ES2962593T3

ES2962593T3 - Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes

Info

Publication number: ES2962593T3
Application number: ES19155593T
Authority: ES
Inventors: Letha Chemmalil
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2024-03-20
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: MX2017006463A; AU2015349809B2; EP3221465B1; HK1244037B; JP2018502287A; US20180321252A1; AU2015349809A1; CA2968372A1; EP3540071A1; JP7055837B2; ES2727380T3; JP2020187128A; WO2016081770A1; US11275090B2; EP3540071B1; EP3221465A1

Abstract

La invención se refiere a un método para determinar la fracción de glicano en una glicoproteína recombinante usando detección de dispersión de luz por condensación, nucleación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/082.014, presentada el 19 de noviembre de 2014.

Introducción

La glucosilación puede influir en las propiedades biológicas y fisicoquímicas de proteínas recombinantes destinadas a utilizarse como fármacos biofarmacéuticos (Byrne, Donohoe y O'Kennedy, 2007). Por ejemplo, el resto de ácido siálico de una proteína desempeña un papel importante en la semivida sérica. A medida que la galactosa terminal queda expuesta, las glucoproteínas asialoladas se endocitan mediante receptores hepáticos de asialo galcotosa por medio de endocitosis mediada por receptores (Hildenbrandt y Aronson, 1979).

En consecuencia, el estado de los grupos sialo terminales en dichos fármacos biofarmacéuticos puede requerir un seguimiento como un atributo de calidad importante. Los procedimientos comúnmente empleados incluyen la derivatización de ácido siálico. En este procedimiento, se libera ácido siálico por medio de hidrólisis ácida (por ejemplo, ácido acético 8 M) y se marca con un fluoróforo o un cromóforo, tal como con 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno (DMB) El marcado viene seguido de un análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC).

En un enfoque alternativo se usa un procedimiento en el que se somete el ácido siálico liberado enzimáticamente (sialidasa-A) a una separación cromatográfica de intercambio aniónico a pH elevado (HPAEC) y a una posterior detección amperométrica pulsada (PAD). El sistema HPAEC-PAD está disponible comercialmente de Dionex.

Ambos procedimientos presentan inconvenientes. La primera técnica de derivatización tiene una variabilidad inherentemente alta y el segundo procedimiento de HPAEC-PAD sufre una alta variabilidad debido al ensuciamiento de los electrodos durante el análisis (Ganesa, Granda y Mattaliano, 2003). Además, los materiales necesarios para el procedimiento HPAEC-PAD son caros y su mantenimiento es costoso. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un procedimiento más eficaz y reproducible para analizar restos de ácido siálico en glicoproteínas recombinantes.

Se han notificado procedimientos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la separación y cuantificación de una sustancia farmacológica que sea fuertemente polar y carezca de cromóforo en una formulación intravenosa (IV) de manitol (Jose M. Cintron et al., 2013). Se han proporcionado procedimientos para la cuantificación de ácido siálico no derivatizado en glucoproteínas, separado mediante cromatografía de interacción hidrófila, y la detección mediante el detector de analitos en nanocantidades (NQAD) (Letha Chemmalil et al., 2014). El documento WO 2013/130604 se refiere a un procedimiento para medir específicamente la sialilación de una biomolécula de interés sin la interferencia de otras biomoléculas presentes en la muestra. El documento WO 2010/071824 describes procedimientos para enriquecer, identificar y/o cuantificar glucanos modificados de forma no habitual. Ganesa et al., 2003 se refiere a la influencia de los niveles de sialilación en la cuantificación de oligosacáridos.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. La invención divulgada en el presente documento proporciona un procedimiento mejorado y fiable para la determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante. La invención es particularmente adecuada para la determinación de la cantidad de un resto de ácido siálico en un anticuerpo recombinante. La invención se basa, en parte, en el desarrollo de técnicas para la determinación de restos de ácido siálico en glucoproteínas recombinantes usando la tecnología de recuento de partículas por condensación de agua (WCPC). La tecnología WCPC permite agrandar el analito utilizando vapor de agua para proporcionar la máxima sensibilidad. Tal como se muestra más adelante, se divulgan procedimientos que permiten la cuantificación de restos de ácido siálico en anticuerpos recombinantes.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo recombinante con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico. El glucano liberado puede separarse del anticuerpo recombinante antes de la etapa de cuantificación. Los restos glucano incluyen, pero sin limitación, ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N, glucanos unidos a O y análisis de composición de monosacáridos. La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación de la invención puede utilizar un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). También se proporciona un procedimiento para determinar un resto de ácido siálico en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo recombinante con una sialidasa para liberar ácido siálico y cuantificar el ácido siálico usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación. Opcionalmente, el ácido siálico liberado se separa del anticuerpo recombinante antes de la etapa de cuantificación. La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación puede utilizar un detector de analitos en nanocantidades (NQAD).

En un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.

En una forma de realización, el procedimiento comprende además separar el glucano liberado del anticuerpo antes de la etapa de cuantificación. En otra forma de realización, la etapa de separación implica cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), tal como cromatografía de interacción hidrófila (HILIC). En otra forma de realización, la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación utiliza un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). En otra forma de realización, el anticuerpo es de cualquier isotipo o subclase. En otra forma de realización, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra forma de realización, el anticuerpo se aísla de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo está destinado a aplicaciones terapéuticas. En otra forma de realización, el resto glucano en el anticuerpo es un atributo de calidad crítico.

En otra forma de realización, el anticuerpo reconoce uno o más antígenos seleccionados de entre: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23, subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos, B7RP-1, B7RP-2, VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de<e>G<f>, receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvIII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4), receptor de BAFF, bCm A, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o de páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFNy, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1 , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.

En otra forma de realización, el anticuerpo se selecciona de entre adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab guselkumab, ozogamicin, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

En otra forma de realización, el resto glucano es uno o más de ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N, glucanos unidos a O y análisis de composición de monosacáridos. En otra forma de realización, el resto glucano es ácido siálico y la glucosidasa es sialidasa. En otra forma de realización, el ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneurámico. En otra forma de realización, se determina la cantidad de ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneuramínico o la relación de ácido N-acetilneuramínico a ácido N-glicolilneuramínico.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: separación de NANA y NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX (trietilamina/acetonitrilo en condiciones de gradiente isocráticas).

Figura 2A: cromatograma de NANA/NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm usando ácido fórmico al 20%.

Figura 2B: cromatograma de NANA/NGNA (inyección separada y combinada) en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm usando ácido fórmico al 20%.

Figura 3A: cromatograma representativo de un patrón de ácido siálico (NANA).

Figura 3B: cromatograma representativo de ácido siálico (NANA) liberado por sialidasa A de glucoproteína-A.

Figura 4: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm con una composición de gradiente inicial del 15% de B.

Figura 5: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm con una composición de gradiente inicial del 20% de B.

Figura 6: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de10 cm con una composición de gradiente inicial del 25% de B.

Figura 7: separación de NANA y NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm (acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B) con un gradiente inicial del 20% de B.

Figura 8: gráfica de regresión lineal de los patrones de calibración de ácido siálico (NANA).

Figura 9: intervalo dinámico lineal del ácido siálico en el procedimiento de HPLC/NQAD.

Descripción detallada

Tal como se muestra en el presente documento en un aspecto de la invención, el análisis de anticuerpos sin derivatización usando un procedimiento de HPLC/NQAD con una columna de amida PolyGLYCOPLEX™ se correlacionó bien con un procedimiento de HPLC con derivatización previa a la columna usando 1,2-diamino-4, 5-metilendioxibenceno (DMB), así como con la cromatografía de intercambio aniónico de pH elevado basada en Dionex (o cromatografía iónica) con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Sin embargo, con la eliminación de la etapa de derivatización, el procedimiento de HPLC/NQAD es más eficaz que el procedimiento de HPLC/DMB. Además, el procedimiento de HPLC/NQAD es más reproducible que el procedimiento de HPAEC-PAD, ya que el procedimiento de HPAEC-PAD sufre una alta variabilidad debido al ensuciamiento de los electrodos durante el análisis. En general, el procedimiento de HPLC/NQAD divulgado en el presente documento como un aspecto de la invención ofrece un intervalo dinámico lineal amplio, así como una excelente precisión, exactitud, repetibilidad, fiabilidad y facilidad de uso, con una comparabilidad aceptable con los procedimientos que se utilizan habitualmente HPAE-PAD y HPLC/DMB.

Por lo tanto, los procedimientos de la invención incluyen la digestión del anticuerpo recombinante con una sialidasa para generar ácido siálico y, después, la cuantificación de la cantidad y/o el tipo de resto de ácido siálico usando la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación.

No obstante, los procedimientos de la invención también se pueden utilizar para analizar otros restos glucano, además del ácido siálico, incluyendo, pero sin limitación, N-glucanos, galactosa terminal, O-glucanos y análisis de composición de monosacáridos. Los ejemplos de otros restos glucano específicos que se pueden detectar, cuantificar o analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, glucosa (Glu), galactosa (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), manosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa (Fuc), N-acetil-manosamina (ManNAc), fructosa y sacarosa, así como combinaciones más complejas de uno o más tipos de dichos restos, tales como estructuras monoantenarias, biantenarias, triantenarias, tetraantenarias y de orden superior. Cualquier cantidad de modificaciones postraduccionales de las glucoproteínas se puede determinar y cuantificar de forma similar usando los procedimientos de la invención descritos en el presente documento con particularidad para los restos de ácido siálico.

Detección de dispersión de luz por nucleación por condensación

La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación es un tipo de técnica de detección basada en aerosol. Una muestra que se va a someter a ensayo, en primer lugar, se nebuliza en gotas y, después, la fase móvil se evapora de las gotas, dejando partículas suspendidas en el aire de sustancias químicas con una volatilidad inferior a la fase móvil. Este aerosol seco se desplaza, después, a otra cámara donde se condensa vapor de agua sobre las partículas, que se hinchan. Las partículas hinchadas se pueden detectar de forma individual usando un sensor óptico basado en láser. (Gille y Crowshaw, 2008, Chromatography Today, Vol. 1(3), página 26). Un sistema disponible comercialmente para la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación es el detector de analito en nanocantidades (NQAD™) de Dionex.

A diferencia de otros detectores basados en aerosol, la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, tal como el NQAD, no padece interferencias por el ruido o el desplazamiento del sensor que puedan interferir con la resolución y la sensibilidad de los analitos. Mientras que los detectores de índice de refracción y otros detectores basados en aerosol se enfrentan a una inestabilidad basal y a una falta de respuesta lineal durante las ejecuciones de gradiente, se ha demostrado que el sistema NQAD tiene un valor basal estable, un intervalo dinámico lineal más amplio y ha demostrado ser adecuado para la cuantificación de analitos en niveles bajos de nanogramos (Hutchinson, Li, Farrell, Groeber, Szucs, Dicinoski y Haddad, 2011). El detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) y el NQAD son ambos baratos, fáciles de operar y compatibles con todos los tipos de sistemas de HPLC. No obstante, en la cuantificación, el NQAD es más adecuado que el ELSD, ya que este tiene un intervalo dinámico lineal más amplio y mayor sensibilidad.

Según Hutchinson et al. (2011), los límites de detección de analitos cromofóricos UV con una diversidad de propiedades fisicoquímicas se evaluaron usando diversos detectores con diferentes composiciones de fase móvil en condiciones de gradiente en las que se ha demostrado que el NQAD es el detector más sensible. Hutchinson et al. (2011) observaron que el límite de detección inferior (LLOD) del NQAD era de 10 ng/ml, seguido del CAD (detector de aerosol cargado) Corona con un LLOD de 76 ng/ml y el detector de UV (a 200 nm) con un LLOD de 178 ng/ml a un volumen de inyección de 25 |ul de analitos que constan de diversas características fisicoquímicas. Basándose en el estudio realizado por Olsovska, Kamenik y Cjthaml (2009), los compuestos antibióticos investigados (con una baja absorción de UV), macrólidos (oleandomicina, eritromicina, troleandomicina, claritromicina y roxitromicina) habían mostrado una sensibilidad tres veces mayor en la detección con NQAD, en comparación con la detección con UV. Con la mayor sensibilidad de NQAD en los niveles de LOD (límite de detección) y LOQ (límite de cuantificación), junto con la capacidad del NQAD para detectar compuestos antibióticos no cromofóricos, se había permitido la identificación de compuestos antibióticos novedosos (Olsovska, Kamenik y Cajthaml, 2009).

A diferencia de los detectores de índice de refracción, el detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) convencional ofrece capacidades de gradiente y una sensibilidad adecuada. No obstante, un inconveniente del ELSD es que la respuesta del detector es exponencial, en lugar de lineal (Kimball, Arjo y Johnston, 2004). La transformación de datos se debe aplicar a la respuesta de datos de ELSD para generar una función lineal. Con la transformación de datos, los detectores de dispersión de luz por evaporación, tales como ELSD 800 y ELSD 3300 de Alltech, han demostrado una excelente linealidad, además de una exactitud, precisión (repetibilidad y precisiones entre ensayos), especificidad, robustez y estabilidad aceptables (Cintron y Risley, 2013). Sin embargo, se ha demostrado que el detector NQAD es 50 y 10 veces más sensible que el ELSD 800 y el ELSD 3300 con límites de detección (LOD) de 50 g/ml, 10 g/ml y 1 g/ml para el ELSD 800, el<e>L<s>D 3300 y el NQAD, respectivamente.

Tal como se muestra más adelante, los procedimientos de la invención se pueden usar para identificar y cuantificar los restos ácido siálico en un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, la cantidad y/o la relación del ácido N-acetilneuramínico al ácido N-glucolilneurámico liberados se resolvieron y se cuantificaron fácilmente usando los procedimientos de la invención. Otros restos glucano (por ejemplo, glucanos unidos a N, galactosa terminal, glucanos unidos a O y el análisis de composición de monosacáridos) se pueden determinar y cuantificar de forma similar.

Liberación del resto de ácido glucano del anticuerpo recombinante

Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para dirigirse al resto glucano del anticuerpo y liberarlo. Normalmente, dichos procedimientos incluirán la selección de las enzimas adecuadas que escinden el resto glucano que se desea determinar y cuantificar. Dichas enzimas, conocidas como glucosidasas, se conocen ampliamente y están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: sialidasas; PNGasa F, que escinde todos los oligosacáridos complejos, híbridos o con alto contenido de manosa unidos a asparagina (excepto aquellos que contienen un núcleo de a(1-3)-fucosa); endoglucosidasas F1, F2 y F3; endoglucosidasa H; O-glucosidasa para la liberación de glucanos unidos a O; y galactosidasa para la liberación de galactosa terminal.

En uno de los procedimientos de la invención, la glucoproteína recombinante se digiere con una sialidasa para liberar ácido siálico. El ácido siálico liberado se puede detectar después usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación. Se puede usar cualquier cantidad de sialidasas disponibles comercialmente. La invención se ilustra más adelante usando Sialidase-A™ (Prozyme), que libera ácido N-acetilneuramínico unido en a(2-3), a(2-6), a(2-8) y a(2-9) de carbohidratos complejos. Sin embargo, también se pueden usar otras sialidasas, dependiendo de la aplicación y el resto de ácido siálico particular que se va a detectar en la glucoproteína recombinante.

Separación del glucano liberado del anticuerpo recombinante

Opcionalmente, después de liberarse el resto glucano del anticuerpo recombinante, se puede usar una etapa de separación para la mejora de la capacidad de detección del procedimiento de la invención. El resto glucano liberado se puede separar mediante cualquier cantidad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación, electroforesis capilar, filtración y/o cromatografía basada en el tamaño, la carga, la hidrofobicidad o una combinación de los mismos. La cromatografía puede ser por lotes o en columna.

En un aspecto ampliamente usado en los laboratorios de cuantificación, la etapa de separación se realiza usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Las columnas de HPLC están disponibles en una amplia diversidad de formatos, tamaños y medios de cromatografía. En una forma de realización de la invención que emplea HPLC, que se ilustra más adelante, se puede usar una etapa de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) para separar el resto de ácido siálico liberado del anticuerpo recombinante. No obstante, debe entenderse que se pueden desarrollar otras etapas de separación, dependiendo del resto glucano o los restos que se van a analizar y el anticuerpo. Las condiciones de carga y elución pueden utilizar diversos tampones y gradientes, dependiendo de la aplicación seleccionada, y son conocidos por parte de aquellos expertos en la técnica.

Anticuerpo recombinante para su uso en los procedimientos divulgados

Una glucoproteína recombinante se define como cualquier proteína que se produce por una célula huésped que se ha diseñado para producir la proteína mediante técnicas de biología molecular, tales como tecnología de ADN recombinante (ADNr), mediante la que la proteína se ha glucosilado postraduccionalmente. El estado del resto glucano en una glucoproteína recombinante puede ser un atributo de calidad crítico, en especial para las glucoproteínas recombinantes destinadas a aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, su administración a un mamífero). Los procedimientos divulgados tienen una utilidad particular en la fabricación de proteínas terapéuticas que son anticuerpos recombinantes, siendo el anticuerpo humano, humanizado o quimérico. Otros ejemplos de dichas proteínas, que se describen con más detalle más adelante, pero no están abarcados por los procedimiento de la invención, son proteínas de fusión, hormonas y citocinas, así como derivados, variantes, muteínas, fragmentos, multímeros y conjugados de las mismas.

Otros ejemplos de glicoproteínas recombinantes que pueden analizarse pero que no están abarcadas por los procedimientos de la invención incluyen proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente similares a la totalidad o a una parte de una de las siguientes proteínas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando de flt3 (documento WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligando para el activador del receptor de NF-kappa B (RANKL, documento WO 01/36637), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, documento WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, patente de Australia N° 588819), factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de células madre (patente de Estados Unidos N° 6.204.363), factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos, RANTES, proteína 2 similar a fibrinógeno humano (FGL2; número de acceso del NCBI NM_00682; Rüegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62) hormona del crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona paratiroidea, interferones, incluidos interferones a, interferón y e interferones de consenso (patentes de Estados Unidos N° 4.695.623 y 4.897.471), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares a sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagón, interleucinas, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor inhibidor de la leucemia y oncostatina-M. Las descripciones de glucoproteínas recombinantes que pueden analizarse según los procedimientos de la invención se pueden encontrar, por ejemplo, en Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, todos los volúmenes (Aggarwal yGutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993); y The Cytokine Handbook, Vol. 1 y 2 (Thompson y Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

Además, los procedimientos divulgados son útiles para analizar glucanos liberados de las glucoproteínas recombinantes que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de aminoácidos de un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, un antagonista de dicho receptor o cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente y/o proteínas sustancialmente similares a dichos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR en inglés, denominadas p55 y p75, patente de Estados Unidos N° 5.395.760 y patente de Estados Unidos N° 5.610.279), receptores de interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; patente EP N° 0460846, patente de Estados Unidos N° 4.968.607 y patente de Estados Unidos N° 5.767.064), antagonistas del receptor de IL-1 (patente de Estados Unidos N° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (patentes de Estados Unidos N° 5.981.713, 6.096.728 y 5.075.222), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (patente<e>P N° 0367 566 y patente de Estados Unidos N° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores del factor inhibidor de oncostatina-M y leucemia, receptor activador de NF-kappa B (RANK, documento WO 01/36637 y patente de Estados Unidos N° 6.271.349), osteoprotegerina (patente de Estados Unidos N° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluidos receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o receptor inductor de la apoptosis (AIR).

Otras glucoproteínas recombinantes que se pueden analizar, pero que no están abarcadas por los procedimientos de la invención, incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de aminoácidos de los antígenos de diferenciación (denominadas proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a cualquiera de estos. Dichos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., Eds., Kobe, Japón, 1996). En seminarios posteriores se divulgan proteínas CD similares. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.).

Los procedimientos divulgados están adaptados, en particular, al análisis de restos de ácido siálico en glucoproteínas recombinantes que son proteínas de fusión. Las proteínas de fusión pueden comprender la totalidad o una parte de cualquiera de las proteínas anteriores fusionadas con otra proteína o dominio de proteína. Las proteínas de fusión particularmente útiles son las proteínas de fusión Fc. Una serie de dichas proteínas de fusión está disponible comercialmente o se encuentra en desarrollo. Los ejemplos de proteínas de fusión que se pueden analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, etanercept, aflibercept, rilonacept, belatacept, abatacept y alefacept.

Las glucoproteínas recombinantes enzimáticamente activas o sus ligandos también se pueden analizar con los procedimientos de la invención, pero no están abarcadas por los mismos. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una proteína sustancialmente similar a una de las mismas: una desintegrina y miembras de la familia del dominio de metaloproteinasa, incluyendo la enzima convertidora de TNF-alfa, diversas cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y otras numerosas enzimas y sus ligandos.

Las proteínas recombinantes que son anticuerpos también se pueden analizar usando los procedimientos de la invención. El término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas de cualquier isotipo o subclase o a una región de unión a antígeno de las mismas que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique de otra forma, incluyendo anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos, multiespecíficos, monoclonales, policlonales y oligómeros o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se incluyen proteínas que tienen un fragmento o una región de unión a antígeno, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpos, Fd, dAb, maxicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias, fragmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión de antígeno específico a un polipéptido diana. El término "anticuerpo" incluye, pero sin limitación, aquellos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan mediante medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo.

Los ejemplos de los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, aquellos que reconocen una cualquiera o una combinación de proteínas, que incluyen, pero sin limitación, las proteínas mencionadas anteriormente y/o los antígenos siguientes: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de iL-23, subunidad p40 compartida de iL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de<IL-1>8<, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos (véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.272.064 y 5.149.792),>B7RP-1, B7RP-2, V eGf , TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de EGF (véase la patente de Estados Unidos N° 6.235.883), receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvlII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4;véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), receptor de BAFF, BCMA, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFNy, receptores de TRAIL 1,2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno citotóxico asociado a linfocitos T), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1 , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.Los ejemplos específicos de anticuerpos conocidos que se pueden analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab, guselkumab, ozogamicina, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

Los ejemplos de las citocinas que son glucoproteínas incluyen, pero sin limitación, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-17 (incluyendo, pero sin limitación, monómeros, homodímeros y heterodímeros de IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D y IL-17E (también conocidos como IL-25)), IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23 y subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23.

Una vez descrita la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

Ejemplos

Abreviaturas

ACN: Acetonitrilo

AEX: Cromatografía de intercambio aniónico

CAD: Detector de aerosol cargado

CEX: Cromatografía de intercambio catiónico

CNLSD: Detección de dispersión de luz por nucleación por condensación

DMB: 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno

ELSD: Detector de dispersión de luz por evaporación

HIC: Cromatografía de interacción hidrófoba

HILIC: Cromatografía de interacción hidrófila

HPAEC-PAD: Cromatografía de intercambio aniónico y detección amperométrica pulsada

LLOD: Límite inferior de detección

LOD: Límite de detección

LOQ: Límite de cuantificación

NANA: Ácido N-acetilneuramínico

Neu5Ac Ácido N-acetilneuramínico

NGNA: Ácido N-glicolilneuramínico

NQAD: Detector de analitos en nanocantidades

PAD: Detector amperométrico pulsado

RP-HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa

TFA: Ácido trifluoroacético

WCPC: Recuento de partículas por condensación basada en agua

CL-EM: Cromatografía líquida-espectrometría de masas

Procedimientos y materiales

Se adquirieron columnas de amida PolyGLYCOPLEX (50 x 4,0 mm con 5 g) y (100 x 2,1 mm, 5 g) de PolyLC. Se adquirieron una columna XBridge C18 (4,6 x 250 mm con 5 g) y una columna analítica YMC-Pack ODS-AQ (2,0 x 150 mm con 3 g) de Waters. Se adquirieron una columna Kinetex C18 (4,6 x 100 mm con 2,6 g) y una columna de azúcar de modo mixto (cromatografía de exclusión por tamaño/iónica) (8,0 x 300 mm con 6 g) de Phenomenex y Shodex, respectivamente. Se adquirieron columnas de intercambio aniónico y catiónico (4,6 x 150 mm con 3 g) de Sepax Technologies. Se adquirieron 1-heptanosulfonato de sodio, hidrogenosulfato de trimetiltetradecilamonio, ácido L-glutámico, ácido L-aspártico, NANA y NGNA de Sigma Aldrich. Se adquirió sialidasa-A de Prozyme. Se adquirieron viales de muestreador automático de HPLC, insertos de vidrio y tapas de viales de Agilent. Se usaron dos glucoproteínas internas (Glucoproteínas A y B) que contenían ácido siálico (NANA) unido a N y O como proteínas modelo para el estudio.

Ejemplo 1

1. Examen inicial de las columnas de HPLC con diversas químicas

La selección de una columna adecuada es una parte importante del desarrollo de cualquier procedimiento de HPLC. Por lo tanto, se llevó a cabo una evaluación exhaustiva de múltiples químicas de columnas. A fin de retener y cuantificar el ácido siálico, se evaluaron diversas columnas de RP-HPLC, incluyendo la columna X-bridge C18, la columna YMC-Pack ODS-AQ C18 y la columna Kinetex C18 en condiciones de fases móviles ácidas (TFA al 0,1% y TFA/ACN al 0,1% como fases móviles A y B, respectivamente) y neutras (tampón de fosfato 50 mM, pH 7,0 y ACN como las fases móviles inicial y de elución, respectivamente). También se llevó a cabo una evaluación a un pH intermedio usando fosfato de trietilamina 10 mM a pH 4,4 como fase móvil inicial y acetonitrilo como fase móvil de elución. En todos los casos, se mantuvo inicialmente un gradiente isocrático al 5% de B durante 5 minutos antes de la aplicación de un gradiente lineal con un incremento del 4% por minuto hasta que se alcanzó el 95% de B. Se aplicó un caudal de 1 ml/min en todos los casos.

Dado que el análisis por RP-HPLC en presencia de reactivos de pares iónicos adecuados puede aumentar la retención de analitos cargados (Sharma, Glick y Vouros, 2012), tales como el ácido siálico, también se exploró la cromatografía de pares iónicos mediante la adición de o bien un reactivo de pares iónicos catiónico cargado positivamente o un agente de pares iónicos aniónico cargado negativamente a la fase móvil a una concentración final 5 mM. Se usó una solución de 1-heptanosulfonato de sodio como reactivo de pares iónicos catiónico (Calhoun y King, 2007) e hidrogenosulfato de trimetiltetradecilamonio como reactivo de pares iónicos aniónico (Remsburg, 2007). Los análisis cromatográficos de pares iónicos se llevaron a cabo en una columna X-bridge C18 usando TFA al 0,1% con un reactivo de pares iónicos 5 mM como fase móvil A y TFA al 0,1% con un reactivo de pares iónicos 5 mM/ACN como fase móvil B de elución. En todos los casos, se aplicó un gradiente lineal del 5% de B al 95% de B en el transcurso de 20 minutos. Tal como describen Isakau, Robert y Shingel (2009), se evaluó una columna de azúcar de modo mixto de cromatografía de exclusión por tamaño/iónica (SEC/IEX) de Shodex en modo isocrático a un caudal de 1 ml/min usando metanol al 50% como fase móvil. Dicha cromatografía SEC/IEX se ha reconocido como una técnica eficaz para la determinación simultánea de aniones y cationes después de una inyección de muestra individual en la columna de separación (Mori, Taoda, Itabashi, Ikedo y Tanaka, 2006). El patrón de ácido siálico (NANA) a una concentración de 1 mg/ml se diluyó en serie hasta 0,0156 mg/ml y a partir de la misma se inyectaron 100 gl de cada patrón.

Como el detector NQAD no es compatible con un alto contenido de sal, las columnas AEX y CEX se evaluaron usando un gradiente de pH en lugar de un gradiente de sal. Se realizó la cromatografía de intercambio iónico en el gradiente de pH usando columnas catiónicas y aniónicas de Sepax. Con el pKa conocido (2,6) de ácido siálico (NANA), se aplicó un gradiente de pH lineal partiendo de un pH 2,2 y terminando en un pH 3,6 mediante el uso de glicina/HCl 10 mM para la cromatografía de intercambio aniónico y un gradiente lineal de pH 3,6 a pH 2,2 mediante el uso de glicina/HCl 10 mM para la cromatografía de intercambio catiónico. Todos los análisis se llevaron a cabo en sistemas Agilent 1100 o 1200 equipados con un NQAD de QUANT Technologies.

RESULTADOS: Los resultados de evaluación de diversas técnicas de separación sugirieron que la cuantificación del ácido siálico no derivatizado no era factible con técnicas cromatográficas, tales como RP-HPLC, cromatografía de pares iónicos, cromatografía de exclusión por tamaño/iónica de modo mixto y cromatografía de intercambio iónico (en el modo de gradiente de pH). Los resultados obtenidos a partir de la evaluación de las columnas de RP-HPLC sugirieron que el ácido siálico fuertemente polar no podría retenerse en condiciones de pH ácidas, neutras o intermedias. El fenómeno observado no fue inesperado, ya que los grupos polares muy enriquecidos en ácido siálico (carbonilo, oxilo, carboxílico, amina y múltiples hidroxilos) inhiben su unión a las columnas de RP-HPLC. Aunque las columnas de RP-HPLC facilitan la retención del ácido siálico marcado fluorescente extremadamente hidrófobo (Zauner, Deelder y Wuhrer, 2011), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar es difícil de retener en una columna de RP-HPLC. El intento que se realizó para aumentar la hidrofobicidad del ácido siálico utilizando reactivos de pares iónicos no tuvo éxito. El análisis por RP-HPLC de ácido siálico en presencia de reactivos de pares iónicos catiónicos y aniónicos no ayudó a mejorar la retención del ácido siálico no derivatizado en la columna de RP-HPLC. Aunque los enfoques intentados deben trabajarse sobre bases teóricas, el resultado negativo podría ser consecuencia del hecho de que la cantidad recomendada por el proveedor del reactivo de pares iónicos 5 mM puede no haber sido suficiente para una unión adecuada. Basándose en la literatura publicada, la cantidad de los reactivos de pares iónicos debe ser significativamente superior en moléculas fuertemente polares tales como el ácido siálico. Por ejemplo, se usó una solución acuosa 60 mM de reactivo de pares iónicos de triisopropanolamina para la determinación de ácidos siálicos en fluidos biológicos usando cromatografía de pares iónicos de fase inversa (Siskos y Spyridk, 1999). Se puede explorar el aumento de la cantidad de reactivos de pares iónicos.

Los resultados de evaluación de la columna de azúcar de modo mixto de cromatografía de exclusión por tamaño/iónica (dimensiones: 8 x 300 mm) indicaron que la sensibilidad del procedimiento no fue suficiente para la aplicación prevista. El patrón de ácido siálico con concentraciones < 1 mg/ml no presentó ningún pico en 100 gl de inyección en esta columna. Como el umbral de detección del procedimiento se encuentra por debajo del intervalo deseado (de 0,015 a 1.0 mg/ml), no se realizó una optimización adicional de este procedimiento. La misma columna con unas dimensiones menores podría ayudar a mejorar la sensibilidad del procedimiento. Sin embargo, aún no hay disponibles columnas con dimensiones menores. No se muestran los cromatogramas obtenidos a partir de cualquiera de los análisis mencionados anteriormente, ya que ninguno de los mismos presentó picos distintos de los picos de inyección.

Las fases estacionarias que contienen estructuras poliméricas de derivados de poli-succinimida con grupos funcionales, tales como PolyGLYCOPLEX, aspartamida de polisulfoetilo y aspartamida de polihidroxietilo, son más adecuadas, ya que se usan ampliamente para separar diversos compuestos fuertemente polares (Ikegami, Tomomatsu, Takubo, Horie y Tanaka, 2008).

Ejemplo 2

2.Evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX para la separación de NANA-NGNA

Esta evaluación se llevó a cabo para evaluar el uso de una columna de amida PolyGLYCOPLEX para la separación y la cuantificación de NANA y NGNA en proteínas que contienen ambas formas de ácidos siálicos. Aunque los procedimientos de RP-HPLC son adecuados para la retención del ácido siálico marcado fluorescente extremadamente hidrófobo (Zauner, Deelder y Wuhrer, 2011), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar es difícil de retener en una columna de RP-HPLC. Por lo tanto, se exploró la cromatografía HILIC. Para separar diversos compuestos fuertemente polares se han utilizado fases estacionarias que contienen estructuras poliméricas de derivados de polisuccinimida con grupos funcionales, tales como PolyGLYCOPLEX, aspartamida de polisulfoetilo y aspartamida de polihidroxietilo (Ikegami, Tomomatsu, Takubo, Horie y Tanaka, 2008). La columna de amida PolyGLYCOPLEX (100 x 2.1 mm, 3 p) de PolyLC se evaluó en condiciones isocráticas utilizando la fase móvil que contenía acetonitrilo con fosfato de trietilamina 10 mM (80:20 en v/v) a un pH de 4,4. Los patrones de NANA y NGNA a 1 mg/ml se diluyeron 1:10 con agua, en primer lugar, y, después, los dos patrones se mezclaron a una relación de 1:1 antes de preparar inyecciones de 10 pl. Después de la inyección de la mezcla de NANA-NGNA, también se inyectaron por separado 5 pl de cada uno de los patrones de NANA-NGNA. Se llevaron a cabo análisis en el sistema Agilent 1100 usando el ajuste de NQAD mostrado a continuación.

Parámetros de NQAD

RESULTADOS: Tal como se representa en la figura 1, el análisis llevado a cabo en la columna de amida PolyGLYCOPLEX usando acetonitrilo con fosfato de trietilamina 10 mM a pH de 4,4 en condiciones isocráticas proporcionó una excelente separación entre NANA y NGNA. Las asignaciones de pico se realizaron mediante la inyección de NANA y NGNA por separado. Sin embargo, el grado de arrastre fue tan grave (datos no mostrados) que si se inyecta NGNA después de NANA, no se podría obtener un cromatograma de NGNA limpio sin tener un nivel traza de NANA y viceversa. El problema del arrastre junto con la variabilidad de ejecución a ejecución inherente a los procedimientos isocráticos nos llevó a descartar este procedimiento. Aunque se puede desarrollar y adoptar un protocolo de limpieza de columna para resolver el problema del arrastre, este puede influir en la exactitud de los resultados de cuantificación.

Ejemplo 3

3. Optimización del procedimiento de PolyGLYCOPLEX para la separación de NANA-NGNA

Los resultados de evaluación de las columnas de amida de PolyGLYCOPLEX de 5 y 10 cm en diferentes condiciones de fase móvil se muestran en las secciones 3.1 a 3.4. Los resultados de evaluación de las temperaturas de evaporador se muestran en la sección 3.5.

3.1 Optimización de la cromatografía

En este ejemplo, se evaluó y se optimizó la columna de amida PolyGLYCOPLEX en diferentes condiciones de fase móvil y diversos ajustes de la temperatura de evaporador de NQAD. Dado que la columna de amida PolyGLYCOPLEX superó a otras químicas de columna en términos de retención del ácido siálico no derivatizado, se seleccionó la columna de amida PolyGLYCOPLEX para una optimización adicional a fin de lograr la mejor separación posible entre NANA y NGNA sin tener el problema del arrastre. Aunque esta sección (sección 3.1) detalla la optimización cromatográfica del procedimiento, la sección 3.2 describe las condiciones utilizadas para la optimización de la temperatura de evaporador de NQAD. Las diferentes condiciones cromatográficas evaluadas son las enumeradas a continuación.

• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles

• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN al 100% y TFA al 0,1% como fases móviles

• Columna de PolyGLYCOPLEX de 5 cm con ACN al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles

• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN y ácido fórmico al 20% como fases móviles

Se evaluó una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm o de 5 cm usando ACN como fase móvil inicial. Se usaron las fases móviles de elución de ácido fórmico o de TFA al 0,1% enumeradas anteriormente. El patrón de NANA a 1 mg/ml se diluyó a 1:10 con agua y se realizaron inyecciones con 0, 2, 4, 6, 8 y 10 pl. Además de eso, se inyectaron patrones de NANA y NGNA (la misma preparación de muestra que en la sección 2) para evaluar la capacidad del procedimiento para separar NANA y NGNA. Los análisis se llevaron a cabo en el sistema Agilent 1200. Los parámetros de NQAD son los mismos que en la sección 2. Se llevaron a cabo múltiples experimentos mediante el cambio de la composición del gradiente inicial, variando del 0% de B al 35% de B. En todos los casos, el % inicial de B se mantuvo constante durante 1 minuto antes de la aplicación del gradiente lineal de 15 minutos hasta que se alcanzó el 95% de B. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal se mantuvo a 0,5 ml/min.

RESULTADOS: De las diversas composiciones de gradiente inicial que se evaluaron, una composición de gradiente inicial del 20% parece ser ligeramente mejor en términos de separación entre NANA y NGNA. Un cromatograma representativo de la separación de NANA-NGNA utilizando la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm (usando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B) en las composiciones de gradiente inicial del 15, 20 y 25% se muestra en las figuras 4, 5 y 6, respectivamente.

A diferencia del problema del arrastre encontrado anteriormente en la ejecución isocrática (sección 1), no se observó este arrastre en ninguna de las condiciones de gradiente evaluadas. La evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido trifluoroacético al 0,1% como fases móviles A y B proporcionó una simetría de ruido y picos basal que fue inferior a lo deseable. Los resultados de evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B proporcionaron una separación entre NANA y NGNA (figura 7) que no fue tan buena como la separación lograda en la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm en las mismas condiciones de análisis (figura 5). La evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 20% como fases móviles A y B indicó que el ácido fórmico al 20% como fase móvil B es mejor que el ácido fórmico al 10% en términos de lograr picos más agudos y una separación ligeramente mejor entre NANA y NGNA (figura 2A frente a figura 5). La figura 2B representa un cromatograma de NANA y NGNA inyectados por separado, así como una mezcla. Se sometió a ensayo la superposición de cromatograma del patrón de NANA en concentraciones múltiples y no se encontró ningún problema de arrastre.

3.2 Optimización de la temperatura de evaporador de NQAD

La temperatura de evaporador (el parámetro más crítico del NQAD) se optimizó para maximizar la evaporación del disolvente del eluyente, al tiempo que se mantuvo la volatilidad mínima del ácido siálico para lograr una relación de señal a ruido óptima. Otros ajustes de temperatura (temperatura de nebulizador, temperatura óptica, temperatura de crecimiento y temperatura de acondicionador) son constantes y no se pueden variar. El ajuste de la temperatura de evaporador se varió de 35 a 60 °C (35, 40, 45, 50, 55 y 60 °C) para determinar la temperatura de evaporador óptima a la que se puede lograr la mejor relación de señal a ruido. La evaluación se llevó a cabo usando la columna de amida PolyGLYCOPLEX (50 x 4 mm, 5 p) con ACN al 100% y ácido fórmico al 20% como fases móviles A y B, respectivamente. Todos los parámetros de NQAD, excepto la temperatura de evaporador, fueron los mismos que en el ejemplo 2. La composición de fase móvil inicial del 20% de B se mantuvo durante 1 minuto antes de aplicarse el gradiente. Se aplicó un incremento lineal del 8,3% de B/min, de tal manera que se alcanzó el 95% de B a los 10 minutos. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal de columna se mantuvo a 1,0 ml/min.

RESULTADOS: La intensidad de señal, así como el ruido basal, fue directamente proporcional al grado de la temperatura de evaporador. Se logró una relación de señal a ruido óptima a una temperatura de evaporador de 40 °C.

Ejemplo 4

4. Columna de amida PolyGLYCOPLEX corta para la cuantificación de NANA

A fin de cuantificar el NANA en las muestras en las que está ausente el NGNA, se evaluó una columna de amida PolyGLYCOPLEX corta (50 x 4,6 mm, 3 pm). A fin de aumentar la vida de columna, se usó un menor porcentaje de ácido fórmico como fase móvil de elución en lugar de ácido fórmico al 20%. Como un porcentaje menor de ácido fórmico no es lo suficientemente fuerte como para eluir el ácido siálico fuertemente polar de la columna de amida PolyGLYCOPLEX, se llevó a cabo una evaluación en un enfoque de gradiente novedoso. En este enfoque, el gradiente de la fase móvil se cambió de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución tan pronto como se realizó la inyección, de tal manera que el ácido siálico unido se eluye en un entorno isocrático de la fase móvil de elución. La evaluación se llevó a cabo para determinar las composiciones y el caudal de las fases móviles óptimas, así como el mejor gradiente. El NANA liberado de PNGasaF se sometió a un análisis de HPLC/NQAD antes y después de la filtración para determinar la necesidad de filtración. Los parámetros de evaluación detallados se describen en las secciones 4.1 a 4.4.

Los resultados de evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX corta (50 x 4,6 mm, 3 pm) con un menor porcentaje de ácido fórmico como fase móvil de elución son adecuados para la cuantificación de NANA, siempre que el cambio de la condición de fase móvil inicial a la condición de fase móvil de elución se produzca poco después de realizarse la inyección. En esta condición de gradiente, se logran un valor basal estable y una simetría de picos adecuada a medida que se produce la elución del ácido siálico (NANA) durante el entorno isocrático de la fase móvil de elución. Los resultados de análisis de las diferentes fases móviles de elución, las diferentes condiciones de gradiente y los diferentes caudales mostrados en las secciones 4.1 a 4.3 indicaron que se logran los mejores resultados con ácido fórmico al 1 % a un caudal de 1,5 ml/min con el uso del gradiente 2. Los resultados mostrados en la sección 4.3 sugirieron que no se requiere la filtración de muestra posterior a la PNGasaF. Los cromatogramas representativos del patrón de ácido siálico (NANA) y el ácido siálico (NANA) liberado por PNGasaF de las glucoproteínas usando las condiciones optimizadas se muestran en las figuras 3A y 3B, respectivamente. Una gráfica de regresión lineal representativa de los patrones de NANA se muestra en la figura 8.

4.1 Evaluación de ácido fórmico al 0,5% frente a ácido fórmico al 1,0%

Aunque se usó acetonitrilo al 100% como fase móvil inicial, se usó ácido fórmico al 0,5% o al 1,0% como fase móvil de elución para este conjunto de experimentos. Todos los parámetros de NQAD, excepto la temperatura de evaporador, fueron los mismos que en la sección 2. Se aplicó la temperatura de evaporador optimizada de 40 °C. El cambio de gradiente de fase móvil A (ACN al 100%) a fase móvil B (ácido fórmico al 1,0%) se indujo para que se produjera 1 minuto después de la inyección. Después del cambio de gradiente, se mantuvo la condición isocrática de ácido fórmico al 1,0% durante 10 minutos. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal se mantuvo a 1,0 ml/min.

RESULTADOS: Los cromatogramas superpuestos y apilados de dos fases móviles de elución (ácido fórmico al 0,5% y al 1% como fases móviles de elución) demostraron que el cromatograma generado con ácido fórmico al 1% presentó una mejor simetría de picos que con ácido fórmico al 0,5%, por lo tanto, se seleccionó ácido fórmico al 1% en vez de al 0,5%.

4.2 Evaluación de los gradientes 1 y 2

Todos los parámetros, excepto el gradiente de HPLC, fueron los mismos que en la sección 4.1. Se usaron ACN al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente. Aunque el cambio de gradiente de ACN al 100% a ácido fórmico al 1,0% se indujo para que se produjera en 1,0 minuto para el gradiente 2, la duración para el cambio de gradiente se redujo de 1,0 minuto a 0,1 minutos para el gradiente 1.

RESULTADOS: Los cromatogramas obtenidos a partir del gradiente 1 (cambio rápido del gradiente de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución en 0,1 minutos) y del gradiente 2 (cambio del gradiente de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución en 1,0 minuto) no fueron muy diferentes entre sí. Sin embargo, se seleccionó el gradiente 2 con un tiempo de retención más largo porque la separación entre el ácido siálico y los patrones de idoneidad del sistema (eluido de ácido L-glutámico y ácido L-aspártico) es mejor con el gradiente 2.

4.3 Evaluación de diferentes caudales

Se aplicó el gradiente 2 de HPLC descrito en la sección 4.2 a múltiples caudales (1,0, 1,2 y 1,5 ml/min) usando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente. Todos los parámetros de NQAD fueron los mismos que en la sección 4.1.

RESULTADOS: Los análisis llevados a cabo en diferentes caudales mostraron que la mejor simetría de picos se logra a un caudal de 1,5 ml/min.

4.4 Evaluación de la digestión de muestra filtrada frente a no filtrada

Las muestras digeridas con sialidasa se inyectaron con y sin filtración con Centricon. La intención de la filtración con Centricon era separar el ácido siálico (NANA) de la proteína interferente y otros componentes de matriz. Se llevó a cabo un análisis en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm usando los ajustes de NQAD y gradiente de HPLC optimizados mostrados a continuación. Se usaron acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente.

Gradiente de HPLC

Ajustes de NQAD

Los patrones de NANA en el intervalo de 1 a 32 nmol/20 gl de inyección se prepararon a partir de un patrón de NANA liofilizado de Sigma. Se sometió a ensayo un patrón de idoneidad del sistema, ya que este es una parte fundamental de muchos procedimientos analíticos para garantizar la validez de rendimiento del sistema integrado que consiste en los equipos, los componentes electrónicos, las funciones analíticas y las muestras que se van a analizar. La inyección de 20 gl de la mezcla de idoneidad del sistema, que consistía en 1,0 mg/ml de cada uno de ácido L-glutámico y ácido L-aspártico, se incluyó en cada ejecución analítica.

RESULTADOS: Los perfiles cromatográficos, así como las respuestas de pico del NANA, fueron comparables entre las muestras filtradas y no filtradas. A fin de lograr una mayor eficacia durante el análisis, se puede excluir la alternativa de filtración, que requiere mucho tiempo, ya que es evidente que la cuantificación de NANA no se ve interferida por la proteína residual y otros componentes de matriz.

Ejemplo 5

5. Evaluación de comparabilidad del procedimiento de HPLC/NQAD frente a otros procedimientos ortogonales El procedimiento de HPLC corta con el gradiente 2 descrito en la sección 4.2 a un caudal de 1,5 ml/min se comparó frente a los procedimientos de HPAEC-PAD y HPLC/DMB para determinar en que medida se correlacionan los resultados obtenidos a partir del procedimiento de HPLC/NQAD.

5.1 Preparación de muestra para los análisis de HPLC/NQAD, HPAEC-PAD y HPLC/DMB:

En el estudio comparativo, se usaron las técnicas específicas de procedimiento para la liberación de NANA de la glucoproteína. Las condiciones de digestión enzimática usadas para HPLC/NQAD y HPAEC-PAD se describen en las secciones 5.1.1 y 5.1.2, respectivamente. La hidrólisis ácida y la posterior derivatización de DMB realizadas para el procedimiento de HPLC/DMB se describen en la sección 5.1.3. Las etapas de cálculo para la determinación de los picomoles de NANA por inyección se muestran de la forma siguiente.

Las ecuaciones usadas para la determinación de los picomoles de proteína por inyección, así como los picomoles de NANA/picomoles de proteína, son tal como se muestran en las secciones 5.1.1 a 5.1.3.

5.1.1 Digestión de sialidasa-A de las muestras para el procedimiento de HPLC/NQAD:

Para la digestión enzimática, se mezclaron 10 pl de una muestra de 5,0 mg/ml (50 pg) con 12 pl de sialidasa-A (Prozyme) y 4 pl de tampón de reacción 5X y 4 pl de agua Milli-Q. Las muestras se incubaron en un baño de agua a 37 °C ± 3 °C durante 4 horas ± 15 minutos, que se estableció como la condición de digestión óptima a lo largo del transcurso de tiempo de reacción. Al final de la incubación, se añadieron 30 pl de agua para llevar el volumen total a 60 pl. Se usó la siguiente ecuación para el cálculo de los picomoles de proteína por inyección para el procedimiento de HPLC/NQAD:

5.0 mg/ml * 10 pl * (1 julio]' MWen pt;}y (L0,h picomol/ julio!) * (1/60 p¡ ) * 20 jil

En la que 5,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 60 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.

Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X1 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.1.

5.1.2 Digestión de sialidasa-A de las muestras para el procedimiento de HPAEC-PAD:

A fin de liberar el ácido siálico de las muestras de glucoproteína, se mezclaron 10 pl de una muestra de 1,0 mg/ml con 2 pl de sialidasa-A (Prozyme) y 4 pl de tampón de reacción 5X y 4 pl de agua Milli-Q. Las muestras se incubaron en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C durante 4 horas ± 15 minutos, que se estableció como la condición de digestión óptima a lo largo del transcurso de tiempo de reacción. Al final de la incubación, se añadieron 780 pl de agua para llevar el volumen total a 800 pl. Se usó la ecuación siguiente para el cálculo de los picomoles de proteína por inyección para el procedimiento de HPAEC/PAD:

1.0 mgfail * 10 pí * (! pinol/MWenpg) * ( IO1' picóme! pinol) * (1/800 pl ) * 20 pl

En la que 1,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 800 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.

Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X2 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.2.

5.1.3 Hidrólisis ácida y derivatización de DMB para el procedimiento de HPLC/DMB:

El ácido N-acetilneuramínico (NANA) de las muestras de glucoproteínas se liberó mediante una hidrólisis con ácido acético 8 M seguida de una derivación de columna previa con reactivo fluorescente 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno (DMB). El ácido A-acetilneuramínico forma un derivado de quinoxalinona sumamente fluorofórico cuando se somete a tratamiento con DMB (Lin, Inoue e Inoue, 2000). Se usó la ecuación siguiente para el cálculo de los picomoles de proteína para el procedimiento de HPLC/DMB.

En la que 1,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 60 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.

Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X3 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.3.

5.2 Análisis de muestra y evaluación de comparabilidad

Las glucoproteínas A y B se sometieron a ensayos paralelos en los procedimientos de HPLC/NQAD y HPLC/DMB, así como en el procedimiento de HPAEC-PAD. En el procedimiento de HPLC/NQAD, se analizó el NANA liberado de sialidasa-A usando los parámetros cromatográficos y los ajustes de NQAD descritos en la sección 4.4. En el procedimiento de HPLC/DMB, se llevó a cabo un análisis en el sistema Waters Alliance equipado con un detector de fluorescencia. Se usó una columna ultrasphere ODS (Beckman) para la separación. La fase móvil para la separación isocrática de NANA y NGNA consistió en el 78% de agua/21% de metanol/0,3% de acetonitrilo. El eluido de columna se controló usando un detector fluorescente a 374 nm y 448 nm de longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. En el procedimiento de HPAEC-PAD, se analizó el NANA liberado de sialidasa-A usando hidróxido de sodio 0,1 M e hidróxido de sodio 0,1 M con acetato de sodio 1 M como fases móviles A y B, respectivamente. Se aplicó un gradiente lineal del 5% de B al 18% de B a lo largo de un periodo de 35 minutos. El eluido se controló usando un detector amperométrico pulsado (PAD). La concentración de NANA obtenida a partir del procedimiento de HPLC/NQAD se comparó frente a los resultados obtenidos a partir de los procedimientos de HPLC/DMB y HPAEC-PAD para determinar la comparabilidad del procedimiento de HPLC/NQAD con los dos procedimientos ortogonales.

RESULTADOS: Los resultados de comparabilidad del HPLC/NQAD frente al HPAEC-PAD y e1 HPLC/DMB se muestran a continuación en las tablas 1 y 2, respectivamente. Aunque los procedimientos ortogonales (HPAEC-PAD y HPLC/DMB) se usan para la cuantificación del ácido siálico de la glucoproteína-A, el procedimiento HPAEC-PAD es el único procedimiento disponible para la glucoproteína-B. Por lo tanto, el procedimiento HPLC/NQAD solo se comparó frente a HPAEC-PAD para la glucoproteína-B. Los resultados del HPLC/NQAD fueron comparables a los procedimientos ortogonales para las muestras sometidas a ensayo.

Tabla 1: Comparación de HPLC/NQAD frente a HPAEC-PAD

Tabla 2: Comparación de HPLC/NQAD frente a HPLC/DMB

Ejemplo 6

6. Calificación del ensayo de cuantificación de NANA con la columna de amida PolyGLYCOPLEX

El procedimiento de columna corta (con la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm) descrito en la sección 4.4 se sometió a la calificación formal del procedimiento. El procedimiento de HPLC/NQAD corta (con una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm) cumplió con todos los criterios de calificación en cuanto a la exactitud, la linealidad y la precisión de ensayo (repetibilidad y precisión intermedia). El LOD y LOQ del procedimiento se determinaron como 0,32 y 0,86 nmol/inyec., respectivamente. Los resultados detallados se muestran en las secciones 6.1 a 6.4.

6.1 Evaluación de exactitud del procedimiento de HPLC/NQAD

A fin de evaluar la exactitud, se realizó un estudio de adición en el que se añadieron cantidades conocidas de NANA a diversas concentraciones en la glucoproteína-A. Las muestras con adición y sin adición se sometieron después a un análisis de HPLC/NQAD después de la digestión con sialidasa. Las concentraciones de NANA obtenidas para las muestras sin adición se restaron de las muestras con adición, que, después, se compararon frente a la cantidad conocida de NANA añadido para determinar las recuperaciones reales. A fin de verificar, además, la exactitud, se realizó un análisis de espectrometría de masas en un eluido de HPLC/NQAD de glucoproteína-A digerida enzimáticamente.

RESULTADOS: Tal como se ilustra en la tabla 3, los resultados de los experimentos de adición y recuperación demostraron que las recuperaciones de NANA añadido en la glucoproteína-A a diversos niveles se encuentran dentro del intervalo del 90-110%. Las trazas de TIC y los espectros de masas correspondientes indicaron que el pico de NANA obtenido a partir del procedimiento de HPLC/NQAD era puro y que ningún otro componente interferente se coeluyó con el NANA.

Tabla 3: Resultados de adición recuperación

6.2 Evaluación del intervalo dinámico lineal

El intervalo dinámico lineal del ensayo se determinó mediante la ejecución de los conjuntos de patrones de NANA a diversas concentraciones.

Tal como se ilustra en la tabla 4, se ha determinado que el intervalo dinámico lineal del ensayo se encuentra en el intervalo de 1-32 nmol/inyec. con un coeficiente de determinación (R2) = > 0,99. La gráfica de regresión lineal correspondiente se muestra en la figura 9.

Tabla 4: Resultados de la evaluación del intervalo dinámico lineal

6.3 Evaluación de la precisión de procedimiento

La precisión de procedimiento, el grado de concordancia entre una serie de mediciones obtenidas a partir de múltiples muestras del mismo tipo de muestra en las condiciones prescritas, se evaluó a dos niveles, repetibilidad y precisión intermedia.

6.3.1 Repetibilidad

La repetibilidad o la precisión entre ensayos se expresa en las mismas condiciones de funcionamiento durante un intervalo de tiempo corto. A fin de demostrar la repetibilidad del procedimiento, se analizó el ácido siálico liberado (NANA) de la glucoproteína-A en 6 inyecciones de réplica. La desviación estándar relativa calculada a partir de múltiples inyecciones se comparó con el objetivo de rendimiento previsto determinado a partir de la ecuación de Horwitz (Horwitz, 1982) presentada a continuación.

En la que C es la concentración del analito en la muestra en mg/ml.

RESULTADOS: El %RSD de 0,96 determinado a partir de la evaluación de repetibilidad se encontraba dentro del objetivo de rendimiento de %RSD < 4 establecido basándose en la ecuación de Horwitz, que se cumplió totalmente. La precisión de un procedimiento analítico que normalmente se expresa como desviación estándar o %RSD de una serie de mediciones se muestra en la tabla 5.

T l : R l l r i ili l r ín -A

6.3.2 Precisión intermedia

La precisión intermedia se expresa como variaciones dentro de los laboratorios, tales como diferentes días, diferentes analistas, diferentes equipos, etc. A fin de evaluar la precisión intermedia, se llevó a cabo un análisis por parte de dos analistas en diferentes días. Las precisiones intermedias observadas se compararon con el objetivo de rendimiento previsto determinado a partir de la ecuación de Horwitz.

RESULTADOS: La precisión intermedia se estableció mediante el análisis de la glucoproteína-A en dos días diferentes y por parte de dos analistas. El %RSD de 0,95 se encuentra dentro del objetivo de rendimiento de %RSD < 6 establecido mediante la ecuación de Horwitz. La precisión de un procedimiento analítico que se expresa como la varianza, la desviación estándar o el coeficiente de variación de una serie de mediciones se muestra en la tabla 6.

T l : R l r i i n in rm i

6.4 Evaluación de LOD/LOQ

Aunque el LOD describe la concentración de analito más baja que probablemente se distinguirá de manera fiable del ruido, el LOQ es la concentración más pequeña que se puede medir de manera fiable mediante el procedimiento analítico. Un enfoque tradicional y típico para estimar el LOD y el LOQ consiste en la medición de réplicas (normalmente n=20) de un calibrador cero o muestra en blanco y la conversión de la respuesta en nmol/inyección usando la ecuación de regresión lineal derivada de la curva patrón. Para la determinación del LOD y el LOQ, se analizaron 30 réplicas de muestras en blanco de matriz (agua) y 10 réplicas de los patrones de ácido siálico más bajos (1 nanomol/inyección). La curva patrón construida a partir de patrones de ácido siálico analizados simultáneamente facilita la conversión de las respuestas en nmol/inyección.

El LOD y el LOQ se determinaron a partir de los datos generados a partir de 30 ejecuciones de réplicas de muestra en blanco y 10 ejecuciones de réplicas de los patrones de ácido siálico más bajos (1,0 nmol/inyec.). Los datos en bruto se convirtieron en nmol/inyec. usando la ecuación de regresión lineal. Aunque se usó la media 3,3 de SD para determinar el LOD, se usó la media 10 de SD para determinar el LOQ. Tal como se muestra en la tabla 7, el LOD y el LOQ del procedimiento, determinados a partir de 30 inyecciones en blanco, fueron de 0,32 y 0,86 nmol/inyec., respectivamente. El valor observado promedio de 0,99 nmol/inyec. determinado a partir de 10 inyecciones de los patrones de ácido siálico más bajos se encuentra bien dentro del valor esperado de 1,0 nmol/inyec., lo que verifica la exactitud de los patrones más bajos. El %RSD entre los múltiples valores de los patrones más bajos es del 9%, lo que verifica la precisión de los patrones más bajos.

Tabla 7: Determinación de LOD/LOQ basada en 30 inyecciones en blanco, verificación basada en 10 inyecciones del r n i i li m 1 n n m lin .

Análisis

Basándose en los datos resumidos en la tabla 1, no se continuó, además, con el procedimiento de RP-HPLC para cuantificar el ácido siálico no derivatizado. A pesar del uso común del RP-HPLC para la cuantificación del ácido siálico derivatizado de DMB (1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar no se pudo retener en el RP-HPLC sin alguna forma de derivatización previa. La tabla 1 resume también la aplicación positiva y negativa de otros modos de química de columna (cromatografía de pares iónicos, cromatografía de exclusión iónica, cromatografía de intercambio catiónico y aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba) para la cuantificación del ácido siálico no derivatizado.

La evaluación limitada llevada a cabo para aumentar la hidrofobicidad para mejorar la unión del ácido siálico no derivatizado a la columna de RP-HPLC por medio de la utilización de reactivos de pares iónicos no tuvo éxito. Dado que la cromatografía de pares iónicos se evaluó únicamente con un alcance limitado, los futuros investigadores pueden explorar esta área mediante el uso de diversos reactivos de pares iónicos aniónicos y catiónicos diferentes a diversas concentraciones para mejorar la unión.

Dado que el detector NQAD no es compatible con un alto contenido de sal, no se realizaron la AEX ni la CEX con gradientes de sal. Por la misma razón, también se excluyó de la evaluación la cromatografía de interacción hidrófoba.

Tanto la cromatografía de intercambio aniónico como catiónico con un gradiente de pH se evaluaron sin ningún resultado exitoso. La evaluación de la columna de cromatografía de exclusión iónica de modo mixto no es prometedora debido a la deficiente sensibilidad asociada a una dimensión de columna más grande.

Tal como se muestra en las figuras 2 y 3, las columnas de HILIC PolyGLYCOPLEX y X-bridge son adecuadas para la retención del ácido siálico no derivatizado. Como la columna de amida PolyGLYCOPLEX presentó un valor basal relativamente mejor que la columna X-bridge, se seleccionó la columna de amida PolyGLYCOPLEX para la optimización adicional. Con el uso de la columna de amida PolyGLYCOPLEX, se logró una simetría de picos aceptable en dos condiciones de elución: (1) una columna de 10 cm con acetonitrilo como fase móvil A y ácido fórmico al 20% como fase móvil B y (2) una columna de 5 cm con acetonitrilo como fase móvil A y ácido fórmico al 1% como fase móvil B. Aunque la primera opción es más adecuada para las situaciones en las que los analitos tienen tanto NANA como NGNA presente en los mismos (figura 4), la segunda opción es ideal si las glucoproteínas contienen únicamente NANA (figura 6).

La respuesta de pico comparable presentada por las muestras filtradas y no filtradas con Centricon (digestión de glucoproteína sometida a tratamiento con sialidasa) sugiere que la interferencia de matriz de la glucoproteína u otros componentes de matriz no es un problema. Por lo tanto, la filtración con Centricon aplicada para retirar la proteína y los componentes de matriz no es una etapa necesaria.

Tal como se resume en las tablas 2 y 3, los resultados de cuantificación del ácido siálico obtenidos a partir de HPLC/NQAD están en buena concordancia con los procedimientos ortogonales. La recuperación del 95-105% (tabla 4) obtenida a partir del experimento de adición y recuperación (glucoproteína-A con adición de NANA a diversos niveles), así como los resultados comparables del procedimiento de HPLC/NQAD con los procedimientos ortogonales (tablas 2 y 3), apoyan, además, la exactitud del procedimiento.

El intervalo lineal del procedimiento de HPLC/NQAD es de 1-32 nmol/inyec. con un coeficiente de determinación (R) = > 0,99 (tabla 5). Los %RSD del 0,96% y el 0,95% (tablas 6 y 7) determinado a partir de la repetibilidad (precisión entre ensayos) y la precisión intermedia se encontraban ampliamente dentro del objetivo de rendimiento de < 4% y < 6% de RSD, respectivamente, establecidos a partir de la ecuación de Horwitz.

No se produce un ahorro de tiempo significativo en los tiempos de análisis cromatográfico, ya que los tiempos de análisis son comparables en HPLC/NQAD, HPAEC/PAD y HPLC/DMB con los tiempos de ejecución respectivos de 30 minutos, 31 minutos y 35 minutos. Sin embargo, el procedimiento de HPLC/NQAD proporciona un beneficio de coste sobre el procedimiento de HPLC/DMB, ya que se elimina la etapa de derivatización costosa que requiere mucho tiempo.

Desde la perspectiva de la programación, resulta beneficioso la retirada de la derivatización. Por ejemplo, se espera que el proceso de secado de la muestra en Speed Vac se complete en aproximadamente 2 horas. Sin embargo, a menudo este puede variar de vez en cuando y añadir más incertidumbre a la línea de tiempo del ensayo. Aunque el tiempo de preparación y el tiempo de análisis de la muestra son comparables entre HPLC/NQAD y HPAEC/PAD, HPLC/NQAD supera a HPAEC/PAD en términos de fiabilidad y facilidad de uso.

Conclusión

Como el resto de ácido siálico de las proteínas terapéuticas influye en las propiedades biológicas y fisicoquímicas, además de desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la semivida sérica, la cuantificación del ácido siálico en las glucoproteínas es una etapa analítica requerida en la caracterización de las proteínas bioterapéuticas. El procedimiento de HPLC/NQAD sin derivatización descrito en el presente documento es una técnica eficaz y fiable para la cuantificación exacta del ácido siálico no derivatizado en proteínas terapéuticas recombinantes. El ácido siálico liberado enzimáticamente de proteínas terapéuticas separadas mediante la columna de HILIC de PolyGLYCOPLEX se puede detectar y cuantificar usando un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). Aunque la medición exacta del contenido de ácido siálico es crítica en muchas proteínas terapéuticas, las técnicas actualmente empleadas, tales como HPAEC/PAD y HPLC/DMB, se enfrentan a diversos problemas. Mientras que el procedimiento de HPLC/DMB requiere una derivatización tediosa, el procedimiento de HPAEC/PAD presenta problemas, tales como el ensuciamiento de electrodos y altos costes de mantenimiento. Además de eliminar la variabilidad asociada a la derivatización, el procedimiento de HPLC/NQAD ha demostrado un intervalo dinámico lineal, así como una excelente precisión, repetibilidad, fiabilidad, exactitud y facilidad de uso con una comparabilidad aceptable con los procedimientos habitualmente usados HPAE-pA d y HPLC/DMB.

Referencias

1. Byrne, B., Donohoe, G. y O'Kennedy, R. (2007). Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of bio-pharmaceutical proteins and living cells. Drug Discovery Today 12(7/8): 319 326.

2. Hildenbrandt, G. y Aronson, N. (1979). Uptake of asialo-gycophorin by the perfused rat liver and isolated hepatocytes. Biochemica Et Biophysica Acta 587(3): 373-80.

3. Ganesa, C., Granda, B. W. y Mattaliano, R. J. (2003). Sialylation levels influence oligosaccharide quantitation:

Analyzing response variability using high-pH anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection. Biopharm International 16(6): 44-48.

4. Hutchinson JP; Li J; Farrell W; Groeber E; Szucs R; Dicinoski G y Haddad PR. (2011). Comparison of the response of four aerosol detectors used with ultra high pressure liquid chromatography. Journal of Chromatography 1281(12): 1446-55.

5. Olsovská J; Kamenik Z; Cajthaml T. (2009). Hyphenated ultra high-performance liquid chromatography-Nano Quantity Analyte Detector technique for determination of compounds with low UV absorption. Journal of Chromatography 1261(30): 5774-8.

6. Kimball, B., Arjo, W., Johnston, J. (2004). Single point calibration with non-linear detector: Carbohydrate analysis of conifer needles by hydrophobic interaction chromatography-evaporative light scattering detector. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 27(12): 1835-1848.

7. Cintron, J y Risley, D. (2013). Hydrophilic interaction chromatography with aerosol-based detectors for polar compounds lacking UV chromophore in an intravenous formulation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 78-79:14-18.

8. Sharma, V.K., Glick, J., Vouros, P. (2012). Reversed-phase ion-pair liquid chromatography electro spray ionization tandem mass spectrometry for separation, sequencing and mapping of sites of base modification of isomeric oligonucleotide adducts using monolithic column. Journal of Chromatography A 1245 (6): 65-74.

9. Calhoun, A.R., King, A.D. (2007). The solubility of ethane in aqueous solutions of sodium 1-pentanesulfonate, sodium 1-hexanesulfonate, sodium 1-heptanesulfonate, and sodium 1-octanesulfonate at 25 °C. Journal of Colloid and Interface Science 309 (2): 505-510.

10. Remsburg, J. W. (2007). Multiply charged cationic pairing agents for trace analysis of anionic species by electro spray ionization mass spectrometry. (N° de orden 1447279, The University of Texas at Arlington). ProQuest Dissertations and Theses 77.

11. Isakau, H., Robert, M. y Shingel, K. (2009). A novel derivatization-free method of formaldehyde and propylene glycol determination in hydro gels by liquid chromatography with refractometric detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49(3): 594-600.

12. Mori, M., Taoda, H., Itabashi, H., Ikedo, M. y Tanaka, K. (2006). Use of combined ion-exclusion and cation exchange chromatography to study photooxidation of ionic nitrogen compounds on a titanium dioxide photo catalyst. ACTA CHROMATOGRAPHICA 1 (16): 28-37.

13. Horwitz,W. 1982. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Analytical Chemistry 54:67-76.

14. Zauner, G., Deelder, M. y Wuhrer, M. (2011). A recent advance in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) for structural glycomics. Electrophoresis. 32(24): 3456-3466.

15. Ikegami, T., Tomomatsu, K., Takubo, H., Horie, K., Tanaka, N. (2008). Separation efficiencies in hydrophilic interaction chromatography. J. Chromatography 1184(1-2): 474-503.

16. Duy, S., Besteiro, S., Berry, L., Perigaud, C., Bressolle, F., Vial, H.J., Lefebvre-Tournier, I. (2012). A quantitative liquid chromatography tandem mass spectrometry method for metabolomic analysis of Plasmodium falciparum lipid related metabolites. Analytica Chemica Acta 739(20): 47-56.

17. Lin, S.L., Inoue, S. yInoue, Y. (2000). Acid-base properties of the reaction product of sialic acid with flurogenic reagent, 1-2-diamino-4.5-methylethylene dioxybenzene (DMB) Carbohydrate Research 329(2): 447-451.

18. Horwitz, W. (1982). Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Analytical Chemistry 541): 67-76.

19. Siskos, PA. y Spyridk, MH. (1999). Determination of sialic acids in biological fluids using reversed-phase ionpair high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl 724(2): 205-12.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano utilizando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende separar el glucano liberado del anticuerpo antes de la etapa de cuantificación.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la etapa de separación implica cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), tal como cromatografía de interacción hidrófila (HILIC).

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación utiliza un detector de analito en nanocantidades (NQAD).

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es de cualquier isotipo o subclase.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se aísla de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está destinado a aplicaciones terapéuticas.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto glucano de un anticuerpo es un atributo de calidad crítico.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo reconoce uno o más antígenos seleccionados de entre: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23, subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos, B7RP-1, B7RP-2, VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de EGF, receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvIII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4), receptor de BAFF, BCMA, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o de páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFN<y>, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se selecciona de entre adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab guselkumab, ozogamicin, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto glucano es uno o más de ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N y glucanos unidos a O.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el resto glucano es ácido siálico y la glucosidasa es sialidasa.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 o 14, en el que el ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneurámico.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que se determina la cantidad de ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneuramínico o en el que se determina la relación de ácido N-acetilneuramínico a ácido N-glicolilneuramínico.