FI104893B - Menetelmä diasetyylireiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

x 104ft53

Menetelmä diasetyylireiinin valmistamiseksi. - Förfarande för framställning av diacetylrein.

Keksintö koskee menetelmää diasetyylireiinin valmistamiseksi farmaseuttisesti käyttökelpoisessa puhtaudessa ei-toivottujen aloe-emondiinijohdannaisten jäännöspitoisuudella alle 20 ppm, tällä menetelmällä saatavaa diasetyylireiiniä ja farmaseuttista ainetta, joka sisältää tätä yhdistettä.

Diasetyylireiini, jolla on kaava 0 o

1 I

CHj-C-0 O O—C-CH, öööl.

B

O

on lääkeaine, jolla on niveltulehduksen vastaista, tulehduksen vastaista, antipyreettistä ja analgeettista aktiivisuutta.

Tämän vuoksi diasetyylireiiniä käytetään niveltulehdussairaus-ten hoitoon, katso esimerkiksi DE-patenttijulkaisua A2711493 ja US-patenttijulkaisua 4244968.

Diasetyylireiiniä voidaan valmistaa esimerkiksi asetyloimalla barbaloiinia ja hapettamalla saadun perasetyloidun barbaloiinin kromitrioksidilla. Lisäksi diasetyylireiiniä voidaan valmistaa asetyloimalla reiiniä, jota voidaan saada talteen esimerkiksi sennarohdosta.

Tällä tavalla saatuun diasetyylireiiniin sisältyy ei-toivottui-na mukana seuraavina aineina aloe-emodiinijohdannaisia, jotka ovat peräisin ei-täydellisestä kromitrioksidihapetuksesta, tai ne uuttoutuvat mukaan sennarohdon uutossa. Näitä mukana seuraa- 2 104893 via aineita sisältyy suhteellisen vähäisinä määrinä, ja ne ovat sen vuoksi vain hyvin vaikeasti klassisten puhdistusoperaatioi-den avulla erotettavissa. Lisäksi ensiksi mainitussa menetelmässä muodostuu kromijäännöksiä, joiden jätteenkäsittelystä on huolehdittava sopivalla tavalla.

Tämän vuoksi tämän keksinnön tehtävänä on antaa käyttöön menetelmä diasetyyliteiinin talteenottoon, joka menetelmä voidaan suorittaa yksinkertaisesti ja suurella saannolla, ja jossa ase-tyylireiini saadaan farmaseuttisesti käyttökelpoisella puhtaudella ei-toivottujen aloe-emodiinijohdannaisten jäännöspitoi-suudella yhteensä alle 20 ppm.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että A) aloe-emodiinikomponentteja (ts. aloe-emodiinilla ja/tai sen johdannaisilla) sisältävä reiini-9-antroni-8-glukosidilla suoritetaan neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi sekoittuvan polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesifaasin välillä, B) jaon jälkeen vesipohjaiseen faasiin sisältyvä reiini-9-ant-roni-8-glukosidi hapetetaan reiini-8-glukosidiksi, C) glukoosiryhmä reiini-8-glukosidin 8-asemassa lohkaistaan • happamassa väliaineessa ja D) saatu reiini asetyloidaan ja otetaan talteen diasetyylireii-ni.

Oleellinen reiini-9-antroni-8-glukosidin lähde ovat sennaroh-doksen sisältämät sennosidit. Tämän vuoksi keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on menetelmä aloe-emodiinijohdannaisista oleellisen vapaan diasetyylireiinin valmistamiseksi, jossa 3 104893 A) sennosidiseos alistetaan pelkistykselle vastaaviksi reiini- 9-antroni-8-glukosidi- ja aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidi-yhdisteiksi, B) suoritetaan saatujen yhdisteiden neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi sekoittuvan polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesifaasin välillä, C) jaon jälkeen vesifaasiin sisältyvien reiini-9-antroni-8-glukosidiyhdisteiden hapetetaan vastaavaksi antrakinoniyhdis-teiksi, D) glukoosiryhmä antrakinoniyhdisteen 8-asemassa lohkaistaan happamassa väliaineessa, ja E) saatu 1,8-dihydroksiantrakinoniyhdiste asetyloidaan ja otetaan talteen diasetyylireiini.

Seuraavaksi selitetään menetemän yksittäiset vaiheet: Sennosidien pelkistys Lähtöaineena toimiva sennosidiseos voidaan saada esimerkiksi sennarohdosta.

Sennarohto koostuu sennakasvin, esimerkiksi intialaisen sennan (Cassia angustifolia) ja egyptiläisen sennan (Cassia acutifo-lia) kuivatuista lehdistä ja hedelmistä. Sennarohto sisältää reiinin ja aloe-emodiinin diantroniglukosideja. Tärkeimmät ovat sennosidi A, B, Ai, C, D ja Dl. Sennosidit vastaavat kaavaa: 104893 4 cθHj j° ^6^11^5—"® ® Off

Sennosideissa A, B ja AI R on COOH, ja sennosideissa C, D ja Dl R on CH2OH. Sennosidit A, B ja AI tai C, D ja Dl ovat stereo-isomeerejä ja eroavat toisistaan C-atomien 10 ja 10’ konfiguraation suhteen.

Sennosidien talteenotto sennarohdosta on kuvattu esimerkiksi DE-patenttijulkaisussa A3200131, joka täten liitetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi. Sen mukaisesti sennarohto uutetaan ensin vesipohjaisella metanolilla. Metanolin täydellisen poistamisen jälkeen jäljellä oleva konsentraatti sisältää sennosidit kaliumsuolan muodossa. Konsentraatti soveltuu keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineeksi. Konsentraatti voidaan vielä puhdistaa nesteuutolla veteen osaksi liukoisilla alkoholeilla tai ketoneilla (esimerkiksi 2-butanoli, 2-butanoni) (raffinaat-ti) . Raffinaatti säädetään happamaksi pH-arvoon noin 1,5 - 2,0, ja sennosidit saatetaan kiteytymään siemenkiteillä. Saatu raa-kasennosidiseos on saunoin keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena käyttökelpoinen. Toivottaessa raakasennosidiseos voidaan vielä uudelleenkiteyttää.

Vaihtoehtoisesti voidaan lähtöaineena käyttää konsentraattia, johon on lisätty veteen osaksi liukoista alkoholia tai ketonia, erityisesti 2-butanolia.

5 104893

Rohdon suhde uu 11 oi iuot tiineen on sennarohdon uutossa edullisesti 1:4 - 1:15, erityisesti 1:4 - 1:10.

Uutto suoritetaan edullisesti puskurin läsnä ollessa, esimerkiksi trinatriumsitraatin, glysiinin, natriumbikarbonaatin tai sakkaroosin.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti nämä lähtöaineet alistetaan täyselliselle pelkistykselle vastaavaksi reiini-9-antro-ni-8-glukosidiksi (R = COOH) ja vastaavaksi aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidiksi (R « CH2OH), joilla on kaava:

R R 1 COOH, CH20H

Pelkistysreagensseja, joilla on sopiva pelkistyspotentiaali, ovat esimerkiksi tina(II)kloridi, rikkidioksidi, alkalimetal-liboorivedyt ja edullisesti alkalimetalliditioniitit, erityisesti natriumditioniitti.

Lähtöaine voidaan pelkistyksen suorittamiseksi saattaa vesi-liuokseen tai suspensioon ja lisätä pelkistysreagenssi kiinteässä tai veteen liuotetussa muodossa. Voidaan myös toimia 2-faasiseoksessa, jolloin lisätään veden kanssa osaksi sekoittuvaa, polaarista orgaanista liuotinta, erityisesti 2-butanolia tai asetonia.

Voidaan pelkistää ympäristön lämpötilassa tai korkeammassa lämpötilassa. Pelkistys suoritetaan tarkoituksenmukaisesti 40 - 60 °C:ssa, erityisesti 50 - 55 °C:ssa. Toimitaan lähtöainesennosi-diliuoksen tai -suspension pH-arvossa, joka on heikosti happamasta heikosti emäksiseen, edullisesti pH-arvossa 7-9. Toi- ♦ * 6 104893 vottaessa pelkistys voidaan suorittaa useita kertoja, erityisesti 2-10 kertaa.

Muodostunut 9-antroni-8-glukosidi saostetaan säätämällä happa-maan pH-arvoon 4 - 4,5 lisäämällä happoa, esimerkiksi rikkihappoa. Lämpötila ei tällöin tarkoituksenmukaisesti saisi olla yli 40 °C. 9-antroni-8-glukosidin saostuksen ja eristyksen (esimerkiksi suodattamalla) aikana toimitaan tarkoituksenmukaisesti typen alla, jotta vältettäisiin tämän yhdisteen ei-toivottu hapettuminen.

On oleellista, että pelkistys etenee täysin loppuun. Tämän vuoksi pelkistysreagenssia käytetään tarkoituksenmukaisesti suuri ylimäärä. Natriumditioniittia käytettäessä käytetään yleensä 1 - 4-kertaista natriumditioniitin painomäärää lähtöai-nemateriaalin sennosidien pitoisuuden perusteella. Lisäksi pelkistysreagenssin annetaan vaikuttaa vähintään 2 tunnin, edullisesti kuitenkin vähintään 3 tunnin ajan. Yleensä reaktio ei tapahtu pitempään kuin 10 tunnin ajan. Myöhempi pelkistys tapahtuu edullisesti mainituissa olosuhteissa.

Saatu tuote saostetaan edullisesti uudelleen ennen sen käyttöä seuraavassa vaiheessa, jolloin se saatetaan vesiliuokseen lisäämällä emästä (NaOH, KOH) suunnilleen pH-arvoon 6-7, vesi-liuos uutetaan 2-butanolilla, asetonilla tai 2-butanonilla, ja # tuote saostetaan jälleen säätämällä happoa lisäämällä happamaan pH-arvoon noin 2 - 4.

Neste/neste-iako Tässä vaiheessa poistetaan aloe-emodiinikomponentit, erityisesti aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidi. Tämän vuoksi suoritetaan saadun tuotteen neste/neste-jako veteen vain osittain sekoittuvassa polaarisessa orgaanisessa liuottimessa ja vesi-faasissa. Sopivia polaarisia orgaanisia liuottimia ovat 04-5-alkanolit ja di-Cj^-alkyyliketonit, kuten asetoni, 1-butanoli, 1 7 104893 2-butanoli ja 2-butanoni. Edullisesti käytetään 2-butanolia tai asetonia.

Vesifaasiin lisätään edullisesti pelkistysreagenssia, jotta vesifaasille annettaisiin koko neste/neste-jaon ajaksi redoks-potentiaali -210 mV tai negatiivisempi. Tarkoituksenmukaisesti käytetään samaa pelkistysreagenssia kuin vaiheessa A. Käytettäessä pelkistysreagenssina alkalimetalliditioniittia on mainittujen potentiaaliolosuhteiden noudattamiseen yleensä riittävä 2 - 4-paino-% liuos pH-arvossa 7 - 11.

Vesifaasin (painava faasi) tilavuussuhde orgaaniseen faasiin (keveä faasi) on yleensä alueella 1:5 - 1:40.

Neste/neste-uutto tapahtuu edullisesti vastavirtaan. Tällöin antroniyhdisteiden seos johdetaan pelkistyksen jälkeen saadun liuoksen muodossa, tai jos antroniyhdisteet eristettiin, 3 -15-paino-% liuoksen muodossa.

Jaon jälkeen toivottu reiini-9-antroni-8-glukosidi on vesifaa-sissa. Se saostetaan lisäämällä happoa pH-arvoon noin 2-4, ja otetaan talteen tavallisella tavalla.

Reiiniantroni-8-qlukosidin hapetus

Nyt saatu reiini-9-antroni-8-glukosidi hapetetaan reiini-8-glukosidiksi, jolla on kaava: /. u π —0 O ^ C6H11

O

3 104893

Sopivia hapetusreagensseja tähän tarkoitukseen ovat esimerkiksi happi, peroksidiyhdisteet (vetyperoksidi), mangaani-, kromi -tai rautayhdisteet korkeissa hapetusasteissa. Edullisesti käytetään rauta(III)sulfaattia. Tarkoituksenmukaisesti toimitaan korkeassa lämpötilassa, kuitenkin alle 60 °C:ssa. Tällä tavalla vältetään ei-toivottujen ja määrittelemättömien hapetustuottei-den muodostuminen. Hapetuksen loppuun saattamisen jälkeen eristetään muodostunut reiini-8-glukosidi tavallisella tavalla.

Glukoosirvhmän lohkaisu 8-aseman glukoosiryhmä lohkaistaan happamassa liuoksessa. Tarkoituksenmukaisesti tällöin toimitaan noin 85 - 95 °C:ssa.

Saatu tuote eristetään tavallisella tavalla.

Sennosidien muuttaminen happaman hydrolyysin jälkeen suoraan reiiniksi reaktiolla rauta(III)kloridilla on tunnettu, katso esimerkiksi DE-patenttijulkaisua A2711493. Tällöin saanto on kuitenkin on vain noin 10 %, ja lisäksi muodostuneen reiinin erottaminen on vaikeaa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä sennosidien pelkistävä lohkaisu, muodostuneiden antoroniyhdisteiden hapetus vastaaviksi antrakinoniyhdisteiksi ja antrakinoniyhdisteiden 8-aseman glu- .. koosiryhmän lohkaisu suoritetaan kulloinkin erillisissä vai- ♦ heissä. Pelkistävän lohkaisun yhteydessä neste/neste-jaolla poistetaan kvantitatiivisesti kaikki yhdisteet, jotka voivat jatkossa johtaa aloe-emodiinin tai sen johdannaisten muodostumiseen. Lisäksi hapetus voidaan suorittaa hellävaraisissa lämpötiloissa niin, että vältetään ei-toivottujen ja määrittelemättömien hapetustuotteiden muodostuminen. Sitäpaitsi voi-daan tässä reaktion suorituksessa ottaa käytetty rautasuola lähes kvantitatiivisesti talteen ja käyttää takaisinhapetuksen jälkeen uudelleen. Hapetusvaiheen ja hydrolyysivaiheen erottaminen sallii, johtuen antroniglukosidien suuremmasta vesiliukoisuudesta kyseessä oleviin ei-glykosideihin verrattuna, hape-tuksen suorittamisen hellävaraisesti huoneenlämpötilassa alle 9 104893 60 °C:ssa, minkä kautta vältetään muuten välttämättömissä oleva määrittelemättömien sivutuotteiden muodostuminen.

1.8-dihydroksiantrakinonivhdisteen asetvlointi

Saatujen 1,8-dihydroksiantrakinoniyhdisteiden asetylointi tapahtuu tavallisella tavalla. Voidaan esimerkiksi asetyloida asetanhydridillä natriumasetaatin läsnä ollessa, kuten kuvataan julkaisussa Arc. Pharm. 241, 607 (1903). Asetylointi voi kuitenkin tapahtua myös muilla, ammattimiehen tuntemilla menetelmillä, esimerkiksi reaktiolla asetyylikloridin ja vastaavien kanssa.

Tällä tavalla saatu diasetyylireiini on oleellisen vapaata aloe-emodiinista ja sen johdannaisista. Näiden epäpuhtauksien pitoisuus on tällöin kuitenkin vielä noin 50 ppm (määritettynä esimerkeissä kuvatulla analyysimenetelmällä). Näiden epäpuhtauksien pitoisuus voi alentua edelleen, jos saatu diasetyylireiini uudelleenkiteytetään seuraavalla tavalla:

Diasetyylireiini muutetaan alkalimetallisuolaksi, jolloin se käsitellään sopivalla emäksellä. Sopiva emäs on esimerkiksi alkalimetalliasetaatti, edullisesti kaliumasetaatti. Edullisesti käytetään emäksen ekvimolaarisia määriä ja reaktioväliai-. neena vesipitoista C^_3-alkoholia, esimerkiksi 80 - 90-%:sta etanolia. Diasetyylireiinin alkalimetallisuolan annetaan kiteytyä kylmässä, se otetaan vesipitoiseen Cj_3-alkoholiin ja saos-tetaan säätämällä happoa lisäämällä happamaksi pH-arvoon noin 3. Saostunut diasetyylireiini eristetään ja jatkokäsitellään tämän jälkeen tavallisella tavalla.

Näin saatu tuote sisältää alle 20 ppm edellä mainittuja epäpuhtauksia. Lisäksi tuote on neulamaisten kiteiden muodossa, jotka ovat erityisen sopivia galeeniseen formulointiin.

Tuote voidaan kuivata tavallisella tavalla. Tarkoituksenmukaisesti suoritetaan kuivaus ensin tyhjössä suhteellisen alhaises 10 104893 sa lämpötilassa, esimerkiksi ei yli 40 °C:ssa niin pitkään, kunnes tuotteen vesipitoisuus on alennut noin 3 %:iin tai alle. Seuraavaksi lämpötila voidaan kohottaa 70 - 110 eC:seen.

Keksintö koskee myös keksinnön mukaisesti saatavaa, oleellisen puhdasta diasetyylireiiniä, samoin kuin farmaseuttista ainetta, joka sisältää tätä yhdistettä. Käyttöalueet, annettava annos ja sopivat annostelumuodot ovat tunnettuja, katso US-patenttijul-kaisuja A4244968, 4346103, 4950687, DE-patenttijulkaisua A2711493, samoin kuin julkaisua Drugs Exptl. Clin. Res. 6 (1) 53-64 (1980).

Seuraavat esimerkit selittävät keksintöä.

Esimerkki 1 Lähtöaineena käytetyn sennosidiseoksen talteenotto:

Lisätään kulloinkin 40 kg sennarohtoa (sennosidipitoisuus noin 1,5 %) kahteen, rinnan kytkettyyn perkolaattoriin, joiden tilavuus on 250 1, ja ne peitetään revitetyllä teräslevyllä. Uuton liuottimena käytetään 70-%:sta metanolia, joka johdetaan rohdolle ensimmäisessä perkolaattorissa. Ensimmäisessä perkolaat-torissa muodostunut liuos johdetaan rohdolle, joka on toisessa perkolaattorissa. Tällöin liuottimen annetaan virrata vapaasti » t ensimmäisen perkolaattorin läpi.

40 sennarohto-kg:n uuttoon käytetään yhteensä 160 1 liuotinta. Sen jälkeen kun tämä tilavuus 70-%:sta metanolia on johdettu molempien perkolaattorien läpi ja on koottu vastaava määrä perkolaattia, perkolaattorin tyhjennysletku yhdistetään jälki-perkolaattiastiaan, ja perkolaattorien läpi johdetaan vielä 60 1 70-%:sta metanolia. Tämän jälkeen loppu vapaa liuotin ensimmäisestä perkolaattorista johdetaan toisen perkolaattorin yläosaan ja kerätään jälkiperkolaattia, kunnes sitä on yhteensä 120 1. Tämän jälkeen ensimmäinen perkolaattori tyhjennetään, se täytetään uudelleen 40 kg:11a sennarohtoa ja pumpataan jälki- 11 104893 perkolaatti rohdon päälle, jolloin 120 1 jälkiperkolaattia riittää perkolaattorissa olevan rohdon peittämiseen. Seuraavak-si liuoksen lämpötila säädetään 30 °C:seen.

Tämä perkolaatti yhdistetään aikaisemmin uutetun kanssa, ja suoritetaan uutto edellä kuvatulla tavalla.

Kutakin 40 rohto-kg:tä kohden kerätään 160 1 perkolaattia, josta metanoli poistetaan tyhjökiertohaihduttimella, joka on varustettu täytekappalekolonnilla. Saadaan noin 30 1 pohjatuo-tetta. Tämä konsentraatti uutetaan yhtä suurella tilavuudella vedellä kyllästettyä 2-butanolia.

Vaihe A:

Sennosidien pelkistys reiini-9-antroni-8-qlukosideiksi 1,0 1 uutettua konsentraattia säädetään 48-%:11a natronlipeällä pH -arvoon 7,5. Kuumennetaan 60 ®C:seen, ja liuokseen lisätään sekoittaen puolen tunnin aikana 90 g natriumditioniittia kiinteässä muodossa. Lisäyksen loppuun saattamisen jälkeen sekoitetaan vielä tunti. Seuraavaksi lisätään sekoittaen konsentroitua rikkihappoa, kunnes saavutetaan pH-arvo 2. Jäähdytetään kahden tunnin aikana ympäristön lämpötilaan, suodatetaan saostunut kiteinen sakka, ja se pestään rikkidioksidipitoisella vedellä.

Haluttaessa raaka reiini-9-antroni-8-glukosidi saostetaan uudelleen. Vielä märkä suodatinkakku liuotetaan niin seokseen, jossa on 15 tilavuusosaa 2-butanolia ja 85 tilavuusosaa vettä, joka sisältää 0,5 paino-% natriumpyrosulfaattia, että lisäämällä 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta pH-arvoon 7, saadaan 10-%:nen liuos (paino/tilavuus). Liuos säädetään konsentroidulla suolahapolla happamaan pH-arvoon 2,8 tai alle, ja annetaan seistä 2 tuntia. Saostunut sakka suodatetaan pois ja pestään rikkidioksidi- tai natriumpyrosulfaattipitoisella vedellä ja kuivataan.

12 104893

Saanto: 90 %.

Tällä tavalla saadulla tuotteella suoritetaan uusi pelkistus (jälkipelkistys) seuraavalla tavalla: 3.0 g raakaa kuivattua reiini-9-antroni-8-glukosidia tai vastaava määrä kosteaa tuotetta liuotetaan yhdessä 1,4 g:n kanssa natriumditioniittia ja 2,3 ml:n kanssa 5N NaOH:ta 15 ml:aan vettä. Seuraavaksi täytetään vedellä 24 ml:aan, ja liuosta lämmitetään 24 tuntia 55 °C:ssa. Tämän jälkeen lisätään edelleen 1,5 g natriumditioniittia, ja lämmitetään 20 min 55 °C:ssa. Seuraavaksi lisätään 0,9 ml 5N NaOH:ta ja 1,5 g natriumditioniittia. 20-min 55 °C:seen lämmityksen jälkeen lisätään vielä kerran 0,9 ml 5N NaOH:ta. Saatu liuos johdetaan suoraan seuraavaan neste/neste-uuttoon.

Vaihe B:

Aloe-emodiinikomponenttien erottaminen

Aloe-emodiinikomponenttien erottaminen tapahtuu 9-antroni-8-glukosidien neste/neste-jaolla vastavirrassa laitteen avulla, jossa on 60 sekoitin/erotin-yksikköä ("Mixer-Settler"-laite). Vesipohjaisena, raskaana faasina käytetään liuosta, jossa on 3.0 g natriumditioniittia 3,5 ml:ssa 5N NaOH:ta ja 96 ml:ssa , . vettä. Orgaanisena, keveänä faasina käytetään (vedellä kyllästettyä) 2-butanolia tai asetonia. Molemmat faasit lähetetään laitteen läpi niin, että raskaan faasin tilavuussuhde keveään faasiin on 1:10.

Erotettava seos johdetaan laitteeseen tuoreen pelkistetyn liuoksen muodossa tai vastaavan pH-arvon ja vastaavan konsent-raation omaavan liuoksen muodossa, jotka sisältävät vaiheesta A saatua 9-antroni-8-glukosidia, ja siten, että erotettavan seoksen tilavuusosaa kohden käytetään 30 tilavuusosaa orgaanista faasia.

13 104893

Seoksen sisältävän liuoksen pH-arvo pidetään glysiinipuskurin avulla 9 - 9,5:ssä. Puskuria, jossa on 3 tilavuusosaa 7,5-%:sta glysiiniliuosta ja 1 tilavuusosa IN NaOHita, lisätään määrä 240 ml puskuriliuosta/150 g raakaa reiini-9-antroni-8-glukosidia. Ei-toivotut aloe-emodiiniyhdisteet rikastuvat orgaaniseen faasiin, kun taas reiini-9-antroni-8-glukosidi jää vesifaasiin. Vesifaasi säädetään rikkihapolla happamaksi pH-arvoon 2,8, muodostunut sakka suodatetaan ja pestään vedellä ja asetonilla, ja kuivataan ilmassa ympäristön lämpötilassa. Tällä tavalla saadaan reiini-9-antroni-8-glukosidia, jonka aloe-emodiinikom-ponenttien pitoisuus on 41 ppm määritettynä aloe-emodiinina menetelmällä, joka kuvataan tämän patenttihakemuksen lopussa.

Saanto 97 %, reiini-9-antroni-8-glukosidin perusteella.

Vaihe C:

Hapetus reiini-8-alukosidiksi

Tuote vaiheesta B (perustuen pitoisuuteen 3,0 kg sennosideja A, ja B) suspendoidaan liuokseen, jossa on 184 1 demineralisoi-tua vettä ja 75,5 kg rauta(III)sulfaattihydraattia (22 % Fe^+) . Suspensio kuumennetaan 55 - 62 °C:seen ja hapetetaan 14 tuntia käyttä n nopeakäyntistä dispergoijaa. Kun hapetus on edennyt loppua:., muodostunut reiini-8-glukosidi suodatetaan pois ja . . . pestään 50 1:11a demineralisoidulla vettä, joka on säädetty rikkihapolla happamaan pH-arvoon 2.

Vaihe D:

Hvdrolyvsi reiiniksi

Kostea suodatinjäännös vaiheesta B suspendoidaan 200 kg:aan 20-paino-%:sta rikkihappoa ja sekoitetaan 8 tuntia 88 - 92 °C:ssa. Muodostunut reiini suodatetaan pois ja voidaan kuivata varastointia varten 48 tunnin ajan 40 °C:ssa tyhjössä 100 Pa tai käyttäää myös heti kosteassa tilassa asetylointiin vaiheessa D.

14 104893

Kokonaissaanto vaiheille A - D: 79 %, vaiheessa A käytettyjen sennosidien A, A^ ja B perusteella.

Vaihe E:

Asetvlointi diasetvvlireiiniksi 6,5 kg reiiniä vaiheesta C suspendoidaan 100 l:aan etikkahap-poanhydridiä 10 min aikana, sekoitetaan 2 kg:n kanssa kalium-asetaattia, kuumennetaan sekoittaen 95 °C:seen, sekoitetaan 0,65 kg:n kanssa aktiivihiiltä ja sekoitetaan h tuntia 90 - 95 °C:ssa. Aktiivihiili suodaettaan pois kuumasta liuoksesta, ja suodos sekoitetaan 90 °C:ssa 2,1 kg;n kanssa 96 - 98-paino-%:sta rikkihappoa. Seuraavaksi jäähdytetään sekoittaen mahdollisimman nopeasti 20 °C:seen. Muodostunut suspensio suodatetaan. Jäännös pestään demineralisoitulla vedellä sulfaatitto-maksi.

Saanto: 83 %.

Vaihe F:

Uudelleenkitevtvs, kuivaus, jauhaminen

Suspendoidaan nopeasti sekoittaen 7,5 kg diasetyylireiiniä vaiheesta E (kuivan aineen perusteella) 375 l:aan 90-tilavuus-. . „ %:sta etanolia ja sekoitetaan sitten 3,75 kg:n kanssa kalium-asetaattia. Jäähdytettäessä 0-2 °C:seen kiteytyy välillä muodostuneesta kirkkaasta liuoksesta diasetyylireiinin puhdas kaliumsuola.

Kaliumsuola suodatetaan pois ja liuotetaan 300 l:aan 40-tila-vuus-%:sta etanolia lisäten 3 kg kaliumasetaattia 20 - 30 °C:ssa. Kirkas liuos säädetään 10-paino-%: sella rikkihapolla happamaksi pH-arvoon 3,0. Kiteytynyt diasetyylireiini suodatetaan pois ja pestään demineralisoidulla vedellä sulfaatittomak-si.

15 104893

Tuotteen kuivaus tapahtuu ensin tyhjössä 100 Pa ja 40 °C:ssa 24 tunnin aikana. Jos jäännösvesipitoisuus on laskenut alle 3 %:n, materiaali hienonnetaan karkeaksi ja jälkikuivataan 24 tunnin ajan tyhjössä 100 Pa ja 70 °C:ssa.

Seuraavaksi jauhetaan 0,5-mm seulalla (Siebeinlage) ja jälkikuivataan liuotinjäännösten poistamiseksi tyhjössä 100 Pa ja 70 °C:ssa.

Saanto 95 %.

Esimerkki 2

Toistetaan esimerkikssä 1 kuvattu sennarohdon uutto ja sennosi-dien pelkistys. Jälkipelkistys suoritetaan sitten seuraavalla tavalla:

Liuotetaan 14,0 g sakkaroosia, 4,5 g natriumditioniittia (85-%) ja 13,3 g kaliumasetaattia 133 ml:aan vettä ja lisätään 1,3 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 17,3 g kaliumkarbonaattia. Seuraavaksi sekoitetaan 293 ml:n kanssa asetonia ja 50 ml:n kanssa vettä. Seosta ravistellaan erotussuppilossa ja erotetaan faasit, jolloin saadaan 373 ml yläfaasia (asetonifaasi) ja 130 ml alafaasia.

98 ml:aan alafaasia liuotetaan 1,4 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 10 g raakaa reiini-9-antroni-8-glukosidia. Lämmitetään 45 - 50 °C:seen ja pidetään tässä lämpötilassa 20 - 30 min ajan. Seuraavaksi lisätään 1,0 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 3,4 g natriumditioniittia ja lämmitetään edelleen 20 - 30 min 45 - 50 °C:seen. Seuraavaksi lisätään uudelleen 1,0 ml 48-%:sta natriumhydroksidiliuosta ja 3,4 g natriumditioniittia ja lämmitetään 20 - 30 min ajan 45 - 50 °C:seen.

Aloe-emodiinikomponentin erotus tapahtuu pelkistetyn liuoksen neste/neste-jaolla vastavirtaan edellä mainittua yläfaasia (asetonifaasia) vastaan. Pois juokseva, reiini-9-antroni-8-glukosidin sisältävä raffinaattifaasi haihdutetaan 400 ml:aan 16 104893 ja sekoitetaan 20 ml:n kanssa 2-butanolia. Säädetään suolahapolla tai rikkihapolla happamaksi pH-arvoon 4,0 - 4,2. Muodostunut sakka suodatetaan, pestään 40 ml:11a vettä ja 30 ml:11a asetonia, ja kuivataan seuraavaksi. Seuraava hapetus tapahtuu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 3

Sennarohdon uuton jälkeen saatu konsentraatti sekoitetaan noin 2 l:n kanssa 2-butanolia. Sennahedelmäkonsentraatti/2-butanoli-seoksen pelkistys suoritetaan sitten 7 vaiheessa suojakaasuna olevan typpikaasun alla. Pelkistysvaiheen I jälkeen tapahtuu raa’an reiini-9-antroni-8-glukosidin saostus.

Pelkistvsvaihe I

100 1 sennahedelmäkonsentraatti/2-butanoli-seosta, joka sisältää noin 4 kg sennosidia, lisätään sekoitusastiaan ja sen päälle johdetaan typpeä. Lisätään sekoittaen 6 1 20-%:sta (paino) natronlipeää, sen jälkeen 350 1 vedellä kyllästettyä 2-butano-lia (esimerkiksi vaiheesta II) peräjälkeen, ja sekoitetaan 15 min. Erä kuumennetaan 42 - 50 °C:seen ja sekoitetaan 7 kg:n kanssa natriumditioniittia. Sekoitetaan vielä 45 min. pH-arvo pidetään 20-%:11a (paino) natronlipeällä pH-arvossa 7,5 - 8. Pelkistyspotentiaali (Ag/AgCl-elektrodia vastaan) pidetään vaadittaessa natriumditioniittilisäyksellä alle -630 mV:ssa.

30 - 33 eC:seen jäähdyttämisen jälkeen saostetaan 1,5 tunnin sisällä 10-%:11a (paino) rikkihapolla pH-arvoon < 4. Muodostunutta suspensiota sekoitetaan pienellä sekoitusnopeudella < 25 °C:ssa noin 10 tunnin ajan. Muodostunut sakka suodatetaan pois. Sakka suspendoidaan 60 l:aan 15-%:sta (paino) 2-butanolia, sekoitetaan 30 min 50 - 60 °C:ssa ja suodatetaan seuraavaksi. Jäännös pestään 100 1:11a demineralisoitua vettä. Reii-ni-9-antroni-8-glukosidin raakasaanto käytettyjen sennosidien perusteella on yli 82 %.

„ 104893

Pelkistvsvaihe II

3,3 kg raakaa reiini-9-antroni-8-glukosidia vaiheesta I suspen-doidaan seokseen, jossa on 42 1 demineralisoitua vettä ja 7,4 1 2-butanolia. Suspensio liuotetaan 2 1:11a 20-%:sta (paino) nat-ronlipeää ja 9,9 kg:llä trinatriumsitraattia ja sekoitetaan tämän jälkeen 3,3 kg:n kanssa natriumditioniittia ja 350 l:n kanssa vedellä kyllästettyä 2-butanolia (esimerkiksi vaiheesta III). Erä kuumennetaan 42 - 45 °C:seen. pH pidetään 20-%:sella (paino) natronlipeällä pH-arvossa 8,5 - 9. Pelkistyspotentiaali (Ag/AgCl-elektrodia vastaan) pidetään tarpeen mukaan natrium-ditioniittilisäyksellä alle -750 mV:ssa.

Noin 30 min seisomisen jälkeen yläfaasi poistetaan, ja alafaasi · käsitellään edelleen vaiheessa III.

Pelkistysvaihe III

Alafaasilla vaiheesta II toistetaan vaiheessa II kuvattu pel-kistys/uutto-menetelmä seuraavat kemikaalit lisäten: 1,65 kg natriumditioniittia 0,8 1 20-%:sta (paino) natronlipeää 350 1 vedellä kyllästettyä 2-butanolia . (esimerkiksi vaiheesta IV)

Pelkistysvaiheet IV - VII

Alafaasilla kulloinkin edeltävästä vaiheesta toistetaan vaiheessa II kuvattu pelkistys/uutto-menetelmä seuraavat kemikaalit lisäten: 0,825 kg natriumditioniittia 0,4 1 20-%:sta (paino) natronlipeää 350 1 vedellä kyllästettyä 2-butanolia (esimerkiksi kulloinkin seuraavasta vaiheesta - vastavirtaperiaate) m 18 104893

Vaiheessa VII erotettu alafaasi jäähdytetään 30 - 35 °C:seen, ja reiini-9-antroni-8-glukosidi saostetaan - kuten vaiheessa I kuvataan. Muodostunut sakka suodatetaan ja pestään 100 1:11a demineralisoitua vettä. Seuraavaksi peitetään 10 1:11a rauta-(III)sulfaattiliuosta (valmistus katso vaihe B, esimerkki 1).

Sitten reiini-9-antroni-8-glukosidi muutetaan sennosidiksi esimerkissä 1 tai 2 kuvatulla tavalla sennosideiksi.

Farmakologiset tutkimukset

Diasetyylireiinin vaikutus määritettiin kroonisilla tulehdus-malleilla oraalisen annnon jälkeen. Käytettiin seuraavia koemalleja:

Puuvillapellettigranulooma rotalla ja A-vitamiinin nivelensisäisellä annolla laukaistu niveltauti kanilla.

a) Puuvillapellettigranulooma rotalla.

Nuoret, sukukypsät rotat (n = 10) saivat 25, 50 tai 100 mg diasetyylireiiniä/kg tai 5 mg indometasiinia/kg tai 100 mg asetyylisaisyylihappoa/kg päivittäin 5 päivän ajan. Mukaan otettiin myös yksi, vain vedellä käsitelty kontrolliryhmä. Pellettien istutus tapahtui ensimmäisenä käsittelypäivänä.

. Kokeen lopussa preparoitujen granuloomien tuote- ja kuivapainot osoittivat merkittävän ja selvän annoksesta riippuvan pienenemisen kontrolliryhmään verrattuna. Tällöin vaikutus 100 diase-tyylireiini-mg:lla/kg vastasi suunnilleen vaikutusta 5 mg:11a indometasiinia tai 100 mg:11a asetyylisalisyylihappoa. Kateen-korvan ja lisämunuaisten painot eivät muuttuneet käsittelyn . aikana.

b) A-vitamiininiveltauti.

Kolmella nivelensisäisellä A-vitamiini-injektiolla, 30 000 IE, 9 päivän aikana laukaistiin kahdessa kulloinkin 10 kaniinin (valkoisia uusi-seelantilaisia) ryhmässä nivelrikkotyyppinen 19 104893 nivelmuutos. 56 päivää myöhemmin 10 eläintä käsiteltiin 8 viikon ajan 3 mg :11a diasetyylireiiniä/kg/päivä. Kontrolliryhmään verrattuna makroskooppisesti ja mikroskooppisesti havaittavat nivelmuutokset olivat käsittelyryhmässä merkittävästi vähäisemmät.

Diasetyylireiinin parantavaa vaikutusta verrattiin edelleen asetyylisalisyylihapon kanssa kulloinkin 7 kaniinilla, jotka 6-päiväisen esikäsittelyn jälkeen 10 000 IE:llä A-vitamiinia ja 26-päiväisen käsittelyvapaan ajanjakson jälkeen saivat 8 viikon ajan joko 5 mg diasetyylireiiniä/kg/päivä (koeryhmä), 15 mg asetyylisalisyylihappoa/kg/päivä (positiivinen kontrolliryhmä) tai jäivät ilman käsittelelyä (negatiivinen kontrolliryhmä). Kaikissa kolmessa ryhmässä näkyi 24 päivää viimeisen A-vitamii-ni-injektion jälkeen verrattavissa olevia liikehäiriöitä perässä laahaavien takajalkojen muodossa. Negatiivisessa kontrolliryhmässä selvästi havaittavan nivelrikon kliiniset oireet voimistuivat seuraavien 8 viikon aikana.

Koeryhmässä ja positiivisessa kontrolliryhmässä nämä oireet paranivat 8-viikkoisen käsittelyn aikana merkittävästi.

Vatsan limakalvon muutokset . Kun annettaessa kerran 400 mg diasetyylireiiniä/kg tai liuotin ta ei rotalla aiheutettu lainkaan vatsan limakalvon syöpymistä, esiintyi ibuprofeenin (200 mg/kg) tai indometasiinin (20 mg/kg) annon jälkeen yksiselitteisiä limakalvon vaurioita pistemäisistä (halkaisija 1 mm) suurempiin (halkaisija 3 mm) syöpymiin. Myöskään diasetyylireiinin anto kahdesti päivässä annoksella 100 mg/kg 3 päivän ajan ei aiheuttanut lainkaan limakalvon vau-* rioita, mutta kylläkin vastaava indometasiinin käyttö annoksel la 10 mg/kg. Tällöin olivat kyseessä syöpymät, joiden halkaisijat olivat 1-3 mm.

Toksikologia 20 104893

Akuutti toksisuus LD50 on kulloinkin tutkitun lajin (rotta, hiiri, kissa) mukaan oraalisen käytön jälkeen 1,9 - 7,9 g/kg. Rotta osoittautui tällöin vähiten herkäksi. Parenteraalisen annon (i.v. i.p.) jälkeen LD5Q~arvot olivat näillä lajeilla välillä 119 ja 339 mg/kg.

Kliiniset tutkimukset 1. Kaksoissokkotutkimuksessa naprokseenia vastaan ja seuraavas-sa plasebojälkikäsittelyssä tutkittiin diasetyylireiinin vaikutus lonkkanivelen ja polvinivelen rikossa 95 (49/46) potilaalla. Annettu annos oli 50 mg diasetyylireiiniä kahdesti päivässä tai 750 mg naprokseenia päivittäin. Käsittelyn kesto oli 60 päivää 7-päiväisen uloshuuhtoutumisvaiheen jälkeen. Seuraava plasebokäsittely kesti 60 päivää.

Koesuureet olivat kipu- ja liikkuvuussymptomatiikka pisteas-teikolla, toimintarajoitus ja sietokyky.

Molemmissa käsittelyryhmissä (diasetyylireiini/naprokseeni) määritettiin kaikkien koeparametrien suhteen tilastollisesti merkittävä paranemisaste (P < 0,01 tai P < 0,05) lähtöarvoihin verrattuna. Käsittelyn päättymisen ja senraavan plasebonannon jälkeen osoittautui diasetyylireiini/plasebo-ryhmällä kuitenkin päivinä 90 ja 120 spontaanin kivun, aktiivisen ja passiivisen liikekivun parametrien suhteen tilastollisesti merkittävä (P < 0,01) paremmuus verrattuna naprokseeni/plasebo-ryhmään. Tämä ero varmistettiin 5 %;n tasolla myös muuttujille yökipu ja painoarkuus 30 päivää diasetyylireiinin pois jättämisen jälkeen.

2. Avoimessa taudinkulkututkimuksessa kontrollin kanssa tutkittiin diasetyylireiinin vaikutus selkärangan ja polven luu/-nivel-tautia vastaan 70 potilaalla (35/35). Annettu annos oli 100 mg diasetyylireiiniä/päivä. Käsittelyn kesto oli 60 päivää, tarkkailun kesto oli 75 päivää. Testisuureet olivat kipu- ja liikuntarajoitus. Suureet ilmoitettiin pistejärjestelmällä.

21 104893

Kontrolliryhmä käsitti 35 potilasta, joille suoritettiin yksinomaan fysioterapeuttisia toimenpiteitä. Samoin diasetyyli-reiinikäsittelyryhmässä suoritettiin fysioterapiaa.

Tulosten arviointi osoitti kaikkien parametrien suhteen käsit-telyryhmän tilastollisesti merkittävän paremmuuden kontrolliryhmään verrattuna. Myös käsittelyn päättymisen jälkeen voitiin diasetyylireiiniryhmällä osoittaa jatkuva terapeuttinen vaikutus "hang-over"-vaikutus).

3. Yksinkertaisessa, ristikkäistutkimuksessa naprokseeniin verraten tutkittiin diasetyylireiinin vaikutus paikallistuneeseen niveltautiin 20 potilaalla. Nämä jaettiin kahteen ryhmään, jolloin ensimmäisessä ryhmässä annettiin ensin 2 kertaa 50 mg diasetyylireiiniä 20 päivän ajan. Seuraavaksi seurasi 3 päivän "wash-out"-ajanjakso ja edelleen käsittely 2 kertaa päivässä 250 mg:11a naprokseenia edelleen 20 päivän ajan. Toisessa ryhmässä noudatettiin käänteistä järjestystä. Käsittelyn kesto oli yhteensä 43 päivää. Testisuureita olivat kipu, puristuskipu, passiivinen liikekipu, toimintarajoitus ja turvotus pistejärjestelmällä.

Tulosten arviointi osoittaa diasetyylireiinillä käsittelyn paremmuuden naprokseenilla käsittelyyn verrattuna. Ei havaittu v mitään merkittäviä sivuvaikutuksia, ei myöskään mitään kliinis ten laboratorioparametrien muutoksia.

4. Sattumanvaraisessa kaksoissokkotutkimuksessa "douple dummy"-tekniikalla naprokseeniin verrattuna tutkittiin diasetyylireiinin vaikutus 23 potilaalla (12/11), joilla oli nivelsairaus . . (sietotutkimus). Annettu annos oli 2 kertaa 50 mg diasetyyli- reiiniä päivässä ja 3 kertaa 250 mg naprokseenia päivässä. Käsittelyn kesto oli 4 viikkoa. Testisuureet olivat ruokatorven, mahan ja pohjukaissuolen tila ennen terapiaa ja sen jälkeen. Tutkimukseen otettiin vain potilaita, joilla oli normaalit limakalvon tilat tai lieviä limakalvon vaurioita (1. aste).

22 104893 4 viikon kuluttua endoskooppiset tutkimukset osoittivat yhdessä tapauksessa (10 %) diasetyylireiiniryhmässä 2. asteen limakalvovaurioita, kun taas naprokseeniryhmässä 5 potilaalla (50 %) oli toisen, kolmannen ja neljännen asteen limakalvovaurioita. Kaikissa tapauksissa esiintyi normaali mittaustulos.

Aloe-emodiinin analyyttinen määritys 50 mg diasetyylireiiniä liuotetaan 25,3 ml:aan 0,5 M NaOH:ta erotussuppilossa ja ravistellaan 10 min ajan. Seuraavaksi lisätään 74,6 ml liuosta, joka sisältää 0,5 M glysiiniä ja 0,5 M NaCl:ää. Tällöin saadaan tulokseksi pH-arvo 9,5.

Tämä liuos uutetaan kolmesti 25 ml:11a kloroformia. Yhdistetyt orgaaniset faasit uutetaan kerran 10 ml:11a 0,5 M puskuria, jonka pH-arvo on 9,5 (glysiini, NaOH, NaCl) ja kerran 10 ml:11a 0,01 M rikkihappoa. Orgaanisen faasin liuotin poistetaan, ja jäännös liuotetaan 1 ml:aan metanolia.

Standardiliuosta varten 2 mg aloe-emodiinia liuotetaan 20 ml:aan Ν,Ν-dimetyyliasetamidia ja laimennetaan metanolilla konsentraatioon 2 μg/ml (vastaten määrää 40 ppm) .

Liuosten pitoisuus tutkitaan HPLC:llä. HPLC-menetelmän lineaarisuus osoitettiin aloe-emodiinistandardiliuoksella alueella 0,11 μιη/ml (vastaten 2,2 ppm) - 53,6 pg/ml (vastaten 1072 ppm). Pitoisuuden määritys tapahtuu Merck HPLC-kolonnilla Lichrocart 250-4, joka on pakattu Li-Chrospher-100 PR-18:lla, 5 μπι, 40 °C:ssa liikkuvalla faasilla, jossa on l-%:sta etikkahappoa metanolissa (tilavuus/tilavuus), l-%:sta etikkahappoa vedessä (tilavuus/tilavuus) ja asetonitriiliä suhteessa 49:46:5).

Vaiheen B tuotteen analyyttinen määritys, ia reiini-9-antroni- 8-alukosidin. jossa aloe-emodiinikomponenttien pitoisuus on 41 ppm, aloe-emodiinina määritettynä 23 104893

Tutkittava aine muutetaan rauta(III)kloridilla hapettamalla samanaikaisella suolahappohydrolyysillä vesiliuoksen ja hiili-tetrakloridin 2-faasiseoksessa reiiniksi ja aloe-emodiiniksi. Reiini muutetaan suolaksi niin, että se voidaan erottaa aloe-emodiinista neste/neste-jaolla. Orgaanisessa faasissa esiintyvä aloe-emodiini määritetään HPLCillä.

Claims (11)

24 1 0 4 8 9 3

1. Menetelmä diasetyylireiinin talteen ottamiseksi, joka diase-tyylireiini on oleellisesti vapaata aloe-emodiinikomponenteis-ta, tunnettu siitä, että A) aloe-emodiinikomponenttia sisältävää reiini-9-antroni-8-glukosidia alistetaan neste/neste-jaolle veden kanssa vain osittain sekoittuvan, polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesipohjaisen faasin välillä, B) jaon jälkeen vesifaasiin sisältyvä reiini-9-antroni-8-gluko-sidi hapetetaan reiini-9-antroni-8-glukosidiksi, C) glukoosiryhmä reiini-9-antroni-8-glukosidin 8-asemassa lohkaistaan happamassa väliaineessa ja D) saatu reiini asetyloidaan, ja otetaan talteen diasetyyli-reiini.

2. Menetelmä aloe-emodiinikomponenteista oleellisesti vapaan diasetyylireiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A) sennosidiseos alistetaan pelkistykselle vastaaviksi reiini- 9-antroni-8-glukosidi- ja aloe-emodiini-9-antroni-8-glukosidi-yhdisteiksi, B) suoritetaan saatujen yhdisteiden neste/neste-jako veden kanssa vain osaksi sekoittuvan polaarisen orgaanisen liuottimen ja vesipohjaisen faasin välillä, C) jaon jälkeen vesifaasiin sisältyvät reiini-9-antroni-8-glu-kosidiyhdisteet hapetetaan vastaavaksi antrakinoniyhdisteeksi, D) glukoosiryhmä antrakinoniyhdisteen 8-asemassa lohkaistaan happamassa väliaineessa ja 25 104893 E) saatu 1,8-dihydroksiantrakinoniyhdiste asetyloidaan ja di-asetyylireiini otetaan talteen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa A käytetään pelkistysreagenssina alkali-metalliditioniittia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toimitaan pH-arvossa 7-9.

5. Yhden patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistys suoritetaan useita kertoja.

6. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polaarisena orgaanisena liuottimena käytetään neste/neste-jakoon asetonia tai 2-butanolia.

7. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neste/neste-jakoon käytetään vesipohjaista faasia, jonka redokspotentiaali on -210 mV tai negatiivisempi.

8. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neste/neste-jako suoritetaan vastavirtaan .

9. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetusreagenssina käytetään rauta (III) suolaa, edullisesti rauta(III)sulfaattia.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sennosidiseos on saatavissa uuttamalla sennarohtoa vesipitoisella metanolilla, edullisesti puskurin läsnä ollessa.

11. Yhden edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu diasetyylireiini uudelleen- 26 104893 kiteytetään, jolloin diasetyylireiini muutetaan alkalimetalli-suolaksi, tämä otetaan vesipohjaiseen Cj_3~alkoholiin, ja diasetyylireiini seostetaan jälleen happoa lisäämällä. » · 27 104893