ES3025684T3

ES3025684T3 - Production of a low-alcohol fruit beverage

Info

Publication number: ES3025684T3
Application number: ES15700747T
Authority: ES
Inventors: Sofie Saerens; Nathalia Edwards; Kim Ib Soerensen; Mansour Badaki; Jan Hendrik Swiegers
Original assignee: Chr Hansen AS
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2025-06-09
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: US10647951B2; CN105960450A; AU2018229546A1; WO2015110484A9; AU2015208198A1; AU2015208198B2; EP3097177C0; WO2015110484A2; WO2015110484A3; US20160376537A1; CL2016001830A1; EP3097177B1; AU2018229546B2; EP3097177A2; NZ721368A; ZA201604172B

Abstract

La presente invención se refiere a la producción de bebidas de frutas fermentadas, como vino y sidra, con un contenido reducido de alcohol. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende la inoculación inversa o coinoculación de una cepa de bacteria láctica homofermentativa o heterofermentativa facultativa y una cepa de levadura. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de una bebida de fruta con bajo contenido de alcohol

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de bebidas de fruta fermentada, tal como vino y sidra, con un nivel reducido de alcohol. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende el uso de inoculación inversa o inoculación conjunta de una cepa de bacteria ácido láctica homofermentativa o heterofermentativa facultativa y una cepa de levadura.

Antecedentes de la invención

En la actualidad, como consecuencia de una mayor concienciación social y en materia de salud de los consumidores, hay una alta demanda en el mundo del vino de soluciones para reducir el contenido de alcohol en el vino como producto final. Como una alternativa a los vinos de graduación alcohólica completa, los vinos con un contenido reducido de alcohol ofrecen a los consumidores una variedad de beneficios potenciales para la salud y en el ámbito social. Entre los beneficios sociales pueden incluirse una productividad y una función mejoradas después de actividades que involucran al alcohol (por ejemplo, comidas de negocios), un menor riesgo de sufrir accidentes al conducir y un comportamiento social más aceptable en general. Entre las ventajas relacionadas con la salud puede incluirse una ingesta reducida de calorías, un menor riesgo de contraer enfermedades y afecciones relacionadas con el alcohol y beneficios específicos para mujeres embarazadas. Para los productores de estos vinos, existe el incentivo de mercados y segmentos del mercado identificados, así como también menores impuestos a las ventas y aranceles aplicables en muchos países (Pickering, 2000).

Los métodos para producir vinos con un contenido reducido de alcohol se consiguen desde principios del 1900. Aunque en la actualidad la producción comercial se basa casi exclusivamente en sistemas fundamentados en el uso de membranas y destilación modificada, se ha expuesto en la bibliografía una variedad de aproximaciones alternativas. Estas aproximaciones se resumen en la tabla 1 (Pickering, 2000).

Tabla 1. Técnicas actuales para la producción de vinos con un contenido reducido de alcohol (adaptado de Pickering, 2000, y de Schmidtkeet al.,2012)

Al usar fruta inmadura y/o zumo/mosto diluido, el sabor del vino como producto final se ve comprometido, debido a una menor concentración de precursores de sabor. La retirada mecánica del etanol tiende a ser un proceso intenso que afecta a la composición química general del vino, y por ello, también afecta al perfil y la experiencia sensorial del vino.

Hasta ahora, debe realizarse un trabajo arduo para reducir el azúcar con una aproximación biológica. Se han explorado cinco métodos diferentes: 1) la aireación del mosto durante la fermentación usandoSaccharomycessp. con una conversión de azúcar a CO2, agua y biomasa, 2) la aireación del mosto durante la fermentación usando noSaccharomycessp. con una conversión de azúcar a CO2, agua y biomasa, 3) el uso de noSaccharomycesySaccharomycessp. en una fermentación secuencial, 4) la interrupción temprana de fermentación para la producción de vinos dulces y 5) las cepas de vinoSaccharomyces cerevisiaegenéticamente modificadas para volver a dirigir la producción de etanol.

La reducción de un porcentaje de alcohol por aireación del mosto durante la fermentación usandoSaccharomycessp. se ha explorado desde 1989. Se ha descrito un proceso para la preparación de zumos de fruta con bajo contenido de azúcar o sin azúcar en base a un cultivo continuo o semicontinuo con levadura, las condiciones dando como resultado un metabolismo de azúcar a CO2y agua en lugar de etanol y recuperando de ese modo un zumo sin alcohol, sin azúcar o con bajo contenido de azúcar por separación de la biomasa (Kaeppeli, 1989). Grossmannet al.(1991) describen un sistema similar para producir bebidas con bajo contenido de alcohol, donde se añade oxígeno al líquido de fermentación de una manera controlada con el fin de convertir los azúcares en agua y CO2. El suministro de oxígeno se interrumpe cuando se alcanza el nivel requerido de alcohol residual, luego se separa la levadura del líquido y por último, se microfiltra el líquido para dar un producto líquido transparente.

Al examinar una amplia colección de especies de levadura, Kolbet al.(1993) descubrieron que laPichia stipitisresultaba en particular adecuada para la retirada de azúcar de zumo. Sus reivindicaciones incluyen la retirada de más del 50 % del azúcar de zumo en 20 horas, y un mínimo de efectos colaterales en la calidad sensorial y funcional del zumo. Se han obtenido resultados similares a través de la investigación del efecto producido al variar los niveles de aireación y de temperatura en la reducción de azúcar y en la producción de alcohol en el zumo de uva Muller-Thurgau a través de cepas de levadura seleccionadas (Smithet al.,1995). Siete cepas de levadura mostraron resultados prometedores, de las cuales tres cepas produjeron reducciones significativas de alcohol:Pichia stipitis, Candida tropicalisySaccharomyces cerevisiae.Al combinar una aireación controlada a corto plazo para reducir el contenido de azúcar, con una fermentación anaeróbica usando una levadura de vino seca activa, se produjeron vinos con un sabor aceptable y entre un 25 % y un 30 % menos de alcohol. Sin embargo, estos vinos mostraron un color dorado intenso que indica oxidación, lo que en general resulta poco conveniente para un vino.

Más investigaciones sobre los cultivos de partida mixtos de noSaccharomycessp. con una cepa de vino deSaccharomyces cerevisiaereveló que podría reducirse el porcentaje de alcohol (v/v) en un 0,2-0,7 % (Ciani y Ferraro, 1996; Ferraroet al.2000; Erten y Campbell, 2001; Cianiet al.2006; Garcíaet al.2010; Maygar y Toth, 2011; Comitiniet al.2011; Di Maioet al.2012; Sadoudiet al.2012). En una publicación reciente del Instituto Australiano de Investigación Vitivinícola (AWRI, por sus siglas en inglés), se ha realizado una evaluación de 50 aislamientos de noSaccharomycesdiferentes, que pertenecen a 24 géneros distintos con respecto a su capacidad de producir vino con una concentración menor de etanol cuando se usan en regímenes de inoculación secuencial con una cepa de vinoSaccharomyces cerevisiae(Contreraset al.,2013). Una inoculación secuencial deMetschnikowia pulcherrimaAWRI1149 seguida de una cepa de vino deSaccharomyces cerevisiaefue la mejor combinación capaz de producir vino con una concentración de etanol menor que el control de levadura de vino de un solo inóculo. Las fermentaciones secuenciales que utilizaron AWRI1149 produjeron vinos con un 0,9 % (v/v) y un 1,6 % (v/v) (correspondiente a 7,1 g/l y 12,6 g/l) menos de concentración de etanol en Chardonnay y Shiraz, respectivamente.

Otra aproximación de la reducción de etanol en la producción de vino es el uso de cepas de levadura genéticamente modificadas (Kutynaet al.,2010). Sin embargo, ante la reticencia del consumidor actual con respecto al uso de cepas de levadura GMO en el vino, esta opción no es considerada comercialmente viable en este momento.

El documento US5460837 da a conocer un proceso para la producción de un fermento maloláctico para producir vino. El fermento maloláctico se produce a partir de al menos una cepa de bacteria maloláctica (tal comoLeuconostoc oenos, Lactobavillus brevisoLactobacillus plantarum)que se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de nitrógeno asimilable, ácido málico y alcohol.

En la actualidad, los métodos mencionados presentan una aplicación comercial limitada. El principal problema es la calidad sensorial reducida comparada con el vino de graduación alcohólica completa. En particular, se han conocido problemas con el desequilibrio en el sabor y la falta de “cuerpo”. El compuesto de sabor principal que da como resultado un perfil de sabor desequilibrado es etilacetato, que con frecuencia es encontrado en muy altas concentraciones en los vinos con contenido reducido de alcohol producidos con los métodos actuales. Estas propiedades sensoriales alteradas pueden producirse como resultado del procesamiento requerido para producir el vino con un contenido reducido de alcohol o como una consecuencia directa del contenido reducido de etanol. Las características principales de las aproximaciones biológicas respecto de los vinos con contenido reducido de alcohol consisten en el desarrollo potencial del sabor inadecuado (concentraciones de etilacetato o de ácido acético demasiado altas) con el uso de cepas de levadura noSaccharomycesu oxidación del vino como producto final al emplear técnicas de aireación, lo que da como resultado caracteres organolépticos no deseables.

Sumario de la invención

El problema a ser resuelto por la presente invención es la provisión de un método alternativo para reducir el contenido de alcohol en bebidas de fruta fermentada sin pérdida de la calidad sensorial del vino.

La solución se basa en el sorprendente descubrimiento de los inventores de que una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565, cuando es inoculada antes de, o de manera simultánea a la fermentación con levadura, puede usarse para reducir el contenido de alcohol en el vino en al menos el 0,5 % (v/v) en comparación con el vino producido por fermentación con levadura solamente.

Los inventores observaron que la bacteria ácido láctica utiliza el azúcar del mosto para formar ácido láctico (y otros metabolitos) sin producir etanol. De esta manera, puede reducirse el etanol en el vino como producto final, sin ninguna influencia negativa en el perfil de sabor.

Además, al parecer, las notas de frutas así como la sensación de redondez en boca se ven mejoradas en estos vinos.

Además de esto, el ácido málico también puede ser convertido en ácido láctico por las cepas deLactobacillusspp. homofermentativa o heterofermentativa facultativa sometidas a pruebas, lo que significa que se lleva a cabo la fermentación maloláctica (MLF, por sus siglas en inglés) durante la fermentación alcohólica.

Esto significa que, al usar esta técnica nueva, los productores de vinos pueden reducir el contenido de alcohol y completar la m Lf al mismo tiempo, sin comprometer el sabor.

En comparación con las aproximaciones biológicas actuales en el estado de la técnica para reducir el contenido de alcohol usando oxígeno en combinación con una levaduraSaccharomyceso noSaccharomyceso usando cepas noSaccharomycescon una conversión menor de azúcar a etanol, la técnica presente para usar cepas de la bacteria ácido láctica homofermentativa o heterofermentativa facultativa en inoculación inversa (la cepa de la bacteria ácido láctica es inoculada antes de la fermentación con la levadura) o por inoculación conjunta (la cepa de la bacteria ácido láctica es inoculada al mismo tiempo que la fermentación con la levadura) con una levadura de vino no da como resultado la oxidación del vino, el desequilibrio del sabor ni la falta de sensación en boca, sino que incluso puede mejorar el perfil de sabor del vino.

Divulgación detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende los siguientes pasos de:

a) inocular y fermentar un mosto de fruta con una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565; y

b1) dentro de un período de tiempo después de añadir una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399, fermentar el mosto de fruta con al menos una cepa de levadura para obtener la bebida con un contenido reducido de alcohol en comparación con la bebida fermentada solo con la cepa de levadura, en el que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 es inoculada en una cantidad de al menos 1 x 104 UFC/ml y el mosto de fruta se fermenta durante un período de tiempo de al menos 12 horas antes de la fermentación con la al menos una cepa de levadura; o

b2) fermentar de manera simultánea el mosto de fruta con al menos una cepa de levadura para obtener la bebida con un contenido reducido de alcohol en comparación con la bebida fermentada solo con la cepa de levadura.

En una forma de realización preferida, la fermentación del mosto de fruta con una cepa de levadura en el paso b1) se lleva a cabo 24 horas, tal como 36 horas, tal como 48 horas, tal como 60 horas, después de la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro Ds M 27565.

En una forma de realización adicional preferida, la fermentación del mosto de fruta con una cepa de levadura en el paso b2) se lleva a cabo dentro de las 72 horas, tal como dentro de las 60 horas, tal como dentro de las 48 horas, tal como dentro de las 24 horas, tal como dentro de las 12 horas.

En una forma de realización preferida, la cepa de levadura esPichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Torulaspora delbrueckiioKluyveromyces thermotolerans.

La expresión “contenido reducido de alcohol” en una bebida tal como se usa en el presente documento, hace referencia a una concentración menor de alcohol en la bebida en comparación con una bebida preparada bajo idénticas condiciones pero sin la adición de la cepa de bacteria ácido láctica homofermentativa o heterofermentativa facultativa.

Como se usa en el presente documento, el término “mosto” designa el zumo no fermentado o en fermentación proveniente de uvas o de otras frutas.

El término “vino”, tal como se lo emplea en el presente documento, hace referencia a un mosto, en el que la cantidad de alcohol producida por fermentación alcohólica es de al menos el 4%(v/v), incluyendo, pero sin limitarse a, mosto de uva fermentada (vino tinto, vino blanco, vino espumoso, etc.) y sidra (mosto de fruta fermentada a base de zumo de manzana, pera, melocotón, etc.). El vino puede haber alcanzado su grado máximo de alcohol si finalizó la fermentación alcohólica. El contenido de alcohol es expresado por volumen de alcohol con relación al volumen total.

Las bacterias ácido lácticas homofermentativas fermentan la glucosa y/o la fructosa con ácido láctico como subproducto primario.

Las bacterias ácido lácticas heterofermentativas fermentan la glucosa y/o la fructosa con ácido láctico, etanol/ácido acético y dióxido de carbono como subproductos. Las bacterias ácido lácticas heterofermentativas facultativas producen dióxido de carbono y otros subproductos solo bajo determinadas condiciones o a partir de sustratos específicos.

El grupo de cepas de bacteria ácido láctica homofermentativa y heterofermentativa facultativa incluyen cepas deLactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus, Pediococcus pentocaceus, Pediococcus parvulusyStreptococcus thermophilus.

En una forma de realización preferida, el mosto de fruta es inoculado y fermentado con al menos dos o más cepas de bacteria ácido láctica homofermentativa y heterofermentativa facultativa en el paso a), tal como 2, 3, 4, 5 o más cepas de bacteria ácido láctica homofermentativa y heterofermentativa facultativa.

En los ejemplos que aparecen más abajo, se muestra que cuando las bacterias son inoculadas en concentraciones relativamente bajas, la cantidad de bacterias inoculadas en el paso a) determina el período de tiempo adecuado para convertir al menos una porción del azúcar en ácido láctico. Además, se muestra que, cuando las bacterias fueron inoculadas en concentraciones relativamente altas, fue posible inocular de manera conjunta las bacterias y la levadura y aun así, lograr una reducción en el contenido de alcohol en la bebida.

De esta manera, en una forma de realización preferida, la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565 es inoculada en una cantidad de al menos 1 x 104 UFC/ml, tal como al menos 5 x 104 UFC/ml, tal como al menos 1 x 105 UFC/ml, tal como al menos 5 x 105 UFC/ml, tal como al menos 1 x 106 UFC/ml, tal como al menos 5 x 106 UFC/ml, tal como al menos 1 x 107 UFC/ml, y el mosto de fruta es fermentado durante un período de tiempo adecuado como para convertir al menos una porción del azúcar en ácido láctico u otros metabolitos antes de la fermentación con la cepa de levadura.

Preferiblemente, el período de tiempo adecuado para convertir al menos una porción del azúcar en ácido láctico u otros metabolitos es de al menos 12 horas, tal como al menos 24 horas, tal como al menos 36 horas, tal como al menos 48 horas, tal como al menos 52 horas, tal como al menos 60 horas, tal como al menos 72 horas.

En una forma de realización preferida, la porción del azúcar que se convierte en ácido láctico u otros metabolitos es de al menos 5 g/l, tal como al menos 10 g/l, tal como al menos 15 g/l, tal como al menos 20 g/l.

En otra forma de realización preferida, la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565 es inoculada en una cantidad de al menos 1 x 104 UFC/ml, tal como al menos 5 x 104 UFC/ml, tal como al menos 1 x 105 UFC/ml, tal como al menos 5 x 105 UFC/ml, tal como al menos 1 x 106 UFC/ml, tal como al menos 5 x 106 UFC/ml, tal como al menos 1 x 107 UFC/ml, tal como al menos 5 x 107 UFC/ml, tal como al menos 1 x 108 UFC/ml, y el mosto de fruta es fermentado de manera simultánea con la cepa de bacteria ácido láctica y la cepa de levadura.

En una forma de realización preferida, el mosto de fruta es fermentado con una cepa de levadura que es inoculada en una cantidad de al menos 1 x 105 UFC/ml, tal como al menos 5 x 105 UFC/ml, al inicio de la fermentación de levadura en el paso b2).

En otra forma de realización preferida, el mosto de fruta es fermentado espontáneamente en el paso b1) o el paso b2) con una levadura autóctona.

La levadura que se usa puede ser de cualquier tipo de levadura que se usa en la industria alimentaria o de bebida. Los ejemplos incluyen, por ejemplo,Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Torulaspora delbrueckiioKluyveromyces thermotolerans,etc.

Las levaduras típicas usadas en la producción del vino pertenecen a la familia de levadura deSaccharomycetaceae(levaduras ascomicetas). Las levaduras del géneroSaccharomyces(por ejemplo, la especieSaccharomycescerevisiae)son comúnmente utilizadas. Otras levaduras usadas pertenecen a la misma familia deSaccharomycetaceaepero son de otro género, tal comoKluyveromyces(por ejemplo, la especieKluyveromyces thermotolerans)y del géneroTorulaspora(por ejemplo, la especieTorulaspora delbrueckii).

Para la inoculación de mosto de fruta, puede usarse un cultivo de levadura puro (es decir, un cultivo que contiene un solo tipo de levadura), pero también puede usarse un cultivo mixto de dos o más tipos de levadura como inoculante.

En una forma de realización preferida, el mosto de fruta es inoculado y fermentado con al menos dos o más cepas de levadura en el paso b), tal como 2, 3, 4, 5 o más cepas de levadura.

El método de acuerdo con la invención permite una reducción significativa en la concentración de alcohol de una bebida:

El ejemplo 1 del presente documento muestra una reducción de más del 1 % (v/v) en la concentración de alcohol desde el 9,5 % (v/v), 9,0 % (v/v) y 10,2 % (v/v).

El ejemplo 2 del presente documento muestra una reducción de más del 1 % (v/v) en la concentración de alcohol desde el 10,2 % (v/v).

El ejemplo 3 del presente documento muestra una reducción del 0,95 %, 0,55 % y 1,4 % en la concentración de alcohol desde el 10,05 % (v/v).

El ejemplo 4 del presente documento muestra una reducción del 1,1 % (v/v) y 0,9 % (v/v) en la concentración de alcohol desde el 14,14 % (v/v) y 13,25 % (v/v), respectivamente.

El ejemplo 5 del presente documento muestra una reducción del 0,6 % (v/v) en la concentración de alcohol desde el 8,45 % (v/v).

En consecuencia, en una forma de realización preferida, la concentración de alcohol de la bebida es de al menos el 0,5 % (v/v), tal como de al menos el 0,75 % (v/v), tal como de al menos el 1 % (v/v), tal como de al menos el 1,25 % (v/v), tal como de al menos el 1,5 % (v/v), tal como de al menos el 1,75 % (v/v), tal como de al menos el 2 % (v/v), tal como de al menos el 2,5 % (v/v), tal como de al menos el 3 % (v/v) menos que la concentración de alcohol de una bebida preparada bajo idénticas condiciones pero sin la adición de la cepa de bacteria ácido láctica homofermentativa o heterofermentativa facultativa.

Además, un aspecto de la presente invención se refiere a la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565.

Otro aspecto adicional se refiere al uso de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565 en un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende los pasos de:

a) inocular y fermentar un mosto de fruta con una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399; y

b) de manera simultánea o dentro de un período de tiempo posterior a la adición de una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399, fermentar el mosto de fruta con al menos una cepa de levadura para obtener la bebida con un contenido reducido de alcohol en comparación con la bebida fermentada solo con una cepa de levadura.

Tal como se la emplea en el presente documento, la expresión “bacteria ácido láctica” indica una bacteria gram positiva, microaerófila o anaeróbica, que fermenta los azúcares con la producción de ácidos que incluyen ácido láctico como el ácido predominantemente producido, el ácido acético y el ácido propiónico. Las bacterias ácido lácticas más útiles en la industria son las que se encuentran en el orden de los “Lactobacillales” que incluye:Lactococcusspp.,Streptococcusspp.,Lactobacillusspp.,Leuconostocspp.,Pediococcusspp.,Brevibacteriumspp.,Enterococcusspp.,Propionibacteriumspp. yOenococcusspp.

El uso de los términos “un”, “una”, “el”, “la” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (en especial en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe ser interpretado como que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en el presente documento o que el contexto lo contradiga con claridad. De esta manera, “un”, “una”, “la” y “el” pueden significar al menos uno, o uno o más de uno.

Las expresiones “que comprende/n”, “que tiene/n”, “que incluye/n” y “que contiene/n” deben ser interpretadas como términos abiertos (es decir, que significan “que incluye/n pero sin que la enumeración sea excluyente,”) a menos que se indique de otra manera. En el presente documento, la enumeración de intervalos de valores simplemente pretende servir de un método abreviado para hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentran dentro de este intervalo, a menos que el presente documento lo indique de otra manera, y cada valor separado es incorporado a la memoria descriptiva como si fuera mencionado individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que el presente documento lo indique de otra manera o el contexto lo contradiga con claridad. El uso de cualquiera de y todos los ejemplos, o el vocabulario a modo de ejemplo (por ejemplo, la expresión “tal como”) provisto en el presente documento, pretende simplemente dar más claridad a la invención y no limita el alcance de la invención a menos que se reivindique de otra manera. Ninguna frase de la memoria descriptiva debe ser interpretada como indicativa de algún elemento sin reivindicar que sea esencial para la puesta en práctica de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la actividad maloláctica de diferentes dosificaciones de inoculación de cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 con una levadura de vinoSaccharomyces cerevisiaeen el zumo de Riesling. Como control, se muestra una fermentación con solo levadura de vinoSaccharomyces cerevisiae.

La figura 2 representa los niveles finales de alcohol en el vino Riesling producido con regímenes de inoculación de cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399. Se ha añadido una levadura de vinoSaccharomyces cerevisiaea las 24 horas de la inoculación deLactobacillus plantarum.Como control, se muestra una fermentación con solo la levadura de vinoSaccharomyces cerevisiae.

La figura 3 muestra la actividad maloláctica de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 inoculada de manera conjunta con una levadura de vinoSaccharomyces cerevisiaeen el zumo de Riesling. Como control, se muestra una fermentación con solo la levadura de vinoSaccharomyces cerevisiae.

La figura 4 representa la producción de alcohol durante la fermentación del zumo de Riesling con la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 inoculada de manera conjunta con la levadura de vinoSaccharomyces cerevisiae.Como control, se muestra una fermentación con solo la levadura de vinoSaccharomyces cerevisiae.

La figura 5 muestra un análisis de sabor de los vinos Chardonnay como producto final. Se muestran niveles finales de 11 compuestos de sabor tanto para el vino Chardonnay de control (solo levadura de vinoSaccharomyces; Chardonnay con) y Chardonnay con la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (Chardonnay L. pl.).

La figura 6 representa un análisis de sabor de los vinos Merlot como producto final. Se muestran niveles finales de 11 compuestos de sabor tanto para el vino Merlot de control (solo levadura de vinoSaccharomyces;Merlot con) como para el Merlot con la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (Merlot L. pl.).

La figura 7 muestra un análisis sensorial de los vinos Chardonnay como producto final. El Chardonnay 154 de prueba es el vino Chardonnay con la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y Chardonnay 157 control es el vino de control (solo levadura de vinoSaccharomyces).

La figura 8 representa un análisis sensorial descriptivo de los vinos Chardonnay como producto final. El Chardonnay 154 de prueba es el vino Chardonnay con la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y Chardonnay 157 control es el vino de control (solo levadura de vinoSaccharomyces).

La figura 9 muestra el recuento de células deLactobacillusdurante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 10 representa el recuento de células de levadura durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 11 muestra las concentraciones de glucosa durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 12 representa las concentraciones de fructosa durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 13 muestra las concentraciones de glucosa y de fructosa durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 14 representa las concentraciones de ácido málico durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 15 muestra las concentraciones de ácido láctico durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

La figura 16 muestra la producción de etanol durante la fermentación de zumo de uva blanca húngara con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) y levadura de vino Merit que se añade en distintos momentos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Configuración de la fermentación

Se llevaron a cabo pruebas de fermentación en laboratorio en 200 ml de zumo de uva. Se usaron cuatro zumos de uva diferentes: zumo de uva blanca italiana, zumo de uva tinta italiana, zumo de Riesling y zumo de uva blanca húngara. Todas las fermentaciones se llevaron a cabo a una temperatura de 20 °C hasta su finalización (niveles de azúcar de <10 g/l). Se inoculó cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 aislada de zumo de uva sudafricana, otra cepa deLactobacillus plantarumo una cepa deLactobacillus paracaseien distintos niveles de inoculación que variaron desde 5 x 106 hasta 5 x 107 UFC/ml. Se inoculó levadura de vinoSaccharomyces cerevisiaea 1 x 106 UFC/ml.

Análisis GC-FID de espacio libre superior

Se usó cromatografía de gases de espacio libre superior acoplada a un detector de ionización de llama (GC-FID, por sus siglas en inglés) para medir los ésteres y los alcoholes superiores en los productos de fermentación. Se centrifugaron las muestras de fermentación después de lo cual se recolectaron 2 ml en viales. Luego, se analizaron las muestras con un sistema de cromatografía de gases calibrado Perkin Elmer con un muestreador de espacio libre superior. El cromatógrafo de gases estaba equipado con una columna DB-WAXETR (30 m de longitud; 0,25 mm de diámetro interno; grosor de capa de 0,5 pm; de Agilent Technologies, Alemania). Se usó el inyector con/sin fraccionamiento y se lo mantuvo a 180 °C. Se calentaron las muestras durante 30 minutos a 70 °C en el automuestreador de espacio libre superior antes de la inyección (temperatura de aguja: 110 °C). Se empleó helio como gas portador. Después de comenzar a 60 °C, se elevó la temperatura del horno después de 2 minutos desde 60 °C hasta 230 °C a 45 °C/min y por último, se mantuvo a 230 °C durante 5 minutos. Durante el programa de cromatografía de gases, se mantuvo una tasa de flujo constante (10 ml/min) del gas portador (He). Se mantuvo constante la temperatura de FID a 220 °C, respectivamente. Los resultados fueron analizados con un programa de computación Turbochrom.

Análisis sensorial

El análisis sensorial fue realizado con un panel de cata profesional.

Análisis de los parámetros de vino como producto final

Se realizó un análisis de etanol, azúcar total (glucosa fructosa), ácido total (AT), ácido volátil (AV), pH y ácido málico con equipo Oenofoss™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se midieron las concentraciones de ácido láctico, glucosa, fructosa y ácido acético con HPLC a través de métodos conocidos por los expertos en la técnica y tal como los describió, por ejemplo, Castellariet al.(2000. “An improved HPLC method for the analysis of organic acids, carbohydrates, and alcohols in grape must and wines”. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 23 (13); págs. 2047 a 2056).

Resultados

Ejemplo 1: Inoculación inversa de zumo de uva con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaede vino.

El primer experimento fue realizado con una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 aislada de zumo de uva, que era de un pH inferior a 3,5. Los ensayos de laboratorio con la cepa deLactobacillus plantarumse han realizado tanto con zumo de uva blanca como tinta italiana. Aquí, la cepa deLactobacillus plantarumse presenta como un producto en un formato congelado(pelletscongelados).

Se inoculóLactobacillus plantarumen diversas dosificaciones (que variaron desde 5 x 106 hasta 5 x 107 UFC/ml) en una inoculación inversa conSaccharomyces cerevisiaede vino, inoculada a las 72 horas a un nivel de 1 x 106 UFC/ml. El volumen de fermentación era de 200 ml. Los parámetros iniciales del zumo de uva son descritos en la tabla 2.

Tabla 2. Parámetros iniciales del zumo de uva tinta y blanca

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

AT** = acidez total

AV*** = acidez volátil

En total, se sometieron a prueba 4 estados para cada zumo de uva:

- control: adición solo deSaccharomyces cerevisiae

- 5 x 106 UFC/ml deLactobacillus plantarumCHCC12399Saccharomyces cerevisiaea las 72 horas

-1 x 107 a las 72 horas

- 5 x 107 UFC/ml deLactobacillus plantarumCHCC12399Saccharomyces cerevisiaea las 72 horas.

Una vez terminadas las fermentaciones (cuando se agotó el azúcar), se midieron el nivel de alcohol y otros parámetros relevantes del vino (tabla 3 y 4).

Tabla 3. Parámetros del vino como producto final en el vino tinto

Tabla 4. Parámetros del vino como producto final en el vino blanco

A partir de la tabla 3 y de la tabla 4, resulta claro que el vino inoculado con 5 x 107 UFC por ml deLactobacillus plantarumtenía <1 % menos de alcohol (v/v), en comparación con el vino de control y este fue el caso tanto para el vino tinto como para el vino blanco. Curiosamente, la dosificación deLactobacillus plantarumparece de gran importancia para lograr un porcentaje de alcohol más bajo, dado que la inoculación de 1 x 107 UFC/ml no ejerce un efecto significativo en el nivel de alcohol. A partir de la tabla 4, también puede observarse que la adición deLactobacillus plantarumno ejerce un efecto negativo en la producción de ácido acético, dado que las concentraciones son similares entre el control y todas las dosificaciones deLactobacillus plantarum.Sin embargo, se considera que dosificaciones menores deLactobacillus plantarumtambién reducirán el alcohol, dependiendo del tiempo de inoculación posterior de la levadura; cuanto más tiempo se permite que laLactobacillus plantarumfermente sola, se convierte más azúcar en ácido láctico u otros metabolitos. Asimismo, resulta claro que no se produce más ácido acético al añadirLactobacillus plantarum.

Al producirse más ácido láctico que lo teóricamente posible del ácido málico, parte de la glucosa y de la fructosa se convierte en ácido láctico, dejando menos azúcar para que se convierta en etanol (tabla 5). Tal como puede observarse en la tabla 5,Lactobacillus plantarumconsumió más de 16 g/l de azúcar (glucosa y fructosa) en las primeras 24 horas. Esto resultó muy sorprendente dado que se esperaba que solo se hubiera consumido ácido málico bajo estas condiciones. Un 1 % de etanol (v/v) le corresponde a 16 g/l de azúcar consumida porLactobacillus plantarum.Si debe convertirse todo el azúcar en ácido láctico, deben formarse al menos 16 g/l de ácido láctico. Dado que este no es el caso, se formaron otros productos metabólicos de la glucosa, o bien reacciona el ácido láctico con otros productos metabólicos presentes durante la fermentación para formar aún otro grupo de productos metabólicos.

Tabla 5. Medición del azúcar a las 24 horas de la inoculación deLactobacillus plantarumantes de la adición de la levadura de vino

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

Para confirmar que se necesitan 5 x 107 UFC/ml deLactobacillus plantarumpara reducir el porcentaje final de alcohol en el vino con un 1 % (v/v), se realizó otro grupo de experimentos. En este experimento, se sometió a prueba el efecto de los niveles de inoculación entre 1 x 107 UFC/ml y 5 x 107 UFC/ml deLactobacillus plantarumen la producción de etanol. Dado que la adición de la levadura de vino a las 72 horas no es comercialmente viable, se añadió la levadura de vino a las 24 horas. En este caso, se usó zumo de Riesling para los experimentos de fermentación. Los parámetros iniciales del zumo de Riesling se dan en la tabla 6.

Tabla 6. Parámetros iniciales del zumo de uva Riesling

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

AT** = acidez total

AV*** = acidez volátil

Se añadióLactobacillus plantarumen 6 dosificaciones de inoculación distintas: 2 x 107 UFC/ml, 2,5 x 107 UFC/ml, 3 x 107 UFC/ml, 3,5 x 107 UFC/ml, 4 x 107 UFC/ml y 5 x 107 UFC/ml en el zumo de uva Riesling. A las 24 horas, se añadió una cepa deSaccharomyces cerevisiaede vino (1 x 106 UFC/ml) al zumo para terminar la fermentación. El volumen de fermentación fue de 200 ml y la temperatura de fermentación fue de 20 °C. Los parámetros del vino como producto final se muestran en la tabla 6. El rendimiento de la fermentación maloláctica (MLF, por sus siglas en inglés) y los niveles finales de etanol son representados en la figura 1 y en la figura 2.

Tabla 7. Parámetros del vino como producto final en el vino Riesling

5E7 4,0 4,3 3,51 9,1 0,30

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

AT** = acidez total

AV*** = acidez volátil

Los resultados de la tabla 7 y de la figura 2 muestran claramente que se necesitan 5 x 107 UFC/ml deLactobacillus plantarumpara reducir el porcentaje de etanol con un 1 % (v/v). Sin embargo, a partir de un nivel de inoculación de 3,5 x 107 UFC/ml, reduciéndose el nivel de alcohol en el vino como producto final. Además de esto, la figura 1 muestra que la MLF se lleva a cabo durante los primeros tres días de la fermentación mediante la inoculación deLactobacillus plantarumen todas las dosificaciones.

Ejemplo 2: Inoculación conjunta del zumo de uva con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaede vino.

Dado que es más fácil añadir tantoLactobacillus plantarumcomo la levadura juntas en una denominada inoculación conjunta, se sometió a prueba si podría reducirse el porcentaje de etanol en el vino como producto final mediante la inoculación conjunta deLactobacillus plantarumcon una levadura de vino deSaccharomyces.De esta manera, los productores de vino pueden añadir tantoLactobacillus plantarumcomo levadura de vino al comienzo de una fermentación de vino, lo que hace que la nueva técnica sea más fácil de usar de una manera comercial.

Para este experimento, se utilizó el mismo zumo de Riesling que el descrito en la tabla 5. Se añadióLactobacillus plantarumen una dosificación de inoculación de 5 x 107 UFC/ml, junto con la levadura de vino deSaccharomyces cerevisiae(1 x 106 UFC/ml). La fermentación se llevó a cabo a 20 °C. La actividad de la fermentación maloláctica (MLF, por sus siglas en inglés) y la producción de alcohol se muestran en la figura 3 y en la figura 4.

La figura 3 y la figura 4 muestran con claridad que la inoculación conjunta deLactobacillus plantarumcon una levadura de vino deSaccharomyces cerevisiaeda como resultado una reducción final de alcohol de un 1 % (v/v). Asimismo, puede degradarse por completo el ácido málico cuando se emplea una inoculación conjunta. Esto significa que la inoculación conjunta deLactobacillus plantarumjunto conSaccharomyces cerevisiaeen la dosificación correcta da como resultado una reducción final de alcohol del 1 % (v/v) con una MLF completa durante la fermentación alcohólica.

Ejemplo 3: Inoculación inversa del zumo de uva con la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399, cepa deLactobacillus plantarumLPL-1 o cepa deLactobacillus paracaseiLPA-1, respectivamente, y una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaede vino.

Para investigar si esta propiedad de reducir el contenido de alcohol es específica de la cepa y/o de la especie, se sometieron a prueba otra cepa deLactobacillus plantarum,LPL-1, y una cepa deLactobacillus paracasei,LPA-1, para reducir el contenido de alcohol (véase la tabla 8). Se empleó el mismo protocolo que antes, donde se añadió la levadura de vino deSaccharomyces cerevisiaea las 24 horas. Se inocularon las cepas deLactobacillusen una proporción de 5 x 107 UFC/ml y se añadió la levadura en una proporción de 1 x 106 UFC/ml.

Tabla 8. Parámetros de vino como producto final en vino Riesling fermentado con 3 cepas distintas deLactobacillusy un control

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

AT** = acidez total

AV*** = acidez volátil

A partir de la tabla 8, resulta muy claro que todas las especies sometidas a prueba deLactobacilluspueden reducir el contenido de alcohol en al menos un 0,5 %. Sin embargo, parece que soloLactobacillus plantarumtiene la propiedad combinada de reducir el contenido de alcohol y de degradar el ácido mélico por completo.

Ejemplo 4: Inoculación inversa con cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaede vino - Pruebas de campo.

En estos experimentos, se sometió a prueba si esto funciona en el campo. Se realizaron dos pruebas en bodegas, donde se sometió a prueba la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 de vino en dos variedades de uva diferentes: una variedad de uva blanca, Chardonnay, y una variedad de uva tinta, Merlot. En las pruebas de campo, también se sometió a prueba cómo afectaba al perfil de sabor del vino como producto final la reducción de contenido de alcohol conLactobacillussp., dado que se trata de la desventaja principal al usar levadura de noSaccharomyceso aireación para reducir el contenido de alcohol.

En todos los casos, se añadióLactobacillus plantaruma las uvas o en zumo de uva al comienzo de la fermentación en una dosificación de 5 x 106 UFC/ml y se añadió levadura a las 24 horas. La prueba del Chardonnay fue realizada en tanques de 450 hl y la prueba del Merlot, se realizó en tanques de 200 hl. En todos los casos, el contenido de azúcar inicial fue aproximadamente el mismo y se llevó a cabo una fermentación de control con la única adición de levadura de vino deSaccharomyces.Los resultados se muestran en la tabla 9.

Tabla 9. Parámetros finales de vino en ensayos de vino fermentados con y sin la cepa deLactobacillus plantarumde vino. La levadura del vino se añadió a las 24 horas. La fermentación de control es una fermentación con solo levadura de vino deSaccharomyces.

Glu/Fru* = suma de glucosa y fructosa

AT** = acidez total

AV*** = acidez volátil

Los resultados de la tabla 9 muestran que en todas las pruebas de campo, laLactobacillus plantarumde vino fue capaz de reducir el porcentaje final de alcohol en al menos un 0,8 % (v/v) y esto, con una tasa de inoculación muy baja (5 x 106 UFC/ml). Esto significa que la técnica propuesta de usar una cepa deLactobacilluspara reducir el contenido de alcohol en al menos un 0,5 % también funciona a gran escala.

Se analizó el perfil de sabor de los vinos de la tabla 9. Además, se analizaron los vinos Chardonnay a través de un panel sensorial profesional para investigar si los vinos como producto final son aceptables con respecto al perfil de sabor en comparación con los vinos de control. El panel sensorial consistió en 10 personas que calificaron los vinos en una escala de 1 a 5 para cada característica.

Los resultados de los análisis del sabor, realizados con GC-FID de espacio libre superior, se muestran en la figura 5 y en la figura 6. Los resultados de los análisis sensoriales se muestran en las figuras 7 y 8.

Tal como puede observarse a partir de las figuras 5 y 6, el perfil de sabor del Chardonnay de control en comparación con el Chardonnay inoculado conLactobacillus plantarumparece muy similar. Especialmente el etilacetato, que es un componente problemático principal al añadir las cepas de noSaccharomyces,es muy similar en ambos vinos e incluso un poco menos en el Chardonnay con adición deLactobacillus plantarum.Lo mismo ocurre con los vinos Merlot donde también aquí, los perfiles de sabor parecen muy similares.

Resulta muy claro a partir del análisis sensorial que el vino Chardonnay con adición deLactobacillus plantarumno tiene defectos en comparación con el vino de control. El vino de prueba está más caliente, tal como lo muestra la figura 7, pero se prefiere aún más la intensidad aromática general y la complejidad de los vinos de prueba en comparación con el vino de control. Esto se confirma por el análisis descriptivo donde el Chardonnay con la adición deLactobacillus plantarumtiene un carácter más afrutado (pomelo, piña, mango) en comparación con el vino de control.

Ejemplo 5: Inoculación inversa con distintos períodos de tiempo entre la inoculación con cepa deLactobacillus plantarumCHC12399 y la inoculación con levadura de vino Merit en zumo de uva blanca húngara.

Para investigar el potencial de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 para reducir el contenido de alcohol reduciendo la glucosa y/o la fructosa en ácido láctico al comienzo de la fermentación del vino, se realizaron experimentos en zumo de uva blanca húngara con las siguientes características (tabla 10).

Tabla 10. Parámetros del zumo de uva blanca húngara:

Parámetros Glu/Fru pH Ácido málico Ácido total % de etanol AV

(g/l) (g/l) (g/l) (g/l)

Zumo de 166,2 3,29 1,5 3,1 0,16

La tabla 11 describe la configuración de la fermentación. Aquí, se muestra que se emplearon 6 configuraciones diferentes: la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) al inicio de la fermentación con la adición de levadura en distintos momentos posteriores. Como fermentaciones de control, solo se inoculó levadura (experimentos 11 y 12). La levadura usada es Merit, inoculada en una concentración de 1 x 106 UFC/ml. Las fermentaciones se llevaron a cabo a 20 °C.

Tabla 11. Configuración de la fermentación

Las fermentaciones se llevaron a cabo hasta agotar el azúcar. Durante las fermentaciones, se tomaron muestras para las mediciones de Oenofoss, así como también las mediciones de HPLC para los azúcares y los ácidos.

Se analizó la viabilidad deLactobacilluspor siembra anaeróbica en placas de agar de zumo de uva (GJ5; 77,5 g/l de concentrado de zumo de uva (K V Saft Vall0), 22,4 g/l de extracto de levadura (Bio Springer), 0,6 g/l de Tween® 80 (Sigma-Aldrich), 0,1 g/l de MnSO4, H2O (Merck), 15 g/l de agar (SO-BI-GEL) en agua corriente) con natamicina (0,075 g/l; Delvocide de DSM Food Specialities B.V.). Se incubaron las placas durante 3 días a 30 °C y luego, se realizó el recuento.

Se analizó la viabilidad de la levadura por siembra en placas de agar YGC estándar (extracto de levadura, glucosa, cloranfericol). Se incubaron las placas durante 2 días a 30 °C y luego, se realizó el recuento.

Los resultados mostrados no contienen los números de experimento 9 y 10 dado que se inició una fermentación espontánea con la levadura en estas muestras y por lo tanto, se consideró inapropiado. También comenzó una fermentación espontánea en los números de experimento 7 y 8 pero fue sobre el sembrado con levadura Merit a las 72 horas de la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA). Los recuentos de células deLactobacillusy de levadura se muestran en las figuras 9 y 10, respectivamente. Las mediciones de azúcar y ácido se muestran en las figuras 11 a 15.

A partir de los resultados mostrados en las figuras 9 y 10, resulta evidente queLactobacillus plantarumcreció en todos los experimentos, salvo en el experimento con inoculación conjunta, donde el recuento de células no cambió con el transcurso del tiempo. Esto podría explicarse a través del hecho de que los recuentos de levadura ya son muy altos en el día 1, lo que significa que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 no tiene tiempo para crecer. Sin embargo, la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) aún permanece activa dado que el ácido málico es consumido por completo después del día 2 (figura 14).

Las concentraciones de etanol durante la fermentación se muestran en la figura 16 y las concentraciones finales de etanol se muestran en la tabla 12.

Tabla 12. Concentraciones finales de etanol en todos los vinos

Resulta muy evidente a partir de las concentraciones finales de etanol de la tabla 12 que la adición de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) en una concentración de 5 x 107 UFC/ml y la fermentación 2 o 3 días antes de la adición de levadura puede reducir los niveles de alcohol. La reducción más elevada en la concentración de alcohol se dio con una inoculación de levadura a los 3 días en este caso, donde la reducción en la concentración de alcohol final es de un 0,6 % de etanol (v/v).

A partir de las figuras 11 a 14, también resulta evidente que necesita consumirse primero el ácido málico antes que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) comience a consumir el azúcar. El ácido málico es consumido dentro de los 2 días en todos los distintos escenarios. Incluso con la inoculación conjunta de la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 y la levadura, el ácido málico es consumido dentro de los 2 días después del inicio de la fermentación. El ácido láctico es producido a partir de ácido málico y azúcar (fructosa), lo que da como resultado una producción más elevada de ácido láctico cuando se añade la levadura más adelante. No se produce casi nada de ácido láctico en la fermentación de control, donde se añade solo levadura.

También resulta evidente a partir los resultados del azúcar en la tabla 13 que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 (NoVA) prefiere la fructosa a la glucosa.

Tabla 13. Consumo de azúcar (en g/l) con NoVA, medido antes de la adición de la levadura

La cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 consume fructosa y no glucosa antes de la adición de la levadura, pero también debe consumir más fructosa (y/o glucosa) durante el inicio de la fermentación alcohólica, con el fin de reducir el nivel de alcohol con un 0,6 %.

Conclusión

Resulta evidente a partir de este experimento que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 puede reducir el contenido de alcohol en los vinos como producto final por inoculación inversa. Los resultados muestran que el ácido málico es asimilado en primer lugar, antes de que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 comience a asimilar azúcar. Asimismo, resultó sorprendente descubrir que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 consume fructosa como azúcar principal, y no parece consumir glucosa en este caso.

Depósito y solución de los expertos

La cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 fue depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 1 de agosto de 2013 con el número de registro DSM 27565.

Se ha realizado el depósito bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

El solicitante exige que una muestra de los microorganismos depositados debe estar disponible solo para un experto aprobado por el solicitante.

Referencias

Ciani, M., y Ferraro, L. (1996) Enhanced glycerol content in wines made with immobilizedCandida stellatacells. Applied and Environmental Microbiology, 62:128-132.

Comitini, F., Gobbi, M., Domizio, P., Romani, C., Lencioni, L., Mannazzu, I., y Ciani, M. (2011) Selected non-Saccharomyceswine yeasts in controlled multistarter fermentations withSaccharomyces cerevisiae.Food Microbiology, 28:873-882.

Contreras, A., Hidalgo, C., Henschke, P.A., Chambers, P.J., Curtin, C., y Varela, C. (2013) Evaluation of non-Saccharomycesyeast for the reduction of alcohol content in wine. DOI:10.1128/AEM.03780-13.

Di Maio, S., Genna, V., Gandolfo, V., Amore, G., Ciaccio, M., y Oliva, D. (2012) Presence ofCandida zemplininain Sicilian musts and selection of a strain for wine mixed fermentations. South African Journal of Enology and Viticulture, 33:80-87.

Erten, H., y Campbell, I. (2001) The production of low-alcohol wines by aerobic yeasts. Journal of the Institute of Brewing, 107:207-215.

Ferraro, L., Fatichenti, F. y Ciani, M. (2000) Pilot scale vinification process using immobilizedCandida stellatacells andSaccharomyces cerevisiae.Process Biochemistry, 35:1125-1129.

Garcia, V., Vasquez, H., Fonseca, F., Manzanares, P., Viana, F., Martinez, C .et al.(2010) Effects of using mixed wine yeast cultures in the production of Chardonnay wines. Revista Argentina de Microbiología, 42:226-229.

Grossmann, M., Kruse, R. y Heintz, W. (1991). Producing drinks of low to zero alcohol content - oxygen is added to liquid in controlled manner during fermentation to convert sugars to water and carbon dioxide. DE3939064 (A1). Kaeppeli, O. (1989). Production of sugar-free or low-sugar fruit juice - by fermentation with yeast to carbon dioxide and water stage, avoiding ethanol production. CH668887 (A5).

Kolb, E., Wiesenberger, A., Stahl, U. y Harwart, K. (1993). Biological processes for the partial reduction of sugar in fruit juices. Proceedings of the International Federation of Fruit Juice Producers Symposium, Budapest, 7-20.

Kutyna, D.R., Varela, C., Henschke, P.A., Chambers, P.A., y Stanley, G.A. (2010) Microbiological approaches to lowering ethanol concentrations in wine. Trends Food Science and Technology, 21:293-302.

Maygar, I. y Toth, T. (2011) Comparative evaluation of some oenological properties in wine strains ofCandida stellata, Candida zemplinina, Saccharomycesuvarum andSaccharomyces cerevisiae.Food Microbiology, 28:94-100.

Pickering G. J. (2000). Low and reduced-alcohol wines: a review. Journal of Wine Research, 11:129-144.

Sadoudi, M., Tourdot-Marechal, R., Rousseaux, S., Steyer, D., Gallardo-Chacon, J.J., Ballester, J., Vichi, S., Guerin-Schneider, R., Caixach, J., y Alexandre, H. (2012) Yeast-yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture ofnon-SaccharomycesandSaccharomycesyeasts. Food Microbiology, 32:243-253.

Schmidtke, L.M., Blackman, J.W., y Agboola, S.O. (2012) Production technologies for reduced alcoholic wines. Journal of Food Science, 71:25-41.

Smith, P.M. (1995) Biological processes for the reduction of alcohol in wines. M. Appl. Sci., disertación, Lincoln University, Nueva Zelanda.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende los pasos de:

b1) dentro de un período de tiempo después de añadir una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399, fermentar el mosto de fruta con al menos una cepa de levadura para obtener la bebida con un contenido reducido de alcohol en comparación con la bebida fermentada con la al menos una cepa de levadura sola, en el que la cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 es inoculada en una cantidad de al menos 1 x 104 UFC/ml y el mosto de fruta se fermenta durante un período de tiempo de al menos 12 horas antes de la fermentación con la al menos una cepa de levadura; o

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa de levadura esPichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Torulaspora delbrueckiioKluyveromyces thermotolerans.

3. Una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565.

4. Uso de cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399 que se depositó ante la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) bajo el número de registro DSM 27565 en un método para producir una bebida con un contenido reducido de alcohol que comprende los pasos de:

b) de manera simultánea o dentro de un período de tiempo posterior a la adición de una cepa deLactobacillus plantarumCHCC12399, fermentar el mosto de fruta con al menos una cepa de levadura para obtener la bebida con un contenido reducido de alcohol en comparación con la bebida fermentada solo con la cepa de levadura.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la cepa de levadura esPichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Torulaspora delbrueckiioKluyveromyces thermotolerans.