ES2999650T3

ES2999650T3 - Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells

Info

Publication number: ES2999650T3
Application number: ES18841663T
Authority: ES
Inventors: Tarun Khurana; Yir-Shyuan Wu; xi-jun Chen; Filiz Gorpe-Yasar; Yan-You Lin; Victoria Popic; Erich Jaeger; Mostafa Ronaghi
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2025-02-26
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: EP4446437A3; EP4289967A3; US11352668B2; SG11201911869XA; DK3662083T3; CN111108219A; US12428680B2; WO2019028047A1; US11649498B2; EP4446437A2; CN119842876A; US20220243269A1; US20260055456A1; EP4289967A2; EP3662083A4; EP3662083B1; US20230220462A1; EP3662083A1; CN111108219B; US20200216895A1

Abstract

Se proporcionan implementaciones de un método para sembrar bibliotecas de secuencias en una superficie de una celda de flujo de secuenciación que permiten la segregación espacial de las bibliotecas en la superficie. La segregación espacial se puede utilizar para indexar lecturas de secuencias de bibliotecas de secuenciación individuales para aumentar la eficiencia del análisis de datos posterior. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel que contienen bibliotecas de secuenciación encapsuladas se capturan en una celda de flujo de secuenciación y se degradan en presencia de una barrera de difusión líquida para permitir la segregación espacial y la siembra de las bibliotecas de secuenciación en la superficie de la celda de flujo. Además, se proporcionan ejemplos de sistemas, métodos y composiciones relacionados con dispositivos de celda de flujo configurados para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos y la secuenciación de células individuales. Algunos ejemplos incluyen dispositivos de celda de flujo que tienen un hidrogel con material genético dispuesto en el mismo, y que se retiene dentro del hidrogel durante el procesamiento de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Indexación espacial de material genético y preparación de genotecas utilizando perlas de hidrogel y celdas de flujo

Antecedentes

La tecnología de secuenciación por síntesis (SBS, por sus siglas en inglés) proporciona datos de secuenciación de alta calidad. Sin embargo, los métodos de SBS pueden estar limitados por la longitud de lectura de la secuencia ya que las lecturas de las secuencias de SBS en algunos casos no tienen más de 300 nucleótidos de longitud. Las longitudes de lectura cortas de la tecnología de SBS pueden implicar un análisis de datos sustancial para alinear y reconstruir secuencias largas de ácidos nucleicos a partir de múltiples lecturas de secuencias cortas superpuestas generadas durante el procedimiento de SBS. Las etapas previas a la secuenciación (tal como los códigos de barras de moléculas de ácido nucleico particulares) pueden simplificar el análisis de datos, pero también contribuyen a la complejidad del proceso de SBS.

La patente WO 2014/210353 A2 describe métodos y composiciones para el procesamiento de muestras para aplicaciones de secuenciación que incluyen composiciones de perlas. La patente WO2012/149042 A2 describe métodos, composiciones y kits para ensayos que implican reacciones de amplificación tales como la PCR digital o la PCR digital en gotículas. La patente WO2013/126741 A1 describe métodos y materiales para etiquetar y secuenciar el ADN genómico. La patente US 2012/309002 A1 describe métodos para la multiplexación de muestras y métodos para obtener una pluralidad de moléculas reactivas diferentes, unir un identificador único a las moléculas reactivas, y formar una gotita que incluye las moléculas reactivas. La patente WO 2012/112804 A1 describe métodos para fabricar y utilizar genotecas de códigos de barras, incluida la obtención de una pluralidad de constructos de ácidos nucleicos.

Resumen

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método que comprende cargar perlas de hidrogel degradables en una celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel en una superficie de la celda de flujo de secuenciación, en donde: las perlas de hidrogel degradables contienen genotecas de secuenciación preparadas a partir de material genético encapsulado; o las perlas de hidrogel degradables contienen material genético encapsulado, y el método comprende además preparar genotecas de secuenciación en las perlas de hidrogel degradables capturadas a partir del material genético, y después se carga una barrera de difusión de líquidos que rodea las perlas de hidrogel capturadas en la celda de flujo de secuenciación, y las perlas de hidrogel capturadas se degradan en presencia de la barrera de difusión de líquidos para inhibir sustancialmente la difusión de las genotecas de secuenciación más allá del diámetro de la perla de hidrogel correspondiente y permitir el transporte y siembra de las genotecas de secuenciación en la superficie de la celda de flujo de secuenciación, relativamente cerca de una huella de la correspondiente perla de hidrogel.

El material genético puede ser, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana tales como el ADN genómico (por ejemplo, ADN genómico humano), así como células y lisados celulares que contienen moléculas de ácido nucleico diana.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación comprenden ADN o ARN de al menos 150 nucleótidos de longitud.

En algunos ejemplos, la barrera de difusión de líquidos es un aceite, tal como aceite mineral, aceite de silicona, o aceite perfluorado, o una combinación de dos o más de los mismos. En algunos ejemplos, la barrera de difusión de líquidos es una solución acuosa viscosa, por ejemplo, que contiene polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, dextrano plurónico, sacarosa, poli(N-isopropilacrilamida) u óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO)/laponita, o una combinación de dos o más de los mismos.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel degradables se degradan mediante uno o más de (a) entrar en contacto con un reactivo que escinde un reticulante reversible que reticula polímeros del hidrogel (tal como ditiotreitol (DTT), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris(3-hidroxipropil)fosfina (THP), o una combinación de dos o más de los mismos), (b) calentar a aproximadamente 90 °C y (c) exponer las perlas de hidrogel a una longitud de onda de luz que escinde un reticulante fotoescindible que reticula el polímero del hidrogel.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel tienen un diámetro de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 120 pm.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel son perlas de hidrogel huecas que comprenden núcleos huecos que comprenden el material genético.

Las perlas de hidrogel pueden comprender poros que tienen un diámetro de tamaño suficiente para permitir la difusión de sustancias químicas a través de la perla, mientras que retienen el material genético encapsulado y las genotecas de secuenciación en la perla de hidrogel. En algunos ejemplos, los poros tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm.

En algunos ejemplos, la preparación de las genotecas de secuenciación comprende realizar una reacción de tagmentación en las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel. Por ejemplo, la reacción de tagmentación se puede realizar cuando las perlas de hidrogel se capturan en la celda de flujo de secuenciación o antes de cargar las perlas de hidrogel en la celda de flujo de secuenciación. En algunos ejemplos, la reacción de tagmentación comprende poner en contacto las moléculas de ácido nucleico diana con una mezcla de transposasas que comprende secuencias adaptadoras y transposomas.

En algunos ejemplos, la captura de las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo de secuenciación comprende una o más de: la restricción física de las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo de secuenciación, y la unión específica de un primer miembro de un par de unión específico en las perlas de hidrogel a un segundo miembro del par de unión específico en la superficie de la celda de flujo de secuenciación (p.ej.,ubicado en los pocillos de una celda de flujo con patrones). En algunos ejemplos, el diámetro de las perlas de hidrogel es de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 % mayor que la altura de la celda de flujo para restringir físicamente las perlas en la celda de flujo. En algunos ejemplos, la celda de flujo de secuenciación es una celda de flujo con patrones, y el segundo miembro del par de unión específico está ubicado en los pocillos de la celda de flujo con patrones.

En algunos ejemplos del método descrito, el diámetro de las perlas de hidrogel es de aproximadamente 110 pm y la altura de la celda de flujo de secuenciación es de aproximadamente 100 pm.

Algunos ejemplos del método descrito comprenden además amplificar moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel degradables. En algunos ejemplos, la amplificación implica amplificación por desplazamiento múltiple. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas son ADN genómico y la amplificación implica la amplificación del genoma completo.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación no tienen códigos de barras para identificar perlas de hidrogel individuales. En algunos ejemplos, el método comprende además secuenciar las genotecas de secuenciación sembradas en la superficie de la celda de flujo. En algunos ejemplos, la ubicación en la superficie de la celda de flujo de las genotecas de secuenciación sembradas a partir de las respectivas perlas de hidrogel degradables se utiliza como índice espacial para las lecturas generadas a partir de la secuenciación de las genotecas de secuencias.

Adicionalmente, en la presente memoria se proporcionan ejemplos de sistemas, métodos y composiciones relacionados con dispositivos de celda de flujo configurados para la preparación de genotecas de ácidos nucleicos y para la secuenciación de células individuales. En otro aspecto de la presente invención, el dispositivo de celda de flujo incluye un soporte sólido que comprende una superficie que tiene un hidrogel degradable inmovilizado sobre la misma, en donde el hidrogel degradable comprende poros que están dimensionados para permitir la difusión de un reactivo a través del hidrogel, pero que son demasiado pequeños para permitir que el material genético atraviese los poros. En otro aspecto de la presente invención, el sistema incluye una etapa configurada para contener un dispositivo de celda de flujo de la presente invención, que incluye un soporte sólido que comprende una superficie que tiene un hidrogel degradable inmovilizado sobre la misma, el propio dispositivo de celda de flujo, y un detector para obtener datos de secuenciación. Algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria se refieren a un método para preparar una genoteca de ácidos nucleicos en un dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el método incluye proporcionar un dispositivo de celda de flujo tal como se describe en la presente memoria que incluye un soporte sólido que comprende una superficie que tiene un hidrogel degradable depositado sobre la misma, aislar ácidos nucleicos del material genético en el hidrogel, y preparar una genoteca de ácidos nucleicos a partir de los ácidos nucleicos aislados.

Debe tenerse en cuenta que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales descritos en mayor detalle a continuación (siempre que tales conceptos no sean mutuamente contradictorios) se contemplan como parte de la materia de la invención descrito en la presente memoria.

Las anteriores y otras características y ventajas de esta descripción se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varios ejemplos que continúa con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Lafigura 1es una ilustración esquemática de un ejemplo de un método descrito para sembrar genotecas de secuenciación producidas a partir de material genético (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico) en una celda de flujo de secuenciación y secuenciar las genotecas de secuenciación.

Lasfiguras 2A y 2Bson diagramas de flujo de ejemplos de un método descrito para sembrar genotecas de secuenciación producidas a partir de material genético (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana tal como ADN genómico) en una celda de flujo de secuenciación.

Lasfiguras 3A-3Dson ilustraciones esquemáticas y micrografías que muestran la producción y la carga de perlas de hidrogel que contienen material genético en una celda de flujo de secuenciación. (Figura 3A) Se cargó una solución de moléculas de ácido nucleico diana mezcladas con un precursor polimérico en un depósito de muestras de un cartucho generador de gotas, el cartucho se cargó en un generador de gotas, y se procesó para generar gotículas de precursor polimérico que contenía las moléculas de ácido nucleico diana. (Figura 3B) Micrografía de perlas de hidrogel que contienen moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas. En este ejemplo, las perlas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 120 pm. Las perlas de hidrogel se formaron exponiendo las gotículas preparadas utilizando el generador de gotículas a iniciadores de radicales disueltos en aceite, o exponiendo las gotículas a la irradiación UV con un iniciador de radicales UV. (Figura 3C) Ilustración y micrografía de las perlas de hidrogel capturadas en una celda de flujo de secuenciación. En este ejemplo, las perlas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 120 pm, y se cargaron en la celda de flujo de secuenciación donde se capturaron debido a una restricción física en el canal de 100 pm de altura de la celda de flujo. (Figura 3D) La celda de flujo de secuenciación se insertó en un secuenciador de SBS para su posterior procesamiento y secuenciación.

Lasfiguras 4A-4Cson ilustraciones esquemáticas y micrografías que muestran la preparación de la genoteca de secuenciación en perlas y la siembra de celdas de flujo. (Figura 4A) Diagrama esquemático que muestra perlas de hidrogel que contienen moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas que se capturaron en una celda de flujo de secuenciación. En este ejemplo, las perlas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 120 pm, y se cargaron en la celda de flujo de secuenciación donde se capturaron debido a una restricción física en el canal de 100 pm de altura de la celda de flujo. Las perlas de hidrogel capturadas tenían un tamaño de poro que permitía la difusión de enzimas, sustancias químicas y oligonucleótidos de menor tamaño (por ejemplo, menos de 50 pares de bases), pero conservan moléculas de ácido nucleico de mayor tamaño (por ejemplo, más de 300 pares de bases). (Figura 4B) Diagrama esquemático que muestra la preparación en perlas de la genoteca de secuenciación a partir del ADN diana encapsulado dentro de las perlas de hidrogel. La solución de preparación de la genoteca que contenía enzimas y reactivos para la preparación de la genoteca de secuenciación a partir de las moléculas de ácido nucleico diana se cargó en la celda de flujo para preparar la genoteca de secuenciación en la perla de hidrogel. En este ejemplo, la preparación de la genoteca de secuenciación se realizó mediante un ensayo de tagmentación. (Figura 4C) Diagrama esquemático y micrografía que muestran una barrera de difusión de líquidos cargada en la celda de flujo de secuenciación para llenar el volumen vacío entre las perlas y rodear las perlas de hidrogel capturadas que contienen las genotecas de secuenciación. En este ejemplo, la barrera de difusión de líquidos era aceite mineral. A continuación, la celda de flujo se calentó para degradar las perlas de gel de hidrogel y permitir el transporte de la genoteca de secuenciación a la superficie de la celda de flujo donde se capturan las genotecas de secuenciación. En otro ejemplo, se puede utilizar aceite mineral que contenga una concentración suficiente de DTT para despolimerizar las perlas y liberar la genoteca en lugar de o además de aplicar calor a las perlas. En varias implementaciones, la celda de flujo se calienta para desnaturalizar la genoteca antes de la siembra. La presencia del aceite mineral inhibió la difusión de la genoteca de secuenciación más allá del diámetro de las perlas de hidrogel. Por lo tanto, en presencia del aceite, la siembra se produjo muy cerca del espacio de cada perla de hidrogel (a partir de perlas de hidrogel de 120 pm de diámetro, la siembra de la genoteca se limitó a un área de aproximadamente 120 pm de diámetro).

Lasfiguras 5A-5Crepresentan ilustraciones esquemáticas de tres flujos de trabajo diferentes para la secuenciación de moléculas de ácido nucleico.

Lafigura 6representa resultados de secuenciación de celdas de flujo sembradas con perlas de hidrogel que contienen ADN genómico humano que tienen un tamaño de fragmento de ~100 kb con ~100 fragmentos por perla.

Lafigura 7representa resultados de secuenciación de celdas de flujo sembradas con perlas de hidrogel que contienen ADN genómico humano que tienen un tamaño de fragmento de ~100 kb con ~50 fragmentos por perla. El ADN genómico de las perlas de hidrogel se amplificó mediante amplificación con MDA antes de la captura celular de flujo y la generación de la genoteca en las perlas.

Lafigura 8representa resultados de secuenciación de celdas de flujo sembradas con perlas de hidrogel que contienen ADN genómico humano que tienen un tamaño de fragmento de ~10 kb con ~100 fragmentos por perla. El ADN genómico de las perlas de hidrogel se amplificó mediante amplificación con MDA antes de la captura celular de flujo y la generación de la genoteca en las perlas.

Lasfiguras 9A-9Crepresentan un diagrama esquemático (figura 9A) y un conjunto de micrografías (figuras 9B y 9C) que ilustran perlas de hidrogel huecas para su uso en los ejemplos descritos. La figura 9A proporciona un diagrama esquemático que ilustra la construcción de las perlas de hidrogel huecas. En primer lugar, se forma una capa interna de hidrogel (núcleo interno) que contiene una muestra encapsulada (p. ej., material genético, tal como una célula o una molécula de ácido nucleico diana). El núcleo interno se encapsula después con una capa de hidrogel externa (cubierta externa). La capa de hidrogel interna se despolimeriza después utilizando un agente que no despolimeriza la capa de hidrogel externa, dejando la capa de hidrogel externa con un espacio hueco que contiene el material genético.

Lasfiguras 10A-10Cmuestran un diagrama esquemático (figura 10A), un gráfico de la distribución del tamaño de las islas (figura 10B) y un diagrama de islas (figura 10C) para un flujo de trabajo ejemplar que utiliza la entrada de lisado celular para generar perlas de hidrogel que contienen material genético.

La figura 11 muestra una imagen generada a partir de parches de ADN de hidrogel superpuestos de dos muestras diferentes (cada una con un código de barras de ADN diferente introducido durante la etapa de tagmentación) procesadas utilizando una estrategia de siembra secuencial. Los parches de agrupaciones de la primera muestra están marcados con un asterisco (*); los parches de la segunda muestra no están marcados.

Lasfiguras 12A y 12Bmuestran un conjunto de micrografías que muestran la siembra del espacio intersticial entre grupos de perlas de hidrogel con una genoteca estándar de lectura corta para maximizar la utilización de las celdas de flujo. Las micrografías muestran una genoteca sembrada que utiliza perlas de hidrogel para la indexación espacial antes (figura 12A) y después (figura 12B) de la siembra del espacio intersticial entre parches de agrupaciones a partir de perlas de hidrogel con una genoteca estándar de lectura corta para maximizar la utilización de las celdas de flujo.

Lasfiguras 13A y 13Brepresentan una descripción esquemática según un ejemplo de un método para preparar una genoteca de ácidos nucleicos. La figura 13A muestra las etapas (a)-(d) para preparar una matriz de gel que contiene células o ADN genómico en una superficie de la celda de flujo. La figura 13B representa las etapas (a)-(e) para preparar una genoteca de ácidos nucleicos en la superficie de la celda de flujo de la figura 1A.

Las figuras 14A-14F representan una representación esquemática de la retención de perlas de hidrogel dentro de una celda de flujo. En las figuras 14A-14C, las perlas de hidrogel se muestran atrapadas en una celda de flujo y utilizadas para ensayos posteriores con diferentes reactivos. En la figura 14D, se muestra una muestra de fragmentos de ADN atrapados dentro de un hidrogel para la preparación de la genoteca en flujo. En la figura 14E, se muestra un microbioma atrapado dentro de un hidrogel para la preparación de la genoteca en flujo. En la figura 14F, se muestran células de mamíferos atrapadas dentro de las perlas de hidrogel para la preparación de genotecas celulares en flujo.

Lasfiguras 15A-15Crepresentan un ejemplo de una superficie con patrones para capturar perlas de hidrogel. La figura 15A muestra una vista en sección transversal de la estructura de perlas de hidrogel capturadas en celdas de flujo con patrones de micromatrices. La figura 15B es una imagen de campo brillante de perlas de gel rehidratado ubicadas y centradas en pocillos con patrones. La figura 15C es una imagen que muestra imágenes fluorescentes de perlas de hidrogel rehidratadas en los pocillos. Barra de escala, 50 pm.

Lasfiguras 16A-16Crepresentan la hidratación de perlas de hidrogel en un ejemplo descrito en la presente memoria. En la figura 16A, las perlas de hidrogel se muestran deshidratadas y que tienen un tamaño inicial de aproximadamente 70 pm de diámetro. En la figura 16B, las perlas de la figura 16A se rehidratan parcialmente y comienzan a agrandarse. En la figura 16C, las perlas están completamente hidratadas con un diámetro de aproximadamente 105 pm. Barra de escala, 200 pm.

Lafigura 17muestra micrografías de perlas de hidrogel reversibles de 10-100 pm que ilustran la liberación de material genético encapsulado a partir de perlas de hidrogel. Se muestra que las perlas de hidrogel reversibles que contienen bacterias teñidas con tinte se degradan al entrar en contacto con un agente reductor, lo que resulta en la liberación de bacterias. Cada imagen mide 300 pm * 225 pm.

Lasfiguras 18A-18Brepresentan los resultados de un experimento de preparación de genotecas de celdas de flujo y generación de agrupaciones utilizando perlas de hidrogel químicamente descomponibles. En la figura 18A, las perlas de hidrogel en aceite se muestran fusionándose entre sí. En la figura 18B, se muestran grupos de fragmentos de ADN amplificados que se han derivado de las perlas de hidrogel que se muestran en la figura 18A. Barra de escala, 100 pm.

Lasfiguras 19A-19Brepresentan imágenes fluorescentes de hidrogel que contiene ADNg humano teñido (figura 19A) y la densidad del gradiente de grupo del ADN amplificado sembrado (figura 19B). Barra de escala, 100 pm.

Lasfiguras 20A-20Bproporcionan los resultados de secuenciación del ADNg humano que se preparó y secuenció en un dispositivo de celda de flujo. La figura 20A es una puntuación Q-Score global de las lecturas de un primer experimento. La figura 20B muestra la tasa de error de emparejamiento del mismo experimento.

Lasfiguras 21A-21Drepresentan ejemplos de preparación de genotecas de celdas de flujo y generación de agrupaciones y liberación de genotecas de ADN a partir de perlas de hidrogel, como se ve con el colorante intercalador SYTOX. La figura 21A es un diagrama esquemático de un ejemplo de preparación de una genoteca. La figura 21B es una micrografía que muestra el ADN de células bacterianas lisadas en perlas de hidrogel teñidas con el colorante intercalador SYTOX. La figura 21C es una micrografía de una perla de hidrogel durante la liberación de ADN de la perla de hidrogel. La figura 21D es una micrografía de genotecas de ADN sembradas y agrupadas en la superficie de una celda de flujo como se muestra con la tinción con colorante intercalador SYTOX. Barra de escala, 100 pm.

Descripción detallada

En la presente memoria se proporciona un método para sembrar una pluralidad de genotecas de secuencias en una celda de flujo de secuenciación que permite la segregación espacial de las genotecas en la pluralidad. La segregación espacial se puede utilizar para indexar lecturas de secuencias de genotecas de secuenciación individuales para aumentar la eficiencia del análisis de datos posterior.

Las implementaciones adicionales se refieren a dispositivos, sistemas, y métodos para preparar genotecas de ácidos nucleicos en un dispositivo de celda de flujo. Por ejemplo, el dispositivo de celda de flujo incluye un hidrogel que incluye material genético, en donde el hidrogel está configurado para conservar el material genético, mientras que permite que los reactivos, las enzimas, los químicos y los cebadores de menor tamaño de menos de aproximadamente 50 pares de bases pasen a través del hidrogel.

En algunos ejemplos de los métodos de preparación de muestras estándar, cada molde contiene un adaptador en cualquiera de los extremos del inserto y frecuentemente se utilizan varias etapas tanto para modificar el ácido nucleico como para purificar los productos deseados de las reacciones de modificación. Estas etapas se realizan en solución antes de la adición de los fragmentos adaptados a una celda de flujo, donde se acoplan a la superficie mediante una reacción de extensión de cebador que copia el fragmento hibridado al extremo de un cebador unido covalentemente a la superficie. Estos moldes 'semilla' dan lugar a continuación a grupos monoclonales de molde copiados a través de varios ciclos de amplificación.

El número de etapas involucrado para transformar ácidos nucleicos en moldes modificados con adaptador en solución listos para la formación de grupos y la secuenciación puede reducirse, o en algunas instancias incluso minimizarse, utilizando fragmentación y etiquetado mediado por transposasas. Este proceso, denominado en la presente memoria “tagmentación” involucra la modificación de ácidos nucleicos mediante un complejo de transposomas que comprende la enzima transposasa en complejo con adaptadores que comprenden la secuencia terminal transposónica. La tagmentación puede dar como resultado la fragmentación simultánea del ADN y el ligamiento de los adaptadores en los extremos 5' de ambas cadenas de los fragmentos dúplex. En un ejemplo, tras una etapa de purificación para eliminar la enzima transposasa, se añaden secuencias adicionales a los extremos de los fragmentos adaptados mediante PCR. En algunas instancias, la tagmentación en solución tiene inconvenientes y puede involucrar varias etapas laboriosas. Además, se puede introducir un sesgo durante las etapas de amplificación por PCR.

Los dispositivos, sistemas y métodos presentados en la presente memoria superan estos inconvenientes y permiten la preparación imparcial de muestras, la formación de grupos y la secuenciación en un único soporte sólido con requisitos mínimos para la manipulación o transferencia de muestras, y también permiten la secuenciación de material genético distinto, por ejemplo, la secuenciación de células individuales, sobre un soporte sólido. En algunas implementaciones, la indexación espacial de las genotecas de secuenciación permite un procesamiento simplificado y la reconstrucción de secuencias del material genético (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana) a partir del cual se generan las genotecas de secuenciación (por ejemplo, al reducir la necesidad de una etapa de codificación de barras). Las implementaciones descritas en la presente memoria también aumentan la resolución de datos para la secuenciación de moléculas de ácido nucleico diana, y simplifican además el ensamblaje de los genomas(p. ej.,de organismos nuevos), y proporcionan una identificación mejorada de las variaciones genéticas raras y la coaparición de mutaciones en las moléculas de ácido nucleico diana.

I. Resumen de los términos

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan según el uso convencional. Como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular “ un” , “ una” , “ uno” y “ el” o “ la” hacen referencia tanto al singular como al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “ comprende” tal como se utiliza en la presente memoria, es sinónimo de “ incluye” , “ contiene” o “ caracterizado por” y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de método adicionales no enumerados. Aunque se pueden utilizar muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, en la presente memoria se describen métodos y materiales particularmente adecuados. A menos que el contexto indique lo contrario, las enumeraciones de rangos numéricos mediante extremos incluyen todos los números comprendidos dentro de ese rango (p.ej.,1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

A lo largo de la presente memoria descriptiva a “ un ejemplo” , a “ determinados ejemplos” o a “algunos ejemplos” etc., significa que, en al menos un ejemplo de la descripción, se incluye un rasgo, una configuración, una composición o una característica particular descrita en relación con el ejemplo. Por lo tanto, la aparición de tales expresiones en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva, no se refieren necesariamente al mismo ejemplo de la descripción.

En esta descripción, se hace referencia a los dibujos adjuntos. En los dibujos, símbolos similares identifican componentes similares, a menos que el contexto indique lo contrario.

Adaptador:Un oligonucleótido lineal que se puede fusionar con una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante ligamiento o tagmentación. En algunos ejemplos, el adaptador es sustancialmente no complementario al extremo 3' o al extremo 5' de cualquier secuencia diana presente en la muestra. En algunos ejemplos, las longitudes adecuadas del adaptador están en el rango de aproximadamente 10-100 nucleótidos, aproximadamente 12-60 nucleótidos, o aproximadamente 15-50 nucleótidos de longitud. En general, el adaptador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos y/o ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el adaptador puede incluir uno o más grupos escindibles en una o más ubicaciones. En otro aspecto, el adaptador puede incluir una secuencia que es complementaria de al menos una porción de un cebador, por ejemplo, un cebador que incluye una secuencia de nucleótidos universal, tal como una secuencia P5 o P7. En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir un código de barras (también denominado en la presente memoria índice o etiqueta) para ayudar en la corrección de errores, identificación o secuenciación posteriores. Los términos “ adaptador” y “ adaptadores” se utilizan indistintamente.

En algunos ejemplos, un adaptador puede modificarse para impedir la formación de concatámeros, por ejemplo, mediante la adición de grupos de bloqueo que impidan la extensión del adaptador en uno o ambos extremos. Como ejemplos de grupos de bloqueo en 3' se incluyen un c 3 espaciador en 3', un didesoxinucleótido y una unión a un sustrato. Como ejemplos de grupos de bloqueo en 5' se incluyen un nucleótido desfosforilado en 5' y la unión a un sustrato.

En algunos ejemplos, el adaptador puede incluir un polinucleótido espaciador, que puede tener de 1 a 20, tal como de 1 a 15, o de 1 a 10, nucleótidos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, el espaciador incluye 10 nucleótidos. En algunos ejemplos, el espaciador es un espaciador poliT, tal como un espaciador 10T. Los nucleótidos espaciadores pueden incluirse en los extremos 5' de los polinucleótidos, que pueden unirse a un soporte adecuado mediante un enlace con el extremo 5' del polinucleótido. Una unión puede lograrse a través de un nucleófilo que contiene azufre, tal como fosforotioato, presente en el extremo 5' del polinucleótido. En algunos ejemplos, el polinucleótido incluirá un espaciador poliT y un grupo fosforotioato 5'.

Amplificar, amplificado y amplificación:Acción o proceso mediante el cual al menos una porción de una molécula de ácido nucleico se replica o copia en al menos una molécula de ácido nucleico adicional. En algunos ejemplos, tal amplificación puede realizare utilizando condiciones isotérmicas; en otros ejemplos, tal amplificación puede incluir termociclado. En algunos ejemplos, la amplificación es una amplificación multiplexada que incluye la amplificación simultánea de múltiples secuencias diana en una única reacción de amplificación. Los ejemplos no limitativos de reacciones de amplificación incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), reacciones en cadena de la ligasa, reacción de amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, por sus siglas en inglés), reacción de amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés), múltiples ciclos de amplificación basados en hibridación y formación de bucles (MALBAC, por sus siglas en inglés), métodos de amplificación mediada por la transcripción (TMA, por sus siglas en inglés) tal como la NASBA, métodos de amplificación mediada por bucles (p.ej,amplificación “ LAMP” mediante secuencias formadoras de bucles. La molécula de ácido nucleico que se amplifica puede ser ADN que comprenda, consista en, o derive de ADN o ácido ribonucleico (ARN) o de una mezcla de ADN y ARN, incluyendo ADN y/o ARN modificados. Los productos resultantes de la amplificación de una molécula o moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, “ productos de amplificación” o “ amplicones” ), tanto si el ácido nucleico de partida es ADN, ARN o ambos, pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de nucleósidos o nucleótidos tanto de ADN como de ARN, o pueden comprender nucleósidos o nucleótidos de ADN o ARN modificados. Una “ copia” no significa necesariamente una complementariedad o identidad de secuencia perfecta con la secuencia diana. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos tales como desoxiinosina o desoxiuridina, alteraciones de secuencia deliberadas (tales como alteraciones de secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridable con, pero no complementaria a, la secuencia diana y/o errores de secuencia que se producen durante la amplificación.

Diversos ejemplos incluyen la amplificación de fase sólida, que es una reacción de amplificación llevada a cabo en o en asociación con un soporte sólido de modo que todos o una porción de los productos amplificados se inmovilicen sobre el soporte sólido a medida que se forman. Los ejemplos no limitativos de amplificación de fase sólida incluyen la reacción en cadena de la polimerasa en fase sólida (PCR en fase sólida) y la amplificación isotérmica en fase sólida, que son reacciones análogas a la amplificación en fase de solución estándar, salvo que uno o ambos de los cebadores de amplificación directo e inverso se inmovilizan en el soporte sólido.

Sitio de amplificación:Un sitio en la superficie de una celda de flujo de secuenciación donde se pueden generar uno o más amplicones de una reacción de amplificación. Un sitio de amplificación puede configurarse además para capturar, sujetar o unir al menos un amplicón que se genera en el sitio.

Matriz:Una población de sitios que se pueden diferenciar entre sí según su ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una sola molécula de ácido nucleico diana que tenga una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tengan la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma). Los sitios de una matriz pueden ser diferentes casillas situadas en el mismo sustrato. Como casillas de ejemplo se incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, perlas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones desde un sustrato, crestas sobre un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser diferentes sustratos, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a diferentes sustratos según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Como matrices de ejemplo en que se ubican distintos sustratos en una superficie se incluyen, sin limitación, las que tienen perlas en pocillos.

Captura:Inmovilización de una entidad diana (tal como una perla de hidrogel) sobre una superficie de interés (tal como la superficie de una celda de flujo). Un sitio de captura es un sitio en la superficie de una celda de flujo de secuenciación donde se pueden capturar una o más perlas de hidrogel o fragmentos adaptados de una molécula de ácido nucleico diana.

Agente de captura:Un material, sustancia química, molécula o resto de la misma, que es capaz de fijarse, conservarse o unirse a una molécula diana(p. ej.,un ácido nucleico diana). Los ejemplos de agentes de captura incluyen, sin limitación, un ácido nucleico de captura (también denominado en la presente memoria oligonucleótido de captura) que es complementario a al menos una porción de un ácido nucleico diana, un miembro de un par de unión receptor-ligando (p.ej.,avidina, estreptavidina, biotina, lectina, hidrato de carbono, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) capaz de unirse a un ácido nucleico diana (o un resto de enlace unido al mismo), o un reactivo químico capaz de formar un enlace covalente con un ácido nucleico diana (o resto de enlace unido al mismo).

Hidrogel y perla de hidrogel:Un gel coloide formado a partir de un polímero orgánico (natural o sintético) que se reticula mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de red abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar el gel. En varios ejemplos, las perlas de hidrogel tienen forma esférica, aunque también son posibles otras formas. En algunos ejemplos, el hidrogel y las perlas de hidrogel utilizadas en los métodos descritos incluyen un 60-90 % de fluido, tal como agua, y un 10-30 % de polímero. En determinados ejemplos, el contenido acuoso de hidrogel o perlas de hidrogel es de aproximadamente 70-80 %.

Una perla de hidrogel o hidrogel biocompatible es una perla de hidrogel o hidrogel que no es tóxica para las células vivas, y permite una difusión suficiente de oxígeno y nutrientes a las células atrapadas para mantener la viabilidad.

Una perla de hidrogel o hidrogel degradable es una perla de hidrogel o hidrogel que se puede despolimerizar selectivamente. La despolimerización reduce o destruye la estructura reticular del hidrogel, lo que aumenta la porosidad hasta el punto de que las moléculas de ácido nucleico grandes (p. ej., de más de 1 kb) pueden difundirse a través del hidrogel. El tiempo de degradación es una función de la composición y morfología del polímero.

Porosidad del hidrogel:El volumen fraccionario (adimensional) de un hidrogel que está compuesto por espacio abierto, por ejemplo, poros u otras aberturas. Por lo tanto, la porosidad mide los espacios vacíos en un material y es una fracción del volumen de vacíos sobre el volumen total, como un porcentaje entre 0 y 100 % (o una fracción entre 0 y 1). En algunos ejemplos, la porosidad del hidrogel puede variar de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 99 %, o de aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 %.

Índice:Un “ índice” puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede utilizarse como un identificador molecular y/o código de barras para etiquetar un ácido nucleico, y/o para identificar la fuente de un ácido nucleico. En algunos ejemplos, puede utilizarse un índice para identificar un ácido nucleico individual, o una subpoblación de ácidos nucleicos.

Barrera de difusión de líquidos:Líquido en el que los polinucleótidos tienen poca o ninguna solvatación. Las genotecas de secuenciación descritas en la presente memoria son poco solubles en barreras de difusión de líquidos. En un ejemplo no limitativo, la barrera de difusión de líquidos es aceite, tal como aceite mineral. Las barreras de difusión de líquidos adicionales incluyen soluciones viscosas que impiden la difusión de genotecas de ADN, tales como reguladores que contienen polímeros tales como polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, dextrano plurónico, sacarosa, y similares. La barrera de difusión de líquidos también puede ser un gel sensible a la temperatura, donde es una solución no viscosa a temperaturas sin siembra y, al calentarse hasta las condiciones de siembra, se convierte en un gel y forma una barrera para la difusión del a Dn . Los ejemplos incluyen compuestos de nanopartículas de poli(N-isopropilacrilamida) y óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO)/laponita.

Molécula de ácido nucleico:una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y puede incluir ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. Debe entenderse que los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ADN o ARN elaborados a partir de análogos de nucleótidos y que son aplicables a polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios. El término, como se utiliza en la presente memoria, también abarca el ADNc, es decir, el ADN complementario o de copia producido a partir de un molde de ARN, por ejemplo, por la acción de la transcriptasa inversa. Este término se refiere únicamente a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ADN tricatenario, bicatenario y monocatenario así como ARN tricatenario, bicatenario y monocatenario. Los términos molécula de ácido nucleico y polinucleótido se utilizan indistintamente en la presente memoria.

El término “ diana” , cuando se utiliza en referencia a una molécula de ácido nucleico, pretende ser un identificador semántico para el ácido nucleico en el contexto de un método expuesto en la presente memoria y no limita necesariamente la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente.

Los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico pueden incluir ácidos nucleicos naturales y análogos funcionales de los mismos. Los análogos funcionales particularmente útiles pueden hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden utilizarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de cadena principal alternativo que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos naturales generalmente tienen un azúcar de desoxirribosa (p. ej., se encuentra en el ADN) o un azúcar de ribosa (p. ej., se encuentra en el ARN). Un ácido nucleico puede contener cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales o no naturales. En este sentido, un ADN natural puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, uracilo, citosina o guanina. En la técnica se conocen bases no naturales y útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico. Como ejemplos de bases no naturales se incluye un ácido nucleico bloqueado (LNA,locked nucleic acid)y un ácido nucleico con puente (BNA,bridged nucleic acid).En un oligonucleótido de ADN pueden incorporarse bases de LNA y BNA y aumentar la fuerza y especificidad de hibridación del oligonucleótido.

P5 y P7:Se pueden utilizar P5 y P7 cuando se hace referencia a una secuencia universal de P5 o P7 o a un cebador de P5 o P7 con fines de captura y/o amplificación. P5' y P7' se refieren al complemento de P5 y P7, respectivamente. Se entenderá que en los métodos presentados en la presente memoria puede utilizarse cualquier secuencia universal adecuado, y que el uso de P5 y P7 son sólo ejemplos. En algunos ejemplos, la secuencia P5 comprende una secuencia definida por la Id. de sec. n.°: 1 (AATGATACG<g>C<g>ACCACCGA) y la secuencia P7 comprende una secuencia definida por la Id. de sec. n.°: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA). Los usos no limitantes de p 5 y P7 o sus complementos en celdas de flujo se ilustran en las descripciones de WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151 y WO 2000/018957.

Cebador:Una molécula de ácido nucleico que puede hibridarse con una secuencia diana de interés. En diversas implementaciones, el cebador funciona como un sustrato sobre el que una polimerasa puede polimerizar nucleótidos. Sin embargo, en algunos ejemplos, el cebador puede incorporarse a la cadena de ácido nucleico sintetizado y proporcionar un sitio al que pueda hibridarse otro cebador para iniciar la síntesis de una nueva cadena que sea complementaria a la molécula de ácido nucleico sintetizada. El cebador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos o análogos de los mismos. En algunos ejemplos, el cebador es un polinucleótido u oligonucleótido monocatenario.

Reactivo:Un agente o una mezcla de dos o más agentes útiles para reaccionar con, interactuar con, diluir, o añadir a una muestra, y puede incluir, por ejemplo, agentes utilizados en reacciones de amplificación, tagmentación y secuenciación de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, reguladores, productos químicos, enzimas, polimerasas, cebadores que tienen un tamaño de menos de 50 pares de bases, ácidos nucleicos molde, nucleótidos, marcadores, colorantes, o nucleasas. En algunos ejemplos, el reactivo incluye lisozima, proteinasa K, hexámeros aleatorios, polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa de 029, polimerasa Taq, polimerasaBsu),transposasa (por ejemplo, Tn5), cebadores (por ejemplo, secuencias adaptadoras P5 y P7), ligasa, enzima catalizadora, desoxinucleótidos trifosfato, reguladores o cationes divalentes. En algunos ejemplos, los reactivos pueden incluir agentes de lisis, agentes de purificación de ácidos nucleicos, agentes de amplificación de ADN, agentes de tagmentación, agentes de PCR, u otros agentes utilizados en el procesamiento de materiales genéticos.

Sembrar una genoteca de secuenciación:Inmovilización de fragmentos adaptados de una molécula de ácido nucleico diana sobre un soporte sólido, una celda de flujo de secuenciación.

Célula de flujo de secuenciación:Una cámara que comprende una superficie a través de la cual pueden fluir uno o más reactivos fluidos y a la que pueden transportarse y unirse fragmentos adaptados de genotecas de secuenciación. Se describen ejemplos no limitativos de celdas de flujo de secuenciación y de sistemas fluídicos y plataformas de detección relacionados que pueden utilizarse fácilmente en los métodos de la presente descripción, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US-7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US-7.329.492; US-7.211.414; US-7.315.019; US-7.405.281 y US-2008/0.108.082.

Una celda de flujo de secuenciación incluye un soporte sólido que tiene una superficie sobre la que se unen las genotecas de secuenciación. En algunos ejemplos, la superficie contiene un conjunto de nucleótidos de captura que pueden unirse a fragmentos adaptados de una genoteca de secuenciación. En algunos ejemplos, la superficie es una superficie con patrones. Una “superficie con patrones” se refiere a una disposición (tal como una matriz) de diferentes regiones (tal como sitios de amplificación) en o sobre una superficie expuesta de un soporte sólido. Por ejemplo, una o más de las regiones pueden ser casillas donde haya uno o más cebadores de amplificación y/o captura. Las casillas pueden estar separadas por regiones intersticiales donde no hay cebadores. En algunos ejemplos, el patrón puede ser un formato de casillas x-y que estén en filas y columnas. En algunos ejemplos, el patrón puede ser una disposición repetitiva de casillas y/o regiones intersticiales. En algunos ejemplos, el patrón puede ser una disposición aleatoria de casillas y/o regiones intersticiales. En algunos ejemplos, la superficie es una superficie con patrones que contiene una matriz de pocillos con nucleótidos de captura y/o amplificación que se unen a fragmentos adaptados de una genoteca de secuenciación con regiones intersticiales entre los pocillos que carecen de los nucleótidos de captura y/o amplificación.

Las casillas en una superficie con patrones pueden ser pocillos en una matriz de pocillos(p. ej.,micropocillos o nanopocillos) sobre vidrio, silicio, plástico u otros soportes sólidos adecuados con gel unido de manera covalente en patrones, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida) (PAZAM, véanse, por ejemplo, las publicaciones estadounidenses n.° 2013/184796, WO 2016/066586 y WO 2015/002813). El proceso crea almohadillas de gel utilizadas para la secuenciación, que pueden ser estables durante las tandas de secuenciación con un gran número de ciclos. La unión covalente del polímero a los pocillos es útil para mantener el gel en las casillas estructuradas a lo largo de la vida útil del sustrato estructurado durante diversos usos. Sin embargo, en muchos ejemplos, el gel no tiene por qué estar unido de manera covalente a los pocillos. Por ejemplo, en algunas condiciones, como material de gel puede utilizarse acrilamida libre de silano (SFA, véase, por ejemplo, la patente US-8.563.477), que no está unida covalentemente a los pocillos de la superficie. Los ejemplos de celdas de flujo con superficies con patrones que se pueden utilizar en los métodos expuestos en la presente memoria se describen en las patentes US-8.778.848, US-8.778.849 y US-9.0799.148 y en la publicación US-2014/0.243.224.

Las casillas de una superficie con patrones pueden tener en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos 10 (tal como al menos 100, al menos 500, al menos, al menos 5000, al menos 10.000, al menos 50.000, al menos aproximadamente 100.000, al menos aproximadamente 1.000.000, o al menos aproximadamente 5.000. 000, o más) características/cm2

Genoteca de secuenciación:Una colección de fragmentos de ácido nucleico de una o más moléculas de ácido nucleico diana, o amplicones de los fragmentos. En varias implementaciones, los fragmentos de ácido nucleico de la genoteca de secuenciación están unidos a secuencias universales conocidas (tales como las secuencias P5 y P7) en sus extremos 3' y 5'. En varios ejemplos, se prepara una genoteca de secuenciación a partir de una o más moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas dentro de un hidrogel o una perla de hidrogel como se describe en la presente memoria.

Tagmentación:Modificación de una molécula de ácido nucleico mediante un complejo de transposomas para fragmentar la molécula de ácido nucleico y ligar adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos en una única etapa. Las reacciones de tagmentación se pueden utilizar para la preparación de genotecas de secuenciación. Las reacciones de tagmentación combinan la fragmentación aleatoria y el ligamiento del adaptador en una única etapa para aumentar la eficiencia del proceso de preparación de la genoteca de secuenciación.

Transporte:Movimiento de una molécula a través de un fluido. El término puede incluir transporte pasivo, tal como el movimiento de moléculas a lo largo de su gradiente de concentración (p.ej.,difusión pasiva). El término también puede incluir transporte activo mediante el cual las moléculas pueden moverse a lo largo de su gradiente de concentración o en contra de su gradiente de concentración. Por lo tanto, el transporte puede incluir la aplicación de energía para mover una o más moléculas en una dirección deseada o en una ubicación deseada, tal como un sitio de amplificación.

Complejo de transposomas:Una enzima de integración y un ácido nucleico que incluye un sitio de reconocimiento de integración. Un complejo de transposomas es un complejo funcional formado por una transposasa y un sitio de reconocimiento de transposasa que es capaz de catalizar una reacción de transposición (véase, por ejemplo, Gunderson y col., WO 2016/130704). Como ejemplos de enzimas de integración se incluyen, pero sin limitación, una integrasa o una transposasa. Como ejemplos de sitios de reconocimiento de integración se incluyen, pero sin limitación, un sitio de reconocimiento de transposasa.

En condiciones suficientes para:Frase que se utiliza para describir cualquier entorno que permita una actividad deseada.

Secuencia de nucleótidos universal:Una región de secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico donde las moléculas también tienen regiones de secuencia que difieren entre sí. Una secuencia universal que está presente en diferentes miembros de una colección de moléculas puede permitir la captura de múltiples ácidos nucleicos distintos utilizando una población de ácidos nucleicos de captura universal, p.ej.,oligonucleótidos de captura, que sean complementarios a una parte de la secuencia universal, p.ej.,una secuencia de captura universal. Los ejemplos no limitativos de secuencias de captura universales incluyen secuencias que son idénticas o complementarias a los cebadores P5 y P7. De forma similar, una secuencia universal presente en distintos miembros de una colección de moléculas puede permitir la replicación o amplificación (p. ej., secuenciación) de múltiples ácidos nucleicos distintos utilizando una población de cebadores universales que sean complementarios a una porción de la secuencia de universal, p.ej.,una secuencia de anclaje universal. Por lo tanto, un olinucleótido de captura o un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia universal. Dos secuencias universales que se hibridan se denominan par de unión universal. Por ejemplo, un oligonucleótido de captura y una secuencia de captura universal que se hibridan son un par de unión universal.

Ii. Indexación espacial y secuenciación de moléculas de ácido nucleico diana

En la presente memoria se proporcionan ejemplos de un método para sembrar una pluralidad de genotecas de secuencias en una celda de flujo de secuenciación que permite la segregación espacial de las genotecas de la pluralidad. La segregación espacial se puede utilizar para indexar lecturas de secuencias de genotecas de secuenciación individuales para aumentar la eficiencia del análisis de datos posterior. Esta “ indexación espacial” de las genotecas de secuenciación permite un procesamiento simplificado y la reconstrucción de secuencias de las moléculas de ácido nucleico diana a partir de las cuales se generan las genotecas de secuenciación. Entre otras mejoras, los métodos descritos evitan la necesidad de engorrosas etapas de codificación de barras para identificar las lecturas de secuencia relacionadas con una molécula de ácido nucleico diana particular. Las implementaciones descritas en la presente memoria también aumentan la resolución de datos para la secuenciación de moléculas de ácido nucleico diana, y simplifican además el ensamblaje de los genomas (p.ej.,de organismos nuevos), y proporcionan una identificación mejorada de las variaciones genéticas raras y la coaparición de mutaciones en las moléculas de ácido nucleico diana.

La figura 1 ilustra ciertas características de los ejemplos descritos, que se describen en detalle en la presente memoria. Como se muestra en la figura 1, en algunos ejemplos del método descrito, las perlas de hidrogel que contienen moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas se capturan en una celda de flujo de secuenciación. Las genotecas de secuenciación se preparan a partir de las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas en las perlas de hidrogel, y las genotecas de secuenciación se siembran en la superficie de la celda de flujo en presencia de una barrera de difusión de líquidos, lo que da como resultado una siembra segregada espacialmente de las genotecas de secuenciación a partir de perlas de hidrogel individuales. En el ejemplo ilustrado, las dos genotecas de secuenciación sembradas se amplifican mediante amplificación por grupos, formando dos grupos de grupos denominados “ parches de grupos” . La indexación espacial de los parches de agrupaciones en la superficie de la celda de flujo permite que la secuencia de la molécula de ácido nucleico diana se reconstruya a partir de lecturas de secuencias más cortas de parches de agrupaciones individuales.

La figura 2A ilustra un método 100 ejemplar para sembrar genotecas de secuenciación relacionadas con un material genético particular en una celda de flujo de secuenciación.

En la etapa 102, las perlas de hidrogel degradables que contienen material genético encapsulado (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana o células que contienen moléculas de ácido nucleico diana) se capturan en una celda de flujo de secuenciación. Las perlas se cargan en la celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel en la celda de flujo. La captura de las perlas en la celda de flujo se puede lograr, por ejemplo, mediante la restricción física de las perlas de hidrogel en la celda de flujo, por ejemplo, cuando las perlas de hidrogel tienen un diámetro que es aproximadamente un 10 % mayor que la altura de la celda de flujo.

En la etapa 104, se preparan genotecas de secuenciación a partir del material genético en las perlas de hidrogel capturadas. En varios ejemplos, las perlas de hidrogel incluyen poros que permiten la difusión de los reactivos a través de la perla de hidrogel mientras conservan el material genético dentro de la perla. Las genotecas de secuenciación se preparan a partir del material genético de las perlas de hidrogel capturadas haciendo fluir las enzimas, reactivos y componentes apropiados a través de la celda de flujo. Las enzimas, los reactivos y los componentes atraviesan los poros de las perlas de hidrogel para la preparación de la genoteca de secuenciación, mientras que el material genético (por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico diana) y las genotecas de secuenciación resultantes permanecen encapsulados dentro de las perlas de hidrogel. Como resultado, las perlas de hidrogel individuales contienen genotecas de secuenciación separadas producidas a partir del material genético encapsulado.

En la etapa 106, se carga una barrera de difusión de líquidos en la celda de flujo de secuenciación para rodear las perlas de hidrogel. La barrera de difusión de líquidos es un líquido en el que las genotecas de secuenciación encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel tienen poca o ninguna solvatación. Rodear las perlas de hidrogel capturadas con la barrera de difusión de líquidos inhibe la difusión de las genotecas de secuenciación fuera del volumen de las perlas cuando la perla se degrada en la etapa 108.

En la etapa 108, las perlas de hidrogel se degradan para permitir el transporte de las genotecas de secuenciación a la superficie de la celda de flujo de secuenciación, por ejemplo, mediante difusión pasiva. Las genotecas de secuenciación se unen a los agentes de captura en la superficie de la celda de flujo. La barrera de difusión de líquidos inhibe la difusión de las genotecas de secuenciación más allá del diámetro de las perlas de hidrogel. Por lo tanto, en presencia de la barrera de difusión de líquidos, la siembra se produce muy cerca de la huella de cada perla de hidrogel. En algunos ejemplos, se realiza una reacción de amplificación por conglomerados para amplificar la genoteca de secuenciación en la superficie de la celda de flujo antes de la etapa de secuenciación. Las moléculas de ácido nucleico sembradas forman un único grupo de perlas formando un parche de agrupaciones en la celda de flujo. Saber que las moléculas de ácido nucleico dentro de cada parche de agrupación se originan a partir de una única perla de hidrogel simplifica el análisis posterior de las lecturas de secuencia y la reconstrucción de las secuencias de ácido nucleico diana originalmente encapsuladas en la perla de hidrogel.

La figura 2B ilustra un método 200 ejemplar para sembrar genotecas de secuenciación relacionadas con un material genético particular (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico diana) en una celda de flujo de secuenciación.

En la etapa 202, las perlas de hidrogel degradables que contienen genotecas de secuenciación encapsuladas preparadas a partir de material genético (tal como moléculas de ácido nucleico diana o células que contienen moléculas de ácido nucleico diana) se capturan en una celda de flujo de secuenciación. Antes de capturar las perlas de hidrogel en la celda de flujo de secuenciación, las perlas se preparan para encapsular el material genético. Las perlas de hidrogel incluyen poros que permiten la difusión de los reactivos a través de la perla de hidrogel mientras retienen el material genético dentro de la perla. Las genotecas de secuenciación se preparan a partir del material genético de las perlas de hidrogel capturadas incubando las perlas encapsulando el material genético con las enzimas, reactivos y componentes apropiados para generar las genotecas de secuenciación. Las enzimas, los reactivos y los componentes pasan a través de los poros de las perlas de hidrogel para la preparación de la genoteca de secuenciación, mientras que el material genético y las genotecas de secuenciación resultantes permanecen encapsulados dentro de las perlas de hidrogel. Como resultado, las perlas de hidrogel individuales contienen genotecas de secuenciación separadas producidas a partir del material genético encapsulado. Las perlas de hidrogel degradables que contienen las genotecas de secuenciación encapsuladas se cargan después en la celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel en la celda de flujo. La captura de las perlas en la celda de flujo se puede lograr, por ejemplo, mediante la restricción física de las perlas de hidrogel en la celda de flujo, por ejemplo, cuando las perlas de hidrogel tienen un diámetro que es aproximadamente un 10 % mayor que la altura de la celda de flujo.

En la etapa 204, se carga una barrera de difusión de líquidos en la celda de flujo de secuenciación para rodear las perlas de hidrogel. La barrera de difusión de líquidos es un líquido en el que las genotecas de secuenciación encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel tienen poca o ninguna solvatación. Rodear las perlas de hidrogel capturadas con la barrera de difusión de líquidos inhibe la difusión de las genotecas de secuenciación fuera del volumen de las perlas cuando la perla se degrada en la etapa 206.

En la etapa 206, las perlas de hidrogel se degradan para permitir el transporte de las genotecas de secuenciación a la superficie de la celda de flujo de secuenciación, por ejemplo, mediante difusión pasiva. Las genotecas de secuenciación se unen a los agentes de captura en la superficie de la celda de flujo. La barrera de difusión de líquidos inhibe la difusión de las genotecas de secuenciación más allá del diámetro de las perlas de hidrogel. Por lo tanto, en presencia de la barrera de difusión de líquidos, la siembra se produce muy cerca de la huella de cada perla de hidrogel. En algunos ejemplos, se realiza una reacción de amplificación por conglomerados para amplificar la genoteca de secuenciación en la superficie de la celda de flujo antes de la etapa de secuenciación. Las moléculas de ácido nucleico sembradas forman un único grupo de perlas formando un parche de agrupaciones en la celda de flujo. Saber que las moléculas de ácido nucleico dentro de cada parche de agrupación se originan a partir de una única perla de hidrogel simplifica el análisis posterior de las lecturas de secuencia y la reconstrucción de la secuencia del material genético (tal como las moléculas de ácido nucleico diana) originalmente encapsulado en la perla de hidrogel.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación sembradas se secuencian. Se puede utilizar cualquier técnica de secuenciación apropiada, tal como SBS. A continuación se proporciona una descripción adicional del método descrito.

A. Perlas de hidrogel degradables que encapsulan material genético

Las implementaciones proporcionadas en la presente memoria se refieren a perlas de hidrogel degradables que encapsulan material genético, tal como moléculas de ácido nucleico diana, así como a células y lisados celulares que contienen moléculas de ácido nucleico diana. Las perlas pueden incluir polímeros de hidrogel y reticulantes que se mezclan en presencia del material genético, y que forman perlas de hidrogel que encapsulan el material genético. Las perlas de hidrogel pueden incluir poros que permiten la difusión de los reactivos a través de la perla de hidrogel mientras retienen el material genético dentro de la perla, lo que permite que las reacciones tengan lugar dentro de las perlas.

Los ejemplos no limitantes de moléculas de ácido nucleico diana que pueden encapsularse dentro de la perla de hidrogel incluyen A<d>N, tal como ADN genómico o ADNc; ARN, tal como ARMm, ARNp o ARNr; o un híbrido de ADN y ARN.

Las muestras biológicas de ejemplo de las que se puede obtener material genético (tal como moléculas de ácido nucleico diana) incluyen, por ejemplo, las de un mamífero, tal como un roedor, ratón, rata, conejo, cobaya, ungulado, caballo, oveja, cerdo, cabra. vaca, gato, perro, primate, primate humano o no humano; una planta, tal comoArabidopsis thaliana,maíz, sorgo, avena, trigo, arroz, colza, o soja; un alga, tal comoChlamydomonas reinhardtii;un nematodo tal comoCaenorhabditis elegans;un insecto, tal comoDrosophila melanogaster,mosquito, mosca de la fruta, abeja melífera o araña; un pez, tal como el pez cebra; un reptil; un anfibio, tal como una rana oXenopus laevis;undictyostelium discoideum;un hongo, tal comoPneumocystis carinii, Takifugu rubripes,levaduras,Saccharamoyces cerevisiaeoSchizosaccharomyces pombe;o un Plasmodium falciparum. El material genético también puede obtenerse de un procariota tal como una bacteria,Escherichia coli, staphylococciomycoplasma pneumoniae;una arquea; un virus tal como el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana; o un viroide. Las moléculas de ácido nucleico diana pueden obtenerse de un cultivo o población homogénea de los organismos anteriores o, alternativamente, de una colección de varios organismos diferentes, por ejemplo, en una comunidad o ecosistema. No es necesario obtener material genético de fuentes naturales y, en cambio, se puede sintetizar utilizando técnicas conocidas.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana para la encapsulación dentro de las perlas de hidrogel pueden obtenerse del material genético de células individuales. Por ejemplo, las células individuales pueden encapsularse dentro de las perlas de hidrogel y las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico) pueden aislarse de las células individuales utilizando un ensayo de aislamiento en las perlas.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana para la encapsulación dentro de las perlas de hidrogel pueden obtenerse a partir del lisado celular que está encapsulado dentro de las perlas de hidrogel. Las moléculas de ácido nucleico diana (por ejemplo, ADN genómico) se preparan en perlas a partir del lisado y se procesan para generar genotecas de secuenciación para su uso en los métodos proporcionados en la presente memoria.

El material genético encapsulado con la perla de hidrogel es de un tamaño suficiente para quedar atrapado dentro de la perla de hidrogel de modo que no pueda pasar a través de los poros de la perla de hidrogel. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico diana encapsulada dentro de la perla de hidrogel tiene al menos 100 nucleótidos de longitud, al menos 150 nucleótidos de longitud, al menos 200 nucleótidos de longitud, al menos 300 nucleótidos de longitud, al menos 500 nucleótidos de longitud, al menos 1000 nucleótidos de longitud, al menos 5000 nucleótidos de longitud, al menos 10.000 nucleótidos de longitud, al menos 20.000 nucleótidos de longitud, al menos 50.000 nucleótidos de longitud, al menos 100.000 nucleótidos de longitud, o más nucleótidos de longitud. En varios ejemplos, las moléculas de ácido nucleico encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel son fragmentos de ADN genómico de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 20.000 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 50.000 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 300, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 20.000, aproximadamente 50.000 o aproximadamente 100.000 nucleótidos de longitud, o un rango entre dos de los tamaños anteriores, o una longitud mayor que los tamaños anteriores. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico encapsuladas tienen una longitud de hasta aproximadamente 3 Mbases.

Las perlas de hidrogel para su uso en los métodos descritos pueden tener cualquier diámetro apropiado para los métodos descritos en la presente memoria. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel tienen un diámetro de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, o aproximadamente 150 |jm. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel tienen un diámetro de 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, o 150 jm , o un diámetro dentro de un rango definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. En algunos ejemplos, el tamaño de las perlas no es uniforme y, por lo tanto, el tamaño de las perlas incluye perlas de varios diámetros.

Las perlas de hidrogel se pueden preparar mediante la reticulación de biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos. Por lo tanto, en algunos ejemplos, el hidrogel puede incluir un reticulante. Como se utiliza en la presente descripción, el término “ reticulante” se refiere a una molécula que puede formar una red tridimensional cuando reacciona con los monómeros base apropiados. Como ejemplos de los polímeros, que pueden incluir uno o más reticulantes, se incluyen, pero sin limitación, hialuronanos, quitosanos, agar, heparina, sulfato, celulosa, alginatos (incluyendo sulfato de alginato), colágeno, dextranos (incluyendo sulfato de dextrano), pectina, carragenano, polilisina, gelatinas (incluyendo gelatina tipo A), agarosa, copolímeros de (met)acrilato-oligoláctida-PEO-oligolactida-(met)acrilato, copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), poli(fosfaceno), poli(metacrilatos), poli N-vinilpirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G)A, poli(etilenimina), polietilenglicol (PEG)-tiol, PEG-acrilato, acrilamida, N,N'-bis(acriloil)cistamina, PEG, óxido de polipropileno (PPO), ácido poliacrílico, poli(metacrilato de hidroxietilo) (PHEMA), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(N-isopropilacrilamida) (PNlPAAm), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), poli(ácido vinilsulfónico) (PVSA), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), bisacrilamida, diacrilato, dialilamina, trialamina, divinilsulfona, éter dialílico de dietilenglicol, diacrilato de etilenglicol, diacrilato de polimetilenglicol, diacrilato de polietilenglicol, trimetracrilato de trimetilopropoano, triacrilato de trimetilol etoxilado o tetracrilato de pentaeritritol etoxilado, o combinaciones de los mismos. Por lo tanto, por ejemplo, una combinación puede incluir un polímero y un reticulante, por ejemplo, polietilenglicol (PEG)-tiol/PEG-acrilato, acrilamida/N,N'-bis(acriloil)cistamina (BACy), o PEG/óxido de polipropileno (PPO).

En algunos ejemplos, un reticulante forma un enlace disulfuro en el polímero de la perla de hidrogel.

En algunos ejemplos, el reticulante es un reticulante reversible. En algunos ejemplos, un reticulante reversible es capaz de reticular reversiblemente el polímero de hidrogel y es capaz de desreticularse en presencia de una escisión. En algunos ejemplos, un reticulante se puede escindir por la presencia de un agente reductor, por temperatura elevada, o por un campo eléctrico. En algunos ejemplos, el reticulante reversible puede ser N,N'-bis(acriloil)cistamina, un reticulante reversible para geles de poliacrilamida, en donde un enlace disulfuro puede escindirse en presencia de un agente reductor adecuado. La puesta en contacto del reticulante con un agente reductor escinde los enlaces disulfuro del reticulante, rompiendo las perlas de hidrogel. Las perlas de hidrogel se degradan y liberan el contenido, tal como las genotecas de ADN retenidas en las mismas. En algunos ejemplos, el reticulante se escinde aumentando la temperatura a más de aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 °C. En algunos ejemplos, el reticulante se escinde poniendo en contacto las perlas de hidrogel con un agente reductor. En algunos ejemplos, los agentes reductores incluyen compuestos de fosfina, fosfinas solubles en agua, fosfinas que contienen nitrógeno y sales y derivados de las mismas, ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT) (isómeros cis y trans, respectivamente, de 2,3-dihidroxi-1,4-ditiolbutano), 2-mercaptoetanol o p-mercaptoetanol (BME), 2-mercaptoetanol o aminoetanetiol, glutatión, tioglicolato o ácido tioglicólico, 2,3-dimercaptopropanol, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris(hidroximetil)fosfina (THP) o ácido P[tris(hidroximetil)fosfina]propiónico (THPP), o una combinación de dos o más de los mismos. En algunos ejemplos, el reticulante puede ser N,N'-(1,2-dihidroxietileno)bisacrilamida, un reticulante reversible para geles de poliacrilamida, en donde un enlace 1,2-diol puede escindirse en presencia de un agente de oxidación tal como peryodato de sodio, y el enlace de amidometilol puede escindirse en presencia de un ácido fuerte, tal como un ácido periódico, o una base fuerte, tal como el hidróxido de sodio para degradar la perla. En algunos ejemplos, el reticulante se escinde aumentando la temperatura a más de aproximadamente 80, 85, 90, 95, o 100 °C.

En algunos ejemplos, los reactivos incluyen reactivos para procesar material genético, tales como reactivos para aislar ácidos nucleicos de una célula, para amplificar o secuenciar ácidos nucleicos, o para la preparación de genotecas de secuenciación. Los reactivos atraviesan los poros de las perlas de hidrogel, mientras que el material genético (tal como las moléculas de ácido nucleico diana) y las genotecas de secuenciación generadas a partir de las mismas se retienen dentro de las perlas de hidrogel.

En algunos ejemplos, reticular los polímeros de la perla de hidrogel forman una matriz de hidrogel que tiene poros (por ejemplo, una matriz de hidrogel porosa). Estos poros son capaces de retener material genético suficientemente grande dentro de la perla de hidrogel, pero permiten que materiales pequeños, tales como reactivos, pasen a través de los poros, entrando y saliendo así de las perlas de hidrogel. Los hidrogeles pueden tener cualquier tamaño de poro con un diámetro suficiente para permitir la difusión de los reactivos a través de la perla mientras retienen las moléculas de ácido nucleico encapsuladas. La expresión “tamaño de poro” también puede referirse a un diámetro promedio o a un diámetro eficaz promedio de una sección transversal de los poros, basándose en las mediciones de una pluralidad de poros. El diámetro eficaz de una sección transversal que no es circular es igual al diámetro de una sección transversal circular que tiene la misma área transversal que la de la sección transversal no circular. En algunos ejemplos, la perla de hidrogel puede hincharse cuando esta se hidrata. Los tamaños de los poros pueden cambiar dependiendo del contenido acuoso en el hidrogel de la perla de hidrogel. En algunos ejemplos, los poros tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm.

En algunos ejemplos, el tamaño de poro de las perlas de hidrogel se afina al variar la relación de la concentración entre el polímero y la concentración de reticulante. En algunos ejemplos, la relación entre el polímero y el reticulante es de 30:1,25:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1,4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, o 1:30, o una relación dentro de un rango definido por dos relaciones cualquiera de las mencionadas anteriormente. En algunos ejemplos, en la matriz polimérica pueden injertarse funciones adicionales, tales como cebadores de ADN, o grupos químicos con carga, para satisfacer las necesidades de las diferentes aplicaciones.

Se puede utilizar cualquier método apropiado para fabricar las perlas de hidrogel que contienen las moléculas de ácido nucleico encapsuladas.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel se preparan mediante emulsión asistida por vórtice. Como se utiliza en la presente memoria, la emulsión asistida por vórtice se refiere a la agitación de vórtice de un polímero o monómero de hidrogel con moléculas de ácido nucleico largas en un recipiente, tal como en un tubo, vial, o recipiente de reacción. Los componentes se mezclan, por ejemplo, mediante agitación o agitación manual o mecánica.

En algunos ejemplos, las perlas se preparan mediante técnicas de flujo microfluídico. El flujo microfluídico incluye el uso de un dispositivo microfluídico para la generación asistida de emulsiones de gel, tal como se muestra en la figura 2. En algunas implementaciones, el dispositivo microfluídico incluye microcanales configurados para producir una perla de hidrogel de un tamaño deseado y configurados para encapsular una cantidad seleccionada de material genético (tal como una única célula o una cantidad predeterminada de moléculas de ácido nucleico diana) por perla. Además del tamaño del dispositivo microfluídico y el ancho de los canales, el caudal del canal acuoso y el canal de fluido inmiscible también pueden afectar al tamaño de las perlas de hidrogel. En algunos ejemplos, el dispositivo microfluídico tiene una altura de aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190 o aproximadamente 200 pm, o una altura dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, el dispositivo microfluídico incluye uno o más canales. En algunos ejemplos, el dispositivo microfluídico incluye un canal para una corriente acuosa y un canal para un fluido inmiscible, tal como un aceite. En algunos ejemplos, el ancho del uno o más canales es idéntico. En algunos ejemplos, el ancho del uno o más canales es diferente. En algunos ejemplos, el ancho del uno o más canales es de aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, o aproximadamente 150 pm, o un ancho dentro de un rango definido por dos de los valores antes mencionados. En algunos ejemplos, el ancho del canal acuoso es de aproximadamente 75 pm. En algunos ejemplos, el ancho del canal de fluido inmiscible es de aproximadamente 78 pm. Son posibles otros valores de ancho ya que el ancho puede variar para ajustar con precisión el tamaño de la perla. Además del tamaño del dispositivo microfluídico y el ancho de los canales, el caudal del canal acuoso y del canal de fluido inmiscible también afecta al tamaño de las perlas de hidrogel. En algunos ejemplos, el caudal de la solución en el canal de fase acuosa es de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140 o aproximadamente 150 pl/min, o una velocidad dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, el caudal del fluido inmiscible en el canal de fluido inmiscible es de aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 225, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375 o aproximadamente 400 pl/min, o una velocidad dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, la solución en la fase acuosa incluye un polímero de hidrogel, un reticulante y material genético, que fluye a través del canal acuoso hacia un fluido inmiscible, tal como un aceite portador, a una velocidad de flujo inferior a la velocidad de flujo del fluido inmiscible, formando de este modo gotitas. En algunos ejemplos, las gotículas de hidrogel que contienen material genético se formulan en una distribución de tamaño uniforme. En algunos ejemplos, el tamaño de las perlas de hidrogel se afina ajustando el tamaño del dispositivo microfluídico, el tamaño de uno o más canales, o el caudal de cualquiera o ambos de la solución acuosa o líquido inmiscible. En algunos ejemplos, la perla de hidrogel resultante tiene un diámetro que varía de 2 a 150 pm, por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, o aproximadamente 150 pm, o un diámetro dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados.

En algunos ejemplos, el tamaño y la uniformidad del material genético que encapsula las perlas de hidrogel pueden controlarse además poniendo en contacto el polímero de hidrogel antes de la formación de las perlas con un modificador fluídico, tal como con un alcohol, incluido el alcohol isopropílico. En ausencia de alcohol isopropílico, las perlas se forman con un diámetro mayor que las perlas formadas en presencia de alcohol isopropílico. El alcohol isopropílico influye en la propiedad fluídica del polímero de hidrogel, lo que permite la modulación de las perlas de hidrogel.

En otro ejemplo, la perla de hidrogel contiene un núcleo hueco y una capa exterior, en donde el material genético (tal como moléculas de ácido nucleico diana) y/o las genotecas de secuenciación están contenidos en el núcleo hueco (véanse,p. ej.,las figuras 9A-9C). El diámetro del núcleo hueco está en el rango de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 75 % del diámetro de la perla de hidrogel. La perla de hidrogel que contiene el núcleo hueco y la cubierta exterior se puede fabricar, por ejemplo, encapsulando una capa de hidrogel interna en una capa de hidrogel externa y, posteriormente, degradando selectivamente la capa de hidrogel interna, pero no la capa de hidrogel externa. La capa de hidrogel interna es una perla de hidrogel que contiene el material genético (tal como molécula de ácido nucleico diana) y/o las genotecas de secuenciación, por ejemplo, como se describió anteriormente. La capa de hidrogel interna se despolimeriza utilizando un método que no despolimeriza la capa de hidrogel externa para generar la perla de hidrogel hueca. En un ejemplo, la capa interna está hecha de agarosa y se puede despolimerizar calentándola a 60 °C y la capa externa de hidrogel está hecha de acrilamida con un reticulante químicamente reversible y es resistente a la despolimerización a 60 °C. En otro ejemplo, tanto la capa interior como la exterior están hechas de acrilamida, pero se utilizan productos químicos reticulantes ortogonales para las dos capas. Por ejemplo, el reticulante de la capa interna se escinde mediante un reactivo oxidante tal como el peryodato de sodio y el reticulante de la capa externa se escinde mediante un reactivo reductor tal como el DTT. La despolimerización de la capa interna, pero no de la capa externa, produce la perla de hidrogel con el núcleo hueco y la cubierta exterior, donde el material genético y/o las genotecas de secuenciación están contenidas en el núcleo hueco. El núcleo interno hueco proporciona un medio acuoso para una reacción enzimática y química homogénea en el ácido nucleico encapsulado.

En algunos ejemplos, la cantidad de material genético (tal como molécula de ácido nucleico diana) dentro de una perla se puede controlar diluyendo o concentrando el material genético dentro de la muestra introducida. La muestra que incluye el material genético se mezcla con el polímero de hidrogel, y el polímero de hidrogel que contiene el material genético se somete a una emulsión asistida por vórtice o a una emulsión asistida por flujo microfluídico como se describe en la presente memoria.

Las perlas de hidrogel pueden incluir cualquier cantidad de material genético que sea apropiada para los métodos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, en las perlas de hidrogel se puede encapsular cualquier número adecuado de moléculas de ácido nucleico diana de cualquier longitud adecuada. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico encapsuladas tienen una longitud de hasta aproximadamente 3 Mbases. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-1000 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de aproximadamente 1000 a aproximadamente 500.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1 1000 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 100.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-1000 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-1000 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 50.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-1000 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 20.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 500.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 100.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 50.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 1-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 20.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 10-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 500.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 10-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 100.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 10-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 10-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 50.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 10-100 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 20.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 50-150 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 500.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 50-150 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 1000 a 100.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 50-150 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 50-150 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 50.000 a 150.000 nucleótidos. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel encapsulan un promedio de 50-150 moléculas de ácido nucleico diana que tienen una longitud de 10.000 a 20.000 nucleótidos.

En algunos ejemplos, los transposones se unen a la molécula de ácido nucleico diana (p. ej., ADN genómico), mientras mantienen intacta la molécula de ácido nucleico diana antes de encapsular la molécula nucleica diana en perlas de hidrogel. Esto se puede lograr, por ejemplo, haciendo reaccionar la molécula de ácido nucleico diana con la transposasa Tn5 en ausencia del ion de metal catalítico Mg2+ (p.ej.,como se describe en la publicación de patente estadounidense. 2015/0368638, de Gunderson y col., que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad). Una vez que el ADN pretagmentado se encapsula en las perlas de hidrogel, se capturan en la superficie de la celda de flujo y el regulador que contiene iones de Mg2+ se introduce en la celda de flujo para completar el proceso de tagmentación. A esto le sigue una reacción de extensión o llenado de huecos o ligamiento para completar la adición de adaptadores al fragmento de ADN para generar la genoteca de secuenciación. La barrera de difusión de líquidos se carga entonces en la celda de flujo y las perlas de hidrogel se degradan para liberar la genoteca de secuenciación de una manera espacialmente confinada para sembrarla en la celda de flujo de secuenciación.

En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico diana (p. ej., el ADN genómico) se tagmenta primero fuera de la celda de flujo utilizando perlas de tagmentación (p.ej.,0,5-20 pm de tamaño) que contienen transposones en la superficie de la perla (p.ej.,como se describe en la publicación de patente US-2014/0.194.324 de Gormley y col., que se incorpora como referencia en la presente memoria). El ADN tagmentado se une a las perlas de tagmentación después de la reacción de tagmentación. Estas perlas se encapsulan después en perlas de hidrogel más grandes utilizando un generador de gotas para su captura en una celda de flujo. La preparación de la genoteca continúa en la celda de flujo cargando una mezcla de PCR que contiene los cebadores P5/P7 para liberar el ADN tagmentado de las perlas de tagmentación y añadir adaptadores. En ejemplos alternativos, las perlas de tagmentación contienen secuencias adaptadoras completas unidas a los transposones que se unen a las perlas de tagmentación mediante hibridación y la genoteca se libera de las perlas de tagmentación mediante desnaturalización. La barrera de difusión de líquidos se carga entonces en la celda de flujo y las perlas de hidrogel se degradan para liberar la genoteca de secuenciación de una manera espacialmente confinada para sembrarla en la celda de flujo de secuenciación.

B. Captura de perlas de hidrogel en celdas de flujo

Las implementaciones proporcionadas en la presente memoria incluyen la captura de perlas de hidrogel que contienen material genético encapsulado en una celda de flujo de secuenciación. Las perlas de gel de hidrogel que contienen el material genético encapsulado se cargan en la celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel en la celda de flujo de secuenciación.

Se puede utilizar cualquier enfoque apropiado para capturar las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel se capturan en la celda de flujo por la restricción física de las perlas de hidrogel en la celda de flujo debido a una diferencia de tamaño entre el diámetro de las perlas de hidrogel y la altura de la celda de flujo. Por ejemplo, cuando el diámetro de las perlas de hidrogel es de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 % mayor (tal como aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 % o aproximadamente un 30 % mayor) que la altura de la celda de flujo para restringir las perlas en la celda de flujo. En algunos ejemplos, el diámetro de las perlas de hidrogel es aproximadamente un 10 % mayor que la altura de la celda de flujo para restringir las perlas en la celda de flujo, por ejemplo, el diámetro de las perlas de hidrogel es de aproximadamente 110 pm y la altura de la celda de flujo es de aproximadamente 100 pm. Esta diferencia de tamaño hace que las perlas de hidrogel se “ peguen” a la celda de flujo.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel se capturan en la celda de flujo mediante la interacción de un agente de captura en una superficie de la celda de flujo con la perla de hidrogel. Los agentes de captura de ejemplo para inmovilizar una perla de hidrogel en la superficie de una celda de flujo en los métodos descritos incluyen, sin limitarse a, un ácido nucleico de captura que es complementario de al menos una porción de un ácido nucleico vinculado al hidrogel o reticulante de la perla, o un miembro de un par de unión receptor-ligando (p.ej.avidina, estreptavidina, biotina, lectina, carbohidrato, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) capaz de unirse a un ácido nucleico diana (o resto de unión unido al mismo), o un reactivo químico capaz de formar un enlace covalente con un ácido nucleico diana (o resto de unión unido al mismo).

En algunos ejemplos, el agente de captura es un primer miembro de un par de unión específico que se encuentra en la celda de flujo de secuenciación y se une a un segundo miembro del par de unión específico ubicado en la perla de hidrogel. Por ejemplo, la celda de flujo se funcionaliza con un primer miembro de un par de unión específico y la perla de hidrogel se funcionaliza con el segundo miembro del par de unión específico.

En algunos ejemplos, el agente de captura está presente en ubicaciones segregadas en la celda de flujo. Por ejemplo, en los ejemplos en los que la celda de flujo es una celda de flujo con patrones que contiene una matriz de pocillos, el agente de captura puede estar presente en los pocillos de la celda de flujo modelada.

Adicionalmente, las celdas de flujo pueden contener estructuras que atrapan las perlas, tales como pilares/postes, vertederos, estructuras en forma de copa, para inmovilizar/capturar las perlas en una ubicación definida dentro de la celda de flujo. Estas estructuras de atrapamiento se pueden hacer mediante grabado en vidrio o silicona, o mediante fotolitografía de materiales fotomodelables.

C. Preparación de la genoteca de secuenciación integrada

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación se pueden preparar a partir del material genético (tal como las moléculas de ácido nucleico diana) encapsulado dentro de las perlas de hidrogel. Las genotecas de secuenciación se pueden preparar antes, durante o después de la captura de perlas en la superficie de la celda de flujo de secuenciación. En varios ejemplos, las genotecas de secuenciación pueden prepararse a partir del material genético encapsulado dentro de las perlas de hidrogel cuando las perlas se capturan en la superficie de la celda de flujo de secuenciación.

El material genético (tal como moléculas de ácido nucleico diana) encapsulado dentro de una perla de hidrogel se pone en contacto con uno o más reactivos para la preparación de las genotecas de secuenciación. Las genotecas de secuenciación se conservan dentro de las perlas de hidrogel y los reactivos pueden pasar a través de los poros de las perlas de hidrogel. Por lo tanto, las perlas de hidrogel proporcionan un microambiente para reacciones controladas del material genético encapsulado, lo que permite una barrera para que los reactivos entren y salgan de las perlas de hidrogel, mientras que conservan las genotecas de secuenciación correspondientes dentro de las perlas. Todo el proceso de preparación de la genoteca de secuenciación se puede realizar dentro de las perlas de hidrogel con múltiples intercambios de reactivos a través del hidrogel poroso mientras se conservan los productos de la genoteca de secuenciación dentro de la matriz de hidrogel.

En varios ejemplos, la preparación de las genotecas de secuenciación incluye fragmentar las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel y añadir adaptadores que incluyen secuencias de nucleótidos universales a los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico diana. Se puede utilizar cualquier método apropiado para fragmentar las moléculas de ácido nucleico diana y añadir los adaptadores. Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico diana que están unidos a uno o más adaptadores se denominan “ fragmentos adaptados” . Los fragmentos adaptados de las moléculas de ácido nucleico diana en cada perla proporcionan colectivamente una genoteca de ácidos nucleicos que representan las moléculas de ácido nucleico diana de esa perla que pueden inmovilizarse y después secuenciarse.

En varios ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana se someten a un procedimiento de tagmentación dentro de las perlas de hidrogel para la fragmentación y la adición de adaptadores. En un ejemplo no limitativo, el procedimiento de etiquetado se realiza utilizando los protocolos y reactivos de etiquetado Nextera™ (Illumina, San Diego, CA). Las reacciones de tagmentación combinan la fragmentación aleatoria y el ligamiento del adaptador en una única etapa para aumentar la eficiencia del proceso de preparación de la genoteca de secuenciación. El resultado de la fragmentación es una población de fragmentos de las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas en la perla de hidrogel que incluyen secuencias de las moléculas de ácido nucleico diana originales de la perla de hidrogel unidas a uno o más adaptadores. En varias implementaciones, los fragmentos incluyen al menos una cadena que tiene el índice de transposasa. La enzima transposasa se elimina por lavado y se pueden añadir secuencias adicionales a los extremos de los fragmentos adaptados, por ejemplo, mediante PCR, ligamiento, o cualquier otra metodología adecuada.

Algunos ejemplos pueden incluir el uso de una transposasa Tn5 hiperactiva y un sitio de reconocimiento de transposasa de tipo Tn5 (véase, p.ej.,Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)), o una transposasa MuA y un sitio de reconocimiento de transposasa Mu que comprende secuencias terminales R1 y R2 (véase, p. ej., Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983 y Savilahti, H, y col., EMBO J., 14: 4893, 1995). También se pueden utilizar secuencias de Tn5 Mosaic End (ME).

Otros ejemplos de sistemas de trasposición que pueden utilizarse con determinados ejemplos de los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen Tn552 (véase, p.ej.,Colegio y col., J. Bacteriol, 183:2384-8, 2001 y Kirby y col., Mol. Microbiol, 43:173-86, 2002,), Tyl (véase, p.ej.,Devine y Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994 y la publicación internacional WO 95/23875), Transposón Tn7 (véase, p.ej.,Craig, Science. 271:1512, 1996, y Craig, reseña en: Curr Top Microbiol Immunol, 204:27-48, 1996), Tn/O y IS 10 (véase, p.ej.,Kleckner y col., Curr Top Microbiol Immunol, 204:49-82, 1996), la transposasa Mariner (véase, p.ej.,Lampe, y col., EMBO J., 15: 5470-9, 1996), Tel (véase, p.ej.,Plasterk, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996), elemento P (véase, p.ej.,Gloor, Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004), Tn3 (véase p.ej.Ichikawa y Ohtsubo, J. Biol. Chem. 265:18829-32, 1990), secuencias de inserción bacterianas (véase p.ej.,Ohtsubo y Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1-26, 1996), retrovirus (véase p.ej.,Brown, y col., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989), y retrotransposón de levadura (véase p.ej.,Boeke y Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989). Algunos ejemplos adicionales incluyen IS5, TnIO, Tn903, IS911, y versiones modificadas por ingeniería genética de enzimas de la familia de las transposasas (véase, p.ej.,Zhang y col., PLoS Genet. 5:el000689, 2009, y Wilson y col., J. Microbiol. Methods 71:332-5, 2007).

Se proporcionan ejemplos no limitativos de secuencias de transposones útiles con los métodos descritos en la presente memoria en la publicación de solicitud de patente US-2010/0120098, publicación de solicitud de patente US-2012/0208705, publicación de solicitud de patente US-2012/0208724 y publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/061832. En algunos ejemplos, una secuencia transposónica incluye un primer sitio de reconocimiento de transposasa, un segundo sitio de reconocimiento de transposasa, y una secuencia de índice presente entre los dos sitios de reconocimiento de transposasa.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana se fragmentan utilizando métodos apropiados y, posteriormente, los adaptadores se ligan a los fragmentos para la preparación de la genoteca de secuenciación. Un método de ejemplo incluye desfosforilar los extremos 5' de fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos diana para impedir la formación de concatámeros en etapas de ligamiento posteriores; ligar los primeros adaptadores a los extremos 3' de las dianas desfosforiladas utilizando una ligasa, en la que se bloquean los extremos 3' de los primeros adaptadores; volver a fosforilar los extremos 5' de las dianas ligadas; ligar un segundo adaptador a los extremos 5' de las dianas desfosforiladas utilizando la ligasa monocatenaria, en la que los extremos 5' de los segundos adaptadores no están fosforilados.

Otro ejemplo incluye la digestión parcial de los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico con una exonucleasa 5' para formar un ácido nucleico bicatenario con salientes 3' monocatenarios. Un adaptador que contiene un grupo bloqueante 3' puede ligarse a los extremos 3' del ácido nucleico bicatenario con salientes 3'. El ácido nucleico bicatenario con salientes 3' con adaptadores ligados puede deshibridarse para formar ácidos nucleicos monocatenarios. Un adaptador que contiene un extremo 5' no fosforilado puede ligarse al extremo 5' del ácido nucleico monocatenario.

Como un método para desfosforilar ácidos nucleicos, tales como el nucleótido 5' de un ácido nucleico, se incluye poner en contacto un ácido nucleico con una fosfatasa. Como ejemplos de fosfatasas se incluyen fosfatasa intestinal de ternera, fosfatasa alcalina de camarón, fosfatasa antártica, y fosfatasa alcalina APEX (Epicentre).

Como un método para ligar ácidos nucleicos se incluye poner en contacto los ácidos nucleicos con una ligasa. Como ejemplos de ligasas se incluyen ARN ligasa 1 de T4, ARN ligasa 2 de T4, ligasa de RtcB, ARN ligasa de Methanobacterium, y ARN ligasa de TS2126 (Circligasa™).

Como un método para fosforilar ácidos nucleicos, tal como el nucleótido 5 'de un ácido nucleico, se incluye poner en contacto un ácido nucleico con una cinasa. Como ejemplo de cinasa se incluye la polinucleótido cinasa<t>4.

En varias implementaciones, los adaptadores que están unidos a los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico diana incluyen secuencias para la posterior siembra, secuenciación, y análisis de las lecturas de secuencia relacionadas con los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico diana. Los adaptadores pueden incluir, por ejemplo, secuencias de captura, sitios de unión a cebadores de secuenciación, sitios de unión a cebadores de amplificación e índices.

En varios ejemplos, los adaptadores incluyen secuencias de nucleótidos universales para la captura de las moléculas de ácido nucleico de la genoteca de secuenciación en la superficie de una celda de flujo de secuenciación que contiene un césped o pozos que tienen los correspondientes oligonucleótidos de captura que se unen a la secuencia de nucleótidos universal. Las secuencias universales presentes en los extremos de fragmentos pueden utilizarse para la unión de secuencias de anclaje universales que pueden servir como cebadores y extenderse en una reacción de amplificación. En varias implementaciones, se utilizan dos cebadores universales diferentes. Un cebador se hibrida con secuencias universales en el extremo 3' de una cadena de los fragmentos de ácido nucleico indexado, y un segundo cebador se hibrida con secuencias universales en el extremo 3' de la otra cadena de los fragmentos de ácido nucleico indexado. Por lo tanto, la secuencia de anclaje de cada cebador puede ser diferente. Cada uno de los cebadores adecuados puede incluir secuencias universales adicionales, tal como una secuencia de captura universal y otra secuencia índice. Debido a que cada cebador puede incluir un índice, esta etapa da como resultado la adición de una o dos secuencias índice, que pueden ser los complementos inversos entre sí, o pueden tener secuencias que no son los complementos inversos entre sí.

Los fragmentos adaptados pueden tener cualquier tamaño apropiado para las etapas posteriores de siembra y secuenciación. En algunos ejemplos, los fragmentos adaptados tienen una longitud de 150 a 400 nucleótidos, tal como de 150 a 300 nucleótidos.

En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico diana, o fragmentos o fragmentos adaptados de las mismas, pueden amplificarse dentro de las perlas de hidrogel según cualquier metodología de amplificación adecuada.

En algunos ejemplos, la amplificación es una amplificación isotérmica. Los ejemplos de métodos de amplificación isotérmica que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA, por sus siglas en inglés), que es una técnica ampliamente utilizada para amplificar cantidades bajas de ADN y se ejemplifica, por ejemplo, en Dean y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002) o la amplificación de ácido nucleico de desplazamiento de cadena isotérmica ilustrada, por ejemplo, por la patente US-6.214.587.

En ejemplos adicionales, la amplificación puede incluir, pero no se limita a, la PCR, la SDA, la TMA y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), como se describe en la patente US-8.003.354. Los métodos de amplificación anteriores pueden emplearse para amplificar uno o más ácidos nucleicos de interés. Por ejemplo, para amplificar ácidos nucleicos encapsulados, puede utilizarse PCR, incluyendo PCR múltiple, SDA, TMA, NASB<a>y métodos similares. En algunos ejemplos, en la reacción de amplificación se incluyen cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés.

En algunos ejemplos, el método de amplificación puede incluir amplificación de sonda de ligamiento o reacciones de ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA, por sus siglas en inglés) que contienen cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés. En algunos ejemplos, el método de amplificación puede incluir una reacción de extensión-ligamiento de cebador que contenga cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés, y que son capaces de pasar a través de los poros de hidrogel. Como ejemplo no limitativo de extensión de cebadores y cebadores de ligamiento que pueden diseñarse específicamente para amplificar un ácido nucleico de interés, la amplificación puede incluir cebadores utilizados para el ensayo GoldenGate (Illumina, Inc., San Diego, Calif.) como se ilustra en las patentes US-7.582.420 y US-7.611.869.

Otro método de amplificación de ácidos nucleicos que es útil en la presente descripción es la PCR con marcaje que utiliza una población de cebadores de dos dominios que tienen una región 5' constante seguida por una región 3' aleatoria como se describe, por ejemplo, en Grothues y col. Nucleic Acids Res. 21(5): 1321-2 (1993). Las primeras rondas de amplificación se llevan a cabo para permitir una multitud de iniciaciones en ADN desnaturalizado por calor basadas en hibridación individual de la región 3' sintetizada al azar. Debido a la naturaleza de la región 3', se contempla que los sitios de iniciación sean aleatorios en todo el genoma. Posteriormente, los cebadores no unidos pueden retirarse y puede producirse una replicación adicional utilizando cebadores complementarios a la región 5' constante.

En algunos ejemplos, los fragmentos adaptados encapsulados dentro de las perlas de hidrogel pueden modificarse además o hacerse reaccionar en preparación para la siembra en la celda de flujo de secuenciación y la secuenciación. En algunos ejemplos, los fragmentos adaptados se hacen reaccionar con un oligonucleótido de captura que tiene especificidad para los fragmentos adaptados (por ejemplo, uniéndose a una secuencia adaptadora), y los oligonucleótidos de captura pueden inmovilizarse sobre una superficie de un sustrato sólido. Por ejemplo, el oligonucleótido de captura puede incluir un primer miembro de un par de unión universal, y en donde un segundo miembro del par de unión está inmovilizado sobre una superficie de un sustrato sólido.

D. Degradación de perlas y siembra de genotecas de secuenciación

Las perlas de hidrogel se degradan mientras están rodeadas por una barrera de difusión de líquidos para liberar las genotecas de secuenciación de las perlas y sembrar las genotecas de secuenciación en la celda de flujo de secuenciación. La barrera de difusión de líquidos se carga en la celda de flujo de secuenciación para llenar el volumen vacío entre las perlas de hidrogel y rodear las perlas de hidrogel. Rodear las perlas de hidrogel capturadas con la barrera de difusión de líquidos inhibe la difusión de las genotecas de secuenciación fuera del volumen de las perlas cuando la perla se degrada. Tras la degradación de las perlas, las genotecas de secuenciación encapsuladas se transportan a la superficie de la celda de flujo, donde son capturadas. Por lo tanto, en presencia de la barrera de difusión de líquidos, la siembra en la celda de flujo se produce muy cerca de la huella de cada perla de hidrogel.

Una perla de hidrogel individual contiene una genoteca de secuenciación producida a partir de las moléculas de ácido nucleico diana dentro de la perla. Por consiguiente, la genoteca de secuenciación sembrada a partir de una única perla de hidrogel corresponde a las moléculas de ácido nucleico diana que se encapsularon dentro de esa perla. Debido a que la siembra se produce muy cerca de la huella en la celda de flujo de cada perla de hidrogel, la genoteca de secuenciación sembrada de cada perla se segrega espacialmente (o “ indexa” ) en la celda de flujo basada en la ubicación de la perla.

En algunos ejemplos, la barrera de difusión de líquidos puede ser un líquido hidrófobo, tal como aceite, por ejemplo, aceite mineral o aceite de silicona, o aceite perfluorado, o una combinación de dos o más de los mismos. En otros ejemplos, la barrera de difusión de líquidos puede ser una solución viscosa que impide la difusión de genotecas de ADN tales como reguladores que contienen polímeros tales como polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, dextrano plurónico, sacarosa, y similares. En algunos ejemplos, se puede utilizar un material sensible a la temperatura como barrera contra líquidos. El material sensible a la temperatura es un líquido no viscoso a la temperatura de no siembra, y se puede cargar fácilmente en la celda de flujo y ocupar el espacio intersticial entre las perlas de hidrogel. Al calentarse a la temperatura de siembra, el material se solidifica para formar una barrera física y evitar la difusión de la genoteca. En algunos ejemplos, el material sensible a la temperatura puede ser un material compuesto de nanopartículas de poli (N-isopropilacrilamida) u óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO)/laponita. En algunos ejemplos, la barrera de difusión de líquidos utilizada en las implementaciones descritas se compone de una combinación de dos o más de las barreras de difusión de líquidos descritas anteriormente.

Las perlas de hidrogel se pueden degradar utilizando cualquier método apropiado que no reduzca sustancialmente la eficacia de la barrera de difusión de líquidos para inhibir la difusión de las genotecas de secuenciación más allá del diámetro de las perlas de hidrogel. No es necesario que las perlas de hidrogel estén completamente degradadas para liberar las genotecas de secuenciación de las perlas y sembrar las genotecas de secuenciación en la celda de flujo de secuenciación. La degradación suficiente incluye un aumento de la porosidad de las perlas de hidrogel para permitir la difusión de las genotecas de secuenciación encapsuladas y el transporte de las genotecas de secuenciación a la superficie de la celda de flujo.

En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel se degradan aplicando suficiente calor a las perlas para romper la matriz de hidrogel y permitir la difusión de las genotecas de secuenciación dentro de la matriz de hidrogel degradada y la siembra de la genoteca de secuenciación en la superficie de la celda de flujo. En algunos ejemplos, el calor se puede aplicar a las perlas de hidrogel calentando la celda de flujo a aproximadamente 90 °C durante aproximadamente un período de tiempo suficiente (tal como 5 minutos) para degradar la matriz de hidrogel.

En los ejemplos en los que la matriz de hidrogel contiene un reticulante reversible, la matriz se puede degradar desreticulando la matriz con una cortadora apropiada. Por ejemplo, cuando el reticulante contiene enlaces disulfuro que reticulan los polímeros del hidrogel, la cortadora puede ser un agente reductor, tal como DTT. En algunos ejemplos, el reticulante contiene un enlace 1,2-diol que puede escindirse mediante un agente oxidante, una base fuerte o un ácido fuerte, tal como el peryodato de sodio y el ácido peryódico. En algunos ejemplos, el reticulante contiene un resto fotoescindible, cuya escisión desreticula la matriz de hidrogel. En tales ejemplos, la matriz de hidrogel puede exponerse a la luz de una longitud de onda apropiada para escindir la fracción fotoescindible y degradar la matriz de hidrogel.

En otro ejemplo, el agente reductor se activa mediante luz UV. Estas fracciones reductoras fotodegradables pueden estar presentes en la fase oleosa o pueden introducirse en la perla de hidrogel por difusión antes de la etapa de fusión.

Tras una degradación suficiente de las perlas, las genotecas de secuenciación encapsuladas se transportan a la superficie de la celda de flujo, donde son capturadas. Se puede utilizar cualquier enfoque apropiado para capturar las genotecas de secuenciación en la superficie de la celda de flujo.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación se capturan en la celda de flujo mediante la interacción de un agente de captura en la celda de flujo con los fragmentos adaptados de las genotecas de secuenciación.

En algunos ejemplos, el agente de captura es un primer miembro de un par de unión específico que se encuentra en la celda de flujo de secuenciación, y se une a un segundo miembro del par de unión específico ubicado en los fragmentos adaptados de la genoteca de secuenciación. Por ejemplo, la celda de flujo se funcionaliza con un primer miembro de un par de unión específico y los adaptadores de los fragmentos adaptados contienen el segundo miembro del par de unión específico.

En algunos ejemplos, el agente de captura, tal como un oligonucleótido de captura, se puede unir a la superficie de la celda de flujo de secuenciación. Por ejemplo, el agente de captura se puede unir a pocillos en la superficie de una celda de flujo con patrones. La unión puede realizarse a través de una estructura intermedia tal como una perla, partícula o gel. La unión de los agentes de captura a la superficie de una celda de flujo de secuenciación mediante un gel se ejemplifica en las celdas de flujo disponibles comercialmente en Illumina Inc. (San Diego, CA) o se describen en la patente WO 2008/093098, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

En ejemplos particulares, una celda de flujo con patrones contiene una superficie para unirse a genotecas de secuenciación preparadas modelando un material de soporte sólido con pocillos(p. ej.,micropocillos o nanopocillos), recubriendo el soporte con patrones con un material de gel (p.ej.PAZAM, SFA o variantes modificadas químicamente de los mismos, tal como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)] y puliendo el soporte recubierto con gel, por ejemplo, mediante pulido químico o mecánico, reteniendo de este modo el gel en los pocillos pero eliminando o inactivando sustancialmente todo el gel de las regiones intersticiales en la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores y de captura se pueden unir al material de gel para la captura y amplificación de las genotecas de secuenciación. Las genotecas de secuenciación pueden transportarse entonces a la superficie con patrones de modo que los fragmentos individuales adaptados de las genotecas siembren pocillos individuales mediante interacciones con cebadores unidos al material de gel; sin embargo, los fragmentos adaptados no ocuparán las regiones intersticiales entre los pocilios debido a la ausencia o inactividad del material de gel. La amplificación de los fragmentos adaptados quedará confinada a los pocillos ya que la ausencia o inactividad del gel en las regiones intersticiales entre los pocillos impide la migración hacia el exterior de la colonia de ácido nucleico en crecimiento. El proceso puede manufacturarse cómodamente, siendo escalable y utilizando métodos de micro o nanofabricación convencionales.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación sembradas pueden amplificarse antes de la secuenciación. Por ejemplo, las genotecas de secuenciación sembradas pueden amplificarse utilizando sitios cebadores en las secuencias adaptadoras y secuenciarse posteriormente utilizando sitios cebadores secuenciadores en las secuencias adaptadoras.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación sembradas se amplifican mediante amplificación en fase sólida. Los cebadores (tales como cebadores de captura) para la amplificación en fase sólida se inmovilizan preferiblemente mediante unión covalente de punto único al soporte sólido en o cerca del extremo 5' del cebador, dejando la porción específica del patrón del cebador libre para aparearse con su patrón análogo y el grupo hidroxilo 3' libre para la extensión del cebador. Para este fin, puede utilizarse cualquier medio de unión covalente adecuado. La química de unión elegida dependerá de la naturaleza del soporte sólido y de cualquier derivatización o funcionalización que se le aplique. El propio cebador puede incluir un resto, que puede ser una modificación química no nucleotídica, para facilitar la unión. En un ejemplo particular, el cebador puede incluir un nucleófilo que contenga azufre, tal como fosforotioato o tiosfosfato, en el extremo 5'. En el caso de hidrogeles de poliacrilamida de soporte sólido, este nucleófilo se unirá a un grupo de bromoacetamida presente en el hidrogel. Un medio más particular para unir cebadores y moldes a un soporte sólido es mediante la unión con 5' fosforotioato a un hidrogel que comprende acrilamida polimerizada y N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA), como se describe en la patente WO 05/065814.

Aunque la descripción comprende métodos de amplificación de “ fase sólida” en los que solo se inmoviliza un cebador de amplificación (el otro cebador generalmente está presente en solución libre), en algunos ejemplos se prefiere que el soporte sólido se proporcione tanto con los cebadores directos como con los cebadores inversos inmovilizados. En la práctica, habrá una “ pluralidad” de cebadores directos idénticos y/o una “ pluralidad” de cebadores inversos idénticos inmovilizados sobre el soporte sólido ya que el proceso de amplificación utiliza un exceso de cebadores para sustentar la amplificación. Por consiguiente, en la presente memoria, las referencias a cebadores directos e inversos deben interpretarse como que abarcan una 'pluralidad' de tales cebadores salvo que el contexto indique lo contrario.

La superficie de la celda de flujo de secuenciación puede incluir una pluralidad de cebadores que se utilizan para producir amplicones a partir de genotecas de secuenciación sembradas en la celda de flujo. En algunos ejemplos, los cebadores pueden tener una secuencia de cebado universal que es complementaria a una secuencia universal que está presente en una secuencia adaptadora ligada a cada ácido nucleico diana. En ejemplos particulares, la pluralidad de cebadores se puede unir al sitio de amplificación. Los cebadores se pueden unir a un sitio de amplificación como se ha expuesto anteriormente para capturar ácidos nucleicos.

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación sembradas pueden amplificarse utilizando metodologías de amplificación en grupo como se ilustra en las descripciones de las patentes US-7.985.565 y US-7.115.400. patentes US- US-7.985.565 y US-7.115.400 describen métodos de amplificación de ácido nucleico, que permiten que los productos de amplificación se inmovilicen sobre un soporte sólido para formar matrices compuestas por grupos o “ colonias” de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Cada grupo o colonia en tal matriz se forma a partir de una pluralidad de cadenas de polinucleótidos idénticas o sustancialmente idénticas inmovilizadas y una pluralidad de cadenas de polinucleótidos complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices así formadas se denominan generalmente en la presente descripción “ matrices agrupadas” . Los productos de reacciones de amplificación en fase sólida, tales como los descritos en las patentes US-7.985.565 y US-7.115.400 son los denominadas estructuras “ puente” formados por el emparejamiento de pares de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, inmovilizándose ambas cadenas sobre el soporte sólido en el extremo 5', preferiblemente mediante una unión covalente. Las metodologías de amplificación de grupos son ejemplos de métodos en donde para producir amplicones inmovilizados se utiliza un molde de ácido nucleico inmovilizado.

Se apreciará que puede estar presente una pequeña cantidad de contaminación en una colonia o grupo sin afectar negativamente a una reacción de secuenciación posterior. Niveles de contaminación ejemplares que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, aunque no de forma limitativa, como máximo 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % o 25 % de amplicones contaminantes.

También pueden utilizarse otras metodologías adecuadas para producir amplicones inmovilizados a partir de fragmentos de ADN inmovilizados producidos según los métodos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, pueden formarse uno o más grupos o colonias mediante PCR en fase sólida si uno o ambos cebadores de cada par de cebadores de amplificación se inmovilizan. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos encapsulados se amplifican dentro de las perlas y, a continuación, se depositan en una matriz o en un soporte sólido en un grupo.

E. Multiplexación de muestras

En algunos ejemplos, los métodos de indexación de muestras se pueden utilizar para interrogar muestras de ácidos nucleicos múltiples en una sola celda de flujo de secuenciación. Se puede utilizar cualquier enfoque de multiplexación apropiado.

Por ejemplo, en algunos ejemplos, para generar información enlazada de lectura larga a partir de múltiples muestras en el mismo carril de celdas de flujo, se utilizan diferentes transposones indexados para identificar los parches de hidrogel de cada muestra. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico diana pueden tagmentarse antes de la captura de las perlas en la celda de flujo. Diferentes muestras de ácido nucleico (encapsuladas en perlas de hidrogel como se describe en la presente memoria) se etiquetan por separado utilizando diferentes transposones indexados y, posteriormente, se cargan en la celda de flujo para completar la secuenciación, la preparación de la genoteca y la liberación de la genoteca a partir de las perlas de hidrogel. Esto proporciona parches sembrados que contienen diferentes secuencias de índice correspondientes a diferentes muestras que pueden separarse entre sí durante el análisis de lectura posterior a la secuenciación.

Alternativamente, las perlas de hidrogel de cada muestra se procesan secuencialmente en la celda de flujo. Las perlas que contienen una primera muestra se cargan en la celda de flujo y los ácidos nucleicos diana se tagmentan utilizando un transposón indexado. Una vez que la genoteca de la primera muestra se libera de la perla y se siembra en la celda de flujo, se carga una segunda ronda de perlas de hidrogel que contienen una segunda muestra de ácido nucleico diana en la celda de flujo y se tagmentan utilizando un transposón indexado distinto para generar una segunda genoteca indexada que se libera de manera espacialmente limitada para sembrarla en la superficie de la celda de flujo. Esto proporciona parches sembrados que contienen diferentes secuencias de índice de ADN correspondientes a diferentes muestras que pueden separarse entre sí durante el análisis de lectura posterior a la secuenciación.

En un enfoque adicional para la multiplexación de muestras, las moléculas de ácido nucleico exógenas pueden añadirse a diferentes muestras de ácido nucleico diana en la etapa de encapsulación de las perlas. La molécula de ácido nucleico exógena puede ser, por ejemplo, ADN bicatenario o monocatenario. Los ejemplos no limitantes de ADN exógeno que se pueden añadir a las muestras como marcador incluyen ADN Phi-X, A1, A3 o A3. Se procesan múltiples muestras en forma de perlas de hidrogel por separado (cada muestra diferente contiene un marcador exógeno con picos distintos) y, a continuación, las perlas se agrupan para cargarlas en la celda de flujo. Tras la tagmentación y la preparación de la genoteca y la siembra en la celda de flujo, cada parche de agrupación resultante de la genoteca sembrada contiene agrupaciones o lecturas de la muestra de ADN enriquecida, que se pueden utilizar para identificar el origen de la muestra durante el análisis de lectura.

En algunos ejemplos, para maximizar la utilización de la celda de flujo para la generación de datos de secuenciación, se puede añadir una etapa adicional al flujo de trabajo después de la siembra de la genoteca de secuenciación a partir de las perlas de hidrogel. En esta etapa, el espacio intersticial entre las huellas de las perlas de hidrogel tiene una baja densidad de genoteca sembrada. Para utilizar este espacio intersticial, se puede realizar una etapa de siembra adicional utilizando una genoteca de lectura corta normal de la misma muestra o de diferentes semillas de la genoteca en las regiones vacías de los espacios intersticiales y dentro del parche de hidrogel. Esta genoteca de lectura corta contiene un índice de ADN diferente para separar las lecturas de las genotecas vinculadas de lectura larga y lectura corta.

F. Secuenciación

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación sembradas se secuencian en total o en parte. Los las genotecas de secuenciación sembradas pueden secuenciarse según cualquier metodología de secuenciación adecuada, tal como secuenciación directa, incluyendo SBS, secuenciación por ligamiento, secuenciación por hibridación, secuenciación de nanoporos y similares. Los ejemplos no limitativos de métodos para determinar la secuencia de fragmentos de ácido nucleico inmovilizados se describen, por ejemplo, en Bignell y col. (US-8.053.192), Gunderson y col. (WO2016/130704), Shen y col. (US-8.895.249) y Pipenburg y col. (US-9.309.502.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden utilizarse junto con una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas particularmente aplicables son aquellas en donde los ácidos nucleicos se fijan en ubicaciones fijas en una matriz de modo que sus posiciones relativas no cambien, y en donde se obtienen imágenes de la matriz de manera repetida. Son particularmente aplicables las implementaciones en las que se obtienen imágenes en diferentes canales de color, por ejemplo, coincidiendo con diferentes marcadores utilizados para distinguir un tipo de base de nucleótido de otro. En algunos ejemplos, el proceso para determinar la secuencia de nucleótidos de un fragmento puede ser un proceso automatizado.

Una metodología de secuenciación es SBS. En SBS, para determinar la secuencia de nucleótidos en el molde, se controla la extensión de un cebador de ácido nucleico a lo largo de un molde de ácido nucleico (p.ej.,un ácido nucleico o amplicón del mismo). El proceso químico subyacente puede ser la polimerización (p.ej.,catalizada por una enzima polimerasa). En una implementación particular de SBS basada en polimerasa, se añaden nucleótidos etiquetados con fluorescencia a un cebador (extendiéndose de ese modo el cebador) de una manera dependiente del molde, de modo que, para determinar la secuencia del molde, pueda utilizarse la detección del orden y tipo de nucleótidos añadidos al cebador.

En un ejemplo, un monómero nucleotídico incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés) o ácidos nucleicos con puente (BNA, por sus siglas en inglés). El uso de los LNA o BNA en un monómero nucleotídico aumenta la fuerza de hibridación entre un monómero nucleotídico y una secuencia cebadora de secuenciación presente en un fragmento inmovilizado.

La SBS puede utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador o aquellos que carecen de restos terminadores. Los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación utilizando nucleótidos marcados con Y-fosfato, como se expone con más detalle en la presente memoria. En los métodos en los cuales se utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores, el número de nucleótidos añadidos en cada ciclo es generalmente variable y depende de la secuencia molde y del modo de suministro de los nucleótidos. Para las técnicas de SBS que utilizan monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador, el terminador puede ser efectivamente irreversible en las condiciones de secuenciación utilizadas como es el caso de la secuenciación tradicional de Sanger que utiliza didesoxinucleótidos, o el terminador puede ser reversible como es el caso de los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las técnicas de SBS pueden utilizar monómeros de nucleótidos que tengan un resto marcador o que carezcan de este. Por consiguiente, pueden detectarse acontecimientos de incorporación basándose en una característica del marcador, tal como fluorescencia del marcador; una característica del monómero nucleotídico, tal como la carga o el peso molecular; un subproducto de incorporación del nucleótido, tal como la liberación de pirofosfato; o similares. En las implementaciones, donde están presentes dos o más nucleótidos diferentes en un reactivo de secuenciación, los diferentes nucleótidos pueden distinguirse entre sí o, como alternativa, los dos o más marcadores diferentes pueden ser indistinguibles según las técnicas de detección que se utilizan. Por ejemplo, los diferentes nucleótidos presentes en un reactivo de secuenciación, pueden tener diferentes marcadores y se pueden distinguir usando ópticas apropiadas como se ilustra mediante los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Algunos ejemplos incluyen técnicas de pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares a la cadena naciente (Ronaghi y col., Analytical Biochemistry, 242(1):84-9, 1996, Ronaghi, Genome Res., 11(1 ):3-11, 2001, Ronaghi, Uhlen y Nyren, Science, 281 (5375), 363, 1998 y las patentes US-6.210.891; US-6.258.568 y US-6.274.320, cada una se incorpora por referencia en la presente descripción en su totalidad). En la pirosecuenciación, el PPi (pirofosfato inorgánico) liberado puede detectarse convirtiéndolo inmediatamente en adenosín trifosfato (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se detecta mediante fotones producidos por luciferasa. Los ácidos nucleicos que se van a secuenciar se pueden fijar a las casillas de una matriz y se pueden obtener imágenes de la matriz para capturar las señales quimioluminiscentes que se producen debido a la incorporación de nucleótidos en las casillas de la matriz. Puede obtenerse una imagen después de que la matriz se trate con un tipo de nucleótido particular(p. ej.,A, T, C o G). Las imágenes obtenidas después de la adición de cada tipo de nucleótido diferirán con respecto a las casillas de la matriz que se detecten. Estas diferencias en la imagen reflejan el contenido de secuencia diferente de las casillas en la matriz. Sin embargo, las ubicaciones relativas de cada casilla permanecerán sin cambios en las imágenes. Las imágenes pueden almacenarse, procesarse y analizarse utilizando los métodos expuestos en la presente descripción. Por ejemplo, las imágenes obtenidas después del tratamiento de la matriz con cada tipo de nucleótido diferente se pueden manejar de la misma manera que se ilustra en la presente descripción para imágenes obtenidas de diferentes canales de detección para métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles.

En otro tipo de ejemplo de SBS, la secuenciación del ciclo se logra mediante la adición escalonada de nucleótidos terminadores reversibles que contienen, por ejemplo, un marcador de colorante escindible o fotoblanqueable como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 04/018497, WO 91/06678, WO 07/123.744 y en la patente US-7.057.026. La disponibilidad de terminadores marcados con fluorescencia, en los cuales se puede invertir tanto la terminación como escindir el marcador fluorescente, facilita la secuenciación eficaz de la terminación cíclica reversible (CRT). Las polimerasas también pueden diseñarse conjuntamente para incorporar y extenderse eficazmente a partir de estos nucleótidos modificados.

En algunas implementaciones de secuenciación basadas en terminadores reversibles, los marcadores no inhiben sustancialmente la extensión en las condiciones de reacción de SBS. Sin embargo, los marcadores de detección pueden eliminarse, por ejemplo, mediante escisión o degradación. Las imágenes pueden capturarse después de la incorporación de marcadores en las casillas de ácidos nucleicos de la matriz. En ejemplos particulares, cada ciclo implica el suministro simultáneo de cuatro tipos de nucleótidos diferentes a la matriz y cada tipo de nucleótido tiene un marcador espectralmente distinto. A continuación, se pueden obtener cuatro imágenes, cada una de las cuales utiliza un canal de detección que es selectivo para uno de los cuatro marcadores diferentes. Como alternativa, se pueden añadir secuencialmente diferentes tipos de nucleótidos y se puede obtener una imagen de la matriz entre cada etapa de adición. En tales ejemplos, cada imagen mostrará casillas de ácido nucleico que han incorporado nucleótidos de un tipo particular. En las diferentes imágenes habrá o no diferentes casillas debido al diferente contenido de secuencia de cada casilla. Sin embargo, la posición relativa de las casillas permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de tales métodos de SBS con terminador reversible pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se expone en la presente descripción. Después de la etapa de captura de imágenes, los marcadores se pueden eliminar y los restos terminadores reversibles se pueden eliminar para los ciclos posteriores de adición y detección de nucleótidos. La eliminación de los marcadores después de que se hayan detectado en un ciclo particular y antes de un ciclo posterior, puede proporcionar la ventaja de reducir la señal de fondo y la diafonía entre ciclos. En la presente memoria, se exponen ejemplos de marcadores útiles y de métodos de eliminación.

En ejemplos particulares, algunos o todos los monómeros de nucleótidos pueden incluir terminadores reversibles. En tales ejemplos, los terminadores reversibles/fluoróforos escindibles pueden incluir fluoróforos ligados al resto de ribosa mediante un enlace éster 3' (véase,p. ej.,Metzker, Genome Res., 15:1767-1776, 2005). Otros enfoques han separado la química del terminador de la escisión del marcador de fluorescencia (véase, p.ej.,Ruparel y col., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7, 2005). Ruparel ycol.,describieron el desarrollo de terminadores reversibles que utilizaban un pequeño grupo alilo 3' para bloquear la extensión, pero podían desbloquearse fácilmente mediante un tratamiento corto con un catalizador de paladio. El fluoróforo se unió a la base mediante un enlazador fotoescindible que podía escindirse fácilmente mediante una exposición de 30 segundos a luz UV de longitud de onda larga. Por lo tanto, como un enlazador escindible, puede utilizarse la reducción de disulfuro o la fotoescisión. Otro enfoque de la terminación reversible es el uso de la terminación natural que se produce después de la colocación de un colorante voluminoso en un dNTP. La presencia de un colorante voluminoso cargado en el dNTP puede actuar como un terminador eficaz a través de un impedimento estérico y/o electrostático. La presencia de un acontecimiento de incorporación impide otras incorporaciones a menos que se elimine el colorante. La escisión del colorante elimina el fluoróforo e invierte eficazmente la terminación. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en las patentes estadounidenses n.° 7.427.673 y 7.057.026.

Sistemas y métodos de SBS de ejemplo adicionales que pueden utilizarse con los métodos y sistemas descritos en la presente descripción se describen en las patentes US-2007/0166705, US-2006/0188901, US-2006/0240439, US-2006/0281109, US-2012/027.305, y US-2013/0260372, la patente US-7.057.026, la publicación PCT núm. WO 05/065814, la publicación de solicitud de patente US-2005/0100900 y las publicaciones PCT núm. WO 06/064199 y WO 07/010.251.

Algunos ejemplos utilizan la detección de cuatro nucleótidos diferentes utilizando menos de cuatro marcadores diferentes. Por ejemplo, la SBS se puede realizar utilizando métodos y sistemas descritos en la publicación de patente US-2013/0.079.232. Como primer ejemplo, puede detectarse un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguirse basado en la diferencia de intensidad de un miembro del par en comparación con el otro, o basado en un cambio en un miembro del par (p.ej.,mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que aparezca o desaparezca una señal aparente en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como un segundo ejemplo, se pueden detectar tres de cuatro tipos de nucleótidos diferentes en condiciones particulares, mientras que un cuarto tipo de nucleótidos carece de un marcador que sea detectable en esas condiciones, o se detecta mínimamente en esas condiciones (p. ej., detección mínima debido a la fluorescencia de fondo, etc.). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico se puede determinar basándose en la presencia de sus respectivas señales y la incorporación del cuarto tipo de nucleótidos en el ácido nucleico se puede determinar basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como un tercer ejemplo, un tipo de nucleótidos puede incluir un(os) marcador(es) que se detecta(n) en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales. Las tres configuraciones de ejemplo mencionadas anteriormente no se consideran mutuamente excluyentes y pueden utilizarse en varias combinaciones. Un ejemplo que combina los tres ejemplos es un método de SBS basado en fluorescencia que utiliza un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (p.ej.,dATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando se excita con una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (p.ej., dCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando se excita con una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal (p.ej.,dTTP que tiene al menos un marcador que se detecta en ambos canales cuando se excita con la primera y/o segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de un marcador que no se detecta, o se detecta mínimamente, en ninguno de los canales (p.ej.,dGTP sin marcador).

Además, como se describe en las descripciones de la publicación estadounidense n.° 2013/0079232, los datos de secuenciación pueden obtenerse usando un solo canal. En los llamados enfoques de secuenciación de un colorante, el primer tipo de nucleótido se marca pero el marcador se elimina después de que se genere la primera imagen, y el segundo tipo de nucleótido se marca solo después de que se genere una primera imagen. El tercer tipo de nucleótido conserva su marcador tanto en la primera como en la segunda imagen, y el cuarto tipo de nucleótido permanece sin marcar en ambas imágenes.

Algunos ejemplos pueden utilizar secuenciación mediante técnicas de ligamiento. Tales técnicas utilizan ADN ligasa para incorporar oligonucleótidos e identificar la incorporación de tales oligonucleótidos. En varias implementaciones, los oligonucleótidos tienen diferentes marcadores que se correlacionan con la identidad de un nucleótido particular en una secuencia con la que hibridan los oligonucleótidos. Al igual que con otros métodos de SBS, se pueden obtener imágenes después del tratamiento de una matriz de casillas de ácidos nucleicos con los reactivos de secuenciación marcados. Cada imagen mostrará casillas de ácido nucleico que hayan incorporado marcadores de un tipo particular. En las diferentes imágenes habrá o no diferentes casillas debido al diferente contenido de secuencia de cada casilla, pero la posición relativa de las casillas permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de métodos de secuenciación basados en ligamiento se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en la presente descripción. Sistemas y métodos de SBS de ejemplo que pueden utilizarse con los métodos y sistemas descritos en la presente descripción se describen en las patentes US-6.969.488, 6, 172,218, y US-6.306.597.

Algunos ejemplos pueden utilizar la secuenciación de nanoporos (véase,p. ej.,Deamer y Akeson, “ Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing” , Trends Biotechnol., 18, 147- 151, 2000, Deamer y Branton, “ Characterization of nucleic acids by nanopore analysis” , Acc. Chem. Res., 35:817-825, 2002, Li, Gershow, Stein, Brandin, y Golovchenko, “ DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope” , Nat. Mater., 2:611-615, 2003, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad). En tales ejemplos, el fragmento pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, tal como a-hemolisina. Cuando el fragmento pasa a través del nanoporo, cada par de bases puede identificarse midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro (véase, p.ej.,la patente US-7.001.792; Soni y Meller, “A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores” , Clin. Chem. 53, 1996-2001, 2007, Healy, “ Nanopore-based single- molecule DNA analysis” , Nanomed., 2, 459-481, 2007, Cockroft, Chu, Amorin, y Ghadiri, “A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution” , J. Am. Chem. Soc., 130, 818-820, 2008). Los datos obtenidos de la secuenciación de nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar como se expone en la presente descripción. En particular, los datos se pueden tratar como una imagen según el tratamiento de ejemplo de imágenes ópticas y otras imágenes que se expone en la presente descripción.

Algunos ejemplos pueden utilizar métodos que implican la monitorización en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse mediante interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa portadora de fluoróforo y nucleótidos marcados con<y>-fosfato como se describe, por ejemplo, en la patente n.° 7.329.492 y 7.211.414, o las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse con guías de onda en modo cero como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.315.019 y utilizando análogos de nucleótidos fluorescentes y polimerasas diseñadas mediante ingeniería como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.405.281 y en la publicación estadounidense US-2008/0.108.082. La iluminación se puede restringir a un volumen a escala de zeptolitros alrededor de una polimerasa anclada a la superficie, de modo que se pueda observar la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia con un fondo bajo (véase, p.ej.,Levene y col., Science, 299, 682-686, 2003, Lundquist y col., Opt. Lett., 33:1026-1028, 2008, Korlach y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:1176-1181, 2008). Las imágenes obtenidas de dichos métodos se pueden almacenar, procesar y analizar tal como se expone en la presente descripción.

Algunos ejemplos de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, en la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede utilizarse un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles comercialmente en Ion Torrent (Guilford, CT, una filial de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en las publicaciones estadounidenses n.° 2009/0026082; US-2009/0.127.589; US-2005/0.137.143; y 2010/0282617. Los métodos expuestos en la presente descripción para amplificar ácidos nucleicos diana utilizando exclusión cinética pueden aplicarse fácilmente a sustratos utilizados para detectar protones. Más específicamente, los métodos expuestos en la presente descripción pueden utilizarse para producir poblaciones clonales de amplicones que se utilizan para detectar protones.

G. Análisis de datos

Se puede utilizar cualquier flujo de trabajo bioinformático apropiado para analizar y procesar las lecturas de secuencia obtenidas utilizando los métodos descritos.

En algunos ejemplos, las lecturas que se originan en el mismo fragmento de ADN largo se etiquetan con el mismo código de barras para permitir el análisis de lecturas enlazadas. Dado que las agrupaciones que pertenecen al mismo fragmento de ADN están ubicadas espacialmente en la celda de flujo y se encuentran dentro del límite de la perla que contenía el fragmento, la asignación precisa de códigos de barras puede basarse en la identificación de las ubicaciones de las perlas (o “ parches de agrupaciones” ) en la celda de flujo. La identificación de la ubicación de las perlas se puede lograr utilizando directamente imágenes de análisis en tiempo real (RTA) (p.ej.,disponibles en la plataforma Illumina MiSeq™) y/o utilizando las coordenadas del conglomerado informadas por RTA. Por lo tanto, este flujo de trabajo se puede utilizar, por ejemplo, en plataformas que admiten la interrogación de las coordenadas del grupo.

En algunos ejemplos, dadas las coordenadas de lectura RTA (x,y) en cada tesela (teniendo en cuenta ambas superficies y todas las franjas de teselas, cuando proceda), se puede realizar una agrupación espacial basada en la densidad para identificar las ubicaciones de las perlas en cada tesela, donde se supone que cada perla corresponde a un grupo de lecturas de alta densidad en comparación con el fondo de menor densidad creado por las lecturas que se filtraron al espacio intersticial. El procedimiento de agrupamiento detecta un número desconocido de grupos (ya que el número de perlas en cada tesela no es fijo), maneja formas y tamaños de grupos variables (en el caso de que las perlas no tengan un tamaño uniforme y una forma circular después de la fusión) y clasifica las lecturas intersticiales como ruido. Se puede utilizar cualquier algoritmo de agrupamiento basado en la densidad apropiado para definir los grupos, por ejemplo, el algoritmo de agrupamiento DBSCAN. En varias implementaciones, el límite de la perla se calcula a partir de cada grupo resultante encontrando el casco convexo de los puntos asignados al grupo. Para mejorar los resultados de la agrupación, se puede aplicar un procedimiento de filtrado de lectura basado en la densidad antes de la agrupación en grupos, que elimina las lecturas basado en la dispersión de su vecindad en la tesela (por ejemplo, una lectura se filtra si hay menos de n otras lecturas dentro de un radio r a su alrededor en la tesela, donde n y r son parámetros configurables). En algunos ejemplos, se puede implementar una etapa de curación manual para evaluar y corregir los resultados finales del procedimiento de agrupamiento.

En ejemplos adicionales, la ubicación de las perlas se determina a partir de las coordenadas de RTA mediante el aprendizaje profundo. Por ejemplo, se puede utilizar la arquitectura de red neuronal convolucional U-Net para la segmentación de imágenes o un modelo de CNN apropiado para determinar los límites de los parches de agrupación y la ubicación de los cordones correspondientes. En algunos de tales ejemplos, el conjunto de datos de entrenamiento incluye imágenes anotadas manualmente obtenidas de gráficos basados en coordenadas, así como imágenes generadas sintéticamente. El aumento de datos sintéticos se logra mediante la aplicación de un conjunto de transformaciones a las imágenes anotadas manualmente; las transformaciones incluyen deformaciones de forma, variaciones de tamaño, número y colocación, así como variaciones de densidad entre las perlas y dentro de ellas.

Al secuenciar el ADN de un genoma de referencia conocido, la información de alineación del genoma se puede utilizar para refinar además la identificación de las perlas, rescatar las lecturas intersticiales y mejorar la asignación de códigos de barras resultante. Por ejemplo, las perlas asignadas al mismo grupo se pueden separar además teniendo en cuenta las ventanas del genoma en las que se mapearon sus lecturas junto con su proximidad espacial. Alternativamente, la interferencia entre perlas se puede cuantificar contando las lecturas que se asignan a la misma ventana del genoma en las perlas vecinas; los pares de perlas con una interferencia significativamente alta se pueden combinar para mejorar la contigüidad de las islas y el rendimiento en varias aplicaciones diana, tal como la fase. También se considera la asignación probabilística o “ flexible” de códigos de barras para mejorar además el rendimiento en varias aplicaciones de destino, como la puesta en fase y el ensamblaje.

En algunos ejemplos, después de la identificación, cada perla detectada se asocia a un código de barras único y las lecturas contenidas dentro del límite de la perla se etiquetan con este código de barras. Como resultado, las lecturas que se originan en los fragmentos largos de ADN atrapados inicialmente en la misma perla se asignan al mismo código de barras y se pueden vincular durante el análisis posterior. En particular, para el escalonamiento del genoma humano, las lecturas de códigos de barras se pueden vincular en islas (correspondientes a los fragmentos de ADN más largos de los que se originaron las lecturas) utilizando la proximidad de sus posiciones de alineación del genoma (p. ej., las lecturas del mismo código de barras se pueden vincular si se mapean cerca del genoma humano), lo que permite la reconstrucción de bloques de fase mucho más grandes. En el ensamblaje del genoma, la información de códigos de barras se puede utilizar para eliminar la ambigüedad de las repeticiones y aumentar significativamente la contigüidad del ensamblaje, por ejemplo, mapeando primero las lecturas con los cóntigos parcialmente ensamblados y después utilizando la información de códigos de barras para vincular los cóntigos. Las canalizaciones de fase y ensamblaje se han implementado como etapas posteriores del flujo de trabajo de análisis de datos siguiendo las mejores prácticas para el análisis de lectura enlazada y aplicando optimizaciones de rendimiento específicas para hidrogeles cuando corresponde.

III. Dispositivo de celda de flujo y uso del mismo

En algunas implementaciones, la presente descripción se refiere a dispositivos, sistemas y métodos para preparar genotecas de ácidos nucleicos en un dispositivo de celda de flujo. Por ejemplo, el dispositivo de celda de flujo puede incluir un hidrogel que incluye material genético, en donde el hidrogel puede configurarse para conservar el material genético, mientras permite que los reactivos, las enzimas, los productos químicos y los cebadores de menor tamaño de menos de aproximadamente 50 pares de bases pasen a través del hidrogel. El dispositivo de celda de flujo se puede utilizar para preparar una genoteca de ácidos nucleicos dentro del dispositivo de celda de flujo y para secuenciar el material genético retenido dentro del hidrogel, incluida la secuenciación de células individuales.

En algunos ejemplos, los dispositivos, sistemas y métodos eliminan los complejos métodos de captura de células individuales y de preparación de genotecas mediante el uso de una superficie de celda de flujo para capturar y convertirin situel contenido genómico de células individuales en una genoteca de secuenciación. Las lecturas de la genoteca se pueden asignar a las células originales debido a la proximidad espacial de los grupos. A diferencia de otros métodos de preparación de genotecas de celdas de flujo, los ejemplos proporcionados en la presente memoria comienzan con la captura de células únicas individuales en la superficie de una celda de flujo en lugar de moléculas de ADN largas de células con adaptadores P5/P7 añadidos en los extremos. Por consiguiente, los ejemplos proporcionados en la presente memoria reducen las complejidades de la extracción de ADN, la selección del tamaño y la preparación de genotecas de secuenciación para fragmentos genómicos largos. Algunos ejemplos de los dispositivos, sistemas y métodos también permiten el ensamblaje sintético de lectura larga utilizando moléculas de ADN largas (de 10 a 100 kilobases) como entrada sin necesidad de ligamiento por adaptador.

A. Dispositivo de celda de flujo de hidrogel

El dispositivo de celda de flujo de la presente invención comprende un soporte sólido que comprende una superficie que tiene un hidrogel degradable inmovilizado sobre la misma, en donde el hidrogel degradable comprende poros que están dimensionados para permitir la difusión de un reactivo a través del hidrogel, pero que son demasiado pequeños para permitir que un material genético atraviese los poros.

Algunos ejemplos se refieren a un dispositivo de celda de flujo que tiene un material de hidrogel depositado sobre el mismo. En algunos ejemplos, el hidrogel incluye material genético dispuesto en el mismo. En algunos ejemplos, el hidrogel incluye poros que permiten la difusión de reactivos, enzimas, productos químicos, y oligonucleótidos o cebadores de menos de aproximadamente 50 pares de bases a través de los poros, al tiempo que retienen el material genético en los mismos.

En algunos ejemplos, el dispositivo de celda de flujo tiene una altura de canal de 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 110 pm, 120 pm, 130 pm, 140 pm, o 150 pm, o una cantidad dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados.

Los términos “ superficie sólida” , “ soporte sólido” y otros equivalentes gramaticales en la presente memoria se refieren a cualquier material que sea apropiado o que pueda modificarse para que sea apropiado para la unión de materiales para el procesamiento de ácidos nucleicos, incluidos, por ejemplo, materiales para la preparación de genotecas de ácidos nucleicos, incluidos los complejos de transposomas. Como apreciarán los expertos en la técnica, la cantidad de materiales de soporte sólidos posibles es muy grande. Posibles materiales incluyen, pero sin limitarse a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, cerámicas, resinas, sílice o materiales basados en sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibras ópticas, y una variedad de otros polímeros. Los soportes sólidos y superficies sólidas especialmente útiles para algunos ejemplos están situados dentro de un aparato de celda de flujo.

En algunos ejemplos, un soporte sólido incluye sustratos a base de sílice, tales como vidrio, sílice fundida u otros materiales que contienen sílice. En algunos ejemplos, los sustratos a base de sílice también pueden ser silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio o hidruros de silicona. En algunos ejemplos, un soporte sólido incluye materiales plásticos tales como polietileno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, nailon, poliésteres, policarbonatos, polímeros de olefinas cíclicas, o poli(metacrilato de metilo). En algunos ejemplos, el soporte sólido es un material a base de sílice o un material plástico. En algunos ejemplos, el soporte sólido tiene al menos una superficie que comprende vidrio.

En algunos ejemplos, el soporte sólido puede ser, o puede contener, un metal. En algunos de tales ejemplos, el metal es oro. En algunos ejemplos, el soporte sólido tiene al menos una superficie que incluye un óxido metálico. En un ejemplo, el soporte sólido incluye un óxido de tántalo u óxido de estaño.

También se puede utilizar acrilamida, enona o acrilato como material de soporte sólido. Otros materiales de soporte sólido pueden incluir, aunque no de forma limitativa, arseniuro de galio, fosfuro de indio, aluminio, cerámica, poliimida, cuarzo, resinas, polímeros y copolímeros.

En algunos ejemplos, el soporte sólido y/o la superficie sólida pueden ser cuarzo. En algunos ejemplos, el soporte sólido y/o la superficie sólida pueden ser un semiconductor, tal como GaAs u óxido de indio y estaño (ITO).

Los soportes sólidos pueden incluir un único material o una pluralidad de materiales diferentes. Los soportes sólidos pueden ser compuestos o laminados. Los soportes sólidos pueden ser plano, redondo, texturizado y que tiene un patrón. Los patrones se pueden formar, por ejemplo, mediante almohadillas metálicas que forman características en superficies no metálicas, por ejemplo, como se describe en la patente US-8.778.849. Otra superficie con patrones útil es aquella que tiene características bien formadas en una superficie, por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente US-2014/0.243.224 A1 o la patente de patente US-2011/0.172.118 A1 o la patente US-7.622.294. Para los ejemplos que utilizan una superficie con patrones, un gel puede asociarse o depositarse sobre las características del patrón o, alternativamente, el gel puede depositarse uniformemente tanto en las características del patrón como en las regiones intersticiales.

En algunos ejemplos, el soporte sólido comprende una superficie con patrones. Una “ superficie con patrones” se refiere a una disposición de diferentes regiones en o sobre una capa expuesta de un soporte sólido. En algunos ejemplos, el patrón puede ser un formato de casillas x-y que estén en filas y columnas. En algunos ejemplos, el patrón puede ser una disposición repetitiva de casillas y/o regiones intersticiales. En algunos ejemplos, el patrón puede ser una disposición aleatoria de casillas y/o regiones intersticiales. Se describen superficies con patrones ilustrativas que pueden utilizarse en los métodos y composiciones expuestos en la presente descripción en la patente. US-13/661.524 o la publicación de solicitud de n.° US-2012/0316086 A1. Se describen superficies con patrones de ejemplo que pueden utilizarse en los métodos y composiciones expuestos en la presente descripción en la patente US-13/661.524 o la publicación de solicitud de n.° US-2012/0316086 A1.

En algunos ejemplos, el soporte sólido comprende una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Este puede fabricarse, como se sabe generalmente en la técnica, utilizando una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación, fotolitografía, técnicas de estampado, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la materia, la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del sustrato de la matriz. En algunos ejemplos, la matriz de pocillos o depresiones tiene un diámetro de 10 pm a 50 pm, tal como 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm, o 50 pm de diámetro, o un diámetro dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, los pocilios o depresiones tienen una profundidad de 0,5 |jm a 1 |jm, tal como 0,5 |jm, 0,6 |jm, 0,7 |jm, 0,8 |jm, 0,9 |jm, o 1 |jm de profundidad, o una profundidad dentro de un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, los pocillos o depresiones están hechos de un material hidrófobo. En algunos ejemplos, el material hidrófobo incluye un fluoropolímero amorfo, que incluye, por ejemplo, CYTOP, Fluoropel® o Teflon®.Véase,por ejemplo, la solicitud PCT n.° PCT/US2017/033.169.

En algunos ejemplos, un soporte sólido descrito en la presente memoria forma al menos parte de una celda de flujo o está ubicado en una celda de flujo. En un ejemplo, un soporte sólido en el dispositivo de celda de flujo está recubierto con un polímero de superficie que comprende grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados, tales como los descritos en las publicaciones del PCT n.° WO 2013/184796 o WO2016/066586. En algunos ejemplos, el polímero de superficie comprende una unidad recurrente de fórmula (I) y una unidad recurrente de fórmula (II):

(I)

en donde

R1 y R1' son cada uno independientemente hidrógeno, halo, alquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, o una variante opcionalmente sustituida de los mismos;

R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, alquilamino, alquilamido, alquiltio, arilo, o una variante opcionalmente sustituida de los mismos;

R4, R4', R5, y R5' son cada uno independientemente hidrógeno, R6, OR6, -C(O)OR6, -C(O) R6, -OC(O) R6, - C(O)NR7R8, o -NR7R8;

en donde R<6>es hidrógeno, hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, o una variante opcionalmente sustituida de los mismos; y

R<7>y R<8>son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo, o R<7>y R<8>tomados junto con el átomo o los átomos a los que están unidos forman un heterociclo.

En algunos ejemplos, R<1>, R<1'>, R<3>, R<5>, y R<5'>son cada uno hidrógeno. En algunos ejemplos, R<4'>es hidrógeno o alquilo. En algunos ejemplos, R<4>es -C(O)NR<7>R<8>. En algunos ejemplos, R<2>es -(CH2)5-<n>H<c>(0)CH2N3. En algunos ejemplos, el polímero de superficie es poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-coacrilamida) (PAZAM) o acrilamida libre de silano (SFA). En algunos ejemplos, el polímero de superficie está unido covalentemente al soporte sólido. En otros ejemplos, el polímero de superficie está unido de forma no covalente al soporte sólido. En este ejemplo, el dispositivo de celda de flujo incluye un soporte sólido que tiene un recubrimiento polimérico superficial sobre el cual puede fluir un hidrogel que incluye material genético.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ alquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburo completamente saturada, lineal o ramificada. En algunos ejemplos, el grupo alquilo contiene de 1 a 20 átomos de carbono, o de 1 a 6 átomos de carbono, o de 1 a 4 átomos de carbono. Un “ alquilo inferior” tiene de 1 a 4 átomos de carbono y puede denominarse alquilo C<1-4>. Los ejemplos de grupos alquilo de 1 a 6 carbonos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, o hexilo.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ alquenilo” se refiere a un grupo alquilo que contiene uno o más dobles enlaces.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ cicloalquilo” se refiere a un sistema de anillos mono o policíclico completamente saturado. Cuando están presentes múltiples anillos, pueden ser sistemas fusionados, puenteados o espirocíclicos. Los cicloalquilos pueden contener de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo, o de 3 a 8 átomos de carbono en el anillo, o de 3 a 6 átomos de carbono en el anillo. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ arilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos carbocíclicos, monocíclicos o policíclicos. Los anillos arílicos pueden incluir anillos no aromáticos fusionados. En algunos ejemplos, el grupo arilo tiene de 6, 10 o 14 átomos de anillo de carbono. Ejemplos de grupos arilo son benceno, naftaleno y antraceno.

Los términos “ heterociclilo” y “ heterociclo” se refieren a un sistema de anillos que incluye al menos un heteroátomo, tal como oxígeno, nitrógeno o azufre. Tales sistemas pueden ser insaturados, parcialmente saturados, aromáticos, o una combinación de los mismos.

Como se utiliza en la presente memoria, “ heteroarilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclicos o policíclicos que contiene uno o más heteroátomos, tales como nitrógeno, oxígeno, o azufre. Los grupos “ heteroarilo” incluyen sistemas fusionados que comprenden al menos un anillo aromático que contiene heteroátomos, mientras que otro anillo puede ser carbocíclico o heterocíclico y aromático o no aromático. Los grupos heteroarilo de ejemplo incluyen furano, furazano, tiofeno, benzotiofeno, ftalazina, pirrol, oxazol, benzoxazol, 1,2,3-oxadiazol, 1,2,4-oxadiazol, tiazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, benzotiazol, imidazol, benzimidazol, indol, indazol, pirazol, benzopirazol, isoxazol, benzoisoxazol, isotiazol, triazol, benzotriazol, tiadiazol, tetrazol, piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, purina, pteridina, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina, cinolina, y triazina.

Como se utiliza en la presente memoria, “ alquilamino” se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno están reemplazados por un grupo amino. Los ejemplos de grupos alquilamino incluyen, pero no se limitan a, aminometilo, 2-aminoetilo, 3-aminoetilo.

Como se utiliza en la presente memoria, “ alquilamido” se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno están reemplazados por un grupo C-amido o un grupo N-amido.

El término “ halo” se refiere a sustituyentes de flúor, cloro, bromo y yodo, especialmente, flúor, cloro, bromo y yodo.

Siempre que un grupo se describa como “ opcionalmente sustituido” , ese grupo puede estar insustituido o sustituido con uno o más de los sustituyentes indicados.

Por lo tanto, algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria se refieren a un dispositivo de celda de flujo de hidrogel. Como se utiliza en la presente memoria, un dispositivo de celda de flujo de hidrogel es un dispositivo de celda de flujo que tiene un soporte sólido como se describe en la presente memoria, e incluye además un hidrogel, en donde el hidrogel incluye un polímero de hidrogel y material genético.

Los hidrogeles se pueden prepararse mediante la reticulación de biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos. Por lo tanto, en algunos ejemplos, el hidrogel puede incluir un reticulante. Los ejemplos de polímeros de hidrogel para el dispositivo de celda de flujo de hidrogel, que pueden incluir uno o más reticulantes, incluyen, pero no se limitan a, los descritos anteriormente para las perlas de hidrogel.

En algunos ejemplos, el reticulante es un reticulante reversible, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para las perlas de hidrogel. En algunos ejemplos, la capa de hidrogel es una capa de hidrogel reversible que puede estar reticulada o no reticulada dependiendo de la sustancia química a la que esté expuesta. En algunos ejemplos, la capa de hidrogel reversible se prepara con reticulantes, tales como reticulantes de bisacrilamida, que contienen enlaces disulfuro, que pueden romperse con agentes reductores tales como DTT, TCEP o THP (fosfina). Como se muestra en la figura 17, el polímero de hidrogel reversible de 10 a 100 micrómetros que encapsula una carga de bacterias teñidas con tinte (imágenes superiores) es degradable tras la exposición al agente reductor THP, lo que resulta en la liberación de las bacterias (imágenes inferiores).

En algunos ejemplos, la elevación de la temperatura o el contacto con un agente reductor degrada el reticulante, liberando de este modo el material genético encapsulado del polímero de hidrogel.

En algunos ejemplos, la reticulación del reticulante establece poros dentro del polímero de hidrogel, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para las perlas de hidrogel. En algunos ejemplos, el tamaño de los poros del polímero de hidrogel es regulable y se formula para encapsular material genético, tal como células o ácidos nucleicos de más de aproximadamente 300 pares de bases, pero para permitir que partículas más pequeñas, tales como reactivos, enzimas, productos químicos, o ácidos nucleicos de menor tamaño de menos de aproximadamente 50 pares de bases, tales como cebadores, pasen a través de los poros. En algunos ejemplos, los reactivos incluyen reactivos para procesar material genético, tales como reactivos para aislar ácidos nucleicos de una célula, para amplificar o secuenciar ácidos nucleicos, o para la preparación de genotecas de ácidos nucleicos. Los hidrogeles pueden tener cualquier tamaño de poro y cualquier porosidad, por ejemplo, un tamaño de poro o porosidad como se ha descrito anteriormente para las perlas de hidrogel.

“ Material genético” , tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a células, microbiomas o ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, la célula es una única célula, que incluye una célula procariota o eucariota. En algunos ejemplos, la célula es una célula de mamífero. En algunos ejemplos, la célula es una célula humana. En algunos ejemplos, la célula es una célula bacteriana. En algunos ejemplos, el material genético es una partícula viral. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es una molécula de ADN larga, ADN genómico, ácidos nucleicos virales, ácidos nucleicos bacterianos, o ácidos nucleicos de mamíferos. En algunos ejemplos, el material genético se retiene dentro del hidrogel, mientras que los reactivos, las enzimas, los productos químicos y los ácidos nucleicos pequeños de menos de aproximadamente 50 pares de bases pueden entrar y salir del hidrogel.

En algunos ejemplos, el hidrogel es una capa de hidrogel que cubre la superficie sólida del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, la capa de hidrogel se prepara a partir de una solución precursora de hidrogel que incluye material genético y que fluye sobre la superficie de un dispositivo de celda de flujo, y que puede reticularse además mientras está en la superficie del dispositivo de celda de flujo para formar una capa de hidrogel polimerizado. En algunos ejemplos, la solución precursora de hidrogel incluye un agente modificador de la viscosidad, tal como PEG o dextrano, para modular la viscosidad de la solución. En algunos ejemplos, la solución precursora de hidrogel incluye una muestra que contiene material genético.

En algunos ejemplos, el hidrogel es una perla de hidrogel que se captura dentro del dispositivo de celda de flujo. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la perla de hidrogel forma columnas a lo largo de un canal dentro del dispositivo de celda de flujo. La perla de hidrogel incluye material genético. En algunos ejemplos, la perla de hidrogel incluye un polímero de hidrogel, un reticulante, y material genético. En algunos ejemplos, el polímero de hidrogel incluye 60-90 % de líquido, tal como agua y 10-30 % de polímero. En determinados ejemplos, el contenido acuso de hidrogel es de aproximadamente 70-80 %.

La perla de hidrogel se puede preparar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, un método de preparación como el descrito anteriormente para las perlas de hidrogel, tal como las técnicas de emulsión asistida por vórtice o flujo microfluídico.

En algunos ejemplos, una perla de hidrogel, ya sea preparada mediante emulsión asistida por vórtice o emulsión asistida por flujo inercial microfluídico, encapsula un material genético único o distinto. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la perla de hidrogel encapsula una única célula. En algunos ejemplos, la cantidad de material genético dentro de una perla de hidrogel se puede controlar diluyendo la muestra que contiene material genético. La muestra que incluye el material genético se mezcla con el polímero de hidrogel, y el polímero de hidrogel que contiene el material genético se somete a una emulsión asistida por vórtice o a una emulsión asistida por flujo inercial microfluídico como se describe en la presente memoria.

En algunos ejemplos, después de la preparación de la perla de hidrogel que contiene material genético, la perla de hidrogel se deshidrata para disminuir el tamaño de la perla de hidrogel. En algunos ejemplos, el tamaño de la perla de hidrogel se reduce en aproximadamente un 1 %, un 2 %, un 3 %, un 4 %, un 5 %, un 6 %, un 7 %, un 8 %, un 9 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 30 %, un 40 % o un 50 %, o una cantidad dentro de un rango definido por dos de los valores anteriormente mencionados. Por lo tanto, por ejemplo, una perla de hidrogel puede reducirse de un tamaño hidratado de 105 pm de diámetro a un tamaño deshidratado de menos de 100 pm de diámetro. En algunos ejemplos, una perla de hidrogel deshidratada que tiene material genético dispuesto en ella fluye hacia un dispositivo de celda de flujo y se rehidrata hasta un diámetro mayor que la altura del canal del dispositivo de celda de flujo, lo que resulta en la captura de la perla de hidrogel dentro del dispositivo de celda de flujo.

B. Métodos de preparación de un dispositivo de celda de flujo de hidrogel descrito en la presente memoria como referencia

Algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria se refieren a métodos para preparar un dispositivo de celda de flujo de hidrogel. En algunos ejemplos, se proporciona un dispositivo de celda de flujo que tiene una superficie sólida. En algunos ejemplos, la superficie de un dispositivo de celda de flujo está recubierta con un polímero de superficie, tal como los descritos en la presente memoria, o tal como PAZAM o SFA. En algunos ejemplos, una solución precursora de hidrogel, tal como se describe en la presente memoria, que tiene un polímero de hidrogel, un reticulante, y material genético, se hace fluir hacia el dispositivo de celda de flujo, cubriendo la superficie sólida del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, la mayor parte de una solución precursora de hidrogel se elimina haciendo fluir un fluido inmiscible a través del dispositivo de celda de flujo, lo que desplaza la mayor parte de la solución precursora de hidrogel y deja una capa residual de solución precursora de hidrogel que tiene material genético en el dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el fluido inmiscible es aceite, tal como aceite mineral, un aceite de hidrocarburo, un aceite de silicio o un aceite de polidimetilsiloxano, o mezclas de los mismos. En algunos ejemplos, el grosor de la solución precursora de hidrogel que se retiene en la capa residual puede controlarse mediante la viscosidad de la solución precursora de hidrogel, que puede modularse con la presencia de especies poliméricas no reactivas, tales como PEG o dextrano. En algunos ejemplos, se añade aceite que contiene un agente de reticulación, tal como la tetrametiletilendiamina (TEMED) al dispositivo de celda de flujo, lo que inicia la reticulación de la capa residual de la solución precursora de hidrogel. En algunos ejemplos, el aceite que contiene el agente de reticulación se elimina, dejando una capa de hidrogel reticulado que tiene material genético dispuesto en la misma sobre la superficie del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, la capa de hidrogel reticulado cubre la superficie de la celda de flujo. En algunos ejemplos, el dispositivo de celda de flujo que tiene la capa de hidrogel reticulado se puede utilizar para procesar el material genético, como se describe en la presente memoria.

Algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria se refieren a métodos para preparar un dispositivo de celda de flujo que tiene columnas de capa de hidrogel dispuestas en su interior. En algunos ejemplos, el método incluye proporcionar un dispositivo de celda de flujo como se describe en la presente memoria. En algunos ejemplos, el método incluye proporcionar perlas de hidrogel que encapsulan el material genético tal como se describe en la presente memoria. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel se deshidratan hasta un diámetro inferior a la altura del canal del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, la celda de flujo tiene una altura de canal que varía de aproximadamente 50 pm a aproximadamente l0o pm, por ejemplo, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 110 pm, 120 pm, 130 pm, 140 pm o 150 pm, o una cantidad dentro de un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, el diámetro de la perla de hidrogel deshidratada varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 140 pm, por ejemplo, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, o 140 pm, o un diámetro dentro de un rango definido por dos valores cualquiera de los mencionados anteriormente. Por lo tanto, a modo de ejemplo, un dispositivo de celda de flujo puede incluir un canal que tiene una altura de 100 pm y una perla de hidrogel deshidratado correspondiente que tiene un diámetro inferior a 100 pm, por ejemplo, 70 pm de diámetro. Las perlas de hidrogel deshidratadas son capaces de rehidratarse y, al hacerlo, aumentar su diámetro entre un 1 % y un 50 %, por ejemplo, aproximadamente un 1 %, un 2 %, un 3 %, un 4 %, un 5 %, un 6 %, un 7 %, un 8 %, un 9 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 30 %, un 40 % o un 50 %, o una cantidad dentro de un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriormente mencionados. Las perlas de hidrogel deshidratado que contienen material genético se hacen fluir a un dispositivo de celda de flujo y se rehidratan, fijándose de este modo dentro del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, las perlas de hidrogel fijas forman estructuras de pilares dentro del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el dispositivo de celda de flujo que tiene las perlas de hidrogel fijas que tienen material genético encapsulado en las mismas puede utilizarse para el procesamiento de material genético como se describe en la presente memoria.

C. Métodos de procesamiento de material genético en un hidrogel dentro de un dispositivo de celda de flujo

Algunos ejemplos proporcionados en la presente memoria se refieren a métodos para procesar material genético encapsulado dentro de un hidrogel sobre una superficie sólida de un dispositivo de celda de flujo de la invención. En algunos ejemplos, el dispositivo de celda de flujo incluye una capa de hidrogel que cubre la superficie del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el dispositivo de celda de flujo incluye perlas de hidrogel atrapadas, o pilares, dentro del dispositivo de celda de flujo. Por lo tanto, el hidrogel depositado dentro de un dispositivo de celda de flujo puede incluir una capa de hidrogel o una perla de hidrogel capturada dentro del dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el material genético encapsulado dentro del hidrogel se pone en contacto con uno o más reactivos para el procesamiento de ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, el material genético se retiene dentro del hidrogel y los reactivos pueden pasar a través de los poros del hidrogel, mientras que al mismo tiempo retienen el material genético dentro de la capa de hidrogel, lo que permite que los reactivos entren y salgan durante el procesamiento del material genético. En algunos ejemplos, los reactivos pueden incluir agentes de lisis, agentes de purificación de ácidos nucleicos, agentes de amplificación de ADN, agentes de tagmentación, agentes de PCR, u otros agentes utilizados en el procesamiento de materiales genéticos. Por lo tanto, el hidrogel retiene el material genético para un procesamiento eficiente del material genético dentro del hidrogel al permitir una barrera para que los reactivos entren y salgan del hidrogel, al tiempo que retiene el propio material genético dentro del hidrogel.

En algunos ejemplos, la preparación completa de la genoteca de ADN se puede lograr sin problemas dentro del hidrogel con múltiples intercambios de reactivos haciendo fluir los reactivos al dispositivo de celda de flujo mientras se retiene el ADNg y los productos de su genoteca dentro del hidrogel.

En algunos ejemplos, los reactivos se hacen pasar a través del dispositivo de celda de flujo, poniéndose en contacto con el hidrogel y encapsulando una célula o partícula viral para purificar y aislar los ácidos nucleicos de la célula o partícula. Por lo tanto, por ejemplo, el regulador de lisis fluye a través del dispositivo de celda de flujo. Como se utiliza en la presente memoria, “ lisis” significa la perturbación o alteración de una pared celular o partícula viral que facilita el acceso o la liberación del ARN o ADN celular. Típicamente, no es necesaria la interrupción y rotura completas de la pared celular. Por el término “ regulador de lisis” se entiende un regulador que contiene al menos un agente de lisis. Los agentes de lisis enzimáticos típicos incluyen, pero no se limitan a, lisozima, glucolasa, zimolosa, liticasa, proteinasa K, proteinasa E, y endolisinas y exolisinas virales. Por lo tanto, por ejemplo, la lisis de las células en el hidrogel puede realizarse introduciendo agentes de lisis, tales como la lisozima y la proteinasa K, en el dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, después del tratamiento de lisis, el ácido nucleico aislado se retiene dentro del hidrogel en el dispositivo de celda de flujo y se puede utilizar para un procesamiento posterior.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ aislado” , “ aislar” , “ aislamiento” , “ purificado” , “ purificar” , “ purificación” y equivalentes gramaticales de los mismos, como se utilizan en la presente memoria, a menos que se especifique lo contrario, se refieren a la reducción de la cantidad de al menos un contaminante (tal como una proteína y/o una secuencia de ácido nucleico) de una muestra o de una fuente (p. ej., una célula) de la que se aísla el material. Por lo tanto, la purificación da como resultado un “ enriquecimiento” , o un aumento de la cantidad de una proteína y/o una secuencia de ácido nucleico deseables en la muestra.

En algunos ejemplos, el ADN aislado después de la lisis de las células puede amplificarse mediante técnicas de amplificación como se describe en la presente memoria. En algunos ejemplos, tales como para la secuenciación del ARNm de una única célula, la síntesis de ADNc y la síntesis de la segunda cadena, se puede realizar la depleción del ARN ribosómico y el ADN bicatenario y la síntesis de la segunda cadena después de la lisis celular. En algunos ejemplos, tales como para la lectura por carga sintética, no se requiere una etapa de lisis ya que el material genético de la solución precursora de hidrogel o de las perlas de hidrogel son ácidos nucleicos ya aislados, y que pueden amplificarse mediante las técnicas de amplificación descritas en la presente memoria. Un experto en la materia reconocerá que las etapas proporcionadas en la presente memoria pueden modificarse según la aplicación específica y las etapas para la aplicación particular, y que la descripción en la presente memoria generalmente abarca las preparaciones de genotecas de ácidos nucleicos.

Los ácidos nucleicos encapsulados que se aíslan dentro del hidrogel pueden amplificarse según cualquier metodología de amplificación adecuada conocida en la técnica, incluidos los métodos descritos en la presente memoria. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos encapsulados se amplifican dentro del hidrogel. En algunos ejemplos, el hidrogel se degrada, en donde los ácidos nucleicos encapsulados se liberan sobre el soporte sólido del dispositivo de celda de flujo y los ácidos nucleicos se amplifican dentro del dispositivo de celda de flujo. La amplificación puede realizarse mediante técnicas tal como la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), que es una técnica muy utilizada para amplificar bajas cantidades de ADN, especialmente de células individuales. En algunos ejemplos, los cebadores y enzimas de amplificación se introducen en el dispositivo de celda de flujo y pasan a través de los poros del hidrogel y se hibridan con los ácidos nucleicos encapsulados. Por lo tanto, cualquiera de las metodologías de amplificación descritas en la presente memoria o conocidas en general en la técnica se puede utilizar con cebadores universales o específicos de la diana para amplificar los ácidos nucleicos encapsulados haciendo fluir los reactivos de amplificación apropiados a través del dispositivo de celda de flujo, amplificando de este modo los ácidos nucleicos encapsulados en el hidrogel del dispositivo de celda de flujo.

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos encapsulados se amplifican utilizando metodologías de amplificación en grupo como se ilustra en las descripciones de patente estadounidense US-7.985.565 y US-7.115.400. Las descripciones de las patentes US-7.985.565 y US-7.115.400 describen métodos de amplificación de ácido nucleico, que permiten que los productos de amplificación se inmovilicen sobre un soporte sólido para formar matrices compuestas por grupos o “ colonias” de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Cada grupo o colonia en dicha matriz se forma a partir de una pluralidad de cadenas de polinucleótidos idénticas inmovilizadas y una pluralidad de cadenas de polinucleótidos complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices así formadas se denominan generalmente en la presente descripción “ matrices agrupadas” . Los productos de reacciones de amplificación en fase sólida, tales como los descritos en las patentes US-7.985.565 y US-7.115.400 son los denominadas estructuras “ puente” formados por el emparejamiento de pares de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, inmovilizándose ambas cadenas sobre el soporte sólido en el extremo 5', preferiblemente mediante una unión covalente. Las metodologías de amplificación de grupos son ejemplos de métodos en donde para producir amplicones inmovilizados se utiliza un molde de ácido nucleico inmovilizado. T ambién pueden utilizarse otras metodologías adecuadas para producir amplicones inmovilizados a partir de fragmentos de ADN inmovilizados producidos según los métodos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, pueden formarse uno o más grupos o colonias mediante PCR en fase sólida si uno o ambos cebadores de cada par de cebadores de amplificación se inmovilizan. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos encapsulados se amplifican dentro del hidrogel y, a continuación, se depositan en una matriz o en un grupo en el dispositivo de celda de flujo. La agrupación de moléculas de ADN sembradas individuales en la superficie de la celda de flujo se puede realizar, por ejemplo, mediante agrupamiento estándar.

En algunos ejemplos, el hidrogel es un hidrogel reversible que puede degradarse en condiciones apropiadas, como se describe en la presente memoria, incluso con temperatura elevada o con contacto con un agente reductor. Por ejemplo, como se muestra en las figuras 18A-18B, el hidrogel puede ser una perla de hidrogel que puede degradarse, liberando de este modo el material genético en grupos. En la figura 18A, las perlas de hidrogel se encapsulan individualmente y las perlas se rompen químicamente para liberar el ADN para su agrupamiento. Como se muestra en la figura 18B, el ADN se agrupó en la superficie de la celda de flujo y está listo para la secuenciación.

Otros métodos de amplificación incluyen amplificación isotérmica. Otros métodos no basados en PCR que pueden utilizarse en la presente descripción incluyen, por ejemplo, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) que se describe, por ejemplo, en Walker y col., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; patentes US- n.° 5.455.166 y 5.130.238, y en Walker y col., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992) o amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada que se describe, por ejemplo, en Lage y col., Genome Research 13:294-307 (2003). Para la amplificación aleatoria de cebador de ADN genómico, pueden utilizarse métodos de amplificación isotérmica con la polimerasa Phi 29 de desplazamiento de cadena o el fragmento grande de ADN polimerasa de Bst, exo- 5'->3'. El uso de estas polimerasas aprovecha su alta procesividad y actividad de desplazamiento de cadenas. La alta procesividad permite que las polimerasas produzcan fragmentos que tienen una longitud de 10-20 kb. Como se ha expuesto anteriormente, pueden producirse fragmentos más pequeños en condiciones isotérmicas utilizando polimerasas que tienen baja procesividad y actividad de desplazamiento de cadena tal como la polimerasa Klenow. Una descripción adicional de reacciones, condiciones y componentes de amplificación, se expone en detalle en la descripción de la patente US-7.670.810. En algunos ejemplos, las polimerasas, los reactivos y los componentes para realizar estas reacciones de amplificación se introducen en un dispositivo de celda de flujo y son capaces de atravesar los poros del hidrogel para interactuar con los ácidos nucleicos encapsulados, amplificando de este modo los ácidos nucleicos dentro del hidrogel (ya sea que el hidrogel sea una capa que recubre la superficie del dispositivo de celda de flujo o una perla o pilar de hidrogel como se describe en la presente memoria).

En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos encapsulados se secuencian en total o en parte dentro del hidrogel. Los ácidos nucleicos encapsulados pueden secuenciarse según cualquier metodología de secuenciación adecuada, que incluye aquellas descritas en la presente memoria, tal como secuenciación directa, incluyendo secuenciación por síntesis, secuenciación por ligamiento, secuenciación por hibridación, secuenciación de nanoporos y similares.

En algunos ejemplos, uno o más ácidos nucleicos encapsulados amplificados pueden someterse a una SBS o a otra técnica de detección que implique el suministro repetido de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, una ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una perla de hidrogel que contenga una o más moléculas de ácido nucleico amplificado. Pueden detectarse aquellos sitios en los que la extensión del cebador provoque la incorporación de un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, a un cebador se le puede añadir un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminación reversible, de modo que no se pueda producir la extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por lo tanto, para ejemplos que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre las diversas etapas de suministro. Después, el ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de este modo una secuencia de longitud n. Se describen procedimientos de SBS, sistemas de fluidos y plataformas de detección de ejemplo que pueden adaptarse fácilmente para su uso con amplicones producidos mediante los métodos de la presente descripción, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), en la patente WO 04/018497; la patente US-7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; la patente US-7.329.492; la patente US-7.211.414; la patente US-7.315.019; la patente US-7.405.281 y US-2008/0.108.082.

Los métodos de ejemplo para el análisis de expresión y genotipado basados en matriz que pueden aplicarse a la detección según la presente descripción se describen en la patente US-7.582.420; US-6.890.741; US-6.913.884 o US-6.355.431 o las publicaciones patente US-2005/0.053.980 A1; US-2009/0.186.349 A1 o US 2005/0.181.440 A1.

En los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, amplificación y secuenciación, como se describe en la presente memoria, se utilizan diversos reactivos para el aislamiento y la preparación de ácido nucleico. Tales reactivos pueden incluir, por ejemplo, lisozima, proteinasa K, hexámeros aleatorios, polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa de 029, polimerasa de Taq, polimerasa de Bsu), transposasa (por ejemplo, Tn5), cebadores (por ejemplo, secuencias adaptadoras P5 y P7), ligasa, enzima catalizadora, desoxinucleótido trifosfatos, reguladores, o cationes divalentes. Estos reactivos se introducen en el dispositivo de celda de flujo, solos o en combinación, según sea necesario para cada etapa de procesamiento, y pasan a través de los poros del hidrogel en el dispositivo de celda de flujo, mientras que el material genético se retiene dentro del hidrogel y se procesa en él. Una ventaja de los métodos expuestos en la presente memoria es que proporcionan un microentorno encapsulado para el procesamiento de ácidos nucleicos dentro de un hidrogel en un dispositivo de celda de flujo, proporcionando de este modo un sistema de procesamiento de ácidos nucleicos simplificado. Esto permite el procesamiento de células individuales para un procesamiento rápido y eficiente de un ácido nucleico diana dentro de un dispositivo de celda de flujo. Los adaptadores pueden incluir sitios de cebadores de secuenciación, sitios de cebadores de amplificación, e índices. En algunos ejemplos, las genotecas de ácidos nucleicos se pueden preparar dentro de un hidrogel en un dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, por ejemplo, el material genético encapsulado dentro de un hidrogel puede utilizarse para la indexación combinatoria de las células individuales, por ejemplo, utilizando un enfoque de transposición que preserva la contigüidad (CPTSeq). En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos de una única célula pueden codificarse mediante la encapsulación de células individuales después de la amplificación por WGA con transposones codificados con códigos de barras que disuelven el hidrogel poniéndolo en contacto con un agente reductor, por ejemplo, para liberar el ADN genómico para la codificación de barras.

Adicionalmente, los ejemplos de los métodos y técnicas de “ indexación espacial” descritos en la presente memoria acortan el análisis de datos y simplifican el proceso de preparación de genotecas a partir de células individuales y moléculas de ADN largas. Los protocolos existentes para la secuenciación de células individuales implican una separación física eficiente de las células y un código de barras único para cada célula aislada y la agrupación de todo para realizar la secuenciación. Los protocolos actuales para lecturas largas sintéticas suelen utilizar engorrosas etapas de codificación de barras y agrupan cada fragmento del código de barras para secuenciarlo y permitir el análisis de datos para distinguir la información genética que proviene de cada célula con código de barras. Durante estos largos procesos también hay una pérdida de material genético que provoca pérdidas en las secuencias. Los ejemplos descritos en la presente memoria no solo acortan el proceso sino que también aumentan la resolución de datos para células individuales. Además, los ejemplos proporcionados en la presente memoria simplifican el ensamblaje de genomas de nuevos organismos. Los ejemplos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para revelar variaciones genéticas raras y la coaparición de mutaciones. En algunos ejemplos, la genoteca de ADN confinada en las perlas de hidrogel hasta su liberación brinda la oportunidad de controlar el tamaño de los fragmentos que se liberan en la superficie controlando el proceso de liberación y la formulación del hidrogel.

D. Preparación de genotecas de ácidos nucleicos en un dispositivo de celda de flujo dentro del hidrogel

En algunos ejemplos, las genotecas de secuenciación se pueden preparar a partir del material genético (tal como las moléculas de ácido nucleico diana) encapsulado dentro del hidrogel en el dispositivo de celda de flujo. Por ejemplo, la genoteca de secuenciación se puede preparar como se ha descrito anteriormente para la preparación de genotecas de secuenciación en perlas de hidrogel. En varios ejemplos, el ácido nucleico diana se aísla de una única célula encapsulada dentro del hidrogel en el dispositivo de celda de flujo.

En algunos ejemplos, el material genético atrapado (por ejemplo, células individuales) dentro del hidrogel del dispositivo de celda de flujo de hidrogel se lisa y los ácidos nucleicos aislados se procesan adicionalmente mediante amplificación, tagmentación u otro método de preparación de genotecas de ácidos nucleicos y, a continuación, se siembran en la superficie de un dispositivo de celda de flujo. En algunos ejemplos, el soporte sólido comprende una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Este puede fabricarse, como se sabe generalmente en la técnica, utilizando una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación, fotolitografía, técnicas de estampado, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la materia, la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del sustrato de la matriz. En algunos ejemplos, la matriz de pocillos o depresiones tiene un diámetro de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 50 pm, tal como 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm o 50 pm de diámetro, o un diámetro dentro de un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, los pocillos o depresiones tienen una profundidad de 0,5 pm a 1 pm, tal como 0,5 pm, 0,6 pm, 0,7 pm, 0,8 pm, 0,9 pm, o 1 pm de profundidad, o una profundidad dentro de un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriormente mencionados. En algunos ejemplos, los pocillos o depresiones están hechos de un material hidrófobo. En algunos ejemplos, el material hidrófobo incluye un fluoropolímero amorfo, que incluye, por ejemplo, CYTOP, Fluoropel® o Teflon®. En algunos ejemplos, la naturaleza hidrófoba de los pocillos mejora el aislamiento del ADN genómico de las células individuales durante el procesamiento enzimático y reduce la interferencia entre las poblaciones de ADN sembrado.

Los ejemplos de los sistemas y métodos proporcionados en la presente memoria incluyen kits, que contienen uno o más de los polímeros de hidrogel, reticulantes, o dispositivos microfluídicos para preparar perlas de hidrogel que encapsulan material genético, e incluyen además componentes útiles para el procesamiento del material genético, incluidos los reactivos para la lisis celular y la amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos, o para la preparación de genotecas de ácidos nucleicos, que incluyen lisozima, proteinasa K, hexámeros aleatorios, merasa (por ejemplo, ADN polimerasa de 029, polimerasa Taq, polimerasa Bsu), transposasa (por ejemplo, Tn5), cebadores (por ejemplo, secuencias adaptadoras P5 y P7), ligasa, enzima catalizadora, desoxinucleótidos trifosfatos, reguladores o cationes divalentes tal como se describe en la presente memoria y tal como se utiliza para el procesamiento respectivo del material genético.

Ejemplos de trabajo

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar las características particulares de ciertos ejemplos, pero el alcance de las reivindicaciones no debe limitarse a las características ejemplificadas.

Ejemplo 1

Captura de celda de flujo de perlas de hidrogel degradables que contienen moléculas de ácido nucleico encapsuladas

Este ejemplo ilustra la preparación de perlas de hidrogel que encapsulan moléculas de ácido nucleico utilizando generadores manuales de gotas microfluídicas y de vórtex.

El tamaño de poro de las perlas de hidrogel se seleccionó para permitir la difusión de enzimas, productos químicos y cebadores de menor tamaño (<50 bps), pero retuvo el ADN de mayor tamaño (>300 bps) de modo que el ADN genómico y la genoteca de ADN producida se retengan dentro de las perlas de gel durante la preparación de la genoteca.

Se preparó una solución de hidrogel al 12 % a partir de acrilamida al 40 %/bis 19:1 (BioRad n.° 161-0144) diluida con agua desionizada. Un 40 % (p/v) de acrilamida/N,N'bis(acriloil)cistamina (BA Cy) (19): 1) se preparó una solución madre de monómero (3,8 g de acrilamida, 0,2 g de BACy y 6 ml de (dd) H20 doblemente destilado). La mezcla se llevó a un volumen final de 10 ml. Para preparar la solución, la acrilamida se disolvió en 6 ml de ddH20 y la solución resultante se utilizó para disolver el BACy. La disolución de los monómeros es endotérmica, por lo que calentar ligeramente la mezcla ayudará a disolver completamente los monómeros. La solución de hidrogel se mantuvo a 4 °C hasta su uso. 35 pl de solución saturada de persulfato de potasio (KPS; Sigma) se añadió a 200 pl de la solución de hidrogel al 12 % y se mezcló bien.

Las muestras de ADN genómico se transfirieron a un tubo estéril de 1,7 ml. La solución de 235 pl de hidrogel-KPS se añadió a cada tubo que contenía una muestra de ADN genómico. La solución de ADN genómico de hidrogel se cargó después en 600 pl de aceite mineral con surfactante (4,5 % de Span 80, 0,4 % de Tween 20 y 0,05 % de Triton X-100). La solución se agitó con vórtice durante 30 segundos para generar una emulsión en forma de gotículas, y se añadieron inmediatamente 25 pl de TEMED (Sigma), seguidos de otros 30 segundos de agitación de vórtice.

Para hacer un gel al 10%con una relación acrilamida/BACY de 19:1 (2 ml), se mezclaron 0,96 ml de ddH20, 0,5 ml de acrilamida al 40 %/BACY (19:1), 0,5 ml de regulador Tris/borato/EDTA (TBE) 10 veces, 20 j l de TEMED y 20 j l de KPS (saturado).

Para hacer un gel al 5 % con una relación acrilamida/BACY de 19:1 (2 ml), 1,21 ml de ddH20, 0,25 ml de acrilamida al 40 % /BACY (19: I), se mezclaron 0,5 ml de I Ox TBE, 20 j l de TEMED y 20 j l de KPS (saturado). La reacción se dejó polimerizar hasta la gelificación (6 min).

A continuación, se generaron perlas de hidrogel que encapsulaban el ADN genómico. Tras la incubación durante 15 minutos para permitir que las perlas de hidrogel se reticularan por completo, se añadieron aproximadamente 900 j l de éter de petróleo a cada tubo. Los tubos se agitaron con vórtice para lavar el aceite y se retiró el sobrenadante. Las perlas de hidrogel se lavaron, después se agitaron con vórtice y se hicieron girar las perlas. Las perlas se volvieron a suspender y se pueden almacenar a 4 °C durante al menos 3 semanas.

El método descrito anteriormente utilizando una emulsión manual se utilizó para generar perlas de hidrogel que tenían una distribución de tamaños de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 100 jm de diámetro.

Para generar perlas de hidrogel de una distribución de tamaño uniforme, se utilizó un generador de gotículas microfluídicas (véase la figura 3). Se cargó una solución acuosa que contenía un polímero de hidrogel y fragmentos de ADN genómico en el cartucho de un generador de gotas microfluídicas y se introdujo en aceite mineral en el generador de gotículas microfluídicas (figura 3A). El dispositivo microfluídico tenía una altura de 120 jm con un ancho de canal acuoso de 75 jm y un ancho de canal de aceite portador de 78 jm . Con este dispositivo, se utilizaron caudales de 60 jl/m in para el canal acuoso y 300 jl/m in para el canal de aceite portador. Utilizando este dispositivo, se generaron perlas de hidrogel de aproximadamente 120 jm de diámetro (figura 3B). El tamaño de las perlas se puede ajustar con precisión ajustando los anchos de los canales, el tamaño del dispositivo microfluídico, y los caudales.

Las perlas de hidrogel que contenían los fragmentos de ADN genómico se inmovilizaron en una celda de flujo de secuenciación MiSeq™ (Figura 3C) (Illumina, San Diego, CA). Las perlas se capturaron en la celda de flujo debido a restricciones físicas. Las perlas de hidrogel tienen aproximadamente 120 jm de diámetro y el canal de la celda de flujo de secuenciación tiene aproximadamente 100 jm de altura. La celda de flujo con las perlas capturadas se insertó en un secuenciador MiSeq™ para su posterior procesamiento (figura 3D).

Ejemplo 2

Preparación de la genoteca de secuenciación en perlas y siembra de celdas de flujo

Este ejemplo demuestra un proceso para preparar una genoteca de secuenciación a partir del ADN genómico contenido en una perla de hidrogel capturada en una celda de flujo de secuenciación, y la posterior siembra de la genoteca de nucleótidos preparada en la celda de flujo.

Las perlas de hidrogel que contenían fragmentos de ADN genómico encapsulados se capturaron en la superficie de una celda de flujo MiSeq™ como se describe en el ejemplo 1. La solución que contenía enzimas y reactivos para la preparación de la genoteca de ADN a partir del<a>D<n>genómico de las perlas capturadas en la celda de flujo de secuenciación se hizo fluir a la celda de flujo para preparar la genoteca de ADN en la perla de hidrogel (figuras 4A y 4B). Las perlas de hidrogel capturadas tienen un tamaño de poro que permite la difusión de enzimas, productos químicos y cebadores de menor tamaño (<50 bps), pero retiene ADN de mayor tamaño (>300 bps). A continuación, se cargó aceite mineral en la celda de flujo de secuenciación para llenar el vacío entre las perlas y rodear las perlas de hidrogel capturadas que contenían la genoteca de ADN. La temperatura de la celda de flujo MiSeq™ se elevó después a 90 °C durante 3 minutos para desnaturalizar la genoteca de ADN y degradar las perlas de hidrogel. Como se muestra en la figura 4C, la genoteca de ADN desnaturalizado se difundió fuera de las perlas de hidrogel y, debido a la presencia del aceite mineral, permaneció en una región definida por el diámetro de la perla. Por lo tanto, en presencia del aceite, la siembra se produce muy cerca de la huella de cada perla de hidrogel (a partir de perlas de hidrogel de 120 jm de diámetro, la siembra de la genoteca se limita a un área de aproximadamente 120 jm de diámetro). La temperatura de la celda de flujo MiSeq™ se redujo a 60 °C durante 6 minutos, a 40 °C durante 2 minutos y a 20 °C durante 2 minutos para permitir que la genoteca de ADN monocatenario se hibridara con los cebadores P5/P7 de la superficie de la celda de flujo para sembrar la genoteca en la superficie de la celda de flujo.

Posteriormente, la genoteca sembrada se puede agrupar y secuenciar con la química de SBS estándar.

Ejemplo 3

Secuenciación de ácidos nucleicos mediante perlas de hidrogel

Este ejemplo proporciona los resultados de los ensayos de secuenciación que utilizan perlas de hidrogel para la indexación espacial de las moléculas de ácido nucleico en la superficie de una celda de flujo.

Se ensayaron tres flujos de trabajo diferentes para la secuenciación de moléculas de ADN largas (véanse las figuras 5A-5C). Se probaron dos longitudes de fragmentos de ADN diferentes (~100 kb y ~10 kb), así como una etapa de MDA en la perla para amplificar el ADN genómico en las perlas de hidrogel antes de la preparación de la genoteca de secuenciación.

Se generaron perlas de hidrogel que contenían fragmentos de ADN genómico encapsulado de ~100 kb o ~10 kb como se describe en el ejemplo 1. Para cada longitud de fragmento, se evaluó el MDA en las perlas antes de la generación de la genoteca.

Las perlas de hidrogel resultantes se cargaron en una celda de flujo de secuenciación MiSeq™ y las genotecas de secuenciación se generaron mediante una reacción de tagmentación utilizando reactivos y procedimientos de Nextera™ (Illumina, San Diego, CA). A continuación, se cargó aceite mineral en la celda de flujo para rodear las perlas capturadas. La temperatura de la celda de flujo se elevó después a 90 °C durante 3 minutos para desnaturalizar la genoteca de ADN y degradar las perlas de hidrogel. La genoteca de ADN desnaturalizado se difundió fuera de las perlas de hidrogel y, debido a la presencia del aceite mineral, permaneció en la región definida por el diámetro de la perla. La temperatura de la celda de flujo MiSeq™ se redujo a 60 °C durante 6 minutos, a 40 °C durante 2 minutos y a 20 °C durante 2 minutos para permitir que la genoteca de ADN monocatenario se hibridara con los cebadores P5/P7 de la superficie de la celda de flujo para sembrar la genoteca en la superficie de la celda de flujo. Posteriormente, la genoteca sembrada se agrupó y secuenció con la química estándar de SBS y las lecturas se procesaron mediante análisis estroboscópicos y de lectura enlazada.

En el primer ensayo (véase la figura 6), se generaron perlas de hidrogel que contenían ADN genómico humano (Cornell) que tenía un tamaño de fragmento de aproximadamente 100 kb con ~100 fragmentos por perla. No se realizó la amplificación de MDA en la perla antes de la generación de la genoteca de secuenciación en la perla. El análisis de lectura estroboscópica de las lecturas de secuencia resultantes (1 lectura cada 328 o 400 pb) mostró un promedio de ~405 islas de secuencia por perla con un tamaño promedio de isla de 64 kb y un promedio de 33 agrupaciones por isla.

En el segundo ensayo (véase la figura 7), se generaron perlas de hidrogel que contenían ADN genómico humano (Cornell) que tenía un tamaño de fragmento de aproximadamente 100 kb con ~50 fragmentos por perla. Se realizó la amplificación de MDA antes de la generación de la genoteca de secuenciación en perlas. El análisis de lectura enlazada de las lecturas de secuencia resultantes mostró un promedio de aproximadamente 166 islas de secuencia por perla, con un tamaño promedio de isla de 58 kb y un promedio de 85 grupos por isla.

En el tercer ensayo (véase la figura 8), se generaron perlas de hidrogel que contenían ADN genómico humano (Cornell) que tenía un tamaño de fragmento de ~10 kb con ~100 fragmentos por perla. Se realizó la amplificación de MDA en la perla antes de la generación de la genoteca de secuenciación en la perla. El análisis de lectura enlazada de las lecturas de secuencia resultantes mostró un promedio de ~85 islas de secuencia por perla con un tamaño promedio de isla de 10,4 kb y un promedio de 57 grupos por isla.

En conjunto, los resultados demuestran la utilidad de los ensayos que utilizan perlas de hidrogel que proporcionan una indexación espacial para sembrar y secuenciar moléculas de ADN largas. Además, la segregación espacial de los parches de agrupaciones en la superficie de la celda de flujo permite que las moléculas de ácido nucleico diana se reconstruyan a partir de lecturas de secuencia más cortas de parches de grupo individuales.

Ejemplo 4

Perlas de hidrogel con núcleo hueco

Este ejemplo ilustra la construcción de perlas de hidrogel con un núcleo hueco que contiene moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas.

La figura 9A proporciona un diagrama esquemático que ilustra la construcción de las perlas de hidrogel huecas. En primer lugar, se forma una capa interna de hidrogel que contiene material genético encapsulado, tal como moléculas de ácido nucleico diana. La capa de hidrogel interna se encapsula entonces con una capa de hidrogel externa. La capa de hidrogel interna se despolimeriza después utilizando un agente que no despolimeriza la capa de hidrogel externa, dejando la capa de hidrogel externa con un espacio hueco que contiene el material genético.

La figura 9B muestra micrografías de un núcleo interno de hidrogel de poliacrilamida que contiene moléculas de ácido nucleico encapsuladas antes (izquierda) y después (derecha) de la encapsulación con una cubierta externa de poliacrilamida y la despolimerización del hidrogel central utilizando un agente de despolimerización que escinde el reticulante utilizado para formar el hidrogel interno. La figura 9C muestra micrografías de un núcleo interno de hidrogel de agarosa que contiene moléculas de ácido nucleico encapsuladas antes (izquierda) y después (derecha) de la encapsulación con una cubierta exterior de poliacrilamida y la despolimerización del hidrogel central mediante calentamiento a 60 °C.

Las perlas de hidrogel huecas resultantes que contienen moléculas de ácido nucleico encapsuladas pueden cargarse en una celda de flujo de secuenciación para secuenciar las moléculas de ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria.

Ejemplo 5

Uso del lisado celular para generar perlas de hidrogel degradables que encapsulan las moléculas de ácido nucleico diana

Este ejemplo proporciona los resultados de los ensayos de secuenciación que utilizan perlas de hidrogel para la indexación espacial de las moléculas de ácido nucleico en la superficie de una celda de flujo, en donde las perlas de hidrogel contienen moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas preparadas en perlas a partir del lisado celular.

Las células humanas del cultivo tisular se añadieron directamente al regulador de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM, SDS al 0,5 % y 50 pg/ml de RNasa A) y se incubaron durante 5 minutos. Después, la solución precursora de hidrogel como la descrita en el ejemplo 1 se añadió al lisado en una proporción de 1:1 y la solución resultante se proporcionó a la entrada de un generador de gotas para generar las perlas de hidrogel. Las perlas se cargaron en una celda de flujo de secuenciación, se prepararon genotecas de secuenciación y se sembraron en la superficie de la celda de flujo, y se realizó un ensayo de secuenciación como se describe en los ejemplos 2 y 3. La distribución del tamaño de las islas y las islas más largas observadas se muestran en las figuras 10B y 10C.

Ejemplo 6

Multiplexación de muestras

Este ejemplo ilustra ejemplos de métodos de indexación de muestras que se pueden utilizar para interrogar múltiples muestras de ácido nucleico en una sola celda de flujo de secuenciación.

Para generar información enlazada de lectura prolongada a partir de varias muestras en el mismo carril de celdas de flujo, se pueden utilizar transposones con diferentes índices para etiquetar cada muestra con un índice diferente en el que se confía posteriormente para identificar los parches de agrupaciones correspondientes a cada muestra. Las moléculas de ácido nucleico diana se tagmentan con un índice único para cada muestra antes de la captura de las perlas en la celda de flujo. Diferentes muestras de ADN genómico humano se encapsulan en perlas de hidrogel como se describe en el ejemplo 1 y se etiquetan por separado utilizando diferentes transposones indexados antes de cargar las perlas en la celda de flujo. Las perlas de hidrogel que contienen el ADN tagmentado se agrupan y capturan en una celda de flujo de secuenciación, tras lo cual se completa la preparación de la genoteca de secuenciación, se carga una barrera de difusión de líquidos en la celda de flujo de secuencias y las perlas de hidrogel se degradan en presencia de la barrera de difusión de líquidos para sembrar las genotecas de secuenciación en la superficie de la celda de flujo. Los parches sembrados contienen diferentes secuencias de índice de ADN correspondientes a diferentes muestras y pueden separarse entre sí durante el análisis de lectura posterior a la secuenciación.

En un ejemplo adicional, para generar información enlazada de lectura larga a partir de múltiples muestras en el mismo carril de celdas de flujo, las perlas de hidrogel de cada muestra se procesaron secuencialmente en la celda de flujo, utilizando transposones indexados de manera diferente para cada muestra, para identificar los parches de agrupaciones correspondientes a cada muestra. Las perlas que contenían la primera muestra se cargaron en la celda de flujo y los ácidos nucleicos diana se etiquetaron utilizando un transposón indexado. Después de que la genoteca de la primera muestra se liberara de la perla y se sembrara en la celda de flujo, se cargó una segunda ronda de perlas de hidrogel que contenían una segunda muestra de ácido nucleico diana en la celda de flujo y se segmentó utilizando un transposón indexado distinto para generar una segunda genoteca indexada que se liberó de manera espacialmente limitada para sembrarla en la superficie de la celda de flujo. Esto proporciona parches sembrados que contienen diferentes secuencias de índice de ADN correspondientes a diferentes muestras que pueden separarse entre sí durante el análisis de lectura posterior a la secuenciación. La figura 11 muestra una imagen generada a partir de parches de ADN de hidrogel superpuestos de dos muestras diferentes (cada una con un código de barras de ADN diferente introducido durante la etapa de tagmentación) procesadas utilizando esta estrategia de siembra secuencial. Los parches de agrupaciones de la primera muestra están marcados con un asterisco (*); los parches de la segunda muestra no están marcados.

En un ejemplo adicional, para generar información enlazada de lectura larga a partir de múltiples muestras en el mismo carril de celdas de flujo, las moléculas de ácido nucleico exógenas pueden añadirse a diferentes muestras de ácido nucleico diana en la etapa de encapsulación. Se mezclan diferentes muestras de ADN genómico humano con distintos marcadores de ADN exógeno (tales como ADN Phi-X, A1, A3 o A3), y la mezcla se encapsula en perlas de hidrogel como se describe en el ejemplo 1. Las perlas de hidrogel generadas a partir de cada muestra se agrupan, se cargan en la celda de flujo de secuenciación, se tagmentan para generar genotecas de secuenciación y se degradan en presencia de una barrera de difusión de líquidos para sembrar las genotecas de secuenciación en la superficie de la celda de flujo. Las moléculas de ácido nucleico exógenas sirven como marcador para identificar los parches sembrados correspondientes a cada muestra.

En un ejemplo adicional, para maximizar la utilización de la celda de flujo para la generación de datos de secuenciación y, opcionalmente, para generar información de lectura a partir de múltiples muestras en el mismo carril de celdas de flujo, se añadió una etapa adicional al flujo de trabajo tras la siembra de la genoteca de secuenciación a partir de las perlas de hidrogel. En esta etapa, el espacio intersticial entre las huellas de las perlas de hidrogel en la celda de flujo tiene una baja densidad de genoteca sembrada. Para utilizar este espacio intersticial, se llevó a cabo una etapa de siembra adicional utilizando una genoteca de secuenciación de lectura corta normal producida a partir de la misma muestra de ácido nucleico diana que la encapsulada en las perlas de hidrogel. Esta genoteca de lectura corta se sembró en la celda de flujo de secuenciación utilizando métodos estándar y contiene un índice de ADN distinto del utilizado para la genoteca encapsulada dentro de las perlas de hidrogel para separar las lecturas de las genotecas de lectura larga y corta enlazadas. La figura 12 muestra las pseudoimágenes correspondientes de antes y después de la siembra del espacio intersticial. Con este enfoque, se logró una mayor cobertura de la muestra de ADN diana, lo que proporciona una mayor precisión de identificación de los SNP.

Ejemplo 7

Método de fabricación de un dispositivo de celda de flujo con una capa de hidrogel

El siguiente ejemplo demuestra un método para fabricar un dispositivo de celda de flujo que tiene una capa de hidrogel depositada sobre el mismo.

Un dispositivo de celda de flujo que tenía una superficie se recubrió con un polímero de superficie, tal como PAZAM o SFA, como se muestra en la figura 13A, etapa (a). Como se muestra en la etapa (b), una solución precursora de hidrogel que tenía un polímero de hidrogel, un reticulante y células se hizo fluir al dispositivo de celda de flujo, cubriendo la superficie sólida del dispositivo de celda de flujo. La mayor parte de la solución precursora de hidrogel se desplazó con aceite para crear una película de hidrogel residual que contenía material genético. El aceite que contenía TEMED (25 |jl de TEMED en 600 |jl de aceite mineral) se hizo fluir a través de la superficie para iniciar la reticulación de la película de hidrogel residual como se muestra en la etapa (c). El aceite que contenía el agente de reticulación se retiró, dejando atrás las células en la matriz de hidrogel reticulado, como se muestra en la etapa (d).

Ejemplo 8

Método de agrupamiento de moléculas de ADN sembradas en un dispositivo de celda de flujo que tiene una capa de hidrogel

El siguiente ejemplo demuestra un método para agrupar moléculas de ADN sembradas en un dispositivo de celda de flujo fabricado en el ejemplo 7, que tiene células encapsuladas en la capa de hidrogel.

Se preparó un dispositivo de celda de flujo del ejemplo 7, que tenía una capa de hidrogel con células depositadas en su interior. El regulador de lisis se introdujo en el dispositivo de celda de flujo, como se muestra en la figura 13B, etapa (a). Los agentes de lisis en el regulador de lisis permeabilizaron la pared celular de las células en la capa de hidrogel reticulado. Los agentes de lisis utilizados incluyen lisozimas o detergentes. La proteinasa K se introdujo en el dispositivo de celda de flujo para liberar los ácidos nucleicos de los complejos unidos.

A continuación, las moléculas de ADN genómico de una única célula se amplificaron utilizando MDA para crear varias copias del ADN, como se muestra en la figura 13B, etapa (b), mediante la introducción de reactivos de MDA en el dispositivo de celda de flujo. La superficie del dispositivo de celda de flujo se lavó después con regulador para permitir que los amplicones cortos se difundieran fuera de la capa de hidrogel y se introdujo aceite en el dispositivo de celda de flujo, cubriendo la capa. La superficie se calentó a 80 °C para promover la difusión lateral de las moléculas de ADN para sembrarlas aparte de la ubicación de captura inicial, como se muestra en la figura 13B, etapa (c). Una vez que el ADN se sembró en la capa de PAZAM, el gel reticulado se lavó utilizando un agente reductor, tal como THP, TCEP o DTT, que desreticula el gel, como se muestra en la figura 13B, etapa (d).

Finalmente, las moléculas de ADN sembradas individuales se agruparon utilizando ExaMP o agrupamiento estándar, como se muestra en la figura 13B, etapa (e). Los datos de secuenciación resultantes se recopilaron utilizando información espacial de los grupos, que se pudo obtener porque los grupos de la misma célula se siembran en la misma proximidad física.

Ejemplo 9

Método de fabricación de un dispositivo de celda de flujo con un pilar de hidrogel

El siguiente ejemplo demuestra un método para fabricar un dispositivo de celda de flujo que tiene un hidrogel depositado sobre el mismo en forma de pilares.

Se prepararon perlas de hidrogel con material genético encapsulado en las mismas. Para preparar las perlas de hidrogel, se utilizó el siguiente proceso.

Se preparó una solución de hidrogel al 12%(p/v) a partir de acrilamida al 40 %/bis 19:1 (BioRad n.° 161-0144) diluida con agua desionizada. Se preparó una solución madre de monómero de acrilamida/N, N'-bis(acriloil)cistamina (BaCy) (19:1) al 40 % (p/v) (3,8 g de acrilamida, 0,2 g de BaCy y 6 ml de (dd) H2O doblemente destilada), y el volumen final se llevó a 10 ml. La solución se preparó disolviendo primero la acrilamida en 6 ml de ddH2O, que después se utilizó para disolver el BACy. La disolución de los monómeros es endotérmica, por lo que calentar ligeramente la mezcla ayuda a disolver completamente los monómeros. La solución de hidrogel se mantuvo a 4 °C hasta su uso. 35 pl de solución saturada de persulfato de potasio (KPS; Sigma) se añadió a 200 pl de solución de hidrogel al 12 % y se mezcló bien. Esta solución de hidrogel se puede utilizar para encapsular material genético, incluyendo ADN o células, como se describe en la presente memoria.

Para la encapsulación del ADN, se añadieron 20 pl de solución de ADN de Coriell (10 ng/pl) a los 235 pl de solución de hidrogel/KPS. Se añadieron 20 pl de la solución de hidrogel con ADN de Coriell a cada pocillo de muestra de una placa generadora de gotículas (BioRad QX200) y se añadieron 70 pl de aceite a cada pozo. T ras cargar la placa en el generador de gotas durante 2 minutos, se formaron 20.000 gotas. Se añadieron 50 pl de aceite TEMED (25 pl de TEMED en 600 pl de aceite mineral) a cada pocillo de gotículas recolectado para reticular las perlas. Tras 15 minutos de incubación, el hidrogel estaba completamente reticulado. Las perlas de hidrogel que contenían ADN de Coriell se cargaron directamente en una celda de flujo MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) y, a continuación, se lavaron con PR2, como se muestra en la figura 14. Las perlas de hidrogel tenían un diámetro de aproximadamente 120 pm, lo que hace que se fijen dentro del canal celular de alto flujo de 100 pm, formando pilares dentro del dispositivo de celda de flujo. El dispositivo de celda de flujo que tenía perlas de hidrogel capturadas en su interior estaba entonces listo para el procesamiento del ADN.

Para la encapsulación celular, las muestras que contenían células de E.colialmacenadas a -80 °C se descongelaron a temperatura ambiente. Se transfirieron 100 pl de solución bacteriana a un tubo estéril de 1,7 ml y la muestra se lavó una vez con 1 ml de NaCl al 0,85 %. La muestra se granuló y la solución de lavado se retiró. El sedimento de bacterias se guardó para mezclarlo con la solución de hidrogel que se describe a continuación.

Se transfirieron 5 pl de resuspensión de E.colien PR2 a un tubo de PCR limpio, se añadieron 200 pl de la mezcla de hidrogel más KPS y se mezclaron bien. Se añadieron 20 pl de solución de mezcla de polímeros de E.colicomo se describió anteriormente a cada pocillo de muestra en una placa generadora de gotas (BioRad QX200), y se añadieron 70 pl de aceite en cada pozo petrolífero. Después de cargar la placa en el generador de gotas, se formaron aproximadamente 20.000 gotas en 2 minutos y se añadieron 50 pl de aceite TEMED (25 pl de TEMED en 600 pl de aceite mineral) a cada pocillo de gotículas recolectado. Tras 15 minutos de incubación, el hidrogel estaba completamente reticulado. Las perlas se cargaron directamente en una celda de flujo MiSeq™ y después se lavaron con PR2, y las perlas de gel tenían un diámetro de aproximadamente 120 pm y se pegaron dentro del canal de celda de flujo alto de 100 pm. La celda de flujo puede utilizarse entonces para procesar las células bacterianas y los ácidos nucleicos para la preparación de la genoteca de ácidos nucleicos.

Las perlas de hidrogel que contienen el ADN de Coriell o las células bacterianas se pueden deshidratar para reducir el tamaño de las perlas antes de introducir las perlas en el dispositivo de celda de flujo. Como se muestra en las figuras 16A-16C, las perlas deshidratadas que contienen las muestras se diseñaron para ajustarse dinámicamente adaptando su nivel de hidratación. Las perlas deshidratadas de aproximadamente 70 pm (figura 16A) pueden cargarse fácilmente en una celda de flujo que tiene una altura de canal de 100 pm. A medida que las perlas de hidrogel se hidratan, comienzan a agrandarse (figura 16b ) y, finalmente, alcanzan su tamaño original de 105 pm con la hidratación completa (figura 16C).

Como se muestra en las figuras 15A-15C, el dispositivo de celda de flujo puede incluir una superficie con patrones que incluye un patrón para separar y localizar individualmente cada perla de hidrogel. Se puede utilizar una matriz con patrones de micropocillos para capturar las perlas de hidrogel mientras están en estado deshidratado. A continuación, el reactivo puede fluir a través de la celda de flujo para rehidratar las perlas de hidrogel y fijarlas en el canal y continuar con los ensayos posteriores. El dispositivo puede ser un sustrato a base de silicio o vidrio recubierto con material hidrófobo (que puede ser CYTOP, Fluoropel®, o Teflon®, u otro material hidrófobo) y, a continuación, se modela fotolitográficamente con matrices de micropocillos (los diámetros y los tonos varían según el tamaño de las perlas de hidrogel diana) y se puede grabar, de modo que los pocillos puedan grabarse o la superficie funcionalizarse para capturar las perlas de hidrogel con la matriz. La superficie con patrones del dispositivo de celda de flujo puede utilizarse para aumentar la cantidad de perlas de hidrogel dentro del dispositivo de celda de flujo y para la liberación precisa de ADN en ubicaciones designadas dentro del dispositivo de celda de flujo.

Ejemplo 10

Preparación de genotecas de ADN en un dispositivo de celda de flujo

El siguiente ejemplo demuestra un método para preparar una genoteca de ADN en un dispositivo de celda de flujo que tiene un hidrogel depositado en el mismo en forma de pilares de hidrogel.

En la preparación de la genoteca de ADN se usó el dispositivo de celda de flujo descrito en el ejemplo 9, que tenía perlas de hidrogel fijadas en el mismo, que formaban columnas de hidrogel. El reactivo de transposoma T n5 (Nextera™, Illumina Inc.) se cargó en la celda de flujo y se incubó durante cinco minutos a 55 °C. Los adaptadores que contenían los extremos P5 y P7 se insertaron en el ADN. Se cargaron 50 pl de regulador de parada en la celda de flujo para eliminar las enzimas Tn5. La mezcla de extensión con polimerasa Bsu y nucleótidos para rellenar huecos se cargó en el dispositivo de celda de flujo para preparar la genoteca de ácidos nucleicos, que se preparó y se fijó dentro de la matriz de perlas de hidrogel. El regulador de lavado PR2 se cargó en el dispositivo de celda de flujo y la temperatura se elevó a 90 °C durante tres minutos para desnaturalizar la genoteca de ADN, que se difundió fuera de las perlas de hidrogel. Después, la temperatura se redujo a 60 °C durante seis minutos, a 40 °C durante dos minutos y a 20 °C durante dos minutos para permitir que la genoteca de ADN monocatenario se hibridara con los cebadores P5/P7 de la superficie para la amplificación de agrupaciones. La celda de flujo se utilizó directamente en la fabricación de cebadores de amplificación, linealización y secuenciación en puente de 30 ciclos. Después se realizó un ciclo de secuenciación de 2x150 y las secuencias determinadas se alinearon con las secuencias de Coriell.

Las figuras 19A y 19B muestran imágenes fluorescentes de perlas de hidrogel teñidas que contienen ADN de Coriell (figura 19A) y la densidad del gradiente de la agrupación del ADN amplificado sembrado (figura 19B). Los resultados de la secuenciación del ADNg humano se proporcionan en la figura 20. La figura 20A es una puntuación Q-Score global de las lecturas de un único experimento. La figura 20B muestra la tasa de error de emparejamiento del mismo experimento. Los resultados de la secuenciación incluyeron 151.101 agrupaciones/mosaico, un 92 % de agrupaciones, un 67 % de alineación, una tasa de error de emparejamiento del 0,41 % y una longitud media de 186.

Ejemplo 11

Aislamiento de ADN y preparación de genotecas a partir de células bacterianas en un dispositivo de celda de flujo

El siguiente ejemplo demuestra un método para aislar el ADN de células bacterianas en un dispositivo de celda de flujo y preparar una genoteca de ADN en el dispositivo de celda de flujo que tiene un hidrogel depositado en el mismo en forma de pilares de hidrogel que encapsulan las células bacterianas.

Se proporcionó el dispositivo de celda de flujo del ejemplo 9 que tiene perlas de hidrogel con células bacterianas encapsuladas en las mismas. Se cargaron 100 pl de reactivos de lisis bacteriana (Life Technologies, 0,5 mg de lisozima en el kit Charge Switch de 100 pl de regulador de resuspensión) en la celda de flujo y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. El reactivo de proteinasa K se cargó después en la celda de flujo y se incubó a 55 °C durante 20 minutos para digerir completamente las proteínas. En esta etapa, el ADNg de E.coliquedó expuesto pero se fijó dentro de las perlas de hidrogel, que quedaron atrapadas en el dispositivo de celda de flujo. Tras lavar con PR2, se cargó el reactivo de transposoma Tn5 (Nextera™, Illumina Inc.) en la celda de flujo y se incubó a 55 °C durante cinco minutos. Los adaptadores que contenían los extremos P5 y P7 se insertaron en el ADN. Se cargaron 50 pl de regulador de parada en el dispositivo de celda de flujo para desactivar las enzimas Tn5. Se cargó en el dispositivo una mezcla de extensión que contenía polimerasa Bsu y nucleótidos para llenar los huecos, preparando de este modo una genoteca de ácidos nucleicos de E.coli,que se fijó dentro de las perlas de hidrogel que quedaron atrapadas dentro del dispositivo de celda de flujo. A continuación, se añadió el regulador de lavado PR2 y la temperatura se elevó a 90 °C durante tres minutos para desnaturalizar la genoteca de ADN, que se difundió fuera de las perlas de hidrogel. Después, la temperatura se redujo a 60 °C durante seis minutos, a 40 °C durante dos minutos y a 20 °C durante dos minutos para permitir que la genoteca de ADN monocatenario se hibridara con los cebadores P5/P7 de la superficie para la amplificación de agrupaciones. La celda de flujo se utilizó directamente en la fabricación de cebadores de amplificación, linealización y secuenciación en puente de 30 ciclos. Después se realizó un ciclo de secuenciación de 2x150 y las secuencias determinadas se alinearon con las secuencias de E.coli.

La figura 21A ilustra esquemáticamente el proceso de preparación de una genoteca de ácidos nucleicos según el ejemplo 11. Las células se aislaron en perlas de hidrogel, se cargaron en un dispositivo de celda de flujo y se rehidrataron para fijar la perla de hidrogel dentro del dispositivo de celda de flujo. El reactivo de lisis lisó células en las perlas de hidrogel y la preparación de la genoteca se realizó en el ADN bacteriano. A continuación, el ADN se liberó y se sembró en la superficie del dispositivo de celda de flujo que rodeaba las perlas. Como se muestra en la figura 21B, la genoteca de ADN se encapsuló dentro de las perlas de hidrogel antes de la liberación y se difundió desde las perlas de hidrogel después de la liberación (figura 21C). Las imágenes fluorescentes de los grupos teñidos con SYTOX revelaron grupos distintos muy cerca de las perlas de gel originales (figura 21D). Barras de escala = 50 pm.

Los términos “ sustancialmente” y “ aproximadamente” utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva se utilizan para describir y considerar pequeñas fluctuaciones. Por ejemplo, pueden referirse a menor o igual al ± 5 %, tal como menor o igual al ± 2 %, tal como menor o igual al ± 1 %, tal como menor o igual al ± 0,5 %, tal como menor o igual al ± 0,2 %, tal como menor o igual al ± 0,1 %, tal como menor o igual al ± 0,05 %.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método, que comprende:

cargar perlas de hidrogel degradables en una celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel degradables en una superficie de la celda de flujo de secuenciación, en donde:

las perlas de hidrogel degradables contienen genotecas de secuenciación preparadas a partir de material genético encapsulado; o

las perlas de hidrogel degradables contienen material genético encapsulado, y el método comprende además preparar genotecas de secuenciación en las perlas de hidrogel degradable capturadas a partir del material genético; y

cargar una barrera de difusión de líquidos en la celda de flujo de secuenciación que rodea las perlas de hidrogel; y

degradar las perlas de hidrogel capturadas en presencia de la barrera de difusión de líquidos para inhibir la difusión de las genotecas de secuenciación más allá del diámetro de la perla de hidrogel correspondiente y para permitir el transporte y la siembra de las genotecas de secuenciación a la superficie de la celda de flujo de secuenciación en una proximidad relativamente cercana a un espacio de la perla de hidrogel correspondiente.
2 El método de la reivindicación 1, en donde cargar perlas de hidrogel degradables en la celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para la captura de las perlas de hidrogel degradables en la superficie de la celda de flujo de secuenciación comprende cargar las perlas de hidrogel degradables en la celda de flujo de secuenciación en condiciones suficientes para inmovilizar las perlas de hidrogel degradables en la superficie de la celda de flujo de secuenciación, y en donde cargar la barrera de difusión de líquidos en la celda de flujo de secuenciación que rodea las perlas de hidrogel comprende cargar la barrera de difusión de líquidos en las perlas de hidrogel degradables inmovilizadas en la superficie de la celda de flujo de secuenciación, de modo que la barrera de difusión de líquidos rodee las perlas de hidrogel.
3 El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el material genético se selecciona de al menos una de las moléculas de ácido nucleico diana, o células, y un lisado celular que comprende moléculas de ácido nucleico diana.
4 El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las genotecas de secuenciación comprenden ADN o ARN de al menos 150 nucleótidos de longitud.
5 El método de la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico diana es ADN genómico.
6 El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la barrera de difusión de líquidos es un aceite, una solución acuosa viscosa, o una combinación de los mismos; opcionalmente en donde:

(i) el aceite es aceite mineral, aceite de silicona, aceite perfluorado, o una combinación de dos o más de los mismos; o

(ii) la solución acuosa viscosa es una solución que contiene polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona, dextrano plurónico, sacarosa, poli(N-isopropilacrilamida) u óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (PEO-PPO-PEO)/laponita, o una combinación de dos o más de los mismos.
7 El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las perlas de hidrogel se degradan

(a) al poner en contacto las perlas de hidrogel con un reactivo que escinde un reticulante reversible que reticula los polímeros del hidrogel;

(b) al calentar las perlas de hidrogel a aproximadamente 90 °C;

(c) al exponer las perlas de hidrogel a una longitud de onda de luz que escinda un reticulante fotoescindible que reticula el polímero del hidrogel; o

(d) una combinación de (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); o (a), (b) y (c).
8. El método de la reivindicación 6, en donde el reactivo comprende ditiotreitol (DTT), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris(3-hidroxipropil)fosfina (THP), o una combinación de dos o más de los mismos.
9 El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las perlas de hidrogel

(i)tienen un diámetro de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 120 pm;

(ii) son perlas de hidrogel huecas que comprenden núcleos huecos que comprenden el material genético; o

(iii) comprenden poros que tienen un diámetro de tamaño suficiente para permitir la difusión de químicos a través de las perlas de hidrogel, mientras se conserva las genotecas de secuenciación encapsuladas, opcionalmente en donde los poros tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde preparar las genotecas de secuenciación comprende realizar una reacción de tagmentación en las moléculas de ácido nucleico diana dentro de las perlas de hidrogel; opcionalmente, en donde la reacción de tagmentación comprende poner en contacto las moléculas de ácido nucleico diana con una mezcla de transposasas que comprende secuencias adaptadoras y transposomas.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la captura de las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo de secuenciación comprende uno o más de:

restricción física de las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo de secuenciación; y la unión específica de un primer miembro de un par de unión específico en las perlas de hidrogel a un segundo miembro del par de unión específico en la superficie de la celda de flujo de secuenciación; que comprende opcionalmente la restricción física de las perlas de hidrogel en la superficie de la celda de flujo de secuenciación, en donde el diámetro de las perlas de hidrogel es de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 % mayor que la altura de la celda de flujo para restringir las perlas en la celda de flujo.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además amplificar moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas dentro de las perlas de hidrogel degradables; opcionalmente en donde:

(i) la amplificación implica una amplificación por desplazamiento múltiple; o

(ii) las moléculas de ácido nucleico diana encapsuladas son ADN genómico y la amplificación implica la amplificación del genoma completo.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además secuenciar las genotecas de secuenciación; opcionalmente, en donde la ubicación en la superficie de la celda de flujo de las genotecas de secuenciación sembradas a partir de las respectivas perlas de hidrogel degradables se utiliza como un índice espacial para las lecturas generadas a partir de la secuenciación de las genotecas de secuencias.
14. Un dispositivo de celda de flujo que comprende:

un soporte sólido que comprende una superficie que tiene un hidrogel degradable inmovilizado sobre la misma, en donde el hidrogel degradable comprende poros que están dimensionados para permitir la difusión de un reactivo a través del hidrogel, pero que son demasiado pequeños para permitir que un material genético atraviese los poros.
15. Un sistema que comprende:

una plataforma para sujetar un dispositivo de celda de flujo de la reivindicación 14; el dispositivo de celda de flujo; y

un detector para obtener datos de secuenciación.
16. Un método, que comprende: proporcionar un dispositivo de celda de flujo de la reivindicación 14;

aislar ácidos nucleicos del material genético en el hidrogel; y preparar una genoteca de ácidos nucleicos a partir de los ácidos nucleicos aislados.