ES2986293T3 - Extracto de una composición herbaria como agente antimicrobiano y/o antibiopelícula - Google Patents

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Abstract

Se describe en la presente memoria un extracto de una composición herbaria que comprende al menos dos plantas secas diferentes, útil como agente antimicrobiano y/o antibiofilm en el tratamiento o prevención de infecciones microbianas causadas por bacterias, como por ejemplo Escherichia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus o Staphylococcus, o por hongos, como por ejemplo. Se ha encontrado que en dicho extracto, los principios activos ejercen sus efectos biológicos de manera sinérgica. El extracto puede constituir el principio activo de un complemento alimenticio, una composición nutracéutica, farmacéutica o cosmética o un alimento funcional o un aditivo alimentario. También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar dicho extracto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Extracto de una composición herbaria como agente antimicrobiano y/o antibiopelícula
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones 1-23 y se refiere a un extracto de una composición herbaria que comprende al menos dos plantas secas diferentes útiles como agentes antimicrobianos y/o antibiopelículas. Se ha descubierto también que en dicho extracto, los ingredientes activos ejercen sus efectos biológicos de una manera sinérgica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Al igual que cualquier organismo vivo, las plantas contienen numerosas entidades químicas, que incluyen productos químicos de bajo peso molecular, polipéptidos, polisacáridos, enzimas. Un extracto vegetal es por tanto un ejemplo trivial de mezcla de entidades químicas que se produce de manera natural.
Las actividades biológicas y terapéuticas de muchas mezclas de entidades químicas obtenidas a partir de plantas son de conocimiento secular y se recopilan en numerosos manuscritos (véase, por ejemplo, The Definitive Home Reference Guide to 550 Key Herbs with all their Uses as Remedies for Common Ailments Hardcover - 15 de noviembre de 2000, por Andrew Chevallier).
La ciencia moderna permite observar los efectos biológicos y terapéuticos de las combinaciones de entidades químicas obtenidas de plantas en un gran número de organismos.
Por ejemplo, se describe en Scheggi (Scheggi S. et al, Pharm. Biol. enero 2016 5:1-11 [Epub anterior a la impresión] cómo un modelo de rata permite probar el efecto contra la depresión de las combinaciones de entidades químicas obtenidas de plantas.
En Zhipeng QU (Oncotarget. 1 de septiembre de 2016 Epub) se muestra cómo es posible identificar los mecanismos moleculares anticancerosos candidatos de la inyección del compuesto Kushen usando genómica funcional. La inyección de compuesto Kushen (ICK) se ha usado clínicamente en China durante más de 15 años para tratar diversos tipos de tumores sólidos. Sin embargo, debido a que tales preparaciones de Medicina China Tradicional (MCT) son mezclas complejas de metabolitos secundarios vegetales, es esencial explorar sus mecanismos moleculares subyacentes de una manera sistemática. Este estudio muestra que la ICK inhibía la proliferación de células MCF-7 e inducía apoptosis de una manera dependiente de la dosis. Se descubrió que se perturbaban múltiples rutas y se identificó el ciclo celular como la posible ruta diana primaria de ICK en células m CF-7. La ICK también puede inducir apoptosis en células MCF-7 a través de un mecanismo independiente de p53. Además, identificaron nuevos lncARN y mostraron que muchos de ellos podrían expresarse como una respuesta al tratamiento con ICK.
El efecto de las mezclas de entidades químicas obtenidas, por ejemplo, de plantas, hongos o bacterias sobre el crecimiento de microorganismos tales como bacterias y hongos se ha descrito muchas veces, por ejemplo, en Venkatadri (Venkatadri B. et al., Indian J. Pharm. Sci. noviembre-diciembre 2015; 77(6):788-91).
El efecto de las combinaciones de entidades químicas obtenidas, por ejemplo, de plantas, hongos o bacterias sobre la formación de biopelículas (comunidades de microorganismos embebidos en una matriz polimérica unida a una superficie) también se ha descrito muchas veces, por ejemplo, en Süntar (Süntar I. et al., Pharm. Biol. junio de 2016; 54(6):1065-70Epub 2015 Oct 29).
Shimizu M. et al. (Antimicrob Agents Chemother. noviembre de 2001; 45(11):3198-201) descubrió que un extracto deArcostaphylos uva-ursiredujo marcadamente las CIM (Concentraciones Inhibidoras Mínimas) de los antibióticos betalactámicos, tales como oxacilina y cefmetazol, contraStaphylococcus aureusresistente a meticilina. El mismo grupo aisló también el compuesto eficaz y lo identificó como corilagina.
Otro grupo (Denev P. et al, Acta Biochim. Pol. 2014;61(2):359-67. Epub 18 de junio de 2014) estudió las actividades antioxidantes, antimicrobianas y moduladoras de neutrófilos de extractos de seis plantas medicinales de morera(Rubus fruticosus)hojas de acohón(Aronia melanocarpa),hojas de espino(Crataegus monogyna),manto de la landa(Alchemilla glabra)partes aéreas de la hierba de la mandioca(Filipendula ulmaria),partes aéreas y hojas de frambuesa(Rubus idaeus).La actividad antimicrobiana de los extractos investigados contra 11 patógenos humanos se investigó usando tres métodos diferentes y los resultados de este estudio permitieron concluir que los extractos de hojas de Filipéndula Ulmaria y mora tenían el efecto antimicrobiano más alto y las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) más bajas contra los microorganismos ensayados.
Yam T. et al. (FEMS Microbiol Lett. 1 de julio de 1997; 152 (1) :169-74) centró su estudio en la actividad microbiológica de extractos crudos completos y fraccionados de té(Camellia sinensis),y de componentes del té. Se probaron extractos acuosos de tés(Camellia sinensis)de diferentes tipos y de diversas fuentes y se descubrió que inhibían una amplia variedad de bacterias patógenas, incluyendo resistentes a meticilinaStaphylococcus aureus.Los extractos de té eran bactericidas para los estafilococos yYersinia enterocoliticaa muy por debajo de las concentraciones de "taza de té". La actividad se limitó a una de cuatro fracciones obtenidas a partir de un extracto de té verde mediante cromatografía de partición. El ensayo de compuestos de té puro y productos químicos estrechamente relacionados sugería que la actividad antibacteriana de extractos de té verde puede explicarse por su contenido de epigalocatequina, galato de epigalocatequina y galato de epicatequina. En los extractos de té negro, la teoflavina y sus galatos son componentes antibacterianamente activos adicionales.
La WO 2009/031041 informa de una composición que comprende (a) un compuesto antimicrobiano que tiene una fórmula estructural química dada, (b) un material antimicrobiano seleccionado de bacteriocinas de lantionina, té[Camellia sinensis]extracto de lúpulo[Humulus lupulusL], extracto de piel de uva, extracto de semilla de uva, extracto de Uva Ursi[Arcostaphylos uva-ursi]y combinaciones de los mismos.
La WO 99/20289 informa de una solución de extracto de hierbas transparente que comprende un extracto de hierbas concentrado y un líquido de relleno. Se informa que el extracto de hierbas concentrado se selecciona de una larga lista de extractos de plantas, donde dicha lista incluyeFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArcostaphylos uva-ursi.Sin embargo, la WO 99/20289 no menciona ningún uso terapéutico o médico específico de la solución herbaria reivindicada.
La US 2015/0056255 informa de un producto para uso medicinal, cosmético, colorante o dermatológico, el producto contiene una capa de un producto vegetal fibroso y un extracto vegetal aplicado a la capa del producto vegetal fibroso. Se dice que el extracto vegetal incluye sustancias de una o más partes específicas de una o más plantas, en donde las plantas se seleccionan de al menos una de una larga lista de plantas.
Azanida NN (Med. Aromat. Plants, 4:3, p.1-6, 2015) publicó una revisión, que presenta una descripción y una comparación de los métodos más comúnmente usados para preparar extractos de plantas medicinales. Los autores concluyen su artículo afirmando que "ningún método de extracción universal es el método ideal y cada procedimiento de extracción es único para las plantas" (véase"Conclusiones",líneas 5-7).
Selman A. Wachsman et al. (Bacteriology, 31, p. 157-164, 1945) informa que diferentes cepas de la misma especie bacteriana pueden variar en gran medida en su resistencia a la estreptomicina. En dicho artículo se usan diferentes cepas bacterianas deStaphylococcus aureuspara ensayar la actividad de la estreptomicina. Sin embargo, ningún extracto de planta se prueba en las mismas cepas y por lo tanto no se puede extraer ninguna orientación clara de dicho artículo.
Los efectos biológicos, tales como los contemplados en los ejemplos anteriores, pueden ser inducidos por una sola entidad química, tal como en fármacos estándar, o por efectos sinérgicos de diferentes entidades químicas, tal como en extractos. En algunos casos, el efecto biológico es atribuible casi completamente a una única entidad química contenida en el extracto. En este caso, el extracto puede ser reemplazado por la entidad química activa purificada.
Los efectos biológicos de una entidad química pueden deberse a reacciones químicas (transformaciones) con las entidades químicas que constituyen el organismo o deberse a la unión transitoria o permanente a las entidades químicas, en particular las macromoléculas, que constituyen el organismo. Tal unión modulará la actividad de las entidades químicas del organismo, en particular las macromoléculas, por ejemplo, aumentará o disminuirá la actividad de una enzima.
Desafortunadamente, las entidades químicas nunca tienen un único efecto sobre un organismo. En particular, las interacciones con los constituyentes macromoleculares son numerosas. De hecho, está bien establecido que cualquier entidad química, ya sea natural o resultante de la síntesis química, tendrá efectos perjudiciales sobre organismos (seres humanos, animales, plantas, microflora, etc.) de una manera relacionada con la dosis. Finalmente, también se puede observar un efecto positivo o terapéutico relacionado con la dosis. Para que la entidad química sea de interés industrial, es obvio que la dosis requerida para observar el efecto positivo o terapéutico debe ser menor que la dosis para la que los efectos perjudiciales se vuelven inaceptables.
Las entidades químicas que difieren en su composición o estructura química tendrán diferentes afinidades (o constantes de unión) con las diferentes macromoléculas que constituyen el organismo, y por tanto diferentes modos de acciones que dan como resultado los efectos nocivos, positivos y terapéuticos observados.
En muchos casos las macromoléculas implicadas en efectos nocivos y las implicadas en efectos positivos o terapéuticos son diferentes. Las entidades químicas que difieren en su composición química tendrán en la mayoría de los casos afinidades (o constantes de unión) muy diferentes con las numerosas macromoléculas que constituyen el organismo.
En la mayoría de los casos, diferentes entidades químicas tendrán diferentes afinidades (o constantes de unión) con una macromolécula dada. En casos raros, diferentes entidades químicas tendrán afinidades (o constantes de unión) similares con la misma macromolécula o conjuntos de macromoléculas implicadas en un efecto positivo o terapéutico. Entre estos casos, será raro que estas diferentes entidades químicas tengan afinidades (o constantes de unión) comparables con las macromoléculas implicadas en un efecto perjudicial dado.
Las mezclas de diferentes entidades químicas pueden tener por tanto un efecto sinérgico positivo o terapéutico sin un efecto perjudicial dado acumulativo. Por lo tanto, para un efecto positivo o terapéutico dado, la dosis requerida para cada entidad química diferente individual en una mezcla será menor que la dosis requerida por cada una de las entidades químicas consideradas individualmente para obtener ese efecto positivo o terapéutico dado. En aquellos casos en los que los efectos perjudiciales inducidos por cada compuesto químico diferente son diversos o tienen una etiología macromolecular diferente, cada efecto perjudicial de la mezcla será menor que el efecto perjudicial de la entidad química considerada individualmente porque se usa a una dosis menor en la mezcla.
Obsérvese que la situación sinérgica de la administración simultánea de dosis reducidas de diferentes entidades químicas es diferente de la coadministración de diferentes fármacos (entidades químicas) que tienen diferentes efectos terapéuticos administrados a sus dosis estándar. En la última situación, son bien conocidos los efectos secundarios aumentados debido a interacciones con fármacos. Una de las causas de los efectos secundarios es la posible interacción química de los diferentes fármacos (entidades químicas). En la situación sinérgica, cada entidad química está presente a una concentración reducida y, por lo tanto, con velocidades mucho menores de interacciones químicas. Con fines ilustrativos, una mezcla sinérgica de 10 entidades químicas (fármacos) diferentes administradas cada una a 1/10a de la concentración (dosis) necesaria para una entidad química (fármaco) administrada individualmente, la tasa de reacciones químicas interfármacos se reducirá en un factor de 100 como implica la ley universal de acción de la masa.
Por lo tanto, es de interés usar mezclas sinérgicas de diferentes entidades químicas para obtener un efecto positivo o terapéutico dado con efectos perjudiciales reducidos, o para obtener un efecto positivo o terapéutico aumentado con un nivel dado de diferentes efectos perjudiciales. De hecho, se conocen varios extractos que tienen actividades sinérgicas en relación con entidades químicas aisladas (véase, por ejemplo, Deharo E. et al., Malar. J. 15 de marzo de 2011;10 Suppl 1:S5).
Los extractos naturales compuestos de una mezcla de entidades químicas sinérgicas pueden descubrirse, por ejemplo, por medio de pruebas sistemáticas de numerosos extractos naturales de polvos vegetales individuales o composiciones herbarias que contienen al menos dos o más polvos vegetales diferentes.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha descubierto que un extracto de una composición herbaria que contiene al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipéndula ulmaria, Camellia sinensisyArcostaphylos uva-ursies útil como agente antimicrobiano y/o antibiopelícula en el tratamiento o prevención de infecciones microbianas causadas por bacterias, tales como, por ejemploEscherichia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, StreptococcusoStaphylococcus,o por hongos, tales como por ejemploCandida.También se ha descubierto que en dicho extracto, los ingredientes activos ejercen sus efectos biológicos de una manera sinérgica.
En el presente documento se describe el tratamiento o prevención de las infecciones microbianas mencionadas anteriormente que comprende administrar una cantidad eficaz de un extracto de una composición herbaria que contiene al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArctostaphylos uva-ursi,un liofilizado de dicho extracto, o una composición farmacéutica o veterinaria que comprende dicho extracto o dicho liofilizado, a un sujeto que lo necesite.
Un objeto de la presente invención es un extracto de una composición herbaria, que contiene al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArcostaphylos uva-ursiy al menos una planta seleccionada entreVitis vinifera var. tinctoria, Euqenia caryophyllusyDesmodium adscendens.
Dicha composición herbaria puede comprender además una o más plantas secas adicionales seleccionadas entre:Achillea millefolium, Acorus calamus, Agrimonia eupatoria, Agropyrum repens, Agropyrum repens, Alchemilla vulgaris, Alcanna tinctoria, Althaea officinalis, Anethum graveolens, Angelica archangelica, Arbutus unedo, Arnica montana, Artemisia pontica, Artemisia vulqaris, Asparaqus officinalis, Asparagus officinalis, Asperula odorata, Betula pendula, Borrago officinalis, Buuxus sempervirens, Calamintha officinalis, Calendula officinalis, Calluna vulgaris, Carum carvi, Cassia anquistifolia, Cen to urea cyanus, Centaurium erythraea, Centella asiática, Cetraria islandica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chrysanthelum americanum, Cichorium endivia, Cichorium intybus, Cinnamomum zeylanicum, Citrus aurantium, Combretum micranthum, Crataequs oxiacanta, Cunum cyminum, Cupresus sempervirens, Curcuma zedoaria,Cynara scolymus, Cytisus scoparius, Elettaria cardamomum, Eleutherococcus senticosus, Epilobium parviflorum, Erysimum officinale, Eucalyptus globulus, Eupatorium cannabinum, Foeniculum vulgare, Fraxinus excelsior, Fucus vesiculosus, Fumaric officinalis, Galium odoratum,Gentiana lutea, Geranium robertianum, Ginkgo biloba, Glechoma hederacea, Glycyrrhiza glabra, Handroaanthus impetiqinosus Harpakophytum procumbens, Hieracium pilosella, Humulus lupulus, Hypericum perforatum, Hyssopus officinalis, Illicium verum, Inula helenium, Juqlans regia, Juniperus communis, Lamium album, Lavandula anqustifolia, Leviticum officinale, Lippia citridora, Lotus corniculatus, Lythrum salicaria, Malva sylvestris, Marrubium vulgare, Medicago sativa, Melissa officinalis, Mentha * piperita, Morus nigra, Myrtus communis, Olea europaea, Oriqanum maiorana, Panax qinsenq, Papaver rhoeas, Parietaria officinalis, Passiflora incarnata, Petroselinum crispum, Peumus boldus, Phaseolus vulgaris, Pimpinella anisum, Plantago lanceolata, Plantago ovata, Potentinilla anserina, Quercus robur, Rhamnus frangula, Rheumatum, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Rubia tinctorum, Rubus idaeus, Salix alba, Salvia officinalis, Sambucus nigra, Satureja montana, Silybum marianum, Solanum dulcamara, Tabebuia impétiginosa, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinalis, Thymusserpyllum, Thymus vulgaris, Tilia tomentosa, Tilia cordata, Trigonella foenum-graecum, Tussilago fafara, Vaccinium myrtillus, Valeriana officinalis, Verbascum thapsus, Verbena officinalis, Viscum album, Zea maysyZingiber officinale.
Un objeto adicional de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende de tres a siete plantas secas seleccionadas entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uva-ursi, Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes, Eugenia caryophyllusyEucalyptus Globulus,en la que al menos dos de tales plantas se seleccionan entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArcostaphylos uva-ursiy al menos una de tales plantas se selecciona entreVitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendesyEugenic Caryophyllus.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas:Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoriayArcostaphylos uva-ursi.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas:Rheuum palmatum, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoriayArcostaphylos uva-ursi.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas:Rheuum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eugenia caryophyllusyArcostaphylos uva-ursi.
Un objeto adicional de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas:Rheuum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eucalyptus globulus, Arctostaphylos uva-ursi, Mentha spicatayRubia tinctoria.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende al menos catorce o quince plantas secas seleccionadas entre las dieciséis siguientes:Rheuum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodorayTanacetum vulgare.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas;Rheuum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthumyLippia citrodora.
Otro objeto de la invención es un extracto de una composición herbaria que comprende las siguientes plantas secas:Rheuum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodorayTanacetum vulgare.
Todas las composiciones herbarias mencionadas anteriormente también son un objeto de la invención, como productos intermedios en la preparación de los extractos correspondientes.
El extracto puede constituir el principio activo de un suplemento alimenticio, una composición nutracéutica, farmacéutica o cosmética o un alimento funcional o un aditivo alimenticio.
El extracto de la invención puede utilizarse tal cual o en forma seca o liofilizada.
Un suplemento alimenticio, una composición nutracéutica, farmacéutica, veterinaria o cosmética o un alimento funcional o un aditivo alimenticio que contiene el extracto definido anteriormente junto con excipientes adecuados son objetos adicionales de la invención.
Dicho suplemento alimenticio, una composición nutracéutica, farmacéutica, veterinaria o cosmética o un alimento funcional o un aditivo alimenticio se puede formular en cualquier forma adecuada, por ejemplo, para administración oral, incluyendo formas sólidas tales como polvos, gránulos, cápsulas, píldoras, comprimidos (de liberación normal o controlada), gomas de mascar, o formas líquidas tales como jarabes, gotas, elixires, soluciones y suspensiones en general.
Además, el extracto según la invención puede ser incorporado en otras formulaciones, tales como cremas, pomadas, geles, leches, pastas, cremas a base de agua, emulsiones, sueros, máscaras, bálsamos, fluidos, pulverizaciones, supositorios, supositorios vaginales, parches transdérmicos y pastas dentífricas, geles periodontales, enjuagues bucales.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "composición herbaria" se refiere a un polvo que contiene una o más plantas secas molidas diferentes. El polvo de una única planta seca puede haber sido obtenido de toda la planta o formar una parte específica de la misma, por ejemplo, flores, brotes, frutos, tallos, hojas, semillas, raíces u otras.
De acuerdo con la invención, un extracto puede obtenerse mediante incubación simple de una composición herbaria con un disolvente de extracción (con o sin la adición de un azúcar) a temperatura ambiente.
Los disolventes de extracción adecuados de acuerdo con la invención son agua y todos los disolventes no acuosos autorizados para su uso en la producción de productos alimentarios e ingredientes alimentarios. Por ejemplo, de acuerdo con la Directiva 2009/32/EC, una lista de tales disolventes no acuosos incluye propano, butano, acetato de etilo, etanol, dióxido de carbono, acetona, óxido nitroso. De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, el disolvente de extracción se selecciona entre agua, etanol, acetato de etilo y cualquier mezcla de los mismos.
De acuerdo con otra realización alternativa, un extracto puede obtenerse mediante incubación de una composición herbaria con un disolvente de extracción (con o sin la adición de un azúcar) y posterior calentamiento, con o sin centrifugación y filtración.
De acuerdo con una realización alternativa, un extracto acuoso puede obtenerse mediante incubación de una composición herbaria con agua (con o sin la adición de un azúcar) y posterior calentamiento (por ejemplo, calentando la preparación líquida resultante a una temperatura que varía de 60° C a 134° C, preferentemente de 119° C a 121° C, durante un tiempo que varía de 5 a 60 minutos, preferentemente de 20 a 30 minutos).
Pretendemos que con el término "azúcar", se entienda un azúcar de calidad farmacéutica o alimentaria, tal como por ejemplo dextrosa, lactosa, lactosa anhidra, manitol, sorbitol, maltosa, galactosa o sacarosa.
Según una realización particular de la invención, dicho azúcar es sacarosa.
Dicho azúcar puede utilizarse a concentraciones que varían de 1 a 100 g/l, opcionalmente de 50 a 75 g/l.
Con el término "suplemento alimenticio" se entiende un producto alimenticio destinado a suplementar la dieta común y que es una fuente concentrada de nutrientes, tales como vitaminas y minerales, u otras sustancias con un efecto nutricional o fisiológico, en forma de dosis unitaria (véase también la Directiva 2002/46/CE del 10 de junio de 2002).
Se pretende que la expresión "alimento funcional" incluya alimentos caracterizados por efectos adicionales debidos a la presencia de componentes (generalmente no nutrientes) presentes o añadidos de manera natural, que interactúan más o menos selectivamente con una o más funciones fisiológicas del organismo (biomodulación) que conducen a un efecto positivo en el mantenimiento de la salud y/o la prevención de enfermedades. Un alimento puede considerarse "funcional", si se demuestra suficientemente su influencia beneficiosa en una o más funciones del cuerpo, además de efectos nutricionales adecuados, para ser relevante para un estado de bienestar y salud, o para la reducción del riesgo de una enfermedad. Los efectos beneficiosos podrían incluirse tanto en el mantenimiento como en la promoción de un estado de bienestar o salud y/o una reducción en el riesgo de un proceso de enfermedad o enfermedad (véase AT Diplock et al: Scientific concepts of functional foods in Europe: Consensus Document, British Journal of Nutrition 1999, 81 (Supl. 1), S1-S27).
De acuerdo con la presente invención se pretende que la expresión "composición nutracéutica" signifique un producto, que no solo complementa la dieta, sino que también debería ayudar en la prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos. Esta expresión fue consignada en 1989 por Stephen L. DeFelice (MD, fundador y presidente de la Fundación para Innovación en Medicina (FIM)) que se une a los conceptos de "nutrición" y "farmacéutico".
Se pretende que el término "excipiente", se refiera en la presente memoria a excipientes convencionales, es decir, compuestos inertes hacia el principio activo de una composición.
Los excipientes pueden dividirse en diversas clasificaciones funcionales, dependiendo del papel que se pretenda que desempeñen en la formulación resultante, por ejemplo, en formas de dosificación sólidas, pueden actuar como diluyentes (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina), disgregantes (por ejemplo, glicolato sódico de almidón, croscarmelosa sódica), aglutinantes (por ejemplo, PVP, HPMC), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio), deslizantes (por ejemplo, SO2 coloidal) o agentes aromatizantes (por ejemplo, menta, aceites de limón). En formas de dosificación líquidas pueden actuar como disolventes, codisolventes o solubilizantes (por ejemplo, propilenglicol, glicerol, etanol, sorbitol, dextrosa), agentes tamponantes (por ejemplo, fosfato sódico), agentes antimicrobianos (por ejemplo, sorbato potásico), agentes humectantes (por ejemplo, polisorbatos o Tweens), agentes antiespumantes (por ejemplo, polidimetilsiloxano-dióxido de silicio), agentes espesantes (por ejemplo, metilcelulosa o hidroxietilcelulosa) o agentes edulcorantes (por ejemplo, sorbitol, acesulfamo-K).
Como ya se ha dicho, el extracto de la invención es un agente antimicrobiano y/o antibiopelícula y se utiliza ventajosamente en el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de infecciones microbianas en seres humanos y animales.
Otro objeto de la invención es por tanto el uso del extracto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o diagnóstico de infecciones microbianas. Tal medicamento puede ser útil para seres humanos o animales.
De acuerdo con la presente invención, las expresiones "tratamiento" o "tratar" están destinadas a actividades diseñadas para curar, mitigar los síntomas o retrasar la progresión de una enfermedad o una afección patológica.
Se pretende que las expresiones "prevención" o "prever" se refieran a actividades diseñadas para minimizar la incidencia o efectos de una enfermedad o una afección patológica. Por ejemplo, en el caso de infecciones microbianas, la prevención específicamente en el presente documento significa prevenir la adhesión y colonización de microbios patógenos a células, tejidos y órganos.
Se pretende que las expresiones "diagnóstico" o "diagnosticar" se refieran a actividades diseñadas para identificar una serie de parámetros fisiológicos con el fin de evaluar la presencia y el alcance de una enfermedad o afección patológica determinada.
La expresión "agente antimicrobiano" se usará aquí para que signifique un agente que es capaz de inhibir el crecimiento de células microbianas. Si las células microbianas son células microbianas patógenas, el agente antimicrobiano puede usarse como principio activo de una composición farmacéutica o veterinaria para el tratamiento de infecciones microbianas en seres humanos o animales.
La expresión "agente antibiopelícula" se usará en el presente documento para que signifique un agente que es capaz de inhibir la formación de biopelículas por células microbianas y/o facilitar la dispersión de biopelículas preformadas. Al contrario que los agentes antimicrobianos convencionales, un agente antibiopelícula no afecta directamente a la supervivencia microbiana y, por lo tanto, la expectativa es que no se produzca fácilmente resistencia a estos agentes.
De acuerdo con la presente invención, se entiende que el término "sinérgico" se refiere a un efecto o actividad biológica (en el presente documento antimicrobiano o antibiopelícula), presentado por el extracto de una composición herbaria de la invención (es decir, que comprende al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipéndula ulmaria, Camellia sinensisyArcostaphylos uva-ursi),que es mayor que la suma de los efectos o actividades de los extractos de las plantas secas individuales correspondientes.
Tal efecto o actividad biológica mayor puede ilustrarse, por ejemplo, en términos de inhibición del crecimiento planctónico (actividad antimicrobiana), en términos de inhibición de la formación de biopelículas (actividad antibiopelícula) o en términos de número de cepas, en las que se pueden identificar una o ambas de estas actividades.
Según una realización particular de la invención, las infecciones microbianas son causadas por bacterias, tales como, por ejemploEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella entericasubsp. enterica serovar Enteritidis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, o por hongos, tales como por ejemploCandida albicans.
Según otra realización particular de la invención, las infecciones microbianas son causadas porStaphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisoStaphylococcus pseudintermedius.
ElStaphylococcus aureus,una bacteria Gram-positiva comensal es un patógeno líder que puede causar una amplia variedad de enfermedades en seres humanos que van desde infecciones de piel y tejidos blandos a septicemia grave, shock tóxico o neumonía. ElStaphylococcus aureuses una causa importante de infecciones asociadas a hospital, y muchas cepas hospitalarias deStaphylococcus aureushan adquirido resistencia a los antibióticos, más particularmente a la meticilina. No hay vacunas disponibles todavía, pero se están realizando esfuerzos importantes para desarrollar inmunoterapia activa y pasiva contra diversas dianas de Staphylococcus aureus.
Para evaluar tales actividades biológicas para el extracto de la invención y para muestras comparativas, se han usado muchas cepas diferentes y se mencionarán en la sección de Ejemplos.
En particular, para ensayar tanto la actividad antimicrobiana como antibiopelícula de los extractos de la invención se han usado las siguientes cepas bacterianas.
La ATCC 25923, también conocida como Sealle 1945, es una cepa deStaphylococcus aureusampliamente utilizada en la investigación académica (se cita en 627 publicaciones a partir del octubre de 2016 (véase N!H-NCB!-Pubmed)). Su comportamiento de resistencia a antibióticos se ha caracterizado a fondo (véase, por ejemplo, Reimer L.G. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1981 Jun; 19(6):1050-5).
La ATCC 29213 también es una cepa deStaphylococcus aureusampliamente utilizada en la investigación académica (citada en 327 publicaciones a octubre de 2016 (véase N!H-NCB!-Pubmed)). Se ha usado en la investigación de biopelículas (véase, por ejemplo, Ceri H. et al., J. Clin. Microbiol. 1999 Jun; 37(6):1771-6).
La ATCC 1228 es una cepa deStaphylococcus epidermidis(citada en 101 publicaciones a partir de octubre de 2016 (véase NIH-NCBI-Pubmed)). El Código de Regulaciones Federales (CRF) enumera tales cepas como el organismo de ensayo preferido para neomicina (véase también Robertson J.H. et al., Appl. Microbiol. 1971 Dec;22(6):1164-5).
La ATCC 43300 es una cepa deStaphylococcus aureusaislada de un estudio clínico (citado en 81 publicaciones a octubre de 2016 (véase NIH-NCBI-Pubmed), incluyendo Lubrenko et al., J. Antimicrob. Chemother.
2008 Nov; 62(5):1065-9).
La cepa deStaphylococcus aureusNewman se aisló en 1952 de una infección humana y se ha usado ampliamente en modelos animales de infecciones estafilocócicas debido a su fenotipo de virulencia robusto (véase Baba T.et al., Journal of bacteriology, 190:300-310 (2008)). Al contrario que con MRSA adquirido en hospital (resistente a meticilinaStaphylococcus aureus), Staphylococcus aureusNewman porta un puerto sólo un pequeño número de secuencias de inserción (SI) y carece de determinantes de resistencia a antibióticos conocidos.
Otras cepas usadas en los ejemplos también se usan comúnmente en investigación académica o en la industria para el control de calidad (CC). La mayoría de ellos también son resistentes a la meticilina.
Para referencia a ATCC 33591, véase Reyes N. y col., J. Antimicrob. Chemother. Agosto de 2006; 58(2):462-5, Epub 30 de mayo de 2006. Para referencia a ATCC 33592, véase Teka A. y col., BMC Complement Altern Med. Agosto de 2015 18; 15:286. Para referencia a NCTC 12493, véase Carey B.E. y col., J. Antimicrob. Chemother. Agosto de 2006; 58(2):455-7, Epub 20 de junio de 2006. Para referencia a ATCC 700698, véase Kirker K.R. y col., Int. J. Antimicrob Agents, octubre de 2015; 46(4):451-5, epub 9 de julio de 2015. Para referencia a ATCC 700699, véase Sy C.L. y col., J. Clin. Microbiol. Marzo de 2016; 54(3):565-8, Epub 16 de diciembre de 2015. Para referencia a ATc C 9144, véase Carson C.F. y col., Antimicrob. Agents Chemother. 2002 Jun; 46(6):1914-20. Para referencia a ATCC BAA-44, véase Monecke S. y col., PLoS One. 2011 Apr 6;6(4):e17936. Para referencia a ATCC 14990, véase Bernardo T.H. y col., Scientific World Journal. 2015; 751791, Epub 2015, 3 de junio).). Para referencia a ATCC 49444, véase Ramsey KJ y col., J Food Prot. (2010).). Para referencia a ATCC 60193, véase Petrikaite V y col., Medica (Kaunas).
2007; 43(8):657-63. Para referencia a At CC 11775, véase Usman H y col., Afr J Tradit Complement Altern Med. 10 de junio de 2007; 4(4):488-94. Para referencia a ATCC 13883, véase Supardy NA y col., J Microbiol Biotechnol. 2012 Jun; 22(6):872-81. Para referencia a ATCC 33090, véase Le Marc Y y col., lnt J Food Microbiol. Marzo 2002; 73(2-3):219-37. Para referencia a ATCC 19115, véase Vodnar DC., Chem Cent J. 28 de julio de 2012; 6(1):74. doi: 10.1186/1752-153X-6-74. Para referencia a ATCC 27853, véase Reimer LG y col., Antimicrob Agents Chemother.
1981 Jun; 19(6):1050-5. Para referencia a ATCC 13076, véase Fioretto F y col., Braz J Med Biol Res. agosto de 2005; 38(8):1259-65. Epub 30 de julio de 2005. Para referencia a ATCC 13311, véase Leguérinel I y col., Int J Food Microbiol.
1 de mayo de 2007; 116(1):88-95. Epub 13 de enero de 2007. Para referencia a ATCC 27336, véase Chen S y col., Appl Environ Microbiol. 2013 Jul; 79(13):4015-23. doi: 10.1128/AEM.00704-13. Epub 2013 Apr 19. Para referencia a ATCC 43079, véase Faarrow JA y Collins MD., Syst. Appl. Microbiol. 5: 483-493, 1984. Para referencia a ATCC BAA-1323, véase Svensson Mikael D y col., Microbiology 148: 3933-3945, 2002.
El suplemento alimenticio, la composición nutracéutica, farmacéutica o cosmética de la invención se puede formular adecuadamente para diferentes vías de administración. Tales vías de administración incluyen: auricular, bucal, cutánea, dental, nasal, oftálmica, oral, orofaríngeo rectal, respiratoria (inhalación), sublingual, tópica o vaginal.
Generalmente, las composiciones que comprenden los extractos de la invención se administran en una "cantidad terapéuticamente eficaz".
Para el objetivo de la presente descripción y de las siguientes reivindicaciones, el término "que comprende" también incluye los términos "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".
La cantidad de la composición administrada realmente se determinará típicamente por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, la composición real administrada, la edad, el peso corporal y la respuesta del sujeto individual, la gravedad de los síntomas del sujeto y similares. Para cualquier composición, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, normalmente ratones, ratas, cobayas, conejos, perros o cerdos.
El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos. En el cálculo de la Dosis Equivalente Humana (DEH) se recomienda usar la tabla de conversión proporcionada en Guidance for Industry y Reviewers document (2005, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA).
De acuerdo con la invención, la dosis del extracto que se va a administrar a seres humanos puede regularse en referencia a la composición herbaria usada para prepararla y, en consecuencia, la cantidad de plantas secas individuales molidas presentes en la composición herbaria. Normalmente, se usan de 0,001 a 500 g de cada planta seca molida para preparar el extracto final, opcionalmente de 0,01 a 100 g. Dicho extracto puede usarse como tal o en una forma liofilizada, seca o liofilizada en la composición final para uso humano o animal o puede diluirse adicionalmente.
La dosis eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad de la enfermedad o condición, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, otras terapias simultáneas, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse por experimentación rutinaria y está dentro del criterio del clínico.
El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.
Otro objeto de la invención es el procedimiento de preparación del extracto de la invención. Tal procedimiento comprende esquemáticamente las siguientes etapas:
a) triturar o moler por separado o en una mezcla al menos dos plantas secas individuales para obtener los polvos vegetales correspondientes;
b) mezclar al menos dos polvos vegetales diferentes para obtener una composición herbaria;
c) añadir un disolvente de extracción a dicha composición herbaria para obtener una preparación (o extracto) líquida correspondiente;
d) incubar dicha preparación líquida a temperatura ambiente durante un tiempo que varía entre 5 y 15 minutos; e) calentar dicha preparación líquida a una temperatura que varía entre 60° C a 134° C durante un tiempo entre 5 a 60 minutos; opcionalmente,
f) centrifugar, recoger el sobrenadante y filtrar el sobrenadante recogido; y, opcionalmente,
g) concentrar y/o secar o liofilizar la preparación líquida obtenida de la etapa e) o f).
De acuerdo con la presente solicitud, la palabra "liofilizado" se referirá tanto a extractos liofilizados (deshidratados) como secados de acuerdo con la invención.
Las plantas secas individuales son productos comerciales que pueden adquirirse como parte de las colecciones de plantas secas de farmacias o tiendas de hierbas. Las listas de colecciones de plantas secas están disponibles en cada farmacia de la planta de hierbas de elección y las plantas secas disponibles en tales colecciones pueden variar de país a país.
Por ejemplo, Bélgica, Francia e Italia, decidieron en 2012 unir fuerzas para desarrollar una lista común de plantas, cuyo uso podría permitirse, siempre que los fabricantes cumplan los requisitos de calidad de la ley europea (EC Regulation 852/2004). Gracias al trabajo duro de tres expertos reconocidos (Robert Anton, Luke Delmulle y Mauro Serafini) el proyecto dio como resultado el establecimiento de una lista de 1.029 plantas y 11 setas (vease la lista BelFrit en http://www.economie.gouv.fr/files/files/additions services/dgccrf/imgs/breve/2014/documents/ha rmonized list Section A.pdf)
La invención se describirá ahora haciendo referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Lista de plantas usadas en los Ejemplos
Las plantas y partes de plantas en la siguiente lista se han usado en los diferentes Ejemplos. Por razones de concisión, cada planta se identifica mediante un código usado en todos los Ejemplos. También se indica el peso correspondiente a 200 pl (volumen de la cuchara calibrada) de polvo vegetal (Tabla 0-1). Las plantas secas de grado farmacéutico PA00 a PB12 se obtuvieron de "Pharmacie Fontgiéve" (Clermont-Ferrand, Francia) y las plantas secas de grado farmacéutico PB13 a PD08 se obtuvieron de "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia). Cuando se indica en el Ejemplo, las plantas también se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia) o de Siccarapam (Aubiat, Francia).
y
continuación
continuación
continuación
Método para preparar las composiciones herbarias (Método A)
Cada planta seca se molió usando un molino de granos de café (Tipo 8100, SEB, Francia). El polvo obtenido (polvo vegetal) se tamizó usando un tamiz de malla de 2 mm, y se conservaba en recipientes de 60 ml (Labbox, Francia).
Se prepararon mezclas de diferentes plantas secadas molidas (o polvos vegetales) recogiendo un volumen fijo de polvo vegetal con una cuchara calibrada que permitió recoger 200 pl de polvo. El peso del volumen recogido depende del polvo vegetal específico (véase la Tabla 0-1).
Tales mezclas de diferentes plantas secas molidas (o polvos vegetales) así como plantas secas individuales se denominarán en el presente documento también como "composiciones herbarias".
Método parapreparar los extractos acuosos (también denominado en esta sección de Ejemplos "muestras procesadas", "extractos" o "mezclas de extractos") (Método B)
Tales composiciones herbarias se colocaron en tubos falcon de 50 ml (Falcon, EE.UU.) y se añadieron 20 ml o 40 ml (como se indica en los Ejemplos) de solución de agua de manantial de calidad alimentaria (Volvic, Francia) que contenía 100 g/l de sacarosa de calidad alimentaria (Daddy, Francia). La elección de sacarosa y agua de calidad alimentaria en lugar de sus homólogos de calidad científica fue dictada con el objetivo de obtener una composición comestible que entra en la clase de "aromatizantes" que pueden consumirse directamente según la Regulación (CE) No 1334/2008 del 16 de diciembre de 2008 en aromatizantes y ciertos ingredientes alimenticios con propiedades aromatizantes para su uso en y sobre alimentos.
Cada tubo falcon que contenía tales preparaciones líquidas se agitó usando un mezclador vorticial (ThermoFisher, EE.UU.) durante 10 segundos, se incubó a temperatura ambiente durante 10 min y se colocó en un autoclave (MED 12, JP Selecta, España) y se sometió a un ciclo de esterilización de 20 minutos a 119° o 121° C, como se indica. Después de enfriarse, la preparación esterilizada se mantuvo a -20° C hasta su uso.
El día de la manipulación, la preparación se descongeló a 37° C. La preparación se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemania) o se incubó a temperatura ambiente para la decantación (como se indica en los Ejemplos). Se recogieron 2 ml del sobrenadante con una jeringa de 10 ml y se filtraron usando filtros 0,2 pM (Minisart Jeringa Filters, Sartorius, Alemania) y se recogieron en un tubo Eppendorf de 2 ml. La preparación esterilizada restante se mantiene a -20° C para su uso posterior.
Las muestras así obtenidas se denominarán en el presente documento también "muestras procesadas" y se identificarán por el mismo nombre o código dado a la composición herbaria correspondiente (por ejemplo, el nombre"Mezcla[2P]-1"se utilizará para identificar una composición herbaria y el extracto correspondiente (o muestra procesada), para el que se determina una actividad biológica).
Método para determinar la actividad antimicrobiana y antibiopelícula (Método C)
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó usando las cepas indicadas en cada experimento (o Ejemplo). Para cada medición, cada bacteria almacenada a -80° C en crioperlas (Servicio Técnico, Reino Unido) se coloca en placa en una placa de agar TS (caldo de soja tríptico, Sigma, EE.UU.; agar, Fisherbrand, EE.UU.) y se incuba a 37° C durante la noche. Se recogen varias colonias utilizando un asa de inoculación y se suspenden en solución salina. Se mide la densidad óptica y se realiza una dilución en caldo TS para obtener una concentración de 2.1055 bacterias/ml para cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus pseudintermedius,2.105 bacterias/ml paraStaphylococcus epidermidis.
La actividad biológica de cada muestra procesada se midió en placas de 96 pocillos, usando las cepas indicadas en cada experimento (o Ejemplo) y un control sin bacterias. Cada pocillo contiene 190 pl de caldo TS inoculado con 1055 bacterias/ml para cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus pseudintermedius,105 bacterias/ml paraStaphylococcus epidermidis(o a la concentración indicada en los Ejemplos para todas las demás especies) o sin bacterias para el control y la muestra procesada diluida o el control negativo (solución de sacarosa a 100 g/l sin ninguna planta) a una concentración final de 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 o a una concentración final de 1:20, 1:63 y 1:200 (como se indica en los Ejemplos).
Cada placa se incubó durante 17 horas a 37° C en una incubadora (HettCube 400, Hettich, Alemania).
Las mediciones se realizaron en base al análisis con imágenes del software ImageJ (NIH, EE.UU.) (pero se puede usar cualquier otro software equivalente) de las placas obtenidas usando un escáner de documentos comercial (V 220, Epson, Japón). Las imágenes de la placa colocada en el área de escaneo se adquieren a 600 dpi usando el software provisto del escáner. Para cada placa, se adquirieron 3 imágenes: la primera, antes de la incubación (T0), la segunda después de 17 h de incubación (Tf) y la tercera después de la tinción con cristal violeta (CV) como se describe en Optimización del ensayo de placa de microtitulación para el ensayo de la capacidad de formación de biopelículas en diferentes serotipos deSalmonella(Agarwal, R.K. et al., International Food Research Journal 18(4):1493-1498, 2011).
Para cada pocillo de interés, a partir respectivamente de la primera, segunda y tercera imagen, se caracterizaron regiones circulares de diámetro, respectivamente, 14, 14 y 76 píxeles, centradas con respecto al pocillo, usando una macro ImageJ para calcular, respectivamente, el promedio de M1 y M2 de los píxeles menos intensos del 1% de la región y el promedio M3 de todos los píxeles de la región. La turbidez de la solución bacteriana en el pocillo se dedujo a partir de M1 y M2 usando una curva de referencia obtenida en un experimento independiente en el que se midió el promedio de los píxeles menos intensos del 1% de la región de 14 píxeles de diámetro de pocillos que contenían soluciones bacterianas de turbidez conocida. La densidad óptica de la solución de cristal violeta en el pocillo se dedujo a partir de M3 usando una curva de referencia obtenida en un experimento independiente en el que se midió el promedio de los píxeles de la región de 76 píxeles de diámetro a partir de pocillos que contenían soluciones de cristal violeta de densidad óptica conocida.
Para cada muestra procesada y una bacteria dada, se determinó la CIM a partir de la dilución inhibidora más alta (HID) entre las 4 ensayadas (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) de muestra procesada que evita la aparición de crecimiento visible en 17 h. "0" se asignó cuando ninguna de las diluciones analizadas estaba previniendo el crecimiento bacteriano.
Para cada pocillo que contiene la muestra procesada y una bacteria dada, el porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico de las bacterias se estableció de acuerdo con la fórmula siguiente:
donde Tf (muestra procesada) es la turbidez de la segunda imagen del pocillo de muestra, T0 (muestra procesada) es la turbidez de la primera imagen del mismo pocillo, Tf (control negativo) es la turbidez de la segunda imagen de un pocillo que contiene las mismas bacterias sin muestra procesada, T0 (control negativo) es la turbidez de la primera imagen del mismo pocillo.
Para cada pocillo que contiene la muestra procesada y una bacteria dada, el porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas (IBF) se estableció de acuerdo con la siguiente fórmula:
donde CV (muestra procesada) es la DO de la tercera imagen del pocillo de muestra, CV (control negativo) es la DO de la tercera imagen de un pocillo que contiene las mismas bacterias sin muestra procesada, CV (muestra de control) es la DO de la tercera imagen de un pocillo que contiene la misma muestra o el control negativo a la misma dilución sin ninguna bacteria. Un valor negativo de IBF significa que la mezcla ensayada está promoviendo la formación de biopelícula.
Ejemplo 1
En este Ejemplo ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureus- de la composición divulgada de 2 plantas entre 3:Filipéndula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uvaursi.Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia).
Partiendo de estos tres polvos vegetales diferentes se prepararon seis composiciones herbarias según el método A indicado anteriormente, cuyo contenido se indica en la tabla 1-1.
T l 1-1: m i i n h r ri m r r
Como se muestra en la Tabla 1-1, las tres primeras composiciones herbarias solo contienen un único polvo vegetal, mientras que las tres últimas composiciones contienen dos de los tres polvos vegetales diferentes.
Partiendo de cada composición herbaria indicada en la Tabla 1-1, se prepararon muestras procesadas correspondientes de acuerdo con el Método B indicado antes de usar 20 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua y que incluía la etapa de centrifugación antes de la filtración.
El porcentaje de crecimiento planctónico bacteriano y de inhibición de la formación de antibiopelículas de las muestras procesadas de las 2 mezclas de plantas y las plantas separadas asociadas de este Ejemplo 1 a una dilución 1:10 se determinaron usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus:ATCC 25923 y ATC<c>29213, según el método C indicado anteriormente y se proporcionan en la tabla 1-2.
Tabla 1-2: Inhibición del crecimiento planctónico y la formación de biopelículas (IBF) de 2 muestras
PA13, PA21 y PB12 tienen un efecto antibiótico conocido. Se midió la inhibición limitada del crecimiento planctónico (< 27 %) y la formación de biopelículas (< 51 %) a una dilución 1:10, mientras que las 3 preparaciones aromáticas de 2 extractos de mezcla de plantas muestran efectos antimicrobianos (> 66 %) y efectos antibiopelícula (> 78 %) en ambas cepas analizadas, ATCC 25923 y ATCC 29213.
Para todas las mezclas (mezcla [2P]-1, mezcla [2P]-2, mezcla [2P]-3), se observa un efecto sinérgico de las 2 plantas para los efectos antimicrobianos sobre las 2 cepas analizadas.
Ejemplo comparativo 1
Como ejemplo comparativo, se ilustra la actividad de algunas muestras procesadas, que se ha descubierto que no tienen ninguna o tienen escasas actividades antimicrobianas y antibiopelículas contraStaphylococcus aureusy que se obtuvieron a partir de composiciones herbarias correspondientes que contenían 2 polvos vegetales diferentes.
Se prepararon cinco muestras procesadas usando 2 polvos vegetales adicionales: PA74 (polvo de fruta deRibes nigrum)y PC72 (flores en polvo deCochlearia officinalis).
Los polvos vegetales secos individuales se trataron como se describe en el Ejemplo 1 y se prepararon cinco composiciones herbarias siguiendo el protocolo descrito en el Método A descrito anteriormente. Estas cinco composiciones herbarias tenían el contenido indicado en la Tabla 1-3.
T l 1- : m i i n h r ri m r r
Cada composición herbaria se trató siguiendo el protocolo descrito en el Método B para llegar a la muestra procesada correspondiente usando 20 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de centrifugación antes de la filtración.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus: ATCC 25923 y ATCC 29213, según el método C descrito anteriormente.
El porcentaje de inhibición de crecimiento planctónico bacteriano y de formación de antibiopelículas de las muestras procesadas de las 2 mezclas de plantas y las plantas separadas asociadas a una dilución 1:10 se proporcionan en la Tabla 1-4.
Tabla 1-4: inhibición del crecimiento planctónico y la formación de biopelículas (IBF) de 2 muestras pro :10
PC72 y PA74 y la Mezcla 1 asociada no mostraron actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula limitada en ambas cepas probadas a una dilución 1:10. En cada caso, no se observó efecto sinérgico.
Para todas las mezclas que contenían PA13 y PA21 (Mezcla 2 y 3), no se observó ningún efecto sinérgico para los efectos antimicrobianos en las 2 cepas probadas a una dilución 1:10, cuando tales mezclas contenían también PC72 o PA74.
Es interesante observar que se sabía que ambasRibes nigrumyCochlearia officinalistenían efecto antimicrobiano.
Este ejemplo comparativo ilustra que no cualquier combinación aleatoria entre plantas secas individuales que tienen actividad antimicrobiana y/o antibiopelícula conocida permite obtener un extracto acuoso, en el que se observa una actividad sinérgica.
Ejemplo 2
En este Ejemplo ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusde diferentes extractos acuosos obtenidos a partir de composiciones herbarias que contienen 2 plantas entre las 3 indicadas en el ejemplo 1, cuando tales extractos acuosos se preparan de acuerdo con diferentes métodos.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia).
Se prepararon veinte composiciones herbarias, cuyo contenido se indica en la Tabla 2-1, de acuerdo con el Método A indicado anteriormente.
Tab -
Para cada composición herbaria, se prepararon 20 preparaciones líquidas (agua) como sigue:
Los polvos recogidos se colocaron en veinte tubos falcon de 50 ml (Falcon, EE.UU.). Se añadieron 20 ml de solución de agua de manantial de calidad alimentaria (Volvic, Francia) que contenía 0, 25, 50, 75 o 100 g/l de sacarosa de calidad alimentaria (Daddy, Francia) a 4 tubos de Flacon por condición. Cada tubo falcon que contenía tales preparaciones líquidas se agitó usando un mezclador vorticial (ThermoFisher, EE.UU.) durante 10 segundos, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después se aplicaron 4 tratamientos de calentamiento diferentes a cada condición:
- Infusión fría (sin calentamiento antes de la centrifugación y filtración):
Después de la incubación a temperatura ambiente, las preparaciones se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemania), se recogieron 2 ml del sobrenadante con una jeringa de 10 ml y se filtraron usando filtros 0,2 pM (Minisart Jeringa Filters, Sartorius, Alemania) y se recogieron en un tubo Eppendorf de 2 ml y se mantuvieron a -20° C hasta su uso. El día de la manipulación, la preparación se descongeló a 37° C.
- Calentamiento a 60° C durante 30 minutos:
Después de la incubación a temperatura ambiente, las preparaciones se colocaron en un autoclave (VWR, EE.UU.) y se sometieron a un ciclo de 20 minutos a 60° C. Después de enfriar, las preparaciones tratadas se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemania), se recogieron 2 ml del sobrenadante con una jeringa de 10 ml y se filtraron usando filtros de 0,2 pM (Minisart Syring Filters, Sartorius, Alemania) y se recogieron en un tubo Eppendorf de 2 ml y se mantuvieron a -20° C hasta su uso. El día de la manipulación, la preparación se descongeló a 37° C.
- Calentamiento a 119° C durante 20 minutos:
Después de la incubación a temperatura ambiente, las preparaciones se colocaron en un autoclave (VWR, EE.UU.) y se sometieron a un ciclo de esterilización de 20 minutos a 119° C. Después de enfriar, las preparaciones tratadas se mantuvieron a -20° C hasta su uso. El día de la manipulación, la preparación se descongeló a 37° C, se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemania), se recogió 1 ml del sobrenadante con una jeringa de 10 ml y se filtró usando filtros 0,2 pM (Minisart Jeringa Filters, Sartorius, Alemania) y se recogió en un tubo Eppendorf de 2 ml.
Estas muestras se denominarán en el presente documento "muestra procesada".
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó usando la cepa deStaphylococcus aureusATCC 25923, según el método C descrito anteriormente.
En la Tabla 2-2 se proporcionan el porcentaje de crecimiento planctónico bacteriano de 20 muestras procesadas, preparadas a partir de las composiciones herbarias después de cada uno de los diferentes tratamientos de calentamiento presentados anteriormente, a una dilución 1:10.
Tabla 2-2: Crecimiento planctónico de ATCC 25923 con 20 muestras procesadas a una dilución 1:10 r r r ir l m i i n h r ri M z l 1 M z l 2 l T l 2-1
Todas las muestras procesadas preparadas a partir de la Mezcla 1 mostraron efectos antimicrobianos sobre la ATCC 25923, solo después del tratamiento con temperatura a 119°, mientras que la Mezcla 2 mostró efectos antimicrobianos limitados (del 31 al 52% de inhibición) después de la infusión en frío para toda la concentración de sacarosa excepto para la afección sin sacarosa y después de todos los tratamientos con temperatura probados (> 82 % de inhibición) excepto para la condición sin adición de sacarosa tratada a 60° C, para la que la muestra procesada mostró solo un 16% de inhibición del crecimiento planctónico. Los tratamientos de temperatura potenciaron los efectos antimicrobianos de la Mezcla 2. El tratamiento de temperatura óptima entre los tratamientos probados para la Mezcla 1 y la Mezcla 2 fue de 119° C durante 20 minutos.
La influencia de la concentración de sacarosa sobre el efecto antimicrobiano depende del tratamiento térmico aplicado. Para la Mezcla 1 tratada a 119° C durante 20 min, se obtuvo el mismo efecto antimicrobiano con 100, 75, 25 y 0 g/l de sacarosa, se observó una menor actividad con 50 g/l. Para la Mezcla 2, se obtuvo el mismo efecto antimicrobiano independientemente de la concentración de sacarosa para el tratamiento a 119° C de temperatura.
En la Tabla 2-3 se proporciona el porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas (IFB) de 20 muestras procesadas, preparadas a partir de las composiciones herbarias después de cada uno de los diferentes tratamientos de calentamiento presentados anteriormente, a una dilución de 1:10.
Tabla 2-3: inhibición de la formación de biopelículas (IFB) de ATCC 25923 con 20 muestras procesadas a
En todas las condiciones probadas, las muestras procesadas mostraron algún efecto antibiopelícula.
Para la Mezcla 1, se observó actividad antibiopelícula limitada para toda la concentración de sacarosa con infusión fría y con tratamiento a temperatura de 60° C (22 a 55% de inhibición). Se observó una alta actividad antibiopelícula (>90% de inhibición) con un tratamiento a 119° C de temperatura para todas las concentraciones de sacarosa excepto para 50 g/l que mostró un 75 % de inhibición.
Para la Mezcla 2, se obtuvieron actividades antibiopelícula equivalentes independientemente de las concentraciones de sacarosa para tratamientos de temperatura de 60° C y 119° C (> 77 % de inhibición). Después de la infusión fría, la Mezcla 2 mostró un efecto antibiopelícula de medio a bueno (del 50% al 74% de inhibición) dependiendo de las concentraciones de sacarosa: cuanto más alta era la concentración de sacarosa, más activa era la preparación.
Ejemplo 3
En este Ejemplo ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidisde 12 mezclas que contienen 2 a 7 plantas.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia). Se prepararon composiciones herbarias que comprendían de 2 a 7 polvos vegetales recogiendo un volumen fijo de polvo vegetal con una cuchara calibrada que permitió recoger 200 pl de polvo. Se prepararon doce composiciones herbarias como se indica a continuación (Tabla 3-1) de acuerdo con el Método A descrito previamente.
T l -1: m i i n h r ri m r r
Se prepararon doce muestras procesadas correspondientes a partir de cada composición herbaria de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 20 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de centrifugación antes de la filtración.
La actividad biológica de la muestra procesada se determinó usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 29213, NCTC 12493, ATCC 33591, ATCC 33592, ATCC 43300, ATCC 700698, ATCC 700699, ATCC 9144 y ATCC BAA-44 y las siguientes cepas deStaphylococcus epidermidis:ATCC 12228, ATCC 700296, ATCC 49461 y ATCC 14990, según el método C descrito anteriormente.
La concentración inhibidora mínima (CIM) observada con las 12 muestras procesadas se da en la Tabla 3-2 en forma de HID, así como la eficacia promedio sobre todas las cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidis.
Tabla 3-2: HID de 12 muestras procesadas sobre 10 cepas de Staphylococcus aureus y 4 cepas de Staphylococcus epidermidis
Dado que en este Ejemplo los HID observados están en la mayoría de los casos entre 1:10 y 1:20, se eligió 1:20 como la dilución de referencia para el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas. El porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano de las 12 muestras procesadas a una dilución 1:20 se da en la Tabla 3-3, así como la eficacia promedio sobre todas las cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidis.
Tabla 3-3: inhibición del crecimiento planctónico de las 12 muestras procesadas en 10 cepas de
En la Tabla 3-4 se informa del porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas(IFB) de las 12 muestras tratadas en la dilución 1:20, así como la eficacia promedio en todas las cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidis.La eficacia promedio de la inhibición del crecimiento planctónico de las bacterias y el porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en todas las cepas probadas es un buen indicador de la actividad antimicrobiana y la eficacia antibiopelícula en diversas cepas bacterianas.
Tabla 3-4: inhibición de la formación de biopelícula de 12 muestras tratadas sobre 10 cepas de Staphylococcus aureus y 4 cepas de Staphylococcus epidermidis con dilución 1:20
Los extractos de mezclas de 2 plantas mostraron actividad antimicrobiana completa a una dilución de 1:10 sobre 10 cepas deStaphylococcus aureusprobadas excepto para la Mezcla [2P]-3 que no tenía agente antimicrobiano a la dilución ensayada en 2 de las 10 cepas deStaphylococcus aureusprobadas (ATCC 29213 y ATCC 43300) (véase la Tabla 3-2).
Los tres extractos de mezclas de 2 plantas mostraron diferente actividad antimicrobiana en las 4 cepas deStaphylococcus epidermidisprobadas. La mezcla [2P]-1 tenía una HID de 1:10 en 3 cepas (ATCC 12228, ATCC 49461 y ATCC 14990) y una HID de 1:20 en la cepa ATc C 700296. La mezcla [2P]-2 tenía una HID de 1:10 en 2 cepas (ATCC 12228 y ATCC 49461) y una HID de 1:20 en las otras 2 cepas (ATCC 700296 y ATCC 14990). Mientras que la Mezcla[2P]-3 tenía una HiD de 1:10 en 2 cepas (ATCC 12228 y ATCC 14990) y una HID de 1:20 en las otras 2 cepas (ATCC 700296 y ATCC 49461) (véase la Tabla 3-2).
La Mezcla[3P]-1 obtenida de las 3 plantas que se incluyen en la Mezcla[2P]-1, la Mezcla[2P]-2 y la Mezcla[2P]-3, mostró una actividad antimicrobiana más amplia que las 3 mezclas de dos plantas (HID de 1:10 en 9 cepas deStaphylococcus aureusy HID de 1:20 sobre ATCC 700699, HID de 1:20 sobre las 4Staphylococcus epidermidisprobadas) (véase la Tabla 3-2). La ganancia de actividad antimicrobiana se confirma mediante el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico de cada mezcla de plantas (véase la Tabla 3-3).
A la mezcla de 3 plantas Mezcla[3P]-1 3 se agregaron plantas diferentes, PA11, PA12 y PA22, para obtener tres extractos de mezclas de 4 plantas, Mezcla[4P]-1, Mezcla[4P]-2 y Mezcla[4P]-3, respectivamente. Estos extractos de mezclas de 4 plantas mostraron la misma HiD o mejor HID que el extracto de mezcla de 3 plantas Mezcla[3P]-1 (véase la Tabla 3-2), y un mayor porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico: se obtiene un promedio del 28 % al 45 % con extractos de mezclas de 4 plantas en las 10 cepas deStaphylococcus aureusen comparación con el 23% con el extracto de mezcla de 3 plantas (véase la tabla 3-3). También mostraron un mayor porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas: se obtuvo un promedio del 34% al 42% con extractos de mezclas de 4 plantas en las 10 cepas deStaphylococcus aureusen comparación con el 25% con el extracto de mezcla de 3 plantas (véase la tabla 3-4).
Se prepararon 5 mezclas de plantas añadiendo 2 plantas entre las 3 plantas adicionales seleccionadas. Los tres extractos de mezclas de 5 plantas mostraron una actividad antimicrobiana y antibiopelícula superior a la de los extractos de mezclas de 4 plantas (véanse las Tablas 3-2, 3-3 y 3-4).
La mezcla [6P]-1 consiste en las 6 plantas que se usaron para la preparación de las muestras procesadas previamente analizadas. Curiosamente, el extracto de mezcla de 6 plantas mostró menos actividad antimicrobiana y antibiopelícula que los extractos de mezclas de 5 plantas pero mayor efecto antimicrobiano y mayor a los efectos antibiopelícula equivalentes que los extractos de mezclas de 4 plantas. La actividad antimicrobiana y antibiopelícula se recuperó y mejoró mediante la adición de una nueva planta (PA79) (véanse las Tablas 3-2, 3-3 y 3-4).
El aumento del número de plantas en las mezclas permitió preparar extractos acuosos correspondientes que tenían actividad antimicrobiana y antibiopelícula mejorada y aumentó el número de cepas, en las que se pueden identificar una o ambas de estas actividades.
Ejemplo 4
En este Ejemplo ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusde 196 extractos de agua obtenidos a partir de composiciones herbarias que incluyen al menos 2 plantas entre las 3 plantas descritas en el ejemplo 1 y plantas adicionales para formar mezclas de 3 a 10 plantas.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Pharmacie Fontgiéve"(Clermont-Ferrand Francia, plantas PA00 a PB12) y "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PB13 a PD08).
Las 4 composiciones herbarias de referencia Mezcla[2P]-1, Mezcla[2P]-2, Mezcla[2P]-3, Mezcla[3P]-1 y las 196 nuevas composiciones herbarias se prepararon de acuerdo con el Método A descrito previamente y tenían el contenido informado en la Lista 4-1.
Lista 4-1: composiciones herbarias de muestras procesadas
Mezcla[2P]-1 PA13 PA21
Mezcla[2P]-2 PA21 PB12
Mezcla[2P]-3 PA13 PB12
Mezcla[3P]-1 PA13 PA21 PB12
Mezcla[3P]-2 PA11 PA13 PA21
Mezcla[3P]-3 PA21 PB12 ; PC63
Mezcla[3P]-4 PA13 PB12 ; PC63
Mezcla[3P]-5 PA13 PA21 ; PC63
Mezcla[3P]-6 PA13 PA21 PB12
Mezcla[3P]-7 PA21 PB12 ; PC29
Mezcla[3P]-8 PA13 PB12 ; PC29
Mezcla[3P]-9 PA13 PA21 PB12
Mezcla[4P]-1 PA11 PA13 PA21 PB12
Mezcla[4P]-2 PA12 PA13 PA21 PB12
Mezcla[4P]-3 PA13 PA21 PA22 PB12
Mezcla[4P]-4 PA11 PA13 PA21 PA22;
Mezcla[4P]-5 PA13 PA21 PB12 PC63
Mezcla[4P]-6 PA11 PA12 PA21 PB12
Mezcla[4P]-7 PA11 PA12 PA13 PB12
Mezcla[4P]-8 PA11 PA13 PA21 PB12
Mezcla[4P]-9 PA12 PA13 PA21 PB12
Mezcla[4P]-10: PA13; PA21; PB12; PC29;
Mezcla[5P]-1 PA12 PA13 PA21 PA22 PB12
Mezcla[5P]-2 PA11 PA13 PA21 PA22 PB12
Mezcla[5P]-3 PA11 PA12 PA13 PA21 PB12
Mezcla[5P]-4 PA11 PA12 PA21 PA22 PB12
Mezcla[5P]-5 PA11 PA12 PA13 PA22 PB12
Mezcla[5P]-6 PA11 PA12 PA13 PA21 PA22
Mezcla[5P]-7 PA13 PA21 ; PA22 PB12 PC63
Mezcla[5P]-8 PA13 PA21 PB12 PC29 ; PC63;
Mezcla[6P]-1 PA11 PA12 PA13 PA21 PA22 PB12
Mezcla[6P]-2 PA12 PA13 PA21 PA22; PB12 PC63;
Mezcla[6P]-3 PA11 PA13 PA21 PA22 PB12 PC63;
Mezcla[6P]-4 PA11 PA12 PA13 PA21 PB12 PC63;
Mezcla[6P]-5 PA12 PA13 PA21 PA22 PB12 PC63;
Mezcla[6P]-6 PA11 PA13 PA21 PA22 PB12 PC63;
Mezcla[6P]-7 PA11 PA12 PA21 PA22; PB12 PC63;
Mezcla[6P]-8: PA11; PA12; PA13; PA22; PB12; PC63;
Mezcla[6P]-9: PA11; PA12; PA13; PA21; PB12; PC63;
Mezcla[6P]-10: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PC63;
Mezcla[6P]-11: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12;
Mezcla[7P]-1: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12; PA79;
M[7P]-2: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12; PB49;
M[7P]-3: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12; PC29;
M[7P]-4: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12; PC63;
M[9P]-11: PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-12: PA11; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-13: PA11; PA12; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-14: PA11; PA12; PA13; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-15: PA11; PA12; PA13; PA21; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-16: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PB12; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-17: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB49; PC29; PC63;
M[9P]-18: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PC29; PC63;
M[9P]-19: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC63;
M[9P]-20: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29;
M[10P]-40: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA23; PA67; PB12; PC27; PC60; M[10P]-44: PA13; PA40; PA41; PA62; PA75; PB18; PC22; PC63; PC64; PD05; M[10P]-71: PA21; PA85; PB14; PB18; PB85; PC19; PC61; PC63; PD05; PD08; M[10P]-75: PA02; PA10; PA12; PA13; PA18; PA21; PA27; PA79; PB86; PC26; M[10P]-84: PA10; PA21; PA27; PB12; PB15; PC26; PC68; PD05; PD06; PD08; M[10P]-98: PA11; PA12; PA13; PA14; PA20; PA21; PA27; PB16; PB18; PD06; M[10P]-102: PA12; PA13; PA19; PA21; PA41; PA79; PB10; PC26; PC61; PC64; M[10P]-103: PA13; PA17; PA21; PA24; PB08; PB49; PB85; PC15; PC29; PD05; M[10P]-105: PA10; PA11; PA12; PA18; PA19; PA21; PA22; PB12; PC63; PD08; M[10P]-109: PA10; PA12; PA13; PA21; PA27; PA75; PB14; PB16; PC45; PC63; M[10P]-112: PA08; PA13; PA15; PA17; PA18; PA21; PA27; PB18; PB41; PB81; M[10P]-115: PA13; PA20; PA21; PA22; PA62; PA79; PB08; PB19; PC15; PC61; M[10P]-119: PA11; PA13; PA14; PA24; PB12; PB41; PB49; PC51; PD06; PD08; M[10P]-123: PA10; PA13; PA15; PA20; PA21; PA75; PB12; PB18; PB49; PC63; M[10P]-124: PA08; PA13; PA21; PA24; PA27; PB08; PB41; PB49; PC64; PD05; M[10P]-125: PA13; PA14; PA19; PA21; PA75; PB12; PC15; PC26; PC61; PC63; M[10P]-129: PA08; PA12; PA18; PA21; PA41; PB08; PB85; PC63; PC64; PD08; M[10P]-130: PA12; PA13; PA21; PA24; PA27; PB10; PB41; PB49; PC15; PC61; M[10P]-132: PA12; PA20; PA21; PA24; PC15; PC26; PC61; PC63; PC64; PD08; M[10P]-134: PA21; PA22; PA24; PA27; PB10; PB12; PB49; PC15; PC29; PD05; M[10P]-136: PA10; PA11; PA12; PA13; PA18; PA21; PB16; PB18; PC26; PC29; M[10P]-140: PA13; PA15; PA21; PA24; PA62; PA79; PB10; PB12; PC63; PC64; M[10P]-142: PA11; PA12; PA13; PA19; PA21; PB12; PB85; PC15; PC26; PC64; M[10P]-144: PA13; PA15; PA21; PA24; PA75; PB49; PC51; PC61; PC64; PD05; M[10P]-145: PA12; PA13; PA17; PA20; PA21; PA79; PB08; PB16; PB85; PC63; M[10P]-148: PA10; PA13; PA20; PA24; PB08; PB12; PB49; PC26; PC51; PC64; M[10P]-149: PA13; PA14; PA15; PA19; PA21; PB08; PB10; PB41; PC15; PC61; M[10P]-150: PA10; PA12; PA13; PA14; PA21; PA62; PB10; PC26; PC64; PD06; M[10P]-151: PA10; PA13; PA21; PA22; PA24; PA41; PB49; PC15; PC61; PC63; M[10P]-152: PA11; PA12; PA13; PA15; PA21; PA27; PA75; PB12; PB49; PB85; M[10P]-154: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA79; PB12; PB49; PC29; PC63; M[10P]-156: PA15; PA21; PA22; PB10; PB85; PC26; PC29; PC61; PC63; PC64; M[10P]-157: PA11; PA13; PA15; PA19; PA21; PB18; PB41; PC15; PC51; PD08; M[10P]-158: PA10; PA17; PA21; PA24; PA27; PA41; PB49; PC26; PC61; PC63; M[10P]-160: PA10; PA12; PA13; PA15; PA18; PA20; PA21; PA24; PB12; PC26; M[10P]-162: PA12; PA13; PA21; PA27; PA79; PB12; PB16; PB18; PC63; PC64; M[10P]-164: PA12; PA13; PA15; PA19; PA21; PA27; PB08; PB12; PB49; PD05; M[10P]-165: PA13; PA15; PA22; PA75; PA79; PB12; PB18; PC15; PC26; PC29; M[10P]-167: PA12; PA13; PA75; PB08; PB12; PB85; PC15; PC51; PC61; PC63; M[10P]-168: PA11; PA13; PA17; PA21; PA27; PA62; PA79; PB16; PB49; PC64; M[10P]-169: PA12; PA17; PA21; PA24; PA75; PA79; PB10; PB12; PB85; PC15; M[10P]-170: PA11; PA13; PA15; PA20; PA21; PA22; PC26; PC29; PC63; PC64; M[10P]-172: PA13; PA20; PA21; PA75; PB10; PB12; PB18; PB49; PC29; PC61; M[10P]-173: PA10; PA12; PA13; PA14; PA19; PA20; PA21; PA79; PC15; PC63; M[10P]-174: PA11; PA12; PA13; PA27; PA62; PB12; PB16; PB49; PB85; PC26; M[10P]-175: PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA75; PB10; PB49; PC15; PC63; M[10P]-176: PA11; PA13; PA21; PA24; PA62; PB12; PC15; PC26; PC61; PC64; M[10P]-178 PA11 PA14 PA15 PA18 PA19 PA21 PA22 PB16 PC15 PC63 M[10P]-180 PA08 PA11 PA12 PA13 PA15 PA17 PA21 PA62 PB12 PC63 M[10P]-181 PA13 PA19 PA21 PA22 PA79 PB08 PB10 PB18 PC15 PC29 M[10P]-182 PA11 PA15 PA20 PA21 PA22 PA75 PB12 PC29 PC63 PC64 M[10P]-183 PA11 PA12 PA13 PA27 PA79 PB16 PB18 PB49 PC15 PC63 M[10P]-184 PA11 PA13 PA15 PA20 PA21 PA22 PA27 PA75 PB12 PC29 M[10P]-186 PA11 PA15 PA19 PA20 PA21 PA22 PA27 PB10 PB12 PB85 M[10P]-188 PA11 PA12 PA13 PA19 PA21 PA75 PA79 PB49 PC15 PC63 M[10P]-190 PA11 PA13 PA21 PA22 PA27 PA75 PB10 PB12 PB49 PC63 M[10P]-191 PA13 PA19 PA20 PA21 PA79 PB10 PB18 PB85 PC29 PC61 M[10P]-192 PA12 PA13 PA19 PA21 PA27 PA75 PB12 PB49 PC63 PC64 M[10P]-193 PA13 PA15 PA20 PA21 PA79 PB16 PC15 PC26 PC29 PC61 M[10P]-194 PA11 PA17 PA21 PA22 PA27 PB12 PB49 PC15 PC63 PC64 M[10P]-196 PA11 PA12 PA13 PA15 PA21 PA75 PB10 PB18 PC51 PC63 M[10P]-197 PA11 PA12 PA13 PA15 PA21 PA24 PA79 PB49 PC61 PC64 M[10P]-198 PA12 PA15 PA21 PA22 PB12 PB16 PB85 PC15 PC26 PC29 M[10P]-199 PA11 PA12 PA13 PA15 PA21 PA75 PB12 PC15 PC63 PC64 M[10P]-201 PA11 PA13 PA20 PA21 PA22 PA27 PA75 PB12 PB49 PC64 M[10P]-202 PA11 PA21 PA75 PB10 PB12 PB61 PC26 PC29 PC42 PC63 M[10P]-205 PA11 PA13 PA19 PA21 PA22 PA27 PA75 PB12 PB41 PC63 M[10P]-207 PA11 PA13 PA21 PA75 PB10 PB12 PB41 PB51 PC45 PC63 M[10P]-209 PA12 PA13 PA21 PA24 PA75 PB12 PB16 PB49 PB60 PC15 M[10P]-210 PA13 PA15 PA20 PA22 PA27 PB08 PB10 PB12 PB18 PC63 M[10P]-212 PA11 PA13 PA21 PA22 PA27 PA75 PB12 PB16 PC15 PC63 M[10P]-214 PA11 PA12 PA15 PA21 PA22 PA75 PB12 PB49 PC15 PC61 M[10P]-215 PA11 PA12 PA13 PA21 PA25 PB12 PC02 PC29 PC51 PC64 M[10P]-216 PA11 PA12 PA13 PA21 PA27 PA75 PA85 PB18 PB49 PC49 M[10P]-217 PA18 PA20 PA21 PA22 PA75 PB10 PB12 PB16 PB85 PC64 M[10P]-218 PA10 PA13 PA15 PA20 PA22 PA27 PB18 PB49 PC51 PC63 M[10P]-219 PA12 PA13 PA15 PA19 PA21 PA22 PA75 PB10 PB12 PC26 M[10P]-220 PA11 PA12 PA13 PA19 PA21 PA22 PA27 PB12 PB49 PC63 M[10P]-221 PA13 PA15 PA19 PA20 PA21 PA41 PA75 PB12 PC15 PC60 M[10P]-222 PA05 PA13 PA21 PA22 PA75 PA79 PB49 PC26 PC29 PC63 M[10P]-223 PA11 PA12 PA13 PA22 PA25 PA75 PB12 PB49 PC61 PC64 M[10P]-225 PA12 PA13 PA21 PA27 PB10 PB12 PC29 PC63 PC64 PD08 M[10P]-226 PA11 PA12 PA21 PA39 PA79 PB18 PB49 PB85 PC61 PC63 M[10P]-227 PA11 PA12 PA15 PA20 PA21 PA22 PB12 PB42 PC15 PC26 M[10P]-229 PA13 PA20 PA62 PA79 PB12 PB46 PB85 PC29 PC64 PD08 M[10P]-230 PA11 PA12 PA13 PA21 PA22 PA75 PB10 PB12 PB58 PC61 M[10P]-232 PA12 PA13 PA15 PA22 PA27 PA83 PB12 PB49 PC26 PC63 M[10P]-235 PA12 PA13 PA15 PA20 PA21 PA22 PC29 PC51 PC63 PC65 M[10P]-236 PA12 PA13 PA20 PA21 PA27 PA75 PB50 PB85 PC29 PC64 M[10P]-237 PA11 PA13 PA15 PA21 PA27 PA75 PB10 PB12 PC63 PC70 M[10P]-239 PA10 PA11 PA12 PA20 PA21 PB10 PB41 PB49 PC63 PD08 M[10P]-240 PA11 PA12 PA15 PA21 PA27 PA79 PB46 PC29 PC51 PC63 M[10P]-241 PA11 PA14 PA20 PA21 PA22 PA75 PB12 PB18 PC15 PC29 M[10P]-242 PA11 PA12 PA13 PA21 PA22 PA79 PB18 PB49 PC51 PC63 M[10P]-244 PA11 PA12 PA13 PA20 PA22 PA27 PB10 PB12 PC63 PC64 M[10P]-246 PA11 PA12 PA13 PA21 PA61 PA79 PB10 PB12 PB18 PB85 M[10P]-247 PA11 PA12 PA21 PA27 PB16 PB49 PC21 PC51 PC61 PC63 M[10P]-248 PA11 PA13 PA14 PA19 PA21 PA75 PA79 PB14 PB49 PC15 M[10P]-250 PA11 PA12 PA15 PA20 PA21 PA41 PA75 PB49 PC26 PC63 M[10P]-251 PA12 PA13 PA21 PA22 PA27 PA79 PB10 PB12 PB13 PB16 M[10P]-252 PA11 PA13 PA20 PA21 PA44 PB08 PB12 PB18 PB88 PD06 M[10P]-253 PA10 PA11 PA12 PA13 PA15 PA21 PA22 PA27 PA79 PC63 M[10P]-255 PA11 PA13 PA21 PA75 PB12 PB18 PB49 PC15 PC26 PC63 M[10P]-256 PA11 PA12 PA13 PA21 PA22 PA23 PA75 PA79 PC29 PC64 M[10P]-257 PA13 PA20 PA21 PA27 PB12 PB49 PB83 PC29 PC63 PD00 M[10P]-258 PA12 PA13 PA20 PA21 PA22 PA75 PB10 PB12 PC15 PC63 M[10P]-262 PA11 PA12 PA21 PA31 PA75 PB49 PB85 PC61 PC63 PC64 M[10P]-264 PA21 PA24 PA27 PA31 PA79 PB10 PB18 PB49 PC15 PC63 M[10P]-267 PA11 PA12 PA21 PA22 PA75 PC29 PC51 PC61 PC63 M[10P]-268 PA11 PA12 PA13 PA15 PA27 PA75 PB10 PB12 PB45 PC64 M[10P]-269 PA13 PA20 PA21 PA22 PA79 PB10 PB11 PB49 PC61 PC63 M[10P]-270 PA11 PA12 PA13 PA15 PA21 PA75 PB12 PB14 PB18 PC49 M[10P]-271: PA11 PA13 PA20 PA22 PA27 PA45 PB08 PB12 PB49 PC64
M[10P]-272: PA13 PA21 PA24 PA79 PB10 PB12 PB41 PC15 PC29 PC63
M[10P]-273: PA11 PA15 PA21 PA22 PA27 PA75 PB12 PB14 PC64 PD00
M[10P]-274: PA12 PA13 PA21 PA22 PB12 PB49 PC26 PC51 PC63 PC64
M[10P]-278: PA13 PA15 PA21 PA22 PA75 PA79 PB10 PB12 PB49 PC63
M[10P]-280: PA11 PA12 PA15 PA21 PB08 PB12 PB18 PB49 PB58 PC51
M[10P]-281: PA11 PA12 PA20 PA21 PA22 PA27 PA29 PA75 PB16 PC63
M[10P]-282: PA10 PA13 PA21 PA22 PA27 PA79 PB12 PC15 PC29 PC61
M[10P]-284: PA11 PA13 PA20 PA21 PA22 PA27 PA95 PC15 PC29 PC63
M[10P]-285: PA11 PA13 PA14 PA21 PA79 PB10 PB12 PB18 PB49 PB82
M[10P]-286: PA11 PA12 PA13 PA14 PA20 PA21 PA79 PC51 PC64 PC82
M[10P]-287: PA12 PA13 PA19 PA20 PA75 PB10 PB12 PC26 PC63 PD08
M[10P]-289: PA12 PA13 PA15 PA19 PA20 PA21 PB10 PB12 PC29 PC51
M[10P]-290: PA11 PA12 PA13 PA22 PA27 PA75 PB85 PC29 PC63 PD07
M[10P]-292: PA12 PA13 PA15 PA75 PA79 PB10 PB12 PC29 PC45 PC63
M[10P]-293: PA00 PA11 PA12 PA13 PA21 PA27 PA75 PB18 PB85 PC26
M[10P]-294: PA12 PA13 PA15 PA21 PA22 PA79 PB12 PB49 PC51 PC63
M[10P]-296: PA11 PA13 PA15 PA17 PA21 PA62 PA79 PB10 PB12 PC63
M[10P]-300: PA12 PA13 PA17 PA48 PB10 PB12 PB16 PC26 PC29 PC63
M[10P]-301: PA11 PA12 PA13 PA20 PA21 PA75 PB08 PC15 PC35 PC51
M[10P]-302: PA11 PA12 PA13 PA21 PA70 PB12 PB16 PB18 PC26 PC63
M[10P]-303: PA11 PA12 PA15 PA21 PA75 PA79 PB10 PB12 PC29 PC64
M[10P]-307: PA12 PA13 PA21 PB10 PB12 PB18 PB78 PC51 PC63 PD08
M[10P]-308: PA17 PA21 PA22 PA27 PB12 PB49 PB85 PC15 PC26 PC29
M[10P]-309: PA13 PA22 PA27 PA53 PA62 PA75 PB10 PC51 PC63 PD06
M[10P]-311: PA12 PA15 PA19 PA21 PA79 PB12 PB49 PC26 PC63 PC83
M[10P]-312: PA00 PA11 PA13 PA21 PA22 PA29 PA75 PB10 PB85 PC29
M[10P]-313: PA13 PA15 PA21 PA22 PA27 PA75 PB49 PC51 PC61 PC63
M[10P]-314: PA08 PA12 PA13 PA21 PB10 PB12 PB49 PC15 PC32 PC64
M[10P]-315: PA11 PA13 PA21 PA47 PA75 PB16 PB83 PC15 PC51 PC63
M[10P]-317: PA11 PA12 PA19 PA21 PA22 PA79 PB10 PB16 PC29 PC63
M[10P]-319: PA12 PA13 PA22 PA75 PA79 PA98 PB08 PB10 PB85 PC63
M[10P]-321: PA11 PA12 PA13 PA20 PA21 PA22 PB49 PB85 PC55 PC63.
Los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de tales composiciones herbarias se prepararon de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 20 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de centrifugación antes de la filtración.
La actividad biológica de la muestra procesada se determinó usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus:ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 y ATCC 14775, con las siguientes diluciones finales de muestras procesadas: 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 para muestras procesadas que contienen menos de 10 cucharas de polvo vegetal (M[2P] a M[9P]) o 1:20, 1:63 y 1:200 para muestras procesadas que contienen 10 cucharas de polvo vegetal (M[10P]), de acuerdo al Método C descrito previamente.
En la Tabla 4-1 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de las 2 plantas de Mezcla[2P]-1 a una dilución de 1:20.
Tabla 4-1: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y de la inhibición de la formación de biopelícula, así como el porcentaje de eficacia en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas basado en Mezcla[2P]-1 a una dilución de 1:20.
Se descubrió que 20 muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 5 o 10 plantas tenían una actividad antimicrobiana y antibiopelícula más alta que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-1 (Tabla 4-1 A). Se descubrió que cuatro extractos de mezclas de 10 plantas tenían una mayor actividad antibiopelícula y una actividad antimicrobiana equivalente o menor (Tabla 4-1 B). Se descubrió que cinco muestras procesadas que contenían 3, 4 o 10 plantas tenían una actividad antimicrobiana superior y una actividad antibiopelícula equivalente o inferior (Tabla 4-1C).
En la Tabla 4-2 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que contienen las 2 plantas de Mezcla[2P]-2 a una dilución de 1:20.
Tabla 4-2: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas de la muestra procesada sobre la base de Mezcla[2P]-2 a una dilución de 1:20. A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antiobiopelícula y actividad antimicrobiana equivalente o inferior. (C) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
Se descubrió que 33 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 3, 5, 9 o 10 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-2 (Tabla 4-2 A). Se descubrió que seis extractos de mezclas de 10 plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 4-2 B). Se descubrió que un extracto de mezcla de 4 plantas tenía una actividad antimicrobiana más alta y una actividad antibiopelícula equivalente (Tabla 4-2 C).
En la Tabla 4-3 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que contienen las 2 plantas de Mezcla[2P]-3 a una dilución de 1:20.
Tabla 4-3: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y de la inhibición de la formación de biopelícula con una eficacia porcentual del 10% en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en Mezcla[2P]-3 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
Se descubrió que 23 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 3, 5, 9 o 10 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-3 (Tabla 4-3 A). Se descubrió que cuatro muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 3, 4 o 10 plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 4-3 B).
En la Tabla 4-4 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que contienen las 3 plantas de Mezcla[3P]-1 a una dilución de 1:20.
Tabla 4-4: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y de la inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en Mezcla[3P]-1 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antibiopelícula y actividad antimicrobiana equivalente o inferior. (C) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
Se descubrió que 80 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 4, 5, 6, 7, 9 o 10 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[3P]-1 (Tabla 4-4 A). Se descubrió que 18 muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 3, 4 o 10 plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 4-4 B). Se descubrió que dos muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias de 4 y 10 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y una actividad antibiopelícula equivalente (Tabla 4-4 C).
Ejemplo comparativo 2
Como ejemplo comparativo, se ilustran varios extractos de mezclas de 3 o 10 obtenidos de composiciones herbarias que contienen solo una planta entre las 3 plantas del Ejemplo 1 (PA13, PA21, PB12), que se ha descubierto que no tienen ninguna o tienen escasas actividades antimicrobianas y antibiopelículas contra las mismasStaphylococcus aureus.
Se prepararon diez composiciones herbarias, cuyo contenido se informa en la Lista 4-8, de acuerdo con el Método A descrito previamente.
Lista 4-8: composiciones herbarias de muestras procesadas
M[3P]-31: PA21; PA05; PB06;
M[3P]-35: PA21; PA76; PB50;
M[3P]-37: PA21; PB06; PB50;
M[3P]-43: PB12; PA05; PC34;
M[3P]-45: PB12; PA76; PB50;
M[10P]-65: PA01; PA08; PA25; PA29; PA37; PB12; PB50; PC15; PC37; PD05;
M[10P]-70: PA10; PA16; PA21; PA25; PA37; PA75; PB18; PB45; PC04; PC57;
M[10P]-72: PA08; PA21; PA62; PA70; PA85; PB19; PB31; PB45; PB49; PC26;
M[10P]-89: PA10; PA13; PA18; PA19; PA37; PA41; PA75; PB49; PC21; PC67;
M[10P]-306: PA15; PA21; PA22; PA62; PA75; PB18; PB49; PB85; PC49; PC61;
Se prepararon diez extractos acuosos (o muestras procesadas) a partir de las composiciones herbarias correspondientes.
El promedio en porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio en porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas para tales muestras procesadas a una dilución de 1:20 se determinaron de acuerdo con el Método C informado previamente y se proporcionan en la Tabla 4-5.
Tabla 4-5: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas de las muestras tratadas a una dilución de 1:20.
(continuación)
Todas las muestras procesadas probadas, obtenidas de composiciones herbarias compuestas de 3 o 10 plantas, que incluían una planta entre las 3 plantas del Ejemplo 1 (PA13, PA21, PB12), mostraron una actividad antimicrobiana menor que los tres extractos de mezclas de 2 plantas de la Mezcla [2P]-1 de referencia (obtenida de PA13 y PA21), la Mezcla [2P]-2 (obtenida de PA21 y PB12) y la Mezcla [2P]-3 (obtenida de PA13 y PB12) y una actividad antibiopelícula menor que la Mezcla [2P]-1 y la Mezcla [2P]-3.
Ejemplo 5
En este Ejemplo, ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusde 390 extractos mixtos obtenidos a partir de composiciones herbarias que comprenden al menos 2 plantas entre las 3 plantas descritas en el Ejemplo 1 (véase la tabla 1-1) y plantas adicionales para ensamblar mezclas de 9 a 20 plantas.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Pharmacie Fontgieve" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PA00 a PB12) y "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PB13 a PD02).
Se prepararon composiciones herbarias que contenían de 9 a 20 polvos vegetales según el Método A descrito previamente.
Las 4 composiciones herbarias de referencia Mezcla[2P]-1, Mezcla [2P]-2, Mezcla [2P]-3, Mezcla [3P]-1 y 390 nuevas composiciones herbarias se prepararon teniendo el contenido mostrado a continuación (Lista 5-3).
Lista 5-3 : composiciones herbarias de muestras procesadas Mezcla[2P]-1: PA13; PA21;
Mezcla[2P]-1: PA13; PA21;
Mezcla[2P]-2: PA21; PB12;
Mezcla[2P]-3: PA13; PB12;
Mezcla[3P]-1: PA13; PA21; PB12;
M[09P]-1 PA13 PA14 ; PA20 PA21 ; PA23 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-2 PA11 PA14 ; PA20 PA21 ; PA23 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-3 PA11 PA13 ; PA20 PA21 ; PA23 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-4 PA11 PA13 PA14 PA21 ; PA23 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-6 PA11 PA13 PA14 ; PA20 ; PA23 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-6 PA11 PA13 PA14 ; PA20 PA21 ; PA67 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-7 PA11 PA13 PA14 ; PA20 PA21 ; PA23 PB12 ; PC27; PC60;
M[09P]-8 PA11 PA13 PA14 ; PA20 PA21 ; PA23 ; PA67 ; PC27; PC60;
M[09P]-9 PA11 PA13 PA14 ; PA20 PA21 ; PA23 ; PA67 PB12; PC60
M[09P]-10: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA23; PA67; PB12; PC27;
M[09P]-21: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12;
M[10P]-41: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20;
M[10P]-303: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33;
M[11P]-1: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA11;
M[11P]-2: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA14;
M[11P]-3 PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA25;
M[11P]-4: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA26;
M[11P]-5: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA28;
M[11P]-6: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA29;
M[11P]-7: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA67;
M[11P]-8: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PA75;
M[11P]-9: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PC49;
M[11P]-10: PA13; PA20; PA21; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PC60;
M[11P]-11: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39;
M[11P]-12: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21;
M[12P]-1: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22;
M[12P]-2: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29;
M[13P]-1: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20;
M[13P]-2: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20;
M[14P]-1: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20; PC26;
M[14P]-2: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20; PC49;
M[15P]-1: PA10; PA11; PA13; PA15; PA20; PA21; PA23; PA26; PA33; PB08; PB12; PB60; PB88; PC12; PC20; M[15P]-5: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20; PC26; PC20; M[16P]-1: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12; PC11; PC12; PC20; PC51; PC55; PC67;
M[16P]-2: PA11; PA12; PA13; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[16P]-3: PA11; PA12; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[16P]-5: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20; PC26; PC20; PA12;
M[16P]-6: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20; PC49; PA14; PA14;
M[17P]-1: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12; PC11; PC11; PC12; PC20; PC51; PC55; PC67;
M[17P]-2: PA11; PA12; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[17P]-3: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[17P]-5: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12; PC11; PC11; PC12; PC20; PC51; PC55; PC67;
M[17P]-4: PA10; PA10; PA11; PA13; PA15; PA20; PA20; PA21; PA23; PA33; PB08; PB12; PB12; PB60; PB88; PC12; PC20;
M[17P]-6: PA10; PA11; PA14; PA18; PA21; PA23; PA29; PA67; PB00; PB07; PB12; PB33; PB77; PC11; PC52; PC60; PC71;
M[17P]-8: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20; PC49; PA14; PA14; PA22;
M[17P]-9: PA13; PA13; PA13; PC49; PC37; PA11; PA20; PA22; PA12; PC26; PB60; PA39; PC33; PC20; PA14; PA14; PA21;
M[18P]-1: PA10; PA11; PA13; PA14; PA18; PA21; PA23; PA29; PA67; PB00; PB07; PB12; PB33; PB77; PC11; PC52; PC60; PC71;
M[18P]-2: PA11; PA11; PA12; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-3: PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-4: PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-5: PA11; PA12; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-6: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-7: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-9: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-9: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-10: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-11: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-12: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-13: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-14: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-15: PA11; PA12; PA13; PA20; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC33; PC37; PC49;
M[18P]-16: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20 PC26; PC37; PC49;
M[18P]-17: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20 PC26; PC33; PC49;
M[18P]-18: PA11; PA12; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20 PC26; PC33; PC37;
M[18P]-23: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12; PB12; PC11; PC11; PC12; PC20 PC51; PC55; PC67;
M[18P]-19: PA11; PA13; PA15; PA20 PA20 PA21; PA23; PA26; PA26; PA26; PA33; PB08; PB12; PB12; PB60 PB88; PC12; PC20;
M[18P]-20: PA10; PA10; PA11; PA13; PA15; PA21; PA23; PA26; PA26; PA26; PA33; PB08; PB12; PB12; PB60 PB88; PC12; PC20;
M[18P]-21: PA10; PA10; PA11; PA13; PA15; PA20; PA20; PA21; PA23; PA26; PA33; PB08; PB12; PB12; PB60 PB88; PC12; PC20;
M[18P]-22: PA10; PA10; PA11; PA13; PA15; PA20; PA20; PA21; PA23; PA26; PA26; PA26; PA33; PB08; PB60 PB88; PC12; PC20;
M[18P]-24: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12; PB12; PB12; PB12; PC12; PC20 PC51; PC55; PC67;
M[18P]-25: PA10; PA11; PA13; PA14; PA18; PA21; PA23; PA29; PA67; PB00; PB07; PB12; PB33; PB77; PC11 PC52; PC60; PC71;
M[18P]-31: PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA28; PA52; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28; PB38 PB60; PC37; PC52;
M[18P]-33: PA11; PA11; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA28; PA52; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28; PB38 PB60; PC37; PC52;
M[18P]-34: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA26; PA26; PA28; PA52; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28; PB38 PB60; PC37; PC52;
M[18P]-34: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA28; PA52; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28; PB38 PB60; PC37; PC52;
M[18P]-35: PC49; PC37; PA13 ; PA13:; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20; PC26; PC20 PA12; PA14; PA14;
M[18P]-36: PA11; PC37; PC33 ; PA39 ; PB60 PC26 ; PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20; PC49; PA14: PA14; PA22; PA20;
M[18P]-37: PA13; PA13; PA13; PC49; PC37 PA11; PA20; PA22; PA12; PC26; PB60; PA39; PC33; PC20; PA14: PA14; PA21; PA29;
M[19P]-1: PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-2: PA11; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-3: PA11; PA13; PA20; PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-4: PA11; PA13; PA14; PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-5: PA11; PA13; PA14; PA20; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-6: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-7: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-8: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-9: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA28; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-10: PA11; PA13; PA14; PA20 PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-11: PA11; PA13; PA14; PA20 PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-12: PA11; PA13; PA14; PA20 PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB12; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
M[19P]-13: PA11; PA13; PA14; PA20 PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB27; PB33; PB60 PB88; PC20; PC49; PC60;
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M[19P]-93: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA52; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28 PB38; PB60; PC37; PC52;
M[19P]-95: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA28; PA67; PB00; PB12; PB27; PB28 PB38; PB60; PC37; PC52;
M[19P]-96: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA28; PA52; PB00; PB12; PB27; PB28 PB38; PB60; PC37; PC52;
M[19P]-96: PA11; PA11; PA13; PA13; PA13; PA14; PA14; PA26; PA26; PA28; PA52; PA67; PB12; PB27; PB28 PB38; PB60; PC37; PC52;
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M[19P]-104: PC49; PC37; PA13; PA13; PA13; PA11; PA29; PA21; PB12; PC33; PA39; PA22; PA20; PC26; PC20 PA12; PA14; PA14; PB60;
M[19P]-105: PA11; PC37; PC33; PA39; PB60; PC26 PB12; PA13; PA13; PA13; PA21; PA29; PC20; PC49; PA14: PA14; PA22; PA20; PA12;
M[19P]-106: PA13; PA13; PA13; PC49; PC37; PA11; PA20; PA22; PA12; PC26; PB60; PA39; PC33; PC20; PA14: PA14; PA21; PA29; PB12;
M[20P]-29: PA10; PA11; PA12; PA13; PA14; PA15; PA16; PA17; PA18; PA19; PA20; PA21; PA22; PA23; PA24 PA25; PA26; PA27; PA28; PA29;
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M[20P]-335: PA00; PA10; PA11; PA21; PA26; PA27; PA31; PA34; PA67; PA69; PA81; PA89; PB01; PB10; PB12 PB25; PB58; PC11; PC86; PC97;
M[20P]-340: PA11; PA13; PA15; PA18; PA21; PA26; PA34; PA36; PA69; PA79; PA95; PB07; PB25 PB48; PB60; PC35; PC74; PC84;
M[20P]-349: PA10; PA11; PA13; PA16; PA20; PA33; PA69; PB07; PB12; PC01; PC49 PC50; PC53; PC55; PC60; PC67;
M[20P]-371: PA05; PA14; PA15; PA21; PA22; PA23; PA32; PA34; PA35; PA57; PA72; PA89; PB12 PB39; PB88; PC20; PC55; PC74;
M[20P]-374: PA06; PA13; PA21; PA24; PA25; PA26; PA27; PA57; PB12; PB24; PB28; PB29; PB35; PB38; PB61 PC11; PC37; PC54; PC74; PC86;
M[20P]-375: PA11; PA15; PA19; PA20; PA21; PA22; PA28; PA29; PA81; PB10; PB12; PB26;
PC52; PC58; PC60; PC73; PC98;
M[20P]-377: PA07; PA10; PA11; PA13; PA14; PA21; PA22; PA29; PA32; PA33; PA35; PB10; PB36; PB82; PC49; PC52; PC94;
M[20P]-380: PA13; PA15; PA16; PA21; PA33; PA38; PB12; PB26; PB27; PC14 PC33; PC55; PC57; PC58; PC98;
M[20P]-382: PA00; PA12; PA13; PA16; PA21; PA29; PA35; PA75; PB33; PC14; PC24; PC36; PC58; PC66;
M[20P]-383: PA10; PA21; PA22; PA23; PA81; PB12; PB26; PB39; PB77; PB82; PC01 PC17; PC37; PC50; PC52; PC67;
M[20P]-386: PA13; PA14; PA28; PA29; PA33; PA35; PA40; PA57; PA67; PA79; PA88; PB00; PB01; PB07; PB12 PB33; PB77; PB85; PC50; PC66;
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; PC51 ; PC52; PC97;
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M[20P]-548: PA10; PA13; PA14; PA14; PA22; PA27; PA27 PA28; PA29; PA29; PA33; PA39; PB10; PB12; PB60; PB88; PC20 ; PC37 ; PC50; PC55;
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M[20P]-574: PA13; PA21; PA22; PA23; PA25; PA29; PA35; PA67; PB01; PB12; PB12; PB35; PB88; PC24; PC37 PC37; PC51; PC52; PC52; PC66;
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M[20P]-785: PA16; PA17; PA21; PA28; PA29; PA30; PA32; PA33; PA55; PB07; PB12; PB77; PB85; PB88; PB99 PC12; PC20; PC35; PC67; PC98;
M[20P]-786: PA11; PA13; PA14; PA18; PA19; PA21; PA22; PA27; PA28; PA29; PA33; PA40; PA52; PA57; PA81 PB28; PC11; PC20; PC21; PC50;
M[20P]-787: PA10; PA11; PA13; PA22; PA23; PA35; PB07; PB12; PB22; PB85; PB99; PC11; PC20; PC41; PC49 PC52; PC53; PC55; PC73; PD02;
M[20P]-789: PA10; PA11; PA13; PA22; PA23; PA27; PA40; PA57; PA75; PA81; PB07; PB12; PB27; PB60; PB88 PC11; PC20; PC23; PC35; PC41;
M[20P]-791: PA10; PA11; PA13; PA15; PA21; PA33; PA35; PA40; PA57; PA69; PA85; PA98; PA99; PB07; PB12 PB20; PB99; PC12; PC20; PC58;
M[20P]-793: PA11; PA13; PA14; PA15; PA19; PA26; PA29; PA55; PA67; PA89; PB12; PB33; PB88; PC14; PC20 PC21; PC34; PC37; PC67; PC97;
M[20P]-794: PA21; PA23; PA28; PA29; PA34; PA35; PA57; PA75; PA81; PB07; PB12; PB18; PB32; PB58; PC11 PC14; PC41; PC55; PC62; PC74;
M[20P]-795: PA10; PA13; PA20; PA23; PA27; PA29; PA57; PA60; PA69; PB00; PB07; PB12; PB18; PB32; PB85 PB88; PC20; PC66; PC74; PD02;
M[20P]-803: PA11; PA13; PA15; PA22; PA25; PA26; PA29; PA30; PA33; PA40; PA75; PB07; PB12; PB28; PC21 PC23; PC34; PC55; PC71; PC73;
M[20P]-804: PA11; PA12; PA13; PA20; PA22; PA23; PA30; PA33; PA34; PA79; PB12; PB18; PB58; PB60; PB85 PB88; PC20; PC50; PC67; PC68;
M[20P]-806: PA06; PA10; PA11; PA13; PA19; PA20; PA21; PA23; PA25; PA28; PA52; PA73; PA75; PA98; PB12 PB33; PB82; PB85; PB88; PC11;
M[20P]-816: PA11; PA13; PA19; PA25; PA28; PA29; PA33; PA57; PA81; PA89; PB00; PB10; PB12; PB26; PB28 PB99; PC11; PC12; PC76; PC97;
M[20P]-819: PA10; PA11; PA13; PA15; PA26; PA34; PA60; PA81; PA92; PB07; PB12; PB38; PB85; PC01; PC14 PC20; PC52; PC58; PC66; PC67;
M[20P]-823: PA00; PA11; PA12; PA13; PA14; PA17; PA27; PA29; PA40; PA60; PA75; PA79; PA89; PB07; PB12 PB99; PC20; PC52; PC66; PC71;
M[20P]-830: PA13; PA20; PA25; PA26; PA28; PA40; PA75; PA89; PB00; PB07; PB12; PB32; PB88; PC06; PC12 PC20; PC41; PC52; PC76; PC98;
M[20P]-831: PA11; PA15; PA21; PA25; PA33; PB12; PB28; PB32; PB33; PB38; PB60; PB77; PB88; PC20; PC23 PC35; PC37; PC49; PC58; PC66;
M[20P]-841: PA10; PA11; PA13; PA18; PA22; PA28; PA29; PA30; PA35; PA40; PA55; PA75; PB07; PB12; PB28 PB32; PB33; PC41; PC49; PC60;
M[20P]-844: PA11; PA15; PA21; PA24; PA26; PA29; PA33; PA40; PA69; PA81; PA98; PB12; PB28; PB61; PC49 PC67; PC71; PC73; PC74; PD02;
M[20P]-845: PA11; PA13; PA14; PA15; PA21; PA30; PA34; PA39; PA79; PA81; PA89; PB07; PB18; PC14 PC20; PC21; PC34; PC68; PC97;
M[20P]-846: PA11; PA13; PA25; PA27; PA29; PA32; PA33; PA35; PA37; PA39; PA40; PB08; PB12; PB33; PB88 PC24; PC41; PC52; PC58; PC62;
M[20P]-847: PA10; PA19; PA20; PA21; PA28; PA29; PA30; PA67; PA75; PA89; PB00; PB12; PB28; PB33; PB60 PC12; PC55; PC73; PC74; PD02;
M[20P]-848: PA07; PA11; PA13; PA15; PA20; PA22; PA26; PA27; PA30; PA40; PA69; PA75; PB12; PB32; PB85 PB88; PC34; PC37; PC66; PC68;
M[20P]-849: PA00; PA13; PA25; PA27; PA28; PA29; PA34; PA40; PA57; PA81; PB00; PB12; PB18; PB77; PC20 PC24; PC35; PC41; PC50; PC51;
M[20P]-852: PA00; PA11; PA13; PA15; PA19; PA22; PA26; PA35; PA89; PB00; PB12; PB58; PB77; PC12; PC20 PC29; PC62; PC71; PC94; PC98;
M[20P]-853: PA00; PA11; PA21; PA24; PA25; PA33; PA57; PA60; PB07; PB12; PB28; PB32; PB60; PB82; PB88 PC24; PC41; PC50; PC51; PC58;
M[20P]-857: PA00; PA11; PA13; PA26; PA28; PA75; PA76; PA79; PB12; PB28; PB60; PB88; PC11; PC12; PC20 PC37; PC50; PC52; PC67; PD02;
M[20P]-873: PA10; PA13; PA26; PA27; PA30; PA34; PA85; PA98; PB05; PB07; PB12; PB28; PB29; PB32; PB60 PC14; PC20; PC26; PC41; PC76;
M[20P]-880: PA11; PA13; PA17; PA20; PA22; PA24; PA26; PA27; PA29; PA38; PA57; PB07; PB12; PB20; PB29 PB97; PC24; PC37; PC51; PC71;
M[20P]-888: PA10; PA12; PA15; PA16; PA21; PA27; PA28; PA33; PA44; PB00; PB12; PB13; PB27; PC11; PC20 PC51; PC58; PC73; PC75; PD02;
M[20P]-890: PA00; PA11; PA13; PA15; PA16; PA25; PA34; PA75; PA82; PA86; PB00; PB12; PB16; PB27; PB33 PC20; PC49; PC50; PC57; PC98;
M[20P]-894: PA12; PA18; PA21; PA24; PA26; PA27; PA34; PA57; PA67; PA82; PB01; PB12; PB33; PB76; PB98; PB99; PC11; PC24; PC33; PC83;
M[20P]-902: PA12; PA13; PA21; PA26; PA29; PA39; PA40; PA57; PA96; PB00; PB07; PB12; PB27; PC20; PC50; PC53; PC61; PC62; PC75; PC94;
M[20P]-904: PA06; PA13; PA20; PA23; PA25; PA27; PA35; PA46; PA52; PA60; PA81; PA90; PA97; PB03; PB12; PB57; PB99; PC20; PC52; PC73;
M[20P]-907: PA00; PA07; PA14; PA21; PA24; PA25; PA45; PA75; PA83; PA97; PB12; PB26; PB32; PB60; PB92; PC06; PC20; PC35; PC37; PD02;
M[20P]-909: PA12; PA14; PA20; PA21; PA29; PA39; PA72; PA93; PB12; PB22; PB28; PB32; PC21; PC23; PC24; PC41; PC52; PC73; PC79; PD02.
Nota: si en las listas análogas anteriores y en las siguientes se produce un código de planta más de una vez en la misma composición herbaria, significa que se usó más de una cuchara calibrada de la planta seca molida correspondiente.
Partiendo de las composiciones herbarias enumeradas en la Lista 6-3 se prepararon extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 y ATCC 14775, con las siguientes diluciones finales de muestras procesadas: 1:20, 1:63 y 1:200.
En la Tabla 5-1 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que incluyen las 2 plantas de Mezcla[2P]-1 a una dilución de 1:20.
Tabla 5-1: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en Mezcla[2P]-1 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antibiopelícula y actividad antimicrobiana equivalente o inferior. (C) Mezclas de extractos que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
Se descubrió que 20 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 9, 18, 19 o 20 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-1 (Tabla 5-1 A). Se descubrió que catorce extractos de 20 mezclas de plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 5-1 B). Se descubrió que dos muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 17 y 18 plantas tenían una actividad antimicrobiana superior y una actividad antibiopelícula equivalente o inferior (Tabla 5-1C).
En la Tabla 5-2 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que incluyen las 2 plantas de Mezcla[2P]-2 a una dilución de 1:20.
Tabla 5-2: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en la Mezcla[2P]-2 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
Se descubrió que 58 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 9, 16, 17, 18, 19 o 20 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-2 (Tabla 5-2 A). Se descubrió que 25 muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 16, 17, 19 o 20 plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 5-2 B).
En la Tabla 5-3 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que incluyen las 2 plantas de Mezcla[2P]-3 a una dilución de 1:20.
Tabla 5-3: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y de la inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en la Mezcla[2P]-3 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas de que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
(continuación)
(continuación)
Se descubrió que 70 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 9, 19 o 20 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[2P]-3 (Tabla 5-3 A). Se descubrió que 37 muestras procesadas que contenían de 18 a 20 plantas tenían una actividad antibiopelícula superior y una actividad antimicrobiana equivalente o inferior (Tabla 5-3 B).
En la Tabla 5-4 se proporcionan el promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de composiciones herbarias que incluyen las 3 plantas de Mezcla[3P]-1 a una dilución de 1:20.
Tabla 5-4: Promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas, basado en la Mezcla[3P]-1 a una dilución de 1:20. (A) Extractos de mezclas que muestran una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula. (B) Extractos de mezclas que muestran actividad antimicrobiana y actividad antibiopelícula equivalente o inferior.
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Se descubrió que 51 de las muestras procesadas obtenidas a partir de composiciones herbarias que contenían 9, 16, 17, 18, 19 o 20 plantas tenían una mayor actividad antimicrobiana y antibiopelícula que el extracto de mezcla de referencia Mezcla[3P]-1 (Tabla 5-4 A). Se descubrió que 113 muestras procesadas que contenían de 9 a 20 plantas tenían una mayor actividad antibiopelícula y una actividad antimicrobiana equivalente o menor (Tabla 5-4 B).
Ejemplo comparativo 3
Como ejemplo comparativo, se informa de varios extractos de mezclas de 20 plantas que contienen sólo una planta entre las 3 plantas del ejemplo 1 (PA13, PA21, PB12), que se ha descubierto que no tienen ninguna o tienen escasas actividades antimicrobianas y antibiopelículas contra las mismasStaphylococcus aureus.
Se prepararon diez composiciones herbarias que tenían el contenido indicado en la Lista 5-8 de acuerdo con el Método A descrito previamente.
Lista 5-8: composiciones herbarias de muestras procesadas
M[20P]-39: PB00; PB01; PB02; PB03; PB04; PB05; PB06; PB07; PB08; PB09; PB10; PB11; PB12; PB13; PB14; PB15; PB16; PB17; PB18; PB19;
M[20P]-239: PA00; PA05; PA21; PA23; PA26; PA33; PA39; PA60; PA85; PB00; PB06; PB32; PB79; PC02; PC26; PC34; PC38; PC62; PC78; PCS4;
M[20P]-337: PA00; PA10; PA11; PA15; PA18; PA21; PA22; PA24; PA26; PA28; PA52; PA94; PA98; PB10;
PB26; PB29; PB82; PC67; PC97;
M[20P]-362: PA21; PA23; PA25; PA33; PA37; PA57; PA69; PA81; PA92; PB16; PB25; PB26; PB28; PB29; PB78 PC20; PC21 ; PC71 ; PC83; PD02;
M[20P]-364: PA15; PA21; PA25; PA28; PA39; PA75; PA80; PA85; PA89; PA98; PB01; PB06; PB24; PB28; PB35 PC24; PC25 ; PC57 ; PC75; PCS2;
M[20P]-540: PA06; PA10; PA12; PA14; PA20; PA21; PA26; PA27; PA27; PA57; PA57; PA57; PA69; PB07; PB82 PC11; PC20 ; PC23 ; PC55; PC98;
M[20P]-647: PA10; PA11; PA24; PA26; PA28; PA33; PA35; PA40; PA57; PA69; PB00; PB07; PB12; PB28; PB33 PB38; PB60; PC55 PC67; PC97;
M[20P]-652: PA00; PA07; PA13; PA15; PA16; PA23; PA26; PA28; PA33; PA39; PA57; PA92; PB28; PB38; PC20 PC21; PC52 ; PC55 ; PC74; PC97;
M[20P]-862: PA11; PA15; PA18; PA21; PA25; PA27; PA28; PA29; PA35; PA38; PA52; PA86; PA89; PA92; PB07 PB28; PB88; PC11 PC55; PC98;
M[20P]-872: PA13; PA14; PA16; PA28; PA29; PA30; PA33; PA35; PA39; PA81; PA90; PA92; PB00; PB32; PC12 PC34; PC37 ; PC67 ; PC97; PD02.
Se prepararon diez extractos acuosos (o muestras procesadas) a partir de las composiciones herbarias correspondientes de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
Para cada muestra procesada, la actividad biológica se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente, con las siguientes diluciones finales de muestras procesadas: 1:20, 1:63 y 1:200.
En la Tabla 5-5 se proporcionan el promedio del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio del porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas a una dilución de 1:20.
Tabla 5-5: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas en las muestras tratadas a una dilución de 1:20.
Todas las muestras procesadas probadas obtenidas de composiciones herbarias que contienen 20 plantas que incluyen solo una planta entre las 3 plantas del Ejemplo 1 (PA13, PA21, PB12) mostraron una menor actividad antimicrobiana que las tres extractos de mezclas de 2 plantas de Mezcla[2P]-1 de referencia (obtenida de PA13 y PA21), Mezcla[2P]-2 (obtenida de PA21 y PB12) y Mezcla[2P]-3 (obtenida de PA13 y PB12) y una menor actividad antibiopelícula que Mezcla[2P]-1 y Mezcla[2P]-3.
Ejemplo 6
En este Ejemplo, se informa de las actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contra las mismasStaphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisyStaphylococcus pseudintermediusde 2 muestras procesadas elegidas entre las mejores mezclas descritas en los Ejemplos 4 y 5.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Pharmacie Fontgieve" (Clermont-Ferrand, Francia) y "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia).
Se prepararon dos preparaciones herbarias que contenían los polvos vegetales secos indicados en la Tabla 6-1 a continuación, de acuerdo con el Método A descrito previamente.
Tabla 6-1
Partiendo de tales composiciones herbarias, se prepararon 2 extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml para M[20P]-576 y 20 ml para M[10P]-154 de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de centrifugación antes de la filtración.
La actividad biológica de las muestras procesadas se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas:
- Cepas deStaphylococcus aureus:ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213, ATCC 14775, NCTC 12493, ATCC 33591, ATCC 33592, ATCC 43300, ATCC 700698, ATCC 700699, ATCC 9144 y ATCC BAA-44
- Cepas deStaphylococcus epidermidis:ATCC 14990, ATCC 12228, ATCC 700296, ATCC 49134 y ATCC 49461 - Cepa deStaphylococcus pseudintermedius:ATCC 49444
La concentración inhibidora mínima (CIM) observada con las 2 muestras procesadas se da en la Tabla 6-2 en forma de HID, así como la eficacia promedio sobre todas las cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidis.
Tabla 6-2: HID de las 2 muestras procesadas en 14 cepas de Staphylococcus aureus, 5 cepas de
continuación
M[10P]-154 y el M[20P]-576 mostraron una actividad antimicrobiana completa en todas lasStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidisprobadas. M[10P]-154 mostró actividad antimicrobiana completa a 1:80 en 1 cepa deStaphylococcus epidermidis,a 1:40 en 4 cepas deStaphylococcus aureus,4 deStaphylococcus epidermidisy la cepa probada deStaphylococcus pseudintermedius,a 1:20 en 9 cepas deStaphylococcus aureus,y a 1:10 en 1 cepa deStaphylococcus aureus.
M[20P]-576 mostró una actividad antimicrobiana completa a 1:80 en 1 cepa deStaphylococcus epidermidis,a 1:40 en 6 cepas deStaphylococcus aureusy la cepa probada deStaphylococcus pseudintermedius,a 1:20 en 7 cepas deStaphylococcus aureusy 4 deStaphylococcus epidermidisy a 1:10 en 1 cepa deStaphylococcus aureus.
En la Tabla 6-3 se proporcionan el porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas (IFB) de las 2 muestras procesadas a una dilución 1:20, así como la eficacia promedio sobre todas las cepas deStaphylococcus aureusyStaphylococcus epidermidis.
Tabla 6-3: inhibición del crecimiento planctónico e inhibición de la formación de biopelículas (IFB) de las 2 muestras procesadas en 14 cepas de Staphylococcus aureus, 5 cepas de Staphylococcus epidermidis y 1 h l in rm i il i n 1:2
A una dilución de 1:20, M[10P]-154 mostró un promedio del 88% de inhibición de la formación de biopelículas en todos los ensayos de cepas deStaphylococcus aureus,mientras que M[20P]-576 mostró un promedio del 90%. Las dos mezclas mostraron una menor actividad antimicrobiana en una cepa: ATCC 6538 (45% para M[10P]-154, 60% para M[20P]-576). M[10P]-154 mostró un promedio del 91% de inhibición del crecimiento planctónico en todas las cepasStaphylococcus epidermidisprobadas mientras que M[20P]-576 mostró un promedio del 88%. (véase la Tabla 6-3). Las dos mezclas mostraron más de respectivamente el 95% (M[10P]-154) y el 93% (M[20P]-576) de porcentaje de inhibición en laStaphylococcus pseudintermediusprobada Por tanto, M[10P]-154 y M[20P]-576 han demostrado actividad antibiopelícula enStaphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisyStaphylococcus pseudintermediusa dilución 1:20.
Ejemplo 7
La solución de la mezcla [20C]-576 (descrita en el Ejemplo 6) usada para las siguientes formulaciones se preparó de acuerdo con los Métodos A y B descritos previamente, con la excepción de la etapa de filtración, que en este Ejemplo se realiza mediante filtración por succión con un embudo Büchner rellenado con una capa hidrófila de algodón de 5 cm de espesor. Para mayor claridad, en el siguiente Ejemplo esta solución filtrada de algodón se denominará SK576.
Se prepararon una pomada y dos cremas que iban a usarse para aplicaciones tópicas con un método de emulsificación como sigue:
- Se prepararon la Fase A y la Fase B mezclando con agitación orbital en dos vasos de precipitados separados los siguientes ingredientes:
- Los dos vasos de precipitados se calentaron a 70° C usando un baño de agua caliente y se mantuvo a 70° C durante 10 min para evitar la cristalización de cera de abejas.
- La Fase B se vertió lentamente en la Fase A, manteniendo el vaso de precipitados en el baño de agua caliente y con agitación constante mediante un mezclador de inmersión mecánico (Moulinex"lnfinyforce_hand blender", Francia).
- El vaso de precipitados que contenía la mezcla de las fases A y B se retiró después del baño caliente y se formó la pomada usando una "batidora de mayonesa" por inmersión (batidora Moulinex"lnfinyforce_hand", Francia).
Se preparó un gel para ser usado para aplicaciones tópicas mediante:
- Filtrado de 20,6 g de SK576, en un filtro de jeringa hidrófilo (0,22 pm).
- Agregado 0,75 g de polvo de xantano (Hyteck "Aroma Zone"™"Francia) y 0,25 g de ácido ascórbico (Hyteck "Aroma Zone"™"Francia) a la solución filtrada y mezclando con una espátula durante 5-10 min para formarla.
Se preparó una solución de pulverización para ser usada para aplicaciones tópicas mediante:
- Mezclado 5,5 g de SK576 con 11,9 g de etanol absoluto (Sigma-Aldrich, Francia) en un vaso de precipitados de 20 ml que se almacenó en un refrigerador a 5° C durante 3 h.
- Colocación del vaso de precipitados con la mezcla fría en un baño de hielo-agua y añadiendo suavemente 0,7 g de Kolliphor® P-407 (Sigma-Aldrich, Francia) bajo agitación con una barra magnética y un agitador.
- Después de 30 min de agitación en baño de hielo-agua, la solución se cargó en un pulverizador de reactivo (CAMAG, Suiza) para la administración.
El protocolo de cada una de estas cinco preparaciones se puede ampliar a escala fácilmente a diferentes volúmenes de preparación manteniendo la misma cantidad relativa de cada ingrediente.
Ejemplo 8
Actividad biológica de un extracto acuoso de la invención en un modelo de ratón letal por infección de Staphylococcus aureus
Introducción
La cepa de S.aureusNewman se aisló en 1952 de una infección humana y se ha usado ampliamente en modelos animales de infecciones estafilocócicas debido a su fenotipo de virulencia robusto.
Se han usado extensamente ratones OF1 hembra para estudiar la patogénesis inducida porStaphylococcus aureus.Los primeros trabajos sobre la patogénesis de las infecciones deStaphylococcus aureususaron la vía intraperitoneal de desafío para infectar y tratar ratones debido a su facilidad técnica.
El objetivo de este ejemplo fue evaluar la actividad antimicrobiana de un extracto acuoso de la invención en ratones OF1 hembra infectados con dosis letal deStaphylococcus aureusNewman. El tratamiento se administró por vía oral de acuerdo con el programa Q1Dx10, de 2 días antes de la infección a 7 días después de la infección. La monitorización de la mortalidad se realizó desde D0 a D15.
Se usó vehículo como control negativo.
Material y métodos
Sustancia de ensayo y controles
Sustancia de ensayo:Extracto acuoso M[20C] 576 (obtenido a partir de 120 g/l de composición herbaria, preparado como se describe en el Ejemplo 6). Se proporcionó en 11 viales que contenían 1.200 pl de cada uno de los extractos acuosos. Se almacenó a -20° C.
Vehículo:Solución acuosa de sacarosa al 10%. Se almacenará a -20° C.
Cepa bacteriana:cepa Newman deStaphylococcus(proporcionada por el Dr. T. Foster, Trinity College, Dublin, Irlanda, Lote No 14156, LST4).
Adquisición y confinamiento de animales
Se adquirieron veinte (20) ratones hembra Crl:OF1 (no cruzados), de 6 semanas de edad, de Charles River (L'Arbresle Francia).
La unidad de cuidado de animales fue autorizada por el ministerio francés de agricultura e investigación (número de acuerdo B35-288-1). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas de experimentaciones con animales (Principes d'éthique de l'expérimentation animale, Directiva n°86/609 CEE del 24 de noviembre de 1986, Decrét n° 87/848 del 19 de octubre de 1987, Arrété d'Application del 19 de abril 1988).
Los animales se mantuvieron en habitaciones "A2" en condiciones controladas de temperatura (22 ± 3° C), humedad (50 ± 20 %), fotoperíodo (12 h de luz/12 h de oscuridad), intercambio de aire y baja presión. El sistema de tratamiento de aire está programado para 14 cambios de aire por hora, sin recirculación.
Se proporcionaron alimento y aguaad libitum,estando colocado en la tapa metálica encima de la jaula.Tratamiento y diseño experimental
Preparación de bacterias- Amplificación de bacterias para exposición
Se descongeló un vial de bacterias y se cultivaron 100 |jl de inóculo en 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB, Ref. 43592 o 22902, Sigma). Las bacterias se incubaron a 37° C durante 20 h con agitación a 110 rpm en un agitador horizontal. La suspensión bacteriana se diluirá a 1/20 (100 j l 1,9 ml de TSB) y la densidad óptica se leerá a 680 nm (D.O.680 nm).
A continuación, se centrifugaron 10 ml de bacterias a 5.200 rpm (3400 g) durante 10 min a 4° C. Se desechó el sobrenadante y se solubilizaron las bacterias en 10 ml de DPBS (ref. BE17-512F, Lonza, Francia). La suspensión bacteriana (C0) se diluyó a 1/20 (100 j l 1,9 ml de DPBS) y se medirá la D.O.680 nm.
La D.O. 680 nm medida antes y después de la centrifugación debe ser similar.
La concentración de UFC/ml de la solución bacteriana se calculó como sigue:
CFU/ml = (0.D.680 nm x 20 (factor de dilución) x 6.5.108 (CFU/U.D.0)
Preparación de mucina
Se preparó mucina (Sigma, Francia) al 20% 14-16 días antes del tratamiento tal como se describe a continuación:
Se precalentó DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) a 56° C y se transfirieron % del volumen final a un mezclador, luego se agregará mucina de cerdo y se mezclará. El mezclador se lavó con el volumen restante de DPBS. A continuación, la solución de mucina al 20% se transfirió a un matraz Erlenmeyer y se incubó a 37° C con agitación durante 1 hora y 30 minutos. Los % de solución de mucina al 20% se transfirieron a un frasco estéril. El % restante de la solución se almacenó por separado. Después, los % y el % de las soluciones se esterilizaron por autoclave. Se almacenó una solución estéril de mucina de cerdo al 20% a 4° C.
El día anterior a la infección, el pH de los % de solución de mucina al 20% se ajustó a 7,4 añadiendo NaOH filtrado al 30%. Si era necesario, se usó una parte del % de solución restante para ajustar el pH.
Preparación de bacterias
De acuerdo con los resultados de O.D. 680 nm, las bacterias (C0) se diluyeron en DPBS para alcanzar la concentración de 6,8x107 UFC/ml. Estas suspensiones se diluyeron a la mitad en mucina de cerdo al 20% para obtener la concentración de DL80 de 3,4x107 UFC/ml en PBS-mucina de cerdo al 10%. La suspensión utilizada para el tratamiento se puso en un tubo que contenía perlas de vidrio estériles (4 mm, ref. 068502, Dutscher, Francia). La suspensión no se agitó con vórtex, sino que se mezcló invirtiendo los tubos. Las bacterias se colocaron en hielo antes de los tratamientos y se mantuvieron en hielo durante el tratamiento.
Determinación de UFC
Para determinar la concentración exacta de la suspensión bacteriana antes y después de inocularla en los animales, la suspensión bacteriana se diluyó en diluciones en serie de 10 veces en DPBS-0,5% Tween 20 (Sigma, Francia) como se describe en la Tabla 8-1 en pocillos profundos (50 j l de bacterias 450 j l de DPBS-0,5% de Tween 20). A continuación, se sembraron 6 x 50 pl de diluciones bacterianas 3, 4, 5 y 6 en placa de agar de soja tríptico (agar de soja tríptico, Sigma) y se colocaron a 37° C durante la noche. Se contaron las colonias para determinar las UFC reales (unidades formadoras de colonias) de inóculos.
La numeración se realizó en la gota (50 pl) que contenía entre 20 y 100 colonias. Los recuadros sombreados corresponden a las diluciones sembradas en placas.
Tabla 8-1: Diluciones de la suspensión bacteriana para determinar las UFC (viabilidad) reales de los in l . L ill m r rr n n l il i n m r n l l .
Aleatorización
Antes del experimento (D-2), se aleatorizaron 20 ratones hembra OFI sanos en 2 grupos de 10 ratones/grupo según criterios de peso corporal, de modo que los pesos corporales medios de los grupos no eran estadísticamente diferentes.
Tratamientos
Los tratamientos se realizaron desde D-2 hasta D7 (D0: día de la inoculación de bacterias) mediante administración oral (PO). Las inoculaciones bacterianas se realizaron mediante inyección intraperitoneal (IP).
Inoculación
Se inoculó a los ratones D0 una suspensión bacteriana. Cada inoculación consistió en una inyección intraperitoneal de 500 pl de la suspensión a 3,4 x 107 CFU/ml (1,7 x 107 CFU/ ratón).
Diseño experimental
Los animales se trataron con una administración oral de la sustancia de ensayo desde D-2 hasta D7. En D0, los tratamientos se realizaron 1 hora después de la inoculación de bacterias.
Los grupos experimentales se definirán como se describe a continuación y se resumen en la Tabla 8-2. • Los 10 ratones del grupo 1 se tratarán de D-2 a D7 con el vehículo mediante administración oral de acuerdo con el programa de tratamiento Q1DX10.
• Los 10 ratones del grupo 2 se tratarán de D-2 a D7 con la sustancia de prueba mediante administración oral según el programa de tratamiento Q1DX10.
Tabla 8-2: Diseño ex erimental
Monitorización de animales
Desde D0 hasta D1, se observó la mortalidad de los ratones dos veces al día.
Desde D2 hasta D15, se observó la mortalidad de los ratones una vez al día.
El peso corporal de los ratones se registró dos veces a la semana hasta el final del experimento.
Las observaciones clínicas detalladas (cambios en la piel, piel, ojos, membranas mucosas, aparición de secreciones y excreciones, función respiratoria, cambios en la marcha, postura) se monitorizaron dos veces a la semana como se describe en la Tabla 8-3 a continuación por ejemplo. La descripción de esta lista no es exhaustiva y se complementó con otras observaciones, de ser necesario.
Tabla 8-3 Observaciones/ arámetros clínicos
continuación
Sacrificio de ratones
En el D15, los ratones supervivientes se sacrificaron por exanguinación, seguido de dislocación cervical, si fuera necesario. No se realizó autopsia.
Resultados
El análisis de supervivencia de los ratones mostró los resultados presentados en las siguientes Tablas 8-4 y 8-5.
-
T l - P r n r n rvivi n l í
ND = No disponible
El tratamiento permitió reducir la mortalidad de los ratones del 100% al 70%. Este estudio con animales demostró, por lo tanto, que se observaron las actividades antimicrobianas y antibiopelículas reivindicadasin vitrolo cual se traduce en un efecto terapéutico, cuando el extracto acuoso de la invención se administra por vía oral a animales.
Ejemplo 9
En este Ejemplo ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusde la composición divulgada de 2 plantas entre 3:Filipéndula ulmoricPA13,Camellia sinensisPA21,Arcostaphylos uva-ursiPB12 y al menos 1 planta entre 3:Eugenia caryophyllusPC20,Vitis vinifera var. tinctorialPA22,Desmodium adscendensPB07. Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia).
Partiendo de estos tres polvos vegetales diferentes se prepararon seis composiciones herbarias según el método A notificado anteriormente.
Lista 9-1 : composiciones herbarias de muestras procesadas
M[02P]-064: PA13; PA21;
M[03P]-050: PA13; PA21; PC20;
M[03P]-053: PA13; PA21; PB07;
M[03P]-056: PA13; PA21; PA22;
M[02P]-065: PA13; PB12;
M[03P]-051: PA13; PB12; PC20;
M[03P]-054: PA13; PB12; PB07;
M[03P]-057: PA13; PB12; PA22;
M[02P]-066: PA21; PB12;
M[03P]-052: PA21; PB12; PC20;
M[03P]-055: PA21; PB12; PB07;
M[03P]-058: PA21; PB12; PA22;
M[03P]-059: PA13; PB12; PA21;
M[04P]-025: PA13; PB12; PA21; PC20;
M[04P]-026: PA13; PB12; PA21; PB07;
M[04P]-027: PA13; PB12; PA21; PA22.
Partiendo de las composiciones herbarias enumeradas en la Lista 6-3 se prepararon extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus:ATCC 6538, con las siguientes diluciones finales de muestras procesadas: 1:5 para la inhibición de la formación de biopelículas y 1:10 para la inhibición del crecimiento. Obsérvese que la inhibición del crecimiento es cercana al 100% para cada mezcla a una dilución de 1:5, y la inhibición de la formación de biopelículas es cercana al 0% para todas las mezclas a una dilución de 1:10.
El porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre toda la cepa probada de las muestras procesadas obtenidas de las diferentes composiciones herbarias se informan en la siguiente Tabla 9-1.
Tabla 9-1: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538 de la muestra tratada según las composiciones proporcionadas en el Listado 9-1. Las muestras tratadas se utilizaron en una dilución de 1:10 para las pruebas de inhibición del crecimiento planctónico y en una dilución de 1:5 para la inhibición de la formación de biopelícula.
(A) enumera extractos obtenidos de composiciones herbarias que contienen PA13 y PA21, en las que la adición de uno entre PC20, PB07 y PA22 mejora la actividad; (B) enumera extractos obtenidos de composiciones herbarias que contienen PA13 y PB12, en las que la adición de uno entre PC20, PB07 y PA22 mejora la actividad; (C) enumera extractos obtenidos de composiciones herbarias que contienen PA13, PA21 y PB12, en las que la adición de uno entre PC20, PB07 y PA22 mejora la actividad; (D) enumera extractos obtenidos de composiciones herbarias que contienen PA13 y PA21, en las que la adición de uno entre PC20, PB07 y PA22 mejora la actividad.
Ejemplo 10
En este Ejemplo, ilustramos actividades antimicrobianas y antibiopelículas simultáneas contraStaphylococcus aureusde 324 extractos de mezclas obtenidos a partir de composiciones herbarias divulgadas que comprenden 2 plantas entre 3:Filipéndula ulmaria(PA13),Camellia sinensis(PA21),Arcostaphylos uva-ursi(PB12) y al menos 1 planta entre 3:Eugenia caryophyllus(PC20),Vitis vinifera var. tinctorial(PA22),Desmodium adscendens(PB07).
Para las mezclas de M[20C]-2083 a M[20C]-20798, las plantas secas de grado farmacéutico se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia). Para las mezclas de M[20C]-2805 a M[20C]-2957, las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Pharmacie Fontgieve" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PA00 a PB12) y "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PB13 a PD02).
Se prepararon composiciones herbarias que contenían de 3 a 20 polvos vegetales según el Método A descrito previamente.
Partiendo de las composiciones herbarias, se prepararon los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 y ATCC 14775, con las diluciones finales 1:20 de las muestras procesadas.
El promedio de porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y el promedio de porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas analizadas de las muestras procesadas obtenidas de las siguientes composiciones herbarias de, respectivamente, la Lista 10-1, la Lista 10-2, la Lista 10-3 y la Lista 10 4 se proporcionan, respectivamente, en la Tabla 10-1, la Tabla 10-2, la Tabla 10-3 y la Tabla 10-4. En cada conjunto, Se descubrió que los extractos obtenidos a partir de composiciones herbarias que contenían más de 3 o 4 plantas mostraban inhibición del crecimiento planctónico o inhibición de la formación de biopelículas (o ambas inhibiciones) mayor que cualquiera de las mezclas que contenían solo 3 o 4 plantas.
Lista 10-1: Extractos de composiciones herbarias que contienen 2 plantas entre 3: Filipéndula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21) y al menos una de 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctorial (PA22), Desmodium adscendens (PB07):
M[03P]-050: PA13; PA21; PC20;
M[03P]-053: PA13; PA21; PB07;
M[03P]-056: PA13; PA21; PA22;
M[20C]-2808: PA11; PA12; PA13; PA13; PA18; PA21; PA23; PA24; PA28; PA69; PB07; PB88; PC23; PC24; PC49; PC52; PC55 (2 cucharas); PC60; PC97;
M[20C]-2820: PA10; PA11 (2 cucharas); PA12; PA13; PA14; PA18; PA20; PA21; PA25; PA29; PA33; PA35; PA67; PA75; PB07; PB60; PC33; PC35; PC55 ;
M[20C]-2821: PA11; PA13 (2 cucharas); PA19; PA20; PA21; PA22; PA25; PA29; PA33; PA35; PA75; PB07; PB36; PC20; PC33 (2 cucharas); PC49; PC55; PC97;
M[20C]-2826: PA11; PA13 (2 cucharas); PA20; PA21; PA24; PA25; PA29; PA33; PA34; PA35; PA52; PA70; PA75; PB07; PC11; PC21; PC33; PC37; PC74;
M[20C]-2827: PA10; PA11; PA13 (2 cucharas); PA20; PA21; PA25; PA26; PA29; PA33; PA35; PA57; PA75; PB02; PB07; PB28; PC11; PC23; PC33; PC49;
M[20C]-2830: PA10; PA11; PA12; PA13; PA14; PA18; PA21; PA22; PA25; PA29; PA32; PA34; PA67; PB07; PB60; PB88; PC33; PC35; PC55; PC98;
M[20C]-2831: PA13; PA13; PA19; PA21; PA22; PA22; PA25; PA29; PA32; PA34; PB07; PB36; PB88; PC20; PC33; PC33; PC49; PC55; PC97; PC98;
M[20C]-2833: PAID; PA11; PA13; PA14; PA21; PA22; PA24; PA25; PA26; PA29; PA32; PA34; PB33; PB88; PB88; PC12; PC23; PC27; PC33; PC98;
M[20C]-2836: PA13; PA13; PA21; PA22; PA24; PA25; PA29; PA32; PA34; PA34; PA52; PA70; PB07; PB88; PC11; PC21; PC33; PC37; PC74; PC98;
M[20C]-2837: PA10; PA13 (2 cucharas); PA21; PA22; PA25; PA26; PA29; PA32; PA34; PA57; PB02; PB07; PB28; PB88; PC11; PC23; PC33; PC49; PC98;
M[20C]-2838: PA12; PA13 (2 cucharas); PA18; PA21; PA21; PA22; PA24; PA25; PA29; PA32; PA34; PB88; PC23; PC33; PC49; PC52; PC55; PC97; PC98;
M[20C]-2839: PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA22; PA25; PA25; PA26; PA29; PA32; PA34; PA39; PA52; PA57; PB33; PB88; PC33; PC71; PC97; PC98;
M[20C]-2858: PA12; PA13; PA18; PA20; PA21; PA23; PA24; PA24; PA67; PB07; PB28; PB33; PC12; PC20; PC21; PC23; PC49; PC52; PC55; PC97;
M[20C]-2861: PA13; PA19; PA21; PA22 (2 cucharas); PB07; PB28; PB36; PB60; PC11; PC20; PC20; PC23; PC33; PC49; PC55 (2 cucharas); PC60; PC74; PC97;
M[20C]-2866: PA13; PA21; PA22; PA24; PA34; PA52; PA70; PB07; PB28; PB60; PC11 (2 cucharas); PC20; PC21; PC23; PC37; PC55; PC60; PC74 (2 cucharas);
M[20C]-2867: PA10; PA13; PA21; PA22; PA26; PA57; PB02; PB07; PB28; PB28; PB60; PC11 (2 cucharas); PC20; PC23; PC23; PC49; PC55; PC60; PC74;
M[20C]-2868: PA12; PA13; PA18; PA21; PA21; PA22; PA24; PB28; PB60; PC11; PC20; PC23 (2 cucharas); PC49; PC52; PC55 (2 cucharas); PC60; PC74; PC97;
M[20C]-2869: PA13; PA14; PA21; PA22; PA25; PA26; PA39; PA52; PA57; PB28; PB33; PB60; PC11; PC20; PC23; PC55; PC60; PC71; PC74; PC97;
M[20C]-2871: PA10; PA11; PA13; PA19; PA21; PA22; PA35; PA57; PB07; PB07; PB36; PB77; PC20 (2 cucharas); PC23; PC33; PC49; PC55; PC71; PC97;
M[20C]-2876: PA10; PA11; PA13; PA21; PA24; PA34; PA35; PA52; PA57; PA70; PB07 (2 cucharas); PB77; PC11; PC20; PC21; PC23; PC37; PC71; PC74;
M[20C]-2877: PA10; PA10; PA11; PA13; PA21; PA26; PA35; PA57; PA57; PB02; PB07; PB28; PB77; PC11; PC20; PC23 (2 cucharas); PC49; PC71;
M[20C]-2878: PA10; PA11; PA12; PA13; PA18; PA21; PA21; PA24; PA35; PA57; PB07; PB77; PC20; PC23; PC23; PC49; PC52; PC55; PC71; PC97;
M[20C]-2879: PA10; PA11; PA13; PA14; PA21; PA25; PA26; PA35; PA39; PA52; PA57 (2 cucharas); PB07; PB33; PB77; PC20; PC23; PC71 (2 cucharas); PC97;
M[20C]-2889: PA10; PA12; PA13; PA14; PA18; PA21; PA26; PA26; PA28; PA29; PA33; PA39; PA75; PB36; PC20; PC52; PC55 (2 cucharas); PC60;
M[20C]-2894: PA11 (2 cucharas); PA13; PA21; PA28; PA39; PA39; PA70; PB02; PB02; PB07; PB99 (2 cucharas); PC14; PC20; PC49; PC71; PC97; PC98;
M[20C]-2944: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA14; PA21; PA28; PA39; PA70; PB02; PB07; PB27; PB99; PC11; PC20; PC23; PC67; PC71; PC97; PC98;
M[20C]-2954: PA11; PA12; PA13; PA14; PA21; PA23; PA28; PA33; PA39; PA70; PB01; PB02; PB07; PB99; PC20; PC27; PC52; PC71; PC97; PC98.
Tabla 10-1: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas en la muestra tratada según los extractos del Listado 10-1 a una dilución de 1:20.
Lista 10-2: extractos de composiciones herbarias que contienen: Filipéndula ulmaria (PA13), Arcostaphylos uva-ursi (PB12) y al menos una entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctoria (PA22), Desmodium adscendens (PB07):
M[03C]-051: PA13; PB12; PC20;
M[03C]-054: PA13; PB12; PB07;
M[03C]-057: PA13; PB12; PA22;
M[20C]-2083: PA02; PA13; PA28 (2 cucharas); PA31; PA36; PA40; PA79; PA93; PB01; PB12; PB17; PB18; PB31; PB51; PB77; PC20; PC58; PC64; PC66;
M[20C]-2084 PA13 ; PA28 PA31 PA36; PA61; PA76; PA76; PA79; PA82; PB01; PB10; PB12; PB17; PB31; PB57 PC20; PC36; PC41 PC64 ; PC66
M[20C]-2085: PA12 PA13 PA14 PA28; PA30; PA31; PA36; PA79; PA94; PB00; PB01; PB08; PB12; PB17; PB31 PC02; PC14; PC20 PC64 ; PC66
M[20C]-2090 PA08 PA13 ; PA20 PA23; PA26; PA32; PA46; PA52; PA57; PA79; PA95; PB10; PB12; PB33; PB76 PB82; PC08; PC20; PC21 PD00
M[20C]-2091 PA08 PA13; PA26 PA52; PA57; PA72; PA79; PA88; PA92; PA95; PB12; PB60; PB76; PB83; PC08 PC11; PC20; PC26 PC68 PD00
M[20C]-2092: PA08 PA13 PA17 PA26; PA52; PA53; PA57; PA79; PA95; PB06; PB12; PB50; PB76; PC08; PC20 PC20; PC27; PC97 PD00 PD02
M[20C]-2100 PA13 ; PA20; PA23 PA32; PA41; PA46; PA53; PA79; PA80; PA90; PB08; PB10; PB12; PB33; PB82 PB85; PC20; PC21 PC28 PC75
M[20C]-2102 PA13 PA17 PA41 PA53; PA53; PA79; PA80; PA90; PB06; PB08; PB12; PB50; PB85; PC20; PC20 PC27; PC28; PC75 PC97 PD02
M[20C]-2104 PA13 PA41 ; PA53 PA61; PA76; PA76; PA79; PA80; PA82; PA90; PB08; PB10; PB12; PB57; PB85 PC20; PC28; PC36 PC41 PC75
M[20C]-2105 PA12 PA13 PA14 PA30; PA41; PA53; PA79; PA80; PA90; PA94; PB00; PB08; PB08; PB12; PB85 PC02; PC14; PC20 PC28 PC75
M[20C]-2110 PA00 PA10 PA13 PA20; PA23; PA25; PA30; PA32; PA46; PA52; PA79; PB05; PB10; PB12; PB33 PB82; PC01; PC20; PC21 PD07
M[20C]-2111 PA00 PA10 PA13 PA25; PA30; PA52; PA72; PA79; PA88; PA92; PB05; PB12; PB60; PB83; PC01 PC11; PC20; PC26 PC68 PD07
M[20C]-2120 PA11 PA13 PA16 PA20; PA23; PA32; PA44; PA46; PA60; PA67; PA73; PA79; PB10; PB12; PB33 PB48; PB82; PC17; PC20; PC21
M[20C]-2122 PA11 PA13 PA16 PA17; PA44; PA53; PA60; PA67; PA73; PA79; PB06; PB12; PB48; PB50; PC17 PC20; PC20; PC27 PC97 PD02
M[20C]-2131 PA05 PA13 PA18 PA37; PASS PA72 PA72 PA79 PA88 ; PA92 PA97 PB04; PB12 PB60; PB83 PC11; PC20; PC26 PC35 ; PC68
M[20C]-2135 PA05 PA12 PA13 PA14; PA18; PA30; PA37; PA55; PA72; PA79; PA94; PA97; PB00; PB04; PB08 PB12; PC02; PC14 PC20 PC35
M[20C]-2137 PA05 PA13 PA18 PA27; PA37; PA46; PA55; PA72; PA79; PA82; PA97; PB00; PB04; PB11; PB12 PC20; PC35; PC45 PC52 ; PC67
M[20C]-2140 PA13 PA14; PA20 PA23; PA32; PA37; PA46; PA79; PA85; PB10; PB12; PB33; PB49; PB82; PB98 PC20; PC21; PC55 PC62 PC98
M[20C]-2141 PA13 PA14 PA37 PA72; PA79; PA85; PA88; PA92; PB12; PB49; PB60; PB83; PB98; PC11; PC20 PC26; PC55; PC62 PC68 PC98
M[20C]-2142 PA13 PA14 PA17 PA37; PA53; PA79; PA85; PB06; PB12; PB49; PB50; PB98; PC20; PC20; PC27 PC55; PC62; PC97 PC98 PD02
M[20C]-2143 PA02 PA13 PA14 PA28; PA37; PA40; PA79; PA85; PA93; PB12; PB18; PB49; PB51; PB77; PB98 PC20; PC55; PC58 PC62 PC98
M[20C]-2144 PA13 PA14; PA37 PA61; PA76; PA76; PA79; PA82; PA85; PB10; PB12; PB49; PB57; PB98; PC20 PC36; PC41; PC55 PC62 PC98
M[20C]-2150 PA13 ; PA20; PA23 PA31; PA32; PA46; PA60; PA74; PA79; PB03; PB10; PB12; PB33; PB82; PC20 PC21; PC29; PC37 PC60 PC86
M[20C]-2151 PA13 PA31; PA60; PA72; PA74; PA79; PA88; PA92; PB03; PB12; PB60; PB83; PC11; PC20; PC26 PC29; PC37; PC60 PC68 PC86
M[20C]-2152 PA13 PA17 PA31 PA53; PA60; PA74; PA79; PB03; PB06; PB12; PB50; PC20; PC20; PC27; PC29 PC37; PC60; PC86 PC97 PD02
M[20C]-2153 PA02 PA13; PA28 PA31; PA40; PA60; PA74; PA79; PA93; PB03; PB12; PB18; PB51; PB77; PC20 PC29; PC37; PC58 PC60 PC86
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M[20C]-2155 PA12 PA13 PA14 PA30; PA31; PA60; PA74; PA79; PA94; PB00; PB03; PB08; PB12; PC02; PC14 PC20; PC29; PC37 PC60 PC86
M[20C]-2163 PA06 PA13 PA17 PA20; PA23; PA72; PA79; PA80; PA92; PB01; PB03; PB10; PB12; PB33; PB57 PB82; PC20; PC62; PC86 PC97
M[20C]-2164 PA13 PA17 PA20 PA41; PA79; PA80; PA86; PA92; PB03; PB10; PB12; PC20; PC26; PC27; PC29 PC55; PC60; PC62 PC86 PC97
M[20C]-2214 PA13; PA37 PA41 PA79; PA86; PB00; PB10; PB12; PB49; PB82; PC20; PC26; PC27; PC29; PC55 PC60; PC62; PC66; PC86
M[20C]-2234: PA13 PA41 PA79 PA85; PA86; PB12; PB31; PB50; PB77; PC14; PC20; PC26; PC27; PC29; PC55 PC55; PC60; PC62 PC98
M[20C]-2241 PA10 PA13 PA14 PA23; PA36; PA37; PA46; PA79; PB00; PB10; PB11; PB12; PB17; PB57; PC20 PC27; PC29; PC37 PC64 ; PC68
M[20C]-2242 PA13 PA14 PA17 PA23; PA36; PA37; PA60; PA61; PA76; PA79; PA82; PB00; PB06; PB12; PB49 PC20; PC27; PC29 PC68 PC98
M[20C]-2243 PA13 PA14 ; PA23 PA36; PA37; PA52; PA53; PA73; PA79; PA92; PB00; PB01 PB12; PB18; PB60 PC20; PC20; PC27 PC29; PC68;
M[20C]-2248 PA13 PA14 (2 cucharas); PA23; PA25; PA36; PA36; PA37; PA46; PA79; PA85; PB00; PB12; PC02 PC20; PC27; PC29; PC29 PC55; PC68
M[20C]-2249: PA10 PA13 ; PA14; PA23; PA36; PA37; PA53; PA74; PA79; PA92; PB00; PB12; PC20; PC27; PC29 PC62; PC67; PC68 PC86 PC97
M[20C]-2250: PA13 ; PA23 PA37 PA76; PA79; PB10; PB12; PB33; PB50; PB82; PB82; PB85; PB98; PC01; PC11 PC20; PC45; PC55 PC60 PD02
M[20C]-2253: PA13 ; PA37 ; PA52 PA53; PA73; PA79; PA92; PB01; PB10; PB12; PB18; PB33; PB50; PB60; PB82 PB85; PC01; PC20; PC20 PC45
M[20C]-2254: PA11 PA13 PA17 PA27; PA37; PA79; PB00; PB10; PB12; PB33; PB50; PB82; PB83; PB85; PB92 PB98; PC01; PC20; PC27 PC45
M[20C]-2255: PA13 ; PA36 ; PA37 PA53; PA72; PA79; PA80; PB03; PB10; PB12; PB33; PB49; PB50; PB82; PB82 PB85; PC01; PC20; PC45 PC68
M[20C]-2256: PA13 ; PA23 ; PA37 PA53; PA61; PA79; PA85; PB10; PB12; PB33; PB50; PB60; PB82; PB85; PC01 PC11; PC20; PC29 PC45 PD02
M[20C]-2257: PA13 ; PA37 PA37 PA60; PA72; PA79; PB10; PB12; PB33; PB49; PB50; PB82; PB85; PC01; PC08 PC20; PC45; PC68 PC98 PD02
M[20C]-2258: PA13 PA14 ; PA25 PA36; PA37; PA46; PA79; PA85; PB10; PB12; PB33; PB50; PB82; PB85; PC01 PC02; PC20; PC29 PC45 PC55
M[20C]-2259: PA10 PA13 PA37 PA53; PA74; PA79; PA92; PB10; PB12; PB33; PB50; PB82; PB85; PC01; PC20 PC45; PC62; PC67 PC86 PC97
M[20C]-2261 PA10 PA13 ; PA23 PA36; PA37; PA46; PA53; PA73; PA79; PA97; PB10; PB11 PB12; PB17; PB57 PC20; PC26; PC29 PC37; PC64
M[20C]-2278: PA10 PA13 PA14 PA25; PA28; PA30; PA36; PA37; PA41; PA46; PA79; PA85 PB12; PB50; PB60 PC02; PC20; PC29 PC55; PC66
M[20C]-2281 PA10 PA13 PA17 PA46; PA52; PA79; PA82; PA92; PA96; PB10; PB11; PB12 PB17; PB57; PB98 PC20; PC36; PC37 PC64 PC86
M[20C]-2321 PA13 ; PA46 ; PA53; PA79; PA82; PA92; PB03; PB10; PB11; PB12; PB83; PB85; PC20; PC20; PC21 PC55; PC60; PC86 PC97 PD02
M[20C]-2406: PA13 ; PA37 ; PA46 PA53; PA79; PA85; PB01; PB05; PB10; PB11; PB12; PB17; PB49; PB98; PC20 PC36; PC37; PC45 PC58; PC67
M[20C]-2420: PA10 PA13 PA14 PA36; PA46; PA79; PB10; PB10; PB11; PB11; PB12; PB17 PB17; PB33; PB82 PC20; PC54; PC55 PC68 PC98
M[20C]-2441 PA00 PA13 PA14 PA17; PA17; PA37; PA37; PA46; PA74; PA79; PB00; PB03; PB10; PB12; PB49 PC08; PC20; PC35 PC62 PC86
M[20C]-2443: PA00 PA13 ; PA14; PA14; PA17; PA36; PA37; PA79; PB00; PB01; PB10; PB12; PC02; PC08; PC11 PC20; PC29; PC62 PC67 PC86
M[20C]-2449: PA00 PA13 PA14 PA17; PA36; PA37; PA60; PA79; PA85; PB00; PB10; PB12; PB82; PB98; PC08 PC20; PC29; PC62 PC86 PC98
M[20C]-2451 PA10 PA13 PA17 PA23; PA37; PA46; PA74; PA76; PA79; PB00; PB03; PB08; PB10; PB12; PB49 PB49; PC20; PC35; PC97 PC98
M[20C]-2460: PA08 PA13 PA14 PA36; PA36; PA46; PA79; PB10; PB11; PB12; PB17; PB17; PB98; PC20; PC36 PC54; PC62; PC68 PC68 PC86
M[20C]-2488: PA10 PA13 ; PA37; PA46; PA53; PA74; PA79; PA82; PB00; PB00; PB12; PB49; PC20; PC29; PC37 PC45; PC54; PC74 PC86 PC98
M[20C]-2545: PA00 ; PA08 PA10 PA13; PA46; PA73; PA76; PA79; PA90; PB01; PB08; PB10 PB12; PB17; PB33 PB33; PC20; PC55; PC68 PD02
M[20C]-2551 PA13 PA14 PA16 PA27; PA36; PA79; PA82; PA92; PA95; PB10; PB12; PB57; PB85; PC11; PC20 PC29; PC29; PC54 PC64 PC98
M[20C]-2553: PA13 PA16 ; PA23 PA60; PA79; PA82; PA95; PB00; PB10; PB10; PB12; PB33; PB49; PB50; PB85 PC02; PC11; PC20 PC29 PC98
M[20C]-2555: PA00 PA10 PA13 PA16; PA79; PA82; PA90; PA95; PB08; PB10; PB10; PB12; PB33; PB85; PC11 PC20; PC29; PC68 PC98 PD02
M[20C]-2580: PA10 PA13 ; PA25 PA37; PA40; PA46; PA79; PB11; PB12; PB33; PB49; PB82; PB85; PB98; PC20 PC29; PC29; PC36 PC45 PC97
M[20C]-2589: PA13 PA14 PA17 PA40; PA46; PA79; PA80; PB11; PB12; PB33; PB49; PB85; PB98; PC20; PC26 PC29; PC37; PC86 PC97 PD02
M[20C]-2622: PA13 PA25 PA36 PA36; PA37; PA46; PA46; PA79; PA82; PB12; PB49; PB82; PC20; PC20; PC54 PC55; PC64; PC68 PC86 PC98
M[20C]-2627: PA13 PA14 ; PA36; PA46; PA76; PA79; PA80; PA96; PB12; PB49; PB49; PC20; PC20; PC45; PC54 PC55; PC64; PC97 PC98 PC98
M[20C]-2641 PA05 PA13 PA16 PA27; PA36; PA37; PA41; PA79; PA96; PB05; PB10; PB12 PB82; PB85; PB98 PC11; PC20; PC54 PC68 PD02
M[20C]-2651: PA13; PA36; PA41; PA46; PA79; PA92; PB00; PB01; PB05; PB12; PB33; PB82; PB82; PB85; PB98; PC20; PC54; PC55; PC86; PD02;
M[20C]-2654: PA13; PA36; PA46; PA79; PA92; PB00; PB00; PB01; PB08; PB11; PB12; PB33; PB82; PC01; PC20; PC55; PC55; PC64; PC86; PC86;
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M[20C]-2730: PA13; PA36; PA37; PA46; PA61; PA79; PA82; PA85; PB00; PB12; PB17; PB33; PB82; PB85; PC01; PC02; PC20; PC29; PC64; PC98;
M[20C]-2738: PA05; PA13; PA37; PA46; PA61; PA61; PA79; PA85; PB10; PB12; PB82; PB82; PB85; PB85; PB98; PC02; PC20; PC29; PC37; PC64;
M[20C]-2788: PA00; PA05; PA13; PA27; PA46; PA61; PA79; PA82; PB00; PB10; PB12; PB82; PB85; PB85; PB98; PC20; PC37; PC37; PC58; PC97;
M[20C]-2805: PA11; PA13; PA13; PA14; PA22; PA23; PA28; PA33; PA35; PA69; PB07; PB12; PB38; PB88; PB88; PC20; PC24; PC55; PC55; PC60;
M[20C]-2812: PA11; PA11; PA13; PA20; PA23; PA29; PA30; PA83; PA98; PB02; PB12; PB27; PB38; PC11; PC11; PC20; PC23; PC37; PC51; PC60;
M[20C]-2815: PA11; PA13; PA14; PA22; PA23; PA29; PA33; PA35; PA98; PB02; PB12; PB27; PB38; PB38; PB88; PC11; PC20; PC23; PC37; PC55;
M[20C]-2840: PA10; PA11; PA12 (2 cucharas); PA13; PA14; PA18; PA28; PA33; PA67; PA67; PB07 (2 cucharas); PB12; PB60; PC23; PC35; PC37; PC55; PC67;
M[20C]-2841: PA12; PA13 (2 cucharas); PA19; PA22; PA28; PA33; PA67; PB07 (2 cucharas); PB12; PB36; PC20; PC23; PC33; PC37; PC49; PC55; PC67; PC97;
M[20C]-2842: PA11; PA12; PA13 (2 cucharas); PA20; PA28; PA30; PA33; PA67; PA83; PB07; PB12 (2 cucharas); PC11; PC20; PC23; PC37; PC51; PC60; PC67;
M[20C]-2843: PA10; PA11; PA12; PA13; PA14; PA24; PA26; PA28; PA33; PA67; PB07; PB12; PB33; PB88; PC12; PC23; PC23; PC27; PC37; PC67;
M[20C]-2844: PA12; PA13; PA13; PA15; PA18; PA20; PA28; PA32; PA33; PA67 (2 cucharas); PB07; PB12; PB12; PC20; PC23; PC37; PC49; PC55; PC67;
M[20C]-2845: PA12; PA13 (2 cucharas); PA14; PA22; PA28; PA33; PA33; PA35; PA67; PB07; PB12 (2 cucharas); PB38; PB88; PC20; PC23; PC37; PC55; PC67;
M[20C]-2847: PA10; PA12; PA13 (2 cucharas); PA26; PA28; PA33; PA57; PA67; PB02; PB07; PB07; PB12; PB28; PC11; PC23; PC23; PC37; PC49; PC67;
M[20C]-2849: PA12; PA13 (2 cucharas); PA14; PA25; PA26; PA28; PA33; PA39; PA52; PA57; PA67; PB07; PB12; PB33; PC23; PC37; PC67; PC71; PC97;
M[20C]-2852: PA11; PA13; PA20 (2 cucharas); PA23; PA24; PA30; PA67; PA83; PB07; PB12; PB28; PB33; PC11; PC12; PC20; PC20; PC21; PC51; PC60;
M[20C]-2854: PA13; PA15; PA18; PA20 (2 cucharas); PA23; PA24; PA32; PA67 (2 cucharas); PB07; PB12; PB28; PB33; PC12; PC20 (2 cucharas); PC21; PC49; PC55;
M[20C]-2855: PA13; PA14; PA20; PA22; PA23; PA24; PA33; PA35; PA67; PB07; PB12; PB28; PB33; PB38; PB88; PC12; PC20; PC21; PC55;
M[20C]-2893: PA00; PA06; PA11; PA12; PA13; PA23; PA26; PA28; PA33; PA39; PB02; PB07 (2 cucharas); PB12; PB99; PC14; PC20; PC49; PC98; PD02;
M[20C]-2897: PA11 (2 cucharas); PA13; PA14; PA24; PA29; PA39; PA83; PB02; PB07; PB12; PB60; PB99; PC11; PC14; PC20; PC20; PC49; PC51; PC98;
M[20C]-2930: PA11; PA13; PA14; PA23; PA26; PA28; PA33; PA35; PA83; PB12; PB28; PB33; PB38; PB77; PB88; PC20; PC23; PC37; PC60; PC60;
M[20C]-2933: PA00; PA06; PA11; PA12; PA13; PA14; PA23; PA26; PA28 (2 cucharas); PA33; PA33; PB07; PB12; PB12; PB28; PB38; PB77; PC60; PD02;
M[20C]-2935: PA10; PA11; PA13; PA14; PA28; PA29; PA33; PA57; PA67; PB07; PB12; PB28 (2 cucharas); PB38; PB77; PB77; PC11; PC20; PC52; PC60;
M[20C]-2936: PA11 (2 cucharas); PA13; PA14; PA18; PA28; PA33; PA57; PA67; PB02; PB12; PB28; PB38 (2 cucharas); PC11; PC20; PC27; PC52; PC60;
M[20C]-2937: PA11; PA11; PA13; PA14 (3 cucharas); PA28; PA29; PA33; PA83; PB12 (2 cucharas); PB28; PB38; PB60; PB77; PC11; PC20; PC51; PC60;
M[20C]-2939: PA10; PA11; PA12; PA13 (2 cucharas); PA14; PA18; PA26; PA28; PA33 (2 cucharas); PA39; PB12; PB28; PB38; PB77; PC20; PC52; PC55; PC60;
M[20C]-2943: PA00; PA06; PA10; PA11; PA12; PA13; PA14; PA23; PA26; PA28; PA33; PB07 (2 cucharas);PB12; PB27; PC11; PC20; PC23; PC67; PD02;
M[20C]-2947: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA14 (2 cucharas); PA24; PA29; PA83; PB07; PB12; PB27; PB60; PC11 (2 cucharas); PC20 (2 cucharas); PC23; PC51; PC67;
M[20C]-2953: PA00; PA06; PA12 (2 cucharas); PA13; PA14; PA23 (2 cucharas); PA26; PA28; PA33 (2 cucharas); PB01; PB07 (2 cucharas); PB12; PC20; PC27; PC52; PD02;
M[20C]-2957: PA11; PA12; PA13; PA14 (2 cucharas); PA23; PA24; PA29; PA33; PA83; PB01; PB07; PB12; PB60; PC11; PC20 (2 cucharas); PC27; PC51; PC52.
Tabla 10-2: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas en la muestra procesada según las mezclas de la Lista 10-2 a una dilución de 1:20.
(continuación)
Lista 10-3: composiciones herbarias de muestras procesadas que contienen: Camellia sinensis (PA21), Arcostaphylos uva-ursi (PB12) y al menos una entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctorial (PA22), Desmodium adscendens (PB07):
M[03C]-052: PA21; PB12; PC20;
M[03C]-055: PA21; PB12; PB07;
M[03C]-058: PA21; PB12; PA22;
M[20C]-2888: PA14; PA15; PA18; PA21; PA21; PA23; PA26; PA28; PA28; PA29; PA39; PA57; PA75; PB07; PB12; PB36; PC11; PC55; PC55; PC60;
M[20C]-2913: PA00; PA06; PA12; PA21; PA23; PA26; PA26; PA27; PA28; PA33; PB07; PB07; PB12 (2 cucharas); PB33; PC20; PC24; PC41; PC71; PD02;
M[20C]-2918: PA15; PA18; PA21 (2 cucharas); PA23; PA26; PA27; PA28; PA57; PB07 (2 cucharas); PB12 (2 cucharas); PB33; PC11; PC20; PC24; PC41; PC55; PC71;
M[20C]-2920: PA20; PA21; PA23; PA26; PA28; PA35; PA35; PA67; PA83; PB12; PB33; PB88; PC12; PC20; PC23; PC37; PC37; PC60 (2 cucharas); PC74;
M[20C]-2923: PA00; PA06; PA12; PA20; PA21; PA23; PA26; PA28 (2 cucharas); PA33; PA35; PA67; PB07; PB12 (2 cucharas); PC12; PC37; PC60; PC74; PD02;
M[20C]-2928: PA15; PA18; PA20; PA21 (2 cucharas); PA23; PA28 (2 cucharas); PA35; PA57; PA67; PB07; PB12 (2 cucharas); PC11; PC12; PC37; PC55; PC60; PC74;
M[20C]-2887: PA11; PA14; PA14; PA21; PA24; PA26; PA28; PA29 (2 cucharas); PA39; PA75; PA83; PB12; PB36; PB60; PC11; PC20; PC51; PC55; PC60;
M[20C]-2914: PA11; PA21 (2 cucharas); PA26; PA27; PA28; PA39; PA70; PB02; PB07; PB12; PB33; PB99; PC20; PC24; PC41; PC71 (2 cucharas); PC97; PC98;
M[20C]-2915: PA10; PA21; PA26; PA27; PA29; PA57; PA67; PB07 (2 cucharas); PB12; PB28; PB33; PB77; PC11; PC20 (2 cucharas); PC24; PC41; PC52; PC71;
M[20C]-2916: PA11; PA18; PA21; PA26; PA27; PA57; PA67; PB02; PB07; PB12; PB33; PB38; PC11; PC20; PC20; PC24; PC27; PC41; PC52; PC71;
M[20C]-2917: PA11; PA14; PA21; PA24; PA26; PA27; PA29; PA83; PB07; PB12 (2 cucharas); PB33; PB60; PC11; PC20 (2 cucharas); PC24; PC41; PC51; PC71;
M[20C]-2925: PA10; PA20; PA21; PA28; PA29; PA35; PA57; PA67 (2 cucharas); PB07; PB12; PB28; PB77; PC11; PC12; PC20; PC37; PC52; PC60; PC74;
M[20C]-2926: PA11; PA18; PA20; PA21; PA28; PA35; PA57; PA67 (2 cucharas); PB02; PB12; PB38; PC11; PC12; PC20; PC27; PC37; PC52; PC60; PC74;
M[20C]-2927: PA11; PA14; PA20; PA21; PA24; PA28; PA29; PA35; PA67; PA83; PB12; PB12; PB60; PC11; PC12; PC20; PC37; PC51; PC60; PC74;
M[20C]-2910: PA21; PA23; PA26 (2 cucharas); PA27; PA35; PA83; PB07; PB12; PB33 (2 cucharas); PB88; PC20 (2 cucharas); PC23; PC24; PC37; PC41; PC60; PC71.
Tabla 10-3: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas en la muestra procesada según las mezclas de la Lista 10-2 a una dilución de 1:20.
Lista 10-4: extractos de composiciones herbarias que contienen: Filipéndula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21), Arcostaphylos uva-ursi (PB12) y al menos una entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctorial (PA22), Desmodium adscendens (PB07):
M[04C]-025: PA13; PA21; PB12; PC20;
M[04C]-026: PA13; PA21; PB12; PB07;
M[04C]-027: PA13; PA21; PB12; PA22;
M[20C]-2898: PA11; PA13; PA15; PA18; PA21; PA23; PA28; PA39; PA57; PB02; PB07 (2 cucharas); PB07; PB12; PB99; PC11; PC14; PC20; PC49; PC55; PC98;
M[20C]-2900: PA10; PA11; PA13; PA21; PA23; PA25; PA26; PA35; PA69; PA83; PB12; PB32; PB33; PB88; PC20 (2 cucharas); PC23; PC37; PC55; PC60;
M[20C]-2903: PA00; PA06; PA10; PA11; PA12; PA13; PA21; PA23; PA25; PA26; PA28; PA33; PA69; PB07; PB12 (2 cucharas); PB32; PC20; PC55; PD02;
M[20C]-2908: PA10; PA11; PA13; PA15; PA18; PA21 (2 cucharas); PA23; PA25; PA28; PA57; PA69; PB07; PB12 (2 cucharas); PB32; PC11; PC20; PC55 (2 cucharas);
M[20C]-2938: PA11; PA13; PA14; PA15; PA18; PA21; PA23; PA28 (2 cucharas); PA33; PA57; PB07; PB12 (2 cucharas); PB28; PB38; PB77; PC11; PC55; PC60;
M[20C]-2948: PA10; PA11; PA13; PA14; PA15; PA18; PA21; PA23; PA28; PA57; PB07 (2 cucharas); PB12; PB27; PC11 (2 cucharas); PC20; PC23; PC55; PC67;
M[20C]-2951: PA12; PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA23; PA24; PA33; PA39; PA67; PB01; PB07; PB12; PB77; PC20; PC27; PC33; PC49; PC52; PC60;
M[20C]-2952: PA12; PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA23; PA25; PA26; PA33; PA37; PA67; PB01; PB07 (2 cucharas); PB12; PC20; PC27; PC49; PC52; PC71;
M[20C]-2958: PA12; PA13; PA14; PA15; PA18; PA21; PA23 (2 cucharas); PA28; PA33; PA57; PB01; PB07 (2 cucharas); PB12; PC11; PC20; PC27; PC52; PC55;
M[20C]-2822: PA11 (2 cucharas); PA13 (2 cucharas); PA20 (2 cucharas); PA21; PA25; PA29; PA30; PA33; PA35; PA75; PA83; PB12; PC11; PC20; PC33; PC51; PC60;
M[20C]-2824: PA11; PA13 (2 cucharas); PA15; PA18; PA20 (2 cucharas); PA21; PA25; PA29; PA32; PA33; PA35; PA67; PA75; PB12; PC20; PC33; PC49; PC55;
M[20C]-2825: PA11; PA13 (2 cucharas); PA14; PA20; PA21; PA22; PA25; PA29; PA33 (2 cucharas); PA35 (2 cucharas); PA75; PB12; PB38; PB88; PC20; PC33; PC55;
M[20C]-2834: PA13 (2 cucharas); PA15; PA18; PA20; PA21; PA22; PA25; PA29; PA32 (2 cucharas); PA34; PA67; PB12; PB88; PC20; PC33; PC49; PC55; PC98;
M[20C]-2835: PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA22 (2 cucharas); PA25; PA29; PA32; PA33; PA34; PA35; PB12; PB38; PB88 (2 cucharas); PC20; PC33; PC55; PC98;
M[20C]-2848: PA12 (2 cucharas); PA13 (2 cucharas); PA18; PA21; PA24; PA28; PA33; PA67; PB07; PB12; PC23 (2 cucharas); PC37; PC49; PC52; PC55; PC67; PC97;
M[20C]-2862: PA11; PA13; PA20; PA21; PA22; PA30; PA83; PB12; PB28; PB60; PC11 (2 cucharas); PC20 (2 cucharas); PC23; PC51; PC55; PC60 (2 cucharas); PC74;
M[20C]-2864: PA13; PA15; PA18; PA20; PA21; PA22; PA32; PA67; PB12; PB28; PB60; PC11; PC20 (2 cucharas); PC23; PC49; PC55 (2 cucharas); PC60; PC74;
M[20C]-2865: PA13; PA14; PA21; PA22 (2 cucharas); PA33; PA35; PB12; PB28; PB38; PB60; PB88; PC11; PC20 (2 cucharas); PC23; PC55 (2 cucharas); PC60; PC74;
M[20C]-2872: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA20; PA21; PA30; PA35; PA57; PA83; PB07; PB12; PB77; PC11; PC20 (2 cucharas); PC23; PC51; PC60; PC71;
M[20C]-2874: PA10; PA11; PA13; PA15; PA18; PA20; PA21; PA32; PA35; PA57; PA67; PB07; PB12; PB77; PC20 (2 cucharas); PC23; PC49; PC55; PC71;
M[20C]-2875: A10; A11; A13; A14; A21; A22; A33; A35; A35; A57; B07; B12; B38; B77; B88; C20 (2 cucharas); C23; C55; C71;
M[20C]-2882: PA13; PA14; PA21 (2 cucharas); PA25; PA26 (2 cucharas); PA28; PA29; PA37; PA39; PA67; PA75; PB07; PB12; PB36; PC49; PC55; PC60; PC71;
M[20C]-2891: PA11; PA13 (2 cucharas); PA21; PA24; PA39; PA39; PA67; PB02; PB07; PB12; PB77; PB99; PC14; PC20; PC33; PC49 (2 cucharas); PC60; PC98;
M[20C]-2892: PA11; PA13 (2 cucharas); PA21; PA25; PA26; PA37; PA39; PA67; PB02; PB07 (2 cucharas); PB12; PB99; PC14; PC20; PC49 (2 cucharas); PC71; PC98;
M[20C]-2901: PA10; PA11; PA13 (2 cucharas); PA21 (2 cucharas); PA24; PA25; PA39; PA67; PA69; PB12 (2 cucharas); PB32; PB77; PC20; PC33; PC49; PC55; PC60;
M[20C]-2902: PA10; PA11; PA13 (2 cucharas); PA21 (2 cucharas); PA25 (2 cucharas); PA26; PA37; PA67; PA69; PB07; PB12 (2 cucharas); PB32; PC20; PC49; PC55; PC71;
M[20C]-2904: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA21 (2 cucharas); PA25; PA28; PA39; PA69; PA70; PB02; PB12; PB32; PB99; PC20; PC55; PC71; PC97; PC98;
M[20C]-2905: PA10 (2 cucharas); PA11; PA13; PA21; PA25; PA29; PA57; PA67; PA69; PB07; PB12; PB28; PB32; PB77; PC11; PC20 (2 cucharas); PC52; PC55;
M[20C]-2906: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA18; PA21; PA25; PA57; PA67; PA69; PB02; PB12; PB32; PB38; PC11; PC20 (2 cucharas); PC27; PC52; PC55;
M[20C]-2907: PA10; PA11 (2 cucharas); PA13; PA14; PA21; PA24; PA25; PA29; PA69; PA83; PB12 (2 cucharas); PB32; PB60; PC11; PC20 (2 cucharas); PC51; PC55;
M[20C]-2909: A10 (2 cucharas); A11; A12; A13 (2 cucharas); A18; A21; A25; A26; A33; A39; A69; B12; B32; C20 (2 cucharas); C52; C55 (2 cucharas);
M[20C]-2911: PA13; PA21 (2 cucharas); PA24; PA26; PA27; PA39; PA67; PB07; PB12 (2 cucharas); PB33; PB77; PC20; PC24; PC33; PC41; PC49; PC60; PC71;
M[20C]-2912: PA13; A21 (2 cucharas); PA25; PA26 (2 cucharas); PA27; PA37; PA67; PB07 (2cucharas);PB12 (2 cucharas); PB33; PC20; PC24; PC41; PC49; PC71 (2 cucharas);
M[20C]-2919: PA10; PA12; PA13; PA18; PA21; PA26 (2 cucharas); PA27; PA33; PA39; PB07; PB12; PB33; PC20 (2 cucharas); PC24; PC41; PC52; PC55; PC71;
M[20C]-2922: PA13; PA20; PA21 (2 cucharas); PA25; PA26; PA28; PA35; PA37; PA67 (2 cucharas); PB07; PB12 (2 cucharas); PC12; PC37; PC49; PC60; PC71; PC74;
M[20C]-2929: PA10; PA12; PA13; PA18; PA20; PA21; PA26; PA28; PA33; PA35; PA39; PA67; PB12; PC12; PC20; PC37; PC52; PC55; PC60; PC74;
M[20C]-2932: PA11; PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA25; PA26; PA28; PA33; PA37; PA67; PB07; PB12 (2 cucharas); PB28; PB38; PB77; PC49; PC60; PC71;
M[20C]-2941: PA10; PA11; PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA24; PA39; PA67; PB07; PB12; PB27; PB77; PC11; PC20; PC23; PC33; PC49; PC60; PC67;
M[20C]-2942: PA10; PA11; PA13 (2 cucharas); PA14; PA21; PA25; PA26; PA37; PA67; PB07 (2 cucharas); PB12; PB27; PC11; PC20; PC23; PC49; PC67; PC71;
Tabla 10-4: promedio de la eficacia del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico y del porcentaje de inhibición de la formación de biopelícula en las 6 cepas de Staphylococcus aureus probadas en la muestra tratada según las mezclas de la Lista 10-4 a una dilución de 1:20.
Ejemplo comparativo 4
Como ejemplo comparativo, se informan varios extractos de composiciones herbarias que contienen solo 1 planta entre 3:Filipéndula ulmoric(PA13),Camellia sinensis(PA21),Arcostaphylos uva-ursi(PB12) y sólo 1 entre 3:Eugenia caryophyllus(PC20),Vitis vinifera var. tinctoria(PA22),Desmodium adscendens(PB07).
Se prepararon 5 composiciones herbarias que tenían el contenido indicado en la Lista 10-5 de acuerdo con el Método 1 descrito anteriormente.
Lista 10-5 extractos de composiciones herbarias que contienen las siguientes plantas
M[20P]-318: PA15; PA21; PA34; PA35; PA82; PA83; PA85; PA92; PA96; PB03; PB07; PB26; PB30; PB36; PB79 PC11; PC49 ; PC91 ; PC92 ; PD10;
M[20P]-329: PA10; PA28; PA34; PA36; PA55; PA72; PA83; PA85; PA91; PB03; PB12; PB16; PB28; PB35; PB49 PB92; PC20 ; PC23 ; PC64 ; PC85;
M[20P]-333: PA04; PA05; PA13; PA16; PA22; PA39; PA51; PA55; PA57; PA72; PA82; PA92; PA98; PB05; PB20 PB36; PB43; PB74; PB77; PC37;
M[20P]-362: PA21; PA23; PA25; PA33; PA37; PA57; PA69; PA81; PA92; PB16; PB25; PB26; PB28; PB29; PB78 PC20; PC21 ; PC71 ; PC83 ; PD02;
M[20P]-513: PA12; PA14; PA14; PA20; PA20; PA21; PA22; PA33; PA35; PA52; PA57; PA69; PB00; PB32; PB38 PC24; PC37; PC52; PC55; PC67;
Se prepararon composiciones herbarias que contenían 20 polvos vegetales según el método A descrito anteriormente.
Partiendo de las composiciones herbarias, se prepararon los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas deStaphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 y ATCC 14775, con las diluciones finales 1:20 de muestras procesadas.
En la Tabla 10-5 se proporcionan el promedio del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y del promedio del porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas probadas de las muestras procesadas obtenidas de las composiciones herbarias de la Lista 10-4. Cada porcentaje es el promedio de 2 mediciones de la misma condición en dos pocillos diferentes. Los porcentajes negativos reflejan la promoción del crecimiento y la promoción de biopelículas, en lugar de la inhibición deseada. Se aprecia que tales extractos dan una inhibición muy pobre, si la hay, en comparación con los extractos del Ejemplo 10.
Tabla 10-5: promedio del porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico bacteriano y promedio del porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas sobre todas las cepas probadas de las muestras rocesadas obtenidas de las com osiciones herbarias de la Lista 10-4
Ejemplo 11
En este Ejemplo, ilustramos actividades antimicrobianas contra 14 especies microbianas diferentes descritas en la Tabla 11-1 de 10 extractos de mezclas obtenidas de las composiciones herbarias divulgadas en la Lista 11-1 que comprenden al menos 2 plantas entre 3:Filipéndula ulmoric(PA13),Camellia sinensis(PA21),Arcostaphylos uvaursi(PB12) y al menos 1 planta entre 3:Eugenia caryophyllus(PC20),Vitis vinifera var. tinctorial(PA22), yDesmodium adscendens(PB07).
Tabla 11-1: especies microbianas y cepas usadas en el Ejemplo 11
(continuación)
Lista 11-1: extractos de composiciones herbarias que contienen: Filipéndula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21) y al menos una de 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctoria (PA22), Desmodium adscendens (PB07) usadas en el Ejemplo-11:
M[20P]-297: PA10; PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA29; PA33; PA57; PA67; PA69; PB07; PB12; PB60; PC20; PC37; PC49; PC98;
M[20P]-416: PA11; PA13; PA14; PA20; PA21; PA25; PA26; PA28; PA29; PA67; PA75; PB02; PB12; PB27; PB33; PB60; PB88; PC20; PC49; PC60;
M[20P]-418: PA10; PA11; PA12; PA13; PA21; PA22; PA23; PA24; PA26; PA39; PB07; PB12; PB38; PC11; PC12; PC20; PC23; PC24; PC49; PC55;
M[20P]-527: PA10; PA10; PA11; PA13; PA15; PA20; PA20; PA21; PA23; PA26 (3 cucharas); PA33; PB08; PB12 (2 cucharas); PB60; PB88; PC12; PC20;
M[20P]-557: PA00; PA10; PA20; PA21; PA23; PA24; PA29; PA57; PB07; PB12 (4 cucharas); PC11 (2 cucharas); PC12; PC20; PC51; PC55; PC67;
M[20P]-573: PA10; PA11; PA13 (3 cucharas); PA14; PA18; PA21; PA23; PA29; PA67; PB00; PB07; PB12; PB33; PB77; PC11; PC52; PC60; PC71;
M[20P]-576: PA11 (2 cucharas); PA12; PA13 (3 cucharas); PA14 (2 cucharas); PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37; PC49;
M[19P]-576: PA11 (2 cucharas); PA12; PA13 (3 cucharas); PA14 (2 cucharas); PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37 ;
M[5P]-1: PA12; PA13; PA21; PA22; PB12;
M[5P]-2: PA11; PA13; PA21; PA22; PB12;
Para las mezclas M[5P]-1, M[5P]-2 y M[19P]-576, las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia). Para las otras mezclas, las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Pharmacie Fontgieve" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PA00 a PB12) y "Pharmacie St Herem" (Clermont-Ferrand, Francia, plantas PB13 a PD02).
Todas las composiciones herbarias de 20 plantas se prepararon de acuerdo con el Método A descrito previamente.
Partiendo de las composiciones herbarias, se prepararon los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 40 ml de agua que contenía 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
Las composiciones herbarias M[19P]-576, M[5P]-1 y M[5P]-2 se prepararon ponderando cada hierba seca como se indica en la Tabla 11-2
Tabla 11-2: peso de planta seca (mg) usada en las composiciones herbarias de M[19P]-576, M[5P]-1 y
Partiendo de las composiciones herbarias, se prepararon los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando, respectivamente, 30 ml, 40 ml y 40 ml, de agua sin sacarosa con, respectivamente, M[19P]-576, M[5P]-1 y M[5P]2, para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
En la Tabla 11-3 se proporciona la actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas a las diluciones finales indicadas de muestras procesadas.
En la Tabla 11-3 se proporciona el promedio en porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico microbiano.
Tabla 11-3: porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico en las 14 cepas microbianas analizadas de la muestra procesada de la composición divulgada en la Lista 11-1
g
Ejemplo 12
En este Ejemplo, ilustramos actividades antimicrobianas de una mezcla vegetal donde la etapa de extracción se realizó con los disolventes no acuosos acetona, acetato de etilo, etanol, usados solos o como mezclas binarias como se indica en la Tabla 12-1. Se proporciona una comparación con el agua.
Tabla^ 12-1: m i i n l m z l in ri ilz n l E m l 12 r l x r i n n uosa.
La mezcla de plantas secas M[20P]-576 se componía de la siguiente Tabla 12-2 y se colocó en un vial de 500 ml y se mezcló completamente mediante volteo y laminado manuales. Las hierbas secas se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia), excepto PC49 que se obtuvo de Siccarapam (Aubiat, Francia).
- -
____
Para cada disolvente ensayado, se colocaron 5 g de mezcla vegetal seca en un vial coloreado de 100 ml (Schott, Alemania) con una barra magnética y se añadieron 50 ml de disolvente. La suspensión líquida se agitó con un agitador magnético (RO 15P IKA, Alemania) a la velocidad máxima durante 48 horas a temperatura ambiente. Cada suspensión/solución se filtró por gravedad usando un filtro plegado de 250 mm (J025106, Prats Dumas, Francia) colocado en un embudo de vidrio (Schott, Alemania) colocado en un matraz de evaporación. El matraz que contiene el líquido que atraviesa el filtro se coloca en un dispositivo de evaporación rotatoria al vacío (controlador de vacío Rotavapor® R205 V800, Büchi, Suiza) y la evaporación se realiza a 35° C con vacío ajustado para estar por debajo del punto de ebullición del disolvente, hasta que todo el disolvente se haya evaporado. El material restante se pesa y se disuelve en DMSO (Acros organic, EE.UU.) qsp 10 g/l para formar la mezcla extraída.
Se prepararon dos extractos acuosos de acuerdo con el Método B descrito previamente, en el que las cucharas de plantas secas se reemplazaron por 2 g de la mezcla de plantas secas M[20P]-576 del Ejemplo 12, usando 40 ml de agua para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración. El contenido de residuo seco de uno de los extractos de mezcla de plantas se determinó pesando el residuo de liofilización obtenido con un dispositivo de liofilización (FreeZone™ 2.5, Labconco EE.UU., con RZ6 Vacuubrand, Alemania) del extracto congelado.
Estos contenidos de residuo seco se usaron para deducir las actividades específicas de los diferentes extractos.
La actividad biológica de cada mezcla extraída se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las cepas indicadas en la Tabla 12-3, donde la dilución de la mezcla extraída fue: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160. La concentración inhibidora mínima (CIM) se observó mediante observación visual de los pocillos como la concentración más baja en la que no se observa crecimiento.
Tabla 12-3: lista de las cepas bacterianas usadas en el Ejemplo 12
Los resultados se recopilan en las tablas 12-4 para los diferentes disolventes.
Tabla 12-4: CIM en mg/l de las mezclas extraídas usando, A) acetona, etanol-acetato, etanol y agua como disolvente, B), diferentes proporciones de acetona y etanol como disolvente binario como se indica en la Tabla 12-2-A, C) diferentes proporciones de etanol-acetato y etanol como disolvente binario como se indica en la Tabla 12-2-B, y D) usando diferentes proporciones de etanol-acetato y acetona como disolvente binario como se indica en la Tabla 12-2-C.
continuación
Ejemplo 13
En este Ejemplo, ilustramos actividades antimicrobianas de una mezcla de plantas preparada de acuerdo con el Método B descrito previamente, donde el carbohidrato añadido se elige entre sacarosa, dextrosa, maltosa y galactosa.
La mezcla de plantas secas M[19P]-576, M[5P]-1 y M[5P]-2 se compuso siguiendo la Tabla 13-1 y se colocó en un vial de 500 ml y se mezcló exhaustivamente mediante volteo y laminado manuales. Las hierbas secas se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia), excepto PC49 que se obtuvo de Siccarapam (Aubiat, Francia).
Tabla 13-1: lista de plantas secas que componen: A) la mezcla M[20P]-576, B) la mezcla M[5P]-1 y C) la mezcla M[5P]-2 utilizada en el Ejemplo 13.
_____
B
(continuación)
(g)
Para cada mezcla de plantas secas, los extractos se prepararon de acuerdo con el Método B descrito previamente, en el que las cucharas de plantas secas se reemplazaron por 2 g de la mezcla de plantas del Ejemplo 13, usando 40 ml de agua y las cantidades de carbohidrato indicadas en la Tabla 13-3 para la extracción de agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración.
El contenido de residuo seco de las mezclas vegetales sin carbohidrato se determinó por separado, pesando el residuo de liofilización obtenido con un dispositivo de liofilización (FreeZone™ 2.5, Labconco Ee .UU, con RZ6 Vacuubrand, Alemania) de un extracto congelado de 40 ml preparado de acuerdo con el Método B descrito previamente, donde las cucharas de plantas secas se reemplazaron por 2 g de la mezcla de plantas del Ejemplo 13, usando 40 ml de agua para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración. Estos contenidos de residuo seco se usaron para deducir las actividades específicas de los diferentes extractos, en los que el carbohidrato se considera como un adyuvante y no se tiene en cuenta como parte del ingrediente activo.
La actividad biológica de cada mezcla extraída se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las cepas indicadas en la Tabla 13-2, donde la dilución de la mezcla extraída fue: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160. La concentración inhibidora mínima (CIM) se observó mediante observación visual de los pocillos como la concentración más baja en la que no se observa crecimiento.
Tabla 13-2: lista de las cepas bacterianas usadas en el Ejemplo 13
Los resultados se recopilan en las tablas 13-4.
Tabla 13-3: CIM en mg/l de las mezclas extraídas usando sacarosa, lactosa, dextrosa, maltosa o galactosa para: A) la mezcla M[20P]-576, B) la mezcla M[5P]-1 y C), la mezcla M[5P]-2
(continuación)
Ejemplo 14
En este Ejemplo, ilustramos la potenciación de la actividad antimicrobiana del extracto de mezcla herbaria M[20P]-576 hacia antibióticos usados comúnmente.
Tabla 14-1: especies bacterianas y ce jas usadas en el ejemplo 14
Lista 14-1: composiciones herbarias de muestra procesada usadas en el ejemplo 14:
M[19P]-576: PAII; PA12; PA13; PA14; PA20; PA21; PA22; PA29; PA39; PB12; PB60; PC20; PC26; PC33; PC37.
Las plantas secas de calidad farmacéutica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia). Las composiciones herbarias M[19P]-576 se prepararon ponderando cada hierba seca como se indica en la Tabla 14-2
Tabla 14-2: peso de planta seca (mg) usada en las composiciones herbarias de M[19P]-576
-576
Partiendo de la composición herbaria, se prepararon los extractos acuosos correspondientes (o muestras procesadas) de acuerdo con el Método B descrito anteriormente usando 2,06 g de la composición herbaria anterior con 40 ml de agua con 100 g/l de sacarosa para la extracción con agua e incluyendo la etapa de decantación antes de la filtración. En una preparación de extracto acuoso independiente sin sacarosa, se ha medido que 2,06 g/40 ml de composición herbaria corresponde a 14,5 g/l como se deduce del peso del extracto herbaria seco liofilizado.
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las siguientes cepas a las diluciones finales indicadas de muestras procesadas que se proporcionan en la Tabla 14-3. En el Ejemplo 14 calculamos el crecimiento de las bacterias en presencia de antibiótico y/o mezcla herbaria con respecto al crecimiento en ausencia de extracto de antibiótico y mezcla herbaria.
En la Tabla 14-3 se proporciona el promedio en porcentaje de inhibición del crecimiento planctónico de bacterias.
Debe observarse que la presencia del extracto de hierbas M[19P]-576 tiene tres efectos a la concentración usada: 1) reduce el crecimiento de las bacterias a baja concentración y ausencia de antibiótico, 2) reduce el aumento del crecimiento bacteriano inducido por la baja concentración de antibiótico con respecto al crecimiento en ausencia de antibióticos, y 3) reduce la concentración inhibidora mínima (CIM), de, respectivamente, vancomicina para B-A17 y de ampicilina y penicilina para B-A21, a la concentración de M[19P]-576 comenzando a, respectivamente, 90.6 |jg/ml, 181.3 jg/m l y 90.6 jg/ml.
Tabla 14-3: crecimiento planctónico en presencia de diferentes concentraciones de extracto y concentraciones de antibiótico con respecto al crecimiento de las bacterias en ausencia tanto de extracto como de antibiótico en dos ce as diferentes.
Ejemplo 15
En este ejemplo, se ilustra cómo adaptar la temperatura en el Método B para hacer frente a restricciones industriales.
Las plantas secas de calidad orgánica se obtuvieron de "Herboristerie Cailleau" (Chemillé, Francia).
Las composiciones herbarias M[5P]-1 se prepararon ponderando cada hierba seca como se indica en la Tabla 15-1
Tabla 15-1: peso de planta seca (mg) usada en las composiciones herbarias de M[5P]-1
Se preparó un primer extracto M[5P]-1-A incorporando 120 g de la composición herbaria en 600 ml de agua contenida en un vaso de precipitados de 2 l (Schott, Alemania). Se preparó un segundo extracto M[5P]-1-B colocando 120 g de la composición herbaria en una bolsa de algodón de calidad orgánica de 25 x 30 cm (Ecobags, EE.UU.), y la bolsa llena se colocó en 600 ml de agua contenida en un vaso de precipitados de 2 l (Schott, Alemania). Se preparó un tercer extracto M[5P]-1-C colocando dos veces 60 g de la composición herbaria en una bolsa de algodón de calidad orgánica de 25 x 30 cm (Ecobags, EE.UU.), y las dos bolsas llenas se colocaron en 600 ml de agua contenida en un único vaso de precipitados de 2 l (Schott, Alemania). Cada preparación, respectivamente, de M[5P]-1-A, M[5P]-1-B y M[5P]-1-C, se dejó para maceración durante 3 horas a temperatura ambiente y luego se colocó en su vaso de precipitados en un autoclave (línea de vapor VWR Eco 25, e E.UU.) durante 30 minutos a121° C, 121° C y 134° C, respectivamente. Para cada uno de M[5P]-1-B y M[5P]-1-C, las bolsas de algodón se prensaron usando una prensa de fruta de 5 l manejada manualmente (Brouwland, Bélgica) y el líquido recuperado se colocó de nuevo en el vaso de precipitados de 2 l. Cada vaso de precipitados se dejó decantar y la cantidad necesaria de líquido sobrenadante usó para medir su actividad biológica.
Tabla 15-2: especies bacterianas y cepas usadas en el Ejemplo 15N b l t d l Códi d
La actividad biológica de cada muestra procesada se determinó de acuerdo con el Método C descrito previamente usando las cepas enumeradas en la Tabla 15-2 a diluciones finales de 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320. La dilución correspondiente a la concentración inhibidora mínima (CIM) se observó mediante observación visual de los pocillos como la concentración más baja en la que no se observa crecimiento y se notifica en la tabla 15-3.
Tabla 15-3: dilución correspondiente a la concentración inhibidora mínima (CIM) de los extractos realizados con diferentes detalles industriales y temperatura
Debe observarse que la introducción de la bolsa de algodón para facilitar el proceso industrial redujo ligeramente la actividad del extracto en comparación con el proceso insatisfactorio sin bolsa. El aumento de la temperatura del autoclave durante la fase de extracción caliente permitió recuperar la actividad completa.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un extracto de una composición herbaria, que comprende al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipéndula ulmaria, Camellia sinensisyArctostaphylos uva-ursiy al menos una planta seleccionada entreVitis vinifera var. tinctoria, Eugenia caryophyllusyDesmodium adscendens.
2. El extracto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la composición herbaria comprende además una o más plantas secas adicionales seleccionadas entre:Achillea millefolium, Acorus calamus, Agrimonia eupatoria, Agropyrum repens, Agropyrum repens, Alchemilla vulgaris, Alkanna tinctoria, Althaea officinalis, Anethum graveolens, Angelica archangelica, Arbutus unedo, Arnica montana, Artemisia pontica, Artemisia vulgaris, Asparagus officinalis, Asparagus officinalis, Asperula odorata, Betula pendula, Borrago officinalis, Buxus sempervirens, Calamintha officinalis, Calendula officinalis, Calluna vulgaris, Carum carvi, Cassia angustifolia,Centaurea cyanus, Centaurium erythraea, Centella asiatica, Cetraria islandica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chrysanthellum americanum, Cichorium endivia, Cichorium intybus, Cinnamomum zeylanicum, Citrus aurantium, Combretum micranthum, Crataegus oxyacantha, Cuminum cyminum, Cupressus sempervirens, Curcuma zedoaria,Cynara scolymus, Cytisus scoparius,Desmodium adscendens, Elettaria cardamomum, Eleutherococcus senticosus, Epilobium parviflorum, Erysimum officinale, Eucalyptus globulus, Eugenia caryophyllus, Eupatorium cannabinum, Foeniculum vulgare, Fraxinus excelsior, Fucus vesiculosus, Fumaric officinalis, Galium odoratum, Gentiana lutea, Geranium robertianum, Ginkgo biloba, Glechoma hederacea, Glycyrrhiza glabra, Handroanthus impetiginosus, Harpagophytum procumbens, Hieracium pilosella, Humulus lupulus, Hypericum perforatum, Hyssopus officinalis, Illicium verum, Inula helenium, Juglans regia, Juniperus communis, Lamium album, Lavandula angustifolia, Levisticum officinale, Lippia citriodora, Lotus corniculatus, Lythrum salicaria, Malva sylvestris, Marrubium vulgare, Medicago sativa, Melissa officinalis, Menthaxpiperita, Morus nigra, Myrtus communis, Olea europaea, Origanum majorana, Panax ginseng, Papaver rhoeas, Parietaria officinalis, Passiflora incarnata, Petroselinum crispum, Peumus boldus, Phaseolus vulgaris, Pimpinella anisum, Plantago lanceolata, Plantago ovata, Potentilla anserina, Quercus robur, Rhamnus franqula, Rheum palmatum, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Rubia tinctorum, Rubus idaeus, Salix alba, Salvia officinalis, Sambucus nigra, Satureja montana, Silybum marianum, Solanum dulcamara, Tabebuia impetiginosa, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinalis, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Tilia tomentosa, Tilia cordata, Trigonella foenumgraecum, Tussilago farfara, Vaccinium myrtillus, Valeriana officinalis, Verbascum thapsus, Verbena officinalis, Viscum album, Zea maysyZingiber officinale.
3. El extracto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición herbaria comprende de tres a siete plantas secas seleccionadas entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uva-ursi, Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes, Eugenic caryophyllusyEucalyptus globulus,en la que al menos dos de tales plantas se seleccionan entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArctostaphylos uva-ursiy al menos una de tales plantas se selecciona entreVitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendesyEugenic caryophyllus.
4. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria y Arctostaphylos uva-ursi.
5. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rheum palmatum, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria y Arctostaphylos uvaursi.
6. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eugenia caryophyllus y Arctostaphylos uvaursi.
7. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eucalyptus globulus, Arctostaphylos uva-ursi, Mentha spicatayRubia tinctorium.
8. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende al menos catorce o quince plantas secas seleccionadas entre las dieciséis siguientes:Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodorayTanacetum vulgare.
9. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthumyLippia citrodora.
10. El extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que la composición herbaria comprende las siguientes plantas secas:Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipéndula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum,Lippia citrodorayTanacetum vulgare.
11. Un liofilizado del extracto según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.
12. Un suplemento alimenticio, una composición nutracéutica, farmacéutica, veterinaria o cosmética o alimento funcional o aditivo alimenticio que comprende el extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el liofilizado según la reivindicación 11, como principio activo, junto con al menos un excipiente.
13. El suplemento alimenticio, la composición nutracéutica, farmacéutica, veterinaria o cosmética, el alimento funcional, o el aditivo alimenticio de acuerdo con la reivindicación 12, formulado para administración oral o tópica.
14. El uso del extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o del liofilizado según la reivindicación 11 como agente antimicrobiano y/o antibiopelícula.
15. El extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el liofilizado según la reivindicación 11 o la composición farmacéutica o veterinaria según las reivindicaciones 12 o 13, para su uso como agente antimicrobiano y/o antibiopelícula en el tratamiento o la prevención de infecciones microbianas.
16. El extracto, liofilizado o composición farmacéutica o veterinaria para su uso según la reivindicación 15, en el que las infecciones están provocadas porEscherichia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus, CandidaoStaphylococcus.
17. El extracto, el liofilizado o la composición farmacéutica o veterinaria para su uso según la reivindicación 15, en el que las infecciones están provocadas porStaphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisoStaphylococcus pseudintermedius.
18. Un proceso para preparar el extracto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende a) triturar o moler por separado o en una mezcla al menos dos plantas secas individuales para obtener los polvos vegetales correspondientes; b) mezclar al menos dos polvos vegetales diferentes para obtener una composición herbaria; c) añadir un disolvente de extracción a dicha composición herbaria para obtener una preparación (o extracto) líquida correspondiente; d) incubar dicha preparación líquida a temperatura ambiente durante un tiempo que varía entre 5 y 15 minutos y e) calentar dicha preparación líquida a una temperatura que varía entre 60° C y 134° C durante un tiempo que varía entre 5 y 60 minutos; opcionalmente f) centrifugar, recoger el sobrenadante y filtrar el sobrenadante recogido; y, opcionalmente, g) concentrar y/o secar o liofilizar la preparación líquida obtenida de la etapa e) o f).
19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que el disolvente de extracción es agua.
20. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que el agua añadida en la etapa (c) comprende un azúcar disuelto en ella a una concentración que varía de 1 a 100 g/l, opcionalmente de 50 a 75 g/l.
21. Una composición herbaria que comprende al menos dos plantas secas seleccionadas entreFilipendula ulmaria, Camellia sinensisyArctostaphylos uva-ursiy al menos una planta seleccionada entreVitis vinifera var. tinctoria, Eugenia caryophyllusyDesmodium adscendens.
22. La composición herbaria de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además una o más plantas secas adicionales seleccionadas entre:Achillea millefolium, Acorus calamus, Agrimonia eupatoria, Agropyrum repens, Agropyrum repens, Alchemilla vulgaris, Alkanna tinctoria, Althaea officinalis, Anethum graveolens, Angelica archangelica, Arbutus unedo, Arnica montana, Artemisia pontica, Artemisia vulgaris, Asparagus officinalis, Asparagus officinalis, Asperula odorata, Betula pendula, Borrago officinalis, Buxus sempervirens, Calamintha officinalis, Calendula officinalis, Calluna vulgaris, Carum carvi, Cassia angustifolia,Centaurea cyanus, Centaurium erythraea, Centella asiatica, Cetraria islandica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chrysanthellum americanum, Cichorium endivia, Cichorium intybus, Cinnamomum zeylanicum, Citrus aurantium, Combretum micranthum, Crataegus oxyacantha, Cuminum cyminum, Cupressus sempervirens, Curcuma zedoaria,Cynara scolymus, Cytisus scoparius,Desmodium adscendens, Elettaria cardamomum, Eleutherococcus senticosus, Epilobium parviflorum, Erysimum officinale, Eucalyptus globulus, Eugenia caryophyllus, Eupatorium cannabinum, Foeniculum vulgare, Fraxinus excelsior, Fucus vesiculosus, Fumaria officinalis, Galium odoratum, Gentiana lutea, Geranium robertianum, Ginkgo biloba, Glechoma hederacea, Glycyrrhiza glabra, Handroanthus impetiginosus, Harpagophytum procumbens, Hieracium pilosella, Humulus lupulus, Hypericum perforatum, Hyssopus officinalis, Illicium verum, Inula helenium, Juglans regia, Juniperus communis, Lamium album, Lavandula anqustifolia, Levisticum officinale, Lippia citriodora, Lotus corniculatus, Lythrum salicaria, Malva sylvestris, Marrubium vulgare, Medicago sativa, Melissa officinalis, Mentha x piperita, Morus nigra, Myrtus communis, Olea europaea, Origanum majorana, Panax ginseng, Papaver rhoeas,Parietaria officinalis, Passiflora incarnata, Petroselinum crispum, Peumus boldus, Phaseolus vulgaris, Pimpinella anisum, Plantago lanceolata, Plantago ovata, Potentilla anserina, Quercus robur, Rhamnus franqula, Rheum palmatum, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Rubia tinctorum, Rubus idaeus, Salix alba, Salvia officinalis, Sambucus nigra, Satureja montana, Silybum marianum, Solanum dulcamara, Tabebuia impetiginosa, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinalis, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Tilia tomentosa, Tilia cordata, Trigonella foenumgraecum, Tussilago farfara, Vaccinium myrtillus, Valeriana officinalis, Verbascum thapsus, Verbena officinalis, Viscum album, Vitis vinifera var. tinctoria, Zea maysyZingiber officinale.
23.Un procedimiento de preparación del suplemento alimenticio, de la composición nutracéutica, farmacéutica, veterinaria o cosmética, del alimento funcional o del aditivo alimenticio según las reivindicaciones 12 o 13, que comprende mezclar el extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el liofilizado de la reivindicación 11, con al menos un excipiente.
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