ES2970878T3 - Composiciones de vacuna que comprenden una proteína de unión al factor H mutada - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende al menos una proteína de unión al factor H modificada, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune, cuando se administra a un ser humano o un animal no humano; y composiciones, usos y kits asociados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones de vacuna que comprenden una proteína de unión al factor H mutada
La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas para su uso en provocar respuestas inmunes frente a organismos patógenos y, en particular, a composiciones inmunogénicas capaces de provocar respuestas inmunes protectoras.
LaNeisseria meningitidis(meningococo) es una bacteria diplococo gramnegativa encapsulada que habita en la nasofaringe de los seres humanos. Las tasas de estado de portador en la población general suelen rondar el 10%. La compleja relación huésped-patógeno suele ser de naturaleza comensal. Sin embargo, en ocasiones, el estado de portador de meningococos puede provocar una enfermedad invasiva. Este fenómeno se suele asociar con cepas que pertenecen a un pequeño número de linajes clonales hiper-virulentos (Caugant, D. A. y cols. (1987) J Bacteriol 169: 2781 -2792). LaN. meningitidises la principal causa de meningitis piógena a nivel mundial y es la única bacteria capaz de generar brotes de meningitis y septicemia. Las tasas de ataque varían entre 1-3 por 105 de la población, dependiendo de la prevalencia endémica o epidémica de la enfermedad en cualquier localización geográfica. Por lo tanto, es necesario desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas para reducir la incidencia, la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad meningocócica invasiva.
El organismo de laNeisseria meningitidises sensible a varios antibióticos de primera línea, sin embargo, a pesar de esto, un número importante de pacientes diagnosticados con infección meningocócica mueren a causa de una enfermedad abrumadora o sufren complicaciones graves. Las tasas de mortalidad varían del 2-3% en casos de meningitis sin complicación al 50% o más en casos de shock séptico (Cartwright, K. A. y D. A. Ala'Aldeen (1997) J Infect 34: 15-19).
Las vacunas autorizadas actualmente se basan en la cápsula de polisacárido que rodea esa membrana externa bacteriana y, por lo tanto, solo ofrecen protección frente a un subconjunto de cepas que expresan la cápsula correspondiente. Además, no existen vacunas ampliamente eficaces frente el serogrupo B deNeisseria meningitidis,la causa más común de enfermedad meningocócica en los países ricos. Esto se debe a que la cápsula del serogrupo B consiste en un polímero de ácido siálico que está estructuralmente relacionado con una modificación de una molécula de adhesión de células neurales humanas expresada en la infancia y durante el desarrollo embrionario. Existe la preocupación de que la inmunización con este antígeno provoque respuestas autoinmunes.
El documento WO 2006/081259 se refiere a vacunas vesiculares basadas en GNA1870 para una protección de amplio espectro frente a enfermedades causadas porNeisseria meningitidis.
La presente invención se refiere a nuevas composiciones, y en particular a nuevas composiciones inmunogénicas, que comprenden una proteína de unión al factor H modificada, y al uso de estas composiciones para provocar una respuesta inmune frente aNeisseria meningitidis.
Un objetivo de esta invención es proporcionar una o más composiciones que se puedan usar para provocar una respuesta inmune protectora frente aNeisseria meningitidis.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección o enfermedad causada porNeisseria meningitidisy/oNeisseria gonorrhoeae,que comprende al menos una proteína de unión al factor H modificada, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se administra a un ser humano o un animal no humano, en donde la proteína de unión al factor H modificada tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la Sec ID N.°: 1, y tiene una alanina en la posición número 283 como se define en la Sec ID N.°: 1 en lugar de ácido glutámico, lo que da como resultado que no se una al factor H, o que se una al menos 5 veces menos al factor H en comparación con la proteína de unión al factor H de la Sec ID N.°: 1.
Preferiblemente, la referencia en la presente memoria a una proteína de unión al factor H se refiere a la proteína de unión al factor H deNeisseria meningitidiso deNeisseria gonorrhoeae.
LaNeisseria meningitidissubvierte la respuesta inmune de un organismo huésped imitando al huésped. LaNeisseria meningitidisusa proteínas, en forma de proteína de unión al factor H, en lugar de química de carbohidratos cargados para reclutar el regulador del complemento del huésped, el factor H.
En individuos sanos, la activación del complemento se controla con precisión a través de proteínas reguladoras del plasma solubles y unidas a la membrana, incluido el factor H (fH). El factor H es una proteína de 155 kDa compuesta por veinte dominios (denominados repeticiones de proteínas de control del complemento o CCPs). Varios patógenos se han adaptado para evitar la muerte mediada por el complemento secuestrando el factor H en su superficie.
Como se discutió anteriormente, laNeisseria meningitidises un patógeno adaptado al ser humano de importancia mundial como una de las principales causas de meningitis bacteriana y shock séptico (Stephens y cols. (2007) Lancet 369, 2196-210). Debido a la variación de la cepa de Neisseria, las vacunas actualmente disponibles para la enfermedad meningocócica no proporcionan una protección amplia y, por lo tanto, son de uso limitado. Un enfoque ha sido usar la proteína de unión al factor H (conocida como fHbp, GNA1870 o R2086) como un antígeno en una composición de vacuna. La proteína de unión al factor H es una lipoproteína de superficie de 27 kDa, universalmente presente en la superficie deN. meningitidisque provoca anticuerpos bactericidas protectores (Fletcher y cols. (2004) Infect Immun 72, 2088-100; Masignani y cols. (2003) J Exp Med 197, 789-99). La proteína de unión al factor H sirve para reclutar al regulador negativo del complemento, el factor H, en la superficie bacteriana y contribuye a la capacidad del meningococo para evitar respuestas inmunes innatas al inhibir la lisis mediada por el complemento en el plasma humano (Madico y cols. (2006) J Inmunol 177, 501-10; Schneider y cols. (2006) J Immunol 176, 7566-75).
En esta invención se usa como antígeno al menos una proteína de unión al factor H modificada. La proteína se modifica para prevenir o reducir la unión del factor H a la proteína. Se cree que la unión del factor H a la proteína de unión al factor H después de la administración de la proteína de unión al factor H en una formulación de vacuna a un sujeto dificulta el éxito de la vacuna. En primer lugar, la presencia del factor H en la proteína de unión al factor H puede limitar el reconocimiento de epítopos críticos en la proteína de unión al factor H por parte del sistema inmune del huésped. Los anticuerpos generados frente a estos epítopos pueden ser bactericidas e inhibir la unión del factor H a las bacterias, haciéndolas sensibles a la lisis mediada por el complemento. En segundo lugar, las respuestas inmunes frente a la proteína de unión al factor H también pueden provocar respuestas frente al factor H unido, de manera similar a un hapteno. Esto puede dar lugar a una posible respuesta autoinmune no deseada. Finalmente, la activación del complemento está involucrada en las respuestas inmunes ya que las proteínas del complemento tienen actividad adyuvante. La reducción de la activación del complemento en el lugar de la inmunización a través del reclutamiento del factor H podría afectar al nivel de inmunidad logrado tras la vacunación.
Preferiblemente, la unión del factor H a la proteína de unión al factor H modificada es al menos 10 veces menor, preferiblemente al menos dos órdenes de magnitud menos, que la unión del factor H a la proteína de unión al factor H de tipo salvaje. Preferiblemente, la reducción de la unión se mide usando el analito a una concentración de aproximadamente 50 nM. Una reducción en la unión de este orden se consideraría una reducción significativa.
Además de las modificaciones en la proteína de unión al factor H realizadas para prevenir o inhibir la unión del factor H, la proteína también puede incluir otras mutaciones que no afecten a la capacidad de la proteína para actuar como inmunógeno frente a la infección porN. meningitidis.Por ejemplo, se pueden realizar otros cambios de aminoácidos conservadores en la proteína. De manera similar, se pueden realizar inserciones o eliminaciones en la proteína que no afecten a la inmunogenicidad de la proteína.
Preferiblemente, la proteína de unión al factor H modificada tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de la Figura 6.
El porcentaje de identidad de secuencia se define como el porcentaje de aminoácidos en una secuencia que son idénticos a los aminoácidos en una secuencia proporcionada después de alinear las secuencias e introducir espacios si es necesario para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Se puede lograr de muchas maneras el alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia, que son bien conocidas por el experto en la técnica, e incluyen, por ejemplo, el uso de BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica del Centro Nacional de Información Biotecnológica).
Las variaciones en el porcentaje de identidad se pueden deber, por ejemplo, a sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de naturaleza conservadora, en el sentido de que el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, por ejemplo, la sustitución de leucina por isoleucina es una sustitución conservadora.
Una composición inmunogénica es una composición que es capaz de provocar una respuesta inmune frente a al menos una proteína de unión al factor H modificada cuando la composición se administra a un sujeto. Preferiblemente el sujeto es un ser humano o un mamífero no humano.
Preferiblemente la respuesta inmune provocada por la composición de la invención afecta a la capacidad deN. meningitidisde infectar a un ser humano inmunizado. Preferiblemente la capacidad deN. meningitidisde infectar se impide o previene a un ser humano inmunizado con la composición de la invención. Esto se puede lograr de varias maneras. La respuesta inmune provocada puede reconocer y destruir aN. meningitidis.Alternativa o adicionalmente, la respuesta inmune provocada puede impedir o prevenir la replicación deN. meningitidis.Alternativa o adicionalmente, la respuesta inmune provocada puede impedir o prevenir la infección por N.meningitidisque causa la enfermedad en el ser humano o en animales no humanos.
La proteína de unión al factor H modificada se puede producir de forma recombinante (p. ej., a partir de un sistema de expresión diseñado genéticamente) o ser un producto sintético, por ejemplo, producida por síntesis de péptidosin vitroo traducciónin vitro.
La composición de la invención también puede comprender uno o más antígenos adicionales, además de una o más proteínas de unión al factor H modificadas.
Los antígenos adicionales también se pueden derivar deN. meningitidisy pueden ser capaces de provocar una respuesta inmune dirigida frente aN. meningitidis.
La composición se puede usar para provocar/producir una respuesta inmune protectora cuando se administra a un sujeto. La respuesta inmune protectora puede causar que la N.meningitidismuera al infectar al sujeto, o puede prevenir o inhibir que laN. meningitidisse replique y/o cause enfermedades.
La composición se puede usar como una vacuna profiláctica o terapéutica dirigida frente aN. meningitidis.
De acuerdo con un aspecto adicional (que no forma parte de la invención), se proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión al factor H modificada y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente la composición farmacéutica comprende una composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Preferiblemente la composición farmacéutica es capaz de producir una respuesta inmune protectora frente aN. meningitidis.
La frase "producir una respuesta inmune protectora" como se usa en la presente memoria significa que la composición es capaz de generar una respuesta protectora en un organismo huésped, como un ser humano o un mamífero no humano, al que se le administra. Preferiblemente una respuesta inmune protectora protege frente a infecciones posteriores porN. meningitidis.La respuesta inmune protectora puede eliminar o reducir el nivel de infección al reducir la replicación deN. meningitidiso afectar al modo de acción deN. meningitidispara reducir la enfermedad.
Los expertos en la técnica conocerán bien los excipientes y transportadores aceptables adecuados. Estos pueden incluir transportadores sólidos o líquidos. Los transportadores líquidos adecuados incluyen agua y solución salina. Las proteínas de la composición se pueden formular en una emulsión o se pueden formular en microesferas o liposomas biodegradables.
La composición puede comprender además un adyuvante. Los expertos en la técnica conocerán bien los adyuvantes adecuados y pueden incluir el adyuvante incompleto de Freund (para uso en animales) y sales metálicas, como sales de aluminio o calcio.
La composición también puede comprender polímeros u otros agentes para controlar la consistencia de la composición y/o para controlar la liberación del antígeno/proteína secretada de la composición.
La composición también puede comprender otros agentes como diluyentes, que pueden incluir agua, solución salina, glicerol u otros alcoholes adecuados, etc.; agentes humectantes o emulsionantes; agentes tamponadores; agentes espesantes, por ejemplo, celulosa o derivados de celulosa; conservantes; detergentes, agentes antimicrobianos; y similares.
Preferiblemente, los ingredientes activos en la composición tienen una pureza superior al 50%, normalmente una pureza superior al 80%, a menudo una pureza superior al 90% y más preferiblemente una pureza superior al 95%, 98% o 99%. Se usan con mayor frecuencia con ingredientes activos que se aproximan al 100 % de pureza, por ejemplo, aproximadamente el 99,5 % de pureza o aproximadamente el 99,9 % de pureza.
La composición de la presente invención se puede usar como vacuna frente a infecciones causadas porN. meningitidis.La composición se puede usar como vacuna dirigida a la meningitis u otras enfermedades meningocócicas invasivas que incluyen septicemia o shock séptico. La vacuna se puede administrar de forma profiláctica a personas en riesgo de exposición aN. meningitidis,y/o de forma terapéutica a personas que ya han estado expuestas aN. meningitidis.
Preferiblemente, si la composición se usa como una vacuna, la composición comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno en donde la composición comprende al menos una proteína de unión al factor H modificada. Una "cantidad inmunológicamente eficaz" de un antígeno es una cantidad que, cuando se administra a un individuo, ya sea en una dosis única o en una serie de dosis, es eficaz para el tratamiento o la prevención de la infección porN. meningitidis.Esta cantidad variará dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar y del antígeno. La determinación de una cantidad eficaz de una composición inmunogénica o de vacuna para su administración a un organismo está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.
Una composición de acuerdo con la invención puede ser para administración oral, sistémica, parenteral, tópica, mucosal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intranasal, intravaginal, intra-rectal, transdérmica, sublingual, por inhalación o en aerosol.
La composición se puede disponer para administrarse como una dosis única o como parte de un programa de dosis múltiples. Se pueden administrar múltiples dosis como inmunización primaria seguidas de una o más inmunizaciones de refuerzo.
Se pueden determinar de forma rutinaria los tiempos adecuados entre el primado y el refuerzo de las inmunizaciones.
Una composición de acuerdo con la invención se puede usar de forma aislada, o se puede combinar con una o más composiciones inmunogénicas o de vacuna diferentes, y/o con uno o más regímenes terapéuticos diferentes.
Las composiciones de la invención pueden ser capaces de inducir respuestas de anticuerpos bactericidas en suero y provocar anticuerpos que median la opsono-fagocitosis después de ser administradas a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y los resultados son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna.
Las composiciones de la invención también pueden, o alternativamente, ser capaces de provocar una respuesta inmune que neutralice las proteínas bacterianas u otras moléculas, impidiendo así que tengan su función normal y previniendo o reduciendo la progresión de la enfermedad sin necesariamente destruir el organismo/bacteria patógeno, en este caso a laN. meningitidis.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una proteína de unión al factor H modificada para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección o enfermedad causada por Neisseria meningitidis y/o Neisseria gonorrhoeae, en donde la proteína de unión al factor H modificada es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se administra a un ser humano o a un animal no humano que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la Sec ID N.°: 1, y que tiene una alanina en la posición número 283, como se define en la Sec ID N.°: 1 en lugar de un ácido glutámico, lo que da como resultado que no haya unión al factor H, o al menos 5 veces menos unión al factor H en comparación con la proteína de unión al factor H de la Sec ID N.°: 1. El medicamento se puede usar para la vacunación profiláctica o terapéutica de sujetos frente aN. meningitidis.El medicamento puede ser una vacuna profiláctica o terapéutica. La vacuna puede ser para meningitis, septicemia y/o shock séptico causado porN. meningitidis.
De acuerdo con otro aspecto más (que no forma parte de la presente invención), se proporciona una composición que comprende una o más proteínas de unión al factor H modificadas para su uso en la generación de una respuesta inmune aN. meningitidis.La respuesta inmune puede ser profiláctica o terapéutica. La composición puede ser para uso como vacuna.
De acuerdo con otro aspecto más (que no forma parte de la presente invención), se proporciona un método para proteger a un ser humano o a un animal no humano de los efectos de la infección porN. meningitidisque comprende administrar al ser humano o al animal no humano una composición de acuerdo con cualquier otro aspecto de la invención. La composición puede ser una vacuna.
De acuerdo con otro aspecto (que no forma parte de la invención), se proporciona un método para generar una respuesta inmune en un ser humano o un animal no humano que comprende administrar una composición farmacéutica de acuerdo con la invención al ser humano o al animal no humano. La respuesta inmune es preferiblemente protectora. El método puede generar una respuesta de refuerzo en un paciente que ya ha sido primado. La respuesta inmune puede ser profiláctica o terapéutica.
Una forma de comprobar la eficacia de un tratamiento terapéutico que comprende la administración de una composición de acuerdo con la invención implica monitorizar la infección porN. meningitidisdespués de la administración de la composición. Una forma de comprobar la eficacia de un tratamiento profiláctico que comprende la administración de una composición de acuerdo con la invención implica monitorizar las respuestas inmunes frente aNeisseria meningitidisdespués de la administración de la composición.
De acuerdo con otro aspecto (que no forma parte de la presente invención), se proporciona el uso de una o más proteínas de unión al factor H modificadas en la preparación de un medicamento para su uso en la inmunización de mamíferos humanos o no humanos frente a la infección porN. meningitidis.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención (que no forma parte de la presente invención), se proporciona un kit para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un organismo, que comprende una composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la invención e instrucciones relacionadas con la administración.
Además de su uso potencial como vacunas, las composiciones de acuerdo con la invención pueden ser útiles como reactivos de diagnóstico y como una medida de la competencia inmune de un vacunado.
Si bien todas las declaraciones de invención y características preferibles discutidas anteriormente se refieren aN. meningitidis,el experto apreciará que se podrían aplicar igualmente aN. gonorrhoeae.
El experto apreciará que cualquiera de las características preferibles analizadas anteriormente se puede aplicar a cualquiera de los aspectos de la invención.
A continuación, se describirán realizaciones preferidas de la presente invención, simplemente a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.
Figuras 1a a 1f - Las Figuras 1a a 1f demuestran que el sitio de unión de la proteína de unión al factor H está localizado en el CCP6 del factor H y requiere la porción extracelular completa de la proteína de unión al factor H. La Figura 1a muestra el análisis de Far Western de la unión del factor H a la proteína de unión del factor H intacta y versiones truncadas de esta (como se indica). Las membranas se incubaron con factor H purificado que se detectó con pAbs afH. Sólo se observó unión a la proteína de unión al factor H intacta de 27 kDa (mostrada con una flecha). La Figura 1b muestra los resultados del análisis FACS con pAbs a-fH que detectaron la unión entreN. meningitidisy el factor H. La Figura 1c usa los resultados de SPR para demostrar que la proteína de unión al factor H solo es capaz de unirse a constructos de factor H que contienen CCP6. El recuadro muestra un ajuste de Langmuir 1:1 a una serie de diluciones de fH67 inyectadas sobre una superficie de proteína de unión al factor H para determinar los parámetros cinéticos. La Figura 1d muestra los resultados de los estudios de competición por FACS (que usan mAb a-fH dirigido frente a CCP5 y, por lo tanto, incapaz de reconocer el constructo fH67) que demuestran que el constructo fH67 corto (entre ~0,3 y 30 gM) puede competir para eliminar la unión del factor H de longitud completa, lo que demuestra que este constructo contiene todo el sitio de unión de la proteína de unión del factor H. Los valores mostrados son la intensidad de fluorescencia media de tres experimentos ± sd. La Figura 1e muestra que la cuantificación con SPR confirma que es necesaria y suficiente la presencia de CCP6 para una unión de alta afinidad a la proteína de unión del factor H y que el polimorfismo del factor H común en CCP7 (402His/Tyr) no altera significativamente la afinidad de la unión de fHbp. La figura 1f es una tabla que ilustra las constantes de unión obtenidas usando resonancia de plasmón de superficie con la proteína de unión al factor H en la superficie del chip y los constructos del factor H en la fase fluida. Los ajustes se realizaron usando el software BiaEvaluación 2.0 y un modelo Langmuir 1:1. Los valores mostrados son media ± desviación estándar, Chi2 son la calidad de los indicadores de ajuste proporcionados en BiaEvaluación 2.0.
Figuras 2a a 2c - ilustran la estructura de la proteína de unión al factor H y su complejo con fH67. La Figura 2a muestra dos vistas de una representación gráfica de la proteína de unión al factor H (residuos 80 a 320). Se indican las regiones A, B y C. La Figura 2b muestra un gráfico del complejo fHbp:fH67 entre la proteína de unión al factor H y los CCPs 6 y 7 del factor H. Las cadenas laterales de ambas proteínas implicadas en la formación de puentes salinos a través de la superficie de interacción se muestran como representaciones de barras y esferas (ampliadas y reorientadas en el cuadro insertado). La Figura 2c ilustra la topología de la proteína de unión al factor H y de fh67, se indican los residuos implicados en las interacciones de enlace de H o de puente salino entre las proteínas. Los círculos sólidos indican residuos que forman un enlace de hidrógeno con su pareja. Las estrellas sólidas indican residuos que forman un puente salino con su pareja. El asterisco indica una interacción que sólo se ve en algunas de las copias independientes de la estructura del complejo,
La Figura 3 - se refiere a la interfaz entre la proteína de unión al factor H y el factor H, y demuestra que la mutagénesis de sitio dirigido para reemplazar las cadenas laterales cargadas con alanina tanto en el factor H como en la proteína de unión al factor H, causa la abolición de la unión de cada una a la forma de tipo salvaje de su pareja en concentraciones cercanas a la KD de tipo salvaje. La barra negra indica el período de tiempo durante el cual se inyectaron los analitos del factor H (a 50 nM, 40 gl.min-1) sobre las superficies de la proteína de unión al factor H.
La Figura 4 - considera la flexibilidad en el complejo fH67/fHbp usando una superposición de las siete copias cristalográficamente independientes del complejo fH67/fHbp a partir de las dos formas cristalinas (cuatro copias del complejo en la forma P1 y 3 copias en la forma C2). El alto grado de similitud, a pesar de los entornos de empaquetamiento muy diferentes, indica que el complejo es biológicamente relevante. El reordenamiento de las proteínas dentro del complejo se limita a una pequeña cantidad de movimiento en la posición de CCP7 de fH67 en relación con CCP6 y la proteína de unión al factor H. Los bucles de la proteína de unión al factor H que se encuentran más cerca de CCP7 también son relativamente móviles, como lo indican sus factores de temperatura más altos (que se muestran aquí como una representación de masilla "más gruesa").
La Figura 5 - muestra la localización de los epítopos de anticuerpos mapeados en la superficie de la proteína de unión al factor H. Los residuos en los epítopos protectores deCCPibed en 12,20,21 se muestran en representaciones de CPK (Glu 211, Arg 214 y Arg 269) coloreadas por elemento (C verde, N azul, O rojo). Los epítopos de anticuerpos que bloquean la unión al factor H se muestran como coloreados CPK de acuerdo con el color de la proteína de unión al factor H (región "A" amarilla, región "B" verde, región "C" cian). Si bien ninguno de estos epítopos se asigna directamente al sitio de reconocimiento del factor H, todos se encuentran lo suficientemente cerca como para que la unión del anticuerpo grande es probable que obstaculice el reconocimiento del factor H. La cadena lateral de histidina en el residuo polimórfico 402 del factor H también se muestra en una representación CPK. Aunque este residuo se encuentra cerca de un contacto secundario con la proteína de unión al factor H (aproximadamente los residuos 103 a 108; consúltese la Figura 2), la evidencia a partir de SPR de las dos formas polimórficas sugiere que este no es un contacto crítico. Esto también está respaldado por el hecho de que esta región del complejo (tanto los bucles GNA como el dominio del factor H) es la región más móvil observada con una variación significativa en la forma en que las dos proteínas se ponen en contacto entre sí, como se ve en este punto entre las copias cristalográficas independientes del complejo (Figura 4).
La Figura 6 - es la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión al factor H (Sec ID N.°: 6). Esta proteína tiene el número de acceso de GenBank: AAF42204.
La Figura 7 - Estructura del complejo fHbp:fH67. La Figura 7A - fHbp se muestra como un gráfico (en verde los residuos conservados entre familias, en rojo los no conservados) y fH67 se muestra como un modelo de superficie. La Figura 7B - Los residuos que varían entre el fH murino y el humano se muestran en rojo; el presente trabajo ha demostrado que los residuos amarillos afectan a la unión de fH.
La Figura 8 - Unión de fHbp de las variantes 1, 2 y 3 con fH678 determinada por SPR. También se examinaron las interacciones con el homólogo gonocócico, NGO0033.
La Figura 9A, la calorimetría de titulación isotérmica confirma que la interacción fHbp/fH se caracteriza por una KD nM en solución. La Figura 9B, la estructura del doble mutante de fHbp de Glu a Ala confirma que los únicos cambios estructurales se encuentran en las cadenas laterales mutadas (indicados por la diferencia de densidad electrónica roja en un mapa aC, FO-FC). La Figura 9C, respuesta de los dominios 5, 6 y 7 del factor H a 5 nM que fluyeron sobre la fHbp WT y mutante (línea de datos superior = fHbp Variante 1, línea de datos inferior = fHbp Variante 1 DM). La Figura 9D, respuesta del Factor H intacto a 20 nM que fluyó sobre la fHbp WT y mutante (línea de datos superior = fHbp Variante 1, línea de datos inferior = fHbp Variante 1 DM).
La función de la proteína de unión al factor H, cuya secuencia se muestra en la Figura 1, se ha estudiado previamente subdividiendo la proteína en una serie de regiones, denominadas "A", "B" y "C", que cubren todo el dominio extracelular (Giuliani y cols. (2005) Infect Immun 73, 1151-60). El análisis de transferencia de Western demuestra que las tres regiones son necesarias para interacciones de alta afinidad entre el factor H y la proteína de unión al factor H (Figura 1a), lo que implica que la proteína de unión al factor H tiene un sitio de reconocimiento extendido para el factor H en toda su superficie.
Para identificar cuál de los 20 dominios CCP del factor H media la interacción con la proteína de unión al factor H, se usaron las siguientes técnicas: análisis Far Western; análisis FACS (Figura 1b); y resonancia de plasmón de superficie (Figura 1c). Los resultados obtenidos demuestran que la región clave del factor H reconocida por la proteína de unión al factor H es el sexto dominio, CCP6 y que los constructos que contienen CCP6 eran capaces de inhibir la interacción dependiente de la proteína de unión al factor H entre el factor H yN. meningitidis(Figura 1d). La cuantificación de la interacción demuestra que la constante de disociación es ~ 5 nM (Figuras 1c, 1e y 1f) para cualquier constructo que contenga CCP6. Esta interacción no se disociaba por un alto contenido de sal (NaCl 1 M, no se muestra) o un pH que varíe de 4 a 8 (no se muestra), lo que proporciona un respaldo adicional para la naturaleza de alta afinidad del evento de unión.
Con referencia a las Figuras 9A-D, la resonancia de plasmón de superficie demuestra que el doble mutante de fHbp se une a los dominios 6 y 7 del factor H con una KD dos órdenes de magnitud mayor. El mutante también se une a un constructo más largo (que consiste en los dominios 5, 6 y 7) y al factor H de longitud completa (purificado a partir de suero) mucho más débilmente que la fHbp de tipo salvaje.
Se obtuvieron estructuras cristalinas del complejo entre los CCPs 67 del factor H (conocido de ahora en adelante como fH67) y la porción extracelular de la proteína de unión al factor H que comprende las regiones A, B y C, y se construyeron modelos para la proteína de unión al factor H y fH67 y refinaron a 2,35 A en dos formas cristalinas con un total de siete copias independientes del complejo (Figuras 2a, b y c). Como se puede observar en la Figura 2a, la porción extracelular de la proteína de unión al factor H se pliega para formar dos barriles p con el barril N-terminal que consiste en las regiones "A" y parte de las regiones "B", mientras que el barril C-terminal está compuesto por el resto de las regiones "B" y "C". Una búsqueda en bases de datos estructurales con el barril N-terminal no reveló homólogos estructurales cercanos, y las distintas topologías de los barriles p (Figura 2c) sugieren que no surgieron por un evento de duplicación genética.
El complejo fH67:fHBP (el factor H:proteína de unión al factor H) se mantiene unido mediante interacciones extensas entre ambos barriles p de la proteína de unión al factor H y el CCP6 del factor H (Figura 2b), esto es consistente con los estudios de unión. En particular, la inserción helicoidal en la segunda cadena p del CCP6 (una característica inusual de este dominio CCP) está ubicada centralmente en el complejo. El análisis realizado por el servidor PISA otorga a los siete complejos independientes una puntuación de significancia de 1,0 (es decir, extremadamente probable que sea biológicamente significativo), siendo la superficie promedio de la proteína de unión al factor H escondida en el complejo (2860 ± 177A2) mayor que la escondida en la mayoría de los complejos anticuerpo: antígeno. Además, el AG predicho en función de la estructura para la formación del complejo (-6 kcal/mol) concuerda bien con la afinidad derivada de los estudios de unión (-11 kcal/mol, calculada a partir de la KD presentada en la Figura 1e), lo que proporciona un apoyo adicional a la relevancia fisiológica del complejo cristalizado. La superficie de interacción muestra una buena complementariedad de forma con numerosas interacciones electrostáticas (Figura 2c), que incluyen múltiples enlaces de hidrógeno y puentes salinos. Consistente con los estudios de interacción de fHbp:fH que no detectaron diferencias en la unión (Figura 1e, Figura 4 y Figura 5) entre las isoformas 402His/Tyr del factor H asociadas con la degeneración macular relacionada con la edad. La His402 participa solo periféricamente en la interacción con la proteína de unión al factor H y contacta con el bucle flexible entre las cadenas 1 y 2 del barril p N-terminal de la proteína de unión al factor H (Figura 4).
Para investigar más a fondo la superficie de interacción, se generaron formas doblemente mutadas/sustituidas de ambas proteínas, en las que se reemplazaron las cadenas laterales cargadas por el pequeño residuo hidrofóbico Alanina (A). En el fH67 las mutaciones realizadas fueron R341A y H337A, y en la proteína de unión al factor H las mutaciones realizadas fueron E283A y E304A. El uso de SPR para estudiar las interacciones entre las proteínas mutadas y sus parejas de tipo salvaje reveló que la afinidad de ambas formas mutantes se redujo en más de dos órdenes de magnitud, de modo que casi no se pudo observar interacción en concentraciones de analito (~ 50 nM) aproximadamente diez veces la KD de tipo salvaje (Figura 3a). A una concentración de analito mil veces mayor (rangoiM )las formas mutantes de ambas proteínas interaccionaron con las parejas de tipo salvaje: fHbpE283A,E304A mantuvieron una tasa de activación cualitativamente similar pero una tasa de desactivación aumentada con respecto a las de tipo salvaje, mientras que fH67R341A,H337A fue más similar a la interacción de tipo salvaje en su tasa de desactivación, pero tuvo una tasa de activación muy reducida (Figura 1e).
Las fHbp de diferentes familias comparten características de unión
Las cepas de N. meningitidis expresan una única fHbp que pertenece a una de las tres familias de variantes: variante 1, variante 2 y variante 3. Este trabajo se ha centrado en la fHbp de la variante 1, ya que es la familia más prevalente entre los aislados de enfermedades. La figura 7 muestra la variación de secuencia entre las tres familias mapeadas en la estructura del complejo y demuestra que, aunque el nivel de conservación de secuencia es alto (> 60% idéntico), existe una variación significativa alrededor del sitio de unión de fH. Por lo tanto, se determinó si el modo de reconocimiento de fH se conserva entre las diferentes familias de fHbp y si los mismos residuos de fHbp y fH son clave para la unión. Esta es información esencial para generar variantes de fHbp de unión reducida para evaluarlas como vacunas.
Con este fin, se han clonado, expresado y purificado la fHbp de la variante 2 y de la variante 3, y se han comenzado a caracterizar sus interacciones con fH (Fig. 8). Hasta la fecha estos estudios de SPR indican que los modos de reconocimiento son similares; las afinidades son del mismo orden de magnitud y la mutación de los mismos residuos en fH tiene un efecto drástico sobre la unión a las fHbps de todas las familias (no se muestra). Es de destacar que, si bien el homólogo de fHbp de Neisseria gonorrhoeae (NGO0033) está estrechamente relacionado con la variante 3 (91% de identidad de aminoácidos), la proteína purificada no interacciona con fH en un grado apreciable (Fig. 8).
El mutante fHbpE283A,E304A conserva su estructura atómica
Una posible explicación para el fracaso del mutante fHbpE283A,E304A (doble mutante, DM) para unirse a fH67 con una constante de disociación (KD) en el rango nanomolar (nM) es que los cambios de aminoácidos alteran la estructura general de la proteína. Para abordar esto, se determinó la estructura cristalina del mutante fHbpE283A,E304A en el complejo con fH67.
Los resultados confirmaron que los únicos cambios estructurales en fHbp fueron en las cadenas laterales mutadas (Fig. 9B). Además, se determinó la relevancia de estas mutaciones en la unión a fH5,6,7 y a fH de longitud completa (Fig. 9C y D). Se pudo observar que las concentraciones de fH en el rango de 10 nM interaccionan con la proteína de tipo salvaje, lo que sugiere que la afinidad por el fH de longitud completa está en el mismo rango que la de los fragmentos más pequeños (p. ej., fH5,6,7). Sin embargo, la afinidad de unión de la proteína fHbpE283A,E304A se reduce drásticamente en comparación con la proteína de tipo salvaje.
El mapeo de epítopos publicados de la proteína de unión al factor H que genera anticuerpos bactericidas (Giuliani y cols. (2005) Infect Immun 73, 1151 -60; Cantini y cols. (2006) J. Biol Chem. 281,7220-7) sobre la estructura demuestra que ninguno de los sitios caracterizados hasta ahora se encuentra directamente en el sitio de reconocimiento del factor H. Sin embargo, los epítopos reconocidos por los anticuerpos que afectan a la unión del factor se localizan alrededor del borde del sitio de reconocimiento y, por lo tanto, es probable que inhiban la unión del factor H por impedimento estérico (Figura 5).
Los mutantes simples y dobles de fHbp conservan su inmunogenicidad
Para examinar el impacto de los cambios de aminoácidos E283A y E304A, se expresaron y purificaron las proteínas de la variante 1 de fHbp con estas sustituciones de forma aislada (es decir, fHbpE283A y fHbpE304A) o en combinación (fHbpE283A,E304A). Se usaron fHbp de tipo salvaje y estas proteínas para inmunizar grupos de ratones (5/grupo) y se determinó la presencia de anticuerpos bactericidas en sueros inmunes. Los resultados (Tabla 1) se expresan como el recíproco de la dilución más alta de suero que produjo el 50 % o más de eliminación del serogrupo B deN. meningitidis(cepa H44/76) de tipo salvaje. Los sueros pre-inmunes no provocaron la muerte.
Tabla 1 Títulos de anticuerpos bactericidas en suero (ABS) en animales inmunizados con fHbp de tipo salvaje o mutante
Los resultados muestran que las proteínas mutantes tienen al menos la misma capacidad para provocar títulos de ABS frente al serogrupo B deN. meningitidiscomo la proteína de tipo salvaje.
Métodos
Análisis de Western Blot: Las muestras de proteína se separaron mediante SDS-PAGE y luego se transfirieron a membranas de PVDF a 15 V durante 60 minutos. Las membranas se bloquearon en leche al 5% en PBS a 4°C durante toda la noche, se lavaron una vez en PBSTM (PBS, Tween20 al 0,05%, leche desnatada al 0,5%) y luego se incubaron con anticuerpos primarios o una fuente de fH durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados en PBSTM, las membranas se incubaron con pAbs a- fH humano de cabra (a una dilución final de 1:1.000) o pAbs afHbp murino (a una dilución final de 1:10.000) en PBS. La unión se detectó con una a-IgG de conejo conjugada con peroxidasa (Dakocytomation) que se usó a una dilución de 1:500.
Análisis de citometría de flujo: Se incubaron un total de 108N. meningitidiscon 10 pl de fH purificado (2 pM) o CCPs (concentración final, 3 mM) durante 30 minutos a 37 °C. Después de tres lavados con PBS-Tween20 al 0,1% (PBST), las bacterias se incubaron durante 30 minutos con un mAb MRC OX241 o con pAbs a-factor H humano en PBS. Después de tres lavados en PBST, las células se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 minutos en la oscuridad a 4°C. El factor H unido a los meningococos se detectó mediante citometría de flujo usando un analizador FACS Calibur (Becton Dickinson). Para los ensayos de inhibición, se incubó factor H de longitud completa con bacterias junto con concentraciones crecientes de CCPs 67 como se indica.
Expresión de proteínas y purificación del complejo: La proteína de unión al factor H y las versiones truncadas de la proteína se expresaron en células huéspedE. coliBL21 (DE3) como proteínas de fusión marcadas con polihistidina en su extremo C terminal (Masignani y cols. (2003) J Exp Med Vol 197, N.° 6, 789-97). Los cultivos de las cepas se crecieron hasta la fase logarítmica media y se indujo la expresión con isopropil-D-tiogalactósido (IPTG, concentración final 1 mM). Las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad en una columna His-Trap de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) y se eluyeron de las columnas con imidazol 250 mM. Los constructos del factor H se expresaron enE. colicomo se describió anteriormente (con re-plegamiento para permitir la formación correcta de los cuatro enlaces disulfuro dentro de los dos fragmentos de CCP) y se purificaron mediante purificación por afinidad en columna de heparina o mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Después de la mezcla de fHbp con fH67 (en un gran exceso molar), el complejo se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex S-200, GE Healthcare Inc., tampón Tris pH 7,5, NaCl 150 mM) donde la fuerte interacción observada entre el fH67 no acomplejado y la matriz de la columna aseguró una buena separación del pico que contenía el complejo y el que contenía el exceso de fH67. La presencia de ambas proteínas en el supuesto pico del complejo se confirmó mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas (datos no mostrados).
Mutegénesis de sitio dirigido: Se generaron mutantes dobles de forma secuencial usando el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuikChange (Stratagene).
La forma doble mutante R341A, H337A de fH67 se generó usando los siguientes cebadores:
H337A hacia adelante,
5’AAACATGGAGGTCTATATGCTGAGAATATGCGTAGACCATACTT
TCC3’ (Sec ID N.Q: 2) ;
H337A reverso,
5’TTTGTACCTCCAGATACGACTCTTATACGCATCTGGTATGAAAG
G3’ (Sec ID N.Q: 3)
R341A hacia adelante,
5 ’ GGTCTATATC ATG AG AATATGGCTAG ACC ATACTTTCC AGTAGC
3’ (Sec ID N.Q: 4)
R341A reverso,
5 ’ CC AGAT AT AGT ACTCTTATACCGATCTGGT ATGA AAGGTC ATCG
3’ (Sec ID N.Q: 5)
La introducción de la mutación se confirmó mediante secuenciación. Los fragmentos de fH67 mutantes recombinantes se expresaron y replegaron a partir de cuerpos de inclusión como se describió anteriormente (Prosser y cols. (2007) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Common 1 de junio: 63 (PT6): 480-3).
Para la generación de la proteína de unión al factor H E283A, E304A, los cebadores usados fueron:
E283A hacia adelante 5' ACAACCAAGCCGCAAAGGCAGTTAC 3';
E283A reverso, 5' GTAACTGCCTTTCGCGGCTTGGTTGT 3';
E304A hacia adelante TGCCGGCAGCGCGGCAGTGAAAACCG 5';
E304A reverso 5' CGGTTTTCACTGCCGCGCTGCCGGCA 3'
y la proteína se expresó y purificó como se describió anteriormente.
Resonancia de plasmones de superficie: La proteína de unión al factor H o los constructos del factor H se acoplaron a la superficie del sensor (chips CM5) usando protocolos de acoplamiento de amina estándar. Luego se hizo fluir el ligando apropiado en la fase fluida a una velocidad de flujo de 40 gl/min. La fuerte interacción no se interrumpió usando alta/baja sal (NaCl de 0 a 3 M) o pH extremo (intervalo probado de 4 a 8) y, por lo tanto, se usó un tiempo de disociación extendido (60 minutos) entre inyecciones sucesivas. Los datos obtenidos con la proteína de unión al factor H de mayor tamaño en la fase fluida no se pudieron ajustar satisfactoriamente usando un modelo simple 1:1 (presumiblemente debido a problemas de movimiento de la proteína más grande dentro/fuera de la matriz del chip o al impedimento estérico en el sitio de unión del factor H introducido mediante el acoplamiento de la proteína más pequeña a la superficie del chip), el análisis sin refinar de los valores cercanos al equilibrio sugirió una KD en el intervalo de decenas a cientos de nM (dependiendo del constructo de factor H usado). Una vez que se revirtió la interacción (con fH sobre el chip), los datos se pudieron ajustar satisfactoriamente (Figura 1f) usando un modelo de Langmuir 1:1 con c2 de ~ 3 que revela que la verdadera KD para los constructos que contienen CCP6 era del orden de 5 nM (véase la Figura 1f). También se analizaron fH67 y los mutantes dobles de la proteína de unión al factor H con la pareja de fHbp acoplada a la superficie del chip (fHbpwT ~ 800 RU acoplada en el canal 1, fHbpE283A,E304A ~ 1500 RU acoplada en el canal 2). Luego se hicieron fluir fH67 (WT y mutante) a una concentración de 50 gM (~ 10 x de la K<d>nativa) lo que reveló escasa o ninguna interacción de los mutantes con su pareja WT en comparación con la magnitud de la interacción observada con el emparejamiento WT. Para calcular la afinidad de fH67R341A,H337A para fHbpwT se usaron una serie de inyecciones (por duplicado) que abarcaban el intervalo de concentración de 250 nM a 20 gM y se ajustaron usando el software BiaEvaluación para obtener los valores que se muestran en la Figura 1f.
Cristalización y recogida de datos de rayos X: Los cristales se crecieron usando el método de difusión de vapor en gota sentada a partir de 0,2 gl de complejo 0,2 gl de gotas de licor madre (complejo a 4,5 mg/ml calculado usando un coeficiente de extinción supuesto de 2,2, licor madre optimizado aproximadamente de la condición JCSG-plus 15, polietilen glicol 6000 MW al 20 %, Bicina 0,1 M, pH 9,0). La recogida de los cristales y la SDS-PAGE confirmaron que tanto fH67 como la proteína de unión al factor H estaban presentes (datos no mostrados). Los cristales (normalmente 50 x 10 x 5 gm) se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido después de la crioprotección con etilen glicol al 15%. Los datos se recopilaron tanto en ESRF como en Diamond mediante el método de rotación que usa un intervalo de oscilación de 0,5 o de 1 grado con el cristal mantenido a 120 K. Los datos de Native P1 se recogieron en la línea de luz ID14eh4 (ESRF) con lambda 0,9523 Á, los grupos Native C2 y Pt se recogieron en la línea de luz I03 (Diamond) con lambda 0,9814 Á, el conjunto Hg en la línea de luz BM14 (ESRF) con lambda 1,003 Á y el S-SAD en la línea de luz ID29 (ESRF) con lambda 1,8 Á. Los datos se integraron y escalaron usando xia2 con la opción -3d para forzar el uso del programa XDS4 para la integración y el programa Scala5 para el escalado entre cuadros.
Solución y refinamiento de estructura: La estructura del complejo fh67/fHbp se resolvió en forma cristalina C2 mediante una combinación de reemplazo molecular con la estructura de fh67 (tomada de la estructura anterior de fH678 en complejo con octasulfato de sacarosa, SOS, PDBID:2UWN) y métodos MIRAS que usan derivados de Pt, Hg y la dispersión anómala de 31 de los 33 azufres presentes en la unidad asimétrica C2. Se encontraron tres copias de fH67 usando MolRep7 (CCP4 Program Suite) y se refinó el cuerpo rígido de dos dominios CCP usando Buster-TNT sin modelar los átomos ausentes. Luego, estas fases se incorporaron en un trabajo en fase SHARP y se usaron para localizar los sitios de los átomos pesados en los otros cristales (6 Pt, 1Hg y 31 S). El modelo de átomo pesado se refinó en SHARP (con el factor B fijado al valor de Wilson para cada cristal) usando datos de 3,2 Á y las fases generadas se combinaron con las del reemplazo molecular dentro de SHARP para generar fases con una cifra de mérito de 0,54 (0,35 para la estructura de mayor resolución (3,3-3,2A). Las potencias de fase para los derivados fueron (anómalas/isomorfas) 0,7/2,4 para el Pt, 0,2/0,3 para el Hg y 0,3/0,0 para la señal anómala de azufre. El mapa obtenido usando estas fases se aplanó con disolvente dentro de SHARP y se promedió en DM usando tres operadores separados para las regiones de la proteína de unión al factor H, el factor H CCP6 y el factor H CCP7. El modelo de r Mn (Cantini y cols. (2006) J Biol Chem 17 de marzo: 281(11): 7220-7) para el barril C-terminal de la proteína de unión al factor H no se pudo situar en esta densidad (se vio que las cadenas estaban distorsionadas), por lo que se construyó un modelo a mano usando el programa Coot. Se realizó la reconstrucción y el refinamiento usando datos en el intervalo de 40 a 2,35 Á usando Coot y Buster-TNT sin simetría cristalográfica usada para restringir el núcleo de cada dominio, mientras que se permitía más variación entre la región del bucle hasta que R/Rlibre fue 25,5/27,1 sin residuos en las regiones no permitidas del gráfico de Ramachandran (94,6% en la más favorecida, según lo determinado por MolProbity). El modelo contiene todos los residuos de fH67 y todos menos cinco residuos en el extremo N-terminal de la proteína de unión al factor H y las seis histidinas de la etiqueta de afinidad que están desordenadas en todas las copias de la molécula. El reemplazo molecular de los dominios individuales (factor H CCP6 y CCP7 y la proteína de unión al factor H) usando el programa MoIRep permitió la resolución de la forma cristalina P1 (cuatro copias independientes del complejo en una disposición de empaquetamiento diferente). La reconstrucción menor de las regiones del bucle y el refinamiento (90 a 2,35 Á) usando Coot/Buster-TNT llevaron una vez más a un R/Rlibre de 23,2/26,3 sin residuos en las regiones no permitidas del gráfico de Ramachandran (95,3 % en la más favorecida). Las figuras estructurales se dibujan usando el programa PyMol.
Protocolo de vacunación
Se inmunizaron ratones BALB/C de siete semanas de edad por vía subcutánea con fHbp purificada o con fHbp mutante por vía subcutánea con adyuvante de Freund los días 0 y 10. Cada animal recibió 25 microgramos de proteína en PBS con un volumen igual de adyuvante hasta un volumen total de 200 microlitros. El día 14 se sacrificaron los animales y se recogieron los sueros de los ratones y se combinaron, luego se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80°C.
Actividad bactericida sérica (ABS)
La cepa H44/76 de Neisseria meningitidis del serogrupo B se creció durante toda la noche en medio sólido, se recogió en PBS y se cuantificó el número de unidades formadoras de colonias. Se añadieron diluciones en serie de sueros a las bacterias (104 UFC en tampón ABS) y el complemento de conejos bebé (Pelfreeze, dilución final 1 en 8) durante 1 hora y se determinó el número de bacterias supervivientes mediante siembra en placas en medios sólidos.
Claims (7)
1. Una composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o prevención de infección o enfermedad causada porNeisseria meningitidisy/oNeisseria gonorrhoeae,que comprende al menos una proteína de unión al factor H modificada, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se administra a un ser humano o un animal no humano, en donde la proteína de unión al factor H modificada tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la Sec ID N.°: 1, y tiene una alanina en la posición número 283 como se define en la Sec ID N.°: 1 en lugar de ácido glutámico, lo que da como resultado que no se una al factor H, o que se una al menos 5 veces menos al factor H en comparación con la proteína de unión al factor H de Sec ID N.°:1.
2. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de unión al factor H deriva deNeisseria meningitidiso deNeisseria gonorrhoeae.
3. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende uno o más antígenos adicionales además de la proteína de unión al factor H modificada.
4. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune protectora frente aNeisseria meningitidisy/oNeisseria gonorrhoeae.
5. El uso de una proteína de unión al factor H modificada para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección o enfermedad causada porNeisseria meningitidisy/oNeisseria gonorrhoeae,en donde la proteína de unión al factor H modificada es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se administra a un ser humano o a un animal no humano que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la Sec ID N.°: 1, y que tiene una alanina en la posición número 283 como se define en la Sec ID N.°: 1 en lugar de ácido glutámico, lo que da como resultado que no haya unión del factor H, o al menos 5 veces menos unión de factor H en comparación con la proteína de unión al factor H de la Sec ID N.°: 1.
6. El uso de la proteína de unión al factor H modificada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la proteína de unión al factor H se deriva deNeisseria meningitidiso deNeisseria gonorrhoeae.
7. El uso de la proteína de unión al factor H modificada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición es capaz de provocar una respuesta inmune protectora frente aNeisseria meningitidisy/oNeisseria gonorrhoeae.
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