ES2966738T3 - Formulación inyectable de ácido transretinoico total - Google Patents
Formulación inyectable de ácido transretinoico total Download PDFInfo
- Publication number
- ES2966738T3 ES2966738T3 ES17841089T ES17841089T ES2966738T3 ES 2966738 T3 ES2966738 T3 ES 2966738T3 ES 17841089 T ES17841089 T ES 17841089T ES 17841089 T ES17841089 T ES 17841089T ES 2966738 T3 ES2966738 T3 ES 2966738T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- total
- injectable formulation
- tumor
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 title claims abstract description 152
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 title claims abstract description 152
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 title claims description 114
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 title claims description 98
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 88
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 11
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 10
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 10
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims description 9
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 9
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 11
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 6
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 3
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 3
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 108050005848 Annexin A10 Proteins 0.000 description 2
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101150016155 Pml gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002690 Polyoxyl 40 HydrogenatedCastorOil Polymers 0.000 description 1
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 1
- 101150066717 Rara gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940124302 mTOR inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003628 mammalian target of rapamycin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000001565 modulated differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 150000002266 vitamin A derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
- A61K31/203—Retinoic acids ; Salts thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
La presente invención proporciona un inyectante de ácido todo-trans-retinoico y una aplicación del mismo en un producto farmacéutico para el tratamiento de un tumor. El inyectante de ácido totalmente transretinoico comprende un ácido totalmente transretinoico y un solubilizante. La solubilidad aparente del ácido todo-trans-retinoico aumenta de 0,01 mg/ml a 0,1 mg/ml o más. Una preparación de la invención puede reducir la actividad de un grupo de células inmunosuprimidas sumergidas dentro de la sangre o del tejido tumoral de un paciente con cáncer, y mejorar un efecto de limpieza inmune contra un tumor. La preparación se puede aplicar de forma independiente o junto con otro producto farmacéutico para suprimir el crecimiento tumoral o la recurrencia del tumor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Formulación inyectable de ácido transretinoico total
Antecedentes de la presente divulgación
Campo de divulgación
La presente divulgación se refiere al campo técnico de los productos biofarmacéuticos y, en particular, a una formulación inyectable de ácidotransretinoicototal y a su aplicación.
Descripción de las artes relacionadas
El ácido retinoico es un metabolito de la vitamina A en el organismo. Como fármaco, el ácidotransretinoicototal (ATRA) se utiliza sobre todo para tratar el acné. También es un fármaco importante para el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda (LPA). Actualmente, el ácidotransretinoicototal se administra clínicamente en formas farmacéuticas orales.
El ácidotransretinoicototal (ATRA) afecta a la expresión génica al unirse a receptores específicos (RAR, RXR y ROR) en las células. En el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda, puede promover la diferenciación de las células APL y la degradación del gen PML/RARa para lograr efectos terapéuticos (Effectiveness and Pharmacokinetics of Low-Dose All-trans RetinoicAcid (25 mg/m2) in Acute Promyelocytic Leukemia.. Blood 82, 12, 1993. P.3560). También hay literatura que sugiere que el ATRA puede promover la diferenciación de las células supresoras derivadas de los mieloides (MDSC) en pacientes con cáncer y modular las células derivadas de los mieloides en los tejidos tumorales (All-trans-Retinoic Acid Improves Differentiation of Myeloid Cells and Immune Response in Cancer Patients. Cancer Res 2006; 66: (18). 15 de septiembre de 2006). Las MDSC se descubrieron por primera vez en la década de 1980 y se descubrió que estaban formadas por células relativamente inmaduras con diferentes grados de diferenciación. En la médula ósea, la sangre, los órganos linfoides y las zonas de infiltración tumoral de los ratones portadores de tumores se encontró un gran número de células derivadas de los mieloides marcadas positivamente para CD11b y Gr-1. Estas células son CD34+CD33+CD13+ en el cuerpo humano y pueden formar clones en agar como las células precursoras derivadas de los mieloides. En el microambiente tumoral, las células supresoras derivadas de los mieloides regulan a la baja la actividad letal de las células T efectoras e inhiben la maduración de las células DC mediante la secreción de arginasa, ROS e IL-6. Además, se ha descrito que el ATRA promueve la diferenciación de las células madre cancerosas (Targeting cancer stem cells in glioblastoma multiforme using mTOR inhibitors and the differentiating agent all-trans retinoic acid.. ONCOLOGY REPORTS 30: 1645-1650, 2013).
Sin embargo, la aplicación clínica del fármaco ácido transretinoico total es limitada debido a los siguientes obstáculos: 1) el ácido transretinoicotota/ tiene una solubilidad en agua muy baja (4,77e-03 g/L); y 2) el ácidotransretinoicototal tiene una semivida plasmática corta, pero la eficacia del fármaco requiere mantener una concentración sanguínea determinada durante un periodo de tiempo más largo y especialmente en el órgano diana. En la actualidad, sólo se dispone de formas de dosificación orales y se utilizan en estudios clínicos, y la biodisponibilidad es sólo del 30% o inferior. Sin embargo, muchos estudios demostraron que el ATRA sólo tiene capacidad para inducir la diferenciación a partir de una determinada concentración en sangre. Por lo tanto, es especialmente importante encontrar una formulación inyectable con mayores concentraciones aparentes de ácidotransretinoicototal. Ruo-Jing Li et al., "Alltrans retinoic acid stealth liposomes prevent the relapse of breast cancer arising from the cancer stem cells", Journal of Controlled Release, 149., eds: 281-291 (2011), divulga una formulación inyectable que comprende ATRA, fosfatidilcolina de huevo (EPC), colesterol y fosfolípido pegilado.
Sumario de la presente divulgación
Con el fin de superar los problemas de la técnica anterior, la presente divulgación tiene como objetivo proporcionar una formulación inyectable de ácido transretinoico total y su aplicación.
Para alcanzar los objetivos anteriores y otros relacionados, la presente divulgación adopta las siguientes soluciones técnicas:
En un primer aspecto de la presente divulgación, se proporciona una formulación inyectable de ácido transretinoico total, la formulación inyectable de ácido transretinoico total comprende ácido transretinoico total y un solubilizante, en el que el solubilizante es un lípido que consiste en fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol y fosfolípido pegilado.
Preferentemente, la relación de masa del solubilizante con respecto al ácidotransretinoicototal es de (10-80): 1.
Preferentemente, la relación de masa entre el lípido y el ácidotransretinoicototal es de (20-80):1.
Preferentemente, el peso molecular del fosfolípido pegilado está en el intervalo de 50-10000.
Preferentemente, la formulación inyectable de ácidotransretinoicototal es una solución, una suspensión, una emulsión o un polvo inyectable estéril.
Además, preferentemente, cuando la formulación inyectable de ácido transretinoico total es una solución, una suspensión o una emulsión, la formulación inyectable de ácido transretinoico total contiene un disolvente, y el disolvente contiene un agente de ajuste isosmótico.
Preferentemente, el agente de ajuste isosmótico es cloruro sódico. El porcentaje en masa por volumen del cloruro sódico en el disolvente es de 0,5-0,9%.
Preferentemente, la formulación inyectable contiene además un agente protector. El agente protector es la sacarosa. El porcentaje en masa por volumen de la sacarosa en el disolvente es del 2-5%.
El porcentaje en masa por volumen se refiere a la masa g de soluto contenida por 100 ml de disolvente.
Preferentemente, en la formulación inyectable de ácido transretinoico to ta l, la concentración de ácido transretinoico total es mayor o igual a 0,1 mg/ml. Además, preferentemente, en la formulación inyectable de ácido transretinoico total , la concentración de ácidotransretinoicototal es mayor o igual a 1,0 mg/ml. Más preferentemente, en la formulación inyectable de ácido transretinoico to ta l, la concentración del ácido transretinoico total está en el intervalo de 1-5 mg/ml.
Además, preferentemente, la vía de administración de la formulación inyectable se selecciona entre inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intravenosa.
En un segundo aspecto de la presente divulgación, se proporciona la mencionada formulación inyectable de ácidotransretinoico totalpara su uso como producto farmacéutico en el tratamiento de un tumor.
Preferentemente, el producto farmacéutico para su uso en el tratamiento de un tumor es un fármaco para la modulación de células supresoras derivadas de mieloides anormales, la inducción de la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides y la inhibición de la proliferación tumoral y la recurrencia en pacientes con cáncer.
Más preferentemente, las células supresoras derivadas de mieloides son células supresoras derivadas de mieloides de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, carcinoma basocelular, melanoma, linfoma folicular o linfocitoma pequeño.
En un tercer aspecto de la presente divulgación, se proporciona la mencionada formulación inyectable de ácidotransretinoicototal para su uso como producto farmacéutico, teniendo el producto farmacéutico uno o más de los siguientes efectos:
(1) disminuir el número de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en las células infiltradas en el tumor;
(2) inducir la diferenciación de las células CD33+HLA-DR- infiltrantes del tumor;
(3) promover cambios fenotípicos de las células CD33+ en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer;
(4) disminución de la inhibición de células T por células CD33+HLA-DR en células mononucleares de sangre periférica (PBMC);
(5) inducir la apoptosis de las células tumorales;
(6) aumento de la proporción de linfocitos infiltrantes en los tejidos tumorales;
(7) inhibir la metástasis de las células tumorales; y
(8) retrasar el crecimiento tumoral.
En un cuarto aspecto (no según la invención), se proporciona un procedimiento para tratar un tumor, que comprende administrar a un paciente la formulación inyectable de ácidotransretinoicototal descrita anteriormente. La dosis particular administrada es bien conocida por los expertos en la materia.
En comparación con la técnica anterior, la presente divulgación tiene los siguientes efectos beneficiosos:
(1) Se ha descubierto y demostrado mediante experimentos a largo plazo que la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada por la presente divulgación aumenta la solubilidad del ácido transretinoico total de 0,01 mg/ml en la técnica anterior a al menos 0,1 mg/ml o más, que es al menos 10 veces superior.
(2) La aplicación de la formulación inyectable puede regular eficazmente el microambiente del desarrollo tumoral y puede inducir eficazmente la diferenciación de los macrófagos asociados al tumor. La semivida terminal plasmática de la presente divulgación puede ser de hasta 8-12 horas cuando se administra mediante inyección intravenosa o goteo intravenoso. Tras el tratamiento con la presente divulgación, se puede promover la diferenciación o apoptosis del 40%-70% de las células supresoras derivadas de mieloides en los tumores, e inducir la formación de células dendríticas (CD) maduras. El nivel de interleucina-6 (IL-6) secretado por las células supresoras derivadas de los mieloides disminuye significativamente tras el tratamiento con el preparado. La formulación inyectable tiene un efecto inmunoterapéutico cuando se aplica independientemente o junto con otro producto farmacéutico, se puede utilizar para inhibir la proliferación de células tumorales y la recurrencia del tumor, y por lo tanto tiene la gran utilidad médica.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1: ATRA Curvas de concentración en sangre de formulaciones liposomadas de EPC (no según la invención) en ratones.
Fig. 2: Inhibición de las MDSC en tejidos tumorales de ratón tras tratamientos con una formulación inyectable de ácidotransretinoicototal.
Fig. 3: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal promueve la diferenciación de las MDSC obtenidas de muestras de sangre de pacientes con carcinoma escamoso de la mucosa de cabeza y cuello. Fig. 4: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal reduce significativamente la expresión de iNOS en las MDSC de muestras de pacientes con cáncer.
Fig. 5: La formulación inyectable de ácido transretinoico total puede modular significativamente las MDSC entre los linfocitos infiltrantes tumorales en muestras de tejido de cáncer de vejiga
Fig. 6: La formulación inyectable de ácido transretinoico total puede amortiguar significativamente la inhibición de MDSCs en células T en pacientes con cáncer.
Fig. 7: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal promueve la apoptosis de las células de cáncer de mama humano MCF-7.
Fig. 8: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal promueve la apoptosis de las células Jukat de leucemia humana de sangre periférica.
Fig. 9: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal promueve la reducción del tamaño tumoral en ratones portadores de tumores 4T1.
Fig. 10: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal aumenta el número de linfocitos infiltrantes tumorales (células CD4+ y CD8+).
Fig. 11: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal reduce la metástasis de células tumorales en ratones portadores de tumores 4T1 (las flechas blancas indican lesiones invadidas por células tumorales). Fig. 12: La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal reduce la invasión del tejido renal y la metástasis de células tumorales en ratones portadores de tumores 4T1 (las flechas blancas indican lesiones invadidas por células tumorales).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Formulación inyectable de ácido transretinoico total
La formulación inyectable de ácido transretinoico total de la presente divulgación comprende ácido transretinoico total y un solubilizante, en el que el solubilizante es un lípido compuesto de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol y fosfolípido pegilado.
La relación en masa del solubilizante con respecto al ácidotransretinoicototal es de (10-80):1.
La relación de masa entre el lípido y el ácido transretinoico total es de (20-80):1. La relación de masa entre el lípido y el ácidotransretinoico totaltambién puede ser (20-50): 1.
El peso molecular del fosfolípido pegilado es del orden de 50-10000.
En una realización de la presente divulgación, el peso molecular del fosfolípido pegilado es 2000.
La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal es una solución, una suspensión, una emulsión o un polvo estéril para inyección.
Además, cuando la formulación inyectable de ácido transretinoico total es una solución, una suspensión o una emulsión, la formulación inyectable de ácido transretinoico total contiene un disolvente, y el disolvente contiene un agente de ajuste isosmótico.
El agente de ajuste isosmótico puede seleccionarse entre cloruro sódico. El porcentaje en masa por volumen del cloruro sódico en el disolvente es de 0,5-0,9%.
El disolvente también puede contener un agente protector. El agente protector es la sacarosa. El porcentaje en masa por volumen de la sacarosa en el disolvente es del 2-5%.
El porcentaje en masa por volumen se refiere a la masa (g) de soluto contenida por 100 ml de disolvente.
En la formulación inyectable de ácido transretinoico total , la concentración de ácidotransretinoicototal es mayor o igual a 0,1 mg/ml. Además, en la formulación inyectable de ácido transretinoico total , la concentración de ácidotransretinoico totales mayor o igual a 1,0 mg/ml. Además, en la formulación inyectable de ácido transretinoico to ta l, la concentración de ácidotransretinoico totales del orden de 1-5 mg/ml.
Además, la vía de administración de la formulación inyectable se selecciona entre inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intravenosa.
Aplicación de la formulación inyectable de ácido transretinoico total
En la presente divulgación, la aplicación puede ser: la formulación inyectable de ácido transretinoico total para su uso como producto farmacéutico en el tratamiento de un tumor.
El producto farmacéutico para uso en el tratamiento de un tumor es un fármaco para la inducción de la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides, y la inhibición de la proliferación tumoral y la recurrencia en pacientes con cáncer.
Más preferentemente, las células supresoras derivadas de mieloides son células supresoras derivadas de mieloides de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, carcinoma basocelular, melanoma, linfoma folicular o linfocitoma pequeño.
La aplicación también puede aplicarse para su uso como producto farmacéutico, teniendo el producto farmacéutico uno o más de los siguientes efectos:
(1) disminuir el número de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en las células infiltradas en el tumor;
(2) inducir la diferenciación de las células CD33+HLA-DR- infiltrantes del tumor;
(3) promover cambios fenotípicos de las células CD33+ en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer;
(4) disminuir la inhibición de las células T por las células CD33+HLA-DRen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC);
(5) inducir la apoptosis de las células tumorales;
(6) aumento de la proporción de linfocitos infiltrantes en los tejidos tumorales;
(7) inhibir la metástasis de las células tumorales; y
(8) retrasar el crecimiento tumoral.
Procedimiento para tratar tumores (no según la invención)
El procedimiento para tratar un tumor comprende el paso de administrar a un paciente la formulación inyectable de ácidotransretinoico totalantes mencionada. La dosis particular administrada es bien conocida por los expertos en la materia.
Antes de seguir describiendo las realizaciones específicas de la presente divulgación, se entenderá que el alcance de protección de la presente divulgación no se limita a las realizaciones específicas descritas a continuación; también se entenderá que la terminología utilizada en las realizaciones de la presente divulgación tiene por objeto describir las realizaciones específicas, y no limitar el alcance de protección de la presente divulgación. Los procedimientos de ensayo que no especifican las condiciones concretas en las siguientes realizaciones suelen llevarse a cabo según las condiciones convencionales o según las condiciones recomendadas por cada fabricante.
Cuando las realizaciones dan un intervalo numérico, se entenderá que, a menos que se especifique lo contrario en la presente divulgación, dos puntos finales de cada intervalo numérico y cualquier valor entre los dos puntos finales pueden ser opcionales. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente divulgación tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por los expertos en la materia.
A menos que se indique lo contrario, los procedimientos experimentales, procedimientos de detección y procedimientos de preparación divulgados en la presente divulgación emplean técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, química analítica, cultivo celular y ADN recombinante en el campo técnico, y técnicas convencionales en campos relacionados. Estas técnicas han sido bien descritas en la literatura existente; para más detalles, véase Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicasla serie METHODS INENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin (P M. WassarmanyA. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 et al.
Realización 1 (Realización de referencia)
En esta realización, se utilizan los tres procedimientos siguientes para investigar la solubilidad saturada después de la solubilización delATRA por diferentes solubilizadores.
(1) Procedimiento de emulsificación: Se disuelven cantidades apropiadas de un solubilizante en 1 ml de agua ultrapura como fase acuosa; se disuelve 1 mg de fármaco en 1 ml de disolvente orgánico como fase orgánica; se añade la fase orgánica a la fase acuosa durante la agitación; después de agitar durante toda la noche, se elimina el disolvente orgánico por volatilización o evaporación rotatoria para obtener la solución que contiene el fármaco.
(2) Procedimiento de diálisis: El fármaco se disuelve en un disolvente orgánico junto con un solubilizante y, a continuación, la solución se mezcla con 1 ml de agua ultrapura. Y la solución mezclada se dializa en agua pura para obtener la solución que contiene el fármaco.
(3) Procedimiento de liofilización: Se disuelven cantidades apropiadas de un solubilizante en 1 ml de agua pura y, a continuación, se añaden cantidades apropiadas de un agente protector contra la liofilización como fase acuosa. El fármaco se disuelve en un disolvente orgánico (terc-butanol, TBA) como fase orgánica. La fase orgánica y la fase acuosa se mezclan en una relación determinada y, a continuación, la solución se liofiliza en un liofilizador durante 24 horas. La redisolución se lleva a cabo añadiendo 1 ml de agua ultrapura en el liofilizado para obtener la solución que contiene el fármaco.
Se realiza un cribado para seleccionar la siguiente formulación inyectable que contiene los siguientes solubilizantes:
Se disuelven 20% de Cremophor RH40 y 5% de manitol en 1 ml de agua pura como fase acuosa. Se disuelven 3 mg del fármaco ATRA en 1,5 ml de terc-butanol como fase orgánica. La fase orgánica y la fase acuosa se mezclan uniformemente, luego la mezcla se carga en un vial de 5 ml y se liofiliza en un liofilizador. Se extrae el vial al cabo de 24 horas y se monta una tapa. Antes de la administración, el liofilizado se redisuelve añadiendo 1 ml de agua para obtener la suspensión del fármaco. Se ha determinado que la solubilidad saturada del ácido transretinoico total es de 0,1 mg/ml. El diámetro medio de las partículas de la suspensión es de 274 nm±42 nm mediante un procedimiento de dispersión láser dinámica y puede mantener la estabilidad a temperatura ambiente durante 10 horas. Estos resultados demuestran que las partículas tienen buena estabilidad y dispersabilidad.
Realización 2
Los liposomas que comprenden EPC y DPPC no son conformes a la invención. Los liposomas que comprenden HSPC son conformes a la invención.
EPC, HSPC y DPPC se seleccionan respectivamente como materiales lipídicos principales y se mezclan con colesterol y DSPE-PEG2000 según la relación molar de PC:Chol:DSPE-PEG2000=2:1:0,125. A continuación, se añade ATRA según la relación de masa de lípido/ATRA respectivamente 20:1, 40:1, 50:1. En el procedimiento de hidratación se añaden 5-7 pequeñas perlas de vidrio y se realiza una hidratación rotativa durante 30 minutos. La muestra bruta obtenida se extruye pasándola a través de membranas de policarbonato de 400 nm, 200 nm y 100 nm secuencialmente durante 15 veces para obtener pequeños liposomas unilamelares. El diámetro medio de las partículas de los liposomas cargados con ácido transretinoico total obtenidos se sitúa en un intervalo de 100 nm±30 nm, con una PDI de aproximadamente 0,1. El ácidotransretinoicototal (ATRA) libre se elimina mediante una microcolumna sephadex G-50. En el intervalo lineal de una curva estándar de la concentración de ácidotransretinoicototal, la eficacia de encapsulación de la cantidad de ATRA incorporada al liposoma se calcula adquiriendo la relación del valor del área del pico de absorción ultravioleta del fármaco entre las fracciones de ATRA encapsulado y las fracciones de ATRA total. Las eficiencias de encapsulación de las tres formulaciones de liposomas muestran que el liposoma EPC es del 94%, el liposoma HSPC es del 91% y el liposoma DPPC es del 76%. Las concentraciones de ATRA en las tres formulaciones liposomadas son todas de 0,3 mg/ml o superiores.
Los liposomas de ácidotransretinoicototal preparados anteriormente se administran mediante inyección intravenosa, y la semivida del ATRAen ratones oscila entre 4 y 12 horas. La curva de concentración plasma-fármaco del liposoma EPC en ratones se muestra mediante la curva roja de la Fig. 1, y la semivida calculada es de 247 minutos.
Realización 3
Se pesan 0,097 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 0,031 g de fosfolípido pegilado 1, 2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-polietilenglicol 2000 (DSPE-PEG2000) y 0,031 g de colesterol y se disuelven con 1,6 ml de etanol. La mezcla de etanol se disuelve completamente incubándola en un baño de agua a 70°C. A continuación, se añade la solución a 6,4 ml de solución tampón de acetato de calcio (pH 9,0) y se incuba en un baño de agua a 70°C durante 30 minutos. La muestra de liposomas crudos obtenida se extruye pasándola a través de membranas de policarbonato de 400 nm, 200 nm, 100 nm y 50 nm secuencialmente durante 8 veces para obtener pequeños liposomas unilamelares con un diámetro medio de partícula de unos 90 nm.
Los liposomas preparados en el paso anterior se dializan a través de una membrana de diálisis con un 10000 MWCO (Molecular Weight Cut off) para sustituir la fase acuosa por una solución de sacarosa al 10% (pH 6~7). A continuación, se añade una suspensión de 4 mg/ml de ácido transretinoico total y se incuba el paso de carga del fármaco durante 45 minutos a 60°C. Después de la incubación, el ácido transretinoico total libre que no se carga en los liposomas se elimina mediante la membrana de diálisis con un 10000 MWCO y se obtiene la formulación inyectable liposomal final de ácido transretinoico total con una concentración de 2,0 mg/ml de ATRA.
La semivida terminal plasmática del ATRA en ratones puede ser de hasta 8 a 12 horas cuando se administra por inyección intravenosa o goteo intravenoso.
Realización 4 La formulación inyectable de ácido transretinoico total induce la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides tumorales in vitro
1. Construcción del modelo tumoral en ratones Balb/c
(1) Las células CT-26 en fase de crecimiento logarítmico se digieren con tripsina y se recogen centrifugándolas a 300 g durante 5 minutos. Tras desechar el sobrenadante, se resuspenden las células en PBS estéril y se ajusta la concentración a 1*107 células/ml.
(2) Se compran ratones Balb/c de seis semanas de edad y se afeitan por adelantado los pelos alrededor del lugar de inoculación subcutánea. Los ratones se anestesian mediante inyección intraperitoneal de 200 pl de hidrato de cloral al 4% y la suspensión de células CT-26 preparada de 5*105 a 1*10® se inyecta por vía subcutánea en la región axilar derecha. Los animales se alojan en un entorno limpio tras la inoculación.
(3) Después de 2 a 3 semanas, el diámetro largo (L) y el diámetro corto (S) del tumor inoculado se miden con un calibre de pie de rey, y el tamaño del volumen del tumor (V) se calcula mediante la fórmula: V=1/2xLxS2. El experimento con animales puede realizarse cuando el volumen del tumor alcanza aproximadamente 100 mm3.
2. Caracterización y clasificación de linfocitos asociados a tumores MDSCs
(1) Los ratones se sacrifican por dislocación cervical y el tumor se extrae subcutáneamente con pinzas y tijeras. El tejido tumoral se corta en trozos pequeños en un colador celular de 40 pm con una fuerza de cizallamiento suave que puede evitar dañar la célula individual. Al mismo tiempo, los tejidos se lavan continuamente con PBS al 5% durante el proceso de corte.
(2) Se centrifugan todos los trozos pequeños de tejidos y la solución de PBS y se desecha el sobrenadante. Los tejidos picados se transfieren a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 1 ml de medio de digestión tisular, y el tubo se incuba en un agitador (200 rpm/ minuto) a 37°C durante 1 hora.
(3) La suspensión unicelular digerida se tamiza de nuevo con el colador celular de 40 pm, y las células se lavan con PBS durante 2 o 3 veces para eliminar el medio de digestión tisular residual, los restos celulares y las células muertas. Las condiciones de centrifugación se fijan en 1000 rpm durante 5 minutos. Por último, las células centrifugadas se resuspenden en PBS para obtener una suspensión de células tumorales individuales.
(4) El tampón de clasificación se añade en una proporción de 107 células por 90 pl de volumen, y las microperlas CD1 1b se añaden en una proporción de107 células por 100 pl de volumen.
(5) Las microperlas y las células se mezclan a fondo y se incuban a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Tras la incubación, se añaden 90 pl de tampón de clasificación por cada 107 células para lavar las células mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. Este paso se repite 3 veces antes de proceder a la separación magnética.
(6) Por último, se añaden 500 |jl de tampón de clasificación para resuspender la suspensión de células unidas a microperlas.
(7) Se coloca una columna MS en el campo magnético de un separador MACS adecuado y se satura completamente enjuagándola con la cantidad adecuada de tampón.
(8) Una vez preparada la columna MS, se aplica la suspensión celular sobre la columna MS y se lava la columna MS con 1 ml de tampón de clasificación para eliminar las células no marcadas.
(9) Tras repetidos lavados de 3 a 5 veces, se retira la columna MS del separador, se coloca en un tubo de centrífuga de 15 ml y se añade 1 ml de tampón. Al empujar firmemente el émbolo en la columna, las células marcadas con microperlas CD11b se recogen de la columna.
(10) Se realiza el recuento de células y se ajusta la concentración de las muestras de citometría de flujo a 107 células /ml.
(11) Las muestras de citometría de flujo se dividen en una muestra negativa, una muestra Gr-1 positiva, una muestra CD1 1b positiva y una muestra de prueba. La muestra Gr-1 positiva y la muestra CD1 1b positiva se establecen como controles de compensación de fluorescencia. En cada grupo de muestras, se colocan de 2 a 3 tubos en recorridos paralelos.
(12) Se resuspenden aproximadamente 106 células con 100 j l de tampón de tinción para citometría de flujo. No se añade anticuerpo fluorescente en la muestra negativa, se añade anticuerpo fluorescente anti-Gr-1 en la muestra Gr-1 positiva, se añade anticuerpo fluorescente anti-CD11b en la muestra CD11b positiva, y se añaden ambos anticuerpos fluorescentes anti-Gr-1 y anti-CD11b en la muestra problema.
(13) Las muestras de citometría de flujo se incuban a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, para lavar los anticuerpos no unidos, las células se resuspenden en un volumen mayor de tampón de tinción (1 ml) y se mezclan suavemente. A continuación, las muestras se centrifugan a 300 g durante 5 minutos y se aspira el sobrenadante. El paso de lavado se repite dos veces antes de que las células se resuspendan finalmente con 500 j l de tampón de tinción y se proceda a ejecutar las muestras en el citómetro de flujo.
3. La formulación inyectable de ácido transretinoico total induce la diferenciación de linfocitos en sangre periférica y zonas tumorales
(1) La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal se prepara según los procedimientos de las realizaciones 1, 2 y 3.
(2) Las MDSC de los tejidos tumorales se clasifican y la concentración celular se ajusta a 107/ml. Las células recogidas se inoculan en una placa de 24 pocillos a una concentración de 106/poroy se cultivan durante la noche.
(3) Se añaden por separado 20 j l de PBS (grupo de control), 20 j l (grupo de baja concentración) y 50 j l (grupo de alta concentración) de la formulación inyectable de ácidotransretinoicototal en el medio de cultivo celular de una placa de 24 pocillos que contiene células, y se incuba la placa a 37°C durante 24 horas.
(4) Después de 1 día de incubación, las células tratadas se recogen por el procedimiento mencionado anteriormente y los cambios de fenotipo de MDSCs y DCs en la célula se detectan con anticuerpos anti-Gr-1, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD80, anti-CD86 y anti-MHC-II por citometría de flujo. El control de isotipo y la compensación de fluorescencia se añaden durante la citometría de flujo.
Los resultados de la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3 se muestran en la Fig. 2. Los resultados muestran que el número de células Gr-1hi disminuye significativamente al administrar diferentes dosis del fármaco. En el grupo de alta concentración, la proporción de células Gr-1hi disminuye del 17,5% al 9,10% en comparación con el grupo de control. Sin embargo, la proporción de células Gr-1int no cambia mucho, probablemente porque las células con alta expresión de Gr-1 se convierten en células con expresión media-baja de Gr-1 bajo la inducción del ácidoretinoicotodo-trans. La proporción de células Gr-1low aumenta con el incremento de la dosis de administración, lo que indica además que el ácido transretinoico total induce la diferenciación de las MDSC y disminuye la expresión de Gr-1. Dado que la mayoría de las MDSC infiltrantes en las zonas tumorales se caracterizan por ser Gr-1hi o Gr-1int, podemos concluir que la formulación inyectable de ácidotransretinoicototal puede inducir la diferenciación de las MDSC y disminuir su número en las zonas tumorales.
Mediante la administración de cada una de las formulaciones de ácido transretinoico total mencionadas en las realizaciones 1 y 2, también se observan los mismos resultados experimentales. Cada una de las formulaciones de ácidotransretinoicode las realizaciones 1 y 2 también puede inducir la diferenciación de las MDSC y disminuir su número en las zonas tumorales.
Realización 5 La formulación inyectable de ácido transretinoico total promueve cambios inmunofenotípicos de células CD33+ en PBMC de pacientes con carcinoma de células escamosas de la mucosa de cabeza y cuello (HNSCC)
Se toman 2 ml de sangre periférica de un paciente con HNSCC y se diluyen dos veces con 2 ml de PBS. La sangre diluida se extiende cuidadosamente sobre 3 ml de una solución de separación de linfocitos humanos a lo largo de la pared interior del tubo de ensayo. La muestra se centrifuga a 300 g durante 30 minutos a temperatura ambiente (aceleración 2, deceleración 1). La capa de células mononucleares se transfiere cuidadosamente a un tubo de centrífuga limpio y se lava dos veces con 10 ml de tampón PBS a 300 g durante 10 minutos. Tras desechar el sobrenadante, las células mononucleares se suspenden en tampón PBS para su posterior aplicación. Según el manual de instrucciones del equipo de separación por microperlas, las células derivadas de los mieloides en la PBMC se separan mediante microperlas CD33+. Tras la separación, las células derivadas de mieloides se cultivan en placas de 12 pocillos a 5*105 células/pocillo con medio completo RPMI1640 (al que se añade un 10% de FBS) y se incuban durante la noche. La formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada como se describe en la realización 1, 2 o 3 se añade y la placa celular se cultiva durante 24 horas. A continuación, se detecta mediante citometría de flujo el porcentaje de población de células DC fenotípicas HLA-DR+CD11c+ en las células derivadas de mieloides.
Como se muestra en la Fig. 3, los resultados de la citometría de flujo demuestran que el porcentaje de la población de células DC fenotípicas HLA-DR+CD11c+ en las células derivadas de mieloides aumenta significativamente con la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3. Además, como se muestra en la Fig. 4, la expresión de iNOS de las células también disminuye significativamente. Además, los niveles de expresión de Arg-1 e IL-6 también disminuyen significativamente.
Las mismas conclusiones experimentales se obtienen también con cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2. El porcentaje de la población de células DC fenotípicas HLA-DR+CD11c+ en células derivadas de mieloides aumenta significativamente, y los niveles de expresión de Arg-1, iNOS e IL-6 en estas células también disminuyen significativamente utilizando cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2.
Realización 6 La formulación inyectable de ácido transretinoico total reduce significativamente el número de CD33+HLA-DRMDSC en células derivadas de mieloides infiltrantes de tumores de pacientes con cáncer de vejiga
La muestra de tumor clínico se obtiene de un paciente con cáncer de vejiga en cirugía, luego se enjuaga con solución salina estéril y se coloca en un medio RPMI 1640 que contiene penicilina 100 pg/ml, estreptomicina 100 pg/ml y suero bovino fetal al 10% a 4°C antes del tratamiento de laboratorio. El tejido tumoral se corta transversalmente en trozos pequeños en hielo, luego se transfiere a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de líquido digestivo enzimático (líquido digestivo de colagenasa I y IV de 0,6 a 1 mg/ml) y se agita suavemente. La mezcla de tejidos picados se incuba en un agitador (200 rpm/minutos) a 37°C durante 1 hora. La suspensión unicelular digerida se tamiza de nuevo con el colador celular de 40 pm, y las células se lavan con PBS de 2 a 3 veces para eliminar el medio de digestión tisular residual, los restos celulares y las células muertas. Las condiciones de centrifugación se fijan en 300 g durante 10 minutos. Por último, las células centrifugadas se resuspenden en PBS para obtener una suspensión de células tumorales individuales. Según el manual de instrucciones del equipo de separación por microperlas, las células derivadas de mieloides en las células infiltrantes del tejido tumoral se separan mediante microperlas CD33+. Las células derivadas de mieloides recogidas se cultivan en placas de 12 pocillos a 5*105 células/pocillo con medio completo RPMI1640 (con un 10% de FBS añadido) y se incuban durante la noche. La formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada como se describe en la realización 1,2 o 3 se añade y la placa celular se cultiva durante 24 horas. A continuación, se detecta mediante citometría de flujo el porcentaje de población de MDSC CD33+HLA-DR-en las células derivadas de mieloides.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 5, la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3 de la presente divulgación puede reducir significativamente el número de CD33+HLA-DR- MDSCs en células derivadas mieloides infiltrantes tumorales derivadas de pacientes con cáncer de vejiga. Como se muestra en la Fig. 6, la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3 de la presente divulgación puede reducir el efecto inhibidor de las MDSC sobre las células T
Las mismas conclusiones experimentales también se obtienen con respecto a cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2. Cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2 puede reducir significativamente el número de MDSC CD33+HLA-DR- en células derivadas de mieloides infiltrantes en tumores derivadas de pacientes con cáncer de vejiga. Además, cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2 puede reducir el efecto inhibidor de las MDSC sobre las células T
Realización 7 La formulación inyectable de ácido transretinoico total promueve la apoptosis de las células de cáncer de mama humano MCF-7
Una placa de cultivo de 6 pocilios se inocula con 5*105 células MCF-7 un día antes del experimento, y las células se cultivan durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Después de que el sobrenadante del cultivo se retira de la placa de cultivo celular en el segundo día, se añaden el medio de cultivo fresco y la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la forma de realización 1 o la forma de realización 2 o la forma de realización 3. Las células se cultivan durante 24 horas en el incubador celular a 37 °C y 5% de CO2 . Tras la digestión con tripsina sin EDTA, las células se recogen por centrifugación (300 g) durante 5 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavan dos veces con PBS preenfriado mediante centrifugación (300 g) durante 5 minutos a 4°C y se confirma el número de células recogidas. Se resuspenden aproximadamente 1~5*105 células con 100 pl de 1 *Tampón de Unión y, a continuación, se añaden 5 pl de Annexin V-FITC y 10 pl de solución de tinción con PI. Tras la incubación en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10-15 minutos, se añaden 400 pl de 1 *tampón de unión y se mezclan suavemente. Las muestras se conservan en hielo y se detectan por citometría de flujo en 1 hora.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 7, la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3 de la presente divulgación puede promover significativamente la apoptosis de las células de cáncer de mama humano MCF-7.
También se obtienen las mismas conclusiones experimentales con cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2. Cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2 también puede promover significativamente la apoptosis de las células de cáncer de mama humano MCF-7.
Realización 8 La formulación inyectable de ácido transretinoico total promueve la apoptosis de células T de leucemia de sangre periférica humana Jurkat
Una placa de cultivo de 6 pocillos se inocula con 5*105 células Jurkat un día antes del experimento, y las células se cultivan durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Después de que el sobrenadante del cultivo se retira de la placa de cultivo celular en el segundo día, se añaden el medio de cultivo fresco y la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la forma de realización 1 o la forma de realización 2 o la forma de realización 3. Las células se cultivan en la incubadora durante 24 horas en condiciones de 37°C y 5% de CO2. Las células cultivadas se recogen por centrifugación (300 g) durante 5 minutos a 4°C y se lavan dos veces con PBS preenfriado por centrifugación (300 g) durante 5 minutos a 4°C. Se confirma el número de células recogidas. Acerca de 1 -5 *105 células se resuspenden con 100 pl de 1 *Tampón de unión y, a continuación, se añaden 5 pl de Annexin V-FITC y 10 pl de solución de tinción con PI. Tras incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10~15 minutos, se añaden 400 pl de tampón de unión 1* y se mezclan suavemente. La muestra se mantiene en hielo y se detecta por citometría de flujo en 1 hora.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 8, la formulación inyectable de ácidotransretinoico totalpreparada en la realización 3 de la presente divulgación puede promover significativamente la apoptosis de las células T de leucemia de sangre periférica humana Jurkat.
También se obtienen las mismas conclusiones experimentales con respecto a cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2. Cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2 puede promover significativamente la apoptosis de las células T de leucemia de sangre periférica humana Jurkat.
Realización 9 La formulación inyectable de ácido transretinoico total inhibe el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores
El procedimiento para establecer un modelo de xenoinjerto subcutáneo 4T1 se describe a continuación: (1) Las células 4T1 en fase de crecimiento logarítmico se digieren con tripsina y se recogen centrifugándolas a 300 g durante 5 minutos. Tras desechar el sobrenadante, se resuspenden las células en PBS estéril y se ajusta la concentración a 1*107 células/ml. (2) Se estabilizan ratones Balb/c hembra de seis semanas y se esteriliza la piel del lugar de la inyección con bolas de algodón con etanol. Se inyecta subcutáneamente una suspensión de 1*106 células 4T1 en la región axilar derecha. Los animales se alojan en un entorno limpio tras la inoculación.
(3) Transcurridas de 2 a 3 semanas, se miden el diámetro largo (L) y el diámetro corto (S) del tumor inoculado utilizando un calibre de pie de rey, y se calcula el tamaño del volumen tumoral (V) mediante la fórmula: V=1/2xLxS2. El experimento con animales puede realizarse cuando el volumen del tumor alcanza aproximadamente 100 mm3. La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal preparada en la realización 1, 2 o 3 se administra (5 mg/kg) en días alternos mediante inyección intravenosa. Al grupo de ratones de control se les inyecta por vía intravenosa la misma cantidad de formulación inyectable sin ácidotransretinoicototal y se les administra (5 mg/kg) en días alternos. Se registra el peso corporal de los ratones. Se mide el volumen medio del tumor y se traza una curva de crecimiento.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 9, la formulación inyectable de ácidotransretinoico totalpreparada en la realización 3 de la presente divulgación tiene una inhibición eficaz del crecimiento tumoral en los ratones portadores de tumores 4T1 y reduce el tamaño del volumen del tejido tumoral del ratón.
También se obtienen las mismas conclusiones experimentales con respecto a cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2. Cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2 inhibe eficazmente el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores 4T1 y reduce el tamaño del volumen del tejido tumoral del ratón.
Realización 10 La formulación inyectable de ácido transretinoico total aumenta significativamente la proporción de linfocitos infiltrantes de tumores en un modelo de ratón portador de tumores
Los tejidos tumorales obtenidos de los ratones portadores de tumores 4T1 de la realización 9 se fijan en la solución de formaldehído al 4% durante 3 a 5 días a temperatura ambiente. Los tejidos fijados se recortan en tamaño y forma adecuados y se colocan en casetes de incrustación. Los bloques de tejido se deshidratan con etanol al 80%, 90%, 95% y 100% mediante tres cambios. A continuación, tras un tratamiento transparente con xileno mediante tres cambios de 30 minutos cada uno, los bloques de tejido se sumergen en parafina I durante 1 hora y en parafina II durante 6 horas. Los bloques de tejido se incrustan con parafina colocando el material hacia abajo, y los bloques de parafina se almacenan a -20°C cuando los bloques se enfrían y solidifican. Los bloques, según sea necesario, se cortan a 4 pm de grosor, y las secciones se colocan en un baño de agua a 65°C durante 6 a 12 horas. Por último, las secciones se montan en portaobjetos y se mantienen a temperatura ambiente.
Los pasos inmunohistoquímicos se describen a continuación: (1) En primer lugar, se desparafinan y rehidratan los portaobjetos y, a continuación, se incuban en H2O2 al 3% durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena. (2) Los portaobjetos se enjuagan con agua destilada y se sumergen en PBS durante 5 minutos. Estos pasos se repiten dos veces. A continuación, los portaobjetos se bloquean con tampón de bloqueo (5 a 10% de suero normal de cabra diluido en PBS) y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. (3) Se retira el tampón de bloqueo y se incuban los portaobjetos con 100-400 pl de anticuerpo primario diluido en el diluyente de anticuerpos recomendado a 4°C durante toda la noche. Se retira la solución de anticuerpos y se enjuagan los portaobjetos con tampón de lavado tres veces durante 5 minutos cada una. (4) Los portaobjetos se incuban con el anticuerpo secundario diluido en el diluyente de anticuerpos recomendado a 37°C durante 10 a 30 minutos. A continuación se retira la solución de anticuerpos y se enjuagan los portaobjetos con tampón de lavado tres veces durante 5 minutos cada una. (5) Se añaden 100-400 pL de DAB o sustrato adecuado en cada sección y se vigila de cerca la tinción. Transcurridos entre 3 y 15 minutos de desarrollo del color, los portaobjetos se enjuagan con H2O bidestilada dos veces durante 5 minutos cada una. A continuación, se llevan a cabo los pasos de contratinción, deshidratación, tratamiento transparente y montaje en cubreobjetos.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 10, la formulación inyectable de ácidotransretinoico totalpreparada en la realización 3 de la presente divulgación puede aumentar eficazmente el número de células linfáticas infiltrantes (células T CD4+ y CD8+) en el modelo de ratón portador de tumor.
También se obtienen las mismas conclusiones experimentales con respecto a cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2. Cada una de las formulaciones inyectables de ácido transretinoico total preparadas en las realizaciones 1 y 2 puede aumentar eficazmente el número de células linfáticas infiltrantes (células T CD4+ y CD8+) en el modelo de ratón portador de tumor.
Realización 11 La formulación inyectable de ácido transretinoico total inhibe significativamente la metástasis de células tumorales en el riñón y el hígado de ratones portadores de tumores
Los tejidos hepáticos y renales obtenidos de los ratones portadores de tumores 4T1 de la realización 9 se fijan en la solución de formaldehído al 4% durante 3 a 5 días a temperatura ambiente. Los tejidos fijados se recortan en tamaño y forma adecuados y se colocan en casetes de incrustación. Los bloques de tejido se deshidratan con etanol al 80%, 90%, 95% y 100% mediante tres cambios. A continuación, tras un tratamiento transparente con xileno mediante tres cambios de 30 minutos cada uno, los bloques de tejido se sumergen en parafina I durante 1 hora y en parafina II durante 6 horas. Los bloques de tejido se incrustan con parafina colocando el material hacia abajo, y los bloques de parafina se almacenan a -20°C cuando los bloques se enfrían y solidifican. Los bloques, según sea necesario, se cortan a 4 pm de grosor, y las secciones se colocan en un baño de agua a 65°C durante 6 a 12 horas. Por último, las secciones se montan en portaobjetos y se mantienen a temperatura ambiente.
Los pasos para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de las secciones de tejido se describen a continuación: (1) En primer lugar, desparafinación y rehidratación: xileno I durante 15 minutos, xileno II durante 15 minutos, etanol absoluto I durante 5 minutos, etanol absoluto II durante 5 minutos, etanol al 95% durante 5 minutos y etanol al 80% durante 5 minutos, y limpieza por inmersión con agua del grifo durante 1 minuto. (2) Tinción: las secciones se sumergen en una solución de tinción de hematoxilina durante 5 minutos a temperatura ambiente, y las secciones se lavan con agua del grifo durante 1 minuto; las secciones se sumergen en una solución alcohólica de ácido clorhídrico al 1% durante varios segundos, y las secciones se lavan con agua del grifo hasta que los tejidos recuperan el color azul; las secciones se sumergen en tinción de eosina durante 3 a 5 minutos, las secciones se lavan con agua del grifo para eliminar el color flotante de las secciones. (3) Deshidratación, tratamiento transparente y montaje: las secciones se deshidratan con etanol al 80% durante 30 segundos, etanol al 95% I durante 30 segundos, etanol al 95% II durante 30 segundos, etanol absoluto I durante 30 segundos y etanol absoluto II durante 30 segundos, se realiza un tratamiento transparente con xileno I durante 3 minutos y xileno II durante 3 minutos, se extraen las secciones, se montan con goma neutra y se observan para evaluar los resultados de la tinción.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 11 y la Fig. 12, la formulación inyectable de ácido transretinoico total preparada en la realización 3 de la presente divulgación puede inhibir eficazmente la infiltración y la metástasis de células tumorales en el hígado del ratón en comparación con los tejidos del hígado del ratón del grupo de control (Fig. 11). Mientras tanto, puede inhibir eficazmente la infiltración y la metástasis de células tumorales en el riñón en comparación con los tejidos renales de ratón del grupo de control (Fig. 12).
También se obtienen las mismas conclusiones experimentales con respecto a cada una de las formulaciones inyectables de ácidotransretinoicototal preparadas en las realizaciones 1 y 2. En los ratones portadores de tumores 4T 1 inyectados con la formulación inyectable de ácidotransretinoico totalpreparada en las realizaciones 1 y 2, la infiltración y metástasis de células tumorales en el hígado son menores en comparación con los tejidos hepáticos del ratón del grupo de control, y la infiltración y metástasis de células tumorales en el riñón son menores en comparación con los tejidos renales del ratón del grupo de control.
Claims (10)
1. Una formulación inyectable de ácido transretinoico to ta l, que comprende ácido transretinoico total y un solubilizante, en el que el solubilizante es un lípido compuesto de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol y fosfolípido pegilado.
2. La formulación inyectable de ácidotransretinoicototalcomo en la reivindicación 1, en la que el fosfolípido pegilado es el fosfolípido pegilado 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-polietilenglicol 2000 (DSPE-PEG2000).
3. La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal como en la de la reivindicación 1, en la que la relación de masa entre el lípido y el ácido transretinoico total es de (20-80): 1.
4. La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal como en la reivindicación 1, en la que la formulación inyectable de ácidotransretinoicototal es una solución, una suspensión, una emulsión o un polvo inyectable estéril.
5. La formulación inyectable de ácido transretinoico total como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que una concentración del ácido transretinoico total es mayor o igual a 0,1 mg/ml.
6. La formulación inyectable de ácido transretinoico total como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que una vía de administración de la formulación inyectable de ácido transretinoico total se selecciona entre inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intravenosa.
7. La formulación inyectable de ácidotransretinoicototal como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como producto farmacéutico en el tratamiento de un tumor.
8. La formulación inyectable de ácido todo-transretinoico total para uso según la reivindicación 7, en la que la formulación inyectable de ácido transretinoico total puede reducir la actividad de células supresoras derivadas de mieloides anormales, inducir la diferenciación de células supresoras derivadas de mieloides, inhibir la proliferación tumoral y la recurrencia en pacientes con cáncer.
9. La formulación inyectable de ácido transretinoico total para su uso según la reivindicación 8, en la que las células supresoras derivadas de mieloides son células supresoras derivadas de mieloides en pacientes con cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, carcinoma basocelular, melanoma, linfoma folicular o linfocitoma pequeño.
10. La formulación inyectable de ácido transretinoico total como en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como producto farmacéutico, en el que el producto farmacéutico tiene uno o más de los siguientes efectos:
(1) Disminución del número de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en las células infiltradas en el tumor;
(2) inducir la diferenciación de las células CD33+HLA-DR- infiltrantes del tumor;
(3) promover cambios fenotípicos de las células CD33+ en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer;
(4) disminución de la inhibición de células T por células CD33+HLA-DR- en células mononucleares de sangre periférica (PBMC);
(5) inducir la apoptosis de las células tumorales;
(6) aumento de la proporción de linfocitos infiltrantes en el tejido tumoral;
(7) inhibir la metástasis de las células tumorales; y
(8) retrasar el crecimiento tumoral.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610681196.4A CN107753473A (zh) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | 一种全反式维甲酸注射剂与应用 |
| PCT/CN2017/097868 WO2018033117A1 (zh) | 2016-08-18 | 2017-08-17 | 一种全反式维甲酸注射剂与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2966738T3 true ES2966738T3 (es) | 2024-04-24 |
Family
ID=61197288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES17841089T Active ES2966738T3 (es) | 2016-08-18 | 2017-08-17 | Formulación inyectable de ácido transretinoico total |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10952984B2 (es) |
| EP (1) | EP3501517B1 (es) |
| JP (1) | JP6942183B2 (es) |
| CN (1) | CN107753473A (es) |
| ES (1) | ES2966738T3 (es) |
| WO (1) | WO2018033117A1 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110452877A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种肺癌实体瘤原代细胞的培养方法 |
| CN110452878A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种肺癌实体瘤组织样本解离液 |
| CN110447633A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种肺癌实体瘤组织样本保存液 |
| CN109364027B (zh) * | 2018-12-12 | 2021-04-02 | 上海交通大学 | 全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法 |
| CN111808815A (zh) * | 2019-04-11 | 2020-10-23 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种胃癌实体瘤原代细胞的培养方法 |
| CN111197029B (zh) * | 2020-01-09 | 2020-11-10 | 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） | 一种尿酸钠诱导产生髓系抑制性细胞的方法 |
| CN111671902B (zh) * | 2020-03-19 | 2022-08-16 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种增敏剂药物及药物组合及应用 |
| CN114617960A (zh) * | 2022-03-17 | 2022-06-14 | 北京大学 | 调节ptir1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用 |
| CN115414360A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-12-02 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 全反式维甲酸联合抗生素在治疗假体周围感染中的应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU543727B2 (en) * | 1980-06-02 | 1985-05-02 | Ayerst Mckenna & Harrison Inc. | Injectable composition of rapamycin |
| US5811119A (en) * | 1987-05-19 | 1998-09-22 | Board Of Regents, The University Of Texas | Formulation and use of carotenoids in treatment of cancer |
| EP0621773B1 (en) * | 1992-01-16 | 1998-11-25 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Formulation and use of carotenoids in treatment of cancer |
| JP2002356420A (ja) * | 2001-03-27 | 2002-12-13 | Santen Pharmaceut Co Ltd | 安定な水性液剤 |
| CN101244039B (zh) * | 2008-03-20 | 2012-09-12 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种制备难溶性药物脂质体制剂的新方法 |
| CN101843584B (zh) * | 2010-06-02 | 2012-05-30 | 北京大学 | 一种全反式维甲酸与脂质体的复合物及其应用 |
| EP3076944A1 (fr) * | 2013-12-04 | 2016-10-12 | Galderma Research & Development | Microcapsules lipidiques comprenant de preference un actif lipophile et composition les contenant, leur procede de preparation et leur utilisation en dermatologie et en cosmetique |
-
2016
- 2016-08-18 CN CN201610681196.4A patent/CN107753473A/zh active Pending
-
2017
- 2017-08-17 US US16/326,216 patent/US10952984B2/en active Active
- 2017-08-17 JP JP2019530536A patent/JP6942183B2/ja active Active
- 2017-08-17 WO PCT/CN2017/097868 patent/WO2018033117A1/zh unknown
- 2017-08-17 EP EP17841089.0A patent/EP3501517B1/en active Active
- 2017-08-17 ES ES17841089T patent/ES2966738T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3501517C0 (en) | 2023-10-04 |
| JP6942183B2 (ja) | 2021-09-29 |
| US20190282530A1 (en) | 2019-09-19 |
| US10952984B2 (en) | 2021-03-23 |
| EP3501517A4 (en) | 2020-06-03 |
| EP3501517B1 (en) | 2023-10-04 |
| EP3501517A1 (en) | 2019-06-26 |
| CN107753473A (zh) | 2018-03-06 |
| JP2019528315A (ja) | 2019-10-10 |
| WO2018033117A1 (zh) | 2018-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2966738T3 (es) | Formulación inyectable de ácido transretinoico total | |
| CN108543074B (zh) | 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备 | |
| Ding et al. | Multifunctional nanodrug mediates synergistic photodynamic therapy and MDSCs‐targeting immunotherapy of colon cancer | |
| US20130177595A1 (en) | Nano-vehicle derived from tumor tissue, and cancer vaccine using same | |
| WO2013142192A1 (en) | Methods and compositions for regenerating and repairing damaged tissue using nonviable irradiated or lyophilized pluripotent stem cells | |
| Aoki et al. | Dendritic cells pulsed with tumor extract–cationic liposome complex increase the induction of cytotoxic T lymphocytes in mouse brain tumor | |
| WO2020054829A1 (ja) | ミトコンドリアのリンパ器官への移植およびそのための組成物 | |
| Lv et al. | Therapeutic exosomal vaccine for enhanced cancer immunotherapy by mediating tumor microenvironment | |
| WO2022247453A1 (zh) | 一种setd4蛋白抑制剂在制备激活休眠肿瘤细胞药物中的应用 | |
| CN115252582A (zh) | 红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用 | |
| Wang et al. | B16 membrane-coated vesicles for combined photodynamic therapy and immunotherapy shift immune microenvironment of melanoma | |
| CN109745326B (zh) | 一种包含吉非替尼和组蛋白去乙酰酶抑制剂的药物组合物，其脂质体制剂及其制药用途 | |
| JP2024510298A (ja) | 放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用 | |
| JP2020524141A (ja) | がんを処置するための方法および組成物 | |
| CN105963699B (zh) | Fats作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用 | |
| US20220000977A1 (en) | Methods and compositions related to therapeutic peptides for cancer therapy | |
| CN115612670A (zh) | 一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法 | |
| RU2489168C1 (ru) | Фармацевтическая композиция, продуцирующая антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека, способ ее получения и способ терапии | |
| US20180369336A1 (en) | B cell-based cancer immunotherapy | |
| US20060062766A1 (en) | Remedy for cancer | |
| WO2022206160A1 (zh) | 免疫制剂、包含免疫制剂的组合物及其用途、制备方法 | |
| Wang et al. | Manipulating Redox Homeostasis of Cancer Stem Cells Overcome Chemotherapeutic Resistance through Photoactivatable Biomimetic Nanodiscs | |
| CN117379557A (zh) | 一种细胞外囊泡给药系统及其制备方法和应用 | |
| KR20160141068A (ko) | Vegf 유래 펩타이드가 담지된 리포좀을 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| Sun et al. | Influence of Oxa-Nano-Liposome on the Drug Resistance of Gastric Cancer Cells Under p53-Mediated Autophagy |