CN102296077B - 一种基因、重组质粒及在提高植物果实硬度和延长果实货架期方面的应用 - Google Patents

Abstract

一种基因，它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所述基因和改造后的真核表达载体构成。一种真核重组质粒的制备方法，步骤为：(1)根据GeneBank中的序列X95261和Sol genomics network中的序列SL2.40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述的启动子；(2)将步骤(1)得到的启动子替换原始真核表达载体中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；(3)将序列表中SEQ ID NO：1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，即获真核重组质粒。所述真核重组质粒可在提高果实硬度和延长果实货架期中应用。

Description

一种基因、重组质粒及在提高植物果实硬度和延长果实货架期方面的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因、重组质粒及在提高植物果实硬度和延长果实货架期方面的应用。

背景技术

果实发育成熟过程中发生一系列生理生化变化，不仅包括生长，还包括风味、芳香物质、质地、颜色和硬度的变化。其中软化是果实发育成熟和采后最明显的质地变化，而且几乎是所有果实的一个特征。这种变化一方面使果实的适口性和风味发生变化，达到最理想的食用状态，但另一方面果实软化后更容易受到物理伤害和病原侵染，使贮藏寿命缩短。

目前多数焦点集中在对果实成熟衰老相关酶类如ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成酶(ACS)、ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶(ACO)及与细胞壁降解相关的酶如多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基酯酶(PE)、β-半乳糖苷酶等的研究。例如，通过导入反义PG基因，使正常型番茄里的PG基因失活，PG的产生受阻，从而使番茄的货架期延长(寇晓红等，2003，多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因对加工番茄果实成熟的影响，中国食品学报)；将番茄的乙烯合成酶(EFE)反义基因导入到番茄基因组中，获得的转基因植株中乙烯的合成受到显著抑制，这种番茄的果实在成熟时的变红程度减轻，并且在室温下贮藏时更能抵抗成熟过度和皱缩(李广存等，1999，番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建，山东农业科学)；在番茄中表达ACS反义mRNA，使得乙烯的生物合成大大降低，果实不能正常成熟，不出现呼吸高峰，在空气中放置90～120天也不变红变软，只有加了外源乙烯或丙烯才能诱导呼吸高峰的出现和果实的成熟(刘传银等，1998，番茄ACC合成酶cDNA克隆及其对果实成熟的反义抑制，生物工程学报)。

然而，以上提高果实耐储性和货架期的成功并不能解决果实的采后运输和贮藏问题。目前主栽加工番茄、草莓等品种都不同程度存在果实硬度差的缺陷，加之种植规模大，采后运输和加工前处理技术粗放，使果实在采后运输过程中出现挤压裂果，加工前大量烂果，严重影响加工品质及生产效益，因此提高果实硬度是生产中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一个新的基因、真核重组质粒及其制备方法，所述基因在植物中过量表达可提高植物果实的硬度，延长植物果实的货架期。

本发明的技术方案如下：

本发明所述基因，命名为SlCOBRA，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所述，所表达的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所述。该基因的克隆：根据DFCI数据库(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/)中EST序列(TC174193)，利用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计PCR特异引物，从番茄成熟叶片中提取总RNA，利用反转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中分离到一个1804bp的cDNA序列，分析得到一个1335bp的开放阅读框(如序列表中SEQ ID NO：1所示)。

本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所述基因和改造后的真核表达载体构成，所述改造后的真核表达载体是用序列表中SEQ ID NO：3所述核苷酸序列替换原始真核表达载体(现有真核表达载体)中的35S启动子而形成的真核表达载体，序列表中SEQID NO：1所述基因两端在改造后的真核表达载体中的连接位点分别为XbaI、SacI。

本发明所述真核重组质粒的制备方法，其步骤如下：

(1)根据GeneBank中的序列X95261和Sol genomics network中的序列SL2.40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个果实特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述；

(2)将步骤(1)得到的果实特异性启动子替换原始真核表达载体(现有真核表达载体)中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；

(3)将序列表中SEQ ID NO：1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，该基因两端的连接位点分别为XbaI、SacI，即获真核重组质粒。

本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述原始真核表达载体(现有真核表达载体)为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7、YFP-pBA、pBI121中的一种。

将本发明所述真核重组质粒转化番茄，获得转基因植株。实验表明：本发明所述基因在番茄果实中过量表达，可引起外果皮表皮细胞下的厚角组织层数增加及表皮细胞的细胞壁增厚；同时成熟果实的果皮细胞壁纤维素含量明显增加，且显著降低了水溶性果胶含量。与野生型番茄果实相比，转基因番茄果实的表皮硬度、表皮厚度均明显提高。果实耐压力实验表明，在果实红熟期，转基因番茄果实的硬度约为对照番茄果实的两倍；在同样的室温储存条件下，转基因番茄果实的失重率明显降低，储存期可比对照番茄果实延长20天左右。因而，本发明所述真核重组质粒可在提高植物果实硬度和延长植物果实的货架期方面应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为提高植物果实硬度或可压缩性(Compresihility)，延长植物果实货架期提供了一种新的基因和真核重组质粒，有利于植物品质的改良。

2、由于植物果实硬度增加，在采后运输和储存过程中将会大大减少挤压裂果、加工前烂果的发生，具有明显的经济效益。

3、本发明所用的基因为植物本身自有的基因，所以转基因植物的安全性能高。

4、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1是一种本发明所述真核重组质粒(pBIVT-SlCOBRA)的示意图，用于在番茄中表达。

图2是番茄果皮的显微分析照片，其中，照片A是野生型番茄(WT)绿熟期果皮石蜡切片(safranin o染色)的照片，照片B是本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄(OE)绿熟期果皮石蜡切片(safranin o染色)的照片，照片C是野生型番茄(WT)未熟期(25DPA)果皮石蜡切片(safranin o染色)的照片，照片D是本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄(OE)未熟期果皮石蜡切片(safranin o染色)的照片。

图3是用质构仪(TA.XT Plus)对未熟期、绿熟期、红熟期番茄果皮穿刺距离的分析图(P/2N探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，OE-5代表本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果实。

图4是用质构仪(TA.XT Plus)对未熟期、绿熟期、红熟期番茄果实表皮强度的分析图(P/2N探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，OE-5代表本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果实。

图5是用质构仪(TA.XT Plus)对绿熟期、红熟期番茄果实抗压强度的分析图(P/100探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，OE-5代表本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果实。

图6是用拉力机对番茄果皮最大折断力的分析图，图中，WT代表野生型番茄果皮，OE-5代表本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果皮，CS-1、CS-2、CS-3代表三种本发明所述SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果皮。

图7是用拉力机对番茄果皮弹性强度的分析图，图中，WT代表野生型番茄果皮，OE-5代表本发明所述SlCOBRA基因过量表达的番茄果皮，CS-1、CS-2、CS-3代表三种本发明所述SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果皮。

图8是番茄果实的耐储性照片，其中，A照片左边为本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实在室温条件下储存40天后正面的照片，A照片右边为野生型番茄果实在室温条件下储存40天后的照片；照片B是本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实在室温下储存40天后其背面的照片；照片C是本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实在室温下储存40天后其剖面的照片。

图9是红熟期番茄果实在储存过程中的鲜重损失率图，图中，WT-1、WT-2、WT-3为三种野生型番茄果实，OE-4、OE-5、OE-6为三种本发明所述SlCOBRA基因过量表达株系番茄果实。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：SlCOBRA基因的克隆

1、试剂

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、PrimeStar热启动高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆载体等购自大连宝生物工程公司；Trizol试剂购自北京天为时代科技有限公司；反转录试剂盒购自日本ToYoBo公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品，可直接从市场多家公司(企业)购买。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌克隆菌株为E.coli JM109，购自Clontech公司。番茄野生型种子为AC⁺，可通过市场购买。

3、培养基和溶液

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基：SOB+20mM葡萄糖。

TB buffer(临用前配置)：1MKCl 4mL，0.45M MnCl₂2.4mL，0.50M CaCl₂0.6mL，0.50M K-MES 0.5mL，ddH₂O 12.5mL(总体积20mL)。

100×Mg²⁺溶液：20.33g MgCl₂.6H₂O和24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

20％葡萄糖溶液：20g葡萄糖定容于100mL H₂O，过滤除菌。

1M KCl溶液：7.45g KCl定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.45M MnCl₂溶液：8.9g MnCl₂.4H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M CaCl₂溶液：7.35g CaCl₂.2H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M K-MES溶液：9.76g MES定容于100mL H₂O，用KOH调pH至6.3，过滤除菌，分装成0.5mL每管，-20℃储存。

DMSO：分装200μl新鲜DMSO，-20℃储存。

4、实验方法

4.1质粒微量提取

1)将带有克隆载体pMD18-T质粒的E.coli JM109接种于装有5ml LB培养液(含氨苄青霉素)的试管中，37℃搖床培养12～16hr，以扩增质粒。

2)取1.5～5ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min。倒净培养基，往沉淀中加入250μl的溶液I(solution I)/RNaseA(购自OMEGA公司)混和(合)液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

3)往重悬混合液中加入250μl溶液II(solution II，购自OMEGA公司)，翻转试管4～6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。

4)往上述裂解液中加入350ul溶液III(solution III，购自OMEGA公司)，并上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10,000xg离心10min。

5)取一干净的质粒微量分离柱置于2ml收集试管上(已备)，将上清转至质粒微量分离柱内，确保转至柱内的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过分离柱。

6)弃去离心甩出液，加入500μl的HB缓冲液(购自OMEGA公司)到质粒微量分离柱上，室温下10,000xg离心1min洗涤分离柱，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。

7)弃去收集液，加入700μl用无水乙醇稀释的清洗缓冲液洗涤质粒微量分离柱，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。

8)可选做步骤：重复步骤7，用700μl清洗缓冲液再洗涤质粒微量分离柱一次。

9)室温下10,000xg离心空分离柱2min以甩干质粒微量分离柱基质。

10)把质粒微量分离柱置于一干净的1.5ml离心管上，直接加入30～50μl灭菌去离子水或TE缓冲液液到质粒微量分离柱基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)，10,000xg离心1min以洗脱出DNA。

4.2DNA回收方案

1)处理琼脂糖凝胶-EB电泳混和物以分别分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。

2)当带纹间的间距达到能够与其他杂带区分的时候，在紫外灯上把所需的DNA片段切下来。这样就能保证把含DNA的凝胶尽可能多的取出来

3)通过把凝胶薄片装在1.5ml小离心管中称其重量的方法，近似地确定其体积。例如其密度为1g/ml，于是凝胶的体积便可通过如下方法得到：凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml。加入体积为凝胶薄片体积3～4倍的NJ缓冲液形成混合物，将所述混合物置于55～65℃水浴中温浴10min，。

4)把750μl的DNA-琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把回收纯化柱装在一个干凈的2ml收集管内，室温下于10,000xg离心1min，弃去液体。

5)选做步骤：用300μl NJ缓冲液来洗涤回收纯化柱，并在10,000x g下离心1min。

6)用750μl无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤回收纯化柱。室温下10,000xg离心1min。

7)弃去流出液，重复步骤6)一次。

8)弃去液体，把回收柱10,000xg离心1min以甩干残余的液体。

9)把回收纯化柱装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30～50μl 10,000xg离心(具体取决于预期的终产物浓度)的灭菌去离子水(或者PH8.0的TE缓冲液)到柱基质上，10,000xg离心1min以洗脱DNA。

4.3番茄叶片RNA提取

1)液氮研磨番茄幼嫩的叶片，按50-100mg组织/ml Trizol(购自北京天为时代科技有限公司)加入Trizol，震荡，室温放置5min。

2)12,000rpm离心5min。

3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，震荡15s，室温放置3min。

4)4℃ 12,000g离心15min。

5)取上清，加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置10min。

6)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

8)4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。

9)室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。

10)用50ul DEPC-H₂0溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

4.4RT-PCR

1)引物合成

上海invitrogen生物技术有限公司合成：

SlCOBRA-F 1：5’-TGAACAGACATTGCCTACAGAGA-3’

SlCOBRA-R1：5’-CAAGGTGTTTATCCGGTTTCT-3’

2)RT

在冰上对一个200μl EP管中加入以下组分：

按以下程序进行反转录：42℃反应20min；95℃酶变性5min；4℃保存5min。

2)PCR

PCR反应体系：

按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性10s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5终延伸min。

通过上述操作，获得了用于构建pBI-SlCOBRA番茄表达重组质粒的SlCOBRA基因。

4.5高保真PCR产物加尾以及和克隆载体pMD18-T连接

在第二轮高保真PCR产物中加1μlTaq DNA聚合酶，72℃反应15min即可。若PCR产物不纯，则必须先回收纯化目标片段，再加入适量的PCR Buffer、dNTPs和Taq DNA聚合酶进行加尾。

加尾后的PCR产物与克隆载体pMD18-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下：

16℃连接12小时。

4.6大肠杆菌转化

1)感受态细胞的制备

a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

b)转接0.5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18℃震荡18～24h至OD₆₀₀≈0.55；

c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min；

d)去上清，加16mL冰上预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min；

e)去上清，加4mL冰上预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280μl的DMSO并混匀，冰浴10min；

f)分装于冰上预冷的1.5mL EP管中，液氮冻存。

2)转化

a)从液氮中取出一管感受态细胞冰浴解冻；

b)将10μl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min；

c)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

d)加0.8mL的SOC，混匀，37℃温和摇床1h。

e)室温13,000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μl的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养12小时。

4.7细胞快速裂解法鉴定重组质粒

1)挑取单个转化子接种于500μl含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为06～0.8。

2)取200μl菌液至0.5ml离心管中，13,000rpm离心1min，去上清，留约20μl上清。

3)加20μl 2×快速裂解液[0.2mol/L NaOH 50mL+SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200ml]，剧烈振荡。

4)13000rpm离心15min。

5)取5μl上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。

4.8菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组质粒再做菌落PCR以确定插入片段是否为目标片段，反应体系如下：

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，测序结果为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：SlCOBRA基因在番茄中表达的真核重组质粒的构建

1、材料

1.1试剂与材料

1)菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，购自天为时代公司。

2)质粒

pMD18-T载体：衍生自pUC18，2.692Kb，Ampr，为克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体，插入位点为EcoRV的酶切位点，购自TaKaRa。

质粒pSKint(以下简写pSK)：Amp抗性，具有两处多克隆位点。

植物表达真核载体pBI121：含有选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因及β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，购自天为时代公司。

2、方法

2.1提取番茄幼果的总DNA

(1)取100mg新鲜番茄幼果，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1.5mL离心管中，每管加入500μL 65℃预热的2×CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(100mmol/LTris-Hcl pH 8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸pH8.0，1.4mol/LNaCl，40mmol/L 2-巯基乙醇，2％CTAB)混匀。

(2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。

(3)5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。

(4)12000g离心10min，弃上清留沉淀，用70％乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。

(5)将沉淀溶于200μL TE中，加入RNase A(10mg/mL)，37℃保温30min，加入等体积的酚/氯仿，混匀。

(6)12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min。

(7)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于20μL ddH2O中。

2.2真核表达载体的改造

根据GeneBank中的序列X95261和Sol genomics network中的序列SL2.40sc03685设计PCR特异引物，以本实施例2.1提取的番茄幼果总DNA为模板进行PCR扩增。果实特异性启动子的PCR特异引物如下：

TFM7-F：TCTAAGCTTAATTAACTTGATTTTGAGTCCATG  (HindIII)

TFM7-R：GACTCTAGAGGGCAATGAACAAAGTTCCAA     (XbaI)

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

高保真PCR产物经电泳回收后，然后进行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段与pMD18-T克隆载体连接，然后转化大肠杆菌(JM109)，挑单克隆，提阳性克隆质粒后，送测序公司测序，得到SEQ ID NO：3所述核苷酸序列，命名为果实特异性启动子TFM7。

用限制酶HindIII和XbaI酶切果实特异性启动子TFM7，用相同限制酶酶切pBI121真核表达载体，然后将酶切后的TFM7和pBI121载体进行连接(连接位点：HindIII和XbaI)，从而得到改造后的真核表达载体——pBIVT。

2.3SlCOBRA基因在番茄中表达的真核重组质粒的构建

构建在番茄中表达的真核重组质粒(pBIVT-SlCOBRA)的引物如下：

SlCOBRA-F2：5’-cgaTCTAGA TGAACAGACATTGCCTACAGAGA-3’(XbaI)

SlCOBRA-R2：5’-cgaGAGCTC CAAGGTGTTTATCCGGTTTCT3-3’(SacI)

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

高保真PCR产物经电泳回收后，然后进行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段与pMD18-T克隆载体连接，然后转化大肠杆菌(JM109)，挑单克隆，提阳性克隆质粒后，送测序公司测序，得到SEQ ID NO：1所述序列，命名为SlCOBRA基因。

用限制酶XbaI和SacI酶切SlCOBRA基因，同时用相同限制酶酶切本实施例中2.2所述pBIVT载体，然后将酶切后的SlCOBRA基因与酶切后的pBIVT载体连接(连接位点：XbaI和SacI)，获得含SlCOBRA基因的真核重组质粒，命名为pBIVT-SlCOBRA，其结构见图1。

实施例3：SlCOBRA基因在番茄中的表达

1、材料

1.1试剂与材料

1)菌株

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：购自天为时代公司。

2)植物激素

吲哚乙酸(Indoleacetic Acid，IAA)；激动素(Kinetin，Kt)；6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone，ACE)；2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid，2，4-D)。

3)抗生素

羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin)

4)植物DNA提取缓冲液

100mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/L α-巯基乙醇，10％或20％SDS。

5)培养基与溶液

酵母提取物1g/L，胰蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

番茄转化过程中所用培养基如下：(表1)

表1番茄组织培养所用培养基

2、方法

2.1农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取农杆菌单菌落于2ml的YEB液体培养基(含利福平50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜；

2)取过夜培养液500μl转接于50ml YEB(含Rif50μg/ml)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

3)4℃5000rpm离心5min收集菌体，加10ml 0.15M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；

4)4℃5000rpm离心5min收集菌体，用1ml预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10mir；

5)制备好的细胞立即使用，或分装成200μl/管，液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。

2.2农杆菌的转化

1)取200μl感受态细胞，冰上解冻；

2)加1μg实施例2构建的pBIVT-SlCOBRA重组质粒，混匀，冰浴30min；

3)液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1ml YEB培养基，28℃振荡培养4h；

4)将培养物涂布于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB平板上，28℃培养约48h。

2.3农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养16h，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

2.4农杆菌介导法转化番茄

将实施例2构建的真核重组质粒pBIVT-SlCOBRA以冻融法转入农杆菌中备用。

用10％次氯酸钠浸泡番茄种子10min，再用无菌水清洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后于1/2MS培养基上培养，25℃，暗培养4d左右，露白后转置于光照下，光照15001x，16h/d，在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2d。转化法采用叶盘法。将带有目的基因的农杆菌28℃过夜培养，5000r/min，5min，室温下离心，去除上清液，用诱导培养基将农杆菌稀释至OD＝0.1，将预培养2d的子叶浸入其中10～15min，倒掉菌液将子叶置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后转到共培养基上培养3d。然后转入再生培养基上继代筛选培养，每3周换一次培养基，待不定芽长到3cm左右时，切下转移至生根培养基上生根。等根发育好后，移出，温室盆栽。

上述各培养基为：

(1)预培养基：MS+1 mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.04mg/L吲哚乙酸。

(2)诱导培养基(100mL)：5mL AB盐+2mL MES缓冲剂+2mL磷酸钠盐缓冲剂+91mL 1％葡萄糖。

(3)共培养基：MS+0.2mg/L KH₂PO₄+0.1mg/L Kinetin+0.2mg/L 2，4-D+15mg/L乙酰丁香酮。

(4)再生培养基：MS+500mg/L羧卞青霉素钠+50mg/L硫酸卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA。(5)生根培养基：MS+500mg/L羧卞青霉素钠+2mg/L IAA。以上各培养基的pH值均为6.0。

在上述转基因番茄生根阶段播种野生型番茄植株，为实验数据的分析准备对照。

2.5转基因植株的鉴定

2.5.1基因组DNA的提取

(1)取100mg新鲜的野生型番茄叶片和转SlCOBRA基因番茄叶片材料，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1.5mL离心管中，每管加入500μL 65℃预热的2×CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(100mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸pH8.0，1.4mol/LNaCl，40mmol/L 2-巯基乙醇，2％CTAB)混匀。

(2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。

(3)5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。

(4)12000g离心10min，弃上清留沉淀，用70％乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。

(5)将沉淀溶于200μL TE中，加入RNase A(10mg/mL)，37℃保温30min，加入等体积的酚/氯仿，混匀。

(6)12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min。

(7)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于20μL灭菌ddH2O中。

2.5.2番茄的基因组PCR检测

以番茄基因组DNA(本实施例中2.5.1提取的样品)为模板，分别对SlCOBRA基因部分编码序列和番茄卡那霉素抗性标记基因(NPTII)进行PCR扩增。SlCOBRA基因特异引物为cob-F1和cob-R1，卡那霉素抗性标记基因(NPTII)的特异引物为NPTII-F1和NPTII-R1。

cob-F1：5′-ATTTACTGCCCGGAACTCCT-3′

cob-R1：5′-GCACTGAACCAAAGGAGCATA-3′

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

NPTII-F1：5’-TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3’

NPTII-R1：5-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

2.6转基因番茄阳性筛选植株RT-PCR鉴定

由于SlCOBRA基因由果实特异性启动子TFM7调控的，只在果实中过量表达，在其他的组织中表达与对照无明显差别。分别提取野生型番茄(AC+)和pBIVT-SlCOBRA转基因阳性株的三个独立的植株的T1代绿熟期果实的mRNA，反转录后，做RT-PCR分析，同时以番茄的内参基因(UBI3)做为对照。SlCOBRA基因的RT-PCR扩增引物和操作同本实例2.5.2中cob-F1/R1；番茄的内参基因UBI3(泛素核糖体蛋白融合基因)的RT-PCR扩增引物为：RT-UBI3F1和RT-UBI3R1。

RT-UBI3F1：5’-AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3’

RT-UBI3R1：5’-TCCCAAGGGTTGTCACATACATC-3’

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

2.7转基因番茄果实结构和质地分析

2.7.1果皮显微结构分析

选取SlCOBRA基因过量表达株系(OE)和非转基因野生型(WT)的未熟期(25DPA)和绿熟期番茄果实(本实施例中2.4栽培)，切去果肉部分，制作果皮的徒手切片和石蜡切片，分别用荧光染色剂和番红染色，然后在荧光显微镜下观察。

2.7.2转基因番茄果实质地分析

选取SlCOBRA基因的过量表达株系(OE)、SlCOBRA基因的共抑制株系(CS)和非转基因野生型株系(WT)的未熟期(25DPA)和绿熟期及红熟期新鲜完整番茄果实(本实施例中2.4栽培)，用质构仪(TA.XT Plus)进行果实质地分析。选用探头P/2N进行果皮穿刺实验：每个成熟阶段取8个样品，每个样品在不同位置穿刺3次，分别计算探头穿透果皮所需要的力和穿刺距离的平均值作为每个样品果皮强度和果皮厚度的指标。测试条件为：预测试速度：1mm/s；测试速度：2mm/s；测试后速度：10mm/s；目标模式：压力；压力：50％；触发形式：自动。

同样，每个成熟阶段取8个样品，选用P100探头进行果实耐压力的检测。测试条件同上。

2.7.3转基因番茄果皮生物力学性质分析

挑选SlCOBRA基因过量表达株系(OE)、SlCOBRA基因的共抑制株系(CS)和非转基因野生型株系(WT)的新鲜完整番茄果实(本实施例中2.4栽培)，各5个，分离完全成熟果实的外层果皮(fruit skin)，切成一定的长度和宽度(注意保持果皮的完整，没有裂口)，固定于拉力机的两端。用0.1mm/per second条件拉伸，记录果皮从中间断裂时所需的最大力和最大变形值。每个果实测定3次，取平均值。

2.8果实耐储性分析

挑选SlCOBRA基因的3株独立的过量表达株系(OE)的红熟期番茄果实各6个，以及同样数目的非转基因野生型株系(WT)的红熟期番茄果实(本实施例中2.4栽培)于同样条件下储存(25+/-2℃，空气湿度65％)，每隔5天记录一次鲜重的损失量，直至有果皮开裂、果肉流出为止。在保存至第40天时拍照记录果实储存情况。

3、结果

3.1转基因植株的鉴定

3.1.1转基因番茄阳性筛选植株PCR鉴定结果(本实施例中2.5的鉴定结果)

经组织培养和抗性筛选获得27株再生番茄植株，经PCR鉴定成功获得了19株阳性转基因番茄植株。

3.1.2转基因番茄阳性筛选植株RT-PCR鉴定结果(本实施例中2.6的鉴定结果)

鉴定结果表明：pBIVT-SlCOBRA转基因番茄植株中至少有三个独立植株的SlCOBRA基因的mRNA量与对照的同时期果实相比，表达量明显升高，即为过量表达株系(OE)。同时，pBIVT-SlCOBRA转基因番茄植株中至少有三个独立植株的SlCOBRA基因的mRNA量与对照的同时期果实相比，表达量明显下调，即所谓的共抑制株系(CS)。

3.2SlCOBRA基因在番茄果实中过量表达对果实结构和质地的影响

3.2.1对果皮显微结构的影响(本实施例中2.7.1的结果)

如图2所示，从绿熟期果皮石蜡切片(safranin o染色)可看出果实特异性过量表达SlCOBRA基因的转基因番茄的外果皮厚度与野生型相比明显增强；而未熟期(25DPA)番茄果皮切片的荧光染色可看出过量表达SlCOBRA基因的转基因番茄的表皮下的厚角组织下厚角组织层数比对照(WT)增加，且整个果皮切片的荧光增强，表明过量表达SlCOBRA基因的转基因番茄的纤维素含量较高。

3.2.2对果实质地和果皮力学性能的影响(本实施例中2.7.2、2.7.3的结果)

转基因番茄果实果皮穿刺实验表明，随着果实膨大(从IG到MG)，表皮强度增加；到果实成熟时，又发生回落。过量表达SlCOBRA基因的转基因番茄的果实(OE-5)表皮强度均高于野生型，尤其在绿熟期差别显著(见图4)，而SlCOBRA基因的共抑制株系的番茄果实(CS-2)的表皮强度在未熟期明显低于野生型以及过量表达SlCOBRA基因株系的番茄果实。

果实成熟过程中，表皮厚度(表皮厚度指果肉之上果皮的厚度)逐渐增加；除在未熟期，过量表达SlCOBRA基因番茄株系和野生型番茄株系的番茄果实表皮厚度差别不明显外，在其余两个时期(绿熟期和红熟期)，过量表达SlCOBRA基因番茄株系的番茄果实表皮厚度明显大于野生型番茄株系(见图3)。

对完整番茄果实抗挤压性能的检测结果表明，过量表达SlCOBRA基因株系的番茄果实在红熟期的压缩强度为对照野生型株系番茄果实的2倍左右，而SlCOBRA基因的共抑制株系番茄果实的压缩强度则低于野生型株系果实的压缩强度(见图5)。

由图6可以看出，过量表达SlCOBRA基因株系的番茄果实(OE-5)的外层果皮的折断力明显高于野生型株系番茄果实(WT)外层果皮的折断力。由图7可以看出，过量表达SlCOBRA基因株系的番茄果实(OE-5)的外层果皮的弹性强度明显高于野生型株系番茄果实(WT)外层果皮的弹性强度。

3.3对果实耐储性的影响(本实施例中2.8的结果)

18个新鲜完整的SlCOBRA基因的过量表达株系(OE)红熟期番茄果实和同样数目的非转基因野生型株系(WT)红熟期番茄果实于同样条件下(25+/-2℃，空气湿度65％)储存，随着保存时间的延长，两类红熟期番茄果实的鲜重损失率均逐渐上升，但SlCOBRA基因过量表达株系(OE)番茄果实的鲜重损失率明显低于对照野生型株系番茄果实的鲜重损失率(见图9)。

野生型株系番茄果实在保存到第15天时，18个果实中有7个果实(30％左右)的果皮发生开裂，到第30天时所有果实的果皮均开裂，完全皱缩；而SlCOBRA基因过量表达株系(OE)番茄果实在第25天时才有果皮开裂的现象。而且，在室温条件下储存至第40天，SlCOBRA基因过量表达株系(OE)番茄果实(左)85％左右仍大致保持完整。保存至第40天时，SlCOBRA基因过量表达株系(OE)番茄果实表面和果蒂附近有皱缩，见图8中的A-B，果实切开的剖面形态见图8中的C，从图8可以看出，保存至第40天时，SlCOBRA基因过量表达株系(OE)番茄果实的果皮和果肉部分仍保持完整，表明SlCOBRA基因在植物果实中过量表达可延长植物果实的货架期(储存期)。

Claims (6)

1.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所述基因和改造后的真核表达载体构成，所述改造后的真核表达载体是用序列表中SEQ ID NO：3所述核苷酸序列替换原始真核表达载体中的35S启动子而形成的真核表达载体，序列表中SEQ ID NO：1所述基因两端在改造后的真核表达载体中的连接位点分别为XbaI、SacI。

2.根据权利要求1所述的真核重组质粒，其特征在于所述原始真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI121中的一种。

3.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）根据GenBank中的序列X95261和Sol genomics network中的序列SL2.40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个启动子，所述启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述；

（2）将步骤（1）得到的启动子替换原始真核表达载体中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；

（3）将序列表中SEQ ID NO：1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，该基因两端的连接位点分别为XbaI、SacI，即获真核重组质粒。

4.根据权利要求3所述的真核重组质粒的制备方法，其特征在于所述原始真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI121中的一种。

5.权利要求1所述的真核重组质粒在提高番茄果实硬度中的应用。

6.权利要求1所述的真核重组质粒在延长番茄果实货架期方面的应用。

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