ES3029079T3

ES3029079T3 - Method of quantitative determination of a therapeutical tnf-alpha inhibitor

Info

Publication number: ES3029079T3
Application number: ES19702002T
Authority: ES
Inventors: Harald Althaus; Thorsten Keller
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2025-06-23
Anticipated expiration: 2039-01-14
Also published as: CN111630384A; WO2019141614A1; EP3698137B1; US11953503B2; EP3698137C0; US20200400681A1; EP3514541A1; EP3698137A1

Abstract

La invención se enmarca en el campo del diagnóstico in vitro y se refiere a un método para determinar cuantitativamente inhibidores terapéuticos del TNF-alfa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Procedimiento para la determinación cuantitativa de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF

La invención está en el ámbito del diagnóstico in vitro y se refiere a un procedimiento para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF.

Los inhibidores de la proteína (alfa-TNF, TNF-a, cachectina) del factor alfa de necrosis de tumor son usados como medicamentos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, como por ejemplo Morbus Crohn, Morbus Bechterew, psoriasis y en particular artritis reumatoide. Los inhibidores de alfa-TNF son proteínas que se unen a alfa-TNF, como por ejemplo anticuerpos anti-alfa-TNF o fragmentos de ellos o proteínas de fusión fabricadas por tecnología genética, que comprenden el dominio extracelular de unión al alfa-TNF del receptor de TNF humano. Todos los inhibidores de alfa-TNF con eficacia terapéutica se unen a proteína de alfa-TNF y causan una inactivación de la proteína de alfa-TNF, impidiendo la unión de proteína de alfa-TNF a los receptores de TNF.

Para la terapia de enfermedades inflamatorias crónicas están aprobados diversos inhibidores de alfa-TNF, como por ejemplo Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol o Golimumab y diversos biosimilares (productos biofarmacéuticos de imitación).

Es un problema que no todos los pacientes responden de igual manera a los inhibidores de alfa-TNF. Se sabe que la concentración en suero o en plasma de inhibidores de alfa-TNF tiene una correlación clara con los síntomas clínicos de los pacientes tratados. La eficacia de un inhibidor de terapia de alfa-TNF tiene correlación por regla general con la cantidad de anticuerpos terapéuticos, que es detectable justo antes de la siguiente administración del medicamento en el suero o el plasma del paciente, el denominado nivel valle.

Las diferencias individuales en la farmacocinética, la ocurrencia de anticuerpos contra el inhibidor terapéutico de alfa-TNF (denominados ADAs, anticuerpos antifármaco) pueden influir en el nivel valle y con ello en la eficacia de un inhibidor de terapia de alfa-TNF. La ausencia de un éxito en la terapia puede tener diferentes causas, como por ejemplo la subdosificación o la presencia de anticuerpos antifármaco.

Por consiguiente, para poder diseñar de manera óptima un inhibidor de terapia de alfa-TNF, por ejemplo mediante un cambio de la dosificación o mediante un desplazamiento hacia otra preparación, es necesario determinar la concentración en suero o en plasma del inhibidor terapéutico de alfa-TNF en un paciente tratado.

Se conocen diferentes procedimientos para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF en muestras de pacientes. Por un lado, se conocen pruebas ELISA comerciales para la determinación de inhibidores de alfa-TNF específicos, en los cuales anticuerpos monoclonales con especificidad para el respectivo inhibidor de alfa-TNF son fijados en una placa de microtítulo (prueba IDKmonitor® para Adalimumab, Infliximab y Etanercept, Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemania, y de acuerdo con el documento WO-A1-2009/032128 A1 una prueba para Adalimumab) o en los cuales se fija proteína de alfa-TNF directa o indirectamente sobre una placa de microtítulo (prueba IDKmonitor® para Golimumab, Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemania y pruebas Level Adalimumab y Level Infliximab de Sanquin, Amsterdam, Países Bajos). Finckh, A, et al. (Joint Bone Spine 77 (2010) 313-318) divulgan una prueba ELISA para la determinación de Infliximab, en la cual sobre la placa de microtítulo se fija la proteína de alfa-TNF con ayuda de un anticuerpo anti-alfa-TNF.

A partir de los documentos WO-A1-2016/110595 y WO-A1-2018/007327 se conocen procedimientos turbidimétricos reforzados con partícula, para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF en muestras de pacientes, en los cuales se mezclan con la muestra partículas de poliestireno que están recubiertas de alfa-TNF, y se mide la aglutinación en la mezcla de reacción. Es ventajoso que se trata de un arreglo universal de prueba, con el cual es detectable cada inhibidor terapéutico de alfa-TNF. Para una cuantificación precisa de un inhibidor específico de alfa-TNFs es necesaria solamente una curva de calibración creada con el mismo inhibidor específico de alfa-TNF. Sin embargo, es una desventaja que adicionalmente es necesario el uso de un ligando no específico que se entrecruza con el inhibidor de alfa-TNF, del grupo de anticuerpos anti-Ig (por ejemplo anticuerpos específicos de Fc o Fab), proteína G, proteína A, proteína H, proteína L y proteína de fusión de proteína A/G, para alcanzar una sensibilidad suficiente de la prueba, con lo cual con detectables todos los inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, en particular también Etanercept (Markenname Enbrel, Pfizer).

El objetivo subyacente de la presente invención consistió por consiguiente en suministrar un procedimiento universal para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF en muestras de pacientes, que fuese suficientemente sensible para poder detectar todos los inhibidores terapéuticos de alfa-TNF.

En referencia a los procedimientos conocidos reforzados con partículas, el objetivo subyacente de la presente invención consistió en particular en suministrar un procedimiento universal reforzado con partículas, para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF en muestras de pacientes, que fuese suficientemente sensible para poder detectar todos los inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, sin que fuese necesario el uso de un ligando no específico que se entrecruza con el inhibidor de alfa-TNF.

Se encontró que mediante una puesta en contacto de la muestra con proteína de alfa-TNF libre, aislada, y la subsiguiente adición de un asociado de unión de alfa-TNF, se logra un procedimiento suficientemente sensible para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, con el cual son detectables todos los inhibidores terapéuticos de alfa-TNF. El inhibidor terapéutico de alfa-TNF presente en la muestra se une a la proteína de alfa-TNF añadida e impide con ello la unión del asociado de unión de alfa-TNF añadido a continuación. Cuanto más de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF esté presente en una muestra, tanto más fuertemente inhibe la formación de un complejo de proteína de alfa-TNF y el asociado de unión de alfa-TNF añadido. Por consiguiente, se trata esencialmente de un procedimiento competitivo de prueba.

Respecto a los procedimientos reforzados con partícula, se encontró en particular que mediante una puesta en contacto de la muestra con proteína de alfa-TNF libre, aislada, y la subsiguiente adición de una fase sólida en partículas, que está recubierta con un asociado de unión de alfa-TNF, se logra un procedimiento suficientemente sensible para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, con el cual son detectables todos los inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, sin que sea necesario el uso de un ligando no específico que se entrecruza con el inhibidor de alfa-TNF. El inhibidor terapéutico de alfa-TNF presente en la muestra se une a la proteína de alfa-TNF añadida e impide con ello la unión del asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida añadido. Cuanto más de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF esté presente en una muestra, tanto más fuertemente inhibe la reacción de aglutinación.

Por consiguiente, es objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación cuantitativa de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF en una muestra, como se describe en las reivindicaciones 1 a 6. El procedimiento comprende, entre otros, los siguientes pasos:

a) suministrar una mezcla de reacción mediante la puesta en contacto de la muestra

i. con proteína de alfa-TNF libre, aislada y a continuación

ii. con un primer asociado de unión de alfa-TNF;

b) determinar la cantidad de un complejo que surge en la mezcla de reacción, de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF; y a continuación

c) determinar la cantidad del inhibidor terapéutico de alfa-TNF en la muestra, mediante comparación de la cantidad así determinada del complejo de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF en la mezcla de reacción, con cantidades de un complejo de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF en mezclas de reacción que contienen muestras con concentraciones conocidas de un asociado de unión de alfa-TNF.

La muestra puede ser una muestra de líquido corporal, preferiblemente una muestra de líquido corporal humano, como por ejemplo sangre completa, plasma, suero u orina. Usualmente, la muestra de líquido corporal proviene de un paciente, al que se administró un inhibidor terapéutico de alfa-TNF.

El procedimiento es adecuado para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF, que se unen a proteína de alfa-TNF, como por ejemplo anticuerpos anti-alfa-TNF o fragmentos de ellos, o proteínas de fusión producidas por tecnología genética, que comprenden el dominio extracelular de unión de alfa-TNF del receptor de TNF humano. Todos los inhibidores de alfa-TNF terapéuticamente eficaces se unen a proteína de alfa-TNF y causan una inactivación de la proteína de alfa-TNF, con lo cual impiden la unión de proteína de alfa-TNF a los receptores de TNF. El procedimiento es adecuado en particular para la determinación cuantitativa de inhibidores terapéuticos de alfa-TNF del grupo de Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol y Golimumab así como sus biosimilares.

La proteína de alfa-TNF libre, aislada puede ser proteína de alfa-TNF recombinante o producida sintéticamente o una proteína nativa de alfa-TNF, es decir, puede provenir de fuentes naturales, por ejemplo proteína de alfa-TNF purificada de sangre humana. Para la producción de proteína de alfa-TNF recombinante son adecuados sistemas de expresión de procariotas o eucariotas, como por ejemplo la expresión en bacterias (por ejemplo E. coli), en levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), en cultivos celulares vegetales, animales o humanos (por ejemplo células HEK). Para la producción de proteína de alfa-TNF sintética son adecuadas técnicas conocidas para la síntesis in vitro de proteína, como por ejemplo síntesis en fase sólida (por ejemplo síntesis de Merrifield).

La proteína de alfa-TNF es preferiblemente proteína de alfa-TNF humana. El término "proteína de alfa-TNF" comprende no sólo la proteína de alfa-TNF completa, en los también fragmentos de la proteína de alfa-TNF completa, a los cuales pueden unirse inhibidores terapéuticos de alfa-TNF. El término "proteína de alfa-TNF" comprende además no sólo la proteína de alfa-TNF silvestre típica o fragmentos de ella, sino también proteínas de alfa-TNF con una o más sustituciones de aminoácido, a las cuales pueden unirse inhibidores terapéuticos de alfa-TNF. La proteína de alfa-TNF, o un fragmento de proteína de alfa-TNF, puede estar fusionada al extremo N con una secuencia heteróloga de señal, es decir, con un polipéptido que usualmente no está presente en la proteína de alfa-TNF humana, pero que en el sistema elegido de expresión influye positivamente en la expresión y/o secreción de la proteína de alfa-TNF expresada de modo recombinante. Además, la proteína de alfa-TNF o un fragmento de proteína de alfa-TNF puede estar fusionada en el extremo C con una o varias balizas de afinidad, que hacen posible la unión de la proteína expresada, por ejemplo, de modo recombinante en un vehículo de afinidad, mediante lo cual se hace posible por ejemplo la purificación de proteína de alfa-TNF expresada de modo recombinante. Se prefieren balizas de afinidad pequeñas con una longitud no mayor a 12 aminoácidos. Son particularmente preferidas las balizas de afinidad del grupo baliza de His, baliza de Flag, baliza de Arg, baliza de c-Myc y baliza de Strep. Los soportes de afinidad adecuados, que se unen con mayor afinidad a una baliza de afinidad, son por ejemplo anticuerpos específicos, cationes inmovilizados (por ejemplo Ni2+ con afinidad por baliza His) u otros tipos de asociados de unión (por ejemplo estreptavidina con afinidad por baliza Strep). El término "proteína de alfa-TNF libre, aislada" denomina una proteína de alfa-TNF no unida, no conjugada, que no está asociada por ejemplo con un asociado de unión ni con una fase sólida, ni con una etiqueta detectable, ni con un componente de un sistema formador de señal.

Una vez la muestra ha sido mezclada o puesta en contacto con proteína de alfa-TNF libre, aislada, se incuba la mezcla de reacción preferiblemente en primera instancia por un periodo de tiempo de 1 segundo a 10 minutos, de modo particular preferiblemente hasta un periodo de tiempo de 5 segundos a 5 minutos, justo antes de añadir el primer asociado de unión de alfa-TNF. De manera preferida, se incuba la mezcla de reacción a una temperatura de aproximadamente 37 °C. Esto asegura que toda molécula de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF presente en la muestra se une a la proteína de alfa-TNF libre añadida, y con ello eleva la precisión de la determinación cuantitativa.

El primer asociado de unión de alfa-TNF está asociado con una fase sólida en partículas, y se mide la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción, para determinar la cantidad de complejo de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF, que surge en la mezcla de reacción.

En el sentido de esta invención, bajo el término "fase sólida en partículas" en entienden partículas no celulares que exhiben un diámetro aproximado de al menos 20 nm y no más de 20 |jm, usualmente entre 200 nm y 350 nm, preferiblemente entre 250 y 320 nm, de modo particular preferiblemente entre 270 y 290 nm, de modo muy particular preferiblemente 280 nm. Las micropartículas pueden tener forma regular o irregular. Pueden representar esferas, esferoides, esferas con cavidades o poros más o menos grandes. Las micropartículas pueden consistir en material orgánico, inorgánico o en una mezcla o una combinación de ambos. Pueden consistir en un material poroso o no poroso, con capacidad o no para hincharse. En principio, las micropartículas pueden tener cualquier densidad, sin embargo se prefieren partículas con una densidad que está cerca a la densidad del agua, como por ejemplo aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,5 g/ml. Las micropartículas preferidas pueden ser suspendidas en soluciones acuosas y tener una estabilidad en suspensión tan larga como sea posible. Pueden ser transparentes, parcialmente transparentes u opacas. Las micropartículas pueden consistir en varias capas, como por ejemplo la denominada partícula "núcleo-y-concha" con un núcleo y una o varias capas de envoltura. El término micropartículas comprende por ejemplo cristales de colorante, soles metálicos, partículas de sílice, partículas de vidrio y partículas magnéticas. Las micropartículas preferidas pueden ser suspendidas en soluciones acuosas y pueden ser partículas consistentes en material polimérico insoluble en agua, en particular en polietilenos sustituidos. De modo muy particular de prefieren partículas de látex, por ejemplo, de poliestireno, polímeros de ácido acrílico, polímeros de ácido metacrílico, polímeros de acrilonitrilo, acrilonitriloButadieno-estireno, polivinilacetato-acrilato, polivinilpiridina, cloruro de vinilo-acrilato. Son de particular interés las partículas de látex con grupos reactivos en su superficie, como por ejemplo grupos carboxilo, amino o aldehído, permiten una unión covalente de un asociado de unión de anti-alfa-TNF, a la partícula de látex. Las células humanas, animales, vegetales o fúngicas o bacterias no están comprendidas explícitamente, en el sentido de esta invención, dentro del término "fase sólida en partículas".

El término "asociado" se entiende de manera amplia y comprende, por ejemplo, un enlace covalente y uno no covalente, una unión directa y una indirecta, la adsorción a una superficie y la inclusión en una depresión o un espacio vacío, etc. Mediante un enlace covalente, los anticuerpos están unidos mediante una unión química a la fase sólida o a un componente de un sistema que entrega una señal. Son ejemplos de un enlace no covalente, la adsorción superficial, la inclusión en espacios vacíos o la unión de dos asociados específicos de unión. Aparte de una unión directa a la fase sólida o al componente de un sistema que entrega una señal, los anticuerpos también pueden estar unidos indirectamente, mediante interacción específica con otros asociados específicos de unión, a la fase sólida o a la etiqueta. Esto debería ser ilustrado en detalle mediante ejemplos: el anticuerpo biotinilado puede estar unido a la etiqueta mediante avidina unida a la etiqueta, o un conjugado de anticuerpo-fluoresceina puede estar unido a la fase sólida mediante anticuerpo anti-fluoresceina unido a la fase sólida, o el anticuerpo puede estar unido a la fase sólida o a la etiqueta mediante proteínas que se enlazan con inmunglobulina.

El asociado de unión de alfa-TNF, con el cual está recubierta la fase sólida en partículas, puede ser un anticuerpo anti-alfa-TNF, un aptámero de péptido o de ácido nucleico o afímero de péptido.

El anticuerpo anti-alfa-TNF, con el cual está recubierta la fase sólida en partículas, es una inmunoglobulina por ejemplo una inmunoglobulina de la clase o subclase IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM. El anticuerpo exhibe por lo menos un sitio de unión (denominado frecuentemente parátopo) para un epítopo (denominado frecuentemente también determinante de antígeno) en la proteína de alfa-TNF. un epítopo tal se caracteriza por ejemplo por su estructura espacial y/o por la presencia de grupos polares y/o apolares. El sitio de unión del anticuerpo es complementario al epítopo. La reacción antígeno-anticuerpo funciona de acuerdo con el denominado "principio de llave-cerradura" y por regla general tiene un elevado grado de especificidad, es decir, el anticuerpo es capaz de diferenciar pequeñas desviaciones en la estructura primaria, en la carga, en la configuración espacial y el arreglo estérico de la proteína de alfa-TNF.

En el sentido de esta invención, bajo el término "anticuerpo" se entienden no sólo los anticuerpos completos, sino expresamente también fragmentos de anticuerpo, como por ejemplo Fab, Fv, F(ab')2, Fab'; así como también anticuerpos quiméricos, humanizados, bi- u oligoespecíficos, o "de cadena única"; además también agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas y/o sus fragmentos, en tanto se preserven las propiedades de unión a la proteína de alfa-TNF. Los fragmentos de anticuerpo se producen por ejemplo mediante escisión enzimática de los anticuerpos, con enzimas como pepsina o papaina. Los agregados, polímeros y conjugados de anticuerpo pueden ser generados mediante múltiples procedimientos, por ejemplo mediante tratamiento con calor, reacción con sustancias como glutaraldehído, reacción con moléculas que se unen a inmunoglobulina, biotinilación de anticuerpos y subsiguiente reacción con estreptavidina o avidina, etc.

En el sentido de esta invención, un anticuerpo anti-alfa-TNF puede ser un anticuerpo monoclonal o uno policlonal. El anticuerpo puede haber sido producido de acuerdo con procedimientos usuales, por ejemplo mediante inmunización de un animal, como por ejemplo ratón, rata, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, oveja, cabra, pollo, etc. con proteína de alfa-TNF y subsiguiente obtención del antisuero; o mediante el establecimiento de células de hibridoma y la subsiguiente purificación del anticuerpo secretado; o mediante clonación y expresión de la secuencia de nucleótidos o versiones modificadas de ella, que codifican la secuencia de aminoácidos, que son responsables de la unión del anticuerpo natural a la proteína de alfa-TNF.

Si en la muestra está presente un inhibidor terapéutico de alfa-TNF, éste se une en la mezcla de reacción a la proteína de alfa-TNF libre añadida, e impide con ello la unión del asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida añadido a continuación, por consiguiente impide la formación de un complejo de proteína de alfa-TNF y asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida. Sólo la proteína de alfa-TNF libre no enlazada es ahora unida al asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida y provoca una aglutinación de la fase sólida en partículas, en la mezcla de reacción. Cuanto más de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF esté presente en una muestra, tanto más fuertemente inhibe la formación de un complejo de proteína de alfa-TNF y asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida, por consiguiente la reacción de aglutinación.

La medición de la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción puede ocurrir por vía fotométrica, por ejemplo turbidimétrica o nefelométrica. Las pruebas de unión que descansan en el principio de la dispersión de la luz reforzada por partículas son conocidas desde aproximadamente 1920 (para una vista general, véase Newman, D.J. et al., Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 1992; 29: 22-42). En este contexto, de manera preferida se usan partículas de poliestireno con un diámetro de 0.1 a 0.5 |jm, de modo particular preferiblemente con un diámetro de 0,15 a 0,35 |jm. Preferiblemente se usan partículas de poliestireno con funciones amino, carboxilo o aldehído. Además, preferiblemente se usan partículas de concha/núcleo. La síntesis de las partículas y el acoplamiento covalente de ligandos es descrita por ejemplo en Peula, J.M. et al., Covalent coupling of antibodies to aldehyde groups on polimer carriers. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1995; 6: 779-785.

Alternativamente, la medición de la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción puede ocurrir mediante la medición de una señal, que es generada por un sistema formador de señal, cuando un primer y un segundo componentes del sistema formador de señal son llevados a cercanía espacial mutua. En este contexto, una primera fracción de la fase sólida en partículas se asocia con un primer componente de un sistema formador de señal, y una segunda fracción de la fase sólida en partículas se asocia con un segundo componente del sistema formador de señal, en donde el primero y el segundo componentes del sistema formador de señal colaboran de modo que surge una señal detectable, cuando el primero y el segundo componentes del sistema formador de señal son llevados a cercanía espacial mutua, y la aglutinación de la fase sólida en partículas es medida en la mezcla de reacción mediante la señal surgida.

En esta forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, el sistema de formación de señal comprende por lo menos un primer y un segundo componentes, que colaboran de modo que surge una señal detectable, cuando son llevados a cercanía espacial mutua y pueden mediante ello entrar en colaboración. Se entiende por una colaboración entre los componentes, en particular la transferencia de energía - por consiguiente la transmisión directa de energía entre los componentes, por ejemplo mediante radiación de luz o de electrones así como mediante moléculas químicas reactivas, como por ejemplo singlete transitorio de oxígeno. La transferencia de energía puede ocurrir de uno a otro componente, pero también es posible una cascada de diferentes sustancias mediante la cual opera la transferencia de energía. Por ejemplo, los componentes pueden ser un par de un donador de energía y un captor de energía, como por ejemplo fotosensibilizador y agente que emite quimioluminiscencia (documento EP-A2-0515194, LOCI® Technologie) o fotosensibilizador y Fluorophor (documento WO 95/06877) o yodo <125> radioactivo y Fluorophor (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672 - 8676) o Fluorophor y extintor de fluorescencia (documento US 3,996,345). De modo particular preferiblemente, el primer componente del sistema formador de señal es un agente que emite quimioluminiscencia, y el segundo componente del sistema formador de señal es un fotosensibilizador o a la inversa, y se mide la quimioluminiscencia en la mezcla de reacción.

Una vez se ha medido la aglutinación en la mezcla de reacción (por ejemplo mediante determinación del cambio máximo de absorción de la mezcla de reacción), se compara la aglutinación así medida con la aglutinación en mezclas de reacción que contienen muestras con concentraciones conocidas de un asociado de unión de alfa-TNF. Para ello, se miden con anterioridad usualmente muestras con diferentes concentraciones conocidas de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF, de un anticuerpo anti-alfa-TNF, de un aptámero de péptido o de ácido nucleico específico para alfa-TNF o de un afímero de péptido específico para alfa-TNF (denominados calibradores) con el mismo procedimiento en mezclas de reacción, y se prepara una curva de calibración, en la cual puede leerse entonces la concentración de la muestra investigada o puede determinarse después de un paso de conversión.

Las pruebas descritas anteriormente de aglutinación a base de partículas son los denominados procedimientos homogéneos, que se distinguen porque para la verificación cuantitativa del complejo surgido en la mezcla de reacción, de proteína de alfa-TNF y asociado de unión de alfa-TNF acoplado a fase sólida, no es necesaria ninguna separación de la proteína de alfa-TNF no unida o asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida no unido. La cantidad del complejo surgido en la mezcla de reacción de proteína de alfa-TNF y asociado de unión de alfa-TNF acoplado a la fase sólida, es medida en la mezcla de reacción después de o incluso durante la reacción de unión, sin un paso adicional de separación o lavado, para separar el asociado de unión no unido.

El componente de un sistema formador de señal puede ser una etiqueta, que en sí misma genera una señal detectable, de modo que no son necesarios otros componentes. Muchas moléculas orgánicas absorben luz ultravioleta y visible, en donde por la absorción de luz éstas moléculas pueden llegar a un estado excitado por la energía transmitida, y emiten la energía absorbida en forma de luz de otra longitud de onda, diferente de la de la luz irradiada. Otras etiquetas pueden generar directamente una señal detectable, como por ejemplo isótopos radioactivos o colorantes.

El componente de un sistema formador de señal puede ser sin embargo también una etiqueta que es necesaria para la generación de la señal de otros componentes, como por ejemplo sustratos, coenzimas, extintores, aceleradores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos de enzimas, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, iones, etc. con etiquetas adecuadas por ejemplo enzimas incluyendo peroxidasa de Meerrettich, fosfatasa alcalina, deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, alcoholdeshidrogenasa, glucosaoxidasa, p-galactosidasa, luciferasa, ureasa y acetilcolinesterasa; colorantes; sustancias fluorescentes incluyendo isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, bromuro de etidio, cloruro de 1-sulfonil 5-dimetilaminonaftaleno y quelatos fluorescentes de tierras raras; sustancias quimioluminiscentes incluyendo luminol, isoluminol, compuestos de acridinio, olefina, enoléteres, enamina, arilviniléteres, dioxeno, arilimidazol, lucigenina, luciferina y aequorina; sustancias sensibilizantes incluyendo eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, porfirina, ftalocianina, clorofila, Rosa de bengala, coenzimas; sustratos de enzima; isótopos radioactivos incluyendo 125I, 131I, 14C, 3H, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 59Fe, 57Co y 75Se; partículas incluyendo partículas magnéticas o partículas, preferiblemente partículas de látex, que en sí mismas pueden ser marcadas por ejemplo con colorantes, sensibilizantes, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, isótopos u otras etiquetas detectables; partículas de soles, incluyendo soles de oro o de plata, etc.

El segundo asociado de unión de alfa-TNF puede ser, como ya se describió en detalle anteriormente para el primer asociado de unión de alfa-TNF, un anticuerpo anti-alfa-TNF, un aptámero de péptido o de ácido nucleico o un afímero de péptido. El primer y segundo asociados de unión de alfa-TNF pueden ser el mismo asociado de unión, por ejemplo el mismo anticuerpo anti-alfa-TNF monoclonal, o pueden ser diferentes asociados de unión, por ejemplo un anticuerpo anti-alfa-TNF monoclonal y un aptámero de péptido o dos anticuerpos antialfa-TNF monoclonales, que se unen a diferentes epítopos de la proteína de alfa-TNF.

Se encontró que el procedimiento de acuerdo con la invención permite el uso de un único calibrador universal, para la determinación de un inhibidor terapéutico cualquiera de alfa-TNF. El calibrador universal puede contener un único inhibidor terapéutico de alfa-TNF, preferiblemente del grupo de Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol y Golimumab y sus biosimilares, o una mezcla de por lo menos dos inhibidores terapéuticos de alfa-TNF diferentes o sus biosimilares o un anticuerpo anti-alfa-TNF o un aptámero de péptido o de ácido nucleico específico para alfa-TNF o un afímero de péptido específico para alfa-TNF. Tiene como ventaja que puede usarse un único kit de prueba y el calibrador único para la determinación de un inhibidor terapéutico cualquiera de alfa-TNF y puede renunciarse al uso de kits de prueba o calibradores específicos para el inhibidor. Se entiende por un "calibrador universal" también un conjunto de materiales de calibrador, que se diferencia solamente respecto a la concentración del/de los inhibidor o inhibidores terapéuticos de alfa-TNF o del anticuerpo anti-alfa-TNF o del aptámero de péptido o de ácido nucleico específico para alfa-TNF o del afímero de péptidos específico para alfa-TNF, allí presentes. Incluso, cada combinación de inhibidor terapéutico de alfa-TNF y calibrador que va a ser determinada no muestra la misma reactividad, aunque mediante el uso de funciones lineales de conversión o de funciones polinómicas de conversión (2° o 3er grados), pueden compensarse las diferentes reactividades de los inhibidores de alfa-TNF y así calcular las concentraciones correctas.

Otro objeto de la presente invención es el uso de un kit de prueba en un procedimiento para la determinación cuantitativa de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF, en una muestra de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6. El kit de prueba contiene por lo menos los siguientes componentes:

a) un primer recipiente que contiene un reactivo, conteniendo el reactivo 50 |jg - 2 mg/L de proteína de alfa-TNF libre, aislada; y

b) un segundo recipiente que contiene un primer asociado de unión de alfa-TNF, el cual está asociado con una fase sólida en partículas.

El reactivo en el primer recipiente contiene una proteína de alfa-TNF libre, aislada, de la técnica, como ya se describió anteriormente, de modo particular preferiblemente una proteína recombinante de alfa-TNF. El reactivo contiene la proteína de alfa-TNF en una concentración final de 50 jg - 2 mg/L, de modo preferible de 50 jg - 1 mg/L, de modo muy particular preferiblemente de 100 jg - 0.5 mg/L. El reactivo puede estar presente en forma líquida en el recipiente. Alternativamente, el reactivo puede presente también como liofilizado con el propósito de la estabilidad en el largo plazo, el cual es suspendido de nuevo con un volumen adecuado de solvente justo antes del uso, de modo que se alcanza la concentración final deseada.

Para el caso en que uno o todos los reactivos del kit de prueba estén presentes como liofilizado, el kit de prueba puede contener adicionalmente el solvente necesario para la disolución del liofilizado, como por ejemplo agua destilada o amortiguadores adecuados.

El segundo recipiente del kit de prueba, que contiene un primer asociado de unión de alfa-TNF, contiene una fase sólida en partículas, preferiblemente partículas de látex, a las cuales se asocia el primer asociado de unión de alfa-TNF. El reactivo puede ser una suspensión líquida o un liofilizado de la misma, que puede ser suspendido de nuevo. Un kit de prueba tal es adecuado para la medición de la aglutinación, mediante procedimientos fotométricos.

Otra forma de realización del kit de pruebas contiene, aparte del primer recipiente y el segundo recipiente, además un tercer recipiente que contiene un segundo asociado de unión de alfa-TNF. Este tercer recipiente del kit de prueba contiene así mismo una fase sólida en partículas, que está recubierta con el segundo asociado de unión de alfa-TNF, preferiblemente con un anticuerpo anti-alfa-TNF. La fase sólida en partículas del reactivo en el segundo recipiente está asociada, en este contexto, con un primer componente de un sistema formador de señal, y la fase sólida en partículas del reactivo en el tercer recipiente está asociada con un segundo componente del sistema formador de señal, en donde el primero y el segundo componentes del sistema formador de señal cooperan de modo que surge una señal detectable, cuando el primer y el segundo componentes del sistema formador de señal son colocados en cercanía espacial mutua. Preferiblemente, el primer componente del sistema formador de señal es un agente quimioluminiscente, y el segundo componente del sistema formador de señal es un fotosensibilizador, o a la inversa. Un kit de prueba tal es adecuado para la medición de la aglutinación, mediante medición de la quimioluminiscencia.

Un primer o segundo anticuerpo anti-alfa-TNF, con el cual se recubre la fase sólida en el reactivo en el segundo y/o tercer recipientes, es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Los siguientes ejemplos sirven para la ilustración de la presente invención, y no deben ser entendidos como una limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Prueba de aglutinación homogénea para la determinación cuantitativa de diferentes inhibidores terapéuticos de alfa-TNF

Reactivo 1:

Se disolvieron 500 jg de proteína de alfa-TNF humana, recombinante, liofilizada (Active Bioscience GmbH, Hamburgo, Alemania) en 500 jL de agua y se almacenaron a 2-8 °C (solución madre de alfa-TNF de 1 mg/mL). Para la preparación del reactivo 1 se diluyó la solución madre de alfa-TNF a una concentración final de 250 jg /L de proteína de alfa-TNF, en un plasma de citrato humano libre de lipoproteina.

Reactivo 2: Para la preparación del reactivo 2 se mezclaron aproximadamente 1,5 mg del anticuerpo monoclonal anti-alfa-TNF MAK 1D4 con 1 mL de partículas de poliestireno-látex (40 mg/mL, diámetro de partícula 0.2-0.3 |jm) en una solución de amortiguador, y se incubaron. Después de varios lavados de las partículas, se suspendieron de nuevo las partículas a continuación en 60 mL de una solución de amortiguador. El anticuerpo anti-alfa-TNF MAK 1D4 monoclonal fue preparado mediante inmunización de un ratón con proteína de alfa-TNF humana y subsiguiente establecimiento de célula de hibridoma.

Para preparación de muestras que contienen un inhibidor terapéutico de alfa-TNF, se añadieron diferentes cantidades de

• Adalimumab (Humira®, Abbvie Inc., EE.UU.),

• Infliximab (Remicade®, MSD SHARP & DOHME GmbH, Alemania),

• Etanercept (Enbrel®, Pfizer Inc., EE.UU.),

• Certolizumab pegol (Cimzia®, UCB Pharma GmbH, Alemania) o

• Golimumab (Simponi®, Janssen Biologics B.V., Países Bajos)

a muestras de suero humanas de donantes normales (concentración final en la muestra 0.8-25 mg/L).

Para la preparación de calibradores se añadieron

• 100 mg/L Adalimumab (Humira®), o

• 100 mg/L Infliximab (Remicade®)

a un conjunto de suero humano normal. Mediante dilución con suero normal o una solución de amortiguador, se generaron calibradores con bajas concentraciones de inhibidor.

Las muestras de suero o las muestras de calibrador fueron diluidas 1:5 o 1:20 con una solución de amortiguador. Se mezclaron 50 jL de muestra de suero o muestra de calibrador con 10 jL de reactivo 1 y se incubó durante un minuto a 37 °C. A continuación se añadieron a la mezcla 35 jL de reactivo 2, y en un intervalo de tiempo de 6 minutos a una longitud de onda de 840 nm en un aparato de análisis nefelométrico (BN II System, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Alemania) se midió la luz, que es dispersada en los complejos antígeno-anticuerpo. Como resultado de medición se determina el cambio en la señal de medición (en Bit) después de 6 minutos.

Ejemplo la: Determinación de Adalimumab con ayuda de una curva de calibración de AdalimumabCon el procedimiento de acuerdo con la invención, se midieron seis calibradores de suero con diferentes concentraciones de Adalimumab, y se preparó una curva de calibración.

Además, con el procedimiento de acuerdo con la invención se midieron 14 muestras de suero con diferentes concentraciones de Adalimumab. En la curva de calibración preparada anteriormente se leyeron las concentraciones de Adalimumab relacionadas con los resultados de medición.

La Tabla 1 presenta para cada muestra, la concentración esperada (concentración teórica) de Adalimumab de acuerdo con la dosificación de Adalimumab, y la concentración determinada (concentración medida) con el procedimiento de acuerdo con la invención, en una medición doble. Se muestra que las concentraciones teóricas de Adalimumab, en el intervalo de concentración de 0.8 - 3 mg/L, son recuperadas con una desviación máxima de 0.44 mg/L, y en el intervalo de concentración de 3 - 25 mg/L son recuperadas con una desviación máxima de 27.5 %. Esto permite una cuantificación precisa de Adalimumab para la vigilancia de la terapia.

Tabla 1

Ejemplo 1b: Determinación de Infliximab con ayuda de una curva de calibración de InfliximabCon el procedimiento de acuerdo con la invención, se midieron seis calibradores de suero con diferentes concentraciones de Infliximab, y se preparó una curva de calibración.

Además, con el procedimiento de acuerdo con la invención se midieron 14 muestras de suero con diferentes concentraciones de Infliximab. En la curva de calibración preparada anteriormente se leyeron las concentraciones de Infliximab relacionadas con los resultados de medición.

La Tabla 2 presenta para cada muestra, la concentración esperada (concentración teórica) de Infliximab de acuerdo con la dosificación de Infliximab, y la concentración determinada (concentración medida) con el procedimiento de acuerdo con la invención, en una medición doble. Se muestra que las concentraciones teóricas de Infliximab, en el intervalo de concentración de 0.8 - 5 mg/L, son recuperadas con una desviación máxima de 0.47 mg/L, y en el intervalo de concentración de 5 - 25 mg/L son recuperadas con una desviación máxima de 24.5 %. Esto permite una cuantificación precisa de Infliximab para la vigilancia de la terapia.

Tabla 2

Ejemplo 1c: Determinación de diferentes inhibidores terapéuticos de alfa-TNF con ayuda de una curva de calibración de Adalimumab

Con el procedimiento de acuerdo con la invención, se midieron seis calibradores de suero con diferentes concentraciones de Adalimumab, y se preparó una curva de calibración.

Además, con el procedimiento de acuerdo con la invención se midieron en cada caso 12 a 14 muestras de suero con diferentes concentraciones de Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Certolizumab pegol o Golimumab. En la curva de calibración preparada anteriormente se leyeron las concentraciones de Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Certolizumab pegol o Golimumab, relacionadas con los resultados de medición.

Las Tablas 3 a 7 presentan para cada muestra, la concentración esperada (concentración teórica) del respectivo inhibidor de acuerdo con la dosificación, y la concentración determinada (concentración medida) con el procedimiento de acuerdo con la invención, en una medición doble. Se muestra que, también sin cálculo de corrección, las concentraciones teóricas de Adalumimab e Infliximab en el intervalo de concentración de 0.8 -3 mg/L son recuperadas con una desviación máxima de 0.44 mg/L y en el intervalo de concentración de 3 - 25 mg/L son recuperadas con una desviación máxima de 42.3 % (Infliximab).

Se encontró que - cuando se realiza una gráfica de la concentración medida contra la concentración teórica -pueden calcularse funciones (lineales o polinómicas) que permiten corregir los valores medidos, en particular para Etanercept, Certolizumab pegol y Golimumab.

Mediante el uso de una función lineal o una función polinómica (2° o 3er grados) se recuperan las concentraciones teóricas de Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Certolizumab pegol y Golimumab, con desviaciones aceptables. Se muestra que las concentraciones teóricas son recuperadas en el intervalo de concentración de 10 - 25 mg/L con una desviación máxima de 11.2 % (Golimumab). En el intervalo de concentración de 2 - 10 mg/L, las desviaciones absolutas son de máximo 0.61 mg/L (Etanercept y Infliximab).

Para Etanercept es posible una conversión mediante el polinomio, sólo en el intervalo de concentración de 2 -25 mg/L.

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

Tabla 7

El procedimiento descrito en el presente documento permite la determinación automática de las concentraciones de diferentes inhibidores de alfa-TNF, en un único ensayo homogéneo.

Mediante el uso de una función lineal o una función polinómica (2° o 3er grados) para la conversión de los resultados obtenidos, la exactitud de la recuperación de cada inhibidor individual de alfa-TNF es suficiente para el seguimiento de la terapia y el control de la terapia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento competitivo para la determinación cuantitativa de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF en una muestra, comprendiendo el procedimiento los pasos:

1. con proteína de alfa-TNF libre, aislada y a continuación

ii. con una fase sólida en partículas, que está asociada con un primer asociado de unión de alfa-TNF;

b) medir la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción, para determinar la cantidad de un complejo que surge en la mezcla de reacción, de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF; y

c) determinar la cantidad del inhibidor terapéutico de alfa-TNF en la muestra, mediante comparación de la cantidad así determinada del complejo de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF en la mezcla de reacción, con cantidades de un complejo de proteína de alfa-TNF y el primer asociado de unión de alfa-TNF en mezclas de reacción, que contienen muestras con concentraciones conocidas de un asociado de unión de alfa-TNF.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se mide fotométricamente la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde una primera fracción de la fase sólida en partículas está asociada con un primer componente de un sistema formador de señal, y una segunda fracción de la fase sólida en partículas está asociada con un segundo componente del sistema formador de señal, y en donde el primer y segundo componentes del sistema formador de señal cooperan de modo que surge una señal detectable, cuando se llevan a cercanía espacial el primer y el segundo componentes del sistema formador de señal, y mediante la señal surgida se mide la aglutinación de la fase sólida en partículas en la mezcla de reacción.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el primer componente del sistema formador de señal es un agente quimioluminiscente y el segundo componente del sistema formador de señal es un fotosensibilizador o a la inversa, y en donde la quimioluminiscencia es medida en la mezcla de reacción.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde después de la puesta en contacto de la muestra con proteína de alfa-TNF libre, aislada, y antes de la adición del primer asociado de unión de alfa-TNF, la mezcla de reacción es incubada durante un período de 1 segundo a 10 minutos.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el primer y/o el segundo asociados de unión de alfa-TNF es un anticuerpo anti-alfa-TNF.

7. Uso de un kit de prueba en un procedimiento competitivo, para la determinación cuantitativa de un inhibidor terapéutico de alfa-TNF en una muestra, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6, en donde el kit de prueba tiene los siguientes componentes:

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la fase sólida en partículas es de partículas de látex.

9. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 y 8, en donde el kit de prueba contiene además el siguiente componente:

c) un tercer recipiente que contiene una fase sólida en partículas, que está recubierta con el primer o con un segundo asociado de unión de alfa-TNF,

en donde la fase sólida en partículas en el segundo recipiente está asociada con un primer componente de un sistema formador de señal y la fase sólida en partículas en el tercer recipiente está asociada con un segundo componente del sistema formador de señal, y en donde el primer y el segundo componentes del sistema formador de señal cooperan de modo que surge una señal detectable, cuando el primer y el segundo componentes del sistema formador de señal son llevados a cercanía espacial mutua.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el primer componente del sistema formador de señal es un agente quimioluminiscente y el segundo componente del sistema formador de señal es un fotosensibilizador, o a la inversa.

11. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la proteína de alfa-TNF presente en el primer reactivo es proteína de alfa-TNF recombinante.

12. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el primer asociado de unión de alfa-TNF en el segundo recipiente es un anticuerpo anti-alfa-TNF, preferiblemente un anticuerpo anti-alfa-TNF monoclonal.