ES3067019T3 - Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors - Google Patents

Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors

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ES3067019T3
ES3067019T3 ES20184468T ES20184468T ES3067019T3 ES 3067019 T3 ES3067019 T3 ES 3067019T3 ES 20184468 T ES20184468 T ES 20184468T ES 20184468 T ES20184468 T ES 20184468T ES 3067019 T3 ES3067019 T3 ES 3067019T3
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utr
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Doron Merkler
Sandra Margarete Kallert
Mario Kreutzfeldt
Abdelrahman Stephanie Gabrielle Darbre
Nicolas Jean Page
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Abstract

Se proporciona aquí un segmento genómico de arenavirus modificado, en el que dicho segmento ha sido diseñado para contener un ORF viral en una posición distinta a la del ORF de tipo silvestre. Asimismo, se proporciona una partícula de arenavirus que comprende dicho segmento genómico. También se proporcionan una vacuna y una composición farmacéutica que contienen la partícula de arenavirus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Arenavirus trisegmentados como vectores de vacunas
[0003] 1. INTRODUCCIÓN
[0004] La presente solicitud se refiere a arenavirus con reordenamientos de sus marcos de lectura abiertos ("ORF") en sus genomas. En particular, se describe en el presente documento un segmento genómico de arenavirus modificado, en el que el segmento genómico de arenavirus está diseñado para llevar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. También se describen aquí partículas de arenavirus trisegmentadas que comprenden un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S. Los arenavirus aquí descritos pueden ser adecuados para vacunas y/o tratamiento de enfermedades y/o para su uso en inmunoterapias.
[0005] 2. FONDO
[0006] 2.1 Investigación sobre el virus de la coriomeningitis linfocítica y enfermedades humanas
[0007] El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), miembro de la familia arenaviridae, es un virus modelo de ratón prototípico en la investigación sobre infecciones víricas. Desde su aislamiento en los años treinta (Rivers y McNair Scott, 1935, Science, 81(2105): 439-440) los estudios realizados con este virus han desvelado muchos conceptos clave en inmunología y patogénesis víricas (resumidos en Zinkemagel, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:1-5; Oldstone, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263:83-117). El LCMV se ha utilizado ampliamente para investigar la biología molecular viral y las respuestas inmunitarias, especialmente en el contexto de la infección persistente. El hospedador natural del LCMV son los ratones, sin embargo, varios informes revelaron que el LCMV también podría ser un patógeno humano desatendido (Barton, 1996, Clin. Infecta. Dis, 22(1):197; Wright et al., 1997, Pediatrics 100(1): E9). Además, se han encontrado otros numerosos miembros de la familia de los arenavirus en poblaciones de roedores de todo el mundo. Además del arenavirus del Viejo Mundo Lassa virus (LASV), que puede encontrarse en África, varios arenavirus del Nuevo Mundo como Junin (JUNV), Guanarito o Machupo prevalecen en diversas poblaciones de roedores de Sudamérica (Johnson et al., 1966, Am J Trop Med Hyg, 15(1): 103-106; Tesh et al., 1993, Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235; Mills et al., 1994, Trop Med Hyg 51(5): 554-562). Al transmitirse a los seres humanos, muchos de esos virus pueden causar fiebre hemorrágica vírica asociada a una elevada mortalidad (Geisbert y Jahrling, 2004, Nat Med 10(12 Suppl): S110-121).
[0008] 2.2 Organización genómica del virus de la coriomeningitis linfocítica
[0009] Los arenavirus son virus con envoltura. Su genoma consta de dos segmentos de RNA monocatenario de sentido negativo (L: 7,2 kb, S: 3.4 kb). Cada segmento codifica para dos genes virales en orientaciones opuestas. El segmento corto (segmento S) codifica la glicoproteína (GP) viral precursora (GP-C; 75 kDa) y la nucleoproteína (NP; 63 kDa) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). El segmento largo (segmento L) expresa la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp; proteína L; aproximadamente 200 kDa) y la proteína matriz Z (proteína Z), una proteína dedo RING (11 kDa) (Fig. 1A) (Salvato et al., 1988, Virology 164(2): 517-522). El precursor de la GP GP-C se escinde postraduccionalmente en GP-1 y GP-2, que permanecen asociadas de forma no covalente (Buchmeier y Oldstone 1979, Virology 99(1): 111-120). Los trímeros de GP-1 y GP-2 se ensamblan como picos en la superficie de los viriones y son esenciales para mediar la entrada en las células huésped mediante la interacción con los receptores de la superficie celular. Durante mucho tiempo se afirmó que la unión y la entrada del virus en las células huésped estaban mediadas por la interacción de la GP del LCMV con el receptor celular α-Distroglicano como único receptor celular para el LCMV (Cao et al., 1998, Science, 282(5396):2079-2081). Sólo muy recientemente se postularon tres moléculas humanas adicionales (Axl y Tyro3 de la familia TAM y la molécula de adhesión intracelular específica de células dendríticas captadora de ICAM-3 no integrina) como receptores adicionales para el LCMV y el LASV, un pariente cercano del LCMV, que permiten la entrada del LCMV en las células de manera independiente de la α-distroglicana (Shimojima y Kawaoka, 2012, J. Vet. Med., 74(10):1363-1366; Shimojima et al., 2012, J. Virol., 86(4):2067-2078). El NP se une al RNA vírico, formando la nucleocápside, que sirve de molde para la proteína L vírica. La nucleocápside asociada a la proteína viral L forma el llamado complejo ribonucleoproteico, que es activo tanto en la replicación como en la transcripción y representa la unidad mínima de infectividad viral. Se ha demostrado que el NP y la proteína L son los factores transactores mínimos necesarios para la transcripción y replicación del RNA vírico (Lee et al., 2000, J Virol 74(8): 3470-3477). Los dos genes de cada segmento están separados por una región intergénica no codificante (IGR) y flanqueados por regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. El IGR forma una estructura de horquilla estable y se ha demostrado que está implicado en la terminación dependiente de la estructura de la transcripción del RNAm viral (Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526). Los nucleótidos terminales de la UTR muestran un alto grado de complementariedad, lo que da lugar a la formación de estructuras secundarias. Se sabe que estas estructuras panhandle sirven como promotor viral para la transcripción y replicación, y su análisis mediante mutagénesis dirigida al sitio ha revelado dependencia de la secuencia y la estructura, no tolerando ni siquiera cambios menores en la secuencia (Perez and de la Torre, 2003, Virol 77(2): 1184-1194).
[0010] 2.3 Sistema Genético Inverso
[0011] [0004]Los RNA aislados y purificados de virus de cadena negativa como el LCMV no pueden servir directamente como RNAm, es decir,no pueden traducirse cuando se introducen en las células. Por consiguiente, la transfección de células con RNA viral no conduce a la producción de partículas virales infecciosas. Para generar partículas virales infecciosas de virus de RNA de cadena negativa a partir de cDNA en células permisivas cultivadas, el segmento o segmentos de RNA viral deben transcomplementarse con los factores mínimos necesarios para la transcripción y la replicación. Con la ayuda de un sistema de minigenoma que se publicó hace varios años, finalmente se pudieron analizar los elementos virales de acción cis y los factores de transacción implicados en la transcripción, la replicación y la formación de partículas virales (Lee et al., 2000, J Virol 74(8): 3470-3477; Lee et al., 2002, J Virol 76(12): 6393-6397; Perez y de la Torre 2003, J Virol 77(2): 1184-1194; Pinschewer et al., 2003, J Virol 77(6): 3882-3887; Pinschewer et al., 2005, J Virol 79(7): 4519-4526.). También se han establecido sistemas genéticos inversos para otros arenavirus como el LASV y el virus Tacaribe (Lopez et al., 2001, J Virol 75(24): 12241-12251; Hass et al., 2004, J Virol 78(24): 13793-13803). Dos publicaciones demostraron la recuperación de LCMV infeccioso íntegramente a partir de cDNA utilizando, respectivamente, plásmidos dirigidos por pol-I/pol-II o por T7/pol-II (denominado «rescate viral»). (Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103(12): 4663-4668; Sanchez y de la Torre, 2006, Virology 350(2): 370-380).
[0012] 2.4 LCMV Recombinante que Expresa Genes de Interés
[0013] La generación de virus recombinantes de RNA de cadena negativa que expresan genes extraños de interés se ha perseguido durante mucho tiempo. Se han publicado estrategias diferentes para otros virus (Garcia-Sastre et al., 1994, J Virol 68(10): 6254-6261; Percy et al., 1994, J Virol 68(7): 4486-4492; Flick y Hobom, 1999, Virology 262(1): 93-103; Machado et al., 2003, Virology 313(1): 235-249). En el pasado se ha demostrado que es posible introducir genes extraños adicionales en el genoma de partículas bisegmentadas de LCMV (Emonet et al., 2009, PNAS, 106(9):3473-3478). Se insertaron dos genes extraños de interés en el genoma bisegmentado de LCMV, dando lugar a partículas LCMV trisegmentadas (r3LCMV) con dos segmentos S y un segmento L. En el virus trisegmentado, publicado por Emonetet al.,(2009), tanto NP como GP se mantuvieron en su posición natural respectiva en el segmento S y, por tanto, se expresaron bajo sus promotores naturales en la UTR flanqueante (Fig.1B). Sin embargo, la presente solicitud revela que la partícula trisegmentada de LCMV divulgada por Emonetet al.,ensambla predominantemente partículas bisegmentadas (es decir,el arenavirus sólo empaqueta uno en lugar de dos segmentos S), lo que resulta en un crecimiento atenuado y una fuerte presión de selección para recombinar los dos segmentos S. Como se muestra más adelante en la presente solicitud, dicha recombinación se encuentra de forma reproducible y da lugar a la reversión fenotípica a virus de tipo silvestre y a la pérdida del transgén.
[0014] 2.5 Arenavirus de Replicación Defectuosa
[0015] Recientemente, se ha demostrado que una partícula infecciosa de arenavirus puede diseñarse para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su material genético en células infectadas, pero incapaz de producir más progenie en células normales, no diseñadas genéticamente (es decir,una partícula infecciosa de arenavirus de replicación deficiente) (Publicación Internacional N.º: WO 2009/083210 A y Publicación Internacional N.º: WO/2014/140301 A1.
[0016] 3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0017] La presente solicitud se refiere a arenavirus con reordenamientos de sus ORF en sus genomas. En particular, la presente solicitud se refiere a un segmento genómico de arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. La presente solicitud también proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S que no se recombinan en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. La presente solicitud demuestra que la partícula de arenavirus trisegmentada puede diseñarse para mejorar la estabilidad genética y garantizar una expresión transgénica duradera.
[0018] La invención proporciona un segmento genómico de arenavirus, en el que el segmento genómico está diseñado para llevar un marco de lectura abierto ("ORF") viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF, en el que el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:
[0019] (i) un segmento S, en el que el ORF que codifica la nucleoproteína ("NP") está bajo el control de una región no traducida 5' ("UTR") de arenavirus;
[0020] (ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína de matriz Z ("proteína Z") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0021] (iii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la RNA polimerasa L dependiente de RNA ("proteína L") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0022] (iv) un segmento S, en el que el ORF que codifica la glicoproteína viral ("GP") está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus;
[0023] (v) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vi) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (viii) un segmento L, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ix) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (x) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (xi) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (xii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
[0024] La invención proporciona además un cDNA del segmento genómico del arenavirus de la invención.
[0025] La invención proporciona además un vector de expresión de DNA que comprende el cDNA de la invención.
[0026] La invención proporciona además una célula huésped que comprende el vector de expresión de DNA de la invención.
[0027] La invención proporciona además una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende el segmento genómico de arenavirus de la invención, en la que la partícula de arenavirus es infecciosa y competente para la replicación.
[0028] La invención proporciona además una vacuna que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0029] Por último, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0030] En ciertas realizaciones, un vector viral tal como se proporciona en el presente documento es infeccioso,es decir,es capaz de entrar o inyectar su material genético en una célula huésped. En ciertas realizaciones más específicas, un vector viral tal como se proporciona en el presente documento es infeccioso, esdecir,es capaz de introducir o inyectar su material genético en una célula huésped seguido de la amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped. En ciertos ejemplos, el vector viral es un vector viral arenavirus infeccioso, de replicación deficiente, diseñado para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas, pero incapaz de producir más partículas progenitoras infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones, el vector viral arenavirus infeccioso es competente para la replicación y capaz de producir más partículas progenitoras infecciosas en células normales, no modificadas genéticamente. En ciertas realizaciones más específicas, dicho vector viral competente en replicación está atenuado en relación con el virus de tipo silvestre del que deriva el vector viral competente en replicación.
[0031] 3.1 Marco de Lectura Abierto No Natural
[0032] Por consiguiente, en un aspecto, el presente documento proporciona un segmento genómico de arenavirus. Según la invención, el segmento genómico está diseñado para llevar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. Según la invención, el segmento genómico del arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:
[0033] (i) un segmento S, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0034] (ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iv) un segmento S, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (v) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vi) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (viii) un segmento L, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ix) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (x) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (xi) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (xii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
[0035] En algunas realizaciones, la UTR 3' del arenavirus es la UTR 3' del segmento S del arenavirus o del segmento L del arenavirus. En ciertas realizaciones, la 5' UTR del arenavirus es la 5' UTR del segmento S del arenavirus o del segmento L del arenavirus.
[0036] [0018]También se proporciona en el presente documento un cDNA aislado de un segmento genómico de arenavirus proporcionado en el presente documento. También se proporciona un vector de expresión de DNA que comprende un cDNA del segmento genómico del arenavirus.
[0037] También se proporciona en el presente documento una célula huésped que comprende el segmento genómico del arenavirus, un cDNA del segmento genómico del arenavirus o el vector que comprende un cDNA del segmento genómico del arenavirus.
[0038] También se divulga en el presente documento una partícula de arenavirus que comprende el segmento genómico de arenavirus y un segundo segmento genómico de arenavirus de modo que la partícula de arenavirus comprende un segmento S y un segmento L.
[0039] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es infecciosa y competente para la replicación. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus está atenuada. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus es infecciosa pero incapaz de producir más progenie infecciosa en células no complementarias.
[0040] En ciertas realizaciones, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente.
[0041] En ciertas realizaciones, al menos uno de los cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones, sólo se elimina uno de los cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En una realización más específica, el ORF que codifica la GP se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones, el ORF que codifica el NP se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En algunas realizaciones, el ORF que codifica la proteína Z se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otras realizaciones, el ORF que codifica la proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0042] En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno. En otras realizaciones, el ORF heterólogo que codifica un antígeno se selecciona entre antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos del virus varizella zoster, antígenos del citomegalovirus, antígenos de micobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.
[0043] En ciertas realizaciones, el crecimiento o la infectividad de la partícula de arenavirus no se ve afectada por el ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0044] También se proporciona en el presente documento un método de producción del segmento genómico del arenavirus. En ciertas realizaciones, el método comprende la transcripción del cDNA del segmento genómico del arenavirus.
[0045] También se proporciona en el presente documento un método para generar la partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones, el método de generación de la partícula de arenavirus comprende:
[0046] (i) transfectar en una célula huésped el cDNA del segmento genómico del arenavirus;
[0047] (ii) transfectar en la célula huésped un plásmido que comprenda el cDNA del segundo segmento genómico del arenavirus;
[0048] (iii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación del virus; y
[0049] (iv) recolección de la partícula de arenavirus.
[0050] En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento L y del segmento S se realiza utilizando un promotor bidireccional.
[0051] En ciertas realizaciones, el método comprende además transfectar en una célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican una arenavirus polimerasa. En realizaciones aún más específicas, la polimerasa es la proteína L. En otras realizaciones, el método comprende además transfectar en la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican el NP.
[0052] En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento L, y el segmento S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:
[0053] (i) un promotor de RNA polimerasa I;
[0054] (ii) un promotor de RNA polimerasa II; y
[0055] (iii) un promotor T7.
[0056] En otro ejemplo, se proporciona aquí una vacuna que comprende una partícula de arenavirus, en la que al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente; o en la que al menos uno de los ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de otro organismo distinto de un arenavirus; o en la que sólo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones más específicas, la vacuna comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
[0057] En otro ejemplo, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus, en la que al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente; o en la que al menos uno de los ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de otro organismo distinto de un arenavirus; o en la que sólo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En realizaciones más específicas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
[0058] En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de LCMV. En algunas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de la cepa LCMV MP, la cepa Armstrong o la cepa Armstrong Clone 13. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de la cepa Candid #1 de la vacuna contra el virus Junin, o de la cepa XJ Clone 3 de la vacuna contra el virus Junin.
[0059] 3.2 Arenavirus Trisegmentados
[0060] En un aspecto, se proporciona aquí una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En algunas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación tras 70 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón de tipo I, receptor de interferón de tipo II y gen activador de la recombinación 1 (RAG1), y que han sido infectados con 10<4>PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S, uniendo dos ORF de arenavirus en uno solo en lugar de dos segmentos separados, anula la actividad promotora viral.
[0061] En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación tras 70 días de infección persistente en ratones que carecen del receptor de interferón de tipo I, del receptor de interferón de tipo II y del gen activador de la recombinación 1 (RAG1), y que han sido infectados con 10<4>PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmental de los dos segmentos L, uniendo dos ORF de arenavirus en uno solo en lugar de dos segmentos separados, anula la actividad promotora viral.
[0062] En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en:
[0063] (i) un segmento S, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus (ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iv) un segmento S, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (v) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; y
[0064] (vi) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
[0065] En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos L se selecciona del grupo que consiste en:
[0066] (i) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0067] (ii) un segmento L, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (iv) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (v) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (vi) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
[0068] En ciertas realizaciones, la UTR 3' trisegmentada de partículas de arenavirus es la UTR 3' del segmento S de arenavirus o del segmento L de arenavirus. En otras realizaciones, la UTR 5' trisegmentada de la partícula de arenavirus es la UTR 5' del segmento S de arenavirus o del segmento L de arenavirus.
[0069] En ciertas realizaciones, los dos segmentos S comprenden (i) uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus; o (ii) uno o dos ORF duplicados de arenavirus; o (iii) un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus y un ORF duplicado de arenavirus.
[0070] En ciertas realizaciones, los dos segmentos L comprenden (i) uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus; o (ii) uno o dos ORF duplicados de arenavirus; o (iii) un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus y un ORF duplicado de arenavirus.
[0071] En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno. En otras realizaciones, el ORF heterólogo que codifica un antígeno se selecciona entre antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos del virus varizella zoster, antígenos del citomegalovirus, antígenos de micobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.
[0072] En ciertas realizaciones, al menos un ORF heterólogo codifica una proteína fluorescente. En otras realizaciones, la proteína fluorescente es una proteína verde fluorescente (GFP) o una proteína roja fluorescente (RFP).
[0073] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro ORF de arenavirus. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa y competente para la replicación.
[0074] En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno o más de los cuatro ORF de arenavirus. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero incapaz de producir más progenie infecciosa en células no complementarias.
[0075] En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno de los cuatro ORF de arenavirus, en los que la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero incapaz de producir más progenie infecciosa en células no complementarias.
[0076] En algunos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece del ORF GP.
[0077] En otro aspecto, se proporciona aquí una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, un primer segmento S está diseñado para llevar un ORF que codifica GP en una posición bajo el control de un UTR 3' de arenavirus y un ORF que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de un UTR 5' de arenavirus. En algunas realizaciones, un segundo segmento S está diseñado para llevar un ORF que codifica el NP en una posición bajo el control de un UTR 3' de arenavirus y un ORF que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de un UTR 5' de arenavirus.
[0078] En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, un primer segmento S está diseñado para llevar un ORF que codifica GP en una posición bajo el control de un UTR 5' de arenavirus y un ORF que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de un UTR 3' de arenavirus. En algunas realizaciones, un segundo segmento S está diseñado para llevar un ORF que codifica NP en una posición bajo el control de un UTR 5' de arenavirus y un ORF que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
[0079] En ciertas realizaciones, el gen de interés codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno. En otras realizaciones, el gen de interés codifica un antígeno seleccionado entre antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos del virus varizella zoster, antígenos del citomegalovirus, antígenos del mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores. En otra realización, al menos un gen de interés codifica una proteína fluorescente. En una realización específica, la proteína fluorescente es GFP o RFP.
[0080] También se proporciona aquí un cDNA aislado del genoma de la partícula trisegmentada de arenavirus. También se proporciona en el presente documento un vector de expresión de DNA que comprende un cDNA del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada. También se proporcionan aquí uno o más vectores de expresión de DNA que comprenden individualmente o en su totalidad el cDNA del arenavirus trisegmentado.
[0081] También se proporciona en el presente documento una célula huésped que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada, el cDNA del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada o el vector que comprende el cDNA del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada.
[0082] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se atenúa
[0083] También se proporciona aquí un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método de generación de la partícula de arenavirus comprende:
[0084] (i) transfectar en una célula huésped uno o más cDNA de un segmento L y dos segmentos S;
[0085] (ii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación del virus; y
[0086] (iii) recolección de la partícula de arenavirus.
[0087] También se proporciona en el presente documento un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método de generación de la partícula de arenavirus trisegmentada comprende:
[0088] (i) transfectar en una célula huésped uno o más cDNA de dos segmentos L y un segmento S;
[0089] (ii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación del virus; y
[0090] (iii) recolección de la partícula de arenavirus.
[0091] En ciertas realizaciones, la transcripción de un segmento L y dos segmentos S se realiza utilizando un promotor bidireccional. En algunas realizaciones, la transcripción de los dos segmentos L y un segmento S se lleva a cabo utilizando un promotor bidireccional.
[0092] En ciertas realizaciones, el método comprende además transfectar en una célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican una arenavirus polimerasa. En realizaciones aún más específicas, la polimerasa es la proteína L. En otras realizaciones, el método comprende además transfectar en la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican la proteína NP.
[0093] En ciertas realizaciones, la transcripción de un segmento L, y dos segmentos S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:
[0094] (i) un promotor de RNA polimerasa I;
[0095] (ii) un promotor de RNA polimerasa II; y
[0096] (iii) un promotor T7.
[0097] En ciertas realizaciones, la transcripción de los dos segmentos L, y un segmento S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:
[0098] (i) un promotor de RNA polimerasa I;
[0099] (ii) un promotor de RNA polimerasa II; y
[0100] (iii) un promotor T7.
[0101] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tiene el mismo tropismo que la partícula de arenavirus bisegmentada. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es de replicación deficiente.
[0102] En otra realización, se proporciona aquí una vacuna que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0103] En otra realización, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0104] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de LCMV. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de la cepa LCMV MP, la cepa Armstrong o la cepa Armstrong Clone 13. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de la cepa Candid #1 de la vacuna contra el virus Junin, o de la cepa XJ Clone 3 de la vacuna contra el virus Junin.
[0105] 3.3 Convenciones y Abreviaturas
[0106]
[0108]
[0109]
[0112] 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0114]
[0116] Figura 1:Los virus recombinantes trisegmentados muestran un crecimiento deficiente en comparación con el LCMV de tipo silvestre, independientemente de la posición del ORF GP en el genoma. (A-C) Representación esquemática de la organización genómica del LCMV bisegmentado y trisegmentado. El genoma bisegmentado del LCMV de tipo silvestre consta de un segmento S que codifica la GP y la NP y un segmento L que codifica la proteína Z y la proteína L (A). Ambos segmentos están flanqueados por los respectivos UTR 5' y 3'. El genoma de los LCMV recombinantes trisegmentados (r3LCMV) consta de un segmento L y dos segmentos S con una posición donde insertar un gen de interés (aquí GFP) en cada uno de los segmentos S. (B) r3LCMV-GFP<natural>(nat) tiene todos los genes virales en su posición natural mientras que el ORF GP en r3LCMV-GFP<artificial>(art) está yuxtapuesto artificialmente y se expresa bajo el control del 3' UTR (C). (D) Cinética de crecimiento de los virus indicados en células BHK-21, infectadas a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 (LCMV de tipo silvestre: triángulos grises; r3LCMV-GFP<nat>: círculos negros; r3LCMV-GFP<art>: cuadrados blancos). Se tomó sobrenadante en los puntos temporales indicados tras la infección y se determinaron los títulos virales mediante ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error están ocultas en el tamaño del símbolo.
[0117] Figura 2:Las preparaciones de virus trisegmentados contienen una mayoría de partículas bisegmentadas deficientes en replicación (r2LCMV). (A) r2LCMV (barras blancas), r3LCMV-GFP/RFP<art>(barras negras, GFP-GP, RFP-NP) y r3LCMV-GFP/RFP<nat>(barras grises, GP-GFP, RFP-NP) se cultivaron en células BHK-21 de tipo silvestre y se determinó la infectividad del sobrenadante en células BHK-21 de tipo silvestre no complementarias (BHK21), células BHK-21 que expresan GP (BHK-GP) o células BHK-21 que expresan NP (BHK-NP). Los títulos en células BHK-21 y BHK-GP se determinaron mediante la tinción de focos virales NP-positivos. Los títulos en células BHK-21 complementarias de NP se determinaron contando los focos positivos para GP. Los títulos se normalizaron con respecto al título medio obtenido cuando se evaluaron en células BHK-21 y, por tanto, se expresan como múltiplo del mismo. Las barras representan la media±SEM de seis réplicas por grupo. ns.: no significativo estadísticamente (p≥ 0,05);**: p< 0,01 mediante ANOVA de 1 vía seguido de la posprueba de Dunnett utilizando r2LCMV como referencia. (B) El r2LCMV (gráfico de la izquierda) o el r3LCMV-GFP/RFP<art>(gráficos del centro y de la derecha) se cultivaron en células BHK-21 de tipo silvestre (BHK21; gráfico de la izquierda y del centro) o en células BHK-21 que expresaban NP (BHK-NP, gráfico de la derecha) y la fluorescencia se evaluó 12 horas después de la infección mediante citometría de flujo. Las células infectadas con r2LCMV se utilizaron como control degating. Se muestra un gráfico representativo por condición. (C) Cuantificación de células GFP+, RFP+ o GFP+RFP+ doblemente positivas 12 horas después de la infección con r3LCMV-GFP/RFP<art>en células BHK-21 o BHK-NP. Las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo. ns.: no significativo estadísticamente (p≥ 0,05);***: p <0,001 mediante la pruebat destudent no apareada de dos colas.
[0118] Figura 3:Diseño y cinética de crecimiento de virus recombinantes trisegmentados portadores de un ORF GP parcialmente optimizado en codones o de una etiqueta genética en el IGR del segmento S. (A) Esquema del segmento S modificado genéticamente en el que los 255 pares de bases de terminal C de GP están optimizados para el codón y NP se sustituye por GFP (ORF de GP denominado "WE/WET"). La cinética de crecimiento del r3LCMV-WEWET/GFP<nat>trisegmentado que consta de dos segmentos S y uno L, como se detalla en la Fig.1B, con la modificación del segmento S que contiene GP como se muestra en (A) se realizó en células BHK-21. Se tomó sobrenadante en los puntos temporales indicados tras la infección a moi = 0,01 y se determinaron los títulos virales mediante ensayo de formación de foco (B). Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error están ocultas en el tamaño del símbolo. (C) Esquema del segmento S que codifica NP en el que se ha eliminado un par de bases del IGR para "marcar" genéticamente este elemento de RNA no codificante. El residuo G eliminado (indicado con una flecha) se encuentra fuera de la estructura crítica de bucle de tallo del IGR. Se realizaron cinéticas de crecimiento comparativas de virus trisegmentados con o sin etiqueta genética en el IGR del segmento S que codifica NP (r3LCMV-GFP<nat>: círculos negros; r3LCMV-GFP<nat>IGR*: círculos blancos) en células BHK-21 a una moi de 0,01. Se recogió sobrenadante en los puntos temporales indicados tras la infección y se determinaron los títulos virales mediante ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo. Se muestran datos representativos de uno de dos experimentos independientes.
[0119] Figura 4: La infección persistente por r3LCMV-GFP<nat>pero no por r3LCMV-GFP<art>en ratones inmunodeficientes alcanza niveles de viremia equivalentes a los del virus silvestre bisegmentado y provoca la pérdida de expresión de GFP. (A) Se infectaron ratones AGRAG por vía intravenosa con 1x10<4>PFU de r3LCMV-GFP<nat>(círculos negros), r3LCMV-GFP<art>(cuadrados blancos) o r2LCMV bisegmentado de control (triángulos grises) y se monitorizó la viremia a lo largo del tiempo. Los símbolos representan la media±SEM de 3-7 ratones por grupo. (B) Se muestra la viremia de LCMV en el día 127 tras la infección intravenosa de ratones AGRAG con 1x10<4>PFU de r3LCMV-GFP<nat>o r3LCMV-GFP<art>. Se realizaron ensayos de inmunofocalización para detectar la nucleoproteína NP (círculos grises) o la GFP (círculos blancos). Los símbolos representan ratones individuales. ns.: no significativo estadísticamente (p≥ 0,05);***: p <0,001 (pruebat destudent no apareada de dos colas). (C-E) La sangre de ratones AGRAG infectados conr 3LCMV-GFP<nat>, r3LCMV-GFP<art>o r2LCMV se analizó en el día 120 tras la infección mediante citometría de flujo para detectar la presencia de células GFP+. Los monocitos y macrófagos se identificaron utilizando la estrategia degatingdescrita en (C). En (D) se muestra un gráfico FACS representativo de cada grupo y una superposición de histograma representativa de la expresión de GFP. (E) Cuantificación de la población GFP+ dentro de la población de monocitos/macrófagos GR1 CD11b+. Los símbolos representan ratones individuales.
[0120] Figura 5: La infección persistente de ratones por r3LCMV-GFP<nat>provoca la recombinación del segmento S y la pérdida de transgenes funcionales de longitud completa. Se aisló RNA viral del suero de ratones AGRAG el día 127 tras la infección intravenosa con 1x10<4>PFU r3LCMV-GFP<nat>o r3LCMV-GFP<art>. El RNA viral se transcribió a la inversa y el cDNA portador de las secuencias NP y GP se amplificó por PCR con cebadores específicos para cada gen. (A) Electroforesis de DNA de los productos de PCR obtenidos tras (+RT, carriles 1-8) o sin transcripción inversa previa del molde de RNA (-RT, control negativo, carriles 9-12). Se utilizó suero de un animal ingenuo como control negativo independiente (n, carril 8) y un DNA plasmídico que codifica un segmento S de LCMV de tipo silvestre como control positivo (p, carril 17). Los amplicones de los carriles 1-3 se sometieron a secuenciación Sanger. (B) Secuencia representativa de cDNA obtenida del animal #3 (r3LCMV-GFP<nat>#3) que revela un segmento S recombinado que combina secuencias NP y GP, dos IGR (negrita) y una porción de terminal C de GFP (resaltado gris) (SEQ ID N.º: 17). (C) Esquema de tres secuencias recombinadas del segmento viral S aisladas el día 127 después de la infección, cada una de las cuales domina la población viral en un ratón AGRAG representativo. El IGR marcado que se origina en el segmento S portador de NP está marcado con una estrella (*). El tramo secuenciado se indica con una flecha doble (<-->). Las indicaciones de longitud de pares de bases (pb) describen los elementos IGR remanentes de GFP y truncados (acortados) anteriores.
[0121] Figura 6:La cinética de crecimiento del virus recombinado con dos IGR en el segmento S es similar a la del virus bisegmentado. Las células BHK-21 se infectaron a moi de 0,01 con LCMV bisegmentado (triángulos grises) portador de un segmento S de tipo silvestre, con r3LCMV-GFP<nat>trisegmentado (círculos negros) o con r2LCMV_2IGRs (diamantes blancos) portador de un segmento S correspondiente al producto de recombinación recuperado de un ratón AGRAG infectado (comparar Fig. 5). Se tomó sobrenadante en los puntos temporales indicados y se determinaron los títulos virales mediante ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error y están ocultas en el tamaño del símbolo. ns.: no significativo estadísticamente (p≥ 0,05); ***:p< 0,001 (ANOVA de 1 vía seguido de la prueba posterior de Bonferroni para comparaciones múltiples).
[0122] Figura 7:Modelo de los eventos de recombinación responsables de la pérdida del transgén r3LCMV-GP<nat>y mecanismo postulado de estabilidad genética de r3LCMV-GP<art>. Este modelo se basa en los datos de la secuencia de terminación de la transcripción del LCMV (Meyer and Southern, 1993, J Virol, 67(5):2621-2627) combinados con la evidencia genética inversa del IGR como señal de terminación de la transcripción (Pinschewer et al., 2005, J Virol, 79(7):4519-4526). En conjunto, estos hallazgos sugieren una pausa de la polimerasa dependiente de la estructura al completar la estructura en horquilla del IGR. Se descubrió que el remanente de GFP entre los dos IGR en los segmentos S recombinados se originaba en uno o en ambos segmentos S, lo que fomenta el modelo de que el cambio de molde de la polimerasa (también denominado elección de copia) se produjo cuando la polimerasa hizo una pausa, ya fuera durante la síntesis del genoma o del antigenoma (debajo de los escenarios A y B, respectivamente). (A) Durante la síntesis del antigenoma, la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) se inicia en el 3'UTR de una plantilla de segmento S genómico y luego lee a través del ORF NP y el IGR. Al final del IGR, la polimerasa se detiene debido a la estructura secundaria ("pausa de la polimerasa dependiente de la estructura"). El estancamiento de la polimerasa facilita la elección de la copia y la continuación de la replicación del RNA en una plantilla alternativa (aquí: genoma del segmento S codificador de GP). El cambio de plantilla debe producirse aguas arriba del codón de parada GP, y aparentemente es más probable que se dirija a secuencias cercanas o en la base de la horquilla IGR. Continuando su lectura a través del C-terminal de la GFP de la segunda plantilla, la polimerasa sintetiza entonces un segundo IGR, el ORF de la GP y el 5'UTR. (B) Durante la síntesis del genoma, la RdRp inicia la síntesis de RNA en el extremo 3' de una plantilla de segmento S antigenómico que contiene GP, sintetiza la 5'UTR, la GP y la mayor parte o la totalidad de la IGR, seguido de una pausa de la polimerasa dependiente de la estructura. Se produce la elección de la copia, cambiando a la porción de terminal C del ORF de la GFP cerca del IGR de un segmento S que contiene NP. La replicación añade así un fragmento de GFP, seguido de un IGR en toda su longitud, el PN y el 3'UTR. (C - D) El cambio de plantillas análogo a los escenarios (A) y (B) también puede ocurrir durante la síntesis del genoma o antigenoma de r3LCMV-GFP<art>. Este proceso también puede combinar ORFs NP y GP en un segmento de RNA. Sin embargo, este último se compone de dos 3' UTR en lugar de un 3'UTR y un 5'UTR, que sólo juntos forman un promotor viral funcional. Por lo tanto, tales moléculas no pueden ser amplificadas por la RdRp y, en consecuencia, no forman virus recombinados competentes para la replicación.
[0123] Figura 8:Se generó un vector vacunal r3LCMV-OVA<art>con una organización genómica análoga al r3LCMV-GFP<art>(véase la Fig.1C), pero con dos genes de ovoalbúmina (OVA) en lugar de los respectivos genes GFP de este último virus. Los ratones C57BL/6 fueron inmunizados por vía intramuscular (i.m.) con 10<4>PFU de r3LCMV-OVA<art>o con 108 partículas de un vector basado en el adenovirus 5 con deficiencia de replicación E1 que expresaba OVA.8 días después, los animales fueron eutanasiados y se analizó la respuesta de las células T a la vacunación. A: La frecuencia de células T CD8+ específicas de OVA en el bazo se determinó utilizando tetrámeros MHC de clase I cargados con el péptido SIINFEKL. Se determinaron las frecuencias celulares específicas de los epítopos entre los linfocitos CD8+ B220 negativos. B: La funcionalidad de las células T CD8+ específicas de OVA se analizó mediante ensayos de citocinas intracelulares utilizando el péptido SIINFEKL para la reestimulación. Las barras representan la media /- SEM de cinco ratones por grupo. *: p<0,05; **: p>0,01 mediante la prueba t de student de dos colas no emparejadas.
[0124] Figura 9:El LCMV trisegmentado induce células T CD8+ de memoria polifuncionales. Los ratones C57BL/6 fueron infectados i.v. con 1x10<5>PFU r3LCMV-OVA o 1x10<8>PFU rAd-OVA. Se tomaron muestras de bazo 25 días después de la infección y se analizó la funcionalidad de las células T CD8+ específicas de OVA mediante tinción intracelular de citocinas. El perfil de citoquinas (IFN-y, TNF-α e IL-2) de las células T específicas de OVA inducidas por r3LCMV-OVA (barras negras) o rAd-OVA (barras blancas) se muestra como porcentaje de células T CD8+ (A) o como número absoluto por bazo (B). Los símbolos y las barras representan la media±SEM de cinco ratones por grupo. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba t de student no emparejada de dos colas; los valores p resultantes se corrigieron para comparaciones múltiples multiplicándolos por el número de comparaciones (n=7). Se muestra un representante de dos experimentos similares.
[0125] Figura 10:El LCMV codificante de antígenos induce respuestas específicas de células T frente a antígenos extraños y autoantígenos. Ratones C57BL/6 fueron infectados i.v. con 1x10<5>PFU r3LCMV que codifica para el péptido Her2 de rata, humano o ratón (A, B y C, respectivamente). Se tomaron muestras de bazo nueve días después de la infección y se analizó la inducción de células T CD8+ antígeno-específicas funcionales mediante tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo. El perfil de citocinas (IFN-γ, TNF-α e IL-2) de las células T CD8+ específicas de Her2 inducidas por r3LCMV se muestra en % de células T CD8+. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres ratones por grupo.
[0126] Figura 11:El interferón-α se induce con la infección por r3LCMV, pero no con la infección por adenovirus o vacciniavirus recombinantes. Los ratones C57BL/6 fueron infectados i.v. con 1x10<5>PFU r3LCMV-OVA, 1x10<8>PFU rAd-OVA o 1x10<6>PFU rVacc-OVA. Se recogió sangre en los puntos temporales indicados tras la infección y se determinaron los niveles de Interferón-α en el suero mediante ELISA. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de cuatro ratones por grupo. ***:p< 0,001 (ANOVA de 2 vías seguido de la prueba posterior de Bonferroni para comparaciones múltiples). Se muestran datos representativos de uno de dos experimentos independientes.
[0127] Figura 12:Crecimiento en cultivo celular de r3JUNV-GFP<art>en comparación con r3JUNV-GFP<nat>y r2JUNV-wt. r3JUNV-GF<part>y r3JUNV-GFP<nat>se construyeron de forma análoga a los respectivos vectores r3LCMV esbozados esquemáticamente en la Figura 1. Para comparar sus propiedades de crecimiento en cultivo celular, se infectaron células 293T con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 con r2LCMV-wt,<r3JUNV-GFPart>y<r3JUNV-GFPnat>, y se recogió el sobrenadante en los puntos temporales indicados. Las unidades infecciosas (UIF) en el sobrenadante se determinaron mediante ensayo de inmunofoco. Los símbolos y las barras representan la media±SEM de tres réplicas por grupo y están ocultos en el tamaño del símbolo.
[0128] Figura 13:Los JUNV trisegmentados se atenúan drásticamente in vivo y sólo conducen a una viremia detectable tras la pérdida de GFP. (A) Los ratones AGRAG fueron infectados i.v. con 7x10<4>PFU de r3JCJNV-GFP<nat>(cuadrados grises), r3JUNV-GFP<art>(triángulos blancos) o la cepa de control r2JUNV bisegmentada Candid#1 (círculos negros), y se monitorizó la viremia a lo largo del tiempo. Los símbolos representan ratones individuales (n=3-7 por grupo). (B) La viremia de JUNV se determinó el día 120 tras la infección intravenosa de ratones AGRAG con 7x104 PFU de<r3JUNV-GFPnat>o<r3JUNV-GFPart>. Se realizaron ensayos de inmunofocalización para detectar la nucleoproteína NP (círculos grises) o la GFP (círculos blancos). Las cepas víricas utilizadas para inocular a los ratones se utilizaron como control de tinción en el ensayo. Los símbolos representan ratones individuales e inóculos, respectivamente.
[0129] Figura 14:Combinaciones homólogas y heterólogas de sensibilización y refuerzo de vectores vacunales trisegmentados basados en LCMV y JUNV inducen fuertes respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígeno P1A. (A) Los días 0 y 35 del experimento se inmunizó a ratones BALB/c con 8,5x10<4>PFU de r3JUNV-P1A<art>(r3JUNV-P1A) y r3LCMV-P1A<art>(r3LCMV-P1A) por vía intravenosa en las combinaciones homólogas o heterólogas indicadas en el gráfico. Las células T CD8+ específicas del epítopo se tiñeron utilizando tetrámeros MHC de clase I cargados con el epítopo P1A en combinación con el anticuerpo anti-CD8a. Se calculó la frecuencia de células que se unen al tetrámero P1A dentro del compartimento de células T CD8+ en sangre periférica (A) y el número absoluto de células T CD8+ que se unen al tetrámero P1A por microlitro de sangre periférica (B). Los símbolos representan la media /- SEM de 3-5 ratones por grupo y punto temporal.
[0131] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0133] [0065]La invención proporciona un segmento genómico de arenavirus, en el que el segmento genómico está diseñado para llevar un marco de lectura abierto ("ORF") viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF, en el que el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:
[0134] (i) un segmento S, en el que el ORF que codifica la nucleoproteína ("NP") está bajo el control de una región no traducida 5' ("UTR") de arenavirus;
[0135] (ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína de matriz Z ("proteína Z") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0136] (iii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la RNA polimerasa L dependiente de RNA ("proteína L") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0137] (iv) un segmento S, en el que el ORF que codifica la glicoproteína viral ("GP") está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus;
[0138] (v) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vi) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (viii) un segmento L, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ix) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (x) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; (xi) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (xii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
[0140] La invención proporciona además un cDNA del segmento genómico del arenavirus de la invención.
[0141] La invención proporciona además un vector de expresión de DNA que comprende el cDNA de la invención.
[0142] La invención proporciona además una célula huésped que comprende el vector de expresión de DNA de la invención.
[0143] La invención proporciona además una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende el segmento genómico de arenavirus de la invención, en la que la partícula de arenavirus es infecciosa y competente para la replicación.
[0144] La invención proporciona además una vacuna que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0145] Por último, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0146] 4.1 Arenavirus con un Marco de Lectura Abierto en una Posición No Natural
[0147] Aquí se proporcionan arenavirus con reordenamientos de sus ORF. En ciertas realizaciones, dichos arenavirus son competentes para la replicación e infecciosos. En el presente documento se proporcionan secuencias genómicas de dichos arenavirus. En un aspecto, se proporciona en el presente documento un segmento genómico de arenavirus, en el que el segmento genómico de arenavirus está diseñado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición en la que se encuentra el gen respectivo en virus aislados de la naturaleza, como LCMV-MP (véase SEQ ID N.º: 4 y 5) (denominada en el presente documento "posición de tipo silvestre") del ORF (es decir,una posición no natural). En una realización, la partícula de arenavirus es un LCMV.
[0148] Los segmentos genómicos y ORF de arenavirus de tipo silvestre son conocidos en la técnica. En concreto, el genoma del arenavirus consta de un segmento S y un segmento L. El segmento S contiene los ORF que codifican el GP y el NP. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas UTR 5' y 3' (véase la Figura 1A). Los segmentos genómicos ilustrativos de arenavirus de tipo silvestre se proporcionan en SEQ ID N.º: 1-10.
[0149] En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus puede modificarse para que lleve dos o más ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. En otras realizaciones, el segmento genómico del arenavirus puede modificarse para que lleve dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre.
[0150] Según la invención, un segmento genómico de arenavirus proporcionado en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en
[0151] (i) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0152] (ii) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0153] (iii) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0154] (iv) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
[0155] (v) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
[0156] (vi) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
[0157] (vii) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0158] (viii) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0159] (ix) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0160] (x) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
[0161] (xi) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y
[0162] (xii) un segmento L de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
[0163] En ciertas realizaciones, el ORF que se encuentra en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus descrito en el presente documento puede estar bajo el control de una UTR 3' de arenavirus o una UTR 5' de arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 3' del arenavirus es la UTR 3' del segmento S del arenavirus. En otra realización específica, la 3' UTR del arenavirus es la 3'UTR del segmento L del arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR del arenavirus es la 5' UTR del segmento S del arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del segmento L.
[0164] En otras realizaciones, el ORF que se encuentra en la posición no natural del segmento genómico del arenavirus aquí descrito puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservado del arenavirus (las regiones 19-20-nt de terminal 5'- y 3') (véase, p. ej.,Perez & de la Torre, 2003, J Virol.77(2): 1184-1194).
[0165] En ciertas realizaciones, el ORF que se encuentra en la posición no natural del segmento genómico del arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' UTR (véase, p. ej.,Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En otra realización, el ORF que se encuentra en la posición no natural del segmento genómico del arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3' UTR (véase, p. ej.,Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor de la 5' UTR del segmento S o del segmento L. En otra realización específica, el elemento promotor del 3' UTR es el 3' UTR el elemento promotor del segmento S o del segmento L.
[0166] En ciertas realizaciones, el ORF que se encuentra en la posición no natural del segmento genómico del arenavirus puede estar bajo el control de una UTR 3' truncada del arenavirus o una UTR 5' truncada del arenavirus (véase, p. ej.,Perez & de la Torre, 2003, J Virol.77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o del segmento L del arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del segmento S o del segmento L del arenavirus.
[0167] También se divulga en el presente documento una partícula de arenavirus que comprende un primer segmento genómico que ha sido diseñado para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF y un segundo segmento genómico de arenavirus de modo que la partícula de arenavirus comprende un segmento S y un segmento L. En ejemplos específicos, el ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF es uno de los ORF de arenavirus.
[0168] En ciertos ejemplos específicos, la partícula de arenavirus puede comprender un complemento completo de los cuatro ORF de arenaviru En ejemplos específicos, el segundo segmento genómico de arenavirus se ha diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En otros ejemplos específicos, el segundo segmento genómico de arenavirus puede ser el segmento genómico de tipo silvestre (es decir,comprende los ORF del segmento en la posición de tipo silvestre).
[0169] En ciertos ejemplos, el primer segmento genómico de arenavirus es un segmento L y el segundo segmento genómico de arenavirus es un segmento S. En otros ejemplos, el primer segmento genómico del arenavirus es un segmento S y el segundo segmento genómico del arenavirus es un segmento L.
[0170] Ejemplos no limitativos de la partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico con un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF y un segundo segmento genómico se ilustran en la Tabla 1.
[0171] Tabla 1
[0172] Partícula de arenavirus
[0173] *La posición 1 está bajo el control de un segmento S 5' UTR de arenavirus; la posición 2 está bajo el control de un arenavirus
[0174] S 3' UTR; la posición 3 está bajo el control de un arenavirus L segment 5' UTR; la posición 4 está bajo el control de un arenavirus
[0175] control de un segmento L 3' UTR de arenavirus.
[0178]
[0180] También se proporciona en el presente documento un cDNA del segmento genómico del arenavirus diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En ejemplos más específicos, se divulga en el presente documento un cDNA o un conjunto de cDNA de un genoma de arenavirus según se establece en la Tabla 1.
[0181] [0085]En ciertas realizaciones, un cDNA del segmento genómico del arenavirus que está diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF forma parte de un vector de expresión de DNA o se incorpora a él. En una realización específica, un cDNA del segmento genómico de arenavirus que está diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF forma parte de o se incorpora a un vector de expresión de DNA que facilita la producción de un segmento genómico de arenavirus tal como se describe en el presente documento. En otra realización, un cDNA descrito en el presente documento puede incorporarse a un plásmido. En la Sección 4.5.1 se ofrece una descripción más detallada de los cDNA o ácidos nucleicos y de los sistemas de expresión. Las técnicas para la producción de un cDNA son técnicas rutinarias y convencionales de biología molecular y de manipulación y producción de DNA. Puede utilizarse cualquier técnica de clonación conocida por el artesano experto. Estas técnicas son bien conocidas y están a disposición de los expertos en manuales de laboratorio como Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).
[0182] En ciertas realizaciones, el cDNA del segmento genómico del arenavirus que está diseñado para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF se introduce (p. ej., se transfecta) en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en el presente documento, es una célula huésped que comprende un cDNA del segmento genómico del arenavirus que está diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF (es decir,un cDNA del segmento genómico). En otras realizaciones, el cDNA aquí descrito forma parte o puede incorporarse a un vector de expresión de DNA e introducirse en una célula huésped. Así, en algunas realizaciones proporcionadas en el presente documento es una célula huésped que comprende un cDNA descrito en el presente documento que se incorpora en un vector. En otras realizaciones, el segmento genómico del arenavirus aquí descrito se introduce en una célula huésped.
[0183] En ciertas realizaciones, se describe en el presente documento un método de producción del segmento genómico de arenavirus, en el que el método comprende transcribir el cDNA del segmento genómico de arenavirus. En ciertas realizaciones, una proteína polimerasa viral puede estar presente durante la transcripción del segmento genómico del arenavirusin vitrooin vivo.
[0184] En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento genómico del arenavirus se lleva a cabo utilizando un promotor bidireccional. En otras realizaciones, la transcripción del segmento genómico del arenavirus se lleva a cabo utilizando un casete de expresión bidireccional (véase, p. ej.,Ortiz-Riañoet al.,2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188). En realizaciones más específicas, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de la polimerasa I como un promotor de la polimerasa II que leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente. En realizaciones aún más específicas, el casete de expresión bidireccional con promotores pol-I y pol-II leídos desde lados opuestos en el segmento L y el segmento S
[0185] En otras realizaciones, la transcripción del cDNA del segmento genómico del arenavirus descrito en el presente documento comprende un promotor. Ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de RNA polimerasa I, un promotor de RNA polimerasa II, un promotor de RNA polimerasa III, un promotor T7, un promotor SP6 o un promotor T3.
[0186] En ciertas realizaciones, el método de producción del segmento genómico del arenavirus puede comprender además la introducción en una célula huésped del cDNA del segmento genómico del arenavirus. En ciertas realizaciones, el método de producción del segmento genómico de arenavirus puede comprender además introducir en una célula huésped el cDNA del segmento genómico de arenavirus, en el que la célula huésped expresa todos los demás componentes para la producción del segmento genómico de arenavirus; y purificar el segmento genómico de arenavirus a partir del sobrenadante de la célula huésped. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
[0187] Se proporcionan en el presente documento líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionados en el presente documento. En la Sección 4.5 se ofrece una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, los sistemas de vectores y las líneas celulares aquí descritos.
[0188] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus tal como se describe en el presente documento da lugar a una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus descrita en el presente documento está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus está atenuada de tal manera que el virus sigue siendo, al menos parcialmente, capaz de propagarse y puede replicarsein vivo,pero sólo puede generar cargas virales bajas que dan lugar a niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Estos virus atenuados pueden utilizarse como composición inmunogénica. Se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un arenavirus con un ORF en una posición no natural como se describe en la Sección 4.7.
[0189] 4.1.1 Partícula de arenavirus de replicación defectuosa con un marco de lectura abierto en una posición no natural [0093]En ciertos ejemplos, se divulga aquí una partícula de arenavirus en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP, NP, proteína Z y proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente de tal manera que el virus resultante no puede producir más partículas virales progenitoras infecciosas. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en el que uno o más ORF se han suprimido o inactivado funcionalmente puede producirse en células complementarias (es decir,células que expresan el ORF del arenavirus que se ha suprimido o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula huésped a la célula huésped, en la que el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente descrita en el presente documento puede codificar un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus.
[0190] En ciertos ejemplos, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos, al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF o al menos cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L pueden eliminarse y sustituirse por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos específicos, sólo uno de los cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la GP del segmento genómico del arenavirus. En otro ejemplo específico, se elimina el ORF que codifica el NP del segmento genómico del arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico del arenavirus. En otro ejemplo específico se elimina el ORF que codifica la proteína L.
[0191] Así, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus divulgada en el presente documento comprende un segmento genómico que (i) está diseñado para llevar un ORF en una posición no natural; (ii) se elimina un ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o L; (iii) el ORF eliminado se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0192] En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo tiene de 8 a 100 nucleótidos de longitud, de 15 a 100 nucleótidos de longitud, de 25 a 100 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 200 a 500 nucleótidos de longitud, o de 400 a 600 nucleótidos de longitud, de 500 a 800 nucleótidos de longitud. En otros ejemplos, el ORF heterólogo tiene de 750 a 900 nucleótidos de longitud, de 800 a 100 nucleótidos de longitud, de 850 a 1000 nucleótidos de longitud, de 900 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1500 nucleótidos o de 10 a 1500 nucleótidos de longitud, 1500 a 2000 nucleótidos de longitud, 1700 a 2000 nucleótidos de longitud, 2000 a 2300 nucleótidos de longitud, 2200 a 2500 nucleótidos de longitud, 2500 a 3000 nucleótidos de longitud, 3000 a 3200 nucleótidos de longitud, 3000 a 3500 nucleótidos de longitud, 3200 a 3600 nucleótidos de longitud, 3300 a 3800 nucleótidos de longitud, 4000 a 4400 nucleótidos de longitud, 4200 a 4700 nucleótidos de longitud, 4800 a 5000 nucleótidos de longitud, 5000 a 5200 nucleótidos de longitud, 5200 a 5500 nucleótidos de longitud, 5500 a 5800 nucleótidos de longitud, 5800 a 6000 nucleótidos de longitud, 6000 a 6400 nucleótidos de longitud, 6200 a 6800 nucleótidos de longitud, 6600 a 7000 nucleótidos de longitud, 7000 a 7200 nucleótidos de longitud, 7200 a 7500 nucleótidos de longitud, o 7500 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un péptido o polipéptido que tiene de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 10 a 25 aminoácidos de longitud, de 25 a 50 aminoácidos de longitud, de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de 100 a 150 aminoácidos de longitud, de 150 a 200 aminoácidos de longitud, de 200 a 250 aminoácidos de longitud, de 250 a 300 aminoácidos de longitud, 300 a 400 aminoácidos de longitud, 400 a 500 aminoácidos de longitud, 500 a 750 aminoácidos de longitud, 750 a 1000 aminoácidos de longitud, 1000 a 1250 aminoácidos de longitud, 1250 a 1500 aminoácidos de longitud, 1500 a 1750 aminoácidos de longitud, 1750 a 2000 aminoácidos de longitud, 2000 a 2500 aminoácidos de longitud, o más de 2500 o más aminoácidos de longitud. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un polipéptido que no supera los 2500 aminoácidos de longitud. En ejemplos específicos, el ORF heterólogo no contiene un codón de parada. En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo está optimizado para el codón. En ciertos ejemplos, puede optimizarse la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas. Las técnicas para tales optimizaciones son conocidas en la técnica y pueden aplicarse para optimizar un ORF heterólogo.
[0193] Cualquier ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus puede incluirse en un segmento genómico de arenavirus. En un ejemplo, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. En la sección 4.3 se describen con más detalle las proteínas informadoras. En otro ejemplo, el ORF heterólogo codifica un antígeno de un patógeno infeccioso o un antígeno asociado a cualquier enfermedad capaz de provocar una respuesta inmunitaria. En ejemplos específicos, el antígeno se deriva de un organismo infeccioso, un tumor(es decir, cáncer) o un alérgeno. En la sección 4.3 se describen con más detalle los ORF heterólogos.
[0194] En ciertos ejemplos, el crecimiento y la infectividad de la partícula de arenavirus no se ven afectados por el ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0195] Pueden utilizarse técnicas conocidas por un experto en la materia para producir una partícula de arenavirus que comprenda un segmento genómico de arenavirus diseñado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus con replicación defectuosa (es decir,el segmento genómico de arenavirus modificado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre, en la que se ha suprimido un ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o L) puede producirse en una célula complementaria.
[0196] En ciertos ejemplos, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus utilizada según la presente solicitud pueden ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, LCMV.
[0197] En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus descrita en el presente documento adecuada para su uso como vacuna y a métodos de uso de dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones o cánceres. En la sección 4.6 se describen con más detalle los métodos de utilización de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento.
[0198] En ciertos ejemplos, se proporciona en el presente documento un kit que comprende en uno o más recipientes, uno o más cDNA descritos en el presente documento. En ejemplos específicos, un kit comprende, en uno, dos o más contenedores, un segmento genómico de arenavirus o una partícula de arenavirus según se describe en el presente documento. El kit puede comprender además uno o más de los siguientes elementos: una célula huésped adecuada para rescatar el segmento genómico del arenavirus o la partícula del arenavirus, reactivos adecuados para transfectar cDNA plasmídico en una célula huésped, un virus ayudante, plásmidos que codifican proteínas virales y/o uno o más cebadores específicos para un segmento genómico modificado del arenavirus o una partícula del arenavirus o cDNA de los mismos.
[0199] En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus tal como se describe en el presente documento adecuada para su uso como composición farmacéutica y métodos de uso de dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones y cánceres. En la sección 4.7 se describen más detalladamente los métodos de utilización de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento.
[0200] 4.2 Partícula de Arenavirus Trisegmentada
[0201] En el presente documento se proporcionan partículas de arenavirus trisegmentadas con reordenamientos de sus ORF. En un aspecto, se proporciona aquí una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. Más concretamente, en ciertas realizaciones, dos de los segmentos genómicos(por ejemplo, los dos segmentos S o los dos segmentos L, respectivamente) no pueden recombinarse de manera que den lugar a un único segmento vírico que pueda sustituir a los dos segmentos parentales. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En otra realización específica, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro ORF de arenavirus. Así pues, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es competente para la replicación e infecciosa. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno de los cuatro ORF de arenavirus. Así, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero incapaz de producir más progenie infecciosa en células no complementarias.
[0202] En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento puede estar bajo el control de una UTR 3' de arenavirus o una UTR 5' de arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 3' trisegmentada de arenavirus es la UTR 3' de un segmento o segmentos S de arenavirus. En otra realización específica, la UTR 3' trisegmentada de arenavirus es la UTR 3' de un segmento o segmentos L trisegmentados de arenavirus. En realizaciones más específicas, la UTR 5' trisegmentada de arenavirus es la UTR 5' de un segmento o segmentos S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del segmento o segmentos L.
[0203] En otras realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservado de arenavirus (las regiones 19-20-nt de terminal 5'- y 3') (véase, p. ej.,Perez & de la Torre, 2003, J Virol.
[0204] 77(2): 1184-1194).
[0205] En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' UTR (véase, p. ej.,Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En otra realización, el ORF que codifica la GP, la proteína NP Z y la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3' UTR (véase, p. ej.,Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor de la 5' UTR del segmento(s) S o del segmento(s) L. En otra realización específica, el elemento promotor de la 3' UTR es la 3' UTR el elemento promotor del segmento o segmentos S o del segmento o segmentos L.
[0206] En ciertas realizaciones, el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control de una UTR 3' truncada de arenavirus o una UTR 5' truncada de arenavirus (véase, p. ej.,Perez & de la Torre, 2003, J Virol. 77(2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85(8):4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o del segmento L del arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del segmento o segmentos S o L del arenavirus.
[0207] También se proporciona en el presente documento un cDNA de la partícula trisegmentada de arenavirus. En realizaciones más específicas, se proporciona en el presente documento una secuencia de nucleótidos de DNA o un conjunto de secuencias de nucleótidos de DNA que codifican una partícula de arenavirus trisegmentada como se establece en la Tabla 2 o la Tabla 3.
[0208] [0110]En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican el genoma trisegmentado del arenavirus forman parte de o están incorporados en uno o más vectores de expresión de DNA. En una realización específica, los ácidos nucleicos que codifican el genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada forman parte o se incorporan a uno o más vectores de expresión de DNA que facilitan la producción de una partícula de arenavirus trisegmentada tal como se describe en el presente documento. En otra realización, un cDNA descrito en el presente documento puede incorporarse a un plásmido. En la sección 4.5.1 se ofrece una descripción más detallada de los cDNA y los sistemas de expresión. Técnicas para la producción de una rutina de cDNA y técnicas convencionales de biología molecular y manipulación y producción de DNA. Puede utilizarse cualquier técnica de clonación conocida por el artesano experto. Tales técnicas son bien conocidas y están a disposición del artesano experto en manuales de laboratorio como, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).
[0209] En ciertas realizaciones, el cDNA del arenavirus trisegmentado se introduce (p. ej., se transfecta) en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en el presente documento, es una célula huésped que comprende un cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir,un cDNA de los segmentos genómicos de la partícula de arenavirus trisegmentada). En otras realizaciones, el cDNA descrito en el presente documento que forma parte de o puede incorporarse a un vector de expresión de DNA e introducirse en una célula huésped. Así, en algunas realizaciones proporcionadas en el presente documento es una célula huésped que comprende un cDNA descrito en el presente documento que se incorpora en un vector. En otras realizaciones, los segmentos genómicos de arenavirus trisegmentados (es decir, el segmento L y/o el segmento o segmentos S) descritos en el presente documento se introducen en una célula huésped.
[0210] En ciertas realizaciones, se describe en el presente documento un método de producción de la partícula de arenavirus trisegmentada, en el que el método comprende transcribir el cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, una proteína polimerasa viral puede estar presente durante la transcripción de la partícula de arenavirus trisegmentadain vitrooin vivo.En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento genómico del arenavirus se lleva a cabo utilizando un promotor bidireccional.
[0211] En otras realizaciones, la transcripción del segmento genómico del arenavirus se lleva a cabo utilizando un casete de expresión bidireccional (véase, véase, p. ej.,Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94(Pt 6): 1175-1188). En realizaciones más específicas, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de la polimerasa I como un promotor de la polimerasa II que leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente.
[0212] En otras realizaciones, la transcripción del cDNA del segmento genómico del arenavirus descrito en el presente documento comprende un promotor. Ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de RNA polimerasa I, un promotor de RNA polimerasa II, un promotor de RNA polimerasa III, un promotor T7, un promotor SP6 o un promotor T3.
[0213] En ciertas realizaciones, el método de producción de la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además la introducción en una célula huésped del cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método de producción de la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además la introducción en una célula huésped del cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada, en la que la célula huésped expresa todos los demás componentes para la producción de la partícula de arenavirus trisegmentada; y la purificación de la partícula de arenavirus trisegmentada a partir del sobrenadante de la célula huésped. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
[0214] Se proporcionan en el presente documento líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionados en el presente documento. En la Sección 4.5 se ofrece una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, los sistemas de vectores y las líneas celulares aquí descritos.
[0215] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tal como se describe en el presente documento da lugar a una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus descrita en el presente documento está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus trisegmentada está atenuada de tal manera que el virus sigue siendo, al menos parcialmente, competente para la replicación y puede replicarsein vivo,pero sólo puede generar cargas virales bajas que dan lugar a niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Estos virus atenuados pueden utilizarse como composición inmunogénica.
[0216] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tiene el mismo tropismo que la partícula de arenavirus bisegmentada.
[0217] También se proporciona en el presente documento un kit que comprende, en uno o más recipientes, uno o más cDNA descritos en el presente documento. En una realización específica, un kit comprende, en uno o dos o más contenedores, una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento. El kit puede comprender además uno o más de los siguientes elementos: una célula huésped adecuada para rescatar la partícula de arenavirus trisegmentada, reactivos adecuados para transfectar cDNA plasmídico en una célula huésped, un virus auxiliar, plásmidos que codifican proteínas virales y/o uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos para un segmento genómico de arenavirus modificado o una partícula de arenavirus o ácidos nucleicos que codifican los mismos.
[0218] También se proporcionan en el presente documento composiciones inmunogénicas que comprenden la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en las Secciones 4.6 y 4.7.
[0219] 4.2.1 Partícula de Arenavirus Trisegmentada compuesta por un segmento L y dos segmentos S
[0220] En un aspecto, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En determinadas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días, o al menos 100 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón de tipo I, receptor de interferón de tipo II y gen activador de la recombinación (RAG1), y que han sido infectados con 10<4>PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la Sección 4.8.13). En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pasajes, al menos 20 pasajes, al menos 30 pasajes, al menos 40 pasajes o al menos 50 pasajes.
[0221] La partícula de arenavirus trisegmentada con todos los genes virales en su respectiva posición de tipo silvestre es conocida en la técnica (p. ej.,Emonet et al., 2011 J. Virol., 85(4):1473; Popkin et al., 2011, J. Virol, 85(15):7928). En concreto, el genoma del arenavirus trisegmentado consta de un segmento L y dos segmentos S, en los que se inserta un ORF heterólogo (p. ej.,una GFP) en una posición de cada segmento S. Más concretamente, un segmento S codifica GP y GFP, respectivamente. El otro segmento S codifica GFP y NP, respectivamente. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Todos los segmentos están flanqueados por los respectivos UTR 5' y 3'.
[0222] En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada, proporcionada en el presente documento, que une los dos ORF arenavirales en uno en lugar de dos segmentos separados da lugar a un promotor no funcional (es decir,un segmento genómico de la estructura: 5' UTR-----------5' UTR o una 3' UTR------------3' UTR), en la que cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.
[0223] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha diseñado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S se ha diseñado para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Así, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En determinadas realizaciones, los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada se han diseñado para que lleven uno de sus ORF en una posición distinta a la de tipo silvestre. En realizaciones más específicas, los dos segmentos S comprenden un complemento completo de los ORF del segmento S. En ciertas realizaciones específicas, el segmento L ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre o el segmento L puede ser el segmento genómico de tipo silvestre.
[0224] En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S puede ser:
[0225] (i) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0226] (ii) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0227] (iii) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0228] (iv) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
[0229] (v) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la L está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y
[0230] (vi) un segmento S de arenavirus, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
[0231] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir,dos ORF de segmento S de tipo silvestre, p. ej.,GP o NP). En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (p. ej.,(GP, GP)) o dos ORF duplicados (p. ej.,(GP, GP) y (NP, NP)).
[0232] [0127]La Tabla 2A, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en la que la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad promotora arenaviral(es decir,el segmento S recombinado resultante se compone de dos 3'UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).
[0233] Tabla 2A
[0234] Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S
[0235] La posición 1 está bajo el control de una UTR 5' del segmento S del arenavirus; la posición 2 está bajo el control de una UTR 3' del segmento S del arenavirus; la posición 3 está bajo el control de una UTR 5' del segmento S del arenavirus; La posición 4 está bajo el control de una UTR 3' del segmento S del arenavirus; la posición 5 está bajo el control de una UTR 5' del segmento L del arenavirus; la posición 6 está bajo el control de una UTR 3' del segmento L del arenavirus. *ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.
[0237]
[0238]
[0241] En ciertas realizaciones, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento S o del segmento L de arenavirus tres y cuatro; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un IGR del segmento S o del segmento L de arenavirus; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento L de arenavirus. En una realización específica, el IGR entre las posiciones uno y dos puede ser un IGR del segmento S del arenavirus; el IGR entre las posiciones tres y cuatro puede ser un IGR del segmento S del arenavirus; y el IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser un IGR del segmento L del arenavirus. En determinadas realizaciones, también son posibles otras combinaciones. Por ejemplo, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en la que la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos S en el genoma del arenavirus trisegmentado no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad promotora del arenavirus (es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).
[0243] En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.
[0245] En ciertas realizaciones, un experto en la materia podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la Tabla 2A y como se describe en el presente documento, y luego utilizar un ensayo como se describe en la Sección 4.8 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable,es decir,no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación como se discute en el presente documento.
[0247] 4.2.2 Partícula de Arenavirus Trisegmentada compuesta por dos segmentos L y un segmento S
[0249] En un aspecto, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, o al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días, al menos 100 días de persistencia en ratones que carecen del receptor de interferón de tipo I, del receptor de interferón de tipo II y del gen activador de la recombinación (RAG1), y que han sido infectados con 10<4>PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la Sección 4.8.13). En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 pasajes, 20 pasajes, 30 pasajes, 40 pasajes o 50 pasajes.
[0251] En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada, proporcionada en el presente documento, que une los dos ORF arenavirales en uno en lugar de en dos segmentos separados da lugar a un promotor no funcional (es decir,un segmento genómico de la estructura: 5' UTR-----------5' UTR o una 3' UTR------------3' UTR), en la que cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia repetida invertida del otro extremo del mismo genoma.
[0253] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha diseñado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S se ha diseñado para llevar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S incluye un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Así, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En determinadas realizaciones, los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada se han diseñado para que lleven uno de sus ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. En realizaciones más específicas, los dos segmentos L comprenden un complemento completo de los ORF del segmento L. En ciertas realizaciones específicas, el segmento S ha sido diseñado para llevar uno de sus ORFs en una posición distinta de la posición de tipo silvestre o el segmento S puede ser el segmento genómico de tipo silvestre.
[0255] En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos L puede ser:
[0256] 1. (i) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; 2. (ii) un segmento L, en el que el ORF que codifica NP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
[0257] 3. (iii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; 4. (iv) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; 5. (v) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y 6. (vi) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus.
[0259] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado(es decir,dos ORF de segmento L de tipo silvestre, p. ej.,proteína Z o proteína L). En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S puede comprender un ORF duplicado (p. ej.,(proteína Z, proteína Z)) o dos ORF duplicados (p. ej.,(proteína Z, proteína Z) y (proteína L, proteína L)).
[0261] La Tabla 3, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S, en la que la recombinación intersegmentaria de los dos segmentos L en el genoma de arenavirus trisegmentado no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad promotora arenaviral(es decir,el segmento L recombinante supuestamente resultante estaría formado por dos 3' UTR o dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR). Basándose en la Tabla 3, se podrían predecir combinaciones similares para generar una partícula de arenavirus compuesta por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR.
[0263] Tabla 3
[0265] Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S
[0266] *La posición 1 está bajo el control de una UTR del segmento L 5' del arenavirus; la posición 2 está bajo el control de una UTR del segmento L 3' del arenavirus; la posición 3 está bajo el control de una UTR del segmento L 5' del arenavirus; la posición 4 está bajo el control de una UTR del segmento L 3' del arenavirus; la posición 5 está bajo el control de una UTR del segmento S 5' del arenavirus; la posición 6 está bajo el control de una UTR del segmento S 3' del arenavirus.ofan * ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.
[0269]
[0270]
[0272] En ciertas realizaciones, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un segmento S de arenavirus tres y cuatro o un segmento L de arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un segmento S de arenavirus o un segmento L de arenavirus; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un segmento S de arenavirus o un segmento L de arenavirus. En una realización específica, el IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser un IGR del segmento L del arenavirus; el IGR entre la posición tres y cuatro puede ser un IGR del segmento L del arenavirus; y el IGR entre la posición cinco y seis puede ser un IGR del segmento S del arenavirus. En determinadas realizaciones, también son posibles otras combinaciones.
[0273] En ciertas realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación intersegmentaria de un segmento L y un segmento S en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.
[0274] En ciertas realizaciones, un experto en la materia podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la Tabla 3 y como se describe en el presente documento, y luego utilizar un ensayo como se describe en la Sección 4.8 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable,es decir,no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación como se discute en el presente documento.
[0275] 4.2.3 Partícula de Arenavirus Trisegmentada con Replicación Defectuosa
[0276] En ciertos ejemplos, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP, NP, proteína Z, o proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente de tal manera que el virus resultante no puede producir más partículas virales progenitoras infecciosas (es decir,es de replicación defectuosa). En ciertos ejemplos, el tercer segmento del arenavirus puede ser un segmento S. En otros ejemplos, el tercer segmento del arenavirus puede ser un segmento L. En ejemplos más específicos, el tercer segmento de arenavirus puede diseñarse para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF o el tercer segmento de arenavirus puede ser el segmento genómico de arenavirus de tipo silvestre. En ejemplos aún más específicos, el tercer segmento de arenavirus carece de un ORF de arenavirus que codifique la proteína GP, NP, Z o la proteína L.
[0277] En ciertos ejemplos, un segmento genómico trisegmentado podría ser un híbrido de segmento S o L (es decir,un segmento genómico que puede ser una combinación del segmento S y el segmento L). En otros ejemplos, el segmento híbrido es un segmento S que comprende un segmento L IGR. En otro ejemplo, el segmento híbrido es un segmento L que comprende un segmento S IGR. En otros ejemplos, el segmento híbrido es un segmento S UTR con un segmento L IGR. En otros ejemplos, el segmento híbrido es un segmento L UTR con un segmento S IGR. En ejemplos específicos, el segmento híbrido es un segmento S 5' UTR con un segmento L IGR o un segmento S 3' UTR con un segmento L IGR. En otros ejemplos específicos, el segmento híbrido es un segmento L 5' UTR con un segmento S IGR o un segmento L 3' UTR con un segmento S IGR.
[0278] [0142]Una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un genoma modificado genéticamente en el que uno o más ORF se han suprimido o inactivado funcionalmente puede producirse en células complementarias (es decir,células que expresan el ORF del arenavirus que se ha suprimido o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula huésped a la célula huésped, en la que el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente descrita en el presente documento puede codificar un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus.
[0280] En ciertos ejemplos, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos, al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF o al menos cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L pueden eliminarse y sustituirse por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos específicos, sólo uno de los cuatro ORF que codifican las proteínas GP, NP, Z y L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la GP del segmento genómico del arenavirus. En otro ejemplo específico, se elimina el ORF que codifica el NP del segmento genómico del arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico del arenavirus. En otro ejemplo específico, se elimina el ORF que codifica la proteína L.
[0282] En ciertos ejemplos, se divulga aquí una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S en los que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP o NP se ha eliminado o inactivado funcionalmente, de tal manera que el virus resultante es de replicación defectuosa y no infeccioso. En un ejemplo específico, se elimina un ORF y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otro ejemplo específico, se eliminan dos ORF y se sustituyen por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos específicos, se eliminan tres ORF y se sustituyen por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos específicos, el ORF que codifica la GP se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos específicos, el ORF que codifica NP se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos aún más específicos, el ORF que codifica NP y el ORF que codifica GP se eliminan y se sustituyen por uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. Así, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) un segmento L y dos segmentos S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; (iii) uno o más ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus.
[0284] En ciertos ejemplos, se proporciona en el presente documento una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S en el que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) un ORF que codifica la proteína Z, y/o la proteína L se ha eliminado o inactivado funcionalmente, de tal manera que el virus resultante es de replicación defectuosa y no infeccioso. En un ejemplo específico, se elimina un ORF y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos específicos, se eliminan dos ORF y se sustituyen por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos específicos, el ORF que codifica la proteína Z se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En otros ejemplos específicos, el ORF que codifica la proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus. En ejemplos aún más específicos, el ORF que codifica la proteína Z y el ORF que codifica la proteína L se elimina y se sustituye por un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. Así, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) dos segmentos L y un segmento S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; (iii) un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0286] Así, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada aquí divulgada comprende una partícula de arenavirus trisegmentada (es decir,un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S) que i) está diseñada para llevar un ORF en una posición no natural; ii) se elimina un ORF que codifica GP, NP, proteína Z o proteína L); iii) el ORF que se elimina se sustituye con uno o más ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus.
[0288] [0147]En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo tiene de 8 a 100 nucleótidos de longitud, de 15 a 100 nucleótidos de longitud, de 25 a 100 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 200 a 500 nucleótidos de longitud, o de 400 a 600 nucleótidos de longitud, de 500 a 800 nucleótidos de longitud. En otros ejemplos, el ORF heterólogo tiene de 750 a 900 nucleótidos de longitud, de 800 a 100 nucleótidos de longitud, de 850 a 1000 nucleótidos de longitud, de 900 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1200 nucleótidos de longitud, de 1000 a 1500 nucleótidos o de 10 a 1500 nucleótidos de longitud, 1500 a 2000 nucleótidos de longitud, 1700 a 2000 nucleótidos de longitud, 2000 a 2300 nucleótidos de longitud, 2200 a 2500 nucleótidos de longitud, 2500 a 3000 nucleótidos de longitud, 3000 a 3200 nucleótidos de longitud, 3000 a 3500 nucleótidos de longitud, 3200 a 3600 nucleótidos de longitud, 3300 a 3800 nucleótidos de longitud, 4000 a 4400 nucleótidos de longitud, 4200 a 4700 nucleótidos de longitud, 4800 a 5000 nucleótidos de longitud, 5000 a 5200 nucleótidos de longitud, 5200 a 5500 nucleótidos de longitud, 5500 a 5800 nucleótidos de longitud, 5800 a 6000 nucleótidos de longitud, 6000 a 6400 nucleótidos de longitud, 6200 a 6800 nucleótidos de longitud, 6600 a 7000 nucleótidos de longitud, 7000 a 7200 nucleótidos de longitud, 7200 a 7500 nucleótidos de longitud, o 7500 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un péptido o polipéptido que tiene de 5 a 10 aminoácidos de longitud, de 10 a 25 aminoácidos de longitud, de 25 a 50 aminoácidos de longitud, de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de 100 a 150 aminoácidos de longitud, de 150 a 200 aminoácidos de longitud, de 200 a 250 aminoácidos de longitud, de 250 a 300 aminoácidos de longitud, 300 a 400 aminoácidos de longitud, 400 a 500 aminoácidos de longitud, 500 a 750 aminoácidos de longitud, 750 a 1000 aminoácidos de longitud, 1000 a 1250 aminoácidos de longitud, 1250 a 1500 aminoácidos de longitud, 1500 a 1750 aminoácidos de longitud, 1750 a 2000 aminoácidos de longitud, 2000 a 2500 aminoácidos de longitud, o más de 2500 o más aminoácidos de longitud. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un polipéptido que no supera los 2500 aminoácidos de longitud. En ejemplos específicos, el ORF heterólogo no contiene un codón de parada. En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo está optimizado para el codón. En ciertos ejemplos, puede optimizarse la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas. Las técnicas para tales optimizaciones son conocidas en la técnica y pueden aplicarse para optimizar un ORF heterólogo.
[0289] Cualquier ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus puede incluirse en la partícula de arenavirus trisegmentada. En un ejemplo, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. En la sección 4.3 se describen con más detalle las proteínas informadoras. En otros ejemplos, el ORF heterólogo codifica un antígeno para un patógeno infeccioso o un antígeno asociado a cualquier enfermedad y donde el antígeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria. En ejemplos específicos, el antígeno se deriva de un organismo infeccioso, un tumor(es decir,cáncer) o un alérgeno. En la sección 4.3 se describen con más detalle los ORF heterólogos.
[0290] En ciertos ejemplos, el crecimiento y la infectividad de la partícula de arenavirus no se ven afectados por el ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0291] Pueden utilizarse técnicas conocidas por un experto en la materia para producir una partícula de arenavirus que comprenda un segmento genómico de arenavirus modificado para llevar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. Por otra parte, la partícula de arenavirus con replicación defectuosa (es decir,el segmento genómico de arenavirus modificado para que lleve un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo silvestre, en la que se ha suprimido un ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o L) puede producirse en una célula complementaria.
[0292] En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada utilizada según la presente solicitud puede ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, LCMV.
[0293] En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus tal como se describe en el presente documento adecuada para su uso como vacuna y métodos de uso de dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones y cánceres. En la sección 4.6 se describen más detalladamente los métodos de utilización de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento.
[0294] En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus tal como se describe en el presente documento adecuada para su uso como composición farmacéutica y métodos de uso de dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones o cánceres. En la sección 4.6 se describen más detalladamente los métodos de utilización de la partícula de arenavirus descrita en el presente documento.
[0295] 4.3 Partícula de Arenavirus o Partícula de Arenavirus Trisegmentada que Expresa un ORF Heterólogo [0154]En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, y la partícula de arenavirus respectiva o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender un ORF heterólogo. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus y la respectiva partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender un gen de interés. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen de interés codifica un antígeno. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen o interés codifica una proteína reportera o una proteína fluorescente.
[0296] En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender uno o más ORF heterólogos o uno o más genes de interés. El segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender al menos un ORF heterólogo, al menos dos ORF heterólogos, al menos tres ORF heterólogos o más ORF heterólogos. La partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender al menos un gen de interés, al menos dos genes de interés, al menos tres genes de interés o más genes de interés.
[0297] El segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada de la presente solicitud pueden expresar una amplia variedad de antígenos. En una realización, el ORF heterólogo codifica un antígeno de un patógeno infeccioso o un antígeno asociado a cualquier enfermedad capaz de provocar una respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo puede codificar un antígeno derivado de un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, o puede expresarse en un tumor o enfermedad asociada a un tumor (es decir,cáncer), una enfermedad autoinmune, una enfermedad degenerativa, una enfermedad hereditaria, dependencia de sustancias, obesidad o una enfermedad alérgica.
[0298] [0157]En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno viral. Ejemplos no limitantes de antígenos virales incluyen antígenos de adenoviridae (p. ej., mastadenovirus y aviadenovirus), herpesviridae (p. ej., herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2, herpes simplex virus 5, herpes simplex virus 6, virus de Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus), leviviridae (p. ej., levivirus, enterobacteria fase MS2, allolevirus), poxyiridae (p. ej., chordopoxyirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus y entomopoxyirinae), papovaviridae (p. ej., poliomavirus y papilomavirus), paramyxoviridae (p. ej., paramyxovirus, virus de la parainfluenza 1, mobillivirus (p. ej., virus del sarampión), rubulavirus (p. ej., virus de las paperas), pneumonovirinae (p. ej., pneumovirus, virus respiratorio sincitial humano), virus respiratorio sincitial humano y metapneumovirus (p. ej., pneumovirus aviar y metapneumovirus humano), picornaviridae (p. ej., enterovirus, rinovirus, hepatovirus (p. ej., el virus de la hepatitis A humana), cardiovirus y aptovirus), reoviridae (p. ej., ortoreovirus, orbivirus, rotavirus, cipovirus, fijivirus, fitoreovirus y oryzavirus), retroviridae (p. ej., retrovirus de mamíferos de tipo B, retrovirus de mamíferos de tipo C, retrovirus aviares de tipo C, grupo de retrovirus de tipo D, retrovirus BLV-HTLV, lentivirus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) 1 y HIV-2 (p. ej., gp160 del HIV), spumavirus), flaviviridae (p. ej., virus de la hepatitis C, virus del dengue, virus del Nilo Occidental), hepDNAaviridae (p. ej., virus de la hepatitis B), togaviridae (p. ej., alfavirus (p. ej., virus sindbis) y rubivirus (p. ej., virus de la rubéola)), rhabdoviridae (p. ej., vesiculovirus, lyssavirus, ephemerovirus, cytorhabdovirus y necleorhabdovirus), arenaviridae (p. ej., arenavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Ippy y virus lassa) y coronaviridae (p. ej., coronavirus y torovirus). En una realización específica, el antígeno viral es HIV gp120, gp41, HIV Nef, la glicoproteína F del RSV, la glicoproteína G del RSV, Tax de HTLV, glicoproteínas del virus del herpes simple (por ejemplo, gB, gC, gD y gE), o el antígeno de superficie de la hepatitis B, la proteína E del virus de la hepatitis C o la proteínaspikedel coronavirus. En una realización, el antígeno viral no es un antígeno del HIV.
[0300] En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno bacteriano (p. ej.,la proteína de cubierta bacteriana). En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno parasitario (p. ej.,un antígeno protozoario). En otras realizaciones, una secuencia heteróloga de nucleótidos codifica un antígeno fúngico.
[0302] Ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos incluyen antígenos de bacterias de la familia Aquaspirillum, familia Azospirillum, familia Azotobacteraceae, familia Bacteroidaceae, especies Bartonella, familia Bdellovibrio, especiesCampylobacter, especiesChlamydia(p. ej., Chlamydia pneumoniae), clostridium,familia Enterobacteriaceae (p. ej.,especies deCitrobacter,Edwardsiella, Enterobacter aerogenes,especies deEnvinia,Escherichia coli,especies deHafnia, especies deKlebsiella, especies deMorganella,Proteus vulgaris, Providencia,especies deSalmonella,Serratia marcescensyShigella flexneri),familia Gardinella,Haemophilus influenzae,familia Halobacteriaceae, familia Helicobacter, familia Legionallaceae, especiesListeria, familia Methylococcaceae, micobacterias (p. ej., Mycobacterium tuberculosis),familia Neisseriaceae, familia Oceanospirillum, familia Pasteurellaceae, especies de Pneumococcus, especies dePseudomonas, familia Rhizobiaceae, familia Spirillum, familia Spirosomaceae,Staphylococcus(p. ej., Staphylococcus aureusresistente a la meticilina yStaphylococcuspyrogenes),Streptococcus(p. ej., Streptococcus enteritidis, Streptococcusfasciae yStreptococcus pneumoniae), familiaVampirovibr Helicobacter, familiaYersinia,Bacillus antracisy familiaVampirovibrio.
[0304] Ejemplos no limitantes de antígenos de parásitos incluyen antígenos de un parásito como una ameba, un parásito de la malaria,Plasmodium, Trypanosoma cruzi.Ejemplos no limitantes de antígenos fúngicos incluyen antígenos de hongos de las especiesAbsidia(p. ej., Absidia corymbifera y Absidia ramosa), Aspergillus, (p. ej., Aspergillusflavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus nigeryAspergillus terreus), Basidiobolus ranarum, Blastomyces dermatitidis,especies deCandida(p. ej., Candida albicans, Candida glabrata, Candida kern, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida rugosa, Candida stellatoideayCandida tropicalis), Coccidioides immitis,especies deConidiobolus, Cryptococcus neoforms,especies deCunninghamella,dermatofitos, Histoplasma capsulatum, Microsporum gypseum, Mucor pusillus, Paracoccidioides brasiliensis, Pseudallescheria boydii, Rhinosporidium seeberi, Pneumocystis carinii,especies deRhizopus(p. ej., Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae y Rhizopus microsporus),especies deSaccharomyces, Sporothrix schenckii, zigomicetosy clases como Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes.
[0306] [0161]En algunas realizaciones, un ORF heterólogo codifica un antígeno tumoral o un antígeno asociado a un tumor. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral o antígeno asociado a tumor incluye antígenos de enfermedades asociadas a tumor, incluyendo leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal, carcinoma corticosuprarrenal infantil, cánceres relacionados con el SIDA, sarcoma de Kaposi, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, cáncer de vías biliares, extrahepático (véase colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/tumor cerebral glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de las vías visuales y del hipotálamo, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, carcinoide, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, carcinoide, cáncer de mama, linfoma de Burkitt.s, tumor carcinoide, tumor carcinoide gastrointestinal, carcinoma de primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, primario, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, bronquitis crónica leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, enfisema, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en el cromosoma de Ewing, sarcoma de Ewing en el cromosoma de Ewing.sarcoma de la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales: tumor trofoblástico gestacional extracraneal, extragonadal u ovárico, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, vía visual e hipotalámica infantil, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma de la vía visual e hipotalámica, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, linfoma linfoblástico agudo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón, células no pequeñas, células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma hodgkin, linfoma no hodgkin, linfoma, primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia, Waldenström, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno óseo/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, maligno del adulto, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico de cuello con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, crónica, leucemia mieloide, aguda del adulto, leucemia mieloide, aguda infantil, mieloma, múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, crónicos, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno óseo, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelial-estromal de superficie), tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, células de los islotes, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), pelvis renal y uréter, cáncer de células transicionales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma infantil, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, tumores de la familia de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de partes blandas, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma cutáneo de células de Merkel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de intestino delgado, sarcoma de partes blandas, carcinoma de células escamosas - véase cáncer de piel (no melanoma), cáncer escamoso de cuello con primario oculto, metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma cutáneo de células T - véase micosis fungoide y síndrome de Sézary, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer infantil de células de transición de pelvis renal y uréter, tumor trofoblástico gestacional, carcinoma de sitio primario desconocido, cáncer infantil de uréter y pelvis renal, cáncer de células de transición, cáncer retral, cáncer uterino, sarcoma uterino endometrial, tumor bronquial, tumor embrionario del sistema nervioso central; cordoma infantil, cáncer colorrectal, craneofaringioma, ependimoblastoma, histiocitosis de células de Langerhans, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda (adulto / infantil), cáncer de pulmón de células pequeñas, meduloepitelioma, cáncer de la cavidad oral, papilomatosis, tumores del parénquima pineal de diferenciación intermedia, tumor pituitario, carcinoma de las vías respiratorias en el que está implicado el gen NUT del cromosoma 15, tumor de la médula espinal, timoma, cáncer de tiroides, Cáncer vaginal; cáncer de vulva y tumor de Wilms.
[0308] Ejemplos no limitantes de antígenos tumorales o asociados a tumores incluyen Adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKK1, ENAH (hMena), EpCAM, EphA3, EZH2, FGF5, glypican-3, G250 /MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxilesterasa intestinal, alfa-fetoproteína, Kallikrein 4, KIF20A, Lengsin, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53, PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernin 1, SOX10, STEAP1, survivinn, Telomerasa, VEGF, o WT1, EGF-R, CEA, CD52, proteína gp 100, MELANA/MART1, NY-ESO-1, p53 MAGE1, MAGE3 y CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, factor de elongación 2, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pml-RARalpha, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TGF-betaRII, Triosafosfato isomerasa, Lengsin, M-CSF, MCSP o mdm-2.
[0310] En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno patógeno respiratorio. En una realización específica, el patógeno respiratorio es un virus como RSV, coronavirus, metapneumovirus humano, virus parainfluenza, virus hendra, virus nipah, adenovirus, rinovirus o PRRSV. Entre los ejemplos no limitantes de antígenos virales respiratorios se incluyen las proteínas F, G y M2 del virus respiratorio sincitial, las proteínasspike(S) del coronavirus (SARS, HuCoV), las proteínas de fusión del metapneumovirus humano, proteínas de fusión y hemaglutinina (F, HN) del virus de la parainfluenza, glicoproteínas de fijación (G y F) del virus Hendra (HeV) y del virus Nipah (NiV), proteínas de la cápside del adenovirus, proteínas del rinovirus y proteínas GP5 y M de tipo silvestre o modificadas del PRRSV.
[0312] En una realización específica, el patógeno respiratorio es una bacteria comoBacillus anthracis, mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, streptococcus pneumoniae, yersinia pestis, staphylococcus aureus, Francisella tularensis, legionella pneumophila, chlamydia pneumoniae, pseudomonas aeruginosa, neisseria meningitides y haemophilus influenzae.Ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos respiratorios incluyen el antígeno protector PA de Bacillus anthracis, el antígeno micobacteriano 85A y la proteína de choque térmico (Hsp65) de Mycobacterium tuberculosis, el toxoide pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de Bordetella pertussis, la sortasa A y la adhesina de superficie A (PsaA) de Streptococcus pneumoniae, las subunidades F1 y V de Yersinia pestis y las proteínas de Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitides y Haemophilus influenzae.
[0314] En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un epítopo de células T. En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica una citocina o un factor de crecimiento.
[0316] [0166]En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno expresado en una enfermedad autoinmune. En realizaciones más específicas, la enfermedad autoinmune puede ser diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso y psoriasis. Ejemplos no limitantes de antígenos de enfermedades autoinmunes incluyen Ro60, dsDNA o RNP.
[0317] En otras realizaciones, el ORF codifica un antígeno expresado en una enfermedad alérgica. En realizaciones más específicas, la enfermedad alérgica puede incluir, entre otras, rinoconjuntivitis estacional y perenne, asma y eczema. Ejemplos no limitantes de antígenos alergénicos incluyen Bet v 1 y Fel d 1.
[0318] En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada comprende además una proteína informadora. La proteína informadora puede expresarse al mismo tiempo que el antígeno descrito en el presente documento. Lo ideal es que la expresión sea visible con luz normal u otras longitudes de onda de luz. En determinadas realizaciones, la intensidad del efecto creado por la proteína informadora puede utilizarse para medir y controlar directamente la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada.
[0319] Los genes informadores serían fácilmente reconocidos por un experto en la materia. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es una proteína fluorescente. En otras realizaciones, el gen informador es GFP. La GFP emite luz verde brillante cuando se expone a rayos UV o azules similares.
[0320] Ejemplos no limitantes de proteínas informadoras incluyen varias enzimas, tales como, pero no a β-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, neomicina fosfotransferasa, luciferasa o RFP.
[0321] En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo tiene propiedades deseables para su uso como vector para la vacunación (véase, p. ej., la Sección 4.6). En otra realización, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un hospedador (p. ej.,ratón, conejo, cabra, burro, humano). En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo descrito en el presente documento induce una respuesta inmunitaria innata. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta inmunitaria adaptativa. En realizaciones más específicas, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo tanto una respuesta inmunitaria innata como adaptativa.
[0322] En otra realización, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta de células T. En realizaciones aún más específicas, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta de células CD8+T. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus portadora de un gen extraño de interés induce una potente respuesta de células T CD8+ de alta frecuencia y funcionalidad. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno induce células T CD8+ específicas de uno o varios epítopos del correspondiente gen extraño de interés.
[0323] En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo puede inducir la diferenciación de T helper 1, la formación de memoria de células T CD4+ y/o provocar respuestas de anticuerpos duraderas. Estos anticuerpos pueden ser neutralizantes, opsonizantes, tóxicos para las células tumorales o tener otras características biológicas favorables. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo tiene un fuerte tropismo por las células dendríticas y las activa tras la infección. Esto potencia la presentación del antígeno por las células presentadoras de antígeno.
[0324] En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno induce títulos bajos o indetectables de anticuerpos neutralizantes contra LCMV y respuestas altas de anticuerpos neutralizantes protectores contra el transgen extraño respectivo. En algunas realizaciones, la columna vertebral arenavírica que forma la partícula o partícula arenavírica trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno tiene baja capacidad para inducir inmunidad a los componentes de la columna vertebral arenavírica.
[0325] 4.4 Generación de una partícula de arenavirus y de una partícula de arenavirus trisegmentada
[0326] Generalmente, las partículas de arenavirus pueden producirse recombinantemente mediante técnicas genéticas inversas estándar como las descritas para el LCMV (véase Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668; Sanchez et al., 2006, Virology 350:370; Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol.94:1175-88. Para generar las partículas de arenavirus aquí proporcionadas, estas técnicas pueden aplicarse como se describe a continuación. El genoma de los virus puede modificarse como se describe en los apartados 4.1 y 4.2, respectivamente.
[0327] 4.4.1 Marco de Lectura Abierto en Posición No Natural
[0328] [0176]La generación de una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico que ha sido diseñado para llevar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF puede producirse recombinantemente mediante cualquier técnica de genética inversa conocida por un experto en la materia.
[0329] (i) Partícula de Arenavirus Infecciosa y Competente Para la Replicación
[0330] En ciertas realizaciones, el método de generación de la partícula de arenavirus comprende (i) transfectar en una célula huésped el cDNA del primer segmento genómico de arenavirus; (ii) transfectar en una célula huésped el cDNA del segundo segmento genómico de arenavirus; (iii) transfectar en una célula huésped plásmidos que expresen los factores transactores mínimos NP y L de arenavirus; (iv) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación del virus; y (v) recoger la partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones más específicas, el cDNA está comprendido en un plásmido.
[0331] Una vez generadas a partir del cDNA, las partículas de arenavirus (es decir, infecciosas y competentes para la replicación) pueden propagarse. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus puede propagarse en cualquier célula huésped que permita que el virus crezca hasta alcanzar títulos que permitan los usos del virus descritos en el presente documento. En una realización, la célula huésped permite que la partícula de arenavirus crezca hasta alcanzar títulos comparables a los determinados para el tipo silvestre correspondiente.
[0332] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus puede propagarse en células huésped. Ejemplos específicos de células huésped que pueden utilizarse incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus puede propagarse en una línea celular.
[0333] En ciertas realizaciones, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmido(s). El plásmido o plásmidos expresan el segmento o segmentos genómicos de arenavirus que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., consistentes en un promotor de polimerasa I y un terminador.
[0334] Los plásmidos que pueden utilizarse para la generación de la partícula de arenavirus pueden incluir: i) un plásmido que codifica el segmento genómico S, p. ej., pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento genómico L, p. ej., pol-I L. En ciertas realizaciones, el plásmido que codifica una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S puede incorporarse a la mezcla de transfección. Por ejemplo, puede estar presente un plásmido que codifique la proteína L y/o un plásmido que codifique NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y el NP son los factores transactores mínimos necesarios para la transcripción y replicación del RNA vírico. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S, junto con la proteína NP y L, puede realizarse utilizando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II leyendo desde lados opuestos en los cDNA de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.
[0335] En ciertas realizaciones, los segmentos genómicos del arenavirus están bajo el control de un promotor. Típicamente, pueden utilizarse casetes de expresión impulsados por la RNA polimerasa I, casetes impulsados por la RNA polimerasa II o casetes impulsados por la RNA polimerasa del bacteriófago T7. En ciertas realizaciones, el plásmido o plásmidos que codifican los segmentos genómicos del arenavirus pueden ser los mismos,es decir,la secuencia genómica y los factores transactores pueden ser transcritos por un promotor de un plásmido. Ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de RNA polimerasa I, un promotor de RNA polimerasa II, un promotor de RNA polimerasa III, un promotor T7, un promotor SP6 o un promotor T3.
[0336] Además, el (los) plásmido(s) puede(n) presentar un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., casete de expresión de polimerasa II como el anterior, o el (los) transcrito(s) génico(s) viral(es) va(n) seguido(s) de un sitio de entrada de ribosoma interno, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido incorpora además un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
[0337] La transfección de una célula huésped con un(os) plásmido(s) puede realizarse utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de alta expresión se identifican mediante procedimientos de Western blot o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) vírica(s) de interés.
[0338] Para recuperar la partícula de arenavirus aquí descrita, se prevén los siguientes procedimientos. Primer día: las células, normalmente confluentes al 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los plásmidos, como se ha descrito anteriormente. Para ello se puede recurrir a cualquiera de las estrategias utilizadas habitualmente, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
[0339] [0186]3-5 días después: El sobrenadante del cultivo (preparación del vector arenavirus) se recoge, se toma alícuota y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C, en función del tiempo que deba conservarse el vector arenavirus antes de su uso. El título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofocalización. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden pasarse a un recipiente más grande (p. ej.,un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pasaje.
[0340] La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo, en la que un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo. El ORF heterólogo puede incorporarse al plásmido utilizando enzimas de restricción.
[0341] (ii) Partícula de Arenavirus Infecciosa con Replicación Defectuosa
[0342] Las partículas infecciosas de arenavirus con replicación defectuosa pueden rescatarse como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir de cDNA, los arenavirus infecciosos y deficientes en replicación aquí divulgados pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación de su genoma (p. ej.,si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).
[0343] Debido a la supresión o inactivación funcional de uno o más de los ORF en los vectores arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la supresión de la glicoproteína, GP), los vectores arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionanen transel gen o genes virales suprimidos, (p. ej.,la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular de complementación, en adelante denominada células C, se genera transfectando una línea celular como BHK-21, HEK 293, VERO u otra con uno o más plásmidos para la expresión del gen o genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El (los) plásmido(s) C expresa(n) el (los) gen(es) viral(es) suprimido(s) en el vector arenavirus que se va a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero,p. ej.,un promotor de la polimerasa II de mamífero como el promotor FF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos,p. ej.,resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos,p. ej.,casete de expresión de polimerasa II como el anterior, o el transcrito o transcritos génicos virales van seguidos de un sitio de entrada de ribosomas internos, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
[0344] Las células que pueden utilizarse,p. ej.,BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el plásmido o plásmidos de complementación utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado,p. ej.,puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C con alta expresión se identifican mediante procedimientos de Western blot o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) vírica(s) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el gen o genes virales ausentes en cada uno de los pasos en los que se utilizarán células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus ayudante para proporcionar la funcionalidad que faltaen trans.
[0345] Los plásmidos pueden ser de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF, para expresar intracelularmente en células C los factores transactores mínimos del arenavirus, derivados de, p. ej.,las proteínas NP y L del LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos del genoma del vector del arenavirus,p. ej.,los segmentos con modificaciones diseñadas. Los TF-plásmidos expresan las proteínas NP y L del vector arenavirus respectivo bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamífero, típicamente,p. ej.,un promotor de la polimerasa II de mamífero como el promotor CMV o EFlalpha, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden utilizar casetes de expresión impulsados por la polimerasa I o casetes de expresión impulsados por la bacteriófago RNA polimerasa (T7-), este último preferentemente con una ribozima de terminal 3' para procesar el transcrito primario y producir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse mediante la inclusión en el proceso de recuperación de un plásmido de expresión adicional, construido de forma análoga a los plásmidos TF, que proporcione T7, o bien se construyen células C para expresar adicionalmente T7 de forma estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, esdecir,la secuencia del genoma y los factores transactores pueden ser transcritos por promotores T7, polI y polII a partir de un plásmido.
[0346] Para la recuperación del vector arenavirus, se pueden utilizar los siguientes procedimientos. Primer día: Las células C, normalmente confluentes al 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, esdecir,la secuencia del genoma y los factores transactores pueden ser transcritos por promotores T7, polI y polII a partir de un plásmido. Para ello se puede recurrir a cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
[0347] 3-5 días después: El sobrenadante del cultivo (preparación del vector arenavirus) se recoge, se toma alícuota y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C en función del tiempo que deba conservarse el vector arenavirus antes de su uso. A continuación, se evalúa el título infeccioso de la preparación del vector arenavirus mediante un ensayo de inmunofocalización en células C. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden pasarse a un recipiente más grande (p. ej.,un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pasaje.
[0348] La descripción se refiere además a la expresión de un antígeno en un cultivo celular en el que el cultivo celular está infectado con un arenavirus infeccioso de replicación deficiente que expresa un antígeno. Cuando se utiliza para la expresión de un antígeno en células cultivadas, se pueden utilizar los dos procedimientos siguientes:
[0349] i) El tipo celular de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en el presente documento a una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que da lugar a la producción del antígeno en todas las células ya poco después de la infección.
[0350] ii) Alternativamente, se puede utilizar un MOI inferior y seleccionar clones celulares individuales por su nivel de expresión de antígenos virales. Posteriormente, los clones individuales pueden ampliarse infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno puede recogerse posteriormente (y purificarse) a partir del sobrenadante del cultivo o de las propias células, dependiendo de las propiedades del antígeno producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de impulsar la expresión del antígeno utilizando arenavirus infecciosos deficientes en replicación como vectores.
[0351] 4.4.2 Generación de una Partícula de Arenavirus Trisegmentada
[0352] Una partícula de arenavirus trisegmentada puede producirse recombinantemente mediante técnicas de genética inversa conocidas en la técnica, por ejemplo como se describe en Emonet et al., 2008, PNAS, 106(9):3473-3478; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85 (15):7928-7932. La generación de la partícula de arenavirus trisegmentada proporcionada en el presente documento puede modificarse como se describe en la sección 4.2.
[0353] (i) Partícula de Arenavirus Trisegmentada Infecciosa y Competente para la Replicación
[0354] En ciertas realizaciones, el método de generación de la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) transfectar en una célula hospedadora los cDNA de un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S; (ii) transfectar en una célula hospedadora plásmidos que expresen los factores transactores mínimos NP y L del arenavirus; (iii) mantener la célula hospedadora en condiciones adecuadas para la formación del virus; y (iv) cosechar la partícula de arenavirus.
[0355] Una vez generada a partir del cDNA, la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir,infecciosa y competente para la replicación) puede propagarse. En determinadas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en cualquier célula huésped que permita que el virus crezca hasta alcanzar títulos que permitan los usos del virus descritos en el presente documento. En una realización, la célula huésped permite que la partícula de arenavirus trisegmentada crezca hasta alcanzar títulos comparables a los determinados para el tipo silvestre correspondiente.
[0356] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en células huésped. Ejemplos específicos de células huésped que pueden utilizarse incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en una línea celular.
[0357] En ciertas realizaciones, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmido(s). El plásmido o plásmidos expresan el segmento o segmentos genómicos de arenavirus que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero, p. ej., consistentes en un promotor de polimerasa I y un terminador.
[0358] En realizaciones específicas, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmido(s). El plásmido o plásmidos expresan el gen o genes virales que se van a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero,p. ej.,consistentes en un promotor de la polimerasa I y un terminador.
[0359] Los plásmidos que pueden utilizarse para generar el arenavirus trisegmentado que comprende un segmento L y dos segmentos S pueden incluir: i) dos plásmidos que codifican cada uno el segmento del genoma S,p. ej.,pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento del genoma L, p. ej.,pol-I L.Los plásmidos necesarios para el arenavirus trisegmentado que comprende dos segmentos L y un segmento S son: i) dos plásmidos que codifican cada uno el segmento del genoma L, p. ej., pol-I L, ii) un plásmido que codifica el segmento del genoma s,p. ej.,pol-I S.
[0360] [0204]En ciertas realizaciones, pueden incorporarse a la mezcla de transfección plásmidos que codifican una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales. Por ejemplo, un plásmido que codifica la proteína L y un plásmido que codifica NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y el NP son los factores transactores mínimos necesarios para la transcripción y replicación del RNA vírico. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S, junto con la proteína NP y L, puede realizarse utilizando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II leyendo desde lados opuestos en los cDNA de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.
[0361] Además, el (los) plásmido(s) presenta(n) un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., el casete de expresión de polimerasa II como se ha indicado anteriormente, o el (los) transcrito(s) génico(s) viral(es) va(n) seguido(s) de un sitio de entrada de ribosoma interno, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido incorpora además un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
[0362] La transfección de células BHK-21 con un(os) plásmido(s) puede realizarse utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de alta expresión se identifican mediante procedimientos de Western blot o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) vírica(s) de interés.
[0363] Típicamente, se pueden utilizar casetes de expresión impulsados por RNA polimerasa I, casetes impulsados por RNA polimerasa II o casetes impulsados por RNA polimerasa de bacteriófago T7, estos últimos preferentemente con una ribozima de terminal 3' para el procesamiento del transcrito primario para producir el extremo correcto. En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican los segmentos genómicos del arenavirus pueden ser los mismos,es decir, la secuencia genómica y los factores transactores pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y polII a partir de un plásmido.
[0364] Para recuperar el arenavirus el vector de arenavirus trisegmentado, se prevén los siguientes procedimientos. Primer día: las células, normalmente confluentes al 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los plásmidos, como se ha descrito anteriormente. Para ello se puede recurrir a cualquiera de las estrategias utilizadas habitualmente, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
[0365] 3-5 días después: El sobrenadante del cultivo (preparación del vector arenavirus) se recoge, se toma alícuota y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C, en función del tiempo que deba conservarse el vector arenavirus antes de su uso. El título infeccioso de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofocalización. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden pasarse a un recipiente más grande (p. ej.,un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pasaje.
[0366] La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo y/o un gen de interés, en el que un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo y/o un gen de interés. El ORF heterólogo y/o el gen de interés pueden incorporarse al plásmido utilizando enzimas de restricción.
[0367] (ii) Partícula de Arenavirus Infecciosa Trisegmentada con Replicación Defectuosa
[0368] Las partículas de arenavirus trisegmentadas infecciosas y con replicación defectuosa pueden rescatarse como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir de cDNA, los arenavirus infecciosos con deficiencia de replicación aquí divulgados pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus de replicación deficiente mediante la modificación de su genoma(p. ej.,
si el ORF que codifica la proteína GP se elimina o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).
[0369] [0212]Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los ORF en los vectores arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la supresión de la glicoproteína, GP), los vectores arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionanen transel gen o genes virales suprimidos,p. ej.,la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular de complementación, en adelante denominada células C, se genera transfectando una línea celular de mamífero como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará BHK-21 como ejemplo) con uno o más plásmido(s) para la expresión del gen o genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El (los) plásmido(s) C expresa(n) el (los) gen(es) viral(es) suprimido(s) en el vector arenavirus que se va a generar bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero,p. ej.,un promotor de la polimerasa II de mamífero como el promotor CMV o EFlalpha con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., casete de expresión de polimerasa II como el anterior, o el transcrito o transcritos génicos virales van seguidos de un sitio de entrada de ribosomas internos, como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido del marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, como un casete de resistencia a la ampicilina.
[0370] Las células que pueden utilizarse, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el plásmido o plásmidos de complementación utilizando cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación. Unos días más tarde se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C con alta expresión se identifican mediante procedimientos de Western blot o citometría de flujo con anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) vírica(s) de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de forma estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el gen o genes virales ausentes en cada uno de los pasos en los que se utilizarán células C a continuación. Además, se puede utilizar un virus ayudante para proporcionar la funcionalidad que faltaen trans.
[0371] Pueden utilizarse plásmidos de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF, para expresar intracelularmente en células C los factores transactores mínimos del arenavirus, derivados de, p. ej.,las proteínas NP y L del LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos del genoma del vector del arenavirus,p. ej.,los segmentos con modificaciones diseñadas. Los TF-plásmidos expresan las proteínas NP y L del vector arenavirus respectivo bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamífero, típicamente,p. ej.,un promotor de la polimerasa II de mamífero como el promotor CMV o EF 1 alfa, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden utilizar casetes de expresión impulsados por la polimerasa I o casetes de expresión impulsados por la bacteriófago RNA polimerasa (T7-), este último preferentemente con una ribozima de terminal 3' para procesar el transcrito primario y producir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en células C debe proporcionarse mediante la inclusión en el proceso de recuperación de un plásmido de expresión adicional, construido de forma análoga a los plásmidos TF, que proporcione T7, o bien se construyen células C para expresar adicionalmente T7 de forma estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, esdecir,la secuencia del genoma y los factores transactores pueden ser transcritos por promotores T7, polI y polII a partir de un plásmido.
[0372] Para la recuperación del vector arenavirus, se pueden utilizar los siguientes procedimientos. Primer día: Las células C, normalmente confluentes al 80% en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser los mismos, esdecir,la secuencia del genoma y los factores transactores pueden ser transcritos por promotores T7, polI y polII a partir de un plásmido. Para ello se puede recurrir a cualquiera de las estrategias comúnmente utilizadas, como el fosfato de calcio, los protocolos basados en liposomas o la electroporación.
[0373] 3-5 días después: El sobrenadante del cultivo (preparación del vector arenavirus) se recoge, se toma alícuota y se almacena a 4 °C, -20 °C o -80 °C en función del tiempo que deba conservarse el vector arenavirus antes de su uso. A continuación, se evalúa el título infeccioso de la preparación del vector arenavirus mediante un ensayo de inmunofocalización en células C. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden pasarse a un recipiente más grande (p. ej.,un matraz de cultivo de tejidos T75) el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del pasaje.
[0374] La descripción se refiere además a la expresión de un antígeno en un cultivo celular en el que el cultivo celular está infectado con un arenavirus trisegmentado infeccioso y de replicación deficiente que expresa un antígeno. Cuando se utiliza para la expresión de un antígeno CMV en células cultivadas, se pueden utilizar los dos procedimientos siguientes:
[0375] i) El tipo celular de interés se infecta con la preparación de vector de arenavirus descrita en el presente documento a una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que da lugar a la producción del antígeno en todas las células ya poco después de la infección.
[0376] ii) Alternativamente, se puede utilizar un MOI inferior y seleccionar clones celulares individuales por su nivel de expresión de antígenos virales. Posteriormente, los clones individuales pueden ampliarse infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente del enfoque, el antígeno puede recogerse posteriormente (y purificarse) a partir del sobrenadante del cultivo o de las propias células, dependiendo de las propiedades del antígeno producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y se pueden considerar otras formas de impulsar la expresión del antígeno CMV utilizando arenavirus infecciosos deficientes en replicación como vectores.
[0377] 4.5 Ácidos Nucleicos, Sistemas de Vectores y Líneas Celulares
[0378] En ciertas realizaciones, aquí se proporcionan cDNA que comprenden o consisten en el segmento genómico de arenavirus o la partícula trisegmentada de arenavirus como se describe en la Sección 4.1 y Sección 4.2, respectivamente.
[0379] 4.5.1 Marco de Lectura Abierto en Posición No Natural
[0380] En una realización, se proporcionan aquí ácidos nucleicos que codifican un segmento genómico de arenavirus como se describe en la Sección 4.1. En ejemplos más específicos, se divulga en el presente documento una secuencia de nucleótidos de DNA o un conjunto de secuencias de nucleótidos de DNA como se establece en la Tabla 1. Sección 4.1. Células hospedadoras que comprenden dichos ácidos nucleicos.
[0381] En realizaciones específicas, se proporciona en el presente documento un cDNA del segmento genómico del arenavirus diseñado para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF, en el que el segmento genómico del arenavirus codifica un ORF heterólogo como se describe en la Sección 4.1.
[0382] En una realización, se proporciona aquí un sistema de vector de expresión de DNA que codifica el segmento genómico de arenavirus diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. Específicamente, se divulga en el presente documento un sistema de vector de expresión de DNA en el que uno o más vectores codifican dos segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y un segmento S, de una partícula de arenavirus descrita en el presente documento. Un sistema vectorial de este tipo puede codificar (una o varias moléculas de DNA separadas).
[0383] En otra realización, se proporciona aquí un cDNA del segmento S de arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre es parte de o incorporado en un sistema de expresión de DNA. En otras realizaciones, un cDNA del segmento L del arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre forma parte de o se incorpora a un sistema de expresión de DNA. En ciertos ejemplos, un cDNA del segmento genómico del arenavirus se ha modificado para que lleve (i) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) y el ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o L se ha eliminado y sustituido por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0384] En ciertas realizaciones, el cDNA aquí proporcionado puede derivarse de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen el clon 13, la cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el cDNA se deriva del clon 13 de LCMV. En otras realizaciones específicas, el cDNA se deriva de la cepa LCMV MP.
[0385] En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen el clon 13, la cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento puede basarse en el clon 13 de LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento cepa LCMV MP. La secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV figura como SEQ ID N.º: 2. En ciertas realizaciones, la secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV es la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 1. La secuencia del segmento L del clon 13 de LCMV figura como SEQ ID N.º: 5. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV figura como SEQ ID N.º: 53. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV figura como SEQ ID N.º: 4.
[0386] En otra realización, se proporciona en el presente documento una célula, en la que la célula comprende un cDNA o un sistema vectorial descrito anteriormente en esta sección. También se proporcionan líneas celulares derivadas de dichas células, cultivos que comprenden dichas células, métodos de cultivo de dichas células infectadas. En ciertas realizaciones, se proporciona en el presente documento una célula, en la que la célula comprende un cDNA del segmento genómico del arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En algunas realizaciones, la célula comprende el segmento S y/o el segmento L.
[0387] 4.5.2 Partícula de Arenavirus Trisegmentada
[0388] En una realización, se proporcionan aquí ácidos nucleicos que codifican una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la Sección 4.2. En realizaciones más específicas, se proporciona en el presente documento una secuencia de nucleótidos de DNA o un conjunto de secuencias de nucleótidos de DNA, por ejemplo, como se establece en la Tabla 2 o la Tabla 3. Sección 4.2. Células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos.
[0389] En realizaciones específicas, se proporciona en el presente documento un cDNA que consiste en un cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada que se ha diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF. En otras realizaciones, es un cDNA de la partícula arenavírica trisegmentada que se ha diseñado para (i) llevar un ORF arenavírico en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) en la que la partícula arenavírica trisegmentada codifica un ORF heterólogo como se describe en la Sección 4.2.
[0390] [0230]En una realización, se proporciona en el presente documento un sistema de vector de expresión de DNA que codifica conjuntamente la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento. Específicamente, se proporciona en el presente documento un sistema de vector de expresión de DNA en el que uno o más vectores codifican tres segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S de una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento. Un sistema vectorial de este tipo puede codificar (una o varias moléculas de DNA separadas).
[0391] En otra realización, se proporciona en el presente documento un cDNA del segmento o segmentos S del arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre, y forma parte de un sistema de expresión de DNA o se incorpora a él. En otras realizaciones, un cDNA del segmento o segmentos L de arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre forma parte de un sistema de expresión de DNA o se incorpora a él. En ciertos ejemplos, se ha modificado un cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada para que lleve (i) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF; y (ii) se ha eliminado un ORF que codifica la proteína GP, NP, Z o L y se ha sustituido por un ORF heterólogo de un organismo distinto de un arenavirus.
[0392] En ciertas realizaciones, el cDNA aquí proporcionado puede derivarse de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen el clon 13, la cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el cDNA se deriva del clon 13 de LCMV. En otras realizaciones específicas, el cDNA se deriva de la cepa LCMV MP.
[0393] En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen el clon 13, la cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento puede basarse en el clon 13 de LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento cepa LCMV MP. La secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV figura como SEQ ID N.º: 2. En ciertas realizaciones, la secuencia del segmento S del clon 13 de LCMV es la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 1. La secuencia del segmento L del clon 13 de LCMV figura como SEQ ID N.º: 5. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV figura como SEQ ID N.º: 53. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV figura como SEQ ID N.º: 4.
[0394] En otra realización, se proporciona en el presente documento una célula, en la que la célula comprende un cDNA o un sistema vectorial descrito anteriormente en esta sección. También se proporcionan líneas celulares derivadas de dichas células, cultivos que comprenden dichas células, métodos de cultivo de dichas células infectadas. En ciertas realizaciones, se proporciona en el presente documento una célula, en la que la célula comprende un cDNA de la partícula de arenavirus trisegmentada. En algunas realizaciones, la célula comprende el segmento S y/o el segmento L.
[0395] 4.6 Métodos de Uso
[0396] Las vacunas han tenido éxito para prevenir y/o tratar enfermedades infecciosas, como las del virus de la polio y el sarampión. Sin embargo, la inmunización terapéutica en el contexto de enfermedades crónicas establecidas, incluidas las infecciones crónicas y el cáncer, ha tenido menos éxito. La capacidad de generar una partícula de arenavirus y/o una partícula de arenavirus trisegmentada representa una nueva estrategia de vacunación.
[0397] En una realización, los métodos para tratar una infección y/o cáncer en un sujeto comprenden administrar al sujeto uno o más tipos de partículas de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas, como se describe en el presente documento o una composición de las mismas. En una realización específica, un método para tratar una infección y/o cáncer descrito en el presente documento comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una o más partículas de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas, descritas en el presente documento o una composición de las mismas. El sujeto puede ser un mamífero, como, por ejemplo, un ser humano, un ratón, una rata, una cobaya, un animal domesticado, como, por ejemplo, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un gato, un perro, un hámster, un burro. En una realización específica, el sujeto es un ser humano. El sujeto humano puede ser varón, mujer, adulto, niño, anciano (65 años o más) y con múltiples enfermedades (es decir,un sujeto polimórbido). En ciertas realizaciones, los sujetos son aquellos cuya enfermedad ha progresado tras el tratamiento con quimioterapia, radioterapia, cirugía y/o agentes biológicos.
[0398] En otra realización, los métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno en un sujeto comprenden administrar al sujeto una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno o una composición de los mismos.
[0399] [0238]En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo tienen, son susceptibles a, o están en riesgo de una infección, desarrollo de cáncer o una alergia, o presentan una lesión tisular precancerosa. En otra realización específica, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo están infectados, son susceptibles, están en riesgo o se les ha diagnosticado una infección, cáncer, lesión tisular precancerosa o alergia.
[0401] En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo padecen, son susceptibles o corren el riesgo de padecer una infección, un cáncer, una lesión precancerosa o una alergia en el sistema pulmonar, el sistema nervioso central, el sistema linfático, el sistema gastrointestinal o el sistema circulatorio, entre otros. En una realización específica, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo padecen son susceptibles de padecer, o corren el riesgo de padecer, una infección, un cáncer o una alergia en uno o más órganos del cuerpo, incluidos, entre otros, el cerebro, el hígado, los pulmones, los ojos, los oídos, los intestinos, el esófago, el útero, la nasofaringe o las glándulas salivales.
[0403] En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo a un sujeto que padece síntomas que incluyen, entre otros, fiebre, sudores nocturnos, cansancio, malestar general malestar, dolor de garganta, inflamación de los ganglios, dolor articular, dolor muscular, pérdida de apetito, pérdida de peso, diarrea, ulceraciones gastrointestinales, hemorragia gastrointestinal, dificultad para respirar, neumonía, úlceras bucales, problemas de visión, hepatitis, ictericia, encefalitis, convulsiones, coma, prurito, eritema, hiperpigmentación, cambios en los ganglios linfáticos o pérdida de audición.
[0405] En otra realización, un arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno tal como se describe en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto de cualquier grupo de edad que padezca, sea susceptible o esté en riesgo de padecer una infección, un cáncer o una alergia. En una realización específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, tal como se describe en el presente documento, o una composición de la misma, se administra a un sujeto con un sistema inmunitario comprometido, un sujeto embarazado, un sujeto sometido a un trasplante de órgano o de médula ósea, un sujeto que toma medicamentos inmunosupresores, un sujeto sometido a hemodiálisis, un sujeto que padece cáncer, o un sujeto que padece, es susceptible de padecer o tiene riesgo de padecer una infección, un cáncer o una alergia. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, tal como se describe en el presente documento, o una composición de la misma, se administra a un sujeto que es un niño de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padece una infección, un cáncer o una alergia, es susceptible de padecerlos o está en riesgo de padecerlos. En otra realización específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento, o una composición del mismo, se administra a un sujeto que es un lactante que padece una infección, un cáncer o una alergia, es susceptible de padecerlos o está en riesgo de padecerlos. En otra realización específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento, o una composición del mismo, se administra a un sujeto que es un lactante de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad que padece una infección, un cáncer o una alergia, es susceptible de padecerlos o está en riesgo de padecerlos. En otra realización específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento, o una composición del mismo, se administra a un sujeto de edad avanzada que padece una infección, un cáncer o una alergia, es susceptible de padecerlos o está en riesgo de padecerlos. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto de edad avanzada de 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 años de edad.
[0407] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos con un riesgo elevado de infección diseminada, un cáncer o una alergia. En una realización específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos en periodo neonatal con un sistema inmunitario neonatal y, por tanto, inmaduro.
[0409] [0243]En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto que tiene una infección latente, cáncer o alergia. En una realización específica, una partícula de arenavirus o un arenavirus trisegmentado que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto que tiene una infección latente, un cáncer latente o una alergia latente que puede reactivarse en caso de compromiso del sistema inmunitario. Por lo tanto, se proporciona un método para prevenir la reactivación de una infección, un cáncer o una alergia.
[0410] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno tal como se describe en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto que tiene una infección recurrente, un cáncer o una alergia.
[0411] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición del mismo se administra a un sujeto con una predisposición genética a una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización, se administra a un sujeto una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, tal como se describe en el presente documento, o una composición del mismo. En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra a un sujeto con factores de riesgo. Algunos factores de riesgo ejemplares son el envejecimiento, el tabaco, la exposición al sol, la exposición a la radiación, la exposición a sustancias químicas, los antecedentes familiares, el alcohol, la mala alimentación, la falta de actividad física o el sobrepeso.
[0412] En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno reduce una infección sintomática, un cáncer o una alergia. En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno reduce una infección, un cáncer o una alergia asintomáticos.
[0413] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso descrito en el presente documento o una composición de la misma se administra a sujetos o animales infectados con una o más cepas del virus de la gripe, el virus de la bursitis infecciosa, el rotavirus, el virus de la bronquitis infecciosa, el virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la anemia de la gal lina, el virus de la enfermedad de Marekvirus de la enfermedad de Marek, virus de la leucosis aviar, adenovirus aviar o neumovirus aviar, virus causante del SARS, virus respiratorio sincitial humano, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, poliovirus, virus de la rabia, virus de Hendra, virus Nipah, virus de la parainfluenza humana 3, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del Ébola, virus de Marburgo, virus de la enfermedad del Nilo Occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, hantavirus, virus de la fiebre del Valle del Rift, virus de la fiebre de Lassa, virus del herpes simple y virus de la fiebre amarilla.
[0414] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un cáncer descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos que padecen uno o más tipos de cáncer. En otras realizaciones, se puede tratar cualquier tipo de cáncer susceptible de tratamiento con las vacunas descritas en el presente documento. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un cáncer descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos que padecen, por ejemplo, melanoma, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, neuroblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma cervical y carcinoma de estómago, linfoma de Burkitt linfoma no Hodgkin; linfoma de Hodgkin; carcinoma nasofaríngeo (cáncer de la parte superior de la garganta, detrás de la nariz), leucemia, linfoma del tejido linfoide asociado a mucosas.
[0415] En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos que padecen una o más alergias. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un alérgeno descrito en el presente documento o una composición del mismo se administra a sujetos que padecen, por ejemplo, una alergia estacional, una alergia perenne, rinoconjuntivitis, asma, eczema, una alergia alimentaria.
[0416] En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición del mismo a sujetos confiere inmunidad mediada por células (CMI) contra una infección, un cáncer o un alérgeno. Sin estar limitado por la teoría, en otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición del mismo infecta y expresa antígenos de interés en células presentadoras de antígenos (APC) del huésped (p. ej.,macrófagos, células dendríticas o células B) para la presentación directa de antígenos en el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I y II. En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición de los mismos a sujetos induce respuestas citolíticas plurifuncionales así como respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de CMV coproductoras de IFN-γ y TNF-α de gran magnitud para tratar o prevenir una infección, un cáncer o una alergia.
[0417] [0251]En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, o una composición de los mismos, reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección, un cáncer o una alergia en al menos aproximadamente un 10%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección, un cáncer o una alergia en ausencia de dicho tratamiento.
[0419] En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno o una composición de los mismos reduce los síntomas de una infección, un cáncer o una alergia en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección, un cáncer o una alergia en ausencia de dicho tratamiento.
[0421] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra preferiblemente en inyecciones múltiples (p. ej.,al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 45, o 50 inyecciones) o por infusión continua (p. ej.,usando una bomba) en múltiples sitios (p. ej.,al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, o 14 sitios). En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra en dos o más inyecciones separadas durante un periodo de 6 meses, un periodo de 12 meses, un periodo de 24 meses o un periodo de 48 meses. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra con una primera dosis en una fecha elegida, una segunda dosis al menos 2 meses después de la primera dosis, y una tercera hace 6 meses después de la primera dosis.
[0423] En un ejemplo, las inyecciones cutáneas se realizan en múltiples sitios del cuerpo para reducir la extensión de las reacciones cutáneas locales. En un día de vacunación determinado, el paciente recibe la dosis total asignada de células administradas desde una jeringa en 3 a 5 inyecciones intradérmicas separadas de la dosis (p. ej.,al menos 0,4 ml, 0,2 ml o 0,1 ml) cada una en una extremidad espaciada al menos unos 5 cm (p. ej.,al menos 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 o cm) a la entrada de la aguja desde la inyección vecina más cercana. En los días de vacunación siguientes, los puntos de inyección se rotan a diferentes extremidades en el sentido de las agujas del reloj o en sentido contrario.
[0425] En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso, de replicación deficiente que expresa un antígeno CMV o una composición del mismo en sujetos con un sistema inmunitario neonatal y por lo tanto induce una respuesta inmunitaria mediada por células (CMI) contra una infección, un cáncer o una alergia, que excede en al menos aproximadamente un 10%, al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 25%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 35%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, o más, la respuesta CMI contra una infección, un cáncer o una alergia en ausencia de dicho tratamiento.
[0427] En ciertas realizaciones, la administración a un sujeto de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, como se describe en el presente documento, induce un título de anticuerpos detectable durante un mínimo de al menos cuatro semanas. En otra realización, la administración a un sujeto de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, tal como se describe en el presente documento, aumenta el título de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1000%.
[0429] En ciertas realizaciones, la exposición al antígeno primario provoca un título de anticuerpos funcional (neutralizante) y mínimo de al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 300%, al menos el 400%, al menos el 500%, o al menos el 1000% del suero de control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, el título medio geométrico de anticuerpos neutralizantes primarios aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1000 en al menos 4 semanas tras la inmunización. En otra realización, la inmunización con una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en el presente documento, produce títulos elevados de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización tras una única administración de la vacuna, o tras dos o más inmunizaciones secuenciales.
[0431] [0258]En otra realización, la exposición al antígeno secundario aumenta el título de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1000%. En otra realización, la exposición al antígeno secundario provoca un título de anticuerpos funcional (neutralizante) y mínimo de al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 300%, al menos el 400%, al menos el 500% o al menos el 1000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, el título medio geométrico de anticuerpos neutralizantes secundarios aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1000 en al menos 4 semanas tras la inmunización. En otra realización, una segunda inmunización con una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, tal como se describe en el presente documento, produce títulos elevados de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización.
[0433] En otra realización, una tercera inmunización de refuerzo aumenta el título de anticuerpos en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 1000%. En otra realización, la inmunización de refuerzo provoca un título de anticuerpos funcional (neutralizante) y mínimo de al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 300%, al menos el 400%, al menos el 500% o al menos el 1000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la tercera inmunización de refuerzo produce un título de anticuerpos funcional (neutralizante) y mínimo de al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 300%, al menos el 400%, al menos el 500% o al menos el 1000% de los sueros de control medios de sujetos humanos inmunes a la infección. En otra realización, una tercera inmunización de refuerzo prolonga el título de anticuerpos durante al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización.
[0435] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, provoca una respuesta de células T independiente o dependiente. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, provoca una respuesta de células T. En otras realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, tal como se describe en el presente documento, provoca una respuesta T helper. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, tal como se describe en el presente documento, provoca una respuesta orientada a Th1 o una respuesta orientada a Th2.
[0437] En realizaciones más específicas, la respuesta orientada a Th1 se indica por un predominio de anticuerpos IgG1 frente a IgG2. En otras realizaciones, la proporción de IgG1:IgG2 es superior a 1:1, superior a 2:1, superior a 3:1 o superior a 4:1. En otra realización, la partícula infecciosa de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, tal como se describe en el presente documento, se indica por un predominio de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE.
[0439] En algunas realizaciones, el arenavirus infeccioso y de replicación deficiente que expresa un antígeno CMV o un fragmento del mismo provoca una respuesta de células T CD8+. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia provoca respuestas de células T CD4+ y CD8+, en combinación o no con anticuerpos.
[0441] En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en el presente documento, provoca títulos elevados de anticuerpos neutralizantes. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, tal como se describe en el presente documento, produce títulos más altos de anticuerpos neutralizantes que la expresión de los componentes del complejo proteico individualmente.
[0443] En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa uno, dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos derivados de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia provoca títulos más altos de anticuerpos neutralizantes que una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno.
[0445] [0265]En ciertas realizaciones, los métodos comprenden además la coadministración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y al menos una terapia adicional. En ciertas realizaciones, la coadministración es simultánea. En otra realización, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se administra antes de la administración de la terapia adicional. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se administra tras la administración de la terapia adicional. En ciertas realizaciones, la administración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y la terapia adicional es de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas o aproximadamente 12 horas. En ciertas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y dicha terapia adicional es de aproximadamente 1 día, 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas. En ciertas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y la terapia adicional es de aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses o aproximadamente 6 meses.
[0446] En ciertas realizaciones, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, o una composición del mismo, reduce el número de anticuerpos detectados en una muestra de sangre o de suero de un paciente. En ciertas realizaciones, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una composición alergénica del mismo reduce la cantidad del organismo infeccioso, cáncer o alergia detectada en orina, saliva, sangre, lágrimas, semen, muestra de células exfoliadas o leche materna.
[0447] En otra realización, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición puede comprender además una proteína informadora. En una realización más específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno y una proteína informadora como se describe en el presente documento o una composición se administra a sujetos para tratar y/o prevenir una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización específica, la proteína informadora puede utilizarse para monitorizar la expresión génica, la localización de proteínas y la administración de vacunas,in vivo, in situy en tiempo real.
[0448] En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento o una composición puede comprender además una proteína fluorescente. En una realización más específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno y una proteína informadora como se describe en el presente documento o una composición se administra a sujetos para tratar y/o prevenir una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización específica, la proteína fluorescente puede utilizarse para monitorizar la expresión génica, la localización de proteínas y la administración de vacunasin vivo, in situy en tiempo real.
[0449] Los cambios en la función de respuesta CMI contra una infección, un cáncer o una alergia inducidos por la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alérgeno o una composición de los mismos en sujetos pueden medirse mediante cualquier ensayo conocido por el artesano experto, incluyendo, pero sin limitarse a, citometría de flujo (véase,p. ej.,Perfetto S.P. et al., 2004, Nat Rev Immun., 4(8):648-55), ensayos de proliferación de linfocitos (véase,p. ej.,Bonilla F.A. et al., 2008, Ann Allergy Asthma Immunol, 101:101-4; y Hicks M.J. et al., 1983, Am J Clin Pathol, 80:159-63), ensayos para medir la activación de linfocitos, incluida la determinación de cambios en la expresión de marcadores de superficie tras la activación de la medición de citocinas de linfocitos T (véase,p. ej.,Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6), ensayos ELISPOT (véase,p. ej.,Czerkinsky C.C. et al., 1983, J Immunol Methods, 65:109-121; y Hutchings P.R. et al., 1989, J Immunol Methods, 120:1-8), o ensayos de citotoxicidad de células Natural killer (véase,p. ej.,Bonilla F.A. et al., 2006, Ann Allergy Asthma Immunol., 94(5 Suppl 1):S1-63).
[0450] El éxito del tratamiento de un paciente con cáncer puede evaluarse como la prolongación de la supervivencia esperada, la inducción de una respuesta inmunitaria antitumoral o la mejora de una característica particular de un cáncer. Algunos ejemplos de características de un cáncer que podrían mejorarse son el tamaño del tumor (p. ej.,T0, T es o T1-4), el estado de la metástasis (p. ej.,M0, M1), el número de tumores observables, la afectación ganglionar (p. ej.,N0, N1-4, Nx), grado (p. ej.,grados 1, 2, 3 o 4), estadio (p. ej.,0, I, II, III o IV), presencia o concentración de determinados marcadores en las células o en los fluidos corporales (p. ej.,AFP, B2M, beta-HCG, BTA, CA 15-3, CA 27.29, CA 125, CA 72.4, CA 19-9, calcitonina, CEA, cromogranina A, EGFR, receptores hormonales, HER2, HCG, inmunoglobulinas, NSE, NMP22, PSA, PAP, PSMA, S-100, TA-90 y tiroglobulina), y/o patologías asociadas (p. ej.,ascitis o edema) o síntomas (p. ej.,caquexia, fiebre, anorexia o dolor). La mejora, si se puede medir en porcentaje, puede ser de al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% (p. ej.,la supervivencia, o el volumen o las dimensiones lineales de un tumor).
[0451] En otra realización, descrita en el presente documento, es un método de uso con una partícula de arenavirus (p. ej.,LCMV) que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno como se describe en el presente documento en el que el al menos uno de los ORF que codifica la proteína GP, NP, Z y L se sustituye con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alérgeno o un fragmento antigénico del mismo.
[0452] 4.7 Composición, administración y posología
[0453] La presente solicitud se refiere además a vacunas, composiciones inmunogénicas (p. ej.,formulaciones vacunales) y composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en el presente documento. Dichas vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas pueden formularse según los procedimientos habituales en la técnica.
[0454] Será fácilmente aparente para alguien con conocimientos ordinarios en las artes pertinentes que las modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones descritos en el presente documento pueden ser obvias y se pueden hacer sin apartarse del alcance del alcance o cualquier realización del mismo.
[0455] En otra realización, se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento. Dichas composiciones pueden utilizarse en métodos de tratamiento y prevención de enfermedades. En una realización específica, las composiciones aquí descritas se utilizan en el tratamiento de sujetos infectados o susceptibles a una infección. En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se utilizan en el tratamiento de sujetos susceptibles de padecer cáncer o tumorigénesis, o que presentan síntomas característicos de los mismos, o que han sido diagnosticados de cáncer. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria en un huésped al que se administra la composición. Las composiciones inmunogénicas aquí descritas pueden utilizarse como vacunas y, en consecuencia, pueden formularse como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas aquí descritas se utilizan en la prevención de infecciones o cáncer de sujetos (p. ej.,sujetos humanos). En otras realizaciones, la vacuna, la composición inmunogénica o la composición farmacéutica son adecuadas para la administración veterinaria y/o humana.
[0457] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento composiciones inmunogénicas que comprenden un vector arenavirus como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, concomitantemente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento aumenta, mejora y/o potencia la respuesta inmunitaria a una partícula de arenavirus o a una partícula de arenavirus trisegmentada y, lo que es más importante, a los productos génicos que vectoriza, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria a la partícula de arenavirus o a la partícula de arenavirus trisegmentada y a los productos génicos vectorizados por esta última. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria a la partícula de arenavirus o a la partícula de arenavirus trisegmentada y a los productos génicos vectorizados por esta última y no produce una alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, como p. ej., el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos o células dendríticas. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de sal mineral o adyuvantes de gel de sal mineral, adyuvantes particulados, adyuvantes microparticulados, adyuvantes mucosos y adyuvantes inmunoestimuladores. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), lípido monofosforilo A 3 De-O-acilado (MPL) (véase documento GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional n.º PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional n.º WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional N.º PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional N.º WO2007/109813) y saponinas, como QS21 (véase Kensil et al., 1995, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY); Pat. de EE. UU. N.º 5,057,540). En algunas realizaciones, el adyuvante es adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, como el lípido monofosforilo A (véase Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med.336, 86-91).
[0459] Las composiciones comprenden la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada aquí descrita sola o junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Pueden utilizarse suspensiones o dispersiones de la partícula de arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o contener excipientes, p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones, y se preparan de una manera conocida per se, p. ej., mediante procesos convencionales de dispersión y suspensión. En ciertas realizaciones, tales dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones se conservan a temperaturas en torno a 2 °C a 8 °C, o preferentemente para un almacenamiento más prolongado pueden congelarse y luego descongelarse poco antes de su uso, o alternativamente pueden liofilizarse para su almacenamiento. Para la inyección, la vacuna o los preparados inmunogénicos pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, como la solución de Hanks, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes formuladores como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
[0461] En ciertas realizaciones, las composiciones aquí descritas comprenden adicionalmente un conservante, p. ej., el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas aquí comprenden de 0,001% a 0,01% de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas aquí descritas no contienen conservantes.
[0463] Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 10<3>a aproximadamente 10<11>unidades formadoras de foco de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada.
[0464] En una realización, la administración de la composición farmacéutica es parenteral. La administración parenteral puede ser intravenosa o subcutánea. En consecuencia, las formas de dosis unitarias para administración parenteral son, p. ej., ampollas o viales,p. ej.,viales que contienen de aproximadamente 10<3>a 10<10>unidades formadoras de foco o de 10<5>a 10<15>partículas físicas de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada.
[0465] En otra realización, una vacuna o composición inmunogénica proporcionada en el presente documento se administra a un sujeto por, entre otras, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, tópica, subcutánea, percutánea, intranasal e inhalatoria, y mediante escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel,p. ej.,utilizando una aguja bifurcada). Concretamente, pueden utilizarse vías subcutáneas o intravenosas.
[0466] Para la administración intranasal o por inhalación, el preparado para uso según la presente invención puede suministrarse convenientemente en forma de una presentación en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado,p. ej.,diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de,p. ej.,gelatina para su uso en un inhalador o insufladores que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, como lactosa o almidón.
[0467] La dosificación del principio activo depende del tipo de vacunación y del sujeto, así como de su edad, peso, condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración. En ciertas realizaciones, se emplea un ensayoin vitropara ayudar a identificar los intervalos óptimos de dosificación. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayoin vitroo de modelos animales.
[0468] En ciertas realizaciones, la vacuna, composición inmunogénica o composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede utilizarse como una vacunación viva. Las dosis ejemplares de una partícula viva de arenavirus pueden variar entre 10-100, o más, PFU de virus vivo por dosis. En algunas realizaciones, las dosis adecuadas de una partícula de arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada son 10<2>, 5×10<2>, 10<3>, 5×10<3>, 10<4>, 5×10<4>, 10<5>, 5×10<5>, 10<6>, 5×10<6>, 10<7>, 5×10<7>, 10<8>, 5×10<8>, 1×10<9>, 5×10<9>, 1×10<10>, 5×10<10>, 1×10<11>, 5×10<11>o 10<12>pfu, y pueden administrarse a un sujeto una, dos, tres o más veces con intervalos tan frecuentes como sea necesario. En otra realización, un arenavirus vivo se formula de tal manera que una dosis de 0,2 ml contiene 10<6,5>-10<7,5>unidades focales fluorescentes de partícula de arenavirus vivo. En otra realización, una vacuna inactivada se formula de manera que contenga entre 15 µg y 100 µg, entre 15 µg y 75 µg, entre 15 µg y 50 µg, o entre 15 µg y 30 µg de un arenavirus.
[0469] En ciertas realizaciones, para la administración a niños, se administran a un niño dos dosis de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento o una composición de la misma, administradas con un intervalo de al menos un mes. En realizaciones específicas para la administración a adultos, se administra una dosis única de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento o una composición de la misma. En otra realización, se administran a un adulto dos dosis de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento o una composición de las mismas, con un intervalo de al menos un mes. En otra realización, se puede administrar a un niño pequeño (de seis meses a nueve años de edad) una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en el presente documento o una composición de la misma por primera vez en dos dosis administradas con un mes de diferencia. En una realización particular, un niño que recibió sólo una dosis en su primer año de vacunación debería recibir dos dosis en el año siguiente. En algunas realizaciones, se prefieren dos dosis administradas con un intervalo de 4 semanas para niños de 2 a 8 años de edad a los que se administra por primera vez una composición inmunogénica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, para niños de 6 a 35 meses de edad, puede preferirse media dosis (0,25 ml), en contraste con 0,5 ml que puede preferirse para sujetos de más de tres años de edad.
[0470] En ciertas realizaciones, las composiciones pueden administrarse al paciente en una dosis única que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede administrarse al paciente en una dosis única que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada y, una o más composiciones farmacéuticas, cada una en una cantidad terapéuticamente eficaz.
[0471] En ciertas realizaciones, la composición se administra al paciente como dosis única seguida de una segunda dosis de tres a seis semanas después. De acuerdo con estas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse a los sujetos a intervalos de seis a doce meses tras la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar un arenavirus diferente o una composición del mismo. En algunas realizaciones, la administración de la misma composición descrita en el presente documento puede repetirse y separarse al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
[0472] [0287]También se proporcionan aquí procesos y el uso de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada para la fabricación de vacunas en forma de preparaciones farmacéuticas, que comprenden la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente solicitud se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo mediante procesos convencionales de mezcla y/o dispersión.
[0473] 4.8 Ensayos
[0474] 4.8.1 Ensayos de Detección de Arenavirus
[0475] El artesano experto podría detectar un segmento genómico de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada, como se describe en el presente documento, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la RT-PCR puede utilizarse con cebadores específicos de un arenavirus para detectar y cuantificar un segmento genómico de arenavirus que ha sido diseñado para llevar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF o una partícula de arenavirus trisegmentada. Para cuantificar los productos génicos del segmento genómico del arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada pueden utilizarse Western blot, ELISA, radioinmunoensayo, inmuneprecipitación, inmunocitoquímica o inmunocitoquímica junto con FACS.
[0476] 4.8.2 Ensayo para Medir la Infecciosidad
[0477] Para medir la infectividad de una preparación de vector de arenavirus puede utilizarse cualquier ensayo conocido por el artesano experto. Por ejemplo, la determinación del título del virus/vector puede realizarse mediante un "ensayo de unidad formadora de foco" (ensayo FFU). En resumen, las células complementarias,p. ej.,las células MC57, se siembran e inoculan con diferentes diluciones de una muestra de virus/vector. Tras un periodo de incubación, para permitir que las células formen una monocapa y que el virus se adhiera a las células, se cubre la monocapa con metilcelulosa. Cuando se siguen incubando las placas, las células infectadas originales liberan progenie vírica. Gracias a la superposición de metilcelulosa, la propagación de los nuevos virus queda restringida a las células vecinas. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas denominada Foco. Dichos Foci pueden hacerse visibles y, por tanto, contables utilizando anticuerpos contra LCMV- NP u otra proteína expresada por la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y una reacción de color basada en HRP. El título de un virus / vector puede calcularse en unidades formadoras de foco por mililitro (FFU/mL).
[0478] 4.8.3 Crecimiento de una Partícula de Arenavirus
[0479] El crecimiento de una partícula de arenavirus descrita en el presente documento puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento (p. ej.,cultivo celular). El crecimiento viral puede determinarse inoculando diluciones seriadas de una partícula de arenavirus descrita en el presente documento en cultivos celulares (p. ej.,células Vero o células BHK-21). Tras incubar el virus durante un tiempo determinado, se aísla el virus utilizando métodos estándar.
[0480] 4.8.4 ELISA en Suero
[0481] La determinación de la respuesta inmune humoral tras la vacunación de animales (p. ej.,ratones, cobayas) puede realizarse mediante ELISA (ensayos inmunoenzimáticos) en suero específico de antígeno. En resumen, las placas se recubren con antígeno (p. ej.,proteína recombinante), se bloquean para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos y se incuban con diluciones seriadas de sueros. Tras la incubación, pueden detectarse los anticuerpos séricos unidos,p. ej.,utilizando un anticuerpo específico de la especie (p. ej.,ratón, cobaya) acoplado a enzimas (que detecta la IgG total o las subclases de IgG) y una reacción de color posterior. Los títulos de anticuerpos pueden determinarse, porejemplo,como título medio geométrico final.
[0482] 4.8.5 Ensayo para Medir la Actividad Neutralizante de los Anticuerpos Inducidos
[0483] La determinación de los anticuerpos neutralizantes en suero se realiza con el siguiente ensayo celular utilizando células ARPE-19 de ATCC y un virus marcado con GFP. Además, se utiliza suero de cobaya suplementario como fuente de complemento exógeno. El ensayo se inicia con la siembra de 6,5x10<3>células/pocillo (50µl/pocillo) en una placa de 384 pocillos uno o dos días antes de utilizarla para la neutralización. La neutralización se realiza en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos sin células durante 1 h a 37 °C. Tras el paso de incubación de neutralización, la mezcla se añade a las células y se incuba durante 4 días más para la detección de GFP con un lector de placas. En cada placa se utiliza un suero humano neutralizante positivo como control positivo del ensayo para comprobar la fiabilidad de todos los resultados. Los títulos (EC50) se determinan mediante un ajuste de curva logística de 4 parámetros. Como prueba adicional, los pocillos se comprueban con un microscopio de fluorescencia.
[0484] 4.8.6 Ensayo de Reducción de Placa
[0485] [0293]En resumen, los ensayos de reducción de placas (neutralización) para LCMV pueden realizarse mediante el uso de un LCMV de replicación competente o deficiente que se marca con proteína verde fluorescente, puede utilizarse suero de conejo al 5% como fuente de complemento exógeno, y las placas pueden enumerarse mediante microscopía de fluorescencia. Los títulos de neutralización pueden definirse como la dilución más alta de suero que da lugar a una reducción del 50%, 75%, 90% o 95% de las placas, en comparación con la de las muestras de suero de control (preinmune).
[0486] qPCR Los genomas de RNA de LCMV se aíslan utilizando QIAamp Viral RNA mini Kit (QIAGEN), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los equivalentes del genoma del RNA del LCMV se detectan mediante PCR cuantitativa llevada a cabo en un sistema PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) con SuperScript<®>III Platinum<®>One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen) y cebadores y sondas (FAM reporter y NFQ-MGB Quencher) específicos para parte de la región codificante del NP del LCMV u otro tramo genómico de la partícula del arenavirus o de la partícula del arenavirus trisegmentada. El perfil de temperatura de la reacción puede ser: 30 min a 60 °C, 2 min a 95 °C, seguido de 45 ciclos de 15 s a 95 °C, 30 s a 56 °C. El RNA puede cuantificarse comparando los resultados de la muestra con una curva patrón preparada a partir de una serie de diluciones log10 de un fragmento de RNA cuantificado espectrofotométricamente y transcrito in vitro, correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de LCMV NP u otro tramo genómico de la partícula de arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada que contiene los sitios de unión del cebador y la sonda.
[0487] 4.8.7 Inmunoelectrotransferencia
[0488] Las células infectadas cultivadas en frascos de cultivo tisular o en suspensión se lisan en los puntos temporales indicados tras la infección utilizando tampón RIPA (Thermo Scientific) o se utilizan directamente sin lisis celular. Las muestras se calientan a 99 °C durante 10 minutos con agente reductor y tampón de muestras NuPage LDS (NOVEX) y se enfrían a temperatura ambiente antes de cargarlas en geles SDS al 4-12% para la electroforesis. Las proteínas se transfieren a las membranas mediante el dispositivo de transferencia Invitrogens iBlot Gel y se visualizan mediante tinción de Ponceau. Por último, las preparaciones se sondean con anticuerpos primarios dirigidos contra proteínas de interés y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, seguidos de tinción con solución 1-Step NBT/BCIP (INVITROGEN).
[0489] 4.8.8 Ensayo de tinción de multímeros de péptidos MHC para la detección de la proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno
[0490] Se puede utilizar cualquier ensayo conocido por el artesano experto para probar las respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Por ejemplo, puede utilizarse el ensayo de tinción de tetrámeros de péptidos MHC (véase, (p. ej.,Altman J.D. et al., Science. 1996; 274:94-96; y Murali-Krishna K. et al., Immunity.1998; 8:177-187). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos, se utiliza un ensayo de tetrámeros para detectar la presencia de células T específicas de antígeno. Para que una célula T detecte el péptido para el que es específica, debe reconocer tanto el péptido como el tetrámero de moléculas MHC hechas a medida para una especificidad de antígeno y un haplotipo MHC definidos de células T (normalmente marcadas con fluorescencia). A continuación, el tetrámero se detecta por citometría de flujo mediante la etiqueta fluorescente.
[0491] 4.8.9 Ensayo ELISPOT para la detección de la proliferación de células T CD4+ antígeno-específicas.
[0492] Se puede utilizar cualquier ensayo conocido por el artesano experto para probar las respuestas de células T CD4+ específicas de antígeno. Por ejemplo, puede utilizarse el ensayo ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120:1-8). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos: Se recubre una placa inmunospot con un anticuerpo anti-citoquina. Las células se incuban en la placa immunospot. Las células segregan citocinas y luego se lavan. A continuación, las placas se recubren con un segundo anticuerpo anticitoquinas biotinilado y se visualizan con un sistema avidina-HRP.
[0493] 4.8.10 Ensayo de Citoquinas Intracelulares para la Detección de la Funcionalidad de las Respuestas de las Células T CD8+ y CD4+.
[0494] Para comprobar la funcionalidad de las respuestas de las células T CD8+ y CD4+ puede utilizarse cualquier ensayo conocido por el artesano experto. Por ejemplo, puede utilizarse el ensayo de citocinas intracelulares combinado con citometría de flujo (véase, (p. ej.,Suni M.A. et al., J Immunol Methods. 1998; 212:89-98; Nomura L.E. et al., Cytometry.
[0495] 2000; 40:60-68; y Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001; 8:628-63). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos: activación de las células mediante péptidos o proteínas específicos, se añade un inhibidor del transporte de proteínas (p. ej.,brefeldina A) para retener las citocinas dentro de la célula. Tras un periodo definido de incubación, normalmente 5 horas, se procede a un lavado y se pueden añadir a las células anticuerpos contra otros marcadores celulares. A continuación, las células se fijan y permeabilizan. Se añaden los anticuerpos anticitoquinas conjugados con fluorocromo y las células pueden analizarse por citometría de flujo.
[0496] 4.8.11 Ensayo para confirmar la deficiencia de replicación de vectores virales
[0497] Cualquier ensayo conocido por el artesano experto que determine la concentración de partículas virales infecciosas y de replicación competente también puede utilizarse para medir partículas virales de replicación deficiente en una muestra. Por ejemplo, pueden utilizarse para este fin ensayos de FFU con células no complementarias.
[0498] [0300]Además, los ensayos basados en placas son el método estándar utilizado para determinar la concentración de virus en términos de unidades formadoras de placas (PFU) en una muestra de virus. En concreto, una monocapa confluente de células huésped no complementarias se infecta con el virus a diluciones variables y se cubre con un medio semisólido, como el agar, para evitar que la infección vírica se propague indiscriminadamente. Una placa vírica se forma cuando un virus infecta y se replica con éxito en una célula dentro de la monocapa celular fija, y se propaga a las células circundantes (véase, p. ej., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). La formación de la placa puede tardar entre 2 y 14 días, dependiendo del virus analizado. Por lo general, las placas se cuentan manualmente y los resultados, en combinación con el factor de dilución utilizado para preparar la placa, se utilizan para calcular el número de unidades formadoras de placa por unidad de volumen de muestra (PFU/mL). El resultado de PFU/mL representa el número de partículas infecciosas competentes para la replicación dentro de la muestra. Cuando se utilizan células C, el mismo ensayo puede utilizarse para valorar partículas de arenavirus deficientes en replicación o partículas de arenavirus trisegmentadas.
[0499] 4.8.12 Ensayo de Expresión de Antígeno Viral
[0500] Para medir la expresión de antígenos virales puede utilizarse cualquier ensayo conocido por el experto. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de FFU. Para la detección, se utilizan preparados de anticuerpos monoclonales o policlonales contra los antígenos víricos respectivos (FFU transgénicos específicos).
[0501] 4.8.13 Modelos Animales
[0502] Para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus descrita en el presente documento pueden utilizarse modelos animalesin vivo. En ciertas realizaciones, los modelos animales que pueden utilizarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus trisegmentada incluyen ratón, cobaya, conejo y mono. En una realización preferida, los modelos animales que pueden utilizarse para investigar la recombinación y la infectividad de un arenavirus incluyen el ratón. En una realización más específica, los ratones que pueden utilizarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus son triplemente deficientes para el receptor de interferón de tipo I, el receptor de interferón de tipo II y el gen activador de la recombinación 1 (RAG1).
[0503] En ciertas realizaciones, los modelos animales pueden utilizarse para determinar la infectividad del arenavirus y la estabilidad del transgén. En algunas realizaciones, el RNA viral puede aislarse del suero del modelo animal. Las técnicas son fácilmente conocidas por los expertos en la materia. El RNA viral puede transcribirse inversamente y el cDNA portador de los ORF del arenavirus puede amplificarse por PCR con cebadores específicos para cada gen. La citometría de flujo también puede utilizarse para investigar la infectividad de los arenavirus y la estabilidad de los transgenes.
[0504] 5. EJEMPLOS
[0505] Estos ejemplos demuestran que la tecnología de vectores basada en el virus LCMV puede utilizarse para desarrollar con éxito (1) un segmento genómico de arenavirus con un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF, y (2) una partícula de arenavirus trisegmentada que no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.
[0506] 5.1 Materiales y Métodos
[0507] 5.1.1 Células:
[0508] Las células BHK-21 se cultivaron en medio Dulbecco's Eagle con alto contenido en glucosa (DMEM; Sigma) suplementado con un 10 % de suero fetal de ternera inactivado por calor (FCS; Biochrom), 10 mM de HEPES (Gibco), 1 mM de piruvato sódico (Gibco) y 1x caldo de triptosa fosfato. Las células MC57 se mantuvieron en medio esencial mínimo (MEM; Sigma) complementado con un 5 % de FCS inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina (Gibco) y penicilinaestreptomicina (100'000 U/ml de penicilina y 50 mg/l de estreptomicina; Gibco). Ambas líneas celulares se cultivaron a 37 °C en un incubador humidificado con un 5% de CO2.
[0509] Las células BHK-21 que expresan NP se generaron transfectando células BHK-21 con un plásmido que expresa NP bajo el control del promotor eucariota EF1-alfa y que codifica el gen de resistencia a la puromicina de acuerdo con el protocolo del fabricante. 48 horas después de la transfección, se añadieron 4 µg/ml de puromicina al medio. Otras 48 horas después, las células se pasaron a matraces T150. Una vez que se hicieron visibles los clones separados, se cosecharon las células y se diluyeron en serie en una placa de 96 pocillos para obtener clones individuales. Se comprobó ópticamente en los pocillos el crecimiento de poblaciones celulares de clones individuales y se pasaron las células respectivas a placas de 6 pocillos una vez que formaron una monocapa confluente. Las células BHK-21 que expresaban NP se cultivaron en medio BHK-21 en presencia de 4 µg/ml de puromicina.
[0510] Anteriormente se han descrito células BHK-21 que expresan GP. Brevemente, las células BHK-21 se transfectaron de forma estable con un plásmido que expresa un cDNA de LCMV-GP optimizado en codones y el casete de resistencia a la puromicina. Los clones que expresan GP se seleccionaron mediante la adición de 4 µg/ml de puromicina al medio y se obtuvieron clones únicos mediante diluciones seriadas, tal como se ha descrito para las células BHK-21 que expresan NP.
[0511] 5.1.2 Los plásmidos
[0512] Los plásmidos pol-I L, pC-NP y pC-L han sido descritos previamente. Para la generación de plásmidos pol-I S que codifican para GFP o RFP como genes informadores y NP o GP, utilizamos como base un plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm (pol-I 5'-BsmBI_IGR_BbsI_3'). Este plásmido codifica la región 5' no traducida (5' UTR) del segmento S viral seguida de dos sitios de restricción BsmBI, la región intergénica (IGR), un resto NP y un marco de lectura abierto (ORF) CAT flanqueado por sitios de restricción BbsI y la 3' UTR del segmento S. Los plásmidos pol-I S que codifican para GP en su posición natural 5' y GFP en orientación antisentido en la posición 3' (pol-I 5'-GP_IGR_GfP-3') se clonaron insertando GP mediante restricción específica del sitio BsmBI y ligación en el plásmido pol-I Bbs/Bsm. En un segundo paso, se insertó GFP mediante digestión con BbsI y ligadura. Para obtener plásmidos pol-I S que codifican para GP en la orientación artificial 3' (pol-I 5'-GFP_IGR_GP-3'), se insertó GP mediante digestión BbsI en la posición 3' en el plásmido pol-I Bbs/Bsm y GFP con restricción/ligación BsmBI en la posición 5'. Los pol-I S que codifican para GFP o RFP y NP (pol-I 5'-GFP_IGR_NP-3' o pol-I 5'RFP_IGR_NP-3') se clonaron insertando NP mediante digestión BbsI y ligación en el plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm y GFP o RFP mediante clonación BsmBI. El plásmido pol-I con GP de la cepa WE de LCMV y NP de la cepa Clon 13 de LCMV (Cl13) se clonaron insertando los genes respectivos mediante restricción/ligación específica de los sitios Bbs y Bsm en los sitios respectivos del plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm.
[0513] El segmento S que codifica para la GP de fusión WE/WET se obtuvo sustituyendo los últimos 255 pares de bases del ORF WE por una secuencia de codón optimizado denominada "WET". Esto se consiguió amplificando por PCR en un primer paso un fragmento de WE GP con un cebador específico de WE (SEQ ID N.º: 11) y un cebador de fusión específico de WE con un voladizo complementario a la secuencia WET (SEQ ID N.º: 12). Paralelamente, la secuencia WET se amplificó mediante PCR utilizando un cebador específico de WET (SEQ ID N.º: 13) y un cebador de fusión específico de WET complementario a la secuencia WE (SEQ ID N.º: 14). En una tercera reacción PCR, los dos productos PCR se fusionaron mediante PCR-fusión utilizando los dos cebadores de fusión mencionados. El fragmento de fusión WE/WET resultante se digirió con BsmBI y se ligó a un plásmido pol-I BsmBI_IGR_GFP-3' que había sido digerido con la misma enzima de restricción.
[0514] El plásmido pol-I que codifica para el segmento S recombinado del virus recombinado in vivo r3LCMV-GFP<nat>#3 se clonó insertando el fragmento de DNA sintetizado (síntesis génica por GenScript) mediante restricción/ligación sitioespecífica con SacI y XmaI en un plásmido que codifica un segmento S de tipo silvestre bajo el control de un promotor pol-I (pol-I GP_IGR_NP) dando como resultado pol-I GP_IGR_GFPrest_IGR_NP.
[0515] 5.1.3 Transfección de células con DNA y rescate de virus recombinantes
[0516] Las células BHK-21 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 4x105 células/pocillo y se transfectaron 24 horas después con diferentes cantidades de DNA utilizando lipofectamina (3 µl/µg DNA; Invitrogen) o jetPRIME (2 µl/µg DNA; Polyplus) según las instrucciones del fabricante. Para el rescate de virus bisegmentados recombinantes enteramente a partir de DNA plasmídico, los dos factores mínimos de trans-acción viral NP y L se liberaron a partir de plásmidos dirigidos por pol-II (0,8 µg pC-NP, 1 µg pC-L) y se co-transfectaron con 1,4 µg pol-I L y 0,8 µg pol-I S. En el caso del rescate de r3LCMV trisegmentado, compuesto por un segmento L y dos segmentos S, se liberaron 0,8 µg de ambos pol-I L y 0,8 µg de pol-I L.4 µg de pol-I L y 0,8 µg de pol-I S. En el caso del rescate de r3LCMV trisegmentado, compuesto por un segmento L y dos segmentos S, se incluyeron 0,8 µg de ambos segmentos S dirigidos por pol-I en la mezcla de transfección.72 horas después de la transfección se recogió el sobrenadante y se pasó a células BHK-21 para una mayor amplificación del virus. Los títulos virales en el sobrenadante se determinaron mediante el ensayo de formación de foco.
[0517] 5.1.4 Virus y cinética de crecimiento de los virus
[0518] El LCMV Cl13 de tipo silvestre, derivado originalmente del LCMV Armstrong de tipo silvestre, ha sido descrito previamente. Se produjeron stocks de virus de tipo silvestre y recombinante infectando células BHK-21 a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 y se recogió el sobrenadante 48 horas después de la infección. Las curvas de crecimiento de los virus se realizaron in vitro en un formato de 6 pocillos. Las células BHK-21 se sembraron a una densidad de 6×105 células/pocillo y se infectaron 24 horas después incubando las células junto con 500 µl del inóculo del virus a una moi de 0,01 durante 90 minutos en una placa oscilante a 37°C y 5% de CO2. Se añadió medio fresco y las células se incubaron a 37°C / 5% CO2 durante 72 a 96 horas. Se tomó sobrenadante en momentos determinados (normalmente 18, 24, 48, 72 horas) y se analizaron los títulos virales mediante el ensayo de formación de foco.
[0519] 5.1.5 Ensayo de formación de foco
[0520] [0313]A continuación, se determinan los títulos de LCMV mediante ensayo de formación de foco. El LCMV es un virus no citolítico que no lisan sus células huésped y como tal no crea placas. No obstante, en este trabajo las unidades se expresarán con el término más común de unidades formadoras de placa (PFU) en lugar del término correcto de unidades formadoras de foco (UFF). Se utilizaron células MC57 para el ensayo de formación de focos si no se indicaba lo contrario. Las células se sembraron a una densidad de 1,6x105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y se mezclaron con 200 µl de diluciones seriadas 10 veces del virus preparadas en MEM/ 2% FCS. Tras 2-4 horas de incubación a 37 °C, se añadieron 200 µl de un medio viscoso (metilcelulosa al 2 % en DMEM suplementado con 2x) por pocillo para garantizar la propagación de las partículas víricas únicamente a las células vecinas. Tras 48 horas a 37 °C, se eliminó el sobrenadante y se fijaron las células añadiendo 200 µl de paraformaldehído al 4 % (PFA) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente). Las células se permeabilizaron con 200 µl por pocillo de BSS/ 1 % Triton X-100 (Merck Millipore) durante 20 minutos y posteriormente se bloquearon durante 60 minutos con PBS/ 5 % FCS. Para la tinción anti-NP se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-LCMV-NP de rata como anticuerpo primario de tinción a una dilución de 1:30 en PBS/ 2,5% FCS durante 60 minutos. Para la tinción anti-GFP se utilizó un anticuerpo purificado anti-GFP de rata (BioLegend 338002) a una dilución de 1:2000 en PBS/2,5 % de FCS. Las placas se lavaron tres veces con agua del grifo y se añadió el anticuerpo secundario HRP-cabra-anti-IgG de rata a una dilución de 1:100 en PBS/2,5 % de FCS, incubándose durante 1 hora. La placa se lavó de nuevo tres veces con agua del grifo. Se añadió la reacción de color (0,5 g/l de DAB (Sigma D-5637), 0,5 g/l de sulfato de amonio y níquel en PBS/ 0,015 % de H2O2) y se detuvo la reacción al cabo de 10 minutos con agua del grifo. Los focos teñidos se contaron manualmente y se calculó el título final en función de la dilución.
[0521] Para la tinción anti-GP de las células, las placas se fijaron con MeOH al 50 %/ Acetona al 50 % durante 5 minutos y se lavaron con PBS. El bloqueo se realizó como se ha descrito. Como anticuerpo primario se diluyó anti-GP GP83.4 (producido a partir de hibridomas) 1:10 en PBS/ 2,5% FCS y se incubó durante 60 minutos. Después de tres lavados con agua del grifo, se añadió el anticuerpo secundario HRP-conejo-antimouse IgG a una dilución de 1:50 en PBS/ 2,5% FCS y se incubó durante 60 minutos. Después de otros tres lavados con agua del grifo, se añadió la reacción de color como se ha descrito anteriormente.
[0522] Para determinar la viremia de los ratones en sangre, se recogió una gota de sangre (correspondiente a un volumen de 50 µl) en 950 µl de BSS-heparina (Na-heparina, Braun, 1 IE/ml final), se mezcló por inversión y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
[0523] 5.1.6 Ratones
[0524] Los ratones AGRAG (IFNα/βR-/-, IFNγR-/-, RAG-/-) se han descrito previamente y se criaron y alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). Se criaron en el Institut für Labortierkunde de la Universidad de Zúrich (Suiza). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en las Universidades de Ginebra y Basilea de acuerdo con la ley suiza de protección de los animales y el permiso de las respectivas autoridades cantonales responsables de Ginebra y Basilea. La infección de los ratones se realizó por vía intravenosa a una dosis de 1×104 PFU por ratón.
[0525] 5.1.7 Preparación del RNA viral y secuenciación
[0526] El RNA viral se extrajo del sobrenadante del cultivo celular o del suero de ratones infectados utilizando el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de transcripción inversa se realizó con ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) y un cebador específico para LCMV NP (SEQ ID N.º: 15) siguiendo el protocolo del fabricante. La amplificación por PCR se realizó utilizando 2 µl del cDNA de la etapa RT y cebadores específicos de NP y GP (SEQ ID N.º: 16). La reacción de PCR se realizó utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad Phusion (NEB). Los productos amplificados se analizaron y extrajeron de un gel de agarosa al 2 %, se purificaron con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) y se enviaron para secuenciación Sanger del DNA (Microsynth) utilizando los cebadores específicos de NP y GP.
[0527] 5.1.8 Citometría de Flujo
[0528] La sangre se tiñó con anticuerpos contra CD11c (N418), CD11b (M1/70), CD19 (6D5), NK1.1 (PK136), CD90.2 (30-H12) y GR-1 (RB6-8C5). La expresión de moléculas de superficie teñidas con anticuerpos específicos, así como la expresión de GFP y RFP, se analizó en un citómetro de flujo BD LSR Fortessa utilizando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
[0529] 5.1.9 Análisis Estadístico
[0530] La significación estadística se determinó mediante la prueba t de dos colas no emparejadas o ANOVA de 1 vía seguida de la posprueba de Dunnett o Bonferroni para comparaciones múltiples utilizando el software Graphpad Prism (versión 6.0d). Los valores p de p > 0,5 se consideraron no significativos (ns), mientras que los valores p de p < 0,5 se consideraron significativos (*) con gradaciones de p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***) siendo altamente significativos.
[0531] 5.2 Resultados
[0532] 5.2.1 Los virus recombinantes trisegmentados crecen a títulos más bajos que el LCMV de tipo silvestre [0320]El genoma del LCMV de tipo silvestre consiste en dos segmentos de RNA monocatenario de polaridad negativa (un segmento L, un segmento S) (Fig 1A). En los últimos años se ha demostrado que es posible introducir genes extraños adicionales en el genoma normalmente bisegmentado que se encuentra en las partículas de LCMV. Los genes NP y GP se segregan en dos análogos del segmento S, y los genes de interés se insertan en cada segmento S resultante de LCMV, lo que da lugar a partículas virales competentes para la replicación con tres segmentos de RNA (dos S uno L). La única estrategia publicada actualmente mantiene tanto NP como GP en su posición natural en el segmento S, colocando así GFP u otros transgenes en los respectivos sitios libres (r3LCMV-GFP<nat>)
[0534] (Fig 1B). Este fue el enfoque intuitivo destinado a minimizar el riesgo probable de que la reorganización genética del segmento S anule la viabilidad del genoma resultante. Sin embargo, en este estudio se planteó la hipótesis de que también debería ser posible yuxtaponer la GP a la 3'UTR, expresándola a partir del elemento promotor que normalmente impulsa la PN (r3LCMV-GFP<art>; Fig. 1C). Los respectivos plásmidos de expresión se generaron mediante clonación de cDNA recombinante y las tres construcciones virales se rescataron íntegramente a partir de DNA plasmídico. Se realizaron curvas de crecimiento comparativas con los tres virus (Fig.1D). Los tres virus mostraron títulos máximos 48 horas después de la infección, con títulos máximos de los virus trisegmentados 10-100 veces inferiores a los del virus de tipo silvestre. El LCMV de tipo silvestre alcanzó 3,4×10<6>PFU/ml, el r3LCMV-GFP<nat>llegó a 2,7×10<4>PFU/ml y el r3LCMV-GFP<art>a 2,2×10<5>PFU/ml. Independientemente de sus títulos máximos igualmente reducidos, r3LCMV-GFP<nat>mostró una infectividad libre de células algo mayor durante los primeros puntos temporales que r3LCMV-GFP<art>.
[0536] 5.2.2 El empaquetamiento de partículas virales trisegmentadas es menos eficaz que el de virus bisegmentados
[0537] Estas observaciones sugerían que la adición de un segundo segmento S perjudicaba y retrasaba el crecimiento viral. Se planteó la hipótesis de que esta reducción de la aptitud viral podría deberse a un empaquetamiento ineficaz de los tres segmentos de RNA en partículas virales, y que se formaba un exceso de partículas bisegmentadas, que no lograban replicarse productivamente al infectar células frescas. Para estos experimentos se utilizaron r3LCMVs con dos genes informadores diferentes, es decir,GFP junto con GP en un segmento S, y NP junto a RFP en el segundo segmento S. Esto dio lugar a dos virus denominados r3LCMV-GFP/RFP<nat>y r3LCMV-GFP/RFP<art>, que diferían únicamente en la disposición de GFP y GP en el segmento S respectivo. Se infectaron células BHK-21 con r3LCMV-GFP-RFP<nat>o r2LCMV bisegmentado y se realizaron ensayos de formación de focos en células BHK-21 normales o, en paralelo, con células BHK-21 transfectadas de forma estable que expresaban GP (BHK-GP) o NP (BHK-NP) como sustrato celular para transcomplementar genomas virales carentes de los genes respectivos. Las células de tipo silvestre y las complementarias de GP se tiñeron para detectar focos virales que expresaban nucleoproteínas, mientras que las células complementarias de NP se tiñeron para detectar focos positivos de GP. De este modo, la formación de inmunofocos en células BHK-21 de tipo silvestre detectó únicamente viriones trisegmentados. Sin estar limitadas por la teoría, las células BHK-GP deberían replicar viriones trisegmentados, así como bisegmentados que contengan el segmento L en combinación con el segmento S que expresa NP (pero desprovistos del S que expresa GP). Por el contrario, las células BHK-NP deberían replicar LCMV trisegmentado y, además, viriones deficientes en NP consistentes en el segmento L y el segmento S que expresa GP (pero desprovistos del segmento S que expresa NP). Los títulos infecciosos, tanto de r3LCMV-GFP/RFP<nat>como de r3LCMV-GFP/RFP<art>, fueron sistemáticamente superiores cuando se evaluaron en células BHK-GP o BHK-NP que cuando la infectividad se probó en células wt BHK-21. Por el contrario, los títulos de r2LCMV fueron similares, independientemente del sustrato celular utilizado para evaluar su infectividad. Para corregir las posibles diferencias intrínsecas en la permisividad de cada línea celular al LCMV, cada título del virus en células BHK-21 se normalizó a uno, para su visualización, y los títulos de BHK-GP y BHK-NP se expresaron como múltiplos de los mismos. De este modo, se reflejan las diferencias de títulos relacionadas con los clones celulares en relación con las posibles diferencias intrínsecas de los clones en cuanto a la permisividad viral (Fig.2A). En cualquiera de las células complementarias, se observó una diferencia de títulos de aproximadamente cinco a diez veces para r3LCMV -GFP/RFP<nat>y r3LCMV-GFP/RFP<art>, que fue significativamente mayor que para r2LCMV. Esto sugería que la mayoría de las partículas víricas, que estaban formadas por los dos virus trisegmentados, contenían sólo uno de los dos segmentos S, codificando únicamente el segmento NP-(partículas sólo NP) o el segmento S que expresaba GP (partículas sólo GP), respectivamente. La diferencia de 5 veces o más en el título sugería que tanto las partículas de sólo NP como las de sólo GP superaban en número a las partículas trisegmentadas aproximadamente cinco veces cada una, y que las partículas trisegmentadas constituían menos del 10 por ciento de los viriones solamente, lo que era compatible con un retraso en el crecimiento y una reducción de los títulos virales máximos cuando se cultivaban en células no complementarias (Fig.1D). Estos resultados se validaron mediante citometría de flujo. Se infectaron células BHK-21 no complementarias o células BHK-NP con r3LCMV-GFP/RFP<art>o r2LCMV como control degatingy se evaluaron las intensidades de fluorescencia de GFP y RFP con un citómetro de flujo (Fig. 2B). Dado que las células BHK-21 de tipo silvestre no proporcionan los factores transactores mínimos, sólo los viriones que contienen al menos un segmento L junto con el segmento S que expresa NP pueden iniciar un ciclo infeccioso tras la entrada en la célula, dando lugar a la señal de fluorescencia (RFP). En consecuencia, se observó una población de células RFP+GFP- tras la infección de células BHK-21, lo que refleja partículas sólo NP. Las células doblemente positivas RFP+GFP+ evidenciaban la existencia de partículas trisegmentadas de buena fe. De acuerdo con elgatingtambién se observaron células RFP-GFP+, aunque tenían una MFI de RFP mayor que las células RFP-GFP-, lo que sugiere que representaban fases tempranas de la infección por partículas trisegmentadas, interpretación que también se ve apoyada por la continuidad de esta población y la RFP+GFP+ doblemente positiva. Sin embargo, al cultivar r3LCMV-GFP/RFP<art>trisegmentado en células BHK-NP, sustituyendo así este factor transactante mínimo, observamos un número más de 10 veces superior de células RFP-GFP+ en comparación con la infección de células BHK-21 no complementarias. Por el contrario, se detectaron células doblemente positivas RFP+GFP-(evidencia de partículas sólo NP) y GFP+RFP+ (partículas trisegmentadas) en abundancia comparable (Fig. 2C). Estos resultados confirmaron a nivel unicelular los hallazgos obtenidos mediante el ensayo de formación de focos, corroborando así que las preparaciones de virus trisegmentados contienen una mayoría de partículas bisegmentadas deficientes en replicación. Estos resultados ofrecían una explicación probable del crecimiento atenuado de r3LCMV-GFP/RFP<nat>y r3LCMV-GFP/RFP<art>, proporcionando una visión de un empaquetamiento aleatorio aparentemente bastante ineficiente de virus trisegmentados.
[0538] 5.2.3 Clonación y rescate de virus recombinantes para seguir la recombinación in vivo
[0540] Dado que los virus trisegmentados muestran una cinética de crecimiento deteriorada como se ve en la Fig 1, se planteó la hipótesis de que debería haber una alta presión de selección en los virus para recombinar su información genética para NP y GP en un solo segmento S. Se postula que la recombinación intersegmentaria de los arenavirus condujo a la evolución filogenética del clado norteamericano, por lo que parecía un mecanismo potencial por el que los virus trisegmentados podrían restablecer un genoma bisegmentado funcional. Sin estar limitados por la teoría, observando la organización genómica de los dos virus trisegmentados se postuló que la presión de selección sobre r3LCMV-GFP<nat>podría favorecer los eventos de recombinación en la zona del IGR, para reunir GP y NP en el mismo segmento, al tiempo que se deshacía de GFP. En la población de r3LCMV-GFP<art>la presión de selección debería ser igualmente alta, sin embargo, la reorganización de GP y su posicionamiento junto a la 3'UTR debería hacer muy difícil, si no imposible, que este virus combine sus dos segmentos S en un segmento funcional (ver Fig. 7 más abajo). Teniendo en cuenta las advertencias para la identificación de la recombinación de RNA y para discriminarla firmemente de una posible contaminación por cDNA, clonamos un segmento S portador de GFP junto con un ORF de GP recombinante en el que los 255 nucleótidos terminales estaban optimizados para el codón. La GP resultante tenía una secuencia de nucleótidos diferente pero un producto de traducción idéntico al de la GP de la cepa WE de tipo silvestre (WE/WET-GP, Fig.3A). Sin embargo, este ORF recombinante de WE/WET GP no existía como virus bisegmentado infeccioso ni el laboratorio poseía una construcción de cDNA en la que estuviera asociado con NP. Por lo tanto, cualquier posible virus bisegmentado que contuviera WE/WET en el mismo segmento que NP se consideró una prueba clara de recombinación intersegmentaria, diferenciando dichos virus de cDNA o RNA potencialmente contaminantes en los ensayos respectivos. Para comprobar si la GP quimérica tenía un efecto sobre la aptitud viral, se realizaron curvas de crecimiento en cultivo celular del virus recombinante trisegmentado portador de la GP de fusión WE/WET (r3LCMV-WEWET/GFP<nat>) en comparación con un virus trisegmentado portador de la GP WE de tipo silvestre (r3LCMV-WE/GFP<nat>) (Fig. 3B). La cinética de crecimiento y los títulos máximos de los dos virus fueron comparables (r3LCMV-WE/GFP<nat>: 1,7×10<6>PFU/ml, r3LCMV-WEWET/GFP<nat>: 2,3×10<6>PFU/ml). Así pues, la glicoproteína quimérica WEWET no tuvo un impacto detectable en el crecimiento viral.
[0542] Para probar si podrían ocurrir eventos potenciales de recombinación entre los genes NP y GP del segmento S que involucrarían al IGR. De ahí que se introdujera una deleción de un solo nucleótido en la región intergénica del segmento S que codifica el PN, para que sirviera de marca genética. La elección de esta deleción de nucleótidos se debió a que está situada en un tramo que, a diferencia de la mayor parte del segmento S IGR, no se conserva entre cepas, ni en secuencia ni en longitud. En caso de un evento de recombinación, esta región intergénica "marcada" (marcada con * en todas partes, tanto en las figuras como en el texto) debería permitir la identificación del origen genético de las secuencias IGR del segmento S. La posición de la citosina eliminada (marcada con una flecha) y un esquema del segmento S portador de NP resultante se representan en la Figura 3C. Para comprobar si la deleción introducida en el IGR tenía un impacto en el crecimiento viral, se rescató el r3LCMV-GFP<nat>recombinante con o sin la deleción de un solo nucleótido. Los experimentos de curva de crecimiento se realizaron en células BHK-21 (moi= 0,01). Un virus trisegmentado con un IGR de tipo silvestre (r3LCMV-GFP<nat>) y su comparador con el IGR mutado (r3LCMV-GFP<nat>IGR*) crecieron a un ritmo similar y alcanzaron títulos máximos indistinguibles (Figura 3D). Por consiguiente, la etiqueta del IGR en el segmento S portador de la NP no tuvo un impacto detectable en la aptitud viral, validando así su uso para posteriores experimentosin vivo.
[0544] 5.2.4 La infección persistente de r3LCMV-GFPnat pero no r3LCMV-GFPart en ratones alcanza niveles de viremia equivalentes a los del virus wt bisegmentado y provoca la pérdida de expresión de GFP
[0546] [0325]Una vez rescatado el virus recombinante r3LCMV-GFP<nat>, el objetivo fue investigar si los virus trisegmentados se recombinabanin vivo.Para ello, se infectaron ratones AGRAG con r3LCMV-GFP<nat>, r3LCMV-GFP<art>o un r2LCMV bisegmentado como control. Los ratones AGRAG portan deleciones dirigidas en los genes que codifican para el receptor de Interferón-α/β, el receptor de Interferón-γ y RAG1, lo que conduce a un fenotipo inmunodeficiente y al establecimiento de viremia crónica tras la infección con LCMV trisegmentado. Se tomaron muestras de sangre a lo largo del tiempo y se evaluaron los títulos virales mediante el ensayo de formación de focos (Fig.4A). Los portadores de LCMV bisegmentado mostraron un alto título de viremia en el intervalo de 5×10<5>PFU/ml de sangre en los 5 días posteriores a la infección, con una viremia subsecuentemente estable en el intervalo de 10<4>- 10<5>PFU/ml hasta al menos el día 50 post-infección. Los ratones infectados con LCMV trisegmentado mostraron cargas virales de aproximadamente 5×10<3>PFU/ml de sangre hasta el día 20, en consonancia con el crecimiento atenuado en cultivo celular (en comparación con la Fig.1D). A partir del día 30, los portadores de r3LCMV-GFP<nat>mostraron un aumento de la carga viral, que no se observó en los animales infectados con r3LCMV-GFP<art>, lo que dio lugar a una diferencia de más de 10 veces en la viremia en el día 50. Para determinar si la población de virus dominante aún portaba el gen informador GFP, dando lugar así a la expresión de GFP en las células infectadas, se realizaron ensayos de formación de focos virales con muestras de sangre de portadores de r3LCMV-GFP<nat>y r3LCMV-GFP<art>tomadas el día 127 tras la infección y se tiñeron para la nucleoproteína o el gen informador GFP (Fig. 4B). Mientras que la tinción de sangre aislada de portadores de r3LCMV-GFP<art>dio lugar a cantidades iguales de focos con detección de anticuerpos anti-NP y anti-GFP (ambas evaluaciones indicaban independientemente títulos virales en el intervalo de 10<3>PFU/ml), se evidenció un número al menos 100 veces mayor de focos totales (NP+) de r3LCMV-GFP<nat>que de focos que expresaban GFP. Se midieron títulos virales de al menos 10<4>PFU/ml basados en la detección anti-NP, mientras que dos de cada tres ratones no mostraron ninguna infectividad GFP-positiva detectable y un ratón tenía una fracción residual de focos GFP-positivos en el intervalo de 100 PFU/ml, correspondiente al límite inferior de detección de nuestros ensayos. La expresión de GFP de las células infectadas también se evaluó mediante microscopía de fluorescencia (datos no mostrados). Los focos fluorescentes de GFP eran prácticamente indetectables cuando se analizaba sangre de portadores de r3LCMV-GFP<nat>, mientras que el recuento manual de focos positivos para GFP en sangre de portadores de r3LCMV -GFP<art>coincidía con los resultados obtenidos con el ensayo de formación de focos anti-NP. La expresión del gen informador se verificó mediante citometría de flujo de las PBMC de los ratones infectados el día 120 después de la infección. Encontramos que más del 10% de los monocitos/macrófagos CD11b+GR1- eran positivos para GFP en animales infectados con r3LCMV-GFP<art>mientras que la sangre de r3LCMV-GFP<nat>evidenciaba sólo niveles de fondo de GFP, lo que era comparable a los animales infectados con r2LCMV no fluorescente (Fig.4C-E). Este hallazgo corroboró la hipótesis de que los virus trisegmentados con el GP en su posición natural pierden la expresión del gen informador con el tiempo, mientras que la transposición del GP en la yuxtaposición 3'UTR artificial evitó la pérdida del transgén.
[0548] 5.2.5 Los virus trisegmentados con GP en posición natural pueden recombinar sus dos segmentos S dando lugar a un único segmento S con duplicaciones parciales o completas de IGR flanqueando un rudimento de secuencia transgénica.
[0550] La Figura 4 mostró viremia elevada y pérdida de expresión del gen reportero en ratones infectados con r3LCMV-GFP<nat>. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que un evento de recombinación podría explicar este resultado experimental. La recombinación intersegmental debería combinar GP y NP en el mismo segmento S, obviando la necesidad de un segundo segmento S en el ciclo de replicación viral. Tal evento podría haber explicado la viremia a nivel del virus de tipo silvestre, en combinación con la pérdida de expresión del gen informador. Para probar esta posibilidad, se aisló el RNA viral del suero de ratones infectados y se utilizó un par de cebadores que se unen a las secuencias NP y GP, respectivamente, para amplificar selectivamente por RT-PCR sólo las moléculas de RNA supuestamente recombinadas, que llevan los ORF NP y GP en orientación ambisentido en un segmento de RNA. Los fragmentos de PCR resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel (Fig.5A). Los sueros de todos los portadores de r3LCMV-GFP<nat>dieron lugar a productos de PCR dependientes de RT, mientras que los portadores de r3LCMV-GFP<art>y los controles naïve no mostraron bandas específicas. Las reacciones de PCR de control se realizaron con muestras de RNA tratadas con TR simulada para descartar contaminaciones de cDNA como fuente de producto de PCR. Los resultados de la secuenciación de tres portadores individuales de r3LCMV-GFP<nat>se representan esquemáticamente en la Fig. 5C. Los tres ratones contenían segmentos de RNA vírico de secuencias distintas pero con un patrón similar: Las porciones de terminal C de GP y NP se encontraron en orientación ambisentido en un segmento de RNA. Entre ellas, ambas regiones intergénicas,es decir, la del segmento que expresa NP y la del segmento original que expresa GP se conservaron al menos parcialmente, separadas por un fragmento de uno o ambos genes informadores de GFP en los segmentos S parentales del virus trisegmentado. La dirección y longitud del fragmento de GFP variaba entre las tres especies de RNA recuperadas de ratones individuales, lo que era indicativo de eventos de recombinación independientes. En apoyo de esta noción, se recuperó exactamente la misma secuencia de RNA recombinado a partir de dos muestras consecutivas tomadas del mismo ratón con más de tres semanas de intervalo entre muestreos. Basándonos en las secuencias recombinadas del segmento S obtenidas, propusimos un mecanismo molecular, como se esboza esquemáticamente en la Fig. 7 y se describe en la leyenda de la figura, por el que r3LCMV-GFP<nat>recombina sus dos segmentos S, lo que resulta en la pérdida del transgén y la reversión fenotípica al virus de tipo silvestre. Los esquemas de la Fig. 7 también explican por qué, según el mecanismo propuesto de recombinación del segmento S, r3LCMV-GFP<art>no puede recombinarse y reunir sus ORFs NP y GP en un segmento S funcional.
[0552] 5.2.6 El r2LCMV recombinante con dos IGR en el segmento S es viable y crece a títulos similares a los del LCMV bisegmentado con un solo IGR en el segmento S.
[0554] Los datos de secuenciación anteriores revelaron un patrón consistente de elementos genéticos virales en segmentos S recombinados entre los cuales la duplicación (al menos parcial) del IGR era particularmente notable y característica. Sin embargo, no se conocían arenavirus con repeticiones de regiones intergénicas en un segmento S. Sin embargo, en el arenavirus Mopeia del Viejo Mundo se encuentra de forma natural un bucle de tallo doble. Por lo tanto, clonamos el segmento S reordenado del portador r3LCMV-GFP<nat>#3 con los dos IGR y el remanente de GFP en un plásmido de expresión del segmento S dirigido por pol-I y rescatamos el virus respectivo. Se comparó la cinética de crecimiento de este virus (r2LCMV_2IGR) en células BHK-21 con el r3LCMV-GFP<nat>trisegmentado y el r2LCMV bisegmentado (Fig.6). Los títulos infecciosos libres de células de r2LCMV_2IGRs superaron a los de r3LCMV-GFP<nat>ya en los primeros puntos temporales y alcanzaron títulos máximos idénticos a los de r2LCMV (1,<7×107>PFU/ml frente a 1,7×107 PFU/ml).1,6×10<7>PFU/ml, respectivamente). Es importante destacar que r2LCMV_2IGRs creció hasta alcanzar títulos máximos considerablemente más altos que su parental trisegmentado r3LCMV-GFP<nat>, lo que demuestra la ventaja selectiva de la recombinación intersegmentaria a pesar de la duplicación del IGR durante este proceso.
[0556] 5.2.7 El r3LCMV recombinante que expresa ovoalbúmina (OVA) induce una respuesta de células T CD8+ específica de OVA rápida, fuerte y polifuncional.
[0558] [0328]Para probar la utilidad de la tecnología de entrega del vector r3LCMV<art>para propósitos de vacunación, generamos el vector vacunal r3LCMV-OVA<art>con una organización del genoma análoga al r3LCMV-GFP<art>(Fig. 1C) pero con dos genes de ovoalbúmina (OVA) en lugar de los respectivos genes GFP en este último virus. Inmunizamos ratones C57BL/6 por vía intramuscular (i.m.) con 10<4>PFU de r3LCMV-OVA<art>y ocho días después analizamos la respuesta de las células T en el bazo. Para compararlo con una plataforma de vectores ampliamente utilizada, inmunizamos a un segundo grupo de ratones C57BL/6 con 10<8>partículas de un vector basado en adenovirus 5 con deficiencia de replicación y supresión de E1 que también expresaba OVA (rAd5-OVA). La frecuencia de células T CD8+ específicas de OVA que reconocen el epítopo inmunodominante SIINFEKL derivado de OVA estaba en el intervalo del 10% de las células T CD8+ en el grupo de la vacuna r3LCMV-OVA<art>, que era significativamente mayor que en el grupo rAd5-OVA (Fig.8A). Las respuestas de células T CD8+ inducidas por r3LCMV-OVA<art>no sólo fueron de gran magnitud, sino también altamente funcionales, tal y como determinaron los ensayos de citocinas intracelulares, revelando que la mayoría de las células T CD8+ inducidas por r3LCMV-OVA<art>reactivas a SIINFEKL produjeron IFN-y en respuesta a la estimulación peptídica, y que una buena proporción coprodujo TNF-α y/o IL-2. Esto demostró la utilidad de la tecnología del vector r3LCMV-OVA<art>para la administración de vacunas.
[0559] 5.2.8 El LCMV trisegmentado induce células T CD8+ de memoria polifuncionales.
[0560] Para responder a la pregunta de si los vectores r3LCMV inducen una memoria funcional de células T CD8+, inmunizamos ratones C57BL/6 con 10e5 PFU de r3LCMV-OVA<art>i.v. y analizamos las respuestas de células T CD8+ específicas de OVA (específicas de SIINFEKL) en el bazo el día 25. Un grupo de ratones de control de referencia fue vacunado con 10e8 partículas virales (vp) de vector adenoviral recombinante (rAd) con supresión de E1 que expresaba OVA por la misma vía. Las células T CD8+ específicas de OVA que producían IFN-y, TNF-α y/o IL-2 tras la estimulación con péptidos se evaluaron en ensayos intracelulares estándar de citocinas tras la estimulación con el péptido SIINFEKL. Se determinó la frecuencia (Figura 9A) y el número absoluto (Figura 9B) de células productoras de citocinas, tal como se indica en el gráfico. Los ratones inmunes a r3LCMV-OVA<art>mostraron frecuencias y números significativamente mayores de células T CD8+ polifuncionales IFN-γ / TNF-α e IFN-γ / TNF-α / IL-2 coproductoras de OVA-específicas que los ratones inmunes a rAd-OVA.
[0561] 5.2.9 El LCMV codificante de antígenos induce respuestas específicas de células T a antígenos propios y extraños.
[0562] Para investigar si los vectores<r3LCMVart>pueden explotarse para inducir respuestas de células T CD8+ contra antígenos propios expresados por tumores, inmunizamos ratones BALB/c con vectores<r3LCMVart>que expresaban epítopos de células T CD8+ derivados de Her2 de rata (TYVPANASL), humanos (TYLPTNASL) o de ratón (TYLPANASL) (Figura 10). Nueve días después, medimos las células T CD8+ específicas que producían IFN-y, TNF-α y/o IL-2 tras la estimulación con los péptidos respectivos en ensayos de citocinas intracelulares. La Figura 10 muestra las frecuencias de células T CD8+ específicas del epítopo como el porcentaje de células T CD8+ que producen la combinación de citoquinas indicada tras la estimulación con el péptido afín. Las frecuencias de células T CD8+ productoras de citocinas tras la reestimulación sólo con medio fueron insignificantes. Los resultados documentan que los vectores r3LCMV<art>tienen la capacidad de inducir frecuencias sustanciales de respuestas de células T CD8+ reactivas al autoantígeno tumoral.
[0563] 5.2.10 El interferón-α es inducido por el r3LCMVart pero no en la infección con vectores recombinantes de virus Adeno o Vaccinia.
[0564] Los interferones de tipo I pueden tener múltiples efectos inmunoestimuladores y antitumorales. Por lo tanto, la inducción de interferón de tipo I puede representar una característica favorable de una vacuna vectorizada viralmente. Realizamos mediciones ELISA para determinar las concentraciones de interferón-alfa en el suero de ratones inmunizados con r3LCMV-OVA<art>, rAd-OVA o virus vaccinia recombinante que expresaba OVA (rVacc) 24, 48 o 72 horas antes (Figura 11). r3LCMV<art>pero ni rAd ni rVacc indujeron una respuesta sistémica de interferón-alfa detectable y sostenida (al menos 48 horas). Esto demostró la capacidad de los vectores r3LCMV<art>para inducir fuertes respuestas inmunitarias innatas.
[0565] 5.2.11 Crecimiento en cultivo celular de r3JUNV-GFPart en comparación con r3JUNV-GFPnat y la cepa parental Junin Candid#1.
[0566] Por analogía con los vectores r3LCMV-GFP<nat>y r3LCMV-GFP<art>, que llevan un genoma como el descrito en la Fig 1B, diseñamos r3JUNV-GFP<nat>y r3JUNV-GFP<art>, que consisten en vectores trisegmentados basados en la cepa vacunal Junin Candid#1 que llevan genes GFP en cada uno de sus dos segmentos S respectivos (r3JUNV-GFP<nat>y r3JUNV-GFP<art>). Comprobamos sus propiedades de crecimiento en células 293T, que infectamos a una multiplicidad de infección de 0,01 y recogimos sobrenadante a lo largo del tiempo (Fig.12). Encontramos que r3JUNV-GFP<art>crecía más lentamente que su parental bisegmentado Junin vacuna cepa Candid#1 (Fig.12). Sin embargo, creció más rápidamente que r3JUNV-GFP<nat>, (Fig. 12). Este comportamiento de crecimiento diferencial de los vectores trisegmentados basados en el virus Junin fue paralelo a las tasas de crecimiento de los vectores r3LCMV-GFP<nat>y r3LCMV-GF<part>(Fig.1D).
[0567] 5.2.12 Los JUNV trisegmentados se atenúan drásticamente in vivo, y r3JUNV-GFPnat pero no r3JUNV-GFparte pierde la expresión de GFP tras un in vivo prolongada.
[0568] [0333]Para investigar la estabilidad genética de r3JUNV-GFP<nat>y r3JUNV-GFP<art>infectamos ratones AGRAG (IFNα/βR-/-, IFNγR-/-, RAG-/-) con 7x10e4 PFU de cualquiera de estos vectores que expresan GFP. A efectos comparativos, un tercer grupo se infectó con el virus Candid#1 bisegmentado de tipo silvestre. Este último virus se detectó fácilmente en la sangre de todos los ratones infectados el día 20 después de la infección (Figura 13A), mientras que los virus trisegmentados permanecieron indetectables durante al menos 40 días. Este hallazgo documentó la atenuación del crecimientoin vivocomo resultado de la reorganización del genoma, extendiendo nuestros hallazgos con los vectores r3LCMV-GFP de la Fig. 4A a los vectores basados en Junin. Después del día 40, también r3JUNV-GFP<nat>y r3JUNV-GFP<art>se volvieron detectables en varios animales de cada grupo (Figura 13A). Sin embargo, es importante destacar que algunos de los ratones infectados con r3JUNV-GFP<nat>alcanzaron cargas virales en el intervalo de los ratones infectados con Candid#1 de tipo silvestre, mientras que los ratones infectados con r3JUNV-GFP<art>virémicos conservaron una carga viral inferior a la de los controles infectados con Candid#1.
[0569] Para determinar si la población de virus dominante en estos animales virémicos todavía portaba el gen reportero GFP, resultando así en la expresión de GFP en células infectadas, realizamos ensayos de formación de focos virales con muestras de sangre de portadores de r3JUNV-GFP<nat>y r3JUNV-GF<part>tomadas el día 120 después de la infección. Se compararon los títulos infecciosos de los virus que conservaban la expresión GFP (anti-GFP, Fig.13B) y la infectividad total del virus Junin (anti-NP, Fig.13B). Los títulos r3JUNV-GFP<art>estaban en intervalos similares cuando se determinaron mediante el ensayo inmunofocal anti-GFP o anti-NP, documentando que la mayoría de la población de virus conservaba la expresión GFP. Por el contrario, en la sangre de los cuatro animales infectados por r3JUNV-GFP<nat>con mayor viremia (comparable a la de Candid#1 de tipo silvestre) el título infeccioso anti-GFP era al menos 10 veces inferior al título infeccioso total determinado por tinción NP. Esto documentó que r3JUNV-GFP<art>pero no r3JUNV-GFP<nat>retenía de forma estable el transgén GFPin vivo.
[0570] 5.2.13 Las combinaciones de sensibilización y refuerzo homólogas y heterólogas de vectores vacunales trisegmentados basados en LCMV y JUNV inducen fuertes respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígeno P1A.
[0571] A continuación investigamos si los vectores basados en r3LCMV<art>y r3JUNV<art>pueden utilizarse en combinaciones de sensibilización y refuerzo homólogas y heterólogas para inducir respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígenos tumorales. Construimos vectores basados en r3LCMV<art>y r3JUNV<art>que expresan el antígeno propio P1A derivado del mastocitoma de ratón P815 (SEQ ID N.º: 24) (r3LCMV-P1A<art>(SEQ ID N.º: 18, 19, 20) and r3JUNV-P1A<art>(SEQ ID N.º: 21, 22, 23)). Estos constructos de vacuna se utilizaron para inmunizar ratones BALB/c por vía i.v. en combinaciones homólogas y heterólogas de sensibilización y refuerzo, como se indica en la figura 14. Tanto r3LCMV-P1A<art>como r3JUNV-P1A<art>indujeron linfocitos T CD8+ específicos del epítopo P1A cuando se administraron en una vacunación de sensibilización y refuerzo homóloga, según se determinó a partir de sangre utilizando tetrámeros H-2L<d>cargados con el péptido LPYLGWLVF (epítopo P1A 35-43). Las frecuencias medias de células T CD8+ específicas del epítopo en el día 63 del experimento fueron del 1,2% ((r3JUNV-P1A<art>) y del 3.9% (r3LCMV-P1A<art>), respectivamente. Además, los animales sensibilizados con r3JUNV-P1A<art>y reforzados con r3LCMV-P1A<art>de forma heteróloga generaron respuestas aún mayores, con frecuencias medias de células T CD8+ específicas del epítopo del 19,5% en el día 63. Las frecuencias de los animales sensibilizados con r3LCMV-P1A<art>y reforzados con r3JUNV-P1a<art>(3,1%) eran comparables a las de los animales vacunados con el cebador homólogo r3LCMV-P1A<art>.
[0572] 7. LISTADO DE SECUENCIAS
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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES
1.Un segmento genómico de arenavirus, en el que el segmento genómico está diseñado para portar un marco de lectura abierto ("ORF") viral en una posición distinta de la posición de tipo silvestre del ORF, en el que el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:
(i) un segmento S, en el que el ORF que codifica la nucleoproteína ("NP") está bajo el control de una región no traducida 5' ("UTR") de arenavirus;
(ii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína de matriz Z ("proteína Z") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(iii) un segmento S, en el que el ORF que codifica la RNA polimerasa L dependiente de RNA ("proteína L") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus;
(iv) un segmento S, en el que el ORF que codifica la glicoproteína viral ("GP") está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus;
(v) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vi) un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus; (vii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (viii) un segmento L, en el que el ORF que codifica el PN está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (ix) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus; (x) un segmento L, en el que el ORF que codifica la GP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus;
(xi) un segmento L, en el que el ORF que codifica el NP está bajo el control de una UTR 3' de arenavirus; y (xii) un segmento L, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
2.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la nucleoproteína ("NP") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus.
3.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína de matriz Z ("proteína Z") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus.
4.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la RNA polimerasa L dependiente de RNA ("proteína L") está bajo el control de una UTR 5' de arenavirus.
5.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la glicoproteína viral ("GP") está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
6.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
7.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 1, en el que el segmento genómico de arenavirus es un segmento S, en el que el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de un UTR 3' de arenavirus.
8.El segmento genómico de arenavirus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un ORF heterólogo, en el que el ORF heterólogo codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno.
9.El segmento genómico del arenavirus de la reivindicación 8, en el que el antígeno se selecciona entre antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos del virus varizella zoster, antígenos del citomegalovirus, antígenos de la micobacteria tuberculosis y antígenos asociados a tumores.
10.El segmento genómico de arenavirus de la reivindicación 8, en el que el ORF heterólogo codifica un antígeno viral seleccionado entre adenoviridae (p. ej., mastadenovirus y aviadenovirus), herpesviridae (p. ej., herpes simplex virus 8, herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2, herpes simplex virus 5, virus de Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus), leviviridae (p. ej., levivirus, enterobacteria fase MS2, allolevirus), poxyiridae (p. ej., chordopoxyirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus y entomopoxyirinae), papovaviridae (p. ej., poliomavirus y papilomavirus), paramyxoviridae (p. ej., paramyxovirus, virus de la parainfluenza 6, mobillivirus (p. ej., virus del sarampión), rubulavirus (p. ej., virus de las paperas), pneumonovirinae (p. ej., pneumovirus, virus respiratorio sincitial humano), virus respiratorio sincitial humano y metapneumovirus (p. ej., pneumovirus aviar y metapneumovirus humano), picornaviridae (p. ej., enterovirus, rinovirus, hepatovirus (p. ej., el virus de la hepatitis A humana), cardiovirus y aptovirus), reoviridae (p. ej., ortoreovirus, orbivirus, rotavirus, cipovirus, fijivirus, fitoreovirus y oryzavirus), retroviridae (p. ej., retrovirus de mamíferos de tipo B, retrovirus de mamíferos de tipo C, retrovirus aviares de tipo C, grupo de retrovirus de tipo D, retrovirus BLV-HTLV, lentivirus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) 1 y HIV-1 (p. ej., gp160 del HIV), spumavirus), flaviviridae (p. ej., virus de la hepatitis C, virus del dengue, virus del Nilo
Occidental), hepDNAaviridae (p. ej., virus de la hepatitis B), togaviridae (p. ej., alfavirus (p. ej., virus sindbis) y rubivirus (p. ej., virus de la rubéola)), rhabdoviridae (p. ej., vesiculovirus, lyssavirus, ephemerovirus, cytorhabdovirus y necleorhabdovirus), arenaviridae (p. ej., arenavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Ippy y virus lassa) y coronaviridae (p. ej., coronavirus y torovirus).
11.El segmento genómico de arenavirus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el segmento genómico de arenavirus se deriva del virus de la coriomeningitis linfocítica ("LCMV").
12.Un cDNA del segmento genómico de arenavirus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13.Un vector de expresión de DNA que comprende el cDNA de la reivindicación 12.
14.Una célula huésped que comprende el vector de expresión de DNA de la reivindicación 13.
15.Una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende el segmento genómico de arenavirus de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que la partícula de arenavirus es infecciosa y competente para la replicación.
16.La partícula de arenavirus de la reivindicación 15, en la que la partícula de arenavirus está atenuada.
17.Una vacuna que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 15 o 16, y un portador farmacéuticamente aceptable.
18.Una composición farmacéutica que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 15 o 16, y un portador farmacéuticamente aceptable.
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