JP7009463B2 - 細胞、組織、および器官の生存能および機能を向上させるための試薬、組成物、および方法 - Google Patents
細胞、組織、および器官の生存能および機能を向上させるための試薬、組成物、および方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年6月15日出願の米国仮特許出願第62/350,258号明細書(その全内容が参照により本明細書に組み込まれる)に基づく利益を主張する。
R1は、たとえば、-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-アリール、アルキル、イミダゾール、-ORa、-NRbRc、-(CH2)nOH、および-(CH2)nNH2からなる群から選択しうるし、
Raは、H、1~6個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、3~6個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
RbおよびRcは、-H、-OH、-OCH3、1~6個の炭素原子の置換(たとえば-CH2CH2OHなど)または非置換の直線状アルキル基、3~6個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
nは、0、1、2、3、または4でありうるし、
R2およびR3は、-H、-ORd、=O、-C(=O)OH、-C(=O)ORx、および-C(=O)Rxからなる群から独立して選択しうるし、
Rdは、Hまたは1~3個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Rxは、Hまたは1~3個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
R4は、-H、-OH、および1~3個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる)
の1種以上の化合物を用いて行いうる。
R1は、たとえば、-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-アリール、アルキル、イミダゾール、-ORa、-NRbRc、-(CH2)nOH、および-(CH2)nNH2からなる群から選択しうるし、
Raは、H、1~6個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、3~6個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
RbおよびRcは、-H、-OH、-OCH3、1~6個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、3~6個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
nは、0、1、2、3、または4でありうるし、
R2およびR3は、-H、-ORd、=O、-C(=O)OH、-C(=O)ORx、および-C(=O)Rxからなる群から独立して選択しうるし、
Rdは、Hまたは1~3個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Rxは、Hまたは1~3個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
R4は、-H、-OH、および1~3個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる)
の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグが挙げられうる。
本発明は、限定されるものではないが以下の実施例によりさらに詳細に例示される。
in vivo細胞生存能を保証可能であるコンディショニング化合物を同定する試みの中で、セラストロールを用いた予備証拠に基づいて、文献およびSigma-Aldrich(登録商標)構造検索オンラインツールを介して同定された構造類似性を有する12種を超える化合物をスクリーニングした。低酸素ストレスにチャレンジされたヒトMSCの生存能を向上させる化合物の能力を測定した。スクリーニングされた分子は、そのほとんどが天然化合物であり、トリテルペノイド、リモノイド、ウィタノライド、ステロール、イソプレノイド/ジテルペン、およびフラボノイドとして分類可能である。HSP909のNT領域のATP結合ポケットを直接標的とするラディシコール(NT阻害剤)などの古典的HSP90阻害剤もまた、スクリーニングに加えた。スクリーニングは、低酸素ストレス時の細胞の生存能の向上(図1:A、B)およびレポーターベースのアッセイから分かるHSP発現の誘導能(図1C)に関して化合物のさまざまな有効性を示した。セラストロールと構造類似性を共有するウィタノライドおよびゲデュニンをはじめとする上位にスコア付けされた化合物のいくつかでは、これらの効率的コンディショニング化合物の多くは、HSP90コシャペロン相互作用を標的とするHSP90モジュレーターファミリーに属することが、新たな証拠から示される10 11 12。
9Roe SM.Et al.,J Med Chem 1999 Jan 28;42(2):260-6.
10Patwardhan C.A.et al.,J Biol Chem.2013 Mar 8;288(10):7313-25.
11Sreeramulu S.et al.,Angew Chem Int Ed Engl.2009;48(32):5853-5.
12Gu M.,et al.Invest New Drugs.2014 Feb;32(1):68-74.
セラストロールは、移植細胞のin vivo生存能および保持性を向上させることが、以下に記載の結果から示される。簡潔に述べると、ラットMSCをコンディショニング化合物によりサスペンジョン状態で60分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光セルトラッカーで標識し、そしてt=0でラット虚血左後肢に注射した。ART製のOptix(商標)MX3分子イメージングシステムを用いて9日目までin vivoで移植細胞を撮像した(図2:A、B)。プレ処理幹細胞のin vivo生存能および保持性の向上が結果から示され、レーザードップラースキャニングから分かる血流再建の向上傾向が説明される(図3)。ヒトMSCのセラストロール処理は、培養培地中で熱ショックタンパク質(HSP90aは7,0倍、HSP90bは2,2倍、HO1は2,2倍、HSP70は1,8倍)、成長因子およびサイトカイン(MCSFは24,4倍、HGFは2,1倍)、ならびに抗酸化反応関連遺伝子(GSHは2,8倍、TRXは2,5倍、CATは1,7倍)のレベルの増加から分かるように、幹細胞機能を維持および向上させることが、プロテオミクス分析から示される(図4)。
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準は、以下の2つの主要条件を好ましく満たす処理の能力に依拠する。
1. 細胞の処理は、虚血組織で観測される低酸素および/または酸化マイクロ環境においてとくに幹細胞移植との関連でin vivo生存能および保持プロファイルの向上を好ましくもたらす。
2. 細胞の処理は、正常な細胞表現型および/または機能の維持をできる限り好ましく可能にする。しかしながら、きわめて望ましいファーマコオプティマイザーはまた、有益または治療的な表現型を促進する細胞機能を向上させうる。組織修復がパラクリン活性を含む幹細胞の場合には、ファーマコオプティマイザーは、有益なタンパク質の分泌増強および/または有害なタンパク質の産生低減を好ましく行いうるとともに、それにより、移植片環境に対して有利なバランスおよび効果が得られる。
第1の主要条件を試験するために、MSC(ラットまたはヒトのいずれかの起源)を候補ファーマコオプティマイザーで処理し、洗浄し、虚血移植片マイクロ環境に存在する主要な致死ストレッサーをミミックする低酸素/血清飢餓(<1%O2低酸素チャンバー内の低血清培地中に48~72時間)または酸化ストレス(0~2mM H2O2でスパイクされた培地中で1時間インキュベーション)に付した。LIVE/DEAD生存能/細胞傷害キット(Life Technologies(商標))を用いて細胞の生存状態を評価し、Harmony自動解析ソフトウェア(Perkin Elmer(商標))を備えたOperettaハイコンテントスクリーニング(HCS)機器により結果を定量する。
・セラストロール:強力なHSF1アクチベーター(HSP90補因子阻害)、NRF2アクチベーター
・ゲデュニン:HSF1アクチベーター(HSP90補因子阻害)、NRF2アクチベーター
・ラディシコール:HSF1アクチベーター(HSP90古典的ATP阻害剤)、NRF2活性の報告なし
・EGCG:HSF1活性化の報告なし(HSP90-CT阻害)、NRF2アクチベーター
・tBHQ:HSF1活性化の報告なし、NRF2アクチベーター
・HSF1誘導可能な化合物(セラストロール、ゲデュニン、ラディシコール)は、低酸素誘導死から細胞を保護する(図6)。
・HSP90補因子阻害剤(セラストロール、ゲデュニン)は、パラクリン有効性のメディエーターを生成する(図6、7)。
・HSP90NT阻害剤(ラディシコール)は、パラクリン有効性のメディエーターを生成しない(図7)。
・HSP90CT阻害剤(EGCG)は、処理された細胞を低酸素から保護しないが、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる。(図6)。
・NRF2アクチベーター(EGCG、ゲデュニン、セラストロール)は、処理された細胞を酸化ストレス誘導死から保護する。EGCGは、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる(図8)。
・セラストロール以外のNRF2アクチベーター(EGCG、tBHQ、ゲデュニン)は、酸化ストレス誘導死からの保護のためのパラクリンメディエーターを生成する(図9)。
セラストロール(1μM)またはゲデュニン(1μM)+EGCG(1μM、10μM)またはTBHQ(1μM、5μM)
・EGCGおよびtBHQは、セラストロール誘導HSP70およびHSP32発現の相乗的増加を生じる(図10、11)。2つの他のrMSC細胞系では、EGCGはまた、セラストロール誘導HSP70発現の相乗的増加を生じたが、tBHQは、セラストロール誘導変化に効果がなかった。
・EGCGは、ヒトMSCにおいてセラストロール誘導HSP70およびHSP32発現の相乗的用量依存増加を生じる(図12、13)。
・EGCGは、FGF2およびVEGFのセラストロール刺激発現を相乗的に増強するが、TBHQは、FGF2およびVEGFの両方のセラストロール発現およびゲデュニン発現をそれぞれ増加および減少させる(図14、15)。
・EGCGは、CAT、GPx、GR、およびSOD1のセラストロール刺激発現を相乗的に増強する(図16、17、18、19)。
・tBHQは、CAT、GPx、GRのセラストロール刺激発現を相乗的に増強し(低用量tBHQ)、SOD1発現に効果がない。
・セラストロールおよびゲデュニンは、EGCGおよびtBHQによるIL1β誘導発現をダウンレギュレートする(図20)。
・EGCGおよびtBHQは、TNFαのセラストロールおよびゲデュニン誘導ダウンレギュレーションを増強する(図21)。
1. 低酸素誘導死に対して細胞生存能を向上させるとともに各種有益なパラクリン因子(HSP、GF、抗酸化分子)の発現増加および炎症性メディエーターの発現低減を促進することが示されたHSP90阻害剤効果(HSF1誘導可能なHSP90補因子阻害)、および
2. 酸化ストレス誘導死に対する耐性を向上させるとともにある特定の有益なパラクリン因子の発現増強(相加的または相乗的)および/または炎症性サイトカインメディエーターのさらなるダウンレギュレーションを行うことが示されたNRF2活性(潜在的HSP90CT阻害を有する)
実施例3に記載のものに類似した方法を用いて、本出願人は、図23で例証されたものを含めていくつかのセラストロールアナログを試験し、幹細胞ファーマコオプティマイザーとして作用する能力を有するいくつかを同定した(図24、25A、25B、26A~26D)。
適正凍結保存は、凍結保存プロトコルが移植前に許容可能な解凍後生存能(≧70%)をもたらすことを実証する必要がある細胞処理実験室の重要な側面である。たとえば、凍結保存は、解凍肝細胞の著しい変化を誘導し、その生存能、付着、および機能を損なうことが、研究から実証されている。凍結保存前のセラストロールによるrMSCの1時間プレコンディショニングは、解凍後rMSC生存能を向上させることが、図27Aに提示された結果から示される。
10%血清培地(αMEM 1×、10%FBS、1%P-S)中にMSCを再懸濁させ、マルチチャネルピペットを用いて4000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート中にプレーティングし、そして37Cでインキュベートする。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。翌日、培地を穏やかに吸引し、セラストロール(10E-6M)または媒体(DMSO)のいずれかを含有する低血清培地(αMEM 1×、1%FBS、1%P-S)と1時間交換する。次いで、培地を吸引し、培地(αMEM 1×、1%FBS、1%P-S)を3回交換して細胞を洗浄する。細胞をトリプシン処理し、Countess II FL自動セルカウンター(Thermo Fisher Scientific)を用いてカウントする。
セラストロールの1または2回のいずれかの腹腔内注射(1mg/kg、12時間インターバル)によるスプラーグ・ドーリーラットのin vivoコンディショニングは、酸化ストレス誘導死(詳細は以下を参照)に耐えるように骨髄細胞を用量依存的にコンディショニングすることが、図27Bに提示された結果から示される。
スプラーグ・ドーリーラット(CD CRL、Charles River)に12時間のインターバルでセラストロール(1mg/kg)または媒体の1または2回の腹腔内注射を行う。次いで、ラットを屠殺し、以上に記載のようにMSCを単離した。10%血清培地(αMEM 1×、10%FBS、1%P-S)中に再懸濁させることによりMSCを培養下に配置し、マルチチャネルピペットを用いて4000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート中にプレーティングし、そして37Cでインキュベートした。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。
ブタ頸動脈を採取し、閉環および半円開環の構造に切除し、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中または10E-6Mの最終濃度でセラストロールを含有するHBSS中に一晩配置した。製造業者のプロトコルに従ってLIVE/DEADキット(Thermo Fisher Scientific)で頸動脈環を染色した。20×液浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡法(Olympus、FV1000MPE/BK61WF)により組織を撮像した。頸動脈内皮表面のZスタックも得た。図28は、セラストロールを用いない陰性対照と比較してセラストロールを用いたときの内皮層の生存能および健全性の保持を示し、矢印は、死細胞および内皮層健全性損失を指している(図28)。
セラストロールは、各種細胞型で同じように細胞保護メディエーター(生存キナーゼ:pAkt/Akt、pERK/ERK、抗酸化HO1、熱ショック反応タンパク質:HSF1、HSP70)およびタンパク質発現動態を誘導する(10-6M用量で5~120minの試験時間の処理、0~24時間のいずれかの回復、および続いて10-6Mセラストロールで1時間処理)。図29Aおよび29Bは、各種ラットおよびヒト細胞系(H9c2ラット心筋芽細胞、ヒトおよびラットMSC、ラット新生仔心筋細胞、INS-1インスリン産生ラットβ細胞系)で実施されたウェスタンブロットおよび生存能アッセイを表す。
ラットにおける梗塞サイズの減少および心機能の保持に関するセラストロールの効果に加えて、本出願人は、処置ラットにおいて血圧のモジュレーションを観察した。損傷(すなわち、虚血、酸化、炎症、壊死)に対する器官および組織の保持ならびに全身の圧力/灌流の保持に関する本明細書に記載の化合物および組合せ物の潜在能力を考慮すると、これらの病態に関連する器官不全および死亡の割合が高いことから、それらショックモデル(すなわち、敗血性、心原性)で使用することが望ましいであろう。実際に、米国では、年間750,000件を超える重篤な敗血症の症例が25~30%の死亡率で診断されており(Crit Care Med 29(7):1303Y1310,2001)、危機的な症状の心機能不全を含めて複数の器官の機能不全が原因とされる(Circulation 116(7):793Y802,2007)。我々は、ラットにおいて細菌リポ多糖(LPS)により誘導される敗血症性ショックモデルまたは内毒素モデルのいずれかの追加を提案する(Life Sci.,1997;60(15):1223-30)。
本出願人は以前に、ラット虚血心筋においてセラストロールが心筋細胞の生存、傷害および有害なリモデリングの低減を促進して心機能を保持することを示した。本出願人は、この保護効果が他のタイプの虚血疾患で観察可能であるかを調べた。
本出願人は、心筋梗塞のラットモデルにおいてH9c2ラット心筋芽細胞の低酸素培養に対するセラストロールまたはセラストロールアナログの効果を試験した。セラストロールまたはセラストロールアナログと補助剤との組合せは、同様に試験しうる。
細胞培養および刺激:
低酸素チャレンジおよび酸化チャレンジに対する生存性に関連して、H9c2心筋芽細胞を低酸素/血清飢餓(<1%O2低酸素チャンバー内の低血清培地中に48時間)または酸化ストレス(0~1mM H2O2でスパイクされた培地中で1時間インキュベーション)に付す。LIVE/DEADアッセイを用いてH9c2細胞の生存状態を評価した。
すべてのex vivoおよびin vivo実験でルイスラット(250~300g、Charles River,St Constant,QC)を使用した。動物はすべて、実験動物管理使用ガイド(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従って扱った。
分離された灌流心臓調製物:
次の群、すなわち、媒体(n=6)、セラストロールまたはセラストロールアナログ10-8、10-7、または10-6mol/L(n=各5)にラットをランダムに帰属した。イソフルラン麻酔下で、ラットにヘパリン(I.P、1000I.U、Novartis,Dorval,QC)を注入し、心臓を摘出し、氷冷クレブス緩衝液(mmol/l単位:NaCl 113、KCl 4.5、NaH2PO4 1.6、CaCl2 1.25、MgCl2+6H2O 1、D-グルコース 5.5、NaHCO3 25)にただちに浸漬した。5%CO2および残部のO2でバブリングした37℃のクレブス緩衝液を用いて、60~70mmHgの一定大動脈圧でLangendorffシステム(Radnoti,Monrovia,CA)により、心臓の逆灌流を行った。圧力トランスデューサーに接続されたラテックスバルーンを左心室(LV)に挿入し、15mmHg(LVプレロード)に調整した。心臓を300bpmにペース調整し、20分間安定化させた。
次の群、すなわち、シャム(n=6)、媒体(n=8)、セラストロール1mg/Kg(n=6)、またはセラストロールアナログにラットをランダムに帰属した。2%イソフルラン麻酔下で、12MHzトランスデューサーを備えたSonos 5500イメージングシステム(Philips,Philips Healthcare,Andover,MA,USA)を用いて、ベースラインエコーカルジオグラフィーを記載のように行った12。測定結果はすべて、処理を盲検化して同じ経験を積んだ観測者により取得した。各測定に対して、3~5心周期を解析して平均した。
データは、平均値±標準誤差または95%信頼区間のメジアンとして表される。繰返しのない測定の群比較には、ANOVA検定を使用した。繰返し測定では、線形混合効果モデルを群比較に使用した(SASソフトウェア、バージョン9.3のMIXED手順、SAS Institute,Cary,NC,USA)。群間差を評価した。指数や比などの非正規分布測定では、測定結果のlog変換を使用した。血行動態測定では、200測定程度/ラット/時間点をモデルで使用したので、それに応じて各単一測定に加重した(すなわち1/200)。すべての解析で、P<0.05を統計的に有意であるとみなした。
96ウェルプレートのDMEM 10%FBS完全培地中に5,000細胞/ウェルの密度でH9c2ラット心筋芽細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミンを用いてCignalレポーターアッセイ熱ショック反応および抗酸化反応キット(SABiosciences、Qiagen)によりトランスフェクトした。翌日、セラストロール、アナログ、および他の各種化合物をDMEM 1%FBS培地中10E-5~10E-10Mの用量範囲でトリプリケートでウェルに4時間添加し、続いて、3時間のウォッシュアウト時間完全培地を設け、その後、デュアルルシフェラーゼアッセイ(Promega)を用いてシグナリング活性を測定した。セラストロール(供給業者から購入したセラストロール1c、合成アナログを生成するために使用したセラストロール2および3)ならびにセラストロールアナログのアナログ1、アナログ3、およびアナログ4は、熱ショック反応エレメント(HSR)または抗酸化反応エレメント(ARE)により部分的に制御されるレポーター遺伝子の発現を刺激する効力および効率が最高クラスの試験化合物であることが、図35にまとめられた結果から示される。
Claims (11)
- a)アナログ1、アナログ2、アナログ3、アナログ4、及びジヒドロセラストロールからなる群から選択される1種以上の化合物
b)tert-ブチルヒドロキノン(tBHQ)、ビス(2-ヒドロキシベンジリデン)アセトン(2HBA)、エピガロカテキンガレート(EGCG)、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される1種以上の補助剤と、
c)担体または薬学的に許容される担体と、
を含む、
VEGF、SDF1、HGF、HO-1、HSP、及びFGF2からなる群から選択される1種以上の遺伝子の発現を促進し、又はTNFαの発現をダウンレギュレートするための、組成物または医薬組成物。 - 低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素/再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするin vitroまたはex vivo方法であって、前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
a)請求項1又は2に記載の組成物とを接触させることを含む、in vitroまたはex vivo方法。 - 低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素/再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするin vitroまたはex vivo方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
b)アナログ1、アナログ2、アナログ3、アナログ4、およびジヒドロセラストロールからなる群から選択される1種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体と、tBHQ、2HBA、EGCG、カルノソール、およびクルクミンから成る群から選択される補助剤と、
を含む組合せ物とを接触させることを含む、in vitroまたはex vivo方法。 - 低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素/再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするin vitroまたはex vivo方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
c)アナログ1、アナログ2、アナログ3、アナログ4およびジヒドロセラストロールからなる群から選択される1種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体またはそれらの組合せに接触させた個別細胞調製物、及び、tBHQ、2HBA、EGCG、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される補助剤と
を接触させることを含む、in vitroまたはex vivo方法。 - 低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素/再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするin vitroまたはex vivo方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
d)アナログ1、アナログ2、アナログ3、アナログ4、ジヒドロセラストロールからなる群から選択される1種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体またはそれらの組合せに接触させた個別細胞調製物のセクレトーム、及び、tBHQ、2HBA、EGCG、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される補助剤と
を接触させることを含む、in vitroまたはex vivo方法。 - 前記細胞調製物が、細胞または幹細胞を含み、細胞または幹細胞が、間葉幹細胞、CD34+細胞、CD133+細胞もしくは幹細胞、多能性細胞、前駆細胞、もしくは成人分化細胞である、または、細胞調製物、組織、もしくは器官が、哺乳動物における自己移植若しくは同種異系移植予定である、請求項2から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、凍結前またはコンディショニング、凍結/解凍サイクル、細胞のカプセル化、培養、ならびに精製時に、細胞においてin vitroで実施される、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
- 低酸素/再酸素化ストレス、障害、疾患または損傷から細胞、組織、移植片、または器官を保護する、in vitroまたはex vivo方法であって、前記方法が、前記細胞、組織、移植片、または器官と、請求項1または2に記載の組成物、または前記組成物に接触させた細胞調製物のセクレトームと、を接触させることを含む、方法。
- 低酸素/再酸素化ストレスまたは損傷から細胞、組織、移植片、もしくは器官を保護する、または、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減するin vitroまたはex vivo方法であって、前記細胞、幹細胞、組織、移植片、または器官と、請求項1または2に記載の組成物、ならびに、前記組成物に接触させた細胞調製物を含む細胞培地とを接触させる工程を含み、
前記方法が、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減するためのものである場合、前記細胞培地は、移植の前、および/もしくは移植中および/もしくは移植後に前記組成物でコンディショニングされている、
方法。 - 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、前駆細胞、または成体細胞であり、前記細胞、組織、移植片、または器官が、使用前に少なくとも5~180分間の継続時間にわたり、前記化合物に接触され、前記化合物が10-6M~10-10Mの濃度で使用され、前記組成物が1種以上の補助剤をさらに含む、請求項10に記載の方法。
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