BR112019008864B1 - Composição herbácea, extrato de uma composição herbácea e processo de preparação, liofilizado, suplemento alimentar, composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética ou alimento funcional ou aditivo alimentar e processo de preparação - Google Patents

Abstract

Um extrato de uma composição herbácea que compreende pelo menos duas plantas secas diferentes úteis como agente antimicrobiano e/ou antibiofilme no tratamento ou prevenção de infecções microbianas causadas por bactérias, tais como, por exemplo, Escherichia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus ou Staphylococcus, ou por fungos, como, por exemplo, é aqui descrito. Verificou-se que nesse extrato, os ingredientes ativos exercem os seus efeitos biológicos de uma forma sinérgica. O extrato pode constituir o ingrediente ativo de um suplemento alimentar, uma composição nutracêutica, farmacêutica ou cosmética ou um alimento funcional ou um aditivo alimentar. Um processo para preparar o dito extrato é também descrito aqui.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se a um extrato de uma composição herbácea compreendendo pelo menos duas plantas secas diferentes úteis como agente antimicrobiano e/ou antibiofilme. Verificou-se também que, em tal extrato, os ingredientes ativos exercem os seus efeitos biológicos de uma forma sinérgica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Como qualquer organismo vivo, as plantas contêm numerosas entidades químicas, compreendendo produtos químicos de baixo peso molecular, polipeptídeos, polissacarídeos, enzimas. Um extrato vegetal é, portanto, um exemplo trivial de mistura de ocorrência natural de entidades químicas.

[0003] As atividades biológicas e terapêuticas de muitas misturas de entidades químicas obtidas de plantas são de conhecimento secular e são compiladas em inúmeros manuscritos (ver, por exemplo, Encyclopedia of Herbal Medicine: The Definitive Home Reference Guide to 550 Key Herbs with all their Uses as Remedies for Common Ailments Hardcover - 15 de novembro de 2000, por Andrew Chevallier).

[0004] A ciência moderna permite observar efeitos biológicos e terapêuticos de combinações de entidades químicas obtidas de plantas em um grande número de organismos.

[0005] Por exemplo, está descrito em Scheggi (Scheggi S. et al, Pharm. Biol. 5 de janeiro de 2016: 1 a 11. [Publicação eletrônica avançada de artigos]) como um modelo de rato permite testar o efeito contra a depressão de combinações de entidades químicas obtidas a partir de plantas.

[0006] Em Zhipeng QU (Oncotarget., 1 de setembro de 2016, Publicação eletrônica) mostra-se como é possível identificar mecanismos moleculares anticâncer de Injeção de Kushen Composto usando genômica funcional. A Injeção de Kushen Composto (CKI) tem sido clinicamente usada na China há mais de 15 anos para tratar vários tipos de tumores sólidos. No entanto, como tais preparações da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) são misturas complexas de metabólitos secundários de plantas, é essencial explorar seus mecanismos moleculares subjacentes de maneira sistemática. Este estudo mostra que a CKI inibiu a proliferação de células MCF-7 e induziu a apoptose de um modo dependente da dose. Verificou-se que múltiplas vias foram perturbadas e o ciclo celular foi identificado como a via-alvo principal potencial de CKI em células MCF-7. A CKI também pode induzir apoptose em células MCF-7 através de um mecanismo independente de p53. Além disso, eles identificaram novos lncRNAs e mostraram que muitos deles podem ser expressos como uma resposta ao tratamento com CKI.

[0007] O efeito de misturas de entidades químicas obtidas, por exemplo, de plantas, fungos ou bactérias, no crescimento de microrganismos, tais como bactérias e fungos, foi descrito muitas vezes, por exemplo, em Venkatadri (Venkatadri B. et al., Indian J. Pharm. Sci. novembro a dezembro de 2015; 77 (6): 788 a 791).

[0008] O efeito de combinações de entidades químicas obtidas, por exemplo, de plantas, fungos ou bactérias na formação de biofilmes (comunidades de microrganismos embutidos em uma matriz polimérica fixada a uma superfície) também foi descrito muitas vezes, por exemplo, em Süntar (Süntar I. et al. Pharm. Biol. junho de 2016; 54(6): 1065 a 1070 Publicação eletrônica 29 de outubro de 2015).

[0009] Shimizu M. et al. (Antimicrob Agents Chemother. Novembro de 2001; 45 (11): 3198 a 3201) descobriram que um extrato de Arctostaphylos uva-ursi reduziu marcadamente as MICs (Concentrações Inibitórias Mínimas) de antibióticos beta- lactâmicos, tais como oxacilina e cefmetazol, contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina. O mesmo grupo também isolou o composto efetivo e o identificou como corilagina.

[0010] Outro grupo (Denev P. et al., Acta Biochim. Pol. 2014;61(2):359 a 367.Publicação eletrônica, 18 de junho de 2014) estudou as atividades antioxidante, antimicrobianas e moduladoras de neutrófilos de extratos de seis plantas medicinais - folhas de amoreira (Rubus fruticosus), folhas de arônia (Aronia melanocarpa), folhas de espinheiro (Crataegus monogyna), partes aéreas de manto da senhora (Alchemilla glabra), partes aéreas da ulmeira (Filipendula ulmaria) e folhas da framboesa (Rubus idaeus). A atividade antimicrobiana dos extratos investigados contra 11 patógenos humanos foi investigada usando três métodos diferentes e os resultados deste estudo permitiram concluir que os extratos de folhas de ulmeira e amora apresentaram o maior efeito antimicrobiano e as menores concentrações inibidoras mínimas (MICs) contra os microrganismos testados.

[0011] Yam T. et al. (FEMS Microbiol Lett. 1 de julho de 1997; 152 (1): 169 a 174) focaram o seu estudo na atividade microbiológica de extratos brutos integrais e fracionados de chá (Camellia sinensis) e de componentes de chá. Extratos aquosos de chás (Camellia sinensis) de diferentes tipos e de várias fontes foram testados e inibiram uma grande variedade de bactérias patogênicas, incluindo o Staphylococcus aureus resistente à meticilina. Os extratos de chá foram bactericidas para estafilococos e Yersinia enterocolitica, em concentrações bem baixas de “xícara de chá”. A atividade foi confinada a uma das quatro frações obtidas a partir de um extrato de chá verde por cromatografia de partição. Testes de compostos puros de chá e substâncias químicas intimamente relacionadas sugeriram que a atividade antibacteriana dos extratos de chá verde pode ser explicada pelo seu conteúdo de epigalocatequina, galato de epigalocatequina e galato de epicatequina. Nos extratos de chá preto, a teaflavina e seus galatos são componentes ativos antibacterianos adicionais.

[0012] O documento WO 2009/031041 relata uma composição que compreende (a) um composto antimicrobiano tendo uma dada fórmula estrutural química, (b) um material antimicrobiano selecionado de bacteriocinas de lantionina, extrato de chá [Camellia sinensis], extrato de lúpulo [Humulus lupulus L], extrato de pele de uva, extrato de semente de uva, extrato de Uva Ursi [Arctostaphylos uva-ursi ] e suas combinações.

[0013] O documento WO 99/20289 relata uma solução de extrato herbáceo transparente compreendendo um extrato herbáceo concentrado e um líquido de enchimento. O extrato herbáceo concentrado é relatado para ser selecionado a partir de uma longa lista de extratos de plantas, onde essa lista inclui Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi. No entanto, o documento WO 99/20289 não menciona qualquer uso medicinal ou terapêutico específico da solução herbácea reivindicada.

[0014] O documento US 2015/0056255 relata um produto para uso medicinal, cosmético, de coloração ou dermatológico, em que o produto compreende uma camada de um produto vegetal fibroso e um extrato vegetal aplicado à camada do produto vegetal fibroso. Diz-se que o extrato vegetal compreende substâncias de uma ou mais partes específicas de uma ou mais plantas, em que as plantas são selecionadas de pelo menos uma de uma longa lista de plantas.

[0015] Azanida NN (Med. Aromat. Plants, 4:3, páginas 1 a 6, 2015) publicou uma revisão, que relata uma descrição e uma comparação dos métodos mais comumente usados para preparar extratos de plantas medicinais. Os autores concluem seu artigo afirmando que “nenhum método de extração universal é o método ideal e cada procedimento de extração é único para as plantas” (consulte “Conclusions”, linhas 5 a 7).

[0016] Selman A. Wachsman et al. (Bacteriology, 31, páginas 157 a 164, 1945) relata que diferentes cepas da mesma espécie bacteriana podem variar grandemente na sua resistência à estreptomicina. Diferentes cepas bacterianas de Staphylococcus aureus são usadas em tal papel para testar a atividade da estreptomicina. No entanto, nenhum extrato vegetal é testado nas mesmas cepas e, portanto, nenhuma orientação clara pode ser tirada desse papel.

[0017] Os efeitos biológicos, tal como contemplados nos exemplos anteriores, podem ser induzidos quer por uma única entidade química, tal como em fármacos padrão, quer por efeitos sinérgicos de diferentes entidades químicas, tais como em extratos. Em alguns casos, o efeito biológico é quase totalmente atribuível a uma única entidade química contida no extrato. Neste caso, o extrato pode ser substituído pela entidade química ativa purificada.

[0018] Os efeitos biológicos de uma entidade química podem se dar ou devido a reações químicas (transformações) com as entidades químicas que constituem o organismo, ou devido à ligação transitória ou permanente às entidades químicas, em particular às macromoléculas, constituindo o organismo. Essa ligação modulará a atividade das entidades químicas do organismo, em particular as macromoléculas, por exemplo, aumentam ou diminuem a atividade de uma enzima.

[0019] Infelizmente, as entidades químicas nunca têm um efeito único em um organismo. Em particular, as interações com os constituintes macromoleculares são numerosas. De fato, está bem estabelecido que qualquer entidade química, seja ela natural ou resultante de síntese química, terá efeitos deletérios sobre organismos (humanos, animais, plantas, microflora, etc.) de uma forma relacionada à dose. Eventualmente, um efeito positivo ou terapêutico relacionado com a dose pode ser observado também. É óbvio que, para a entidade química ser de interesse industrial, a dose necessária para observar o efeito positivo ou terapêutico deve ser inferior à dose para a qual os efeitos deletérios se tornam inaceitáveis.

[0020] Entidades químicas que diferem em sua composição química ou estrutura terão diferentes afinidades (ou constantes de ligação) com as diferentes macromoléculas que constituem o organismo e, portanto, diferentes modos de ação, resultando nos efeitos deletérios, positivos e terapêuticos observados.

[0021] As macromoléculas envolvidas em efeitos deletérios e aquelas envolvidas em efeitos positivos ou terapêuticos são diferentes em muitos casos. As entidades químicas que diferem na sua composição química terão, na maioria dos casos, afinidades muito diferentes (ou constantes de ligação) com as numerosas macromoléculas diferentes que constituem o organismo.

[0022] Na maioria dos casos, diferentes entidades químicas terão diferentes afinidades (ou constantes de ligação) com uma dada macromolécula. Em casos raros, entidades químicas diferentes terão afinidades similares (ou constantes de ligação) com a mesma macromolécula ou conjuntos de macromoléculas envolvidas em um efeito positivo ou terapêutico. Entre estes casos, será raro que estas diferentes entidades químicas tenham afinidades comparáveis (ou constantes de ligação) com as macromoléculas envolvidas em determinado efeito prejudicial.

[0023] Misturas de diferentes entidades químicas podem, assim, ter um efeito sinérgico positivo ou terapêutico sem um efeito deletério acumulativo dado. Assim, para um determinado efeito positivo ou terapêutico, a dose necessária para cada entidade química diferente individual em uma mistura será menor do que a dose necessária para cada entidade química considerada individualmente para obter aquele determinado efeito positivo ou terapêutico. Nos casos em que os efeitos deletérios induzidos por cada composto químico diferente são diferentes ou têm uma etiologia macromolecular diferente, cada efeito deletério da mistura será menor do que o efeito deletério da entidade química considerada individualmente porque é usada em uma dose menor na mistura.

[0024] Observa-se que a situação sinérgica da administração simultânea de doses reduzidas de diferentes entidades químicas é diferente da coadministração de diferentes fármacos (entidades químicas) com diferentes efeitos terapêuticos administrados nas suas doses padrão. Na última situação, os efeitos colaterais aumentados devido a interações medicamentosas são bem conhecidos. Uma das causas dos efeitos colaterais é a possível interação química dos diferentes fármacos (entidades químicas). Na situação sinérgica, cada entidade química está presente em uma concentração reduzida e, portanto, com taxas muito menores de interações químicas. Para fins de ilustração, uma mistura sinérgica de 10 entidades químicas diferentes (fármacos) administrada a cada 1/10 da concentração (dose) necessária para uma entidade química (fármaco) administrada individualmente, a taxa das reações químicas entre os fármacos será reduzida por um fator de 100, como implicado pela lei universal de ação de massa.

[0025] É, portanto, de interesse utilizar misturas sinérgicas de diferentes entidades químicas para obter um dado efeito positivo ou terapêutico com efeitos deletérios reduzidos, ou para obter um efeito positivo ou terapêutico aumentado com um determinado nível de efeitos deletérios diferentes. De fato, são conhecidos vários extratos que possuem atividades sinérgicas relacionadas a entidades químicas isoladas (consulte, por exemplo, Deharo E. et al., Malar. J. 15 de março de 2011, 10 Supl 1:S5).

[0026] Os extratos naturais compostos por uma mistura de entidades químicas sinérgicas podem ser descobertos, por exemplo, por meio de testes sistemáticos de numerosos extratos naturais de pós de plantas individuais ou de composições herbáceas contendo pelo menos dois ou mais pós de plantas diferentes.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0027] Constatou-se agora que um extrato de uma composição herbácea compreendendo pelo menos duas plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi é útil como agente antimicrobiano e/ou antibiofilme no tratamento ou prevenção de infecções microbianas causadas por bactérias como, por exemplo, Escherichia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus ou Staphylococcus, ou por fungos, como, por exemplo, Candida. Verificou-se também que, em tal extrato, os ingredientes ativos exercem os seus efeitos biológicos de uma forma sinérgica.

[0028] Por conseguinte, um objetivo da presente invenção é um método para o tratamento ou prevenção das infecções microbianas acima mencionadas compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um extrato de uma composição herbácea compreendendo pelo menos duas plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi, um liofilizado do dito extrato, ou uma composição farmacêutica ou veterinária compreendendo o dito extrato ou o dito liofilizado, a um indivíduo necessitado disso.

[0029] Outro objetivo da presente invenção é um extrato de uma composição herbácea, compreendendo pelo menos duas plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi e pelo menos uma planta selecionada entre Vitis vinifera var. tinctoria, Eugenia caryophyllus e Desmodium adscendens.

[0030] A dita composição herbácea pode ainda compreender uma ou mais plantas secas adicionais selecionadas entre:

[0031] Achillea millefolium, Acorus calamus, Agrimonia eupatoria, Agropyrum repens, Agropyrum repens, Alquemila vulgaris, Alkanna tinctoria, Altea officinalis, Anethum graveolens, Angélica archangelica, Arbutus unedo, Arnica montana, Artemisia pontica, Artemisia vulgaris, Asparagus officinalis, Asperula odorata, Betula pendula, Borrago officinalis, Buxus sempervirens, Calamintha officinalis, Calendula officinalis, Calluna vulgaris, Corum carvi, Cassia angustifolia, Centaurea cyanus, Centaurium erythraea, Centella asiatica, Cetraria islandica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chrysanthellum americanum, Cichorium endivia, Cichorium intybus, Cinnamomum zeylanicum, Citrus aurantium, Combretum micranthum, Crataegus oxyacantha, Cuminum cyminum, Cupressus sempervirens, Curcuma zedoaria, Cynara scolymus, Cytisus scoparius, Elettaria cardamomum, Eleutherococcus senticosus, Epilobium parviflorum, Erysimum officinale, Eucalyptus globulus, Eupatorium cannabinum, Foeniculum vulgare, Fraxinus excelsior, Fucus vesiculosus, Fumaria officinalis, Galium odoratum, Gentiana lutea, Geranium robertianum, Ginkgo biloba, Glechoma hederacea, Glycyrrhiza glabra, Handroanthus impetiginosus, Harpagophytum procumbens, Hieracium pilosella, Humulus lupulus, Hypericum perforatum, Hyssopus officinalis, Illicium verum, Inula helenium, Juglans regia, Juniperus communis, Lamium album, Lavandula angustifolia, Levisticum officinale, Lippia citriodora, Lótus corniculatus, Lythrum salicaria, Malva sylvestris, Marrubium vulgare, Medicago sativa, Melissa officinalis, Mentha x piperita, Morus nigra, Myrtus communis, Olea europaea, Origanum majorana, Panax ginseng, Papaver rhoeas, Parietaria officinalis, Passiflora incarnata, Petroselinum crispum, Peumus boldus, Phaseolus vulgaris, Pimpinella anisum, Plantago lanceolata, Plantago ovata, Potentilla anserina, Quercus robur, Rhamnus frangula, Rheum palmatum, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Rubia tinctorum, Rubus idaeus,Salix a lba, Salvia officinalis, Sambucus nigra, Satureja montana, Silybum marianum, Solanum dulcamara, Tabebuia impetiginosa, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinalis, Thymus serpyllum, Timo vulgaris, Tilia tomentosa, Tilia cordata, Trigonella foenum graecum, Tussilago farfara, Vaccinium myrtillus, Valeriana officinalis, Verbascum thapsus, Verbena officinalis, Viscum album, Zea mays e Zingiber officinale.

[0032] Um outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea compreendendo de três a sete plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uva-ursi, Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes, Eugenia caryophyllus e Eucalyptus globulus, em que pelo menos duas destas plantas são selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi e pelo menos uma dessas plantas é selecionada entre Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes e Eugenia caryophyllus.

[0033] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea compreendendo as seguintes plantas secas: Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria e Arctostaphylos uva-ursi.

[0034] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea compreendendo as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria e Arctostaphylos uva-ursi.

[0035] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea compreendendo as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eugenia caryophyllus e Arctostaphylos uva-ursi.

[0036] Um outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea, compreendendo as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera Tinctoria, Eucalyptus globulus, Arctostaphylos uva-ursi, Mentha spicata e Rubia tinctorium.

[0037] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea compreendendo pelo menos catorze ou quinze plantas secas selecionadas entre os dezesseis seguintes: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foziculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodora e Tanacetum vulgare.

[0038] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea, compreendendo as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureia montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera Tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum e Lippia citrodora.

[0039] Outro objetivo da invenção é um extrato de uma composição herbácea, compreendendo as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureia montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera Tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodora e Tanacetum vulgare.

[0040] Todas as composições herbáceas acima mencionadas são também um objetivo da invenção, como intermediários na preparação dos extratos correspondentes.

[0041] O extrato pode constituir o ingrediente ativo de um suplemento alimentar, uma composição nutracêutica, farmacêutica ou cosmética ou um alimento funcional ou um aditivo alimentar.

[0042] O extrato da invenção pode ser usado como tal ou em uma forma seca ou liofilizada.

[0043] Um suplemento alimentar, uma composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética ou um alimento funcional ou um aditivo alimentar contendo o extrato definido acima juntamente com excipientes adequados são objetos adicionais da invenção.

[0044] Tal suplemento alimentar, uma composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética ou um alimento funcional ou um aditivo alimentar pode ser formulado em qualquer forma adequada, por exemplo, para administração oral, incluindo formas sólidas tais como pós, grânulos, cápsulas, pílulas, comprimidos (liberação normal ou controlada), gomas de mascar ou formas líquidas, como xaropes, gotas, elixires, soluções e suspensões em geral.

[0045] Além disso, o extrato de acordo com a invenção pode ser incorporado em outras formulações, tais como cremes, unguentos, géis, leites, pastas, cremes à base de água, emulsões, soros, máscaras, bálsamos, fluidos, sprays, supositórios, supositórios vaginais, emplastros transdérmicos e cremes dentais, géis periodontais, enxaguantes bucais.

[0046] De acordo com a presente invenção, a expressão “composição herbácea” se refere a um pó contendo uma ou mais plantas secas trituradas diferentes. O pó de uma única planta seca pode ter sido obtido a partir de toda a planta ou formar uma parte específica dela, por exemplo, flores, brotos, frutos, caules, folhas, sementes, raízes ou outros.

[0047] De acordo com a invenção, um extrato pode ser obtido por simples incubação de uma composição herbácea com um solvente de extração (com ou sem a adição de um açúcar) à temperatura ambiente.

[0048] Os solventes de extração adequados de acordo com a invenção são água e todos os solventes não aquosos autorizados para utilização na produção de produtos alimentares e ingredientes alimentares. Por exemplo, de acordo com a Diretiva 2009/32/EC, uma lista desses solventes não aquosos inclui o propano, o butano, o acetato de etila, o etanol, dióxido de carbono, acetona, óxido nitroso. De acordo com modalidades específicas da invenção, o solvente de extração é selecionado entre água, etanol, acetato de etila e qualquer mistura destes.

[0049] De acordo com outra modalidade alternativa, um extrato pode ser obtido por incubação de uma composição herbácea com um solvente de extração (com ou sem a adição de um açúcar) e aquecimento subsequente, com ou sem centrifugação e filtração.

[0050] De acordo com uma modalidade alternativa, um extrato de água pode ser obtido por incubação de uma composição herbácea com água (com ou sem a adição de um açúcar) e subsequente aquecimento (por exemplo, aquecendo a preparação líquida resultante a uma temperatura variando de 60 °C a 134 °C, preferencialmente de 119 °C a 121 °C, durante um intervalo de tempo de 5 a 60 minutos, preferencialmente de 20 a 30 minutos).

[0051] Com o termo “açúcar”, pretendemos aqui significar um açúcar farmacêutico ou alimentar, como, por exemplo, dextrose, lactose, lactose anidro, manitol, sorbitol, maltose, galactose ou sacarose.

[0052] De acordo com uma modalidade particular da invenção, esse açúcar é sacarose.

[0053] O dito açúcar pode ser utilizado em concentrações que variam de 1 a 100 g/l, opcionalmente de 50 a 75 g/l.

[0054] Com o termo “suplemento alimentar” entende-se aqui um produto alimentar destinado a suplementar a dieta comum e que é uma fonte concentrada de nutrientes, como vitaminas e minerais, ou outras substâncias com efeito nutricional ou fisiológico, sob a forma de dose unitária (ver também a Diretiva 2002/46/EC, de 10 de junho de 2002.

[0055] A expressão “alimento funcional” significa incluir alimentos caracterizados por efeitos adicionais devido à presença de componentes (geralmente não nutrientes) naturalmente presentes ou adicionados, que interagem mais ou menos seletivamente com uma ou mais funções fisiológicas do organismo (biomodulação) para um efeito positivo na manutenção da saúde e/ou prevenção de doenças. Um alimento pode ser considerado “funcional”, se for suficientemente demonstrada a sua influência benéfica em uma ou mais funções do corpo, além de efeitos nutricionais adequados, de modo a ser relevante para um estado de bem-estar e saúde, ou para redução de risco de uma doença. Os efeitos benéficos podem incluir tanto a manutenção de um estado de bem-estar ou saúde quanto a redução do risco de um processo de doença ou doença (ver AT Diplock et al: Scientific concepts of functional foods in Europe: Consensus Document, British Journal of Nutrition 1999, 81 (Suppl. 1), S1-S27).

[0056] De acordo com a presente invenção, com a expressão “composição nutracêutica” pretende-se significar um produto, que não apenas suplementa a dieta, mas também deve auxiliar na prevenção e/ou tratamento de doença e/ou distúrbio. Esta expressão foi cunhada em 1989 por Stephen L. DeFelice (MD, fundador e presidente da Fundação para a Inovação em Medicina (FIM)) juntando os conceitos de “nutrição” e "farmacêutica".

[0057] Com o termo "excipiente", pretende-se aqui referir-se a excipientes convencionais, isto é, compostos inertes para o ingrediente ativo de uma composição.

[0058] Os excipientes podem ser divididos em várias classificações funcionais, dependendo do papel que se pretende desempenhar na formulação resultante, por exemplo, em formas de dosagem sólidas, eles podem atuar como diluentes (por exemplo, lactose, celulose microcristalina), desintegrantes (por exemplo, amido glicolato de sódio, croscarmelose sódio), ligantes (por exemplo, PVP, HPMC), lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio), deslizantes (por exemplo, SiO2 coloidal) ou agentes aromatizantes (por exemplo, hortelã-pimenta, óleos de limão). Em formas de dosagem líquidas, podem atuar como solventes, cossolventes ou solubilizantes (por exemplo, propilenoglicol, glicerol, etanol, sorbitol, dextrose), agentes tamponantes (por exemplo, fosfato de sódio), agentes antimicrobianos (por exemplo, sorbato de potássio), agentes umidificantes (por exemplo, polissorbatos ou Tweens), agentes anti-espumantes (por exemplo, polidimetilsiloxano-dióxido de silício), agentes espessantes (por exemplo, metilcelulose ou hidroxietilcelulose) ou agentes edulcorantes (por exemplo, sorbitol, acessulfame-K).

[0059] Como já foi dito, o extrato da invenção é um agente antimicrobiano e/ou antibiofilme e é vantajosamente utilizado no tratamento, na prevenção e/ou no diagnóstico de infecções microbianas em seres humanos e animais.

[0060] Outro objetivo da invenção é, portanto, a utilização do extrato da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou diagnóstico de infecções microbianas. Tal medicamento pode ser útil para seres humanos de animais.

[0061] De acordo com a presente invenção, as expressões “tratamento” ou “tratar” se destinam a atividades concebidas para curar, mitigar os sintomas ou retardar a progressão de uma doença ou uma condição patológica.

[0062] As expressões “prevenção” ou “prevenir” são destinadas a se referirem a atividades concebidas para minimizar a incidência ou efeitos de uma doença ou uma condição patológica. Por exemplo, no caso de infecções microbianas, a prevenção especificamente aqui significa evitar a adesão e colonização de micróbios patogênicos para células, tecidos e órgãos.

[0063] As expressões “diagnóstico” ou “diagnosticar” pretendem referir-se a atividades destinadas a identificar uma série de parâmetros fisiológicos para avaliar a presença e a extensão de uma determinada doença ou condição patológica.

[0064] A expressão “agente antimicrobiano” será aqui usada para significar um agente que é capaz de inibir o crescimento de células microbianas. Se as células microbianas são células microbianas patogênicas, o agente antimicrobiano pode ser usado como ingrediente ativo de uma composição farmacêutica ou veterinária para o tratamento de infecções microbianas em humanos ou animais.

[0065] A expressão “agente antibiofilme” será aqui usado para significar um agente que é capaz de inibir a formação de biofilme por células microbianas e/ou para facilitar a dispersão de biofilmes pré-formados. Em contraste com agentes antimicrobianos convencionais, um agente antibiofilme não afeta diretamente a sobrevivência microbiana e, portanto, a expectativa é de que a resistência a esses agentes não ocorra prontamente.

[0066] De acordo com a presente invenção, o termo “sinérgico” pretende referir- se a um efeito biológico ou atividade (aqui antimicrobiana ou antibiofilme), apresentada pelo extrato de uma composição herbácea da invenção (isto é, compreendendo pelo menos duas plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi), que é maior do que a soma dos efeitos ou atividades dos extratos das plantas secas individuais correspondentes.

[0067] Tal efeito biológico ou maior atividade pode ser ilustrado, por exemplo, em termos de inibição do crescimento planctônico (atividade antimicrobiana), em termos de inibição da formação de biofilme (atividade antibiofilme) ou em termos de número de cepas, em que uma ou ambas as atividades podem ser identificadas.

[0068] De acordo com uma modalidade particular da invenção, as infecções microbianas são causadas por bactérias, tais como, por exemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus pyogenes, ou por fungos, como, por exemplo, Candida albicans.

[0069] De acordo com outra modalidade particular da invenção, as infecções microbianas são causadas por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ou Staphylococcus pseudintermedius.

[0070] Staphylococcus aureus, uma bactéria Gram-positiva comensal, é um dos principais patógenos que pode causar uma ampla variedade de doenças em humanos, desde infecções da pele e tecidos moles até septicemia grave, choque tóxico ou pneumonia. O Staphylococcus aureus é uma importante causa de infecções hospitalares e muitas cepas hospitalares de Staphylococcus aureus adquirem resistência aos antibióticos, mais particularmente à meticilina. Ainda não há vacina disponível, mas importantes esforços são realizados para desenvolver imunoterapia ativa e passiva contra vários alvos de Staphylococcus aureus.

[0071] De modo a avaliar tais atividades biológicas para o extrato da invenção e para amostras comparativas, muitas cepas diferentes foram usadas e serão mencionadas na seção dos Exemplos.

[0072] Em particular, as seguintes cepas bacterianas foram utilizadas para testar tanto a atividade antimicrobiana como antibiofilme dos extratos da invenção.

[0073] A ATCC 25923, também conhecida como Seatle 1945, é uma cepa de Staphylococcus aureus amplamente usada em pesquisas acadêmicas (é citada em 627 publicações a partir de outubro de 2016 (ver NIH-NCBI-Pubmed)). O seu comportamento de resistência a antibióticos foi completamente caracterizado (ver, por exemplo, Reimer LG et al., Antimicrob. Agents Chemother. Junho de 1981; 19(6): 1050 a 1055).

[0074] A ATCC 29213 também é uma cepa de Staphylococcus aureus amplamente usada em pesquisa acadêmica (citada em 327 publicações a partir de outubro de 2016 (ver NIH-NCBI-Pubmed)). Foi utilizada na pesquisa de biofilme (ver, por exemplo, Ceri H. et al., J. Clin. Microbiol. Junho de 1999; 37(6): 1771 a 1776).

[0075] A ATCC 1228 é uma cepa de Staphylococcus epidermidis (citada em 101 publicações a partir de outubro de 2016 (ver NIH-NCBI-Pubmed)). O Código de Regulamentos Federais (FDA) lista tal cepa como o organismo de ensaio preferencial para neomicina (ver também Robertson JH et al., Appl. Microbiol. Dezembro de 1971; 22(6): 1164 a 1165).

[0076] A ATCC 43300 é uma cepa de Staphylococcus aureus isolada de um estudo clínico (citada em 81 publicações a partir de outubro de 2016 (ver NIH-NCBI- Pubmed), incluindo Lubenko et al., J. Antimicrob. Chemother. Novembro de 2008; 62(5): 1065 a 1069).

[0077] A cepa Newman de Staphylococcus aureus foi isolada em 1952 de uma infecção humana e tem sido amplamente utilizada em modelos animais de infecções estafilocócicas devido ao seu fenótipo de virulência robusto (ver Baba T. et al., Journal of bacteriology, 190: 300 a 310 (2008)). Em contraste com o MRSA adquirido no hospital (Staphylococcus aureus resistente à meticilina), Newman de Staphylococcus aureus transporta apenas um pequeno número pequeno de sequências de inserção (IS) e não possui determinantes conhecidos de resistência a antibióticos.

[0078] Outras cepas usadas nos exemplos também são comumente usadas em pesquisas acadêmicas ou na indústria para controle de qualidade (QC). A maioria delas também é resistente à meticilina.

[0079] Para referência à ATCC 33591, ver Reyes N. et al., J. Antimicrob. Chemother. Agosto de 2006; 58(2): 462 a 465, Publicação eletrônica de 30 de maio de 2006. Para referência à ATCC 33592, ver Teka A. et al., BMC Complement Altern Med. 18 de agosto de 2015; 15:286. Para referência a NCTC 12493, ver Carey BE et al., J. Antimicrob. Chemother. Agosto de 2006; 58 (2): 455 a 457, Publicação eletrônica de 20 de junho de 2006. Para referência à ATCC 700698, ver Kirker K.R. et al., Int. J. Antimicrob Agents, outubro de 2015; 46(4): 451 a 455, Publicação eletrônica de 9 de julho de 2015. Para referência à ATCC 700699, ver Sy C.L. et al., J. Clin. Microbiol. Março de 2016; 54(3): 565 a 568, Publicação eletrônica de 16 de dezembro de 2015. Para referência à ATCC 9144, ver Carson C.F. et al., Antimicrob. Agents Chemother. Junho de 2002; 46(6): 1914 a 1920. Para referência à ATCC BAA-44, ver Monecke S. et al., PLoS One. 6 de abril de 2011; 6(4):e17936. Para referência à ATCC 14990, ver Bernardo T.H. et al., Scientific World Journal. 2015; 751791, Publicação eletrônica de 3 de junho de 2015). Para referência à ATCC 49444, ver Ramsey KJ et al., J Food Prot. (2010). Para referência à ATCC 60193, ver Petrikaite V et al., Medicina (Kaunas). 2007;43(8):657 a 663. Para referência à ATCC 11775, consulte Usman H et al., Afr J Tradit Complement Altern Med. 10 de junho de 2007; 4(4): 488 a 494. Para referência à ATCC 13883, ver Supardy NA et al., J Microbiol Biotechnol. Junho de 2012; 22(6): 872 a 881. Para referência à ATCC 33090, ver Le Marc Y et al., Int J Food Microbiol. Março de 2002; 73(2-3): 219 a 237. Para referência à ATCC 19115, ver Vodnar DC., Chem Cent J. 28 de julho de 2012; 6(1):74. doi: 10.1186/1752-153X-6-74. Para referência à ATCC 27853, ver Reimer LG et al., Antimicrob Agents Chemother. Junho de 1981; 19(6): 1050 a 1055. Para referência à ATCC 13076, ver Fioretto F et al., Braz J Med Biol Res. Agosto de 2005; 38(8):1259 a 1265. Publicação eletrônica de 30 de julho de 2005. Para referência à ATCC 13311, ver Leguérinel I et al., Int J Food Microbiol. 1 de maio de 2007; 116(1):88 a 95. Publicação eletrônica de 13 de janeiro de 2007. Para referência à ATCC 27336, ver Chen S et al., Appl Environ Microbiol. Julho de 2013; 79(13): 4015 a 4023. doi: 10.1128/AEM.00704-13. Publicação eletrônica de 19 de abril de 2013. Para referência à ATCC 43079, veja Farrow JA e Collins MD., Syst. Appl. Microbiol. 5: 483 a 493, 1984. Para referência à ATCC BAA- 1323, ver Svensson Mikael D et al., Microbiology 148: 3933 a 3945, 2002.

[0080] O suplemento alimentar, a composição nutracêutica, farmacêutica ou cosmética da invenção podem ser adequadamente formulados para diferentes vias de administração. Tais vias de administração incluem: auricular, bucal, cutânea, dentária, nasal, oftálmica, oral, orofaríngea, retal, respiratória (inalação), sublingual, tópica ou vaginal.

[0081] Geralmente, as composições compreendendo os extratos da invenção são administradas em uma “quantidade terapeuticamente eficaz”.

[0082] Para o objetivo da presente descrição e das seguintes reivindicações, o termo “compreendendo” também inclui os termos “que consistem essencialmente em” ou “que consiste em”.

[0083] A quantidade da composição efetivamente administrada será tipicamente determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, a composição real administrada, a idade, o peso corporal e a resposta do sujeito individual, a gravidade dos sintomas do sujeito e semelhantes. Para qualquer composição, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, habitualmente camundongos, ratos, porquinhos-da-dia, coelhos, cães ou porcos.

[0084] O modelo animal também pode ser utilizado para determinar o intervalo de concentração apropriado e a via de administração. Tal informação pode então ser usada para determinar doses e vias úteis para administração em humanos. Ao calcular a Dose Humana Equivalente (HED), recomenda-se usar a tabela de conversão fornecida no documento Orientação para Indústria e Revisores (2005, US Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, EUA).

[0085] De acordo com a invenção, a dose do extrato a ser administrado a humanos pode ser regulada com referência à composição herbácea usada para prepará-la e, consequentemente, a quantidade de plantas secas moídas individuais presentes na composição herbácea. Usualmente, utiliza-se de 0,001 a 500 g de cada planta seca moída para preparar o extrato final, opcionalmente de 0,01 a 100 g. Tal extrato pode ser utilizado como tal ou em uma liofilizada, seca ou liofilizada forma na composição final para utilização humana ou animal ou pode ser ainda mais diluída.

[0086] A dose eficaz precisa para um ser humano dependerá da gravidade da doença ou condição, estado geral de saúde do indivíduo, idade, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, outras terapias simultâneas, sensibilidades à reação, e tolerância/resposta à terapia. Essa quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro do julgamento do clínico.

[0087] O tratamento de dosagem pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas.

[0088] Outro objetivo da invenção é o processo para preparar o extrato da invenção. Tal processo compreende esquematicamente as seguintes etapas: a) picar ou moer separadamente ou em mistura, pelo menos, duas plantas secas individuais para obter os pós vegetais correspondentes; b) misturar pelo menos dois pós vegetais diferentes para obter uma composição herbácea; c) adicionar um solvente de extração à dita composição herbácea para obter uma preparação líquida correspondente (ou extrato); d) incubar a dita preparação líquida à temperatura ambiente durante um intervalo de tempo entre 5 e 15 minutos; opcionalmente, e) aquecer a dita preparação líquida a uma temperatura variando entre 60 °C e 134 °C durante um intervalo de tempo de 5 a 60 minutos; opcionalmente, f) centrifugar, coletar do sobrenadante e filtrar o sobrenadante coletado; e, opcionalmente, g) concentrar e/ou secar ou liofilizar a preparação líquida obtida da etapa e) ou f).

[0089] De acordo com o presente pedido, a palavra “liofilizado” se refere a extratos liofilizados (desidratados) e secos de acordo com a invenção.

[0090] As plantas secas individuais são produtos comerciais que podem ser comprados como parte das coleções de plantas secas de farmácias ou lojas de ervas. Listas de coleções de plantas secas estão disponíveis em cada farmácia da loja de ervas de escolha e as plantas secas disponíveis em tais coleções podem variar de país para país.

[0091] Por exemplo, Bélgica, França e Itália decidiram em 2012 unir forças para desenvolver uma lista comum de plantas, cuja utilização poderia ser permitida, desde que os fabricantes atendessem aos requisitos de qualidade da legislação europeia (Regulamento EC 852/2004). Graças ao trabalho árduo de três especialistas reconhecidos (Robert Anton, Luke Delmulle e Mauro Serafini) o projeto resultou no estabelecimento de uma lista de 1.029 plantas e 11 cogumelos (ver lista BelFrIt em http://www.economie.gouv.fr/files/files/directions services/dgccrf/imgs/breve/2014/do cuments/harmonized list Section A.pdf )

[0092] A invenção será agora descrita fazendo referência aos seguintes Exemplos não limitativos.

EXEMPLOS LISTA DE PLANTAS USADAS NOS EXEMPLOS

[0093] As plantas e partes de plantas na lista a seguir foram usadas nos diferentes Exemplos. Por uma questão de concisão, cada planta é identificada por um código usado em todos os exemplos. O peso correspondente a 200 μl (volume da colher calibrada) da planta em pó também é indicado (Tabela 0-1). As plantas secas de grau farmacêutico PA00 a PB12 foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont- Ferrand, França) e as plantas secas de grau farmacêutico PB13 a PD08 foram obtidas de “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França). Quando indicado no Exemplo, as plantas foram também obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França) ou de Siccarapam (Aubiat, França).TABELA 0-1: LISTA DE PLANTAS COM CÓDIGOS ASSOCIADOS E PESOS DE PÓS SECOS PARA UMA COLHER CALIBRADA

MÉTODO PARA PREPARAR AS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS (MÉTODO A)

[0094] Cada planta seca foi triturada usando um moinho de café (Tipo 8100, SEB, França). O pó obtido (pó vegetal) foi peneirado utilizando uma peneira de malha de 2 mm e conservado em recipientes de 60 ml (Labbox, França).

[0095] Prepararam-se misturas de diferentes plantas secas trituradas (ou pós de plantas) recolhendo um volume fixo de pó de plantas com uma colher calibrada permitindo coletar 200 μl de pó. O peso do volume coletado é dependente do pó específico da planta (ver Tabela 0-1).

[0096] Tais misturas ou misturas de diferentes plantas secas moídas (ou pós de plantas) bem como plantas secas individuais serão aqui denominadas também como “composições herbáceas”.

MÉTODO PARA PREPARAR OS EXTRATOS DE ÁGUA (TAMBÉM CHAMADOS NESTA SEÇÃO DE EXEMPLOS COMO “AMOSTRAS PROCESSADAS”, “EXTRATOS” OU “EXTRATOS DE MISTURAS”) (MÉTODO B)

[0097] Tais composições herbáceas foram colocadas em tubos falcon de 50 ml (Falcon, EUA) e 20 ml ou 40 ml (como indicado nos Exemplos) de solução aquosa de nascente em grau alimentício (Volvic, França) contendo 100 g/l de sacarose em grau alimentício (Daddy, França) foram adicionados. A escolha da sacarose em grau alimentício e da água, em vez de suas contrapartes em grau científico, foi ditada pelo objetivo de obter uma composição comestível que entrasse na classe dos “aromas” que podem ser diretamente consumidos, mediante o Regulamento (EC) n° 1334/2008 de 16 de dezembro de 2008, em aromas e certos ingredientes alimentares com propriedades aromatizantes para uso nos alimentos.

[0098] Cada tubo falcon contendo tais preparações líquidas foi agitado usando um misturador vórtex (ThermoFisher, EUA) por 10 segundos, incubado à temperatura ambiente por 10 min e colocado em autoclave (MED 12, JP Selecta, Espanha) e submetido a um ciclo de esterilização de 20 minutos a 119 °C ou 121 °C, como indicado. Após arrefecimento, a preparação esterilizada foi mantida a -20 ° C até a utilização.

[0099] No dia da manipulação, a preparação foi descongelada a 37 °C. A preparação foi centrifugada a 4.000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemanha) ou incubada à temperatura ambiente para decantação (como indicado nos Exemplos). Foram coletados 2 ml do sobrenadante com uma seringa de 10 ml e filtrados utilizando filtros de 0,2 M (Minisart Syringe Filters, Sartorius, Alemanha) e coletados em um tubo Eppendorf de 2 ml. A preparação esterilizada restante é mantida a -20 °C para uso posterior.

[0100] As amostras assim obtidas serão chamadas também de “amostras processadas” e serão identificadas com o mesmo nome ou código dado à composição herbácea correspondente (por exemplo, o nome “Mix[2P]-1” será usado para identificar uma composição herbácea e o extrato correspondente (ou amostra processada), para o qual uma atividade biológica é determinada).

MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME (MÉTODO C)

[0101] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada utilizando as cepas indicadas em cada experiência (ou Exemplo). Para cada medição, cada bactéria armazenada a -80 °C em crioesferas (Technical Service, Reino Unido) é plaqueada em uma placa de ágar TS (Tryptic Soy Broth, Sigma, EUA; Agar, Fisherbrand, EUA) e incubada a 37 °C de um dia para o outro. Várias colônias são coletadas usando uma alça de inoculação e suspensas em solução salina. A densidade óptica é medida e uma diluição é realizada em caldo TS para obter uma concentração de 2,105,5 bactérias/ml para as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus pseudintermedius, 2,105 bactérias/ml para Staphylococcus epidermidis.

[0102] A atividade biológica de cada amostra processada foi medida em placas de 96 poços, utilizando as cepas indicadas em cada experiência (ou Exemplo) e um controle sem bactérias. Cada poço contém 190 μl de caldo TS inoculado com 105’5 bactérias/ml de Staphylococcus aureus e Staphylococcus cepas pseudintermedius, 105 bactérias/ml para Staphylococcus epidermidis (ou na concentração indicada nos Exemplos para todas as outras espécies) ou nenhuma bactéria para o controle e amostra processada diluída ou controle negativo (solução de sacarose a 100 g/l sem nenhuma planta) a concentração final de 1:10’ 1:20’ 1:40 e 1:80 ou de 1:20’ 1:63 e 1:200 (como indicado nos exemplos).

[0103] Cada placa foi incubada durante 17 horas a 37 °C em uma incubadora (HettCube 400, Hettich, Alemanha).

[0104] As medições foram realizadas com base na análise com o software ImageJ (NIH, EUA) (mas qualquer outro software equivalente pode ser utilizado) das imagens das placas obtidas usando um scanner de documentos comerciais (V 220, Epson, Japão). Imagens da placa posicionada na área de digitalização são adquiridas a 600 dpi usando o software dotado do scanner. Para cada placa, 3 imagens foram obtidas: a primeira, antes da incubação (T0), a segunda após 17 h de incubação (Tf) e a terceira após a coloração com Crystal Violet (CV) conforme descrito em Otimização do ensaio de placa de microtitulação para o teste de capacidade de formação de biofilme em diferentes serotipos de Salmonella (Agarwal, R.K. et al., International Food Research Journal 18(4):1493 a 1498, 2011).

[0105] Para cada poço de interesse, respectivamente da primeira, segunda e terceira imagem, regiões circulares de diâmetro, respectivamente, 14, 14 e 76 pixels, centralizadas em relação ao poço, foram caracterizadas usando um macro ImageJ para calcular, respectivamente, a média M1 e M2 dos pixels menos intensos de 1% da região e a média M3 de todos os pixels da região. A turbidez da solução bacteriana no poço foi deduzida de M1 e M2 usando uma curva de referência obtida em um experimento independente onde a média dos pixels menos intensos de 1% da região e da região de diâmetro de 14 pixels foi medida a partir de poços contendo soluções bacterianas de turbidez conhecida. A densidade óptica da solução de Crystal Violet no poço foi deduzida de M3 usando uma curva de referência obtida em um experimento independente onde a média dos pixels da região de diâmetro de 76 pixels foi medida a partir de poços contendo soluções Crystal Violet de densidade óptica conhecida.

[0106] Para cada amostra processada e uma determinada bactéria, a MIC foi determinada a partir da maior diluição inibitória (HID) dentre as 4 amostras testadas (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) que impedem o aparecimento de crescimento visível dentro de 17 h. "0" foi atribuído quando nenhuma das diluições testadas estava impedindo o crescimento bacteriano.

[0107] Para cada poço contendo amostra processada e uma determinada bactéria, a porcentagem de inibição do crescimento planctônico de bactérias foi estabelecida de acordo com a fórmula abaixo:

[0108] onde Tf (amostra processada) é a turbidez da segunda imagem do poço da amostra, T0 (amostra processada) é a turbidez da primeira imagem do mesmo poço, Tf (controle negativo) é a turbidez da segunda imagem de um poço contendo as mesmas bactérias sem amostra processada, T0 (controle negativo) é a turbidez da primeira imagem do mesmo poço.

[0109] Para cada poço contendo amostra processada e uma determinada bactéria, a porcentagem de inibição da formação de biofilme (IBF) foi estabelecida de acordo com a seguinte fórmula:

[0110] onde CV (amostra processada) é o OD da terceira imagem do poço de amostra, CV (controle negativo) é o OD da terceira imagem de um poço contendo a mesma bactéria sem amostra processada, CV (amostra de controle) é o OD de a terceira imagem de um poço contendo a mesma amostra ou o controle negativo na mesma diluição sem nenhuma bactéria. Um valor negativo de IBF significa que a mistura testada está promovendo a formação de biofilme.

EXEMPLO 1

[0111] Nesse exemplo ilustramos atividades antimicrobianas e antibiofilme simultâneas contra Staphylococcus aureus da composição divulgada de 2 plantas entre 3: Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uva-ursi'. As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0112] Partindo de tais três pós vegetais diferentes, prepararam-se seis composições herbáceas, de acordo com o Método A relatado anteriormente, cujo conteúdo é relatado na Tabela 1-1.TABELA 1-1: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0113] Como se mostra na Tabela 1-1, as primeiras três composições herbáceas contêm apenas um único pó vegetal, enquanto as últimas três composições contêm dois dos três pós vegetais diferentes.

[0114] A partir de cada composição herbácea relatada na Tabela 1-1, amostras processadas correspondentes foram preparadas de acordo com o Método B relatado antes da utilização de 20 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de centrifugação antes da filtração.

[0115] O crescimento planctônico de bactérias e a porcentagem de inibição da formação de antibiofilme das amostras processadas das 2 misturas de plantas e as plantas separadas associadas deste Exemplo 1 na diluição de 1:10 foram determinadas usando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923 e ATCC 29213, de acordo com o Método C relatado anteriormente e são apresentadas na Tabela 1-2.TABELA 1-2: CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME (IBF) DE 2 AMOSTRAS PROCESSADAS DE MISTURAS DE PLANTAS E ÚNICA AMOSTRA PROCESSADA DE PLANTAS EM DILUIÇÃO DE 1:10

[0116] PA13, PA21 e PB12 têm um efeito antibiótico conhecido. A inibição limitada do crescimento planctônico (< 27%) e a formação de biofilme (< 51%) foram medidas na diluição de 1:10, enquanto que as 3 preparações aromáticas de 2 extratos de mistura de planta mostram efeitos antimicrobianos (> 66%) e antibiofilmes (> 78%) em ambas as cepas testadas, ATCC 25923 e ATCC 29213.

[0117] Para todas as Misturas (Mix[2P]-1, Mix[2P]-2, Mix[2P]-3), um efeito sinérgico das 2 plantas é observado para efeitos antimicrobianos nas 2 cepas testadas.

EXEMPLO COMPARATIVO 1

[0118] Como um exemplo comparativo, ilustra-se a atividade de algumas amostras processadas, que se verificou terem atividades antimicrobianas e antibiofilme nulas ou fracas contra Staphylococcus aureus e que foram obtidas a partir de composições herbáceas correspondentes contendo 2 pós de plantas diferentes.

[0119] Cinco amostras processadas foram preparadas usando 2 pós de plantas adicionais: PA74 (pó de frutos de Ribes nigrum) e PC72 (pó de flores de Cochlearia officinalis).

[0120] Os pós de plantas secas individuais foram tratados como descrito no Exemplo 1 e cinco composições herbáceas foram preparadas seguindo o protocolo descrito no Método A descrito anteriormente. Essas cinco composições herbáceas tinham o conteúdo relatado na Tabela 1-3.TABELA 1-3: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0121] Cada composição herbácea foi tratada seguindo o protocolo descrito no Método B para chegar à amostra processada correspondente utilizando 20 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de centrifugação antes da filtração.

[0122] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923 e ATCC 29213, de acordo com o Método C descrito anteriormente.

[0123] O crescimento bacteriano planctônico e a porcentagem de inibição da formação de antibiofilme das amostras processadas das 2 misturas de plantas e as plantas separadas associadas na diluição de 1:10 são dadas na Tabela 1-4.TABELA 1-4: CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME (IBF) DE AMOSTRAS PROCESSADAS DE 2 MISTURAS DE PLANTAS E AMOSTRA PROCESSADA DE PLANTA ÚNICA EM DILUIÇÃO DE 1:10

[0124] PC72 e PA74 e a Mistura 1 associada não mostraram atividade antimicrobiana e atividade antibiofilme limitada em ambas as cepas testadas na diluição de 1:10. Em cada caso, nenhum efeito sinérgico foi observado.

[0125] Para todas as misturas contendo PA13 e PA21 (Misturas 2 e 3), nenhum efeito sinérgico foi observado para os efeitos antimicrobianos nas duas cepas testadas na diluição 1:10, quando tais misturas continham também PC72 ou PA74.

[0126] É interessante notar que tanto Ribes nigrum quanto Cochlearia officinalis eram conhecidas por terem efeito antimicrobiano.

[0127] Este exemplo comparativo ilustra que nem qualquer combinação aleatória entre plantas secas individuais possuindo atividade antimicrobiana e/ou antibiofilme conhecida permite obter um extrato de água, no qual se observa uma atividade sinérgica.

EXEMPLO 2

[0128] Neste exemplo, ilustramos atividades simultâneas antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus de diferentes extratos de água obtidos a partir de composições de plantas contendo 2 plantas entre as 3 descritas no Exemplo 1, quando tais extratos de água são preparados de acordo com diferentes métodos.

[0129] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0130] Vinte composições herbáceas, cujo conteúdo é relatado na Tabela 2-1, foram preparadas de acordo com o Método A relatado anteriormente.TABELA 2-1: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0131] Para cada composição herbácea, 20 preparações líquidas (água) foram preparadas da seguinte forma:

[0132] Os pós coletados foram colocados em vinte tubos de falcon de 50 ml (Falcon, EUA). Foram adicionados 20 ml de solução de água de nascente em grau alimentício (Volvic, França) contendo 0, 25, 50, 75 ou 100 g/l de sacarose em grau alimentício (Daddy, França) a 4 tubos de falcon por condição. Cada tubo de falcon contendo tais preparações líquidas foi agitado usando um misturador de vórtice (ThermoFisher, EUA) por 10 segundos, incubado à temperatura ambiente por 10 minutos, então 4 diferentes tratamentos de aquecimento foram aplicados a cada condição:

- INFUSÃO A FRIO (SEM AQUECIMENTO ANTES DA CENTRIFUGAÇÃO E FILTRAÇÃO):

[0133] Após incubação à temperatura ambiente, as preparações foram centrifugadas a 4.000 rpm durante 10 minutos (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemanha), 2 ml do sobrenadante foram coletados com uma seringa de 10 ml e filtrados usando filtros de 0,2 μM (Minisart Syringe Filters, Sartorius, Alemanha) e coletados em um tubo Eppendorf de 2 ml e mantidos a -20 °C até à utilização. No dia da manipulação, a preparação foi descongelada a 37 °C.

- AQUECIMENTO A 60 °C POR 30 MINUTOS:

[0134] Após a incubação à temperatura ambiente, as preparações foram colocadas em autoclave (VWR, USA) e submetidas a um ciclo de 20 minutos a 60 °C. Após o resfriamento, as preparações tratadas foram centrifugadas a 4.000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemanha), 2 ml do sobrenadante foram coletados com uma seringa de 10 ml e filtrados com filtros de 0,2 μM (Minisart Syringe Filters, Sartorius, Alemanha) e coletados em um tubo Eppendorf de 2 ml e mantidos a -20 °C até serem utilizados. No dia da manipulação, a preparação foi descongelada a 37 °C.

- AQUECIMENTO A 119 °C POR 20 MINUTOS:

[0135] Após a incubação à temperatura ambiente, as preparações foram colocadas em um autoclave (VWR, EUA) e submetidas a um ciclo de esterilização de 20 minutos a 119 °C. Após arrefecimento, as preparações tratadas foram mantidas a -20 °C até serem utilizadas. No dia da manipulação, a preparação foi descongelada a 37 °C, centrifugada a 4.000 rpm durante 10 min (Multifuge 35-R, Heraeus, Alemanha), 1 ml do sobrenadante foi coletado com uma seringa de 10 ml e filtrado com filtros de 0,2 μM (Minisart Syringe Filters, Sartorius, Alemanha) e coletados em um tubo Eppendorf de 2 ml.

[0136] Essas amostras serão chamadas de “amostra processada”.

[0137] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada usando Staphylococcus aureus cepa ATCC 25923, de acordo com o método descrito anteriormente.

[0138] A percentagem de crescimento planctónico de bactérias de 20 amostras processadas, preparadas a partir das composições herbáceas após cada um dos diferentes tratamentos de aquecimento apresentados antes, com uma diluição de 1:10, é apresentada na Tabela 2-2.TABELA 2-2: CRESCIMENTO PLANCTÔNICO DE ATCC 25923 COM 20 AMOSTRAS PROCESSADAS A UMA DILUIÇÃO DE 1:10 PREPARADAS A PARTIR DAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS (MISTURA 1 E MISTURA 2 DA TABELA 2-1)

[0139] Todas as amostras processadas da Mistura 1 apresentaram efeitos antimicrobianos na ATCC 25923, somente após tratamento térmico a 119 °C, enquanto a Mistura 2 mostrou efeitos antimicrobianos limitados (31 a 52% de inibição) após infusão a frio para toda a concentração de sacarose, exceto para a condição sem sacarose e após todos os tratamentos de temperatura testados (> 82% de inibição) exceto para a condição sem adição de sacarose tratada a 60 °C, para a qual a amostra processada mostrou apenas 16% de inibição do crescimento planctônico. Os tratamentos de temperatura aumentaram os efeitos antimicrobianos da Mistura 2. O tratamento de temperatura ideal entre os tratamentos testados para a Mistura 1 e Mistura 2 foi de 119 °C durante 20 minutos.

[0140] A influência da concentração de sacarose no efeito antimicrobiano depende do tratamento térmico aplicado. Para a mistura 1 tratada a 119 °C durante 20 min, o mesmo efeito antimicrobiano foi obtido com 100, 75, 25 e 0 g/l de sacarose, menor atividade foi observada com 50 g/l. Para a Mistura 2, o mesmo efeito antimicrobiano foi obtido independentemente da concentração de sacarose para tratamento com temperatura de 119 °C.

[0141] A percentagem de inibição da formação de biofilme (IBF) de 20 amostras processadas, preparadas a partir das composições herbáceas após cada um dos diferentes tratamentos de aquecimento apresentados anteriormente, à diluição de 1:10, é dada na Tabela 2-3.TABELA 2-3: INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME (IBF) DE ATCC 25923 COM 20 AMOSTRAS PROCESSADAS A UMA DILUIÇÃO DE 1:10 PREPARADA A PARTIR DAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS (MISTURA 1 E MISTURA 2 DA TABELA 2-1)

[0142] Em todas as condições testadas, amostras processadas mostraram algum efeito antibiofilme.

[0143] Para a Mistura 1, foi observada atividade antibiofilme limitada para todas as concentrações de sacarose com infusão a frio e com tratamento com temperatura de 60 °C (22 a 55% de inibição). Alta atividade antibiofilme (> 90% de inibição) foi observada com tratamento de temperatura a 119 °C para todas as concentrações de sacarose, exceto para 50 g/l, que mostrou 75% de inibição.

[0144] Para a Mistura 2, atividades antibiofilme equivalentes foram obtidas independentemente das concentrações de sacarose para tratamentos de temperatura a 60 °C e 119 °C (> 77% de inibição). Após a infusão a frio, a Mistura 2 apresentou um efeito antibiofilme médio a bom (de 50% a 74% de inibição) dependendo das concentrações de sacarose: quanto maior a concentração de sacarose, mais ativa estava a preparação.

EXEMPLO 3

[0145] Neste exemplo ilustramos atividades simultâneas antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis de 12 misturas contendo 2 a 7 plantas.

[0146] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0147] Prepararam-se composições herbáceas compreendendo de 2 a 7 pós de plantas coletando-se um volume fixo de pó de plantas com uma colher calibrada permitindo coletar 200 μl de pó.

[0148] Prepararam-se doze composições herbáceas como se segue (Tabela 3-1) de acordo com o Método A descrito anteriormente.TABELA 3-1: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0149] Doze amostras processadas correspondentes foram preparadas a partir de cada composição herbácea de acordo com o Método B descrito anteriormente, utilizando 20 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de centrifugação antes da filtração.

[0150] A atividade biológica da amostra processada foi determinada utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 29213, NCTC 12493, ATCC 33591, ATCC 33592, ATCC 43300, ATCC 700698, ATCC 700699, ATCC 9144 e ATCC BAA-44 e as seguintes cepas de Staphylococcus epidermidis: ATCC 12228, ATCC 700296, ATCC 49461 e ATCC 14990, de acordo com o Método C descrito anteriormente.

[0151] A concentração inibitória mínima (MIC) observada com as 12 amostras processadas é dada na Tabela 3-2 na forma de HID, bem como a eficácia média sobre todas as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.TABELA 3-2: HID DAS 12 AMOSTRAS PROCESSADAS EM 10 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS E 4 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

[0152] Visto que nesse exemplo observou-se que HID está na maioria dos casos entre 1:10 e 1:20, a diluição de 1:20 foi escolhida como a diluição de referência para o cálculo da percentagem de inibição do crescimento planctônico de bactérias e percentagem de inibição da formação de biofilme. A percentagem de inibição do crescimento planctônico bacteriano das 12 amostras processadas na diluição de 1:20 é dada na Tabela 3-3, bem como a eficácia média sobre todas as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.TABELA 3-3: INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO DAS 12 AMOSTRAS PROCESSADAS EM 10 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS E 4 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS NA . DILUIÇÃO DE 1:20

[0153] A porcentagem de inibição da formação de biofilme (IBF) das 12 amostras processadas na diluição de 1:20 é dada na Tabela 3-4, bem como a eficácia média sobre todas as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. A eficácia média da inibição do crescimento planctônico bacteriano e da porcentagem de inibição da formação de biofilme sobre todas as cepas testadas é um bom indicador da eficácia antimicrobiana e antibiofilme em diferentes cepas bacterianas.TABELA 3-4: INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME (IBF) DAS 12 AMOSTRAS PROCESSADAS EM 10 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS E 4 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS NA DILUIÇÃO DE 1:20

[0154] Extratos de mistura de 2 plantas mostraram atividade antimicrobiana total na diluição de 1:10 nas 10 cepas de Staphylococcus aureus testadas, exceto pelo Mix[2P]-3 que não apresentou antimicrobiano na diluição testada em 2 das 10 cepas de Staphylococcus aureus testadas (ATCC 29213 e ATCC 43300) (ver Tabela 3-2).

[0155] Os três extratos das misturas de 2 plantas mostraram diferentes atividades antimicrobianas nas 4 cepas de Staphylococcus epidermidis testadas. A Mix[2P]-1 teve um HID de 1:10 em 3 cepas (ATCC 12228, ATCC 49461 e ATCC 14990) e um HID de 1:20 na cepa ATCC 700296. A Mix[2P]-2 teve um HID de 1:10 em 2 cepas (ATCC 12228 e ATCC 49461) e um HID de 1:20 nas outras 2 cepas (ATCC 700296 e ATCC 14990). Enquanto a Mix[2P]-3 tinha um HID de 1:10 em 2 cepas (ATCC 12228 e ATCC 14990) e um HID de 1:20 nas outras 2 cepas (ATCC 700296 e ATCC 49461) (ver Tabela 3-2).

[0156] A Mix[3P]-1 obtida das 3 plantas que estão incluídas em Mix[2P]-1, Mix[2P]- 2 e Mix[2P]-3, mostrou uma atividade antimicrobiana mais ampla do que as 3 misturas de duas plantas (HID de 1:10 em 9 cepas de Staphylococcus aureus e HID de 1:20 em ATCC 700699, HID de 1:20 em 4 Staphylococcus epidermidis testadas) (ver Tabela 3-2). O ganho de atividade antimicrobiana é confirmado pelo cálculo da porcentagem de inibição do crescimento planctônico de cada mistura de plantas (ver Tabela 3-3).

[0157] 3 plantas diferentes, PA11, PA12 e PA22, foram adicionadas à mistura de 3 plantas Mix[3P]-1 para obter três extratos de 4 misturas de plantas, Mix[4P]-1, Mix[4P]-2 e Mix[4P]-3, respectivamente. Esses extratos de misturas de 4 plantas mostraram o mesmo HID ou HID melhor do que o extrato da mistura de 3 plantas Mix[3P]-1 (ver Tabela 3-2), e maior percentagem de inibição de crescimento planctônico: uma média de 28% a 45% é obtida com extratos de misturas de 4 plantas nas 10 cepas de Staphylococcus aureus em comparação a 23% com o extrato da mistura de 3 plantas (ver Tabela 3-3). Eles também demonstraram percentagem de inibição de formação de biofilme superior: uma média de 34% a 42% é obtida com extratos de misturas de 4 plantas nas 10 cepas de Staphylococcus aureus em comparação a 25% com o extrato de mistura 3 plantas (ver Tabela 3-4).

[0158] Prepararam-se misturas de 5 plantas adicionando-se 2 plantas entre as 3 plantas adicionais selecionadas. Todos os três extratos de misturas de 5 plantas apresentaram maior atividade antimicrobiana e antibiofilme do que os extratos de misturas de 4 plantas (ver Tabelas 3-2, 3-3 e 3-4).

[0159] Mix[6P]-1 consiste nas 6 plantas que foram usadas para a preparação das amostras processadas previamente testadas. Curiosamente, o extrato da mistura de 6 plantas mostrou menor atividade antimicrobiana e antibiofilme do que os extratos de misturas de 5 plantas, mas um efeito antimicrobiano maior e maior para efeitos antibiofilmes equivalentes do que os extratos de misturas de 4 plantas. A atividade antimicrobiana e antibiofilme foi recuperada e aumentada pela adição de uma nova planta (PA79) (ver Tabelas 3-2, 3-3 e 3-4).

[0160] O aumento do número de plantas nas misturas permitiu preparar extratos aquosos correspondentes com atividade antimicrobiana e antibiofilme aumentada e aumentou o número de cepas, nas quais uma ou ambas as atividades podem ser identificadas.

EXEMPLO 4

[0161] Neste exemplo ilustramos atividades simultâneas antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus de 196 extratos de água obtidos a partir de composições herbáceas incluindo pelo menos 2 plantas entre as 3 plantas descritas no Exemplo 1 e plantas adicionais para formar misturas de 3 a 10 plantas.

[0162] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont-Ferrand, França, plantas PA00 a PB12) e “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França, plantas PB13 a PD08).

[0163] As 4 composições herbáceas de referência Mix[2P]-1, Mix[2P]-2, Mix[2P]- 3, Mix[3P]-1 e as 196 novas composições herbáceas foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente e tiveram a conteúdo relatado na Lista 4-1.LISTA 4-1: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0164] Os extratos aquosos correspondentes (ou amostras processadas) dessas composições herbáceas foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente, utilizando 20 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de centrifugação antes da filtração.

[0165] A atividade biológica da amostra processada foi determinada utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus : ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 e ATCC 14775, com as seguintes diluições finais de amostras processadas: 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80 para amostras processadas contendo menos de 10 colheres de pó vegetal (M[2P] a M[9P]) ou 1:20, 1:63 e 1:200 para amostras processadas contendo 10 colheres de pó de plantas (M[10P]), de acordo com o Método C descrito anteriormente.

[0166] A percentagem de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a percentagem de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das 2 plantas de Mix[2P]-1 à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 4-1.TABELA 4-1: MÉDIA DA EFICÁCIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-1 NA DILUIÇÃO DE 1:20

[0167] 20 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 5 ou 10 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato de mistura de referência Mix[2P]-1 (Tabela 4-1 A). Quatro extratos de misturas de 10 plantas foram encontrados tendo maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 4-1 B). Cinco amostras processadas contendo 3, 4 ou 10 plantas apresentaram maior atividade antimicrobiana e atividade antibiofilme equivalente ou menor (Tabela 4-1 C).

[0168] A média percentual de inibição do crescimento planctônico de bactérias e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas de composições herbáceas contendo as 2 plantas de Mix[2P]-2 em diluição de 1:20 são dadas na Tabela 4-2.TABELA 4-2: MÉDIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-2 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIBIOFILME E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EQUIVALENTE OU MENOR. (C) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE A NTIBIOFILME EQUIVALE NTE OU MENOR.

[0169] Verificou-se que 33 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 3, 5, 9 ou 10 plantas tinham maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato da mistura de referência Mix[2P]-2 (Tabela 4-2 A). Seis extratos de misturas de 10 plantas foram encontrados como tendo maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 4-2 B). Um extrato da mistura de 4 plantas foi encontrado como tendo maior atividade antimicrobiana e atividade antibiofilme equivalente (Tabela 4-2 C).

[0170] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em relação a todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo as 2 plantas de Mix[2P]-3 em diluição de 1:20 são dadas na Tabela 4-3.TABELA 4-3: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-3 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR.

[0171] Verificou-se que 23 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 3, 5, 9 ou 10 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato de mistura de referência Mix[2P]-3 (Tabela 4-3 A). Quatro amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 3, 4 ou 10 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 4-3 B).

[0172] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em relação a todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo as 3 plantas de Mix[3P]-1 em diluição de 1:20 são dadas na Tabela 4-4.TABELA 4-4: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[3P]-1 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIBIOFILME E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EQUIVALENTE OU MENOR. (C) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR.

[0173] Verificou-se que 80 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 4, 5, 6, 7, 9 ou 10 plantas tinham maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato da mistura de referência Mix[3P]-1 (Tabela 4-4 A).Verificou-se que 18 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 3, 4 ou 10 plantas tinham maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 4-4 B). Duas amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas de 4 e 10 plantas apresentaram maior atividade antimicrobiana e atividade antibiofilme equivalente (Tabela 4-4 C).

EXEMPLO COMPARATIVO 2

[0174] Como exemplo comparativo, ilustramos vários extratos de misturas de 3 ou 10 plantas obtidos a partir de composições herbáceas contendo apenas uma planta entre as 3 plantas do Exemplo 1 (PA13, PA21, PB12), que se verificou não ter nenhuma ou fraca atividade antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus.

[0175] Dez composições herbáceas, cujo conteúdo é relatado na Lista 4-8, foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.LISTA 4-8: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

PC61;

[0176] Dez extratos de água (ou amostras processadas) foram preparados a partir das composições herbáceas correspondentes.

[0177] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas para essas amostras processadas em diluição de 1:20 foram determinadas de acordo com o Método C anteriormente relatado e são apresentadas na Tabela 4-5.TABELA 4-5: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E EFICÁCIA DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DAS AMOSTRAS PR OCESSADAS A UMA DILUIÇÃO DE 1:20.

[0178] Todas as amostras processadas testadas, obtidas a partir de composições herbáceas compostas por 3 ou 10 plantas, que incluíam uma planta entre as 3 plantas do Exemplo 1 (PA13, PA21, PB12), apresentaram menor atividade antimicrobiana do que os três extratos de misturas de 2 plantas de referência Mix[2P]-1 (obtido de PA13 e PA21), Mix[2P]-2 (obtida de PA21 e PB12) e Mix[2P]-3 (obtida de PA13 e PB12) e menor atividade antibiofilme do que Mix [2P]-1 e Mix[2P]-3.

EXEMPLO 5

[0179] Neste Exemplo, ilustramos atividades antimicrobianas e antibiofilme simultâneas contra Staphylococcus aureus de 390 extratos de misturas obtidos a partir de composições herbáceas incluindo pelo menos 2 plantas entre as 3 plantas descritas no Exemplo 1 (ver Tabela 1-1) e plantas adicionais para montar misturas de 9 a 20 plantas.

[0180] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont-Ferrand, França, plantas PA00 a PB12) e “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França, plantas PB13 a PD02).

[0181] As composições herbáceas contendo de 9 a 20 pós de plantas foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.

[0182] As 4 composições herbáceas de referência Mix[2P]-1, Mix[2P]-2, Mix[2P]- 3, Mix[3P]-1 e 390 novas composições herbáceas foram preparadas tendo o conteúdo mostrado abaixo (Lista 5-3). LISTA 5-3: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0183] Nota: se, nas listas anteriores e nas seguintes listas análogas, um código de planta ocorre mais de uma vez na mesma composição herbácea, significa que mais de uma colher calibrada da planta seca moída correspondente foi usada.

[0184] Partindo das composições herbáceas listadas na Lista 6-3, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente usando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0185] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 e ATCC 14775, com as seguintes diluições finais de amostras processadas: 1:20, 1:63 e 1:200.

[0186] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das composições herbáceas incluindo as 2 plantas de Mix[2P]-1 à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 5-1.TABELA 5-1: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-1 À DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIBIOFILME E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EQUIVALENTE OU MENOR. (C) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR

[0187] 20 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 9, 18, 19 ou 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato de mistura de referência Mix[2P]-1 (Tabela 5-1 A). Quatorze extratos de misturas de 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 5-1 B). Duas amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 17 e 18 plantas apresentaram maior atividade antimicrobiana e atividade antibiofilme equivalente ou menor (Tabela 5-1 C).

[0188] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das composições herbáceas incluindo as 2 plantas de Mix[2P]-2 à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 5-2.TABELA 5-2: MÉDIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-2 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR.

[0189] 58 amostras processadas obtidas a partir de composições de plantas contendo 9, 16, 17, 18, 19 ou 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e antimicrobiana do que o extrato de mistura de referência Mix[2P]-2 (Tabela 5-2 A). 25 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 16, 17, 19 ou 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 5-2 B).

[0190] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das composições herbáceas incluindo as 2 plantas de Mix[2P]-3 à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 5-3.TABELA 5-3: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[2P]-3 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR.

[0191] Verificou-se que 70 amostras processadas obtidas a partir de composições de plantas contendo 9, 19 ou 20 plantas tinham atividade antimicrobiana e antibiofilme mais elevada do que o extrato de mistura de referência Mix[2P]-3 (Tabela 5-3 A). 37 amostras processadas contendo 18 a 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 5-3 B).

[0192] A média percentual de inibição do crescimento planctônico bacteriano e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das composições herbáceas incluindo as 3 plantas de Mix[3P]-1 à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 5-4.TABELA 5-4: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NA MIX[3P]-1 EM DILUIÇÃO DE 1:20. (A) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO MAIOR ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME. (B) EXTRATOS DE MISTURA MOSTRANDO ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ATIVIDADE ANTIBIOFILME EQUIVALENTE OU MENOR.

[0193] 51 amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 9, 16, 17, 18, 19 ou 20 plantas apresentaram maior atividade antimicrobiana e antibiofilme do que o extrato de mistura de referência Mix[3P]-1 (Tabela 5-4 A). 113 amostras processadas contendo 9 a 20 plantas apresentaram maior atividade antibiofilme e atividade antimicrobiana equivalente ou menor (Tabela 5-4 B).

EXEMPLO COMPARATIVO 3

[0194] Como exemplo comparativo, relatamos vários extratos de misturas de 20 plantas contendo apenas uma planta entre as 3 plantas do Exemplo 1 (PA13, PA21, PB12), as quais foram encontradas como tendo nenhuma ou pouca atividade antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus.

[0195] Dez composições herbáceas tendo o conteúdo relatado na Lista 5-8 foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.LISTA 5-8: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0196] Dez extratos de água (ou amostras processadas) foram preparados a partir das composições herbáceas correspondentes de acordo com o Método B descrito anteriormente utilizando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0197] Para cada amostra processada, a atividade biológica foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente, com as seguintes diluições finais de amostras processadas: 1:20, 1:63 e 1:200.

[0198] A média percentual de inibição do crescimento planctônico de bactérias e a média percentual de inibição da formação de biofilme em todas as cepas testadas das amostras processadas à diluição de 1:20 são dadas na Tabela 5-5.TABELA 5-5: MÉDIA DA EFICÁCIA DE PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E EFICÁCIA DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DAS AMOSTRAS PROCESSADAS A UMA DILUIÇÃO DE 1:20.

[0199] Todas as amostras processadas obtidas a partir de composições herbáceas contendo 20 plantas incluindo apenas uma planta entre as 3 plantas do Exemplo 1 (PA13, PA21, PB12) apresentaram menor atividade antimicrobiana do que os três extratos de misturas de 2 plantas de referência Mix[2P]-1 (obtida de PA13 e PA21), Mix[2P]-2 (obtida de PA21 e PB12) e Mix[2P]-3 (obtida de PA13 e PB12) e menor atividade antibiofilme do que Mix[2P]-1 e Mix [2P]-3.

EXEMPLO 6

[0200] Neste exemplo, relatamos as atividades simultâneas antimicrobiana e antibiofilme contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus pseudintermedius de 2 amostras processadas escolhidas entre as melhores misturas descritas nos Exemplos 4 e 5.

[0201] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont-Ferrand, França) e “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França).

[0202] Duas preparações herbáceas contendo os pós de plantas secas, relatadas na Tabela 6-1 abaixo, foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.TABELA 6-1

[0203] Partindo de tais composições herbáceas, 2 extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente usando 40 ml para M[20P]-576 e 20 ml para M[10P]- 154 de água contendo 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de centrifugação antes da filtração.

[0204] A atividade biológica das amostras processadas foi determinada de acordo com o método C descrito anteriormente, utilizando as seguintes cepas:

[0205] - Cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213, ATCC 14775, NCTC 12493, ATCC 33591, ATCC 33592, ATCC 43300, ATCC 700698, ATCC 700699, ATCC 9144 e ATCC BAA-44

[0206] - Cepas de Staphylococcus epidermidis: ATCC 14990, ATCC 12228, ATCC 700296, ATCC 49134 e ATCC 49461

[0207] - Cepa de Staphylococcus pseudintermedius: ATCC 49444

[0208] A concentração inibitória mínima (MIC) observada com as 2 amostras processadas é dada na Tabela 6-2 na forma de HID, bem como a eficácia média sobre todas as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.TABELA 6-2: HID DAS 2 AMOSTRAS PROCESSADAS EM 14 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, 5 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS E 1 CEPA DE STAPHYLOCOCCUS PSEUDINTERMEDIUS

[0209] M[10P]-154 e M[20P]-576 mostraram atividade antimicrobiana total em todos os Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis testados. M[10P]-154 apresentou atividade antimicrobiana total a 1:80 em 1 cepa de Staphylococcus epidermidis, em 1:40 em 4 cepas de Staphylococcus aureus, 4 Staphylococcus epidermidis e a cepa testada de Staphylococcus pseudintermedius, em 1:20 em 9 cepas de Staphylococcus aureus, e em 1:10 em 1 cepa de Staphylococcus aureus.

[0210] M[20P]-576 apresentou atividade antimicrobiana total a 1:80 em 1 cepa de Staphylococcus epidermidis, em 1:40 em 6 cepas de Staphylococcus aureus e na cepa testada de Staphylococcus pseudintermedius, em 1:20 em 7 cepas de Staphylococcus aureus e 4 Staphylococcus epidermidis e em 1:10 em 1 cepa de Staphylococcus aureus.

[0211] A percentagem de inibição do crescimento planctônico de bactérias e a porcentagem de inibição da formação de biofilme (IBF) das 2 amostras processadas na diluição de 1:20 são dadas na Tabela 6-3, bem como a eficácia média sobre todas as cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.TABELA 6-3: INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME (IBF) DAS 2 AMOSTRAS PROCESSADAS EM 14 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, 5 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS E 1 CEPA DE STAPHYLOCOCCUS PSEUDINTERMEDIUS EM DILUIÇÃO DE 1:20

[0212] Na diluição de 1:20, M[10P]-154 apresentou uma média de 88% de inibição da formação de biofilme em todas as cepas de Staphylococcus aureus testadas, enquanto M[20P]-576 apresentou uma média de 90%. As duas misturas apresentaram menor atividade antimicrobiana em uma cepa: ATCC 6538 (45% para M[10P]-154, 60% para M[20P]-576). M[10P]-154 apresentou uma média de 91% de inibição do crescimento planctônico em todas as cepas de Staphylococcus epidermidis testadas, enquanto M[20P]-576 apresentou uma média de 88%. (ver Tabela 6-3). As duas misturas apresentaram mais, respectivamente, 95% (M[10P]-154) e 93% (M[20P]- 576) de porcentagem de inibição no Staphylococcus pseudintermedius testado. Assim, M[10P]-154 e M[20P]-576 demonstraram atividade antibiofilme em Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus pseudintermedius na diluição de 1:20.

EXEMPLO 7

[0213] A solução de Mix[20C]-576 (descrita no Exemplo 6) utilizada para as formulações seguintes foi preparada de acordo com os Métodos A e B descritos anteriormente, com a exceção da etapa de filtração, que neste Exemplo é realizada por filtração por sucção com um funil Büchner preenchido com uma camada de algodão hidrofílico de 5 cm de espessura. Para maior clareza, esta solução filtrada de algodão será referida como SK576 no exemplo seguinte.

[0214] Um unguento e dois cremes a serem utilizados para aplicações tópicas foram preparados com um método de emulsificação como se segue:

[0215] - Fase A e Fase B foram preparadas misturando com agitação orbital em duas provetas separadas os seguintes ingred ientes:

[0216] - As duas provetas foram aquecidas a 70 °C utilizando um banho de água morna e mantidos a 70 °C durante 10 min para evitar a cristalização da cera de abelha.

[0217] - A fase B foi então lentamente vertida na Fase A, mantendo a proveta no banho de água quente e com agitação constante através de um misturador mecânico de imersão (Moulinex “Infinyforce_hand blender”, França).

[0218] - A proveta contendo a mistura de fase A e B foi então removida do banho quente e o unguento foi formado usando um “misturador de maionese” de imersão (Moulinex “Infinyforce_hand blender”, França).

[0219] Um gel a ser usado para aplicações tópicas foi preparado por

[0220] - Filtração de 20,6 g de SK576, em um filtro de seringa hidrofílico (0,22 μm).

[0221] - Adição de 0,75 g de pó de Xanthan (Hyteck “Aroma ZoneTM”, França) e 0,25 g de ácido ascórbico (Hyteck “Aroma ZoneTM”, França) à solução filtrada e mistura com uma espátula por 5 a 10 min, de modo a ser formado.

[0222] Uma solução para pulverização a ser usada para aplicações tópicas foi preparada por:

[0223] - Mistura de 5,5 g de SK576 com 11,9 g de etanol absoluto (Sigma-Aldrich,França) em uma proveta de 20 ml que foram armazenados em um refrigerador a 5 °C por 3 h.

[0224] - Colocar a proveta com a mistura fria em um banho de água gelada e adicionar suavemente 0,7 g de Kolliphor® P-407 (Sigma-Aldrich, França) sob agitação com uma barra magnética e agitador.

[0225] - Após 30 min de agitação sob banho de água gelada, a solução foi colocada em um pulverizador de reagente (CAMAG, Suíça) para administração.

[0226] O protocolo de cada uma dessas cinco preparações pode ser facilmente escalado para diferentes volumes de preparação, mantendo a mesma quantidade relativa de cada ingrediente.

EXEMPLO 8 ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UM EXTRATO DE ÁGUA DA INVENÇÃO EM UM MODELO DE CAMUNDONGO DE INFECÇÃO LETAL POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS INTRODUÇÃO

[0227] A cepa de S. aureus Newman foi isolada em 1952 de uma infecção humana e tem sido extensivamente usada em modelos animais de infecções estafilocócicas devido ao seu fenótipo de virulência robusto.

[0228] Camundongos fêmea OF1 têm sido amplamente utilizados para estudar a patogênese induzida por Staphylococcus aureus. Os primeiros trabalhos sobre a patogênese de infecções por Staphylococcus aureus utilizaram a via intraperitoneal de desafio para infectar e tratar camundongos devido à sua facilidade técnica.

[0229] O objetivo deste Exemplo foi avaliar a atividade antimicrobiana de um extrato aquoso da invenção em camundongos fêmea OF1 infectados com dose letal de Staphylococcus aureus Newman. O tratamento foi administrado por via oral de acordo com o esquema Q1Dx10, 2 dias antes da infecção até 7 dias após a infecção. O monitoramento da mortalidade foi realizado de D0 a D15.

[0230] Veículo foi usado como controle negativo.

MATERIAL E MÉTODOS SUBSTÂNCIA DE TESTE E CONTROLES

[0231] Substância de Teste: extrato de água M[20C]576 (obtido a partir de 120 g/l de composição herbácea, preparado como descrito no Exemplo 6). Foi fornecido em 11 frascos contendo 1.200 μl de cada um dos extratos de água. Foi armazenado a - 20 °C.

[0232] Veículo: solução aquosa a 10% de sacarose. Ele será armazenado a -20 °C.

[0233] Cepa bacteriana: cepa Newman Staphylococcus (fornecida por Dr T.Foster, Trinity College, Dublin, Irlanda, Lote n° N14156, LST4).

AQUISIÇÃO E ENJAULAMENTO DE ANIMAIS

[0234] Vinte (20) camundongos fêmea Crl:OF1 (heterogênico), com 6 semanas de idade, foram adquiridos em Charles River (L'Arbresle, França).

[0235] A unidade de cuidados com os animais foi autorizada pelos Ministérios Franceses de Agricultura e Pesquisa (Acordo Número B35-288-1). As experiências em animais foram realizadas de acordo com as orientações éticas de experimentações com animais (Principes déthique de l'expérimentation animale, Diretiva n° 86/609 CEE de 24 de novembro de 1986, Décrêt n° 87/848 de 19 de outubro de 1987, Arrêté d' Application de 19 de abril de 1988).

[0236] Os animais foram mantidos em salas “A2” sob condições controladas de temperatura (22 ± 3 °C), umidade (50 ± 20%), fotoperíodo (12 h no claro/ 12 h no escuro), troca de ar e baixa pressão. O sistema de tratamento de ar está programado para 14 mudanças de ar por hora, sem recirculação.

[0237] Alimentos e água foram fornecidos ad libitum, sendo colocados na tampa de metal em cima da gaiola.

TRATAMENTO E DESENHO EXPERIMENTAL

[0238] Preparação de bactérias - Amplificação de bactérias para desafio

[0239] Um frasco de bactéria foi descongelado e 100 μl de inóculo foram cultivados em 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB, Ref. 43592 ou 22902, Sigma). As bactérias foram incubadas a 37 °C durante 20 h sob agitação de 110 rpm em agitador horizontal. A suspensão bacteriana será diluída a 1/20 (100 μl + 1,9 ml de TSB) e a densidade óptica será lida a 680 nm (O.D. 680 nm).

[0240] Em seguida, 10 ml de bactérias foram centrifugados a 5.200 rpm (3.400 g) durante 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e as bactérias foram solubilizadas em 10 ml de DPBS (Ref. BE17-512F, Lonza, França). A suspensão bacteriana (C0) foi diluída a 1/20 (100 μl + 1,9 ml de DPBS) e OD 680 nm será medido.

[0241] O valor de O.D.680 nm medido antes e depois da centrifugação deve ser similar.

[0242] A concentração de UFC/ml da solução bacteriana foi calculada da seguinte forma:

[0243] UFC/ml = (O.D. 680 nm x 20 (fator de diluição) x 6,5.108 (UFC/U.D.O) PREPARAÇÃO DE MUCINA

[0244] Mucina (Sigma, França) foi preparada a 20%, 14 a 16 dias antes do tratamento, como descrito abaixo:

[0245] O DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) foi pré- aquecido a 56 °C e % do volume final foram transferidos para um misturador, depois a mucina de porco será adicionada e misturada. O misturador foi lavado com o volume remanescente de DPBS. Em seguida, a solução de mucina a 20% foi transferida para um frasco Erlenmeyer e foi incubada a 37 °C sob agitação durante 1 hora e 30 minutos. Os % de 20% de solução de mucina foram transferidos em um frasco estéril. O % restante da solução foi estocado separadamente. Então, as soluções % e % foram esterilizadas em autoclave. A solução estéril de 20% de mucina de porco foi armazenada a +4 °C.

[0246] No dia anterior à infecção, o pH de % de 20% de solução de mucina foi ajustado a 7,4 por adição de NaOH filtrado a 30%. Se necessário, uma parte da solução de % remanescente foi usada para ajustar o pH.

PREPARAÇÃO DE BACTÉRIAS

[0247] De acordo com os resultados da O.D. 680 nm, as bactérias (C0) foram diluídas em DPBS para atingir a concentração de 6,8x107 UFC/ml. Essas suspensões foram então diluídas a % em 20% de mucina de porco para obter a concentração LD80 de 3,4 x 107 UFC/ml em PBS a 10% de mucina de porco. A suspensão utilizada para tratamento foi colocada em um tubo contendo esferas de vidro estéreis (4 mm, Ref. 068502, Dutscher, França). A suspensão não foi submetida a vórtice, mas misturada invertendo os tubos. As bactérias foram colocadas no gelo antes dos tratamentos e mantidas no gelo durante o tratamento.

DETERMINAÇÃO DE UFC

[0248] Para determinar a concentração exata da suspensão bacteriana antes e depois da inoculação nos animais, a suspensão bacteriana foi diluída em diluições seriadas de 10 vezes em DPBS a 0,5% de Tween 20 (Sigma, França) como descrito na Tabela 8-1 em poços profundos (50 μl de bactérias + 450 μl de DPBS a 0,5% de Tween 20). Em seguida, 6 x 50 μl de diluições bacterianas 3, 4, 5 e 6 foram semeadas em placa de Agar de Soja de Tríptico (Tryptic Soy Agar, Sigma) e colocadas a 37 °C durante a noite. As colônias foram contadas para determinar as UFC (Unidades formadoras de colônias) reais de inóculos.

[0249] A numeração foi realizada na gota (50 μl) que contém entre 20 e 100 colônias. As caixas sombreadas correspondem às diluições semeadas nas placas.TABELA 8-1: DILUIÇÕES DA SUSPENSÃO BACTERIANA PARA DETERMINAR A UFC REAL (VIABILIDADE) DE INÓCULOS. AS CAIXAS SOMBREADAS CORRESPONDEM ÀS DILUIÇÕES SEMEADAS NAS PLACAS.

RANDOMIZAÇÃO

[0250] Antes do experimento (D-2), 20 camundongos fêmea OFI saudáveis foram randomizados em 2 grupos de 10 camundongos/grupo de acordo com os critérios de peso corporal, tal que os pesos corporais médios dos grupos não fossem estatisticamente diferentes.

TRATAMENTOS

[0251] Os tratamentos foram realizados de D-2 a D7 (D0: dia de inoculação de bactérias) por administração via oral (PO). Inoculações bacterianas foram feitas por injeção intraperitoneal (IP).

INOCULAÇÃO

[0252] Um D0, os camundongos foram inoculados com suspensão bacteriana. Cada inoculação consistiu em uma injeção intraperitoneal de 500 μl da suspensão a 3,4 x 107 UFC/ml (1,7 x 107 CFU/camundongo).

PROJETO EXPERIMENTAL

[0253] Os animais foram tratados com uma administração oral da substância de teste de D-2 a D7. Em D0, os tratamentos foram realizados 1 h após a inoculação das bactérias.

[0254] Os grupos experimentais serão definidos conforme descrito abaixo e resumidos na Tabela 8-2.

[0255] • Os 10 camundongos do grupo 1 serão tratadas a partir de D-2 a D7 com o veículo por administração oral de acordo com o esquema de tratamento Q1DX10.

[0256] • Os 10 camundongos do grupo 2 vai ser tratado a partir de D-2 a D7 com a substância de ensaio por administração oral de acordo com o esquema de tratamento Q1DX10.TABELA 8-2: PROJETO EXPERIMENTAL

MONITORAMENTO DE ANIMAIS

[0257] De D0 a D1, os camundongos foram observados duas vezes por dia para mortalidade.

[0258] De D2 a D15, os camundongos foram observados uma vez por dia para mortalidade.

[0259] O peso corporal dos camundongos foi registrado duas vezes por semana até o final do experimento.

[0260] Observações clínicas detalhadas (alterações na pele, pelo, olhos, membranas mucosas, ocorrência de secreções e excreções, função respiratória, alterações na marcha, postura) foram monitoradas duas vezes por semana, conforme descrito na Tabela 8-3 abaixo, por exemplo. A descrição desta lista não é exaustiva e foi complementada por outras observações, se necessário. TABELA 8-3 OBSERVAÇÕES CLÍNICAS/PARÂMETROS

SACRIFÍCIO DE CAMUNDONGOS

[0261] Em D15, camundongos sobreviventes foram sacrificados por exsanguinação, seguido por deslocamento cervical, se necessário. Nenhuma autópsia foi realizada.

RESULTADOS

[0262] A análise da sobrevivência dos camundongos mostrou os resultados relatados nas Tabelas 8-4 e 8-5 seguintes.TABELA 8-4: NÚMERO DE CAMUNDONGOS SOBREVIVENTES POR DIA

TABELA 8-5: PORCENTAGEM DE CAMUNDONGOS SOBREVIVENTES POR DIA

[0263] O tratamento permitiu reduzir a mortalidade de camundongos de 100% para 70%. Este estudo em animais mostrou, desse modo, que as atividades antimicrobiana e antibiofilme reivindicadas observadas in vitro são traduzidas em um efeito terapêutico, quando o extrato de água da invenção é administrado por via oral a animais.

EXEMPLO 9

[0264] Nesse exemplo, ilustramos atividades antimicrobianas e antibiofilme simultâneas contra Staphylococcus aureus da composição divulgada de 2 plantas entre 3: Filipendula ulmaria PA13, Camellia sinensis PA21, Arctostaphylos uva-ursi PB12 e pelo menos 1 planta entre 3: Eugenia caryophyllus PC20, Vitis vinifera var. tinctorial PA22, Desmodium adscendens PB07. As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0265] Partindo de tais três pós vegetais diferentes, prepararam-se seis composições herbáceas, de acordo com o método A relatado anteriormente.LISTA 9-1 : COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS

[0266] Partindo das composições herbáceas listadas na Lista 6-3, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente usando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração com água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0267] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente, utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 6538, com as seguintes diluições finais de amostras processadas: 1:5 para a inibição da formação de biofilme e 1:10 para a inibição do crescimento. Observe que a inibição do crescimento é próxima de 100% para cada mistura na diluição de 1:5, e a inibição da formação de biofilme está próxima de 0% para todas as misturas na diluição de 1:10.

[0268] A percentagem de inibição do crescimento planctônico de bactérias e a percentagem de inibição da formação de biofilme em relação a todas as cepas testadas das amostras processadas, obtidas a partir das diferentes composições herbáceas, são apresentadas na Tabela 9-1 seguinte.TABELA 9-1: MÉDIA DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME NA CEPA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC® 6538™ DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NAS COMPOSIÇÕES DADAS NA LISTA 9-1. AS AMOSTRAS PROCESSADAS FORAM UTILIZADAS NA DILUIÇÃO DE 1:10 PARA OS TESTES DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E EM UMA DILUIÇÃO DE 1:5 PARA A INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILM E.

(A) lista os extratos obtidos de composições herbáceas contendo PA13 e PA21, em que a adição de um entre PC20, PB07 e PA22 melhora a atividade; (B) lista os extratos obtidos de composições herbáceas contendo PA13 e PB12, em que a adição de um entre PC20, PB07 e PA22 melhora a atividade; (C) lista os extratos obtidos de composições herbáceas contendo PA13, PA21 e PB12, em que a adição de um entre PC20, PB07 e PA22 melhora a atividade; (D) lista os extratos obtidos de composições herbáceas contendo PA13 e PA21, em que a adição de um entre PC20, PB07 e PA22 melhora a atividade.

EXEMPLO 10

[0269] Nesse Exemplo, ilustramos atividades antimicrobianas e antibiofilme simultâneas contra Staphylococcus aureus de 324 extratos de misturas obtidos a partir das composições herbáceas descritas compreendendo 2 plantas entre 3: Filipendula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21), Arctostaphylos uva-ursi (PB12) e pelo menos 1 planta entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctorial (PA22), Desmodium adscendens (PB07).

[0270] Para as misturas de M[20C]-2083 a M[20C]-20798, as plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França). Para as misturas de M[20C]-2805 a M[20C]-2957, as plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont-Ferrand, França, plantas PA00 a PB12) e “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França, plantas PB13 a PD02).

[0271] As composições herbáceas contendo de 3 a 20 pós de plantas foram preparadas de acordo com o método A descrito anteriormente.

[0272] Partindo das composições herbáceas, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente utilizando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0273] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 e ATCC 14775, com as diluições finais de 1:20 de amostras processadas.

[0274] A média da percentagem de inibição do crescimento planctônico de bactérias e da porcentagem média de inibição da formação de biofilme sobre todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas das seguintes composições herbáceas de, respectivamente, Lista 10-1, Lista 10-2, Lista 10-3 e Lista 10-4 é dado em, respectivamente, Tabela 10-1, Tabela 10-2, Tabela 10-3 e Tabela 10-4. Em cada conjunto, os extratos obtidos de composições herbáceas contendo mais de 3 ou 4 plantas exibiram inibição do crescimento planctônico ou inibição da formação de biofilme (ou ambas as inibições) maior que qualquer uma das misturas contendo apenas 3 ou 4 plantas.LISTA 10-1: EXTRATOS DE COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS CONTENDO 2 PLANTAS ENTRE 3: FILIPENDULA ULMARIA (PA13), CAMELLIA SINENSIS (PA21) E PELO MENOS UMA ENTRE 3: EUGENIA CARYOPHYLLUS (PC20), VITIS VINIFERA VAR. TINCTORIAL (PA22), DESMODIUM ADSCENDENS (PB07):

TABELA 10-1: MÉDIA DA EFICÁCIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NOS EXTRATOS DA LISTA 10-1 NA DILUIÇÃO DE 1:20

LISTA 10-2: EXTRATOS DE COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS CONTENDO FILIPENDULA ULMARIA (PA13), ARCTOSTAPHYLOS UVA-URSI (PB12) E PELO MENOS UM ENTRE 3: EUGENIA CARYOPHYLLUS (PC20), VITIS VINIFERA VAR. TINCTORIA (PA22), DESMODIUMADSCENDENS (PB07):

TABELA 10-2: MÉDIA DA EFICÁCIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NAS MISTURAS DA LISTA 10-2 NA DILUIÇÃO DE 1:20

LISTA 10-3: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE AMOSTRAS PROCESSADAS CONTENDO: CAMELLIA SINENSIS (PA21), ARCTOSTAPHYLOS UVA-URSI (PB12) E PELO MENOS UM ENTRE 3: EUGENIA CARYOPHYLLUS (PC20), VITIS VINIFERA VAR. TINCTORIAL (PA22), DESMODIUM ADSCENDENS (PB07):

TABELA 10-3: MÉDIA DA EFICÁCIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NAS MISTURAS DA LISTA 10-2 NA DIL UIÇÃO DE 1:20

LISTA 10-4: EXTRATOS DE COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS CONTENDO: FILIPENDULA ULMARIA (PA13), CAMELLIA SINENSIS (PA21), ARCTOSTAPHYLOS UVA-URSI (PB12) E PELO MENOS UM ENTRE 3: EUGENIA CARYOPHYLLUS (PC20), VITIS VINIFERA VAR. TINCTORIAL (PA22), DESMODIUM ADSCENDENS (PB07):

TABELA 10-4: MÉDIA DA EFICÁCIA DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO E DA PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DO BIOFILME NAS 6 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS TESTADAS DA AMOSTRA PROCESSADA COM BASE NAS MISTURAS DA LISTA 10-4 NA DIL UIÇÃO DE 1:20

EXEMPLO COMPARATIVO 4

[0275] Como um exemplo comparativo, relatamos vários extratos de composições herbáceas contendo apenas 1 planta entre 3: Filipendula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21), Arctostaphylos uva-ursi (PB12) e apenas 1 entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctoria (PA22), Desmodium adscendens (PB07).

[0276] 5 composições herbáceas tendo o conteúdo relatado na Lista 10-5 foram preparadas de acordo com o Método 1 descrito anteriormente. LISTA 10-5: EXTRATOS DE COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS CONTENDO AS SEGUINTES PLANTAS

[0277] Composições herbáceas contendo 20 pós de plantas foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.

[0278] Partindo das composições herbáceas, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente utilizando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0279] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as seguintes cepas de Staphylococcus aureus: ATCC 25923, ATCC 49476, ATCC 6538, ATCC 51740, ATCC 29213 e ATCC 14775, com as diluições finais de 1:20 de amostras processadas.

[0280] A média percentual de inibição do crescimento planctónico de bactérias e a média percentual de inibição da formação de biofilme em relação a todas as cepas testadas das amostras processadas obtidas a partir das composições herbáceas da Lista 10-4 são dadas na Tabela 10-5. Cada porcentagem é a média de 2 medições da mesma condição em dois poços diferentes. Porcentagens negativas refletem a promoção do crescimento e a promoção do biofilme, em vez da inibição desejada. Entende-se que tais extratos proporcionam uma inibição muito fraca, se é que existe, em comparação com os extratos do Exemplo 10. TABELA 10-5: MÉDIA DE PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO PLANCTÔNICO DE BACTÉRIAS E MÉDIA DE PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME EM RELAÇÃO A TODAS AS CEPAS TESTADAS DAS AMOSTRAS PROCESSADAS OBTIDAS A PARTIR DAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DA LISTA 10-4

EXEMPLO 11

[0281] Nesse Exemplo, ilustramos as atividades antimicrobianas contra 14 espécies microbianas diferentes descritas na Tabela 11-1 de 10 extratos de misturas obtidos a partir das composições herbáceas descritas na Lista 11-1 compreendendo pelo menos 2 plantas entre 3: Filipendula ulmaria (PA13), Camellia sinensis (PA21), Arctostaphylos uva-ursi (PB12) e pelo menos 1 planta entre 3: Eugenia caryophyllus (PC20), Vitis vinifera var. tinctorial (PA22) e Desmodium adscendens (PB07).TABELA 11-1: ESPÉCIES MICROBIANAS E CEPAS UTILIZADAS NO EXEMPLO 11

LISTA 11-1: EXTRATOS DE COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS CONTENDO: FILIPENDULA ULMARIA (PA13), CAMELLIA SINENSIS (PA21) E PELO MENOS UM ENTRE 3: EUGENIA CARYOPHYLLUS (PC20), VITIS VINIFERA VAR. TINCTORIA (PA22), DESMODIUM ADSCENDENS (PB07) USADO NO EXEMPLO 11:

[0282] Para as misturas M[5P]-1, M[5P]-2 e M[19P]-576, as plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França). Para as outras misturas, as plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Pharmacie Fontgiève” (Clermont-Ferrand, França, plantas PA00 a PB12) e “Pharmacie St Herem” (Clermont-Ferrand, França, plantas PB13 a PD02).

[0283] Todas as composições herbáceas de 20 plantas foram preparadas de acordo com o Método A descrito anteriormente.

[0284] Partindo das composições herbáceas, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente utilizando 40 ml de água contendo 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0285] As composições herbáceas M[19P]-576, M[5P]-1 e M[5P]-2 foram preparadas pesando-se cada erva seca como indicado na Tabela 11-2.TABELA 11-2: PESO DA PLANTA SECA (MG) USADA NAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE M[19P]-576, M[5P]-1 E M[5P]-2 USADAS NO EXEMPLO-11

[0286] A partir das composições herbáceas, os extratos aquosos correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente, utilizando, respectivamente, 30 ml, 40 ml e 40 ml de água sem sacarose, respectivamente, M[19P]-576, M[5P]-1 e M[5P]2, para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0287] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as seguintes cepas nas diluições finais indicadas das amostras processadas que são dadas na Tabela 11-3.

[0288] A média da percentagem de inibição do crescimento planctônico microbiano é dada na Tabela 11-3.TABELA 11 PLANCTÔNICO NAS PROCESSADA DA CO -3: PERCENTAGEM DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO 14 CEPAS MICROBIANAS TESTADAS DA AMOSTRA MPOSIÇÃO DIVULGADA NA LISTA 11-1.

EXEMPLO 12

[0289] Nesse exemplo, ilustramos as atividades antimicrobianas de uma mistura de plantas em que a etapa de extração foi realizada com os solventes não aquosos acetona, acetato de etila, etanol, utilizados sozinhos ou como misturas binárias como indicado na Tabela 12-1. Uma comparação com a água é fornecida.TABELA 12-1: COMPOSIÇÃO DAS MISTURAS BINÁRIAS USADAS NO EXEM PLO 12 PARA EXTRAÇÃO NÃO AQU OSA

[0290] A mistura de planta seca M[20P]-576 foi composta da Tabela 12-2 a seguir e colocada em um frasco de 500 ml e cuidadosamente misturada por inversão e laminação manual. As ervas secas foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França), exceto PC49 que foi obtido de Siccarapam (Aubiat, França).TABELA 12-2: LISTA DE PLANTAS SECAS QUE COMPÕEM O M[20P]- 576 USADO NO EXEMPLO 12

[0291] Para cada solvente testado, colocaram-se 5 g de mistura de plantas secas em um frasco colorido de 100 ml (Schott, Alemanha) com uma barra magnética e adicionaram-se 50 ml de solvente. A suspensão líquida foi agitada com um agitador magnético (RO 15P IKA, Alemanha) a uma velocidade máxima durante 48 horas à temperatura ambiente. Cada suspensão/solução foi filtrada por gravidade utilizando um filtro dobrado de 250 mm (J025106, Prats Dumas, França) colocado em um funil de vidro (Schott, Alemanha) colocado em um frasco de evaporação. O frasco contendo o líquido que cruzou o filtro é colocado em um dispositivo giratório de evaporação a vácuo (Rotavapor® R205 + controlador de vácuo V800, Büchi, Suíça) e a evaporação é realizada a 35 °C com vácuo ajustado para ficar abaixo do ponto de ebulição do solvente até todo o solvente ser evaporado. O material remanescente é pesado e dissolvido em DMSO (Acros organic, EUA) qsp 10 g/l para formar a mistura extraída.

[0292] Dois extratos de água foram preparados de acordo com o Método B anteriormente descrito, onde as colheres de plantas secas foram substituídas por 2 g da mistura de plantas secas M[20P]-576 do Exemplo 12, utilizando 40 ml de água para a extração de água e que inclui a etapa de decantação, antes de filtração. O teor de resíduo seco de um dos extratos de mistura de plantas foi determinado por pesagem do resíduo de liofilização obtido com um dispositivo de liofilização (FreeZone™ 2.5, Labconco EUA, com RZ6 Vacuubrand, Alemanha) do extrato congelado.

[0293] Esse teor de resíduos secos foi utilizado para deduzir as atividades específicas dos diferentes extratos.

[0294] A atividade biológica de cada mistura extraída foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as cepas indicadas na Tabela 123, em que a diluição da mistura extraída era: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160. A concentração inibitória mínima (MIC) foi observada pela observação visual dos poços como a concentração mais baixa onde não se observa crescimento.TABELA 12-3: LISTA DAS CEPAS BACTERIANAS USADAS NO EXEMPLO 12

[0295] Os resultados são compilados nas tabelas 12-4 para os diferentes solventes. TABELA 12-4: CMI EM MG/L DAS MISTURAS EXTRAÍDAS USANDO, A) ACETONA, ACETATO DE ETANOL, ETANOL E ÁGUA COMO SOLVENTE, B), DIFERENTES PROPORÇÕES DE ACETONA E ETANOL COMO SOLVENTE BINÁRIO COMO INDICADO NA TABELA 12-2-A, C) DIFERENTES PROPORÇÕES DE ACETATO DE ETANOL E ETANOL COMO SOLVENTE BINÁRIO COMO INDICADO NA TABELA 12-2-B E D) USANDO DIFERENTES PROPORÇÕES DE ACETATO DE ETANOL E ACETONA COMO SOLVENTE BINÁRIO COMO INDICADO NA TABELA 12-2-C.

EXEMPLO 13

[0296] Nesse exemplo, ilustramos as atividades antimicrobianas de misturas de plantas preparadas de acordo com o método B descrito anteriormente, em que o carboidrato adicionado é escolhido entre sacarose, dextrose, maltose e galactose.

[0297] As misturas de plantas secas M[19P]-576, M[5P]-1 e M[5P]-2 foram compostas de acordo com a Tabela 13-1 e colocadas em um frasco de 500 ml e completamente misturadas por inversão e laminação manual. As ervas secas foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França), exceto PC49 que foi obtido de Siccarapam (Aubiat, França).TABELA 13-1: LISTA DE PLANTAS SECAS QUE COMPÕEM: A) A MISTURA M[20P]-576, B) A MISTURA M[5P]-1 E C) A MISTURA M[5P]-2 USADA NO EXEMPLO 13

[0298] Para cada mistura de plantas secas, os extratos foram preparados de acordo com o Método B anteriormente descrito, onde as colheres de plantas secas foram substituídas por 2 g da mistura de plantas do Exemplo 13, usando 40 ml de água e as quantidades de carboidrato indicadas na Tabela 13-3 para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração.

[0299] O teor de resíduo seco das misturas de plantas sem carboidrato foi determinado em separado, por pesagem do resíduo de liofilização obtido com um dispositivo de liofilização (FreeZone™ 2,5, Labconco EUA, com RZ6 Vacuubrand, Alemanha) de um extrato de 40 ml congelado preparado de acordo com o Método B previamente descrito, onde as colheres de plantas secas foram substituídas por 2 g da mistura de plantas do Exemplo 13, usando 40 ml de água para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração. Esse teor de resíduos secos foi usado para deduzir as atividades específicas dos diferentes extratos, onde o carboidrato é considerado como um adjuvante e não contabilizado como parte do ingrediente ativo.

[0300] A atividade biológica de cada mistura extraída foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as cepas indicadas na Tabela 132, em que a diluição da mistura extraída era: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160. A concentração inibitória mínima (MIC) foi observada pela observação visual dos poços como a concentração mais baixa onde não se observa crescimento. TABELA 13-2: LISTA DAS CEPAS BACTERIANAS USADAS NO EXEMPLO 13

[0301] Os resultados são compilados nas tabelas 13-4. TABELA 13-3: MIC EM MG/L DAS MISTURAS EXTRAÍDAS USANDO SACAROSE, LACTOSE, DEXTROSE, MALTOSE OU GALACTOSE PARA: A) AMISTU RA M[20P]-576, B) A MISTURA M[5P]-1 E C) A MISTURA M[5P]-2

EXEMPLO 14

[0302] Nesse exemplo, ilustramos o aumento da atividade antimicrobiana do extrato de mistura herbácea M[20P]-576 para antibióticos comumente usados.TABELA 14-1: ESPÉCIES BACTERIANAS E CEPAS USADAS NO EXEMPLO 14

LISTA 14-1: COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DA AMOSTRA PROCESSADA USADA NO EXEMPLO 14:

[0303] As plantas secas de grau farmacêutico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0304] As composições herbáceas M[19P]-576 foram preparadas pesando cada erva seca como indicado na Tabela 14-2.TABELA 14-2: PESO DA PLANTA SECA (MG) USADA NAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE M[19P]-576

[0305] A partir da composição herbácea, os extratos de água correspondentes (ou amostras processadas) foram preparados de acordo com o Método B descrito anteriormente, usando 2,06 g da composição herbácea anterior com 40 ml de água com 100 g/l de sacarose para extração de água e incluindo a etapa de decantação antes da filtração. Em uma preparação independente de extrato de água sem sacarose, foi medido que 2,06 g/40 ml de composição herbácea corresponde a 14,5 g/l, conforme deduzido do peso do extrato herbáceo seco liofilizado.

[0306] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente utilizando as seguintes cepas nas diluições finais indicadas das amostras processadas que são dadas na Tabela 14-3. No Exemplo 14, foi calculado o crescimento das bactérias na presença de antibiótico e/ou mistura herbácea em relação ao crescimento na ausência de antibiótico e extrato de mistura herbácea.

[0307] A média percentual de inibição do crescimento planctônico de bactérias é dada na Tabela 14-3.

[0308] Deve-se notar que a presença do extrato herbáceo M[19P]-576 tem três efeitos na concentração utilizada: 1) reduz o crescimento das bactérias em baixa concentração e ausência de antibiótico, 2) reduz o aumento do crescimento bacteriano induzido por baixa concentração de antibiótico em relação ao crescimento na ausência de antibióticos, e 3) reduz a concentração inibitória mínima (MIC), de, respectivamente, vancomicina para B-A17 e de ampicilina e penicilina para B-A21, em concentração de M[20C]-576 iniciando em, respectivamente, 90,6 μg/ml, 181,3 μg/ml e 90,6 μg/ml.TABELA 14-3: CRESCIMENTO PLANCTÔNICO NA PRESENÇA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE EXTRATO E CONCENTRAÇÕES DE ANTIBIÓTICO EM RELAÇÃO AO CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS NA AUSÊNCIA DE EXTRATO E ANTIBIÓTICO, EM DUAS CEPAS DIFERENTES

EXEMPLO 15

[0309] Nesse exemplo, ilustra-se como adaptar a temperatura no Método B para lidar com restrições industriais.

[0310] As plantas secas de grau orgânico foram obtidas de “Herboristerie Cailleau” (Chemillé, França).

[0311] Composições herbáceas M[5P]-1 foram preparadas pela pesagem de cada erva seca, conforme indicado na Tabela 15-1.TABELA 15-1: PESO DA PLANTA SECA (MG) USADA NAS COMPOSIÇÕES HERBÁCEAS DE M[5P]-1

[0312] Um primeiro extrato M[5P]-1-A foi preparado incorporando-se 120 g da composição herbácea em 600 ml de água contida em uma proveta de 2 l (Schott, Alemanha). Um segundo extrato M[5P]-1-B foi preparado colocando-se 120 g da composição herbácea em um saco de algodão de grau orgânico de 25x30cm (Ecobags, EUA), e o saco cheio foi colocado em 600 ml de água contida em uma proveta de 2 l (Schott, Alemanha). Um terceiro extrato M[5P]-1-C foi preparado colocando-se duas vezes 60 g da composição herbácea em um saco de algodão de grau orgânico de 25x30cm (Ecobags, EUA), e os dois sacos cheios foram colocados em 600 ml de água contida em uma única proveta de 2l (Schott, Alemanha). Cada preparação, respectivamente, M[5P]-1-A, M[5P]-1-B e M[5P]-1-C, foi deixada para maceração durante 3 horas à temperatura ambiente e, em seguida, colocada na sua proveta em um autoclave (VWR Vapour Line Eco 25, EUA) durante 30 minutos a, respectivamente, 121 °C, 121 °C e 134 °C. Para cada uma das M[5P]-1-B e M[5P]-1- C, os sacos de algodão foram prensados usando uma prensa de fruta de 5 l operada manualmente (Brouwland, Bélgica) e o líquido recuperado foi colocado de volta na proveta de 2 l. Cada proveta foi deixada para decantação e a quantidade necessária de líquido sobrenadante foi utilizada para medir a sua atividade biológica.TABELA 15-2: ESPÉCIES BACTERIANAS E CEPAS USADAS NO EXEMPLO 15

[0313] A atividade biológica de cada amostra processada foi determinada de acordo com o Método C descrito anteriormente, utilizando as cepas listadas na Tabela 15-2 em diluições finais de 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320. A diluição correspondente à concentração inibitória mínima (MIC) foi observada pela observação visual dos poços como a concentração mais baixa onde não se observa crescimento e é reportada na Tabela 15-3.TABELA 15-3: DILUIÇÃO CORRESPONDENTE À CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (MIC) DOS EXTRATOS REALIZADOS COM DIFERENTES DETALHES INDUSTRIAIS E TEMPERATURA

[0314] Deve-se notar que a introdução do saco de algodão para facilitar o processo industrial reduziu ligeiramente a atividade do extrato em comparação com o processo insatisfatório sem saco. O aumento da temperatura da autoclave durante a fase de extração a quente permitiu recuperar toda a atividade.

Claims (17)

1. Extrato de uma composição herbácea caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi e pelo menos uma planta selecionada entre Vitis vinifera var. tinctoria, Eugenia caryophyllus e Desmodium adscendens.

2. Extrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende ainda uma ou mais plantas secas adicionais selecionadas entre: Achillea millefolium, Acorus calamus, Agrimonia eupatoria, Agropyrum repens, Agropyrum repens, Alquimilla vulgaris, Alkanna tinctoria, Althaea officinalis, Anethum graveolens, Angélica Archangelica, Arbutus unedo, Arnica montana, Artemisia pontica, Artemisia vulgaris, Asparagus officinalis, Asparagus officinalis, Asperula odorata, Betula pendula, Borrago officinalis, Buxus sempervirens, Calamintha officinalis, Calendula officinalis, Calluna vulgaris, Carum carvi, Cassia angustifolia, Centaurea cyanus, Centaurium erythraea, Centella asiatica, Cetraria islandica, Chamaemelum nobile, Chamomilla recutita, Chrysanthellum americanum, Cichorium endivia, Cichorium intybus, Cinnamomum zeylanicum, Citrus aurantium, Combretum micranthum, Crataegus oxyacantha, Cuminum cyminum, Cupressus sempervirens, Curcuma zedoaria, Cynara scolymus, Cytisus scoparius Desmodium adscendens, Elettaria cardamomum, Eleutherococcus senticosus, Epilobium parviflorum, Erysimum officinale, Eucalyptus globulus, Eugenia caryophyllus, Eupatorium cannabinum, Foeniculum vulgare, Fraxinus excelsior, Fucus vesiculosus, Fumaria officinalis, Galim odoratum, Gentiana lutea, Geranium robertianum, Ginkgo biloba, Glechoma hederacea, Glycyrrhiza glabra, Handroanthus impetiginosus, Harpagophytum procumbens, Hieracium pilosella, Humulus lupulus, Hipericum perforatum, Hyssopus officinalis, Illicium verum, Inula helenium, Juglans regia, Juniperus communis, Lamium album, Lavandula angustifolia, Levisticum officinale, Lippia citriodora, Lótus corniculatus, Lythrum salicaria Malva sylvestris, Marrubium vulgare, Medicago sativa, Melissa officinalis, Mentha x piperita, Morus nigra, Myrtus communis, Olea europaea, Origanum majorana, Panax ginseng, Papaver rhoeas, Parietaria officinalis, Passiflora incarnata, Petroselinum crispum, Peumus boldus, Phaseolus vulgaris, Pimpinella anisum, Plantago Plantolata, Plantago ovata, Potentilla anserina, Quercus robur, Rhamnus frangula, Rheum palmatum, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Rubia tinctorum, Rubus idaeus, Salix alba, Salvia officinalis, Sambucus nigra, Satureja montana, Silybum marianum, Solanum dulcamara, Tabebuia impetiginosa, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinalis, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Tilia tomentosa, Tilia cordata, Trigonella foenum graecum, Tussilago farfara, Vaccinium myrtillus, Valeriana officinalis, Verbascum thapsus, Verbena officinalis, album Viscum, Zea mays e Zingiber officinale.

3. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende de três a sete plantas secas selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Arctostaphylos uva-ursi, Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes, Eugenia caryophyllus e Eucalyptus globulus , em que pelo menos duas dessas plantas são selecionadas entre Filipendula ulmaria, Camellia sinensis e Arctostaphylos uva-ursi e pelo menos uma dessas plantas é selecionada entre Vitis vinifera tinctoria, Desmodium adscendes e Eugenia caryophyllus.

4. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria e Arctostaphylos uva-ursi.

5. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria e Arctostaphylos uva-ursi.

6. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eugenia caryophyllus e Arctostaphylos uva-ursi.

7. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Eucalyptus globulus, Arctostaphylos uva-ursi, Mentha spicata e Rubia tinctorium.

8. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende pelo menos catorze ou quinze plantas secas selecionadas entre as dezesseis a seguir: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodora e Tanacetum vulgare.

9. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum e Lippia citrodora.

10. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição herbácea compreende as seguintes plantas secas: Rheum palmatum, Rosmarinus officinalis, Filipendula ulmaria, Satureja montana, Valeriana officinalis, Camellia sinensis, Vitis vinifera tinctoria, Fucus vesiculosus, Foeniculum vulgare, Arctostaphylos uva-ursi, Arbutus unedo, Eugenia caryophyllus, Juniperus communis, Combretum micranthum, Lippia citrodora e Tanacetum vulgare.

11. Liofilizado caracterizado pelo fato de que é do extrato, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Suplemento alimentar, composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética ou alimento funcional ou aditivo alimentar caracterizado pelo fato de que compreende o extrato, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou o liofilizado, conforme definido na reivindicação 11, como ingrediente ativo, juntamente com pelo menos um excipiente.

13. Suplemento alimentar, composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética, alimento funcional ou aditivo alimentar, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é formulado para administração oral ou tópica.

14. Processo para preparar o extrato, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende a) cortar ou moer separadamente ou em uma mistura pelo menos duas plantas secas individuais para obter pós de plantas correspondentes; b) misturar pelo menos dois pós vegetais diferentes para obter uma composição herbácea; c) adicionar um solvente de extração à dita composição herbácea para obter uma preparação líquida (ou extrato) correspondente; d) incubar a dita preparação líquida à temperatura ambiente durante um intervalo de tempo entre 5 e 15 minutos; opcionalmente, e) aquecer a dita preparação líquida a uma temperatura variando de 60 °C a 134 °C durante um intervalo de tempo de 5 a 60 minutos; opcionalmente f) centrifugar, coletar o sobrenadante e filtrar o sobrenadante coletado; e, opcionalmente, g) concentrar e/ou secar ou liofilizar a preparação líquida obtida da etapa e) ou f).

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o solvente de extração é água.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a água adicionada na etapa (c) compreende um açúcar dissolvido no mesmo a uma concentração que varia de 1 a 100 g/l, opcionalmente de 50 a 75 g/l.

17. Processo para preparar o suplemento alimentar, a composição nutracêutica, farmacêutica, veterinária ou cosmética, o alimento funcional ou o aditivo alimentar, conforme definido na reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que compreende misturar o extrato, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou o liofilizado, conforme definido na reivindicação 11, com pelo menos um excipiente.