ES2992544T3 - Reactivos, composiciones y métodos para mejorar la viabilidad y función de células, tejidos y órganos - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos, composiciones y métodos para mejorar la viabilidad y/o función de células o para la protección in vitro, ex vivo o in vivo de células, tejido, injerto u órganos frente a diversos daños. Los reactivos y la composición se basan en la activación de la respuesta al choque térmico y/o la respuesta antioxidante e incluyen, por ejemplo, inhibidores del cofactor HSP90 como Celastrol o análogos de Celastrol utilizados solos o en combinación con un agente adjunto (por ejemplo, un activador de NRF-2, antioxidante, etc.). La mejora terapéutica también puede incluir un aumento en la producción y señalización de efectores paracrinos. También se describen métodos para mejorar la resistencia de células, tejido, injertos u órganos a daños o estrés, como muerte celular inducida por estrés hipóxico u oxidativo, y/o para mejorar la viabilidad y retención de células trasplantadas o transfundidas. También se proporciona tratamiento terapéutico o prevención de lesiones isquémicas (por ejemplo, infarto de miocardio, lesión por isquemia/reperfusión) y factores estresantes relacionados (hipoxia, estrés oxidativo, inflamación, sepsis/shock, etc.). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos, composiciones y métodos para mejorar la viabilidad y función de células, tejidos y órganos

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modular el estado de una célula, una preparación celular, un tejido, un injerto o un órganoin vitro oexvivo.La presente invención también se refiere a composiciones y métodos para mejorar la viabilidad y/o función de las células o para la protecciónin vitroo exvivode células, tejidos, injertos u órganos frente a varios daños.

La presente invención se refiere en particular a preparaciones celulares, tejidos, injertos, preparaciones de órganos y secretomas de preparaciones celulares para su uso en el tratamiento o la prevención de lesiones isquémicas y factores de estrés relacionados (hipoxia, estrés oxidativo, inflamación, shock, etc.). La presente invención también se refiere en particular a terapias basadas en células y tejidos (por ejemplo, medicina regenerativa, injertos, trasplantes, etc.).

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

A pesar de los numerosos avances técnicos de la cardiología durante las últimas décadas, la cardiopatía isquémica sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Después de un infarto de miocardio (IM), la reperfusión del corazón isquémico induce un estrés adicional debido al aumento masivo de la producción de radicales libres, la infiltración de células inflamatorias y los cambios en el pH local. El tamaño final del infarto puede reducirse significativamente si se establecen medidas cardioprotectoras. Se ha estudiado el acondicionamiento cardiaco previo y posterior que incluye técnicas mecánicas (ciclos cortos repetitivos de isquemia/reperfusión (I/R) mediante pinzamiento coronario), pero la técnica más sencilla y más transferible clínicamente sería el acondicionamiento farmacológico. En este contexto, la cardioprotección implicaría una reducción de la muerte celular inducida por la I/R, con inhibición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) y disminución del estrés oxidativo, lo que llevaría a una reducción del área infartada y a la preservación de la función ventricular.

Los Solicitantes investigaron el efecto del Celastrol (un triterpeno vegetal) sobre cultivos hipóxicos de cardiomioblastos de rata H9c2 y en un modelo de IM de rata, y la eficacia del tratamiento se evaluó mediante ecocardiografía y análisis histológico. El Solicitante descubrió que en las células H9c2, el Celastrol desencadenaba la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el plazo de minutos, inducía la translocación nuclear del factor de transcripción factor de choque térmico 1 (HSF1) dando como resultado una respuesta de choque térmico (HSR) que llevaba a una expresión aumentada de proteínas de choque térmico (HSPs) incluyendo HSP70 así como HSP32 (hemo oxigenasa-1, HO-1). El Celastrol mejoró la supervivencia de H9c2 bajo estrés hipóxico, y el análisis funcional reveló HSF1 y HO-1 como efectores clave inducidos por el Celastrol para promover la protección celular y tisular. En el miocardio isquémico de la rata, el tratamiento diario con Celastrol mejoró la función cardiaca y redujo la remodelación adversa del ventrículo izquierdo en el día 14. El Celastrol desencadenó la expresión del cardioprotector HO-1 e inhibió la fibrosis y el tamaño del infarto. En el área de periinfarto, el Celastrol redujo la infiltración de miofibroblastos y macrófagos, a la vez que atenuaba la regulación por incremento del TGF-p y el colágeno.

Los Solicitantes fueron los primeros en informar de que el tratamiento con Celastrol promovía la supervivencia de los cardiomiocitos, la reducción de las lesiones y la remodelación adversa con preservación de la función cardiaca y concluyeron que el Celastrol puede representar un nuevo agente cardioprotector farmacológico potente que imita el acondicionamiento isquémico y que podría tener un impacto valioso en el tratamiento del infarto de miocardio (S. Der Sarkissian et al., British J. Pharmacol., 2014, 171:5265-5279).

El Solicitante también investigó el efecto del Celastrol sobre la protecciónin vitroy exvivode las células madre para repoblar el miocardio lesionado. De hecho, el trasplante de células madre se ha propuesto como un enfoque terapéutico novedoso para la manipulación de tejidos y la medicina regenerativa para varios estados patológicos. La terapia basada en células madre se ha explorado en modelos animales preclínicos de trastornos o enfermedades isquémicas, y se ha usado en ensayos clínicos tempranos para trastornos isquémicos como el derrame cerebral, el IM y la enfermedad arterial periférica (PAD).

La inflamación sobreviene muy rápidamente después de un IM y es provocada por la detección de altos niveles de ROS y restos celulares necróticos por las células residentes y los leucocitos circulantes. Estas células se concentran en el tejido lesionado y liberan adicionalmente ERO, enzimas proteolíticas y factores difusibles proinflamatorios y citotóxicos, y participan en la fagocitosis de células necróticas y en la alteración de los componentes de la matriz extracelular (ECM). Aunque es importante para depurar el tejido de células y residuos comprometidos, la inflamación excesiva o crónica provoca la expansión del infarto, una remodelación adversa y malos resultados para los pacientes (Steffens, S., et al. Thrombosis and Haemostasis, (2009), 102(2), 240-247; Jiang, B. et al. Journal of Cardiovascular Translational Research, (2010), 3(4), 410-416; Sun, Y. et al. Cardiovascular Research, (2009), 81(3), 482-490; Dobaczewski, M., et al. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, (2010),48(3), 504-511).

Como el miocardio tiene generalmente una capacidad regenerativa muy limitada, el espacio que deja libre la muerte de los cardiomiocitos es sustituido por una cicatriz fibrótica que afecta negativamente a la función cardiaca. Por lo tanto, es de un gran interés la investigación sobre el fomento de la regeneración miocárdica usando estrategias terapéuticas basadas en células, como el trasplante de células madre. Hasta ahora, la mayoría de los efectos positivos de las células madre parecen ser el resultado de acciones paracrinas sobre los tejidos existentes, más que de la diferenciación, incorporación o fusión celular de las células madre en el lugar de la lesión. La señalización paracrina de las células injertadas puede actuar reduciendo la apoptosis, la inflamación y la fibrosis, y estimular la angiogénesis y la aparición de otros procesos de reparación (Steffens, S., et al. Thrombosis and Haemostasis, (2009), 102(2), 240 247; Jiang, B. et al. Journal of Cardiovascular Translational Research, (2010), 3(4), 410-416).

La terapia con células madre tiene el potencial de mejorar la curación del corazón isquémico, repoblar el miocardio lesionado y restaurar la función cardiaca. Ofrece una solución terapéutica más allá de los límites de los tratamientos convencionales, con la perspectiva de llegar a la curación. La enorme esperanza y el potencial de la terapia con células madre son bien conocidos, habiéndose demostrado su viabilidad y seguridad en modelos animales y ensayos clínicos como IMPACT-CABG y COMPARE-AMI para el trasplante autólogo de células madre CD133+ para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca (Forcillo, J. et al., The Canadian journal of cardiology. 2013;29:441-7; Mansour S et al., Bone Marrow Res. 2011;2011:385124). Sin embargo, ensayos recientes que implican terapia celular para enfermedades cardiovasculares han proporcionado resultados dispares, con datos inconsistentes, lo que ha reavivado el interés por las cuestiones no resueltas relativas a los mecanismos responsables de la eficacia terapéutica de las células madre. De hecho, el mayor impedimento que reduce la eficacia clínica de la terapia celular es la escasa viabilidad y retención de las células trasplantadas, particularmente en el tejido isquémico. Independientemente del tipo de célula, menos del 1% de las células trasplantadas sobreviven en el miocardio isquémico días después del trasplante (Pagani FD. et al., J Am Coll Cardiol. 2003;41:879-88; Toma C. et al., Circulation. 2002;105:93-8).

El Solicitante descubrió que el Celastrol activa rápida y fuertemente las propiedades citoprotectoras endógenas y aumenta la supervivencia de las células madre a condiciones hipóxicas y oxidativas que imitan el microambiente isquémico del trasplante. El Solicitante observó una activación drástica y rápida de las vías PI3K/Akt y p44/42 MAPK (ERK1/2) con regulación por incremento de efectores y genes importantes implicados en la protección y la supervivencia celular: Hif1a, HO-1 (HSP32), HSP27, HSP70 y VEGF, así como un aumento de la translocación de Hsf1 del citoplasma al núcleo. El Solicitante concluyó que el preacondicionamiento de células madre con Celastrol podría ser una terapia segura y eficaz para aplicaciones clínicas como las enfermedades cardiovasculares isquémicas (Der Sarkissian et al., Pre-Conditioning of Stem Cells With Celastrol to Enhance theirTherapeutic Potential, Circulation 2011; 124:A14198).

Sharma et al. (Cell Stress and Chaperones, 2015, vol. 20, N° 1, páginas 185-201) informan de que Celastrol recupera significativamente la función ventricular izquierda y el remodelado miocárdico después de modelos de infarto agudo de miocardio y cardiomiopatía inducida por doxorrubicina al disminuir el tamaño del infarto, la apoptosis y la inflamación.

El documento US2011/0311508A1 analiza métodos de modulación de la actividad de HSF1 que comprenden la modificación de la acetilación del dominio de unión al ADN del HSF1.

No obstante, sigue habiendo una necesidad importante de compuestos, composiciones y métodos potentes para mejorar la supervivencia y la función de las células en un entornoin vitro, ex vivooin vivomediante la administración de dichos compuestos o composiciones en el lugar isquémico o a través de células preacondicionadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los aspectos y las realizaciones de la invención se exponen en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En un aspecto, la invención proporciona una composición o composición farmacéutica que comprende a) uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en el Análogo 1, Análogo 3, Análogo 4, Análogo 2, un compuesto de Fórmula I, un compuesto de Fórmula la, una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, o un tautómero de los mismos, y b) un portador o portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente c) uno o más agentes auxiliares,

en donde cuando el compuesto comprende la Fórmula I o la Fórmula la, R1 es -NRbRc; en donde Rb y Rc se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, y - CH2CH2OH; en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -OH, y =O; y/o en donde R4 es -H.

En otro aspecto, la invención proporciona un método exvivopara modular el estado de una célula, una preparación celular, un tejido, un injerto o un órgano con el fin de aumentar o preservar la viabilidad o la funcionalidad o la resistencia a la muerte, al daño o al estrés, el método comprendiendo poner en contacto dicha célula, preparación celular, tejido, injerto u órgano con a) una composición o composición farmacéutica de la invención,b)una combinación que comprende uno o más compuestos de acuerdo con la invención y un agente auxiliar,c)una preparación celular distinta que se ha puesto en contacto con uno o más compuestos de acuerdo con la invención o con una combinación de los mismos, od)un secretoma de una preparación celular distinta que se ha puesto en contacto con uno o más compuestos de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un método exvivopara proteger células, tejidos, injertos u órganos contra el estrés o daños o para reducir daños celulares en trasplante de células madre, tejidos, injertos u órganos, el método comprendiendo poner en contacto las células, células madre, tejidos, injertos u órganos con una composición o composición farmacéutica de la invención o con un secretoma de una preparación celular que se ha puesto en contacto con dicha composición, en donde cuando el método es para reducir daños celulares en el trasplante de células madre, tejidos, injertos u órganos, el secretoma se acondiciona con dicha composición antes y/o durante y/o después del trasplante.

En otro aspecto, la invención proporciona un uso exvivode una composición o composición farmacéutica de la invención, una preparación celular preacondicionada con uno o más compuestos de acuerdo con la invención o un secretoma de una preparación celular acondicionada con dicha composición para i) proteger células, tejidos, injertos u órganos de estrés o daños, ii) modular el estado de una célula, una preparación celular, un tejido, un injerto o un órgano, iii) reducir los daños celulares en el trasplante de células madre, tejidos, injertos u órganos, o iv) proteger células, tejidos, injertos u órganos de daños o factores de estrés durante procedimientos de manipulación como ciclos de congelación/descongelación, encapsulación celular, expansión, enriquecimiento y purificación.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula aislada, preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano preacondicionada con una composición o composición farmacéutica de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano de la invención, o un secretoma de dicha preparación celular, para su uso en el tratamiento de un paciente con necesidad de una cirugía o intervención médica.

En otro aspecto, la invención proporciona una preparación celular, un tejido, un injerto o una preparación de órgano de la invención, o un secretoma de dicha preparación celular, para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades isquémicas o de una enfermedad degenerativa.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit que incluye un primer vial que comprende una composición 0 composición farmacéutica de la invención sola o mezclada con un agente auxiliar y un segundo vial que comprende células madre.

Más particularmente, la presente invención puede llevarse a cabo usando uno o más compuestos de Fórmula 1

en donde R1 es -NRbRc;

en donde Rb y Rc se seleccionan independientemente del grupo formado por -H, -OH, y -CH2CH2OH;

en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo formado por -OH, y =O; y/o en donde R4 es -H.

De acuerdo con la presente invención, el compuesto puede incluir, por ejemplo, compuestos de Fórmula la, una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero de los mismos,

en donde R1 es -NRbRc;

en donde Rb y Rc se seleccionan independientemente del grupo formado por -H, -OH, y -CH2CH2OH;

en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo formado por -OH, y =O; y/o en donde R4 es -H.

Las realizaciones ejemplares de los compuestos abarcados en la presente invención incluyen los de Fórmula I o la donde R1 es NRbRc.

Las realizaciones ejemplares pueden incluir, por ejemplo, análogos del Celastrol identificados como Análogo 1, Análogo 2, Análogo 3 o Análogo 4.

Particularmente se contempla el Análogo 1.

En la bibliografía se han divulgado composiciones de Celastrol solo o sus usos como único compuesto en métodos de tratamiento de la isquemia cardíaca o de protección de células madre (Der Sarkissian et al., Pre-Conditioning of Stem Cells With Celastrol to Enhance their Therapeutic Potential, Circulation 2011; 124:A14198; S. Der Sarkissian et al., British J. Pharmacol., 2014, 171:5265-5279).

De acuerdo con una realización de la invención, el agente auxiliar puede ser, por ejemplo, bis(2-hidroxibencilideno)acetona (2HBA), andrografólido, ácido ascórbico, cafestol, carnosolbardoxolona-imidazol (CDDO-im), chalcona, N6-[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]-3-nitro-2,6-piridindiamina (CHIR98014), conglobatina, curcumina, cicloastragenol, 1,2-ditiol-3-tiona (D3T), doramapimod, edaravona, galato de epigalocatequina (EGCG), ácido gambógico, ganetespib, gedunin, IQ-1, limonina, lonidaminas, melatonina, tetrahidroindolonas benzamidas, N886, alquilamino bifenilamidas, novobiocina, piridoxal 5'-fosfato (P5'-P), piritiona, quercetina, radicicol, resveratrol, N-(2-ciano-3,12-dioxo-28-noroleana-1,9(11)-dien-17-il)-2,2-difluoro-propanamida u omaveloxolona (RTA-408), 4-(4-Fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol (SB202190), 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (SB216763), SNX-5422 (PF-04929113), butirato de sodio, sulforano, tetrabromobenzotriazol (TBB), terc-butilhidroquinona (tBHQ), ácido valpórico, withaferina A, withanólido, ergosteroles, lupenonas y análogos de cualquiera de estos agentes auxiliares.

Más específicamente, el agente auxiliar puede incluir, por ejemplo, tBHQ, carnosol, curcumina, 2HBA o EGCG o análogos de los mismos.

La presente invención proporciona en un aspecto adicional de la misma, una composición o composición farmacéutica que comprende a) uno o más compuestos de acuerdo con la invención, una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, un tautómero de los mismos ya sea solo o en combinación con uno o más agentes auxiliares y b) un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un método exvivopara modular el estado de una célula (una célula aislada), una preparación celular, un tejido (un tejido aislado), un injerto (un injerto aislado) o un órgano (un órgano aislado). Dicha modulación se realiza para aumentar o preservar la viabilidad o la resistencia a la muerte, los daños y/o el estrés, así como la funcionalidad. Dicha modulación puede realizarse de manera que aumente el perfil de resiliencia a la muerte celular, más resistencia a los factores estresantes oxidativos y/o hipóxicos, y/o un perfil mejorado para la expresión de proteínas que puede comprender la secreción mejorada de varias proteínas incluyendo, entre otras, proteínas de choque térmico, proteínas antioxidantes, factores de crecimiento, y/o la reducción de expresiones perjudiciales como mediadores peptídicos asociados con la senescencia celular.

El método comprende poner en contacto la célula, la preparación celular, el tejido, el injerto o el órgano cona)una composición de la invención,b)una combinación que comprende uno o más compuestos de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero de los mismos y un agente auxiliar,c)una preparación celular distinta que se ha puesto en contacto con uno o más compuestos de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero de los mismos, o con una combinación de los mismos, od)un secretoma de una preparación celular distinta que se ha puesto en contacto con uno o más compuestos de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero de los mismos.

De acuerdo con la presente invención, el método puede ser un método exvivorealizado en una preparación celular, tejido u órgano. La preparación celular, tejido u órgano acondicionado de este modo puede administrarse/trasplantarse posteriormente a un mamífero que lo necesite (por ejemplo, un mamífero humano). Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona una preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano, o un secretoma de dicha preparación celular, para su uso en el tratamiento de un paciente que necesita una cirugía o intervención médica. El tratamiento puede realizarse mediante la administración de la preparación celular o secretoma distinto a un mamífero que lo necesite (por ejemplo, un mamífero que padezca o sea susceptible de padecer una enfermedad isquémica, que se someta a una cirugía o intervención médica, o que padezca una enfermedad degenerativa con pérdida de células y tejidos).

La enfermedad degenerativa puede comprender cardiomiopatía, enfermedad hepática como la enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH), cirrosis, enfermedad pulmonar como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), osteoartritis, trastorno pancreático como la diabetes, neurodegeneración como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, demencia, esclerosis lateral amiotrópica (ELA), etc.

La preparación celular o secretoma puede administrarse inmediatamente antes, durante o inmediatamente después de la cirugía o intervención médica y puede administrarse, por ejemplo, sistémica o localmente.

El método también puede ser un métodoin vitroo exvivorealizado en células en cultivo o antes de la congelación.

La célula, la preparación celular, el tejido, el injerto o el órgano pueden ponerse en contacto con el compuesto, la combinación, la preparación celular distinta o el secretoma durante un tiempo, por ejemplo, de por lo menos 5 a 180 minutos antes de su uso.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el compuesto de Fórmula I o Fórmula Ia puede usarse a una concentración de entre 10-6 M y 10-10 M.

El tratamiento de acuerdo con la invención puede comprender la administración de la preparación celular o secretoma local o sistémicamente. Por ejemplo, cuando se administra un secretoma, puede administrarse sistémicamente (por ejemplo, por vía intravenosa) o localmente (por ejemplo, por vía tópica, en un sitio dañado). Cuando se administra un preparación celular, puede administrarse preferiblemente localmente (por ejemplo, en un lugar en el que se sospecha isquemia, en un lugar que necesita citoprotección, etc.).

Las células pueden ser células inmortalizadas o primarias. Las células pueden ser, por ejemplo, células madre, cardiomiocitos, cardiomioblastos, células musculares, células renales, células pancreáticas, células hepáticas, neuronas, células endoteliales, células epiteliales.

Las células madre pueden ser embrionarias, multipotentes o pluripotentes. Realizaciones ejemplares de células madre pueden incluir células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes inducidas. De acuerdo con la presente invención, las células son células no cancerosas.

Las células son preferiblemente de un mamífero, como por ejemplo un humano. Las células pueden ser adecuadas para el trasplante alogénico de células madre o para el trasplante autólogo de células madre. Las células pueden proceder de una fuente comercial o pueden aislarse de un donante o huésped. Las células pueden seleccionarse sobre la base de marcadores específicos y deseables.

De acuerdo con la presente invención, el método puede comprender adicionalmente poner en contacto las células, tejidos, injertos u órganos con uno o más agentes auxiliares. Las células, tejidos, injertos u órganos pueden ponerse en contacto por tanto con una composición que comprenda tanto a) el compuesto de acuerdo con la invención (o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, un tautómero o un profármaco del mismo) como b) el agente auxiliar mezclados juntos o el compuesto y el agente auxiliar pueden añadirse uno después del otro.

Las células, tejidos, injertos u órganos también pueden ponerse en contacto secuencialmente con el compuesto de acuerdo con la invención (o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, un tautómero o un profármaco del mismo) y el agente auxiliar.

La presente invención proporciona además en un aspecto de la misma una preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano de acuerdo con la invención, o un secretoma de dicha preparación celular, para su uso en la prevención o tratamiento de enfermedades isquémicas que incluyen, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares isquémicas, derrame cerebral, infarto de miocardio (IM), enfermedad arterial periférica (EAP), o enfermedades en las que se produce pérdida o degeneración celular y tisular por ejemplo diabetes, enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, etc.

La prevención o el tratamiento de enfermedades isquémicas o enfermedades en las que se produce pérdida o degeneración de células y tejidos de acuerdo con la invención también puede comprender la administración al mamífero que lo necesita de un secretoma o medio de cultivo de preparación de células madre tratado con una composición que comprende uno o más compuestos de acuerdo con la invención y opcionalmente un agente auxiliar.

De acuerdo con una realización de la invención, la preparación de células madre puede ser una preparación de células madre autólogas aislada del mamífero que la necesita. De acuerdo con otra realización de la invención, la preparación de células madre puede ser una preparación de células madre alogénicas aislada de un donante mamífero. Para que sea adecuada para su administración a un mamífero, la preparación de células madre alogénicas es preferiblemente compatible con el tipo HLA. La preparación de células madre también puede ser inmunoprivilegiada, hipoinmunogénica o inmunoevasiva.

La presente invención proporciona en un aspecto adicional de la misma, una preparación celular o una célula aislada, tejido, injerto o preparación de órgano preacondicionado con una composición de la invención.

De acuerdo con la presente invención, la preparación de células, tejidos, injertos u órganos aislados puede preacondicionarse con una composición que comprende una combinación de a) un compuesto de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero del mismo y b) un agente auxiliar.

De acuerdo con una realización de la invención, la composición puede lavarse de la preparación antes de su uso o puede permanecer como parte de la preparación.

De acuerdo con una realización ejemplar, la preparación celular puede ser una preparación de células madre, por ejemplo, células madre tratadasin vitroo células madre recogidas de un donante que haya recibido previamente el tratamiento sistémicamente.

De acuerdo con otra realización de la invención, la preparación celular puede ser una suspensión celular. De acuerdo con una realización adicional de la invención, la preparación celular puede tener la forma de un andamiaje tridimensional. Para obtener un andamiaje tridimensional, las células pueden cultivarse como agregados celulares, en presencia de microportadores, en microencapsulados de alginato, en hidrogeles (por ejemplo, hidrogeles termorreversibles, hidrogeles a base de quitosano, etc.), en andamiajes de nanoestructura compuestos de péptidos autoensamblables (Meng, X. et al., SpringerPlus, 2014, 3:80).

La presente invención proporciona además un método exvivopara disminuir los daños celulares en el trasplante de células madre, tejidos, injertos u órganos, el método comprendiendo poner en contacto las células madre, tejidos, injertos u órganos con una composición de la invención o con un secretoma de una preparación celular acondicionada con dicha composición antes y/o durante y/o después del trasplante.

De acuerdo con una realización de la invención, el método exvivopuede comprender la administración de una combinación de a) un compuesto de acuerdo con la invención o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero del mismo y b) un agente auxiliar.

En un aspecto más particular, la invención se refiere al uso exvivode uno o más compuestos de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero o un tautómero de los mismos para proteger células, tejidos, injertos u órganos de estrés o daños.

En algunas realizaciones del uso exvivode la invención, la invención se refiere al uso de una combinación de a) compuesto de acuerdo con la invención, una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, un tautómero o un profármaco del mismo y b) un agente auxiliar.

En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona una preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano de la invención, o un secretoma de dicha preparación celular, para su uso en el tratamiento de un paciente que necesita una cirugía o intervención médica.

La presente invención también se refiere a un kit que incluye un primer vial que comprende una composición o composición farmacéutica de la invención y un segundo vial que comprende células madre.

De acuerdo con una realización adicional de la invención, el kit puede incluir un tercer vial que contenga un agente auxiliar.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una preparación celular que contiene células vivas que pueden tener características mejoradas después del contacto con las composiciones descritas en la presente. Las características mejoradas pueden incluir una función mejorada, una expresión aumentada de genes asociados con la citoprotección, una viabilidad aumentada, una supervivencia aumentada, una resistencia aumentada a los daños celulares por factores estresantes (por ejemplo, oxidativos, hipóxicos, inflamatorios, térmicos, osmóticos, mecánicos) en los que se puede incurrir en varias condiciones patológicas (por ejemplo, isquemia, isquemia/reperfusión, shock séptico) o procedimientos de manipulación (por ejemplo, ciclos de congelación/descongelación, encapsulación celular, expansión, pasos de enriquecimiento y purificación, preparación/fabricación de injertos, etc.).

La preparación celular puede comprender células madre como las adecuadas para prevenir o reparar daños debidos a isquemia. Las células madre pueden proceder de una fuente comercial, aislarse del individuo que necesita tratamiento (es decir, autólogas) o aislarse de un donante compatible (es decir, alogénicas).

De acuerdo con la presente invención, la preparación celular o tisular se preacondiciona con la composición de la invención. De acuerdo con otra realización de la invención, la preparación celular puede comprender medios que contengan la composición o los reactivos descritos en la presente.

Otros objetos, ventajas y características de la invención presente serán más evidentes tras la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de realizaciones específicas de la misma, dadas a modo de ejemplo sólo con referencia a los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En los dibujos adjuntos:

LaFIG. 1muestra ejemplos de cribados de viabilidad (A,B) y basados en reporteros (C) de varios inhibidores de HSP90 y compuestos similares a Celastrol. El sistema de cribado de alto contenido Perkin Elmer Operetta® permite la detección de varios fluoróforos y cambios morfológicos celulares. El Perkin Elmer Víctor Multilabel Counter o EnVision® Multilabel Reader, un luminómetro permite la detección del metabolismo de la luciferina. También puede caracterizar cuantitativamente la EC50 y la inducción del pliegue máximo usando varias líneas celulares reporteras. LasFIG. 2Ay2Bmuestran que el preacondicionamiento con Celastrol aumenta la viabilidad / retenciónin vivode las MSC. Las MSC fueron tratadas con el compuesto de acondicionamiento o con vehículo durante 60 minutos. A continuación, las células se lavaron, se marcaron con un rastreador celular fluorescente y se inyectaron en t=0 en la extremidad posterior isquémica izquierda de una rata. Se obtuvieron imágenesin vivode las células trasplantadas hasta el día 9 usando Optix®. Se hizo un seguimiento de 3 millones de MSC inyectadas en el cuádriceps izquierdo en t=0 hasta el día 9 usando el sistema de imagenologíain vivoOptix. (Escala logarítmica). LaFIG. 3muestra que el preacondicionamiento con Celastrol mejora el efecto terapéutico de las células madre. Las MSC preacondicionadas con Celastrol restablecen el flujo sanguíneo de manera más eficaz en el modelo de isquemia de la extremidad posterior, como se observa mediante escaneo Doppler láser.

LaFIG. 4muestra proteínas citoprotectoras, factores de crecimiento/supervivencia y proteínas antioxidantes liberadas por las células madre mesenquimales humanas (hMSC) tras una hora de tratamiento con Celastrol (10-6 M). Se recogió el medio celular condicionado, se concentró, se separaron las proteínas por electroforesis en gel y se analizaron por espectrometría de masas y se identificaron mediante búsqueda en bases de datos.

LaFIG. 5muestra algunos compuestos usados en los experimentos descritos en la presente (Fig. 6-22).

LaFIG. 6muestra que un tratamiento de 1 hora de células madre mesenquimales de rata (rMSC) con inhibidores de HSP90 (Celastrol, Gedunin, Radicicol) pero no con activadores de n RF2 solos (EGCG, tBHQ) protege a las rMSC de la muerte celular inducida por hipoxia durante 48 horas. EGCG potencia la protección mediada por Celastrol.

LaFIG. 7muestra que un preacondicionamiento de 48 horas de H9c2 con medios procedentes de rMSC tratadas con un inhibidor del cofactor HSP90 (Celastrol; dosis alta de Gedunin) protege a H9c2 de la muerte celular inducida por hipoxia durante 48 horas.

LaFIG. 8Amuestra que un tratamiento de 1 hora de las rMSC con compuestos activadores de NRF2 (Celastrol, EGCG) pero no esencialmente activadores de HSF1 (Geldanamicina, Radicicol) protegen a las rMSC de la muerte inducida por estrés oxidativo. EGCG potencia la protección inducida por Celastrol.

LaFIG. 8Bmuestra que un tratamiento de 1 hora de cardiomioblastos H9c2 con Celastrol combinado con 2HBA, tBHQ o EGCG produce un aumento sinérgico de la viabilidad de las células después de un desafío oxidativo (incubación en 1mM de H2O2 durante 1 hora).

LaFIG. 9muestra que un preacondicionamiento de 24 horas con medios procedentes de rMSC tratadas con el activador NRF2 (Gedunin, EGCG, tBHQ) protege a las células H9c2 de la muerte inducida por el estrés oxidativo. Los activadores potentes de HSF1 solos (Radicicol, Celastrol) no muestran protección.

LaFIG. 10muestra la expresión de ARNm de HSP70 en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de HSP70 inducida por Celastrol. LaFIG. 11muestra la expresión de ARNm de HSP32 (HO-1) en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de HSP32 inducida por Celastrol. LaFIG. 12muestra la expresión de ARNm de HSP70 en MSC humanas (hMSC) después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG produce un aumento sinérgico de la expresión de HSP70 inducida por Celastrol.

LaFIG. 13muestra la expresión de ARNm de HSP32 (HO-1) en MSC humanas (hMSC) después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG produce un aumento sinérgico de la expresión de HSP32 inducida por Celastrol.

LaFIG. 14muestra la expresión de ARNm de FGF2 en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de FGF2 inducida por Celastrol. La combinación de tBHQ y Gedunin también aumentó la expresión de ARNm de FGF2.

LaFIG. 15muestra la expresión de ARNm de VEGFa en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG produce un aumento sinérgico de la expresión de VEGF inducida por Celastrol.

LaFIG. 16muestra la expresión de ARNm de catalasa (CAT) en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de CAT inducida por Celastrol. LaFIG. 17muestra la expresión del ARNm de la glutatión peroxidasa (GPx) en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de GPx inducida por Celastrol.

LaFIG. 18muestra la expresión del ARNm de la glutatión reductasa (GR) en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG produce un aumento sinérgico de la expresión de GR inducida por Celastrol. tBHQ muestra un efecto sinérgico sólo a dosis bajas.

LaFIG. 19muestra la expresión del ARNm de la Superóxido dismutasa 1 (SOD1) en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. EGCG produce un aumento sinérgico de la expresión de SOD1 inducida por Celastrol.

LaFIG. 20muestra la expresión de ARNm de IL-1p en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. Celastrol y Gedunin regulan por disminución la expresión de IL-1p inducida por EGCG y tBHQ.

LaFIG. 21muestra la expresión de TNFa mRNA en rMSC después de un tratamiento de 1 hora y un lavado de 3 horas. El EGCG y el tBHQ acentúan sinérgicamente la regulación por disminución del TNFa inducida por Celastrol y Gedunin.

LaFIG. 22Amuestra un mapa de compilación de los resultados de viabilidad y expresión de las rMSC (las marcas de verificación indican el nivel de activación; las x indican el nivel de efecto inhibitorio; t indica falta de efecto; las celdas vacías indican que no se realizó el experimento).

LaFIG. 22Bmuestra un mapa de compilación de la viabilidad paracrina de las células H9c2 (las marcas de verificación indican el nivel de activación; las x indican el nivel de efecto inhibitorio; t indica falta de efecto; las celdas vacías indican que no se realizó el experimento).

LaFIG. 23muestra los análogos del Celastrol probados

LaFIG. 24muestra una lista de posibles agentes auxiliares probados.

La FIG. 25Aes una tabla que representa la expresión de ARNm de genes seleccionados medidos por PCR en tiempo real en células madre mesenquimales humanas (hMSC) acondicionadas con Celastrol solo o en combinación con agentes auxiliares seleccionados. Los resultados se expresan como veces de cambio frente a las células tratadas con vehículo.

LaFIG. 25Bes una tabla que representa la expresión de ARNm de genes seleccionados medida por PCR en tiempo real en células madre mesenquimales humanas (hMSC) acondicionadas con análogos de Celastrol seleccionados solos o en combinación con agentes auxiliares seleccionados. Los resultados se expresan como veces de cambio frente a las células tratadas con vehículo.

LaFIG. 26Aa26Cmuestra el resultado de cotratamiento de Celastrol o análogos de Celastrol y activadores de NRF2 auxiliares seleccionados en la expresión de ARNm de genes citoprotectores en células madre mesenquimales humanas (hMSCs) medido por PCR en tiempo real. Sólo se mantienen las combinaciones de tratamiento que son >1,5 veces superiores para la expresión de genes VEGF, FGF2, HO1, y SDF1 en comparación con las células tratadas con vehículo. Los resultados se expresan como veces de cambio frente a las células tratadas con vehículo. (Índice angiogénico arbitrario: (VEGFa FGF2 SDF1)*2) (A=Efecto aditivo; S=Efecto sinérgico).

LaFIG. 26Dmuestra el panel TaqMan (Thermo Fisher) de expresiones génicas de antioxidantes, factores de crecimiento y ARNm de remodelación de la matriz después del tratamiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC) durante una hora con Celastrol (1uM) solo o combinado con 2HBA (1uM), seguido de una incubación de 24 horas en condiciones de normoxia o hipoxia (<1% de O2) y bajo nivel de suero (0,2% de FBS), como puede observarse en un microambiente infartado. Los resultados se expresan como veces de cambio frente a las hMSC tratadas con vehículo.

LaFIG. 26Emuestra la expresión por PCR en tiempo real del ARNm de los genes HO-1 (panel superior) y VEGFa (panel inferior) tras el tratamiento de cardiomioblastos H9c2 con Celastrol (1uM) solo o combinado con tratamientos auxiliares (2HBA 1uM; EGCG 10uM o curcumina 5uM) durante una hora, seguido de 3 horas de incubación en condiciones de normoxia o hipoxia (<1% de O2), con bajo contenido de suero (0,2% de FBS) y bajo contenido de glucosa, como puede observarse en un microambiente infartado. Los resultados se expresan como veces de cambio frente a h9c2 tratado con vehículo.

LaFIG. 26Fmuestra el resultado del contenido de proteína de VEGFa medido (Thermo Fisher; Bio Plex 200, Bio Rad) secretado por las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) en el medio de cultivo después de una hora de cotratamiento con Celastrol (1uM) y compuestos auxiliares seleccionados (1uM) seguido de 48 horas de incubación en condiciones de normoxia o hipoxia (<1% de O2) y bajo contenido de suero (1% de FBS) como puede observarse en un microambiente infartado.

LaFIG. 27Amuestra que el preacondicionamiento de 1 hora con Celastrol antes de la criopreservación aumenta la viabilidad de las rMSC tras la descongelación celular.

LaFIG. 27Bmuestra que el tratamientoin vivocon Celastrol condiciona de forma dependiente de la dosis a las rMSC para que resistan la muerte inducida por el estrés oxidativo.

LaFIG. 28es una imagen obtenida de un experimento de microscopía confocal (Olympus, FV1000MPE/BK61WF) que muestra una arteriola porcina acondicionada durante la noche en medio HBSS sin Celastrol (A) o con (B) Celastrol (1uM). Las secciones del vaso se tiñeron con el kit LIIVE/DEAD. Las flechas señalan las zonas de células muertas y la capa de endotelio degradada en los medios que contienen vehículo, mientras que la imagen representativa del vaso muestra el mantenimiento de la viabilidad y la integridad de la capa endotelial con los medios suplementados con Celastrol.

LasFIG. 29Ay29Bson transferencias Western que muestran la expresión proteica en extractos celulares totales o en fracciones nucleares y citoplasmáticas en diferentes tipos celulares estimulados por Celastrol (1uM) durante de 5 a 120 minutos seguido de 0 a 24 horas de recuperación).

LaFIG. 29Ces un histograma que representa el índice de viabilidad de las células INS-1 secretoras de insulina preacondicionadas durante 30 minutos con Celastrol o Radiciol a concentraciones de 0,25uM o 0,50uM después de un desafío hipóxico de 6 horas. Los resultados se comparan con las células tratadas con vehículo.

LaFIG.30es un gráfico que muestra que Celastrol 1mg/kg previene la caída letal de la presión sanguínea en ratas que reciben una dosis de 10mg/kg de LPS.

LaFIG. 31es una imagen de una transferencia Western que muestra que una única inyección de Celastrol (1mg/ kg) induce la expresión de Hsp32 (HO-1) en el plazo de 60 minutos en los riñones de ratas (véase a). El Celastrol aumenta la expresión de Hsp70 en el riñón de control no ligado de ratas sometidas a isquemia renal, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad sistémica y una respuesta citoprotectora (véase b).

LaFIG. 32es una tabla que resume el efecto del Celastrol (Celastrol 1c: adquirido de una fuente comercial; Celastrol 2 y 3 usados para generar análogos sintéticos) y de los análogos del Celastrol sobre la viabilidad de las células H9c2 durante el estrés hipóxico, el estrés oxidativo y el estrés de hipoxia/reoxigenación.

LasFIG. 33 AaHindican que el Celastrol (10-7 mol/L, mejor dosis) y el Análogo 1 (dosis de 10-8 mol/L) protegieron al corazón de la disfunción sistólica inducida por I/R, como lo muestran los cambios enA, B)+/- dP/dt,C)presión generada (presión máxima - mínima),D)presión diastólica final (EDP) yE)índice de contractilidad en comparación con el tratamiento con vehículo (DMSO) después de isquemia cardíaca global caliente con reperfusión.F)El flujo inverso coronario (CRF) se preservó con los tratamientos,G)la liberación de troponina T de alta sensibilidad (TNT-hs) yH)el área infartada medida mediante tinción con TTC se redujo significativamente en los grupos de tratamiento con Celastrol y análogos en comparación con los corazones tratados con el vehículo (DMSO) después de una lesión por I/R.

LasFIG. 34 AaDindican que el Celastrol (1mg/Kg) y el Análogo 1 (1mg/Kg) protegen la función cardiaca después de una lesión por I/R conservandoA)la fracción de eyección (EF),B)el gasto cardiaco (CO),C)el acortamiento fraccional (FS) yD)el volumen sistólico (SV) en comparación con los animales tratados con vehículo (DMSO). LaFIG. 35es una tabla que resume el efecto del Celastrol (Celastrol 1c: adquirido de una fuente comercial; Celastrol 2 y 3 usados para generar análogos sintéticos) y de los análogos del Celastrol sobre la respuesta al choque térmico (HSR) y la respuesta antioxidante (AR) medidas mediante ensayos con reporteros de luciferasa. Se informa de EC50, inducción de veces máxima y activaciones de respuesta a dosis fijas de 1uM. Los compuestos<se clasifican de acuerdo con una compilación de eficacia y potencia en la estimulación de las vías HSR y>A<r>. LaFIG. 36es un diagrama esquemático que muestra los mecanismos propuestos del Celastrol de inducción de HSR y AR, que llevan a la regulación por incremento de los genes citoprotectores.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente solicitud, el Solicitante demostró que Celastrol puede ser útil para proteger las células y los tejidos de diferentes tipos de daños y puede aumentar la supervivencia de las células que forman parte de tejidos complejos, como injertos y órganos. Por ejemplo, las células madre preacondicionadas con Celastrol solo o en combinación con un agente auxiliar protegen a las células del estrés y/o los daños y estimulan la secreción de mediadores paracrinos y factores de crecimiento que mejoran el perfil terapéutico de las células.

El Solicitante también identificó análogos del Celastrol que tienen un efecto citoprotector similar o aumentado e identificó varias combinaciones terapéuticas que tienen efectos citoprotectores sinérgicos o aditivos con el Celastrol y/o con los análogos del Celastrol.

En la Figura 37 se esquematizan los mecanismos del Celastrol para inducir la respuesta antioxidante y de HSR, lo que lleva a la regulación por incremento de las HPS citoprotectoras.

Más particularmente, el mecanismo de acción del Celastrol incluye 1) la activación del mecanismo de defensa celular rápida y transitoria. Más particularmente, el Celastrol modula la actividad de KEAP1, el represor del factor de transcripción Factor 2 Relacionado con el Factor Nuclear Eritroide 2 (NRF2), permitiendo de este modo la translocación de NRF2 al núcleo y la unión a ARE (Elemento de Respuesta Antioxidante) que activa la transcripción de mediadores antioxidantes protectores y enzimas incluyendo HO1 (HSP32).

El mecanismo de acción del Celastrol también incluye 2) la activación de la vía celular que garantiza la protección y la supervivencia ampliadas: el Celastrol antagoniza con los cochaperonas esenciales de HSP90, concretamente Cdc37, lo que resulta en la disociación de la HSF1 de su represor de chaperona HSP90. Esto lleva a la fosforilación de HSF1, la trimerización, la translocación nuclear y la unión a HSE (Elemento de choque térmico), induciendo de este modo la transcripción de novo de las Proteínas de Choque Térmico citoprotectoras (HSP), incluyendo HSP27, HSP32 y HSP70.

El mecanismo de acción del Celastrol puede incluir además 3) la inducción/amplificación de la señalización protectora: el Celastrol mediante la estimulación de la producción de ROS puede activar los mecanismos descritos anteriormente lo que lleva a la activación de vías de señalización protectoras.

Debe interpretarse que el uso de los términos "un" y "uno" y "el" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente o se contradiga claramente por el contexto.

Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene deben interpretarse como términos abiertos (es decir, con el significado de "que incluye, pero no se limita a") a menos que se indique lo contrario.

Se pretende que la enumeración de intervalos de valores en la presente sirva únicamente como método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerase individualmente en la presente. Todos los subconjuntos de valores dentro de los intervalos también se incorporan a la memoria descriptiva como si se enumerasen individualmente en la presente.

De manera similar, en la presente se pretende que una estructura química general con varios sustituyentes y varios radicales enumerados para estos sustituyentes sirva como método abreviado para referirse individualmente a todas y cada una de las moléculas obtenidas por la combinación de cualquiera de los radicales para cualquiera de los sustituyentes. Cada molécula individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerase individualmente en la presente. Además, todos los subconjuntos de moléculas dentro de las estructuras químicas generales y todas las estructuras/moléculas pertenecientes a la misma familia de compuestos también se incorporan a la memoria descriptiva como si se enumerasen individualmente en la presente.

La presente invención abarca todas y cada una de las combinaciones y subcombinaciones de las realizaciones y características de la invención.

En la presente, el término "aproximadamente" tiene su significado habitual. El término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye una variación inherente de error para el dispositivo o el método que se está empleando para determinar el valor, o abarca valores cercanos a los valores enumerados, por ejemplo dentro del 10% o del 5% de los valores enumerados (o intervalo de valores).

Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente.

El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") que se proporciona en la presente, tiene como único objetivo ilustrar mejor la invención y no supone una limitación del alcance de la invención, a menos que se reivindique lo contrario.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

La expresión "compuesto que activa la vía de la proteína 1 del factor de choque térmico (HSF1)" se refiere a cualquier agente (moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, anticuerpos, oligómeros, etc.) capaz de aumentar directa o indirectamente la liberación de HSF1 del complejo de chaperona represor HSP90 y/o activar su translocación al núcleo o aumentar su contenido celular, incrementando por tanto la transcripción mediada por HSF1. Incluye agentes que antagonizan la o las cochaperonas de HSP90, como Cdc37 y p23, lo que provoca la disociación/activación de HSF1 o de la propia proteína HSF1.

La expresión "compuesto que activa la vía del factor nuclear (eritroide derivado 2) tipo 2 (NRF2)" se refiere a cualquier agente (moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, oligómeros, etc.) capaz de aumentar directa o indirectamente la liberación de NRF2 del represor proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (KEAP1) y/o activar su translocación al núcleo o aumentar su contenido celular, aumentando de este modo la transcripción mediada por NRF2. KEAP1 comprende seis repeticiones Kelch (residuos 327-372, 373-423, 424-470, 471-517, 518-564 y 565-611) que median la interacción con n RF2. Los residuos 69-84, y más particularmente los residuos 76-84, de NRF2 (que abarcan el motivo ETGE conservado), están implicados en la interacción con KEAP1. Los ejemplos de compuestos que activan la vía NRF2 son Celastrol, tBHQ, CDDO, Carnosol, Andrografólido, Cafestol, Sulforafano, Curcumina, EGCG, Piritiona, Resveratrol, Gedunin, Quercetin, bis(2-hidroxibencilideno)acetona (2-HBA) o HBB2, 1,2-ditiol-3-tiona (D3T), bis(cianoenona) tricíclica acetilénica (TBE31), antoecol, whitanólidos y análogos de los mismos o miembros de las familias de los alcaloides, quinonas y quinona-metóxidos, ácido gambógico, limonoides, rotenoides, terpenoides, furanoides, catequinas, alquenilos, carbohidratos, flavonoides o aromáticos.

En una realización, el método exvivode la invención comprende el uso de un compuesto de acuerdo con la invención que activa tanto la vía HSF1 como la vía NRF2. En otra realización, el método exvivocomprende el uso de dos o más moléculas de acuerdo con la invención que activan la vía HSF1 y la vía NRF2, por ejemplo, un primer compuesto que activa la vía HSF1 y un segundo compuesto que activa la vía NRF2, o un primer compuesto que activa las vías HSF1 y NRF2 y un segundo compuesto que activa sólo la vía NRF2, etc.

El término "análogo", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que tiene la estructura básica o principal del compuesto de referencia, pero que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, orden de enlace, ausencia o presencia de uno o más átomos y/o grupos de átomos, y combinaciones de los mismos) que no suprimen la actividad biológica en la vía HSF1 y/o la vía NRF2. Por ejemplo, los análogos de Celastrol (compuestos triterpénicos pentacíclicos) se describen en Klaic et al., ACS Chem Biol. 18 de mayo de 2012; 7(5): 928-937 y publicación de PCT N° WO2015/148802.

En una realización, por lo menos uno de los uno o más compuestos es un inhibidor de HSP90, un inhibidor N o C-terminal de HSP90, preferiblemente un inhibidor cofactor de HSP90.

En una realización, por lo menos uno de los uno o más compuestos tiene actividad inductora de NRF2.

En una realización, se usa una combinación de compuestos que tienen una actividad mejorada (por ejemplo, sinérgica) con respecto a la actividad de los compuestos usados solos.

Como se usa en la presente, el término "agente auxiliar" se refiere a un agente que puede aumentar la supervivencia, la viabilidad o la resistencia de las células al estrés o a los daños. Un "agente auxiliar" puede ser capaz de modular, por ejemplo, el fenotipo celular y puede incluir antioxidantes y activadores de NRF2. Los agentes auxiliares incluyen, por ejemplo, 2HBA, andrografólido, ácido ascórbico, cafestol, carnosolbardoxolona-imidazol (CDDO-im), chalcona, N6-[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]-3-nitro-2,6-piridindiamina (CHIR98014), conglobatina, curcumina, cicloastragenol, 1,2-ditiol-3-tiona (D3T), doramapimod, edaravona, EGCG, ácido gambógico, ganetespib, gedunin, IQ-1, limonina, lonidamida, melatonina, benzamida tetrahidroindolonas, N886, alquilamino bifenilamidas, novobiocina, piridoxal 5'-fosfato (P5'-P), piritiona, quercetina, radicicol, resveratrol, N-(2-ciano-3,12-dioxo-28-noroleana-1,9(11)-dien-17-il)-2,2-difluoro-propanamida u omaveloxolona (RTA-408), 4-(4-Fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol (SB202190), 3-(2,4-Diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (SB216763), SNX-5422 (PF-04929113), butirato sódico, sulforano, tetrabromobenzotriazol (TBB), tercbutilhidroquinona (tBHQ), ácido valpórico, withaferina A, ergosteroles, lupenonas y análogos de cualquiera de estos agentes auxiliares.

Como se usa en la presente, el término "secretoma" se refiere a las moléculas orgánicas y/o elementos inorgánicos secretados por células biológicas, tejidos, órganos y organismos.

Como se usa en la presente, la expresión "modular el estado de una célula" significa un cambio en el fenotipo celular, en el patrón de expresión de ciertos genes o en el patrón de secreción de ciertas proteínas.

La expresión grupo alquilo lineal de 1 a 6 átomos de carbono (es decir, alquilo C1-C6), como se usa en la presente, significa radicales hidrocarbonados monovalentes saturados que tienen fracciones lineales o ramificadas y que contienen de 1 a 6 átomos de carbono. El término "grupo alquilo ramificado" se refiere a un grupo alquilo que incluye uno o más átomos de carbono terciarios o cuaternarios. El grupo alquilo puede estar sustituido (OH, NH2, I, F, Cl, Br, CN) o no sustituido. Ejemplos de tales grupos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, nbutilo, isobutilo y terc-butilo.

Como se usa en la presente, el término "sustituido" se refiere a un grupo en el que uno o más átomos de hidrógeno del grupo se sustituyen, independientemente, por un sustituyente seleccionado entre metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, hidroxi, metoxi, etoxi, flúor, cloro, bromo, yodo, ciano, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, carboxi, clorometilo, triclorometilo, trifluorometilo, metoxietilo y similares.

Como se usa en la presente, el término "grupo alquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono" se refiere a metilo, etilo, propilo.

En una realización, uno o más compuestos están presentes en una composición farmacéutica que comprende además uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente, "farmacéuticamente aceptable" (o "biológicamente aceptable") se refiere a materiales caracterizados por la ausencia (o limitación) de efectos biológicos tóxicos o adversosin vivo.Se refiere a aquellos compuestos, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los fluidos biológicos y/o tejidos y/u órganos de un sujeto (por ejemplo, humano, animal) sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.

El término "portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables" se refiere a aditivos usados comúnmente en la preparación de composiciones farmacéuticas e incluye, por ejemplo, solventes, medios de dispersión, soluciones salinas, surfactantes, agentes solubilizantes, lubricantes, emulsionantes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes quelantes, modificadores del pH, agentes calmantes, tampones, agentes reductores, antioxidantes, agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción o similares (véase, por ejemplo, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press; 6a edición, 2009).

En una realización, los uno o más compuestos pueden combinarse/mezclarse con materiales de andamiaje para trasplante celular/manipulación de tejidos, por ejemplo, biomateriales, polímeros y/o matrices usados comúnmente como andamiaje para células madre.

El uno o más compuestos pueden formularse para su administración por cualquier vía convencional, como la administración intravenosa, oral, transdérmica, intraperitoneal, subcutánea, mucosa, intramuscular, intranasal, intrapulmonar, parenteral o tópica. La preparación de tales formulaciones es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a edición, 2005).

Además, como se muestra en los Ejemplos a continuación, el medio (por ejemplo, secretoma) de las células tratadas con el uno o más compuestos fue capaz de conferir protección contra la muerte, y por lo tanto en una realización los métodos descritos en la presente comprenden cultivar una población de células (por ejemplo, células madre mesenquimales, células CD133+, células pancreáticas, células renales, células epiteliales y endoteliales) en presencia de los uno o más compuestos, recoger el medio o sobrenadante de dicho cultivo; y poner en contacto las células en presencia de dicho medio o sobrenadante.

En una realización, la célula es una célula madre/pluripotente/progenitora o una célula diferenciada, por ejemplo una célula madre hematopoyética (HSC), una célula progenitora hematopoyética (HPC), una célula progenitora multipotente (MPP), una célula progenitora linfoide, una célula progenitora mieloide, una célula madre mesenquimal (MSC), una célula madre derivada del tejido adiposo (ADSC), etc. En otra realización, la célula es una célula diferenciada.

La población de partida de células puede obtenerse del cuerpo o de un órgano del cuerpo que contenga células adecuadas. Las células recogidas pueden enriquecerse para obtener células que tengan ciertas características de maneras conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, basándose en la expresión de ciertos marcadores (por ejemplo, CD34+, CD133+). Además, la población celular de partida puede usarse directamente o congelarse y almacenarse para su uso posterior. Por tanto, la población celular puede someterse primero a pasos de enriquecimiento o purificación, incluyendo la adhesión a material plástico o la selección negativa y/o positiva de células basada en marcadores celulares específicos para proporcionar la población celular de partida, por ejemplo para proporcionar una población celular de partida enriquecida en MSC. Los métodos para aislar dicha población celular de partida basándose en marcadores celulares específicos pueden usar tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o sustrato sólido o insoluble al que se unen anticuerpos o ligandos que interactúan con marcadores específicos de la superficie celular. Por ejemplo, las células pueden ponerse en contacto con un sustrato sólido (por ejemplo, una columna de perlas, matraces, partículas magnéticas) que contenga los anticuerpos y se elimina cualquier célula no unida. Cuando se usa un sustrato sólido que comprende perlas magnéticas o paramagnéticas, las células unidas a las perlas pueden aislarse fácilmente mediante un separador magnético (por ejemplo, clasificación celular magnética, MACS®, línea de productos CliniMacs® de Miltenyi Biotec®).

Las células pueden cultivarse en medios adecuados para el mantenimiento, crecimiento o proliferación de las células, ya sea en condiciones normales de cultivo o en biorreactores para la fabricación a gran escala, por ejemplo. Las condiciones de cultivo de la población de células variarán dependiendo de diferentes factores, en particular, de la población celular de partida. Los medios y condiciones de cultivo adecuados son bien conocidos en la técnica. El método de la presente invención puede llevarse a cabo en un medio natural, un medio semisintético o un medio sintético en términos de composición, y puede ser un medio sólido, un medio semisólido o un medio líquido en términos de forma, y cualquier medio nutriente o medio definido usado para el cultivo celular, que puede suplementarse con uno o más factores adecuados. Dicho medio comprende típicamente sodio, potasio, calcio, magnesio, fósforo, cloro, aminoácidos, vitaminas, citoquinas, hormonas, antibióticos, suero, ácidos grasos, sacáridos o similares. En el cultivo, pueden incorporarse otros componentes químicos o componentes biológicos aislados o combinados, según lo requiera el caso. Tales componentes a incorporar en el medio pueden ser suero fetal de ternera, suero humano, suero de caballo, insulina, transferrina, lactoferrina, colesterol, etanolamina, selenito sódico, monotioglicerol, 2-mercaptoetanol, albúmina de suero bovino, piruvato sódico, polietilenglicol, varias vitaminas, varios aminoácidos, agar, agarosa, colágeno, metilcelulosa, varias citoquinas, varios factores de crecimiento o similares. Los medios pueden ser químicamente definidos, libres de suero y/o libres de xeno.

Durante o después del tratamiento con uno o más compuestos, las células pueden cultivarse en condiciones adecuadas para su mantenimiento, crecimiento y/o proliferación.

La cantidad de los uno o más compuestos usados para mediar los efectos indicados anteriormente puede ser determinada por los expertos en la técnica. En una realización, la concentración es de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1mM, de aproximadamente 10 nM a 100 pM, o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 pM. También están comprendidas en la presente invención las concentraciones de 10-5 M a 10-10 M (incluyendo individualmente, de 1uM a 10uM, de 5uM a 10mM).

En una realización, la puesta en contacto mencionada anteriormente comprende la adición de una dosis única o múltiples dosis de los uno o más compuestos en el medio de cultivo.

A continuación, la población celular puede lavarse para eliminar el uno o más compuestos y/o cualquier otro componente del cultivo celular y volver a suspenderse en un medio de suspensión celular adecuado, o lavarse o dejarse en contacto para su uso a corto plazo o en un medio de almacenamiento a largo plazo, por ejemplo un medio adecuado para la criopreservación.

Los sujetos que pueden beneficiarse del trasplante/transfusión de células, y más particularmente de células madre, incluyen sujetos que padecen de insuficiencia cardíaca, estenocardia, infarto cardíaco (por ejemplo, isquemia de corazón/cardíaca), arritmia, enfermedades cardíacas valvulares, enfermedades miocárdicas/pericárdicas, enfermedades cardíacas congénitas (por ejemplo, defecto del tabique auricular, defecto del tabique ventricular, permeabilidad del conducto arterial, tetralogía de Fallot), enfermedades arteriales (por ejemplo, esclerosis arterial, aneurisma, etc.), enfermedades venosas (por ejemplo., flebeurisma), isquemia crítica de miembros u órganos (isquemia hepática, etc.), enfermedad articular degenerativa, osteoartritis, artritis reumatoide, trastornos óseos (por ejemplo, osteítis, osteoporosis, artrosis, osteosarcoma), enfermedades de la piel (psoriasis, eczema, cáncer de piel), enfermedades de la córnea (queratocono, queratitis), enfermedades del hígado (insuficiencia hepática aguda y crónica, hepatitis, deficiencia genética, incluyendo el trastorno del ciclo de la urea), enfermedades pulmonares (por ejemplo, EPOC, SDRA neumonitis), enfermedades renales (por ejemplo, ERC), lesiones musculoesqueléticas, tendinitis, enfermedades sistémicas (por ejemplo, sepsis), cáncer, trastornos, enfermedades degenerativas, incluyendo enfermedades del SNC (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, demencia, ELA) y lesiones medulares.

Cuando se administran células preacondicionadas a un paciente, el número de células transfundidas tendrá en cuenta factores como el sexo, la edad, el peso, los tipos de enfermedad o trastorno, el estadio del trastorno, el porcentaje de las células deseadas en la población celular y la cantidad de células necesarias para producir un beneficio terapéutico. En una realización particular, la composición se administra por infusión intravenosa y comprende por lo menos aproximadamente 1 x 104 células/kg o por lo menos aproximadamente 1 x 105 células/kg, por ejemplo de aproximadamente 1 x 104 células/kg a aproximadamente 1 x 108 células/kg o de aproximadamente 1 x 104 células/kg a aproximadamente 1 x 107 células/kg.

Los sujetos que pueden tratarse usando la preparación celular, tejido, injerto o preparación de órgano de la invención, o secretoma de dicha preparación celular, son mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas, monos u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedores o murinos, primates, y preferiblemente un ser humano, hombre o mujer.

Otras aplicaciones de los métodos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, la preservación de tejidos, injertos (por ejemplo, injertos vasculares) y perfusiones de órganos exvivo(por ejemplo, perfusión pulmonar (EVLP)).

MODO O MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra con detalle adicionales mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1: Inhibidores de HSP90-cochaperonas como agentes acondicionadores de células

En un intento de identificar compuestos acondicionadores que sean capaces de garantizar la viabilidad celularin vivo,sobre la base de pruebas preliminares realizadas con Celastrol, se cribaron más de una docena de compuestos con similitudes estructurales identificadas a través de la bibliografía y de la herramienta en línea de búsqueda de estructuras de Sigma-Aldrich®. Se midió la capacidad de los compuestos para mejorar la viabilidad de las MSC humanas sometidas a estrés hipóxico. Las moléculas cribadas, la mayoría de las cuales son compuestos naturales, pueden clasificarse como triterpenoides, limonoides, withanólidos, esteroles, isoprenoides/diterpenos y flavonoides. También se añadieron a la criba inhibidores clásicos de HSP90, como el Radicicol, que se dirige directamente al bolsillo de unión del ATP en la región NT de HSP90 (Roe SM. et al., J Med Chem 28 de enero de 1999;42(2):260-6) (inhibidor de NT). Los cribados han mostrado una eficacia variable de los compuestos en la mejora de la viabilidad de las células durante el estrés hipóxico (Figura 1: A, B) y en su capacidad para inducir la expresión de HSP mediante ensayos basados en reporteros (Figura 1C). En el caso de algunos de los compuestos con mayor puntuación, incluyendo Withanólidos y Gedunin, que comparten similitudes estructurales con el Celastrol, las pruebas emergentes muestran que muchos de estos compuestos acondicionadores eficientes pertenecen a familias de moduladores de HSP90 que se dirigen a la interacción de la cochaperona HSP90 (Patwardhan C.A. et al., J Biol Chem. 2013; Sreeramulu S. et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(32):5853-5; Gu M., et al. Invest New Drugs. febrero de 2014;32(1):68-74).

Ejemplo 2: El Celastrol potencia la retención de células trasplantadasin vivoy potencia la secreción paracrina

Los resultados descritos a continuación demuestran que el Celastrol aumenta la viabilidadin vivoy la retención de las células trasplantadas. Brevemente, las MSC de rata se trataron en suspensión con compuestos acondicionadores durante 60 minutos. Luego, se lavaron las células, se marcaron con un rastreador celular fluorescente y se inyectaron en t=0 en la extremidad posterior isquémica izquierda de la rata. Se obtuvieron imágenesin vivode las células trasplantadas hasta el día 9 usando el sistema de imagen molecular Optix™ MX3 de ART (Figura 2: A,B). Los resultados muestran una mejora de la viabilidadin vivoy la retención de las células madre pretratadas, lo que se traduce en una tendencia a la mejora del restablecimiento del flujo sanguíneo, como se observa a través de la exploración Doppler láser (Figura 3). El análisis proteómico muestra que el tratamiento con Celastrol de las MSC humanas preserva y mejora la funcionalidad de las células madre, como se observa por el aumento de los niveles de proteína de choque térmico (HSP90a en 7,0 veces; HSP90b en 2,2 veces; HO1 en 2,2 veces; HSP70 en 1,8 veces), factores de crecimiento y citoquinas (MCSF en 24,4 veces, HGF en 2,1 veces) y genes relacionados con la respuesta antioxidante (GSH en 2,8 veces, TRX en 2,5 veces, CAT en 1,7 veces) en los medios de cultivo (Figura 4).

Brevemente, las MSC de rata se incubaron con medios bajos en suero (aMEM 1X, 1% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (P-S)) que contenían o Celastrol (10E-6M - 10E-8M) o vehículo (dimetilsulfóxido (DMSO)) durante una hora. A continuación se aspira el medio, se lavan las células con 3 cambios de medio (aMEM 1X, 1% de FBS, 1% de P-S). Las células se tripsinan y se tiñen con Vybrant CFDA (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante que permite la detección en imagenología fluorescente (Optix MX2). A continuación, se cuentan las células usando el contador celular automatizado Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) y se inyectan 3 millones de MSC'c viables en el modelo de extremidad posterior de rata isquémica, usando una aguja de 26G y una jeringuilla en 5 puntos diferentes en un volumen total de 200ul.

Se anestesia a ratas Sprague-Dawley (CD CRL: Charles River) (isoflurano 2,5 - 3,0% (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 1 l/min de oxígeno) y se inyecta bupivicaína en el muslo (2 mg/kg sc qd) en el lugar de la incisión. Se despeja la arteria femoral común izquierda y se diseccionan la porción distal de la arteria safena y todas las ramas y venas colaterales. Se extirpa la porción proximal y distal de la arteria entre el ligamento inguinal y la rodilla. De este modo, ninguna de las ramas de la arteria femoral puede formar colaterales. La extremidad inferior derecha de cada animal se mantiene intacta y sirve como control. La herida se cierra usando Vicryl 5-0. El animal recibe clorhidrato de buprenorfina (0,05 mg/kg s.c. bid 3 días) y se coloca en su jaula sobre lecho blando Diamond. Al día siguiente del procedimiento quirúrgico, se inyecta PBS o MSC pretratadas con el vehículo o el compuesto experimental. Los animales son anestesiados (isoflurano 2,5 - 3,0% (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 1L/min de oxígeno) y las células se inyectan directamente en el cuádriceps con una aguja 26G y una jeringuilla en 5 puntos diferentes.

Se obtuvieron imágenesin vivode las células trasplantadas hasta el día 9 usando el sistema de imagenología molecular Optix™ MX3 de ART y, paralelamente, las ratas se sometieron a una exploración Doppler (instrumentos Moor) de la extremidad posterior que permite estudiar la recuperación del flujo sanguíneo (por debajo de la rodilla) en un modelo de isquemia de la extremidad inferior de rata (n = 3) después del trasplante de rMSC acondicionadas.

Las células acondicionadas con Celastrol aumentan la viabilidad y la retención de las células madre implantadas en la extremidad posterior isquémica de la rata y mejoran, en comparación con las células tratadas con vehículo, la recuperación progresiva (según un patrón logarítmico) del flujo sanguíneo en el miembro afectado.

Ejemplo 3: Identificación de los fármaco-optimizadores de células madre

Criterios de identificación de los fármaco-optimizadores de células madre

Los criterios de identificación de los fármaco-optimizadores de células madre se basan en la capacidad del tratamiento para satisfacer preferiblemente dos condiciones principales:

1. El tratamiento de las células conferiría preferiblemente una mayor viabilidadin vivoy un perfil de retención especialmente en el contexto del trasplante de células madre en microambientes hipóxicos y/u oxidativos como los observados en tejidos isquémicos; y

2. El tratamiento de las células permitiría preferiblemente mantener el fenotipo y/o la funcionalidad celular normal en la medida de lo posible. Sin embargo, los fármaco-optimizadores altamente deseables también pueden potenciar las funciones celulares para promover un fenotipo beneficioso o terapéutico. En el caso de las células madre, la reparación de tejidos que implica actividades paracrinas, los fármaco-optimizadores pueden aumentar preferiblemente la secreción de proteínas beneficiosas y/o reducir la producción de proteínas perjudiciales, teniendo de este modo un equilibrio y un impacto favorables en el entorno del trasplante.

Métodos para probar candidatos a fármaco-optimizadores de células madre

Para probar la primera condición principal, las MSC (procedentes de rata o de humanos) se trataron con los fármaco-optimizadores candidatos, se lavaron y se sometieron a hipoxia/privación de suero (<1%de O2 en cámara de hipoxia en medio bajo en suero durante 48-72 horas) o estrés oxidativo (incubación en medio durante 1 hora enriquecido con 0-2mM de H2O2), que imitan los principales factores de estrés letales presentes en el microambiente isquémico del trasplante. El estado de viabilidad de las células se evalúa usando el kit de viabilidad/citotoxicidad LIV<e>/DEAD (Life Technologies™) y los resultados se cuantifican mediante el aparato de cribado de alto contenido Operetta (HCS) equipado con el software de análisis automatizado Harmony (Perkin Elmer™).

Para probar la segunda condición principal, las MSC se trataron con los fármaco-optimizadores candidatos durante 1 hora, seguido de un periodo de lavado de 3 horas. Se extrajo el ARNm celular y se cuantificó la expresión de los genes de interés mediante PCR en tiempo real. En cultivos adicionales de MSC, las células se trataron durante una hora, se lavaron y se cultivaron en medios con bajo contenido en suero durante 24 horas. A continuación, el medio que contenía los factores paracrinos secretados por las MSC se puso en contacto con la línea celular de cardiomioblastos H9c2. A continuación, las células H9c2 se sometieron a hipoxia/privación de suero (<1% de O2 en cámara de hipoxia en medio bajo en suero durante 48 horas) o estrés oxidativo (incubación en medio durante 1 hora enriquecido con 0-1mM H2O2). El estado de viabilidad de las células H9c2 se evaluó usando el ensayo LIVE/DEAD, como se ha detallado anteriormente.

Para identificar los mecanismos responsables de la protección de las MSC acondicionadas y de la protección proporcionada a H9c2 a través de un mecanismo paracrino cuando se incuba con medios de MSC acondicionadas, se seleccionaron varias moléculas como agentes acondicionadores dirigidos a dos vías celulares principales, concretamente, la vía del choque térmico a través de HSP90 (activación de HSF1) y/o la vía del factor nuclear (derivado de eritroides 2) tipo 2 (NRF2).

Compuestos probados (Figura 5):

• Celastrol: Activador de HSF1 potente (inhibición del cofactor HSP90); activador de NRF2

• Gedunin: Activador de HSF1 (inhibición del cofactor HSP90); activador de NRF2.

• Radicicol: Activador de HSF1 (inhibidor de ATP clásico HSP90); sin actividad de NRF2 notificada.

• EGCG: No se ha notificado activación de HSF1 (inhibición de HSP90-CT); activador de NRF2.

• tBHQ: No se ha notificado activación de HSF1; activador de NRF2

Los resultados de estos experimentos, que se recogen en las Figuras 6 a 9, pueden resumirse de la siguiente manera:

• Los compuestos capaces de inducir HSF1 (Celastrol, Gedunin, Radicicol) protegen a las células de la muerte inducida por la hipoxia (Figura 6);

• Los inhibidores del cofactor HSP90 (Celastrol, Gedunin) producen un mediador de la eficacia paracrina (Figura 6, 7);

• El inhibidor de HSP90 NT (Radicicol) no produce un mediador de la eficacia paracrina (Figura 7);

• El inhibidor de HSP90 CT (EGCG) no protege a las células tratadas frente a la hipoxia, pero produce un efecto aditivo sobre la protección inducida por Celastrol. (Figura 6);

• Los activadores de NRF2 (EGCG, Gedunin, Celastrol) protegen a las células tratadas de la muerte inducida por el estrés oxidativo. EGCG produce un efecto aditivo sobre la protección inducida por Celastrol (Figura 8); y

• Los activadores de NRF2 (EGCG, tBHQ, Gedunin) excepto Celastrol producen un mediador paracrino para la protección contra la muerte inducida por el estrés oxidativo (Figura 9).

En conjunto, estos resultados demuestran que un tratamiento óptimo de fármaco-acondicionamiento para la mejora de la viabilidad celular combina la actividad de un inhibidor del cofactor HSP90 capaz de inducir HSF1 (resistencia a la muerte inducida por hipoxia a través de un efecto directo y paracrino) y de un inductor de la vía antioxidante NRF2 (resistencia a la muerte inducida por estrés oxidativo a través de un efecto directo y paracrino). Se descubrió que el EGCG mejora la protección celular estimulada por el Celastrol.

Además de la mejora de la viabilidad (primer criterio para la selección del fármaco-optimizador de células madre), se evaluó la mejora del perfil de expresión (segundo criterio para la selección del fármaco-optimizador de células madre) mediante la cuantificación de la expresión de ARNm de HSP, factores de crecimiento (GF), proteínas/enzimas antioxidantes y citoquinas implicadas en la inflamación. Se probaron tratamientos mono y combinados.

Tratamientos combinados probados - primer experimento:

Celastrol (1 pM) o Gedunin (1 pM) EGCG (1 pM, 10 pM) o TBHQ (1 pM, 5 pM)

Los resultados de estos experimentos, que se notifican en las Figuras 10 a 21, pueden resumirse de la siguiente manera:

Expresión de las HSP

• EGCG y tBHQ producen un aumento sinérgico de la expresión de HSP70 y HSP32 inducida por Celastrol (Figura 10, 11). En otras dos líneas celulares de rMSC, EGCG también produjo un aumento sinérgico de la expresión de HSP70 inducida por Celastrol, mientras que tBHQ no tuvo ningún efecto sobre los cambios inducidos por Celastrol.

• EGCG producen un aumento sinérgico dependiente de la dosis de la expresión de HSP70 y HSP32 inducida por Celastrol en MSC humanas (Figura 12, 13);

Expresión de factores de crecimiento (FCR)

• El EGCG aumenta sinérgicamente la expresión de FGF2 y VEGF estimulada por el Celastrol, mientras que el tBHQ aumenta y disminuye tanto la expresión de FGF2 como la de VEGF estimulada por el Celastrol y la Gedunin, respectivamente (figuras 14 y 15).

Expresión de factores antioxidantes

• EGCG aumenta sinérgicamente la expresión estimulada por Celastrol de CAT, GPx, GR y SOD1 (Figura 16, 17, 18, 19).

• El tBHQ aumenta sinérgicamente la expresión estimulada por Celastrol de CAT, GPx, GR (a dosis bajas de tBHQ), y no tiene efecto sobre las expresiones de SOD1.

Expresión de citoquinas inflamatorias.

• Celastrol y Gedunin regulan por disminución la expresión de IL1 p inducida por EGCG y tBHQ (Figura 20);

• EGCG y tBHQ potencian la regulación por disminución del TNFa inducida por Celastrol y Gedunin (Figura 21).

En conjunto, estos resultados muestran que la EGCG potencia sinérgicamente las expresiones estimuladas por el Celastrol de factores favorables para la función de las células madre. Sin querer estar limitados por la teoría, esto puede deberse a la inhibición por EGCG de un represor de la funcionalidad de Celastrol desconocido o a la estabilización de la conformación de HSP90 para potenciar el efecto de Celastrol. No puede excluirse que el efecto sinérgico también pueda ser secundario, por lo menos en parte, a la activación de un mediador de n RF2 y/o a la normalización del equilibrio redox celular. De hecho, el tBHQ, que no tiene actividad inhibidora de HSP90, muestra ciertos efectos sinérgicos o aditivos sobre la expresión estimulada por el Celastrol en por lo menos una línea de MSC de rata. Por último, los tratamientos conjuntos de EGCG y tBHQ con Celastrol o Gedunin reducen aún más las citoquinas inflamatorias.

En las Figuras 22A y 22B se presenta una recopilación de los resultados de viabilidad y expresión. Estos resultados demuestran que se combina un tratamiento óptimo de fármaco-acondicionamiento que proporciona un microentorno adecuado para el trasplante:

1. Efecto inhibidor de HSP90 (inhibición del cofactor HSP90 capaz de inducir HSF1), que demostró mejorar la viabilidad celular frente a la muerte inducida por hipoxia y promover el aumento de la expresión de varios factores paracrinos beneficiosos (HSPs, GF, moléculas antioxidantes) y la reducción de la expresión de mediadores inflamatorios; y

2. La actividad de NRF2 (con inhibición potencial de HSP90 CT), que ha demostrado aumentar la resistencia a la muerte inducida por el estrés oxidativo y potenciar (o de manera aditiva o sinérgica) la expresión de ciertos factores paracrinos beneficiosos y/o reducir aún más los mediadores de citoquinas inflamatorias.

Curiosamente, el solicitante descubrió que 2HBA, tBHQ y EGCG también producen un aumento sinérgico cuando se combinan con Celastrol para aumentar la viabilidad de los cardiomioblastos H9c2 sometidos a estrés oxidativo (incubación en 1mM H2O2 durante 1 hora) (Figura 8B).

Ejemplo 4: Identificación de análogos del Celastrol como fármaco-optimizadores de células madre

Usando un enfoque similar al descrito en el Ejemplo 3, el Solicitante probó varios análogos de Celastrol, incluyendo los ejemplificados en la Figura 23, e identificó varios que tienen la capacidad de actuar como fármacooptimizadores de células madre (Figura 24, 25A, 25B, 26A-26D).

El Solicitante también probó varias combinaciones de tratamiento de Celastrol o análogos de Celastrol con agentes auxiliares potenciales (por ejemplo, activadores de NRF-2 y/o antioxidantes, Figura 24) e identificó varias combinaciones que tenían efecto sinérgico (S) o aditivo (A) sobre la expresión de HSPs, factores de crecimiento (GF), proteínas/enzimas antioxidantes, citoquinas, proteínas remodeladoras de la matriz (Figuras 25A, 25B y Figuras 26A a 26D). Como se desprende de estos datos, el Análogo 3, el Análogo 1, el Dihidrocelastrol y el Celastrol son los mejores inhibidores de la HSP90 y el 2HBA, el EGCG, la curcumina, el tBHQ y el Carnosol se encuentran entre los principales agentes auxiliares identificados.

Además, el tratamiento durante 1 hora de células madre mesenquimales humanas (hMSC) con Celastrol combinado con 2HBA, EGCG, tBHQ o curcumina produce un aumento de aditivo a sinérgico de la proteína VEGF después de 48 horas en cultivo normal, mientras que el cultivo de las mismas células durante 48 horas en condiciones de hipoxia como las encontradas en un microambiente de infarto produce una expresión incluso mayor de la proteína VEGF (Figura 26F). Esencialmente se observa la misma observación, es decir, un aumento de la expresión de ARNm del antioxidante HO-1 y del factor angiogénico VEGFa en los cardiomioblastos H9c2 tratados durante 1 hora con Celastrol combinado con los adyuvantes 2HBA y EGCG seguido de un período de lavado de 3 horas en condiciones de normoxia o hipoxia (Figura 26E).

Ejemplo 5: El Celastrol aumenta la viabilidad de las rMSC después de la criopreservación

La criopreservación adecuada es un aspecto importante para los laboratorios de procesamiento celular, que deben demostrar que su protocolo de criopreservación da como resultado una viabilidad aceptable después de la descongelación (>70%) antes del trasplante. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la criopreservación induce alteraciones significativas de los hepatocitos descongelados y perjudica a su viabilidad, fijación y función. Los resultados presentados en la Figura 27A muestran que un preacondicionamiento de una hora de las rMSC con Celastrol antes de la criopreservación aumenta la viabilidad de las rMSC después de la descongelación.

Las células madre mesenquimales (MSC) se aíslan de la médula ósea de ratas macho (175-200 g) y se expanden según se describe. Brevemente, las células mononucleares de la médula ósea (BMNC) se aíslan por centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque (Amersham) y se cultivan en medio esencial mínimo alfa 1X (aMEM 1X: Gibco 12571) con un 10% de FBS (Gibco) y un 1% de penicilina-estreptomicina (P-S: Invitrogen 15140). Después de 48 h, se descartan las células no adherentes y se lavan con medio nuevo. Las MSC se separan de las células hematopoyéticas sobre la base de su adhesión preferente a la superficie de poliestireno. El potencial multilineal de las MSC se confirma mediante ensayos de diferenciación adipogénica y osteogénica/condrogénicain vitrocon condiciones de cultivo y tinción específicas. El inmunofenotipado se realiza mediante citometría de flujo multiparamétrica (FACScan®; Becton Dickinson; Mountain View, Ca , USA) con anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de superficie como CD29, CD34, CD45, CD90, CD105 (Coulter Immunology, Hialeah, FL, USA). Para los experimentosin vitro,las MSC se usarán entre el 4° y el 10° pasaje.

Protocolo de viabilidad celular (ciclo de congelación/descongelación)

Las MSC se vuelven a suspender en un medio con un 10% de suero (aMEM 1X, 10% de FBS, 1% de P-S) y se siembran en placas usando una pipeta multicanal en placas de 96 pocillos a una densidad de 4000 células por pocillo y se incuban a 37° C. Cada condición experimental y de control se siembra en placas por triplicado. Al día siguiente, se aspiran suavemente los medios y se sustituyen por medios con bajo contenido de suero (aMEM 1X, 1% de FBS, 1% de P-S) que contienen Celastrol (10E-6M) o Vehículo (DMSO) durante una hora. A continuación se aspira el medio, se lavan las células con 3 cambios de medio (aMEM 1X, 1% de FBS, 1% de P-S). Las células setripsinan y se cuentan usando el contador celular automatizado Countess II FL (Thermo Fisher Scientific).

Congelación de células: Después de la tripsinación y los pasos de recuento descritos anteriormente, las células se dividen en alícuotas a la densidad deseada, se añade DMSO (dilución final 1:10) al concentrado celular y se transfieren a crioviales preetiquetados. Los crioviales se colocan en un recipiente de congelación y se transfieren a -80° C durante la noche, y posteriormente se transfieren a -150° C.

Descongelación de células: Las células congeladas se recalientan vertiendo medio de cultivo precalentado sobre la alícuota congelada. Se centrifugan los viales (200 x g; 3 min), se aspira el sobrenadante y las células se vuelven a suspender en medio precalentado con 10% de suero (aMEM 1X, 10% de FBS, 1% de P-S). Se añade una dilución de azul de tripano a una alícuota de células y se mide la viabilidad usando el contador celular automatizado Countess II FL (Thermo Fisher Scientific).

Ejemplo 6: El Celastrol aumenta la resistencia a la muerte inducida por estrés oxidativo in vivo

Los resultados presentados en la Figura 27B muestran que el acondicionamientoin vivode ratas Sprague-Dawley con una o dos inyecciones intraperitoneales de Celastrol (1mg/kg; intervalo de 12 horas), condiciona de forma dependiente de la dosis a las células de la médula ósea para que resistan la muerte inducida por el estrés oxidativo (ver detalles más adelante).

Las células madre mesenquimales (MSC) se aíslan como se describe en el Ejemplo 5.

Acondicionamiento in vivo

Las ratas Sprague-Dawley (CD CRL; Charles-River) recibieron 1 o 2 inyecciones intraperitoneales de Celastrol (1mg/kg) o vehículo con un intervalo de 12 horas. A continuación, las ratas se sacrificaron y se aislaron las MSC como se ha descrito anteriormente. Las MSC se pusieron en cultivo volviéndolas a suspender en un medio con un 10% de suero (aMEM 1X, 10% de FBS, 1% de P-S) y se sembraron en placas usando una pipeta multicanal en placas de 96 pocillos a una densidad de 4000 células por pocillo y se incubaron a 37C. Cada condición experimental y de control se sembró en placas por triplicado.

A continuación, las células se desafían mediante incubación con medio de suero al 1% que contiene peróxido de hidrógeno 0mM, 0,5mM, 0,75mM o 1mM (ACP Chemicals, H7000) durante 60 minutos. A continuación, las células se lavan suavemente dos veces con medio aMEM 1X templado y se tiñen con el kit LIVE/DEAD (Thermo Fischer Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las imágenes se capturan y analizan usando un sistema de cribado de alto contenido (HCS) Operetta, ejecutando el software de análisis e imagenología de alto contenido Harmony ver. 4.1 (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los resultados que se presentan en la presente demuestran que el tratamientoin vivode ratas Sprague-Dawley con una o dos inyecciones de Celastrol, condiciona de forma dependiente de la dosis a las células de la médula ósea para que resistan la muerte inducida por el estrés oxidativo.

Ejemplo 7: El Celastrol preserva la viabilidad de la capa endotelial

Se recogió la arteria carótida de cerdo, se diseccionó en estructuras de anillos cerrados y anillos abiertos semicirculares y se colocó durante la noche en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) o HBSS que contenía Celastrol a una concentración final de 10E-6M. Los anillos carotídeos se tiñeron con el kit LIVE/DEAD (Thermo Fischer Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Se tomaron imágenes de los tejidos mediante microscopía confocal (Olympus, FV1000MPE/BK61WF) con objetivo de inmersión 20X. También se obtuvieron apilamientos en Z de la superficie endotelial de la carótida. La Figura 28 muestra la conservación de la viabilidad y la integridad de la capa endotelial con Celastrol en comparación con el control negativo sin Celastrol, donde las flechas señalan las células muertas y la pérdida de integridad de la capa endotelial (Figura 28).

Ejemplo 8: El Celastrol induce mediadores citoprotectores

El Celastrol induce mediadores citoprotectores (quinasas de supervivencia: pAkt/Akt, pERK/ERK; antioxidante HO1; proteínas de respuesta al choque térmico: HSF1, HSP70) y cinética de expresión de proteínas de manera similar en varios tipos celulares (tiempos probados de 5 a 120 min de tratamiento para dosis de 10-6 M y de 0 a 24 horas de recuperación después de un tratamiento de 1 hora con 10-6 M de Celastrol). Las Figuras 29A y 29B representan ensayos de transferencia Western y viabilidad realizados en varias líneas celulares de rata y humanas (cardiomioblasto de rata H9c2; MSC humanas y de rata; cardiomiocitos neonatales de rata; línea de células beta de rata INS-1 productora de insulina).

Más particularmente, las células INS-1 se cultivaron en medios completos (RPMI suplementado con soluciones filtradas: 1mM Na piruvato 50|jM b mercaptoetanol, 10mM Hepes Ultra puro, 2mM L-Glutamina) que contenían FBS al 10%. Las células se tripsinan (0,25% de Tripsina-EDTA), se centrifugan a 1500 RPM durante 5 minutos y se vuelven a suspender en medio INS completo suplementado con un 1% de FBS. Las células se cuentan usando un hemocitómetro y se vuelven a suspender 1-2 millones de células en tubos Sarstedt que contienen 9 ml de medio INS completo con 1% de FBS y 2,5ul o 5,0ul de inhibidor de Hsp90 1mM (Celastrol: Cayman Chemical 70950, Geldanamicina: Cayman Chemical 13355, o Radicicol: Cayman Chemical 13089) resuspendido en DMSO. Las muestras de control se preparan de manera similar, pero sustituyendo el inhibidor de Hsp90 por 2,5ul o 5,0ul de vehículo de DMSO. El volumen de las suspensiones celulares se completa hasta un volumen final de 10 ml con medio INS completo con FBS al 1%. Las suspensiones se mezclan suavemente mediante unas pocas inversiones y los tubos se colocan a 37C durante 30 minutos. Las inversiones se repiten después de 15 minutos. A continuación, se centrifugan los tubos a 1500 RPM durante 5 minutos, se aspira suavemente el medio y se lavan las células con 12 ml de solución RPMI caliente. El ciclo de centrifugado y lavado se repite dos veces más antes de volver a suspender las células con 2,5ml o 5,0ml de medio completo INS que contenía un 1% de FBS, para los sedimentos que contienen 1 o 2 millones de células respectivamente. A continuación, usando una pipeta multicanal, se colocan en placas de 96 pocillos alícuotas de 100ul de suspensión celular que contienen 40.000 células cada una. Cada una de las condiciones experimentales y de control se siembran en placas por cuadruplicado y se incuban en condiciones de normoxia o hipoxia durante 6 horas. La hipoxia (<1% de oxígeno) se logra colocando las placas de cultivo en una cámara de hipoxia hermética (Billups-Rothenberg) y enjuagándolas durante 10 minutos a un caudal de 15-20 litros por minuto con una mezcla gaseosa de 5% de CO2 equilibrada con 95% de N2. Después de 6 horas de incubación, los medios de los cultivos en condiciones de hipoxia y de control expuestos hipoxia y normóxicos se sustituyen por 90ul de medio INS completo con 10% de FBS, y se añaden 10ul de reactivo PrestoBlue a cada pocillo. Después de 60 minutos de incubación, se cuantifica la viabilidad mediante la adquisición de fluorescencia usando un lector de placas.

Estos datos muestran que un breve preacondicionamiento de las células INS-1 con Celastrol protege la viabilidad celular cuando se exponen a un estrés hipóxico letal (Figura 29C).

Ejemplo 9: El Celastrol rescata a las ratas de la caída letal de la presión arterial inducida por el LPS

Además del efecto del Celastrol en la disminución del tamaño del infarto y la preservación de la función cardiaca en ratas, el Solicitante observó una modulación de la presión arterial en las ratas tratadas. Considerando el potencial de los compuestos y combinaciones descritos en la presente en la preservación de órganos y tejidos frente al daño (es decir, isquémico, oxidativo, inflamatorio, necrótico) y en la preservación de la presión/perfusión sistémica, sería deseable su uso en modelos de shock (es decir, séptico, cardiogénico) en vista de las altas tasas de fallo orgánico y mortalidad asociadas a estas condiciones. De hecho, en Estados Unidos se diagnostican más de 750.000 casos anuales de septicemia grave, con una tasa de mortalidad del 25-30% (Crit Care Med 29 (7): 1303Y1310, 2001), provocada por el fallo de múltiples órganos, incluyendo la disfunción cardiaca como manifestación crítica (Circulation 116 (7): 793Y802, 2007). Proponemos la adición de un modelo de shock séptico ya sea el modelo endotóxico inducido por el lipopolisacárido bacteriano (LPS) en la rata (Life Sci., 1997; 60 (15): 1223-30).

Brevemente, las ratas SD se anestesian con isoflurano 2,5 - 3,0% (Abbott Laboratories, Abbott Park, III.), 1L/ min de oxígeno y se colocan sobre una manta térmica para evitar la hipotermia. Se canula la arteria carótida externa izquierda con gelco N° 20 y se transmite a un sensor de presión. Alternativamente, dependiendo del tamaño, se canula la arteria femoral izquierda. Las ratas se mantienen al 2% de isoflurano, 1 L/min de oxígeno, y se recogen mediciones de presión basal. Se determina la cinética de la presión en respuesta a la inyección i.v. a través de la vena yugular de LPS (20 a 50 mg/Kg) y la inyección i.p. de Celastrol (1 mg/Kg). Cabe mencionar que la dosis de LPS en los animales puede ser variable y también depende de la edad de los animales (Infection and immunity, Marzo 1996, Vol. 64, N° 3, p769). En nuestro experimento, ambas ratas recibieron un primer bolo de LPS a 10mg/kg. Tras una caída transitoria de la presión arterial (PA) en ambas ratas, la PA se estabilizó y recuperó el valor de referencia. A continuación, una inyección de un bolo de 300ul i.p. de Celastrol (1 mg/Kg) o vehículo (10% de DMSO, 70% de Cremophor EL/etanol (3: 1), 20% de PBS) se llevó a cabo en ratas distintas (ver flecha; Fig. 30 antes de la reinyección de 10mg/kg bolo de LPS en ambas ratas dando como resultado una caída letal de la presión arterial en las ratas tratadas con vehículo, mientras que la presión arterial se conserva en las ratas que habían recibido una sola inyección de Celastrol (Figura 30).

Ejemplo 10: El Celastrol induce la expresión de Hsp32 (HO-1) en el riñón de ratas

El Solicitante demostró con anterioridad que el Celastrol promovía la supervivencia de los cardiomiocitos, la reducción de las lesiones y la remodelación adversa con preservación de la función cardiaca en el miocardio isquémico de rata. El Solicitante comprobó si este efecto protector podía observarse en otros tipos de enfermedades isquémicas.

Las ratas se anestesian con isoflurano al 2,0% - 3,0% (Abbott Laboratories) en 1 L/min de oxígeno, y se colocan en decúbito supino sobre una almohadilla térmica. Las ratas reciben una única inyección en bolo de solución de vehículo o Celastrol ((Cayman Chemical 70950) solución madre 50mM resuspendida en vehículo esterilizado por filtro 0,2uM: DMSO (Sigma 154938) (4% de volumen total), PBS 1X(96% de volumen total)) a través de la vena yugular externa a una dosificación de 1mg/kg. Se afeita a las ratas, se aplica pomada oftálmica en las córneas y se inyecta bupivacaína (2 mg/kg s.c.) en el lugar de la incisión de 3-4 cm empezando en la base del esternón hasta el ombligo. La incisión se mantiene abierta con retractores y los intestinos se envuelven en una gasa estéril humedecida con solución salina. Se aísla el riñón izquierdo (K<l>) y se ocluye la arteria renal con un clip vascular. Los intestinos se vuelven a colocar en la cavidad abdominal y la piel se cierra con suturas temporales 3-0 (Ethicon). Las ratas reciben clorhidrato de buprenorfina (0,05 mg/kg s.c.) y se mantienen con 1,0% - 2,0% de isoflurano (Abbott Laboratories) en 1 L/min de oxígeno durante 30 minutos de isquemia y 45 minutos adicionales de reperfusión tras la retirada del clip. Las ratas se desangran mediante perfusión con solución salina suplementada con 40 mM de KCI y se recogen los órganos, se enjuagan en solución salina fría tamponada con fosfato (PBS1X), se conservan en formol al 10% tamponado con PBS durante la noche para su inclusión en parafina para secciones histológicas/inmunohistológicas o se congelan en nitrógeno líquido para análisis de expresión de transferencia western.

Los resultados del análisis de transferencia Western que se presentan en la presente demuestran que una única inyección de Celastrol (1mg/kg) induce la expresión de Hsp32 (HO-1) en el plazo de 60 minutos en el riñón de ratas (Fig. 31). Además, el Celastrol aumenta la expresión de Hsp70 en el riñón de control no ligado de ratas (K<r>) sometidas a isquemia renal, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad y una respuesta citoprotectora. Este fenómeno reviste especial interés porque sugiere la posibilidad de conferir citoprotecciones sistémicas durante intervenciones clínicas similares al acondicionamiento a distancia con posible generación de mediadores protectores neurohumorales sistémicos, reduciendo de este modo las posibles complicaciones asociadas (por ejemplo, la incidencia de derrames cerebrales derivados de un procedimiento quirúrgico).

Ejemplo 11: Efecto del Celastrol y los análogos del Celastrol sobre la viabilidad celular y la protección frente al estrés y los daños

El Solicitante probó el efecto de Celastrol o análogos de Celastrol en cultivos hipóxicos de cardiomioblastos de rata H9c2 y en un modelo de infarto de miocardio en rata. Las combinaciones de Celastrol o análogos de Celastrol con agentes adyuvantes pueden probarse de manera similar.

Estudios in vitro

Cultivo y estimulación celular:

Para la supervivencia al desafío hipóxico y al desafío oxidativo, los cardiomioblastos H9c2 se someten a hipoxia/privación de suero (<1% de O2 en cámara de hipoxia en medio bajo en suero durante 48 horas) o a estrés oxidativo (incubación en medio durante 1 hora enriquecido con 0-1mM de H2O2). El estado de viabilidad de las células H9c2 se evaluó mediante el ensayo LIVE/DEAD.

A continuación, se realiza el desafío de hipoxia/reoxigenación. Brevemente, el análisis de viabilidad se llevó a cabo en cardiomioblastos H9c2 de rata como se ha informado anteriormente. Para el estrés de hipoxia/reoxigenación, las células se cultivaron en DMEM sin glucosa (Life Technologies), se privaron de suero y se colocaron en condiciones de hipoxia (<1% de O2) durante 18 horas. En el momento de la reoxigenación (condiciones normóxicas), las células se trataron con Celastrol (de 10'10 a 10'6 mol/L, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), análogos del Celastrol o vehículo (dimetilsulfóxido (DMSO), Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON; concentración final <1%v/v) en DMEM con alto contenido en glucosa y un 1% de FBS durante 1 h, y después se continuó la reoxigenación en DMEM con alto contenido en glucosa durante 5 h adicionales.

Los resultados presentados en la Figura 32 muestran que el Celastrol (1uM) (Celastrol 1c: adquirido de una fuente comercial; Celastrol 2 y 3 usados para generar análogos sintéticos) y los análogos del Celastrol Análogo 3 (1uM), Análogo 1 (1uM), Análogo 2 (1uM) y Análogo 4 (1uM) son eficaces para proteger a los cardiomioblastos H9c2 de la hipoxia y del estrés por hipoxia/reoxigenación.

Ejemplo 12: Celastrol y análogos del Celastrol para su uso en el tratamiento de la enfermedad isquémica

En todos los experimentos exvivo e in vivo seusaron ratas Lewis (250-300 g, Charles River, St Constant, QC). Todos los animales se manipularon de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Estudios ex vivo

Preparación de corazón perfundido aislado:

Las ratas se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: Vehículo (n=6), Celastrol o análogos del Celastrol 10-8, 10-7 o 10-6 mol/L (n=5 cada uno). Bajo anestesia con isoflurano, se inyectó a las ratas heparina (I.P, 1000 I.U, Novartis, Dorval, QC) y se extrajeron los corazones, que se sumergieron inmediatamente en tampón Krebs enfriado con hielo (en mmol/l: NaCl 113, KCI 4,5, NaH2PO41,6, CaCh 1,25, MgCh+6H2O 1, D-Glucosa 5,5, NaHCOa 25). El corazón se perfundió retrógradamente usando un sistema Langendorff (Radnoti, Monrovia, CA) con una presión aórtica constante de 60-70 mmHg, usando tampón Krebs a 37°C, burbujeado con un 5% de CO2 equilibrado con O2. Se introdujo en el ventrículo izquierdo (LV) un globo de látex conectado a un transductor de presión y se ajustó a 15 mmHg (precarga del LV). Se marcó el ritmo cardíaco a 300 bpm y se dejaron 20 minutos de estabilización.

Las presiones intraventriculares se midieron continuamente usando un polígrafo Power lab 8/30 (ADinstruments, Colorado Springs, CO), se registraron y se analizaron usando LabChart pro v.7.3.7 (ADinstruments).

Para garantizar que el Celastrol, los análogos del Celastrol o el vehículo (DMSO) estuvieran en contacto con el corazón en el momento del inicio de la reperfusión, se cebó el sistema en el momento de inducir la isquemia global caliente, lo que se consiguió deteniendo el ritmo cardíaco y la perfusión durante 30 minutos. La reperfusión se inició usando tampón de Krebs con Celastrol (10‘8, 10'7 o 10'6 mol/L) o vehículo durante 10 minutos, y luego se continuó (tampón de Krebs) durante un tiempo total de reperfusión de 120 minutos.

Se recogió efluente cardíaco durante 5 minutos al final de la estabilización, a los 5 minutos de reperfusión y luego cada 15 minutos durante 60 minutos en total. Se midieron los volúmenes y las muestras se conservaron a -80° C hasta su análisis.

Al final de la reperfusión, los corazones se cortaron transversalmente (1-2 mm) y se tiñeron con cloruro de 2,3,5-trifenil-tetrazolio al 5% en tampón fosfato salino pH 7,4 (TTC, Sigma-Aldrich Canada) durante 20 min a 37° C15. Se pesaron los cortes y se tomaron imágenes usando un microscopio Stemi 508 Stereo acoplado a una cámara AxioCam ERc 5s y se procesaron con el software de imágenes Zen 2.3 (Carl Zeiss Canada, Toronto, ON). Los análisis se realizaron con el software gratuito imaged 1.51h (NIH, Bethesda, MD). El área del infarto se normalizó con respecto al peso del corte de tejido cardiaco. Se congeló un corte por corazón para determinar la expresión de genes y proteínas.

Los resultados presentados en la Figura 33A-H indican que el Celastrol (10‘7 mol/L, mejor dosis) y el Análogo 1 (dosis de 10'8 mol/L) protegieron al corazón de la disfunción sistólica inducida por la I/R, como muestran los cambios enA, B)+/- dP/dt,C)presión generada (presión máxima - mínima),D)presión diastólica final (PDE) yE)índice de contractilidad en comparación con el tratamiento con Vehículo (DMSO) después de isquemia cardiaca global caliente con reperfusión.F)El flujo inverso coronario (CRF) se conservó con tratamientos,G)la liberación de troponina T de alta sensibilidad (TNT-hs) yH)el área infartada medida mediante tinción con TTC se redujeron significativamente en los grupos de tratamiento con Celastrol y análogos en comparación con los corazones tratados con el vehículo (DMSO) después de una lesión por I/R.

Estudios in vivo

Las ratas se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: Simulado (n=6), Vehículo (n=8), Celastrol 1mg/Kg (n=6) o análogos de Celastrol. Bajo anestesia con isoflurano al 2%, se realizó una ecocardiografía basal usando un sistema de imagenología Sonos 5500 (Philips, Philips Healthcare, Andover, MA, USA) con un transductor de 12 MHz, como se describe en12. Todas las mediciones fueron adquiridas por el mismo observador experimentado, ciego al tratamiento. Para cada medición, se analizaron y promediaron de tres a cinco ciclos cardíacos.

Después de la ecocardiografía, se intubó y ventiló mecánicamente al animal, luego se inyectó bupivacaína 2 mg/kg y se practicó una toracotomía izquierda, exponiendo el corazón. Usando un nudo corredizo de seda 5-0, se realizó una oclusión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. La pérdida de color visual y los cambios electrocardiográficos confirmaron la isquemia miocárdica. En los animales Simulados, no se ligó la sutura. Después de 30 minutos, se liberó la oclusión de la sutura. Se inyectó Celastrol, análogos de Celastrol o vehículo por vía intraventricular para la administración sistémica aguda y, a continuación, se cerró el tórax. Se inyectó buprenorfina (0,05 mg/Kg sc) y carprofeno (5 mg/Kg sc) al final de la cirugía. Se dejó que los animales se recuperasen durante 24 horas y se les realizó una segunda ecocardiografía. Se sacrificó a los animales, se congeló el tejido cardiaco y se recogió sangre en tubos heparinizados, que se centrifugaron a 4° C. Se recogió plasma, que se congeló y se centrifugó a 4° C. Se recogió plasma, se congeló y se conservó a -80° C hasta su análisis.

Los resultados de la Figura 34 indican que el Celastrol (1mg/Kg) y el Análogo 1 (1mg/Kg) protegen la función cardíaca tras una lesión por I/R preservandoA)la fracción de eyección (FE),B)el gasto cardíaco (GC),C)el acortamiento fraccional (FS) yD)el volumen sistólico (SV) en comparación con los animales tratados con el Vehículo (DMSO), y estos efectos protectoresin vivodel Celastrol estaban relacionados con un aumento significativo de la expresión tisular de los cardioprotectores HSP70 y HO-1.

Análisis estadísticos

Los datos se expresan como media ± error estándar o mediana con un intervalo de confianza del 95%. Pra la comparación de grupos de mediciones no repetidas se usó la prueba ANOVA. Para las mediciones repetidas, se usaron modelos lineales de efectos mixtos para comparar los grupos (procedimientos MIXED en el software SAS, versión 9.3; SAS Institute, Cary, NC, USA). Se evaluaron las diferencias entre grupos. Para las mediciones con distribución no normal, como índices y proporciones, se usó una transformación logarítmica de las mediciones. Para las mediciones hemodinámicas, se usaron en el modelo hasta 200 mediciones por rata y por punto temporal, ponderando cada medición individual en consecuencia (es decir, 1/200). Para todos los análisis, P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Ejemplo 13: El Celastrol y los análogos del Celastrol modulan la expresión de genes bajo el control de elementos HSR y ARE

Se sembraron cardiomioblastos de rata H9c2 a una densidad de 5.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio completo DMEM 10% de FBS y se transfectaron usando lipofectamina con los kits de respuesta antioxidante y respuesta al choque térmico Cignal Reporter Assay (SABiosciences, Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Al día siguiente, se añadieron a los pocillos Celastrol, análogos y otros varios compuestos por triplicado en un intervalo de dosis de 10E-5 a 10E-10M en medio DMEM 1% de FBS durante 4 horas, seguido de 3 horas de período de lavado con medio completo antes de medir la actividad de señalización mediante el ensayo de luciferasa dual (Promega) Los resultados resumidos en la Figura 35 muestran que el Celastrol (Celastrol 1c: adquirido de una fuente comercial; Celastrol 2 y 3 usados para generar análogos sintéticos), y los análogos de Celastrol Análogo 1, Análogo 3 y Análogo 4, se encuentran entre los compuestos más potentes y eficientes probados para estimular la expresión de genes reporteros controlados en parte por elementos sensibles al choque térmico (HSR) o elementos sensibles a antioxidantes (ARE).

En las reivindicaciones, la palabra "que comprende" se usa como un término abierto, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a". Las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen las referencias plurales correspondientes, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición o composición farmacéutica que comprende a) uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en Análogo 1, Análogo 3, Análogo 4, Análogo 2, un compuesto de Fórmula I, un compuesto de Fórmula la, una sal farmacéuticamente aceptable, un estereoisómero, o un tautómero de los mismos, y b) un portador o portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente c) uno o más agentes auxiliares,

   en donde cuando el compuesto comprende la Fórmula I o la Fórmula la, R1 es -NRbRc; en donde Rb y Rc se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -H, -OH, y - CH2CH2OH; en donde R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -OH, y =O; y/o en donde R4 es -H.
2. 2. La composición o composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: