CN104822878B - 改进纸浆的排水 - Google Patents
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Abstract
GH61多肽的用途，用于处理纸浆、用于改进纸浆的排水度和/或用于改进由纸浆制成的纸张材料的短距抗压强度，这些纸张材料如纸张、箱纸板、波纹纸板、棉纸、纸巾、波纹容器和盒。
Description
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及通过用糖苷水解酶家族61多肽进行处理来改进纸张或包装纸浆和/或由该纸张或包装纸浆制成的纸张或包装材料的特性。
相关技术说明
公认在纸张和包装材料的制造中使用酶。用于这一目的的酶的实例是蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶以及不同的氧化酶(诸如漆酶和过氧化酶)。
这些酶的作用是广泛的，例如控制不同的沉积物(诸如沥青)、强度改进、脱墨、排水改进、棉纸软化、漂白等。
发明概述
诸位发明人出人意料地发现，纸浆的某些特性，诸如由该纸浆制成的纸张材料的游离度和/或特性，诸如短距抗压强度，可以在该纸张或纸板制造工艺期间，通过用一种糖苷水解酶家族61(GH61)多肽处理或接触该纸浆来改性。
发明详细说明
本发明描述了GH61多肽单独地或与其他的酶一起在新鲜或再循环的纸浆上作为一种方式以改进纸张、纸板或模制包装制造配料(纤维、填料、水和功能性添加剂)的游离度，以便降低制造成本、改进生产力和/或赋予最终产物价值的用途。不受理论约束，该机制似乎包括胶体物质和原纤维的酶溶解，其倾向于在压榨期间(例如在压榨部之内)限制水从电线上的固化纤维网落(纸浆的)的自由排水以及水从结合的纤维网络的萃取。此外，纤维网络内这样的胶体物质部分的减少将减少网络内的结合水的数量，从而降低对干燥器部内网络进行干燥所需的蒸汽数量。
当使用通常用于生产纸张或纸板的新鲜和再循环的纸浆进行应用和孵育时，GH61多肽显著地改进所得配料的标准“游离度”值。一个临时相关性存在于游离度和纸张/纸板机排水和/或脱水之间。鉴于该相关性，用GH61多肽单独地或与一个或多个另外的酶(最优选地选自糖基水解酶)一起预处理这些纤维状浆料可以改进包含1％-100％的经酶处理的纸浆的配料的在机性能。“在机”性能是一种取决于几个因素的累积反应，包括配料的类型和组成、配料排水/脱水速率和程度、化学添加剂(例如凝聚剂及聚合物停留和排水助剂)、网前箱一致性、基重和机械设计和操作。通过直接影响这些因素中的一个或多个，本发明被假定为改进包含GH61多肽的经调节纸浆的配料的整体“在机”性能。
本发明由此给予几个优点，这些优点包括：
a)一种新型酶方法，以在不存在糖基水解酶的情况下提高新鲜和回收纸浆的在机性能。
b)一种方法，用以延长某些传统的酶应用的在机益处，使其优于通过单独地应用传统的酶应用可得到的水平和程度。
相应地，本发明涉及GH61多肽的用途，用于处理纸浆、用于改进纸浆的游离度和/或用于改进由纸浆制成的纸张、纸板或包装材料的短距抗压强度，这些纸张材料诸如纸张、箱纸板、波纹纸板、棉纸、纸巾、模制包装、波纹容器和盒。
纸张和纸浆
术语“纸张或包装材料”是指可以由纸浆制造的产品，诸如纸张、箱纸板、波纹纸板、棉纸、纸巾、包装材料、波纹容器或盒。
术语“纸浆”意指可以用于制造一种纸张和包装材料的任何纸浆。纸浆是一种通过从木材、纤维作物或废纸中化学或机械地分离纤维素纤维而制备的木质纤维素的纤维材料。举例来说，纸浆可以按一种新鲜纸浆形式供应，或可以源自一种再循环的来源。纸浆可以是一种木浆、一种非木浆或一种由废纸制成的纸浆。一种木浆可以由软木(诸如松树、红木、冷杉、云杉、雪松以及铁杉)或硬木(诸如枫树、桤木、桦树、山核桃木、山毛榉、白杨、相思树以及桉树)制成。一种非木浆可以由例如亚麻、大麻、甘蔗渣、竹子、棉或洋麻制造。一种废纸纸浆可以通过对废纸(诸如报纸、混合办公废纸、计算机印出、白色帐簿纸、杂志、牛奶纸箱、纸杯等)进行再制浆来制造。
在一个具体实施例中，待处理的纸浆包括硬木纸浆和软木纸浆两者。
待处理的木浆可以是机械纸浆(诸如磨木浆，GP)、化学纸浆(诸如牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆)、半化学纸浆(SCP)、热磨机械浆(TMP)、化学热磨机械浆(CTMP)、或漂白化学热磨机械浆(BCTMP)。
机械纸浆通过研磨和精制方法来制造，其中原料经受周期性压力脉冲。TMP是热磨机械浆，GW是磨木浆，PGW是加压磨木浆，RMP是精制机械纸浆，PRMP是加压精制机械纸浆，并且CTMP是化学热磨机械浆。
化学纸浆通过碱法蒸煮，由此去除大部分木质素和半纤维素组分来制造。在牛皮纸制浆或硫酸盐蒸煮中，硫化钠或氢氧化钠用作主要蒸煮化学品。
待处理的牛皮纸浆可以是一种漂白牛皮纸浆，它可以由软木漂白牛皮纸(SWBK，也称为NBKP(针叶树漂白牛皮纸浆))、硬木漂白牛皮纸(HWBK，也称为LBKP(阔叶树漂白牛皮纸浆))或其混合物组成。
待用于本发明的工艺中的纸浆是机械或化学纸浆或其组合的悬浮液。举例来说，待用于本发明的工艺中的纸浆可以包括0％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％的化学纸浆。在一个具体实施例中，一种化学纸浆形成用于制造纸张材料的纸浆的一部分。在本文中，表述“形成......的一部分”意指在待用于本发明的工艺中的纸浆中，化学纸浆的百分比处于1％-99％的范围内。在具体实施例中，化学纸浆的百分比处于2％-98％、3％-97％、4-％96％、5％-95％、6％-94％、7％-93％、8％-92％、9％-91％、10％-90％、15％-85％、20％-80％、25％-75％、30％-70％、40％-60％或45％-55％的范围内。
在本发明的用途和工艺的一个具体实施例中，化学纸浆是一种牛皮纸浆、一种亚硫酸盐纸浆、一种半化学纸浆(SCP)、一种热磨机械浆(TMP)、一种化学热磨机械浆(CTMP)、一种漂白化学热磨机械浆(BCTMP)。在具体实施例中，牛皮纸浆是漂白牛皮纸浆，例如软木漂白牛皮纸(SWBK，也称为NBKP(针叶树漂白牛皮纸浆))、硬木漂白牛皮纸(HWBK，也称为LBKP(阔叶树漂白牛皮纸浆))或其混合物。
游离度
纸浆的游离度被设计为给出纸浆的稀释悬浮液(例如，3g的纸浆在1L的水中)在标准化的测试设备内排出的速率的一种度量。该游离度或排水速率(参见例如TAPPI测试方法T 221“纸浆的排水时间”)已经显示与纤维的表面情况和润胀有关。除了这些因素，该结果还取决于该测试进行的条件，诸如备料、温度和水质。
在许多情况下，游离度值和(a)精炼纸浆的目标水平或(b)白色水从湿纤网排放的难易程度之间有一种相关性，尤其是在长网造纸机成形器的先前部分中。游离度的标准测试是基于通过一种筛网的重力脱水。这些装置被设计以便一位操作员可以通过观察刻度量筒中收集的液体的体积来判断脱水的速度。游离度倾向于通过精炼及通过增加配料中的细料水平而降低。游离度可以通过使用排水助剂、去除细料、或将粘液质材料转化为糖的酶处理来增加。
如在本发明的方法、组合物和用途中所定义的游离度是按照加拿大标准游离度来测量的，该加拿大标准体现在如由纸浆和造纸行业的技术协会(Technical Associationof the Pulp and Paper Industry，TAPPI)所公开的TAPPI测试方法T 227“纸浆的游离度(加拿大标准方法)”中。
抗压强度
如在本发明的方法、组合物和用途中所定义的抗压强度是根据TAPPI测试方法T826“容器用板纸的短距抗压强度(Short span compressive strength ofcontainerboard)”来测量的。
短距抗压强度指数是用于比较不同克重纸张的短距抗压强度的建议度量。短距抗压强度指数通过将以牛顿/米(N/m)为单位测量的短距抗压强度除以纸张的以克/平方米(g/m2)为单位的克重而获得。
GH61多肽
术语“GH61多肽”意指根据亨利萨塔(Henrissat)，1991，糖基水解酶基于氨基酸序列相似性的分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280：309-316；和亨利萨塔和巴洛赫(Bairoch)，1996，糖基水解酶的基于序列的分类的更新(Updating the sequence-basedclaSSification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316：695-696属于糖苷水解酶家族61中的一种多肽。
在本发明的组合物和方法中，可以使用任何GH61多肽。
在一个第一方面，该GH61多肽包含以下基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，
其中x是任何氨基酸，x(4，5)是任何四个或五个连续氨基酸，并且x(4)是任何四个连续氨基酸。
包含以上提到的基序的该GH61多肽可以进一步包含：
H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]，
[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]，或
H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]，
其中x是任何氨基酸，x(1，2)是任何一个或两个连续氨基酸，x(3)是任何三个连续氨基酸，并且x(2、)是任何两个连续氨基酸。
在一个优选方面，该GH61多肽进一步包含H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选方面，该GH61多肽进一步包含[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]。在另一个优选方面，该GH61多肽进一步包含H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]。
在一个第二方面，该GH61多肽包含以下基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，
其中x是任何氨基酸，x(4，5)是任何4个或5个连续氨基酸，并且x(3)是任何3个连续氨基酸。在以上基序中，采用可接受的IUPAC单一字母氨基酸缩写。
在一个第三方面，该GH61多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1(Acremonium alcalophilum)、SEQ ID NO：2(Acremonium alcalophilum)、SEQ ID NO：3(Acremonium alcalophilum)、SEQ ID NO：4(土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris))、SEQID NO：5(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：6(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：7(土生梭孢壳霉)、SEQID NO：8(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：9(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：10(金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus))、SEQ ID NO：11(里氏木霉(Trichoderma reesei))、SEQ IDNO：12(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))、SEQ ID NO：13(嗜热毁丝霉)、SEQ IDNO：14(嗜热毁丝霉)、SEQ ID NO：15(嗜热毁丝霉)、SEQ ID NO：16(嗜热毁丝霉)、SEQ IDNO：17(金黄色嗜热子囊菌)、SEQ ID NO：18(烟曲霉(Aspergillus fumigatus))、SEQ IDNO：19(嗜松青霉(Penicillium pinophilum))、SEQ ID NO：20(嗜热子囊菌属(Thermoascussp.))、SEQ ID NO：21(青霉属(Penicillium sp.))、SEQ ID NO：22(土生梭孢壳霉)、SEQ IDNO：23(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：24(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：25(土生梭孢壳霉)、SEQID NO：26(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：27(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：28(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：29(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：30(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：31(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：32(土生梭孢壳霉)、SEQ ID NO：33(甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus))、SEQ ID NO：34(甲壳嗜热子囊菌)或SEQ ID NO：35(甲壳嗜热子囊菌)的成熟多肽具有至少50％、例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列一致性。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
在一个第六方面，该GH61多肽是包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、或SEQ ID NO：35或一种其同源序列的成熟多肽的一个或多个(或若干)氨基酸的取代、缺失和/或插入的一种人工变异体。
优选地，氨基酸改变的性质较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基-或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而协助纯化的小段延伸，诸如多组氨酸区段、抗原表位、或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
一种亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个残基中引入单个丙氨酸突变，并且针对纤维素分解增强活性测试所得突变分子，以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255：306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309：59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，诸如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241：53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46：145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7：127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17：893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：35的成熟GH61多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过4个，例如是1个、2个、3个、或4个。
在另一个方面中，该GH61多肽在一种如WO 2008/151043中所述的可溶活化二价金属阳离子(例如锰离子、铜离子)存在下使用。
在一个方面，该GH61多肽在一种二氧基化合物、一种双环化合物、一种杂环化合物、一种含氮化合物、一种醌化合物或一种含硫化合物存在下使用。
二氧基化合物可以包括包含两个或更多个氧原子的任何适合化合物。在一些方面，二氧基化合物包含一个如在此所述的被取代的芳基部分。二氧基化合物可以包括一个或多个(若干)羟基和/或羟基衍生物，而且包括缺乏羟基和羟基衍生物的被取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3，4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二醇；连苯三酚；没食子酸；3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯；2，3，4-三羟基二苯甲酮；2，6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5-二羟基苯甲酸；4-氯-1，2-苯二醇；4-硝基-1，2-苯二醇；丹宁酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2-丁炔-1，4-二醇；克酮酸；1，3-丙二醇；酒石酸；2，4-戊二醇；3-乙氧基-1，2-丙二醇；2，4，4′-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1，4-二醇；3，4-二羟基-3-环丁烯-1，2-二酮；二羟基丙酮；丙烯醛缩醛；4-羟基苯甲酸甲酯；4-羟基苯甲酸；以及3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯；或其盐或溶剂化物。
双环化合物可以包括如在此所描述的任何适合的取代的稠合环系统。化合物可以包含一个或多个(若干个)另外的环，并且除非另有说明，否则不限于具体数目的环。在一方面中，双环化合物是一种类黄酮。在另一个方面中，双环化合物是一种任选地被取代的异黄酮。在另一个方面中，双环化合物是一种任选取代的花色离子(flavylium ion)，诸如一种任选取代的花色素或任选取代的花色素苷、或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括表儿茶素；槲皮酮；杨梅黄酮；紫杉叶素；堪非醇；桑色素；刺槐素；柚皮素；异鼠李素；芹黄素；矢车菊素；矢车菊素苷；黑豆多酚；花青素鼠李葡糖苷；或其盐或溶剂化物。
杂环化合物可以是如在此所描述的任何适合的化合物，诸如包含一个杂原子的一种任选取代的芳香族或非芳香族环。在一个方面中，杂环是包含一个任选地被取代的杂环烷基部分或一个任选地被取代的杂芳基部分的一种化合物。在另一个方面，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的5元杂环烷基或一个任选地被取代的5元杂芳基部分。在另一个方面，任选地被取代的杂环烷基或任选地被取代的杂芳基部分是一个选自以下的任选地被取代的部分：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂卓基、氮杂卓基、硫杂卓基、哌啶基以及氧杂卓基。在另一个方面中，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括(1，2-二羟基乙基)-3，4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1，2-二羟基乙基]呋喃-2，3，4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己糖醛酸(aldohexuronicaldohexuronic acid)γ-内酯；葡萄糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟基甲基)糠醛；联糠醛；2(5H)-呋喃酮；5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮；以及5，6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或其盐或溶剂化物。
含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何适合化合物。在一个方面中，含氮化合物包含一个胺、亚胺、羟胺或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1，2-苯二胺；2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧基；5，6，7，8-四氢生物蝶呤；6，7-二甲基-5，6，7，8-四氢蝶呤；以及顺丁烯酰胺酸；或其盐或溶剂化物。
醌化合物可以是包含一个如在此所述的醌部分的任何适合化合物。醌化合物的非限制性实例包括：1，4-苯醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或辅酶Q0、2，3，5，6-四甲基-1，4-苯醌或杜醌、1，4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5，6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红、4-叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌、吡咯并喹啉醌、或其盐或溶剂化物。
含硫化合物可以是包括一个或多个硫原子的任何适合化合物。在一个方面中，含硫化合物包含一个选自以下各项的部分：亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫酚；苯-1，2-二硫醇；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂化物。
在一个实施例中，该GH61多肽以2-1000微克/g干燥固体(DS)，例如5-100、10-40或20-40微克/g DS的量存在。
组合物、方法以及用途
在一个第一方面中，本发明提供了一种用于增加(改进)一种纸浆的游离度和/或增加由该纸浆制成的一种纸张或包装材料的短距抗压强度的方法，该方法包括用一种GH61多肽处理该纸浆。
任选地，一种纸张或包装材料随后由该经处理的纸浆制成。
在一个实施例中，该短距抗压强度根据TAPPI测试方法T 826来测量，并且该游离度根据TAPPI测试方法T 227来测量。
本发明的方法赋予纸张或包装材料的经改进的特性。该纸张或包装材料的经改进的特性与在不使该纸浆与一种GH61多肽接触的情况下制造的一种纸张或包装材料相比得到改进。该经处理的纸浆还能够展现改进的排水/脱水。
在一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包含以下一种或多种基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(4)-[HNQ]和/或
[FW]-[TF]-K-[AIV]和/或
H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]和/或
[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽具有至少50％序列一致性；与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽优选至少55％序列一致性、更优选至少60％序列一致性、更优选至少65％序列一致性、更优选至少70％序列一致性、更优选至少75％序列一致性、更优选至少80％序列一致性、更优选至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、并且最优选至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽相比具有多达10个、多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达3个、多达2个或多达1个取代。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的成熟多肽。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35或一种其同源序列的成熟多肽。
在另一个实施例中，该GH61多肽在硫酸锰(或锰离子)、硫酸铜(或铜离子)和/或抗坏血酸存在下使用。上文提及可以与该GH61多肽一起使用的其他适合化合物，诸如连苯三酚(1，2，3-三羟基苯)。
在另一个实施例中，该纸浆还用一种内切葡聚糖酶(诸如SEQ ID NO：36的内切葡聚糖酶)进行处理(或接触)。
在另一个实施例中，该纸张或包装材料是纸张、箱纸板、波纹纸板、棉纸、纸巾、模制包装材料或波纹容器或盒。
在另一个实施例中，该纸浆是一种回收的、再循环的或二次纸浆。
在另一个实施例中，该纸浆是一种化学纸浆。优选地，该纸浆是牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆。该纸浆可以是一种木浆，诸如一种硬木纸浆，例如桉树纸浆；或软木纸浆，例如松树纸浆。
本发明还提供了一种由纸浆制成的纸张或包装材料，其中该纸浆已经经受本发明的方法。
在一个第二方面中，本发明提供了一种用于制造纸张或包装材料的组合物，包含一种纸浆和一种GH61多肽。该纸浆和该GH61多肽是如本发明的方法中所述的相同组分。
在一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包含以下一种或多种基序：
[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(4)-[HNQ]和/或
[FW]-[TF]-K-[AIV]和/或
H-x(1，2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]和/或
[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽具有至少50％序列一致性；与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽优选至少55％序列一致性、更优选至少60％序列一致性、更优选至少65％序列一致性、更优选至少70％序列一致性、更优选至少75％序列一致性、更优选至少80％序列一致性、更优选至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、并且最优选至少95％序列一致性。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽相比具有多达10个、多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达3个、多达2个或多达1个取代。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽。
在另一个实施例中，该GH61多肽的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35或一种其同源序列的成熟多肽。
在另一个实施例中，该组合物包括硫酸锰、硫酸铜和/或抗坏血酸。上文提及可以包含在该组合物中并且与该GH61多肽一起使用的其他适合化合物，诸如连苯三酚(1，2，3-三羟基苯)。
在另一个实施例中，该组合物包括一种内切葡聚糖酶(诸如SEQ ID NO：36的内切葡聚糖酶)、或具有一种氨基酸序列的内切葡聚糖酶，该氨基酸序列与SEQ ID NO：36的氨基酸序列是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性。在一个实施例中，引入SEQ ID NO：36的内切葡聚糖酶中的氨基酸变化(取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入。
在另一个实施例中，该纸张或包装材料是纸张、箱纸板、波纹纸板、棉纸、纸巾、模制包装材料或波纹容器或盒。
在另一个实施例中，该纸浆是一种回收的、再循环的或二次纸浆。
在另一个实施例中，该纸浆是一种化学纸浆。优选地，该纸浆是牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆。该纸浆可以是一种木浆，诸如一种硬木纸浆，例如桉树纸浆；或软木纸浆，例如松树纸浆。
在另一个实施例中，该组合物是一种具有约4到约8的一个pH值的水性组合物，优选地该组合物具有约5到约7的一个pH值。
第二方面的组合物可以用于制造与由该组合物在没有GH61多肽的情况下制成的一种纸张或包装材料相比具有增加的短距抗压强度的一种纸张或包装材料。
工艺条件
本发明的工艺特别适用于改进某些特性，诸如改进一种纸浆的游离度或改进由该纸浆制成的纸张或包装材料的短距抗压强度。
在纸张或包装、和纸浆加工的情况下，根据本发明的工艺可以在任何纸浆制造阶段进行。该GH61多肽可以被添加到任何储料槽中，例如到一种纸浆储存容器(储存柜)、储存塔、混合柜或计量柜。GH61多肽处理可以在纸浆漂白之前、结合纸浆漂白工艺或在漂白之后执行。该GH61多肽还可以被添加到源自漂白的循环工艺用水(白色水)和源自机械或化学机械制浆工艺的工艺用水(褐色水)中。
在本文中，术语“工艺用水”除其他之外包括1)作为一种原料被添加到造纸工艺中的水；2)由用于制造纸张材料的工艺的任何步骤产生的中间水产物；以及3)作为工艺的一种排出物或副产物的废水。在一个具体实施例中，工艺用水被、已经被、正被或预期被循环(再循环)，即在该工艺的另一个步骤中再使用。术语“水”又意指与常用于造纸工艺中的不同的添加剂和佐剂混杂的任何水性介质、溶液、悬浮液(例如普通自来水)以及自来水。在一个具体实施例中，工艺用水具有低含量的固体(干燥)物质，例如少于20％、18％、16％、14％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、20％或少于1％干燥物质。
本发明的工艺可以在纸张和纸浆加工中的常规条件下进行。工艺条件将是所应用的一种或多种多肽、反应时间以及给定条件的一个函数。
本发明的GH61多肽应以一种有效量添加。术语“有效量”意指足以达成所希望的并且预期的作用(诸如改进纸浆游离度和/或纸张或包装材料强度)的量。
在一个具体实施例中，该GH61多肽和另外的酶(如果存在的话)的用量是从(每种多肽的)约0.1mg酶蛋白质到约100,000mg酶蛋白质/吨纸浆。
在其他具体实施例中，该GH61多肽和另外的酶(如果存在的话)的量在0.00001-20或0.0001-20mg多肽(以纯蛋白质形式计算)/克(干重)纸浆材料范围内，如0.0001-10mg/g、0.0001-1mg/g、0.001-1mg/g、0.001-0.1或0.01-0.1mg多肽/克纸浆材料。再次，这些量是指每种多肽的量。
该GH61多肽处理可以在常规稠度(例如0.1％-10％干燥物质)下进行。在具体实施例中，稠度在0.1％-45％、0.1％-40％、0.1-％35％、0.1％-30％、0.1％-25％、0.1％-20％、0.1％-15％、0.1％-10％、0.1％-8％、0.1％-6％或0.1％-5％干燥物质的范围内。
该GH61多肽处理可以在从约10℃到约100℃的一个温度下进行。温度范围(所有“从约”和“到约”)的其他实例是以下：20℃-120℃、30℃-120℃、35℃-120℃、37℃-120℃、40℃-120℃、50℃-120℃、60℃-120℃、70℃-120℃、10℃-100℃、10℃-90℃、10℃-80℃、10℃-70℃、10℃-60℃以及30℃-60℃，以及此处指出的上限和下限值的任何组合。一个典型的温度是从约20℃到90℃或20℃到95℃，优选地从约40℃到70℃或40℃到75℃。通常，该GH61多肽处理在大气压下进行。但当温度超过100℃时，该处理在1-2巴(高于大气压多达1巴)的一个压力下进行。
该GH61多肽处理在从约3到约10的一个pH值下、优选地在从约3.5到约9的一个pH值下、更优选地在从约4到约8的一个pH值下并且最优选地在从约5到约7的一个pH值下进行。
该GH61多肽处理的一个适合持续时间可以在从几秒到几小时的范围内，例如从约30秒到约48小时，或从约1分钟到约24小时，或从约1分钟到约18小时，或从约1分钟到约12小时，或从约1分钟到5小时，或从约1分钟到约2小时，或从约1分钟到约1小时，或从约1分钟到约30分钟。一个典型的反应时间是从约10分钟到3小时、10分钟到10小时，优选地15分钟到1小时、或15分钟到2小时。
如果需要的话，来自大气的分子氧通常将以充足量存在。因此，反应可以便利地在一个开口反应器中、即在大气压下进行。
超出并且高于该GH61多肽和另外的酶(如果存在的话)的不同的添加剂可以用于本发明的工艺或用途中。表面活性剂和/或分散剂通常存在于一种纸浆中，和/或被添加到一种纸浆中。因此，本发明的工艺和用途可以在一种常规地用于一种纸浆中的阴离子型、非离子型、阳离子型和/或两性离子型表面活性剂和/或分散剂存在下进行。阴离子型表面活性剂的实例是烷基、经取代的烷基或芳基的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。非离子型表面活性剂的实例是聚氧乙烯化合物，诸如醇乙氧基化物、丙氧基化物或混合乙氧基化物/丙氧基化物、聚甘油和其他多元醇、以及某些嵌段共聚物。阳离子型表面活性剂的实例是水溶性阳离子聚合物，诸如季铵硫酸盐和某些胺，例如表氯醇/二甲胺聚合物(EPI-DMA)和其交联溶液、聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、DADMAC/丙烯酰胺共聚物以及紫罗烯聚合物，诸如美国专利号5,681,862和5,575,993中披露的那些。两性离子型或两性表面活性剂的实例是甜菜碱、甘氨酸盐、氨基丙酸盐、亚氨基丙酸盐以及不同的咪唑啉衍生物。也可以使用美国专利号5,256,252中披露的聚合物。
同样根据本发明，诸如上述、包括其任何组合的表面活性剂可以与一种如在此定义的GH61多肽一起用于一种造纸工艺中，并且与这种多肽一起包含在一种组合物中。这种组合物中每种表面活性剂的量可以量达从约1到约1000ppm的该组合物。在具体实施例中，每种表面活性剂的量是从约10到约1000ppm，或从约10到约500ppm，或从约50到约500ppm。
在另一个具体实施例中，上述范围中的每一者都是指表面活性剂的总量。
在以上方法和本发明的工艺的其他具体实施例中，该GH61多肽以0.005-50ppm(mg/L)、或0.01-40、0.02-30、0.03-25、0.04-20、0.05-15、0.05-10、0.05-5、0.05-1、0.05-0.8、0.05-0.6、或0.1-0.5ppm的量使用。GH61多肽的量是指一种定义明确的多肽制剂的mg数。
在本发明的工艺中，该GH61多肽可以单独或与一种另外的酶一起应用。术语“一种另外的酶”意指至少一种另外的酶，例如一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或甚至更多种另外的酶。
术语“与......一起应用”(或“与......一起使用”)意指另外的酶可以应用在本发明的工艺的同一个或另一个步骤中。另一工艺步骤在造纸工艺中与使该纸浆与一种GH61多肽接触的步骤相比可以在上游或下游。
在具体实施例中，该另外的酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、氧化还原酶、糖基水解酶纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、固醇酯酶、和/或胆固醇酯酶活性的一种酶。氧化还原酶的实例是具有漆酶、和/或过氧化酶活性的酶。在一个优选实施例中，该另外的酶是糖基水解酶，诸如内切葡聚糖酶。
术语一种工艺的“一个步骤”意指至少一个步骤，并且它可以是一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多个工艺步骤。换句话说，本发明的GH61多肽可以应用于至少一个工艺步骤中，并且一种或多种另外的酶也可以应用于至少一个工艺步骤中，该工艺步骤与使用该GH61多肽的步骤相比可以是同一个或一个不同的工艺步骤。
术语“多肽制剂”意指一种包含至少一种GH61多肽的产品。该多肽制剂还可以包含具有其他酶活性的酶，优选糖基水解酶，诸如内切葡聚糖酶。除了该酶活性之外，这样的一种制剂还可以包含至少一种佐剂。用于纸张和纸浆工业的酶制剂中所用的佐剂的实例是缓冲液、聚合物、表面活性剂以及稳定剂。
另外的酶
具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、漆酶、过氧化酶、氧化酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、固醇酯酶、和/或胆固醇酯酶活性的任何酶都可以用作本发明的用途和工艺中的另外的酶。以下列举此类另外的酶的一些非限制性实例。以大写字母书写的酶是可获自诺维信公司(Novozymes A/S)，克罗格休约尔36(Krogshoejvej 36)，DK-2880巴格斯维尔德(DK-2880 Bagsvaerd)，丹麦(Denmark)的商业酶。那些另外的酶中的任一者的活性可以使用本领域中已知的用于所讨论酶的任何方法来分析，该方法包括所引用的参考文献中提及的方法。
角质酶的实例是源自以下的那些：特异腐质霉(Humicola insolens)(US 5,827,719)；镰孢菌属(Fusarium)的一种菌株，例如大刀粉红镰孢菌(F.roseum culmorum)或特别是豌豆腐皮镰孢菌(F.solani pisi)(WO 90/09446、WO 94/14964、WO 94/03578)。角质酶也可以源自丝核菌属，例如立枯丝核菌(R.solani)的菌株，或链格孢属(Alternaria)，例如芸苔链格孢(A.brassicicola)的菌株(WO 94/03578)，或其变体，诸如WO 00/34450或WO 01/92502中描述的那些。
蛋白酶的实例是ALCALASE、ESPERASE、SAVINASE、NEUTRASE以及DURAZYM蛋白酶。其他蛋白酶是源自类诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、普通芽孢杆菌(B.vulgatus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoide)以及来自芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草杆菌蛋白酶，尤其是来自类诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis sp.)和达松维尔类诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)的蛋白酶，诸如WO 88/03947中披露的那些，及其突变体，例如WO 91/00345和EP 415296中披露的那些。
淀粉酶的实例是BAN、AQUAZYM、TERMAMYL以及AQUAZYM超淀粉酶。一种脂肪酶的一个实例是RESINASE A2X脂肪酶。一种木聚糖酶的一个实例是PULPZYME HC半纤维素酶。内切葡聚糖酶的实例是NOVOZYM 613、342和476以及NOVOZYM 51081酶产品。
甘露聚糖酶的实例是斯塔尔布兰德等人，生物技术杂志(J.Biotechnol.)29(1993)，229-242中所述的里氏木霉内-β-甘露聚糖酶。
固醇酯酶、过氧化酶、漆酶以及胆固醇酯酶的实例披露于此处背景技术部分中提及的参考文献中。氧化还原酶的其他实例是EP 730641、WO 01/98469、EP 719337、EP765394、EP 767836、EP 763115以及EP 788547中披露的过氧化酶和漆酶。在本文中，每当提及需要或受益于受体(例如氧气或过氧化氢)、增强剂、介体和/或活化剂的存在的一种氧化还原酶时，此类化合物应视为包含在内。增强剂和介体的实例披露于EP 705327、WO 98/56899、EP 677102、EP 781328以及EP 707637中。如果希望的话，可以通过将一种氧化还原酶系统(例如一种漆酶，或一种过氧化酶系统)定义为所讨论酶与其受体、以及任选地还与用于所讨论酶的一种增强剂和/或介体的组合来加以区别。
在此描述和要求的本发明不由在此披露的具体实施例限制范围，这是因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。
实例
实例1
用GH61多肽改进旧波纹容器(OCC)纤维纸浆的游离度
纸浆
模式旧波纹容器(OCC)纤维纸浆是通过在室温下将100烘干克(odg)的手撕波纹纸板盒浸泡在2L的去离子水中过夜，并且然后将该经浸泡的材料在标准实验室粉碎机中在20,000转数下进行分解制备的。然后将所得的纸浆进行真空过滤并且将所得的块状物‘分散’成小片，转移至一个可密封的塑料袋中，并且在4℃下存储24小时直至使用。
试剂和酶
GH61辅因子的储备溶液是根据表1来制备的。将该试验中所使用的酶描述在表2中。
表1.储备溶液
| 试剂 | 浓度 | 制备 |
| 连苯三酚，279KEM00218 | 3.17M | 将4.0g的连苯三酚溶解在10ml MQ H2O中 |
| CuSO4，279KEM00098 | 10mM | 将0.5g的CuSO4·5H2O溶解在200ml的MQ H2O中 |
表2.在试验中使用的酶
程序
根据表3，将模型纸浆的等分试样(相当于20烘干克重的固体)放置在八个1L不锈钢Lab-O-Mat烧杯的每一个中，并且用缓冲液稀释至的目标稠度和pH。根据表4中呈现的剂量方案将酶和辅因子添加至每个烧杯中。将这些烧杯进行密封并且放置在Lab-O-Mat中，并且根据表中所描述的条件进行孵育。孵育后，将每个烧杯的内含物用去离子水稀释至2L，在10,000转数下进行分解，并且稀释至5L(0.4％稠度)。从每种经稀释的纸浆样本确定重复试验的‘游离度’值，并且根据TAPPI标准程序从用于干燥和测试的每种纸浆样本制备三个2.6克手抄纸(相当于130g/m2基重)。
表3.恒定试验参数
| 参数 | 值 |
| 底物 | 旧波纹容器(OCC) |
| 每个试验的烘干重 | 20g |
| 稠度 | 3.4％w/v |
| 缓冲液 | 伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)40mM(pH 7) |
| 酶剂量 | 参见表4 |
| 温度 | 50℃ |
| pH | 7 |
| 停留时间 | 240min |
| 孵育容器 | Lab-O-Mat(20rpm，30s左，30s右)，没有O2加压 |
表4.酶和辅因子给药方案
结果
表5呈现出从未处理的纤维(即对照)的0.4％浆料以及用酶进行预处理的纤维中所获得的游离度值。尽管内切葡聚糖酶的单独应用增加了游离度，将GH61与内切葡聚糖酶一起添加提高了这一增加。出人意料地，以12克酶蛋白/干吨纸浆固体单独地添加GH61相对于未经处理的对照改进游离度7％。
有趣地，在不存在内切葡聚糖酶的情况下仅仅添加GH61的试验能产生相对于未经处理的对照具有改进的短距抗压强度的手抄纸(表6)。
表5.从纸浆浆料(0.4％)获得的加拿大标准游离度(CSF)值，该纸浆浆料制备自用内切葡聚糖酶和GH61的共混物预处理的纤维。内切葡聚糖酶和GH61剂量以克酶蛋白(EP)/DT纤维给出。
表6.从130g/m2手抄纸所获得的短距抗压强度(SCT)指数，该手抄纸是用经内切葡聚糖酶和GH61预处理的纤维而制备的。
实例2
用GH61多肽改进回收纸浆的游离度
纸浆
将从回收箱纸板工厂所获得的回收纸浆‘按原样’用于随后的试验中。纸浆表征包括3％稠度和pH 6.3。
试剂和酶
GH61辅因子的储备溶液是根据表来制备的。将该试验中所使用的酶描述在表8中。
表7.储备溶液
| 试剂 | 浓度 | 制备 |
| 连苯三酚，279KEM00218 | 3.17M | 将4.0g的连苯三酚溶解在10ml MQ H2O中 |
| CuSO4，279KEM00098 | 10mM | 将0.5g的CuSO4·5H2O溶解在200ml的MQ H2O中 |
表8.在试验中使用的酶
程序
根据表9，将再循环纤维的等分试样(相当于20烘干克重的固体)放置在八个1L不锈钢Lab-O-Mat烧杯的每一个中。根据表10中呈现的剂量方案将酶和辅因子添加至每个烧杯中。将这些烧杯进行密封并且放置在Lab-O-Mat中，并且根据表9中所描述的条件进行孵育。孵育后，将每个烧杯的内含物用去离子水稀释至2L，在10,000转数下进行分解，并且稀释至5L(0.4％稠度)。从每种经稀释的纸浆样本确定重复试验的‘游离度’值，并且根据TAPPI标准程序从用于干燥和测试的每种纸浆样本制备三个2.6克手抄纸(相当于130g/m2基重)。
表9.恒定试验参数
| 参数 | 值 |
| 底物 | 回收纤维(‘OCC’) |
| 每个试验的烘干重 | 20g |
| 稠度 | 3％w/v |
| 酶剂量 | 参见表10 |
| 温度 | 50℃ |
| pH | 6.3 |
| 停留时间 | 120min |
| 孵育容器 | Lab-O-Mat(20rpm，30s左，30s右)，没有O2加压 |
表1.酶和辅因子给药方案
结果
表11呈现了结果，这些结果清晰地展示出通过用GH61单独地预处理该纸浆可以将游离度显著地改进高达21％。此外，将GH61与内切葡聚糖酶一起添加相对于单独的该内切葡聚糖酶改进了游离度。然而，增加GH61蛋白在GH61/内切葡聚糖酶共混物之内的量超过15克/烘干吨，相对于较低剂量的GH61没有显著增强游离度。
表11.从纸浆浆料(0.4％)获得的加拿大标准游离度(CSF)值，该纸浆浆料制备自用内切葡聚糖酶和GH61的共混物预处理的纤维。内切葡聚糖酶和GH61剂量以克酶蛋白(EP)/DT纤维给出。
Claims (16)
1.一种用于增加一种纸浆的游离度和/或增加由该纸浆制成的一种纸张或包装材料的短距抗压强度的方法，该方法包括用一种糖苷水解酶家族61处理该纸浆，并随后由该经处理的纸浆制成纸张或包装材料，
其中该糖苷水解酶家族61的氨基酸序列包括以下基序：
[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(4)-[HNQ]，和/或
H-x(1,2)-G-P-x(3)-[YW]-[AILMV]，和/或
[EQ]-x-Y-x(2)-C-x-[EHQN]-[FILV]-x-[ILV]
其中x是任何氨基酸，x(4,5)是任何四个或五个连续氨基酸，x(4)是任何四个连续氨基酸，x(1,2)是任何一个或两个连续氨基酸，x(3)是任何三个连续氨基酸，并且x(2)是任何两个连续氨基酸，而且其中该糖苷水解酶家族61的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列一致性，而且其中该纸浆还用与SEQ ID NO:36具有至少90％序列一致性的内切葡聚糖酶进行处理。
2.如权利要求1所述的方法，其中该短距抗压强度根据TAPPI测试方法T 826来测量，并且该排水度根据TAPPI测试方法T 227来测量。
3.如权利要求1所述的方法，其中该糖苷水解酶家族61的氨基酸序列包括一种氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少95％序列一致性。
4.如权利要求1所述的方法，其中该糖苷水解酶家族61的氨基酸序列包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3的成熟多肽。
5.如权利要求1所述的方法，其中该糖苷水解酶家族61是来自Acremoniumalcalophilum、示为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的三种成熟GH61的1:1:1混合物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该内切葡聚糖酶是SEQ ID NO:36。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是一种回收的纸浆。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是一种再循环的纸浆。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是一种二次纸浆。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆。
11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是木浆。
12.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆是硬木纸浆或软木纸浆。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述硬木纸浆是桉树纸浆。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述软木纸浆是松树纸浆。
15.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中与未用一种糖苷水解酶家族61进行处理的纸浆相比，纸浆的排水度、和/或该纸张或包装材料的短距抗压强度被增加。
16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该纸浆展现了改进的排水/脱水。
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