ES2962593T3 - Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes - Google Patents
Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes Download PDFInfo
- Publication number
- ES2962593T3 ES2962593T3 ES19155593T ES19155593T ES2962593T3 ES 2962593 T3 ES2962593 T3 ES 2962593T3 ES 19155593 T ES19155593 T ES 19155593T ES 19155593 T ES19155593 T ES 19155593T ES 2962593 T3 ES2962593 T3 ES 2962593T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- receptor
- hplc
- acid
- sialic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 title claims abstract description 29
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 136
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims abstract description 16
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 145
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims description 77
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 69
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 48
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- -1 IL -4 Proteins 0.000 claims description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 14
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 13
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 10
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 10
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 claims description 9
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 claims description 7
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 claims description 7
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 6
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 6
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 6
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 claims description 6
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 claims description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 claims description 6
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 101001031613 Homo sapiens Fibroleukin Proteins 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 claims description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 102100038647 Fibroleukin Human genes 0.000 claims description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 claims description 4
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims description 4
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims description 4
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010054404 Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010046304 B-Cell Activation Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007536 B-Cell Activation Factor Receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108010008629 CA-125 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007269 CA-125 Antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 108010078311 Calcitonin Gene-Related Peptide Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013602 Cardiac Myosins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051609 Cardiac Myosins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031506 Complement C5 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000924552 Homo sapiens Angiopoietin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000924533 Homo sapiens Angiopoietin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016551 L-selectin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 3
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101710132836 Membrane primary amine oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 3
- 102000019307 Sclerostin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims description 3
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 101710181056 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 claims description 3
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950001863 bapineuzumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002874 briakinumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003735 brodalumab Drugs 0.000 claims description 3
- 102000008323 calcitonin gene-related peptide receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 229960001838 canakinumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950007276 conatumumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950003468 dupilumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000578 gemtuzumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950010864 guselkumab Drugs 0.000 claims description 3
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 claims description 3
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229950007318 ozogamicin Drugs 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950003238 rilotumumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950010968 romosozumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950009092 rovelizumab Drugs 0.000 claims description 3
- HNMATTJJEPZZMM-BPKVFSPJSA-N s-[(2r,3s,4s,6s)-6-[[(2r,3s,4s,5r,6r)-5-[(2s,4s,5s)-5-[acetyl(ethyl)amino]-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-6-[[(2s,5z,9r,13e)-13-[2-[[4-[(2e)-2-[1-[4-(4-amino-4-oxobutoxy)phenyl]ethylidene]hydrazinyl]-2-methyl-4-oxobutan-2-yl]disulfanyl]ethylidene]-9-hydroxy-12-(m Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](N(CC)C(C)=O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@@](C/3=C/CSSC(C)(C)CC(=O)N\N=C(/C)C=3C=CC(OCCCC(N)=O)=CC=3)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HNMATTJJEPZZMM-BPKVFSPJSA-N 0.000 claims description 3
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229950005515 tildrakizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950000835 tralokinumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950007217 tremelimumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 claims description 3
- 229950009002 zanolimumab Drugs 0.000 claims description 3
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005435 ixekizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 229950000518 labetuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950002183 lebrikizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950001869 mapatumumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950008001 matuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950007254 mavrilimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005108 mepolizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001521 motavizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003816 muromonab-cd3 Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 claims description 2
- 102100040149 Adenylyl-sulfate kinase Human genes 0.000 claims 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 claims 1
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 claims 1
- 102000007295 Mucin-3 Human genes 0.000 claims 1
- 108010008701 Mucin-3 Proteins 0.000 claims 1
- 102000056133 human AOC3 Human genes 0.000 claims 1
- 229960005570 pemtumomab Drugs 0.000 claims 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 39
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 39
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 35
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 33
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 32
- SNHKEQOYVVRBQO-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzodioxole-5,6-diamine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC2=C1OCO2 SNHKEQOYVVRBQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 description 22
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 20
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101710165315 Sialidase A Proteins 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 description 8
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 101150041393 rsd gene Proteins 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 5
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- SKBXVAOMEVOTGJ-UHFFFAOYSA-N xi-Pinol Chemical compound CC1=CCC2C(C)(C)OC1C2 SKBXVAOMEVOTGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033105 Interleukin-17C Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- 102100027159 Membrane primary amine oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 2
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100039024 Sphingosine kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000013501 data transformation Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- LRWSTBIEJXJNJY-UHFFFAOYSA-M hydron;trimethyl(tetradecyl)azanium;sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LRWSTBIEJXJNJY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000001032 ion-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- REFMEZARFCPESH-UHFFFAOYSA-M sodium;heptane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCS([O-])(=O)=O REFMEZARFCPESH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 1
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010017987 CD30 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 1
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 1
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033096 Interleukin-17D Human genes 0.000 description 1
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101710172072 Kexin Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N N-acetyl-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N N-acetyl-beta-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000015278 OSM-LIF Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010064527 OSM-LIF Receptors Proteins 0.000 description 1
- RZPAKFUAFGMUPI-UHFFFAOYSA-N Oleandomycin Natural products O1C(C)C(O)C(OC)CC1OC1C(C)C(=O)OC(C)C(C)C(O)C(C)C(=O)C2(OC2)CC(C)C(OC2C(C(CC(C)O2)N(C)C)O)C1C RZPAKFUAFGMUPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004104 Oleandomycin Substances 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 108010082522 Oncostatin M Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283652 Sisko Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960003697 abatacept Drugs 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 1
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 1
- 229960002459 alefacept Drugs 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012158 anionic ion-pair reagent Substances 0.000 description 1
- 229940053198 antiepileptics succinimide derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005347 belatacept Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 1
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023077 detection of light stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004189 ion pair high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002351 oleandomycin Drugs 0.000 description 1
- RZPAKFUAFGMUPI-KGIGTXTPSA-N oleandomycin Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@H](C)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@]2(OC2)C[C@H](C)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C RZPAKFUAFGMUPI-KGIGTXTPSA-N 0.000 description 1
- 235000019367 oleandomycin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- FFRYUAVNPBUEIC-UHFFFAOYSA-N quinoxalin-2-ol Chemical class C1=CC=CC2=NC(O)=CN=C21 FFRYUAVNPBUEIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000000581 reactive spray deposition Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960001886 rilonacept Drugs 0.000 description 1
- 108010046141 rilonacept Proteins 0.000 description 1
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002133 sample digestion Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229960005041 troleandomycin Drugs 0.000 description 1
- LQCLVBQBTUVCEQ-QTFUVMRISA-N troleandomycin Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@H](C)[C@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](C)C(=O)[C@@]2(OC2)C[C@H](C)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)OC(C)=O)[C@H]1C LQCLVBQBTUVCEQ-QTFUVMRISA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
La invención se refiere a un método para determinar la fracción de glicano en una glicoproteína recombinante usando detección de dispersión de luz por condensación, nucleación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/082.014, presentada el 19 de noviembre de 2014.
Introducción
La glucosilación puede influir en las propiedades biológicas y fisicoquímicas de proteínas recombinantes destinadas a utilizarse como fármacos biofarmacéuticos (Byrne, Donohoe y O'Kennedy, 2007). Por ejemplo, el resto de ácido siálico de una proteína desempeña un papel importante en la semivida sérica. A medida que la galactosa terminal queda expuesta, las glucoproteínas asialoladas se endocitan mediante receptores hepáticos de asialo galcotosa por medio de endocitosis mediada por receptores (Hildenbrandt y Aronson, 1979).
En consecuencia, el estado de los grupos sialo terminales en dichos fármacos biofarmacéuticos puede requerir un seguimiento como un atributo de calidad importante. Los procedimientos comúnmente empleados incluyen la derivatización de ácido siálico. En este procedimiento, se libera ácido siálico por medio de hidrólisis ácida (por ejemplo, ácido acético 8 M) y se marca con un fluoróforo o un cromóforo, tal como con 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno (DMB) El marcado viene seguido de un análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC).
En un enfoque alternativo se usa un procedimiento en el que se somete el ácido siálico liberado enzimáticamente (sialidasa-A) a una separación cromatográfica de intercambio aniónico a pH elevado (HPAEC) y a una posterior detección amperométrica pulsada (PAD). El sistema HPAEC-PAD está disponible comercialmente de Dionex.
Ambos procedimientos presentan inconvenientes. La primera técnica de derivatización tiene una variabilidad inherentemente alta y el segundo procedimiento de HPAEC-PAD sufre una alta variabilidad debido al ensuciamiento de los electrodos durante el análisis (Ganesa, Granda y Mattaliano, 2003). Además, los materiales necesarios para el procedimiento HPAEC-PAD son caros y su mantenimiento es costoso. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un procedimiento más eficaz y reproducible para analizar restos de ácido siálico en glicoproteínas recombinantes.
Se han notificado procedimientos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la separación y cuantificación de una sustancia farmacológica que sea fuertemente polar y carezca de cromóforo en una formulación intravenosa (IV) de manitol (Jose M. Cintron et al., 2013). Se han proporcionado procedimientos para la cuantificación de ácido siálico no derivatizado en glucoproteínas, separado mediante cromatografía de interacción hidrófila, y la detección mediante el detector de analitos en nanocantidades (NQAD) (Letha Chemmalil et al., 2014). El documento WO 2013/130604 se refiere a un procedimiento para medir específicamente la sialilación de una biomolécula de interés sin la interferencia de otras biomoléculas presentes en la muestra. El documento WO 2010/071824 describes procedimientos para enriquecer, identificar y/o cuantificar glucanos modificados de forma no habitual. Ganesa et al., 2003 se refiere a la influencia de los niveles de sialilación en la cuantificación de oligosacáridos.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La invención divulgada en el presente documento proporciona un procedimiento mejorado y fiable para la determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante. La invención es particularmente adecuada para la determinación de la cantidad de un resto de ácido siálico en un anticuerpo recombinante. La invención se basa, en parte, en el desarrollo de técnicas para la determinación de restos de ácido siálico en glucoproteínas recombinantes usando la tecnología de recuento de partículas por condensación de agua (WCPC). La tecnología WCPC permite agrandar el analito utilizando vapor de agua para proporcionar la máxima sensibilidad. Tal como se muestra más adelante, se divulgan procedimientos que permiten la cuantificación de restos de ácido siálico en anticuerpos recombinantes.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo recombinante con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico. El glucano liberado puede separarse del anticuerpo recombinante antes de la etapa de cuantificación. Los restos glucano incluyen, pero sin limitación, ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N, glucanos unidos a O y análisis de composición de monosacáridos. La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación de la invención puede utilizar un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). También se proporciona un procedimiento para determinar un resto de ácido siálico en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo recombinante con una sialidasa para liberar ácido siálico y cuantificar el ácido siálico usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación. Opcionalmente, el ácido siálico liberado se separa del anticuerpo recombinante antes de la etapa de cuantificación. La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación puede utilizar un detector de analitos en nanocantidades (NQAD).
En un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.
En una forma de realización, el procedimiento comprende además separar el glucano liberado del anticuerpo antes de la etapa de cuantificación. En otra forma de realización, la etapa de separación implica cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), tal como cromatografía de interacción hidrófila (HILIC). En otra forma de realización, la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación utiliza un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). En otra forma de realización, el anticuerpo es de cualquier isotipo o subclase. En otra forma de realización, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra forma de realización, el anticuerpo se aísla de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo. En otra forma de realización, el anticuerpo está destinado a aplicaciones terapéuticas. En otra forma de realización, el resto glucano en el anticuerpo es un atributo de calidad crítico.
En otra forma de realización, el anticuerpo reconoce uno o más antígenos seleccionados de entre: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23, subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos, B7RP-1, B7RP-2, VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de<e>G<f>, receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvIII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4), receptor de BAFF, bCm A, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o de páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFNy, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1 , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.
En otra forma de realización, el anticuerpo se selecciona de entre adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab guselkumab, ozogamicin, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.
En otra forma de realización, el resto glucano es uno o más de ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N, glucanos unidos a O y análisis de composición de monosacáridos. En otra forma de realización, el resto glucano es ácido siálico y la glucosidasa es sialidasa. En otra forma de realización, el ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneurámico. En otra forma de realización, se determina la cantidad de ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneuramínico o la relación de ácido N-acetilneuramínico a ácido N-glicolilneuramínico.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: separación de NANA y NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX (trietilamina/acetonitrilo en condiciones de gradiente isocráticas).
Figura 2A: cromatograma de NANA/NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm usando ácido fórmico al 20%.
Figura 2B: cromatograma de NANA/NGNA (inyección separada y combinada) en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm usando ácido fórmico al 20%.
Figura 3A: cromatograma representativo de un patrón de ácido siálico (NANA).
Figura 3B: cromatograma representativo de ácido siálico (NANA) liberado por sialidasa A de glucoproteína-A.
Figura 4: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm con una composición de gradiente inicial del 15% de B.
Figura 5: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm con una composición de gradiente inicial del 20% de B.
Figura 6: cromatograma de NANA-NGNA usando una columna de amida PolyGLYCOPLEX de10 cm con una composición de gradiente inicial del 25% de B.
Figura 7: separación de NANA y NGNA en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm (acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B) con un gradiente inicial del 20% de B.
Figura 8: gráfica de regresión lineal de los patrones de calibración de ácido siálico (NANA).
Figura 9: intervalo dinámico lineal del ácido siálico en el procedimiento de HPLC/NQAD.
Descripción detallada
Tal como se muestra en el presente documento en un aspecto de la invención, el análisis de anticuerpos sin derivatización usando un procedimiento de HPLC/NQAD con una columna de amida PolyGLYCOPLEX™ se correlacionó bien con un procedimiento de HPLC con derivatización previa a la columna usando 1,2-diamino-4, 5-metilendioxibenceno (DMB), así como con la cromatografía de intercambio aniónico de pH elevado basada en Dionex (o cromatografía iónica) con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Sin embargo, con la eliminación de la etapa de derivatización, el procedimiento de HPLC/NQAD es más eficaz que el procedimiento de HPLC/DMB. Además, el procedimiento de HPLC/NQAD es más reproducible que el procedimiento de HPAEC-PAD, ya que el procedimiento de HPAEC-PAD sufre una alta variabilidad debido al ensuciamiento de los electrodos durante el análisis. En general, el procedimiento de HPLC/NQAD divulgado en el presente documento como un aspecto de la invención ofrece un intervalo dinámico lineal amplio, así como una excelente precisión, exactitud, repetibilidad, fiabilidad y facilidad de uso, con una comparabilidad aceptable con los procedimientos que se utilizan habitualmente HPAE-PAD y HPLC/DMB.
Por lo tanto, los procedimientos de la invención incluyen la digestión del anticuerpo recombinante con una sialidasa para generar ácido siálico y, después, la cuantificación de la cantidad y/o el tipo de resto de ácido siálico usando la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación.
No obstante, los procedimientos de la invención también se pueden utilizar para analizar otros restos glucano, además del ácido siálico, incluyendo, pero sin limitación, N-glucanos, galactosa terminal, O-glucanos y análisis de composición de monosacáridos. Los ejemplos de otros restos glucano específicos que se pueden detectar, cuantificar o analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, glucosa (Glu), galactosa (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), manosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa (Fuc), N-acetil-manosamina (ManNAc), fructosa y sacarosa, así como combinaciones más complejas de uno o más tipos de dichos restos, tales como estructuras monoantenarias, biantenarias, triantenarias, tetraantenarias y de orden superior. Cualquier cantidad de modificaciones postraduccionales de las glucoproteínas se puede determinar y cuantificar de forma similar usando los procedimientos de la invención descritos en el presente documento con particularidad para los restos de ácido siálico.
Detección de dispersión de luz por nucleación por condensación
La detección de dispersión de luz por nucleación por condensación es un tipo de técnica de detección basada en aerosol. Una muestra que se va a someter a ensayo, en primer lugar, se nebuliza en gotas y, después, la fase móvil se evapora de las gotas, dejando partículas suspendidas en el aire de sustancias químicas con una volatilidad inferior a la fase móvil. Este aerosol seco se desplaza, después, a otra cámara donde se condensa vapor de agua sobre las partículas, que se hinchan. Las partículas hinchadas se pueden detectar de forma individual usando un sensor óptico basado en láser. (Gille y Crowshaw, 2008, Chromatography Today, Vol. 1(3), página 26). Un sistema disponible comercialmente para la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación es el detector de analito en nanocantidades (NQAD™) de Dionex.
A diferencia de otros detectores basados en aerosol, la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, tal como el NQAD, no padece interferencias por el ruido o el desplazamiento del sensor que puedan interferir con la resolución y la sensibilidad de los analitos. Mientras que los detectores de índice de refracción y otros detectores basados en aerosol se enfrentan a una inestabilidad basal y a una falta de respuesta lineal durante las ejecuciones de gradiente, se ha demostrado que el sistema NQAD tiene un valor basal estable, un intervalo dinámico lineal más amplio y ha demostrado ser adecuado para la cuantificación de analitos en niveles bajos de nanogramos (Hutchinson, Li, Farrell, Groeber, Szucs, Dicinoski y Haddad, 2011). El detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) y el NQAD son ambos baratos, fáciles de operar y compatibles con todos los tipos de sistemas de HPLC. No obstante, en la cuantificación, el NQAD es más adecuado que el ELSD, ya que este tiene un intervalo dinámico lineal más amplio y mayor sensibilidad.
Según Hutchinson et al. (2011), los límites de detección de analitos cromofóricos UV con una diversidad de propiedades fisicoquímicas se evaluaron usando diversos detectores con diferentes composiciones de fase móvil en condiciones de gradiente en las que se ha demostrado que el NQAD es el detector más sensible. Hutchinson et al. (2011) observaron que el límite de detección inferior (LLOD) del NQAD era de 10 ng/ml, seguido del CAD (detector de aerosol cargado) Corona con un LLOD de 76 ng/ml y el detector de UV (a 200 nm) con un LLOD de 178 ng/ml a un volumen de inyección de 25 |ul de analitos que constan de diversas características fisicoquímicas. Basándose en el estudio realizado por Olsovska, Kamenik y Cjthaml (2009), los compuestos antibióticos investigados (con una baja absorción de UV), macrólidos (oleandomicina, eritromicina, troleandomicina, claritromicina y roxitromicina) habían mostrado una sensibilidad tres veces mayor en la detección con NQAD, en comparación con la detección con UV. Con la mayor sensibilidad de NQAD en los niveles de LOD (límite de detección) y LOQ (límite de cuantificación), junto con la capacidad del NQAD para detectar compuestos antibióticos no cromofóricos, se había permitido la identificación de compuestos antibióticos novedosos (Olsovska, Kamenik y Cajthaml, 2009).
A diferencia de los detectores de índice de refracción, el detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) convencional ofrece capacidades de gradiente y una sensibilidad adecuada. No obstante, un inconveniente del ELSD es que la respuesta del detector es exponencial, en lugar de lineal (Kimball, Arjo y Johnston, 2004). La transformación de datos se debe aplicar a la respuesta de datos de ELSD para generar una función lineal. Con la transformación de datos, los detectores de dispersión de luz por evaporación, tales como ELSD 800 y ELSD 3300 de Alltech, han demostrado una excelente linealidad, además de una exactitud, precisión (repetibilidad y precisiones entre ensayos), especificidad, robustez y estabilidad aceptables (Cintron y Risley, 2013). Sin embargo, se ha demostrado que el detector NQAD es 50 y 10 veces más sensible que el ELSD 800 y el ELSD 3300 con límites de detección (LOD) de 50 g/ml, 10 g/ml y 1 g/ml para el ELSD 800, el<e>L<s>D 3300 y el NQAD, respectivamente.
Tal como se muestra más adelante, los procedimientos de la invención se pueden usar para identificar y cuantificar los restos ácido siálico en un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, la cantidad y/o la relación del ácido N-acetilneuramínico al ácido N-glucolilneurámico liberados se resolvieron y se cuantificaron fácilmente usando los procedimientos de la invención. Otros restos glucano (por ejemplo, glucanos unidos a N, galactosa terminal, glucanos unidos a O y el análisis de composición de monosacáridos) se pueden determinar y cuantificar de forma similar.
Liberación del resto de ácido glucano del anticuerpo recombinante
Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para dirigirse al resto glucano del anticuerpo y liberarlo. Normalmente, dichos procedimientos incluirán la selección de las enzimas adecuadas que escinden el resto glucano que se desea determinar y cuantificar. Dichas enzimas, conocidas como glucosidasas, se conocen ampliamente y están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: sialidasas; PNGasa F, que escinde todos los oligosacáridos complejos, híbridos o con alto contenido de manosa unidos a asparagina (excepto aquellos que contienen un núcleo de a(1-3)-fucosa); endoglucosidasas F1, F2 y F3; endoglucosidasa H; O-glucosidasa para la liberación de glucanos unidos a O; y galactosidasa para la liberación de galactosa terminal.
En uno de los procedimientos de la invención, la glucoproteína recombinante se digiere con una sialidasa para liberar ácido siálico. El ácido siálico liberado se puede detectar después usando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación. Se puede usar cualquier cantidad de sialidasas disponibles comercialmente. La invención se ilustra más adelante usando Sialidase-A™ (Prozyme), que libera ácido N-acetilneuramínico unido en a(2-3), a(2-6), a(2-8) y a(2-9) de carbohidratos complejos. Sin embargo, también se pueden usar otras sialidasas, dependiendo de la aplicación y el resto de ácido siálico particular que se va a detectar en la glucoproteína recombinante.
Separación del glucano liberado del anticuerpo recombinante
Opcionalmente, después de liberarse el resto glucano del anticuerpo recombinante, se puede usar una etapa de separación para la mejora de la capacidad de detección del procedimiento de la invención. El resto glucano liberado se puede separar mediante cualquier cantidad de técnicas, incluyendo, pero sin limitación, electroforesis capilar, filtración y/o cromatografía basada en el tamaño, la carga, la hidrofobicidad o una combinación de los mismos. La cromatografía puede ser por lotes o en columna.
En un aspecto ampliamente usado en los laboratorios de cuantificación, la etapa de separación se realiza usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Las columnas de HPLC están disponibles en una amplia diversidad de formatos, tamaños y medios de cromatografía. En una forma de realización de la invención que emplea HPLC, que se ilustra más adelante, se puede usar una etapa de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) para separar el resto de ácido siálico liberado del anticuerpo recombinante. No obstante, debe entenderse que se pueden desarrollar otras etapas de separación, dependiendo del resto glucano o los restos que se van a analizar y el anticuerpo. Las condiciones de carga y elución pueden utilizar diversos tampones y gradientes, dependiendo de la aplicación seleccionada, y son conocidos por parte de aquellos expertos en la técnica.
Anticuerpo recombinante para su uso en los procedimientos divulgados
Una glucoproteína recombinante se define como cualquier proteína que se produce por una célula huésped que se ha diseñado para producir la proteína mediante técnicas de biología molecular, tales como tecnología de ADN recombinante (ADNr), mediante la que la proteína se ha glucosilado postraduccionalmente. El estado del resto glucano en una glucoproteína recombinante puede ser un atributo de calidad crítico, en especial para las glucoproteínas recombinantes destinadas a aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, su administración a un mamífero). Los procedimientos divulgados tienen una utilidad particular en la fabricación de proteínas terapéuticas que son anticuerpos recombinantes, siendo el anticuerpo humano, humanizado o quimérico. Otros ejemplos de dichas proteínas, que se describen con más detalle más adelante, pero no están abarcados por los procedimiento de la invención, son proteínas de fusión, hormonas y citocinas, así como derivados, variantes, muteínas, fragmentos, multímeros y conjugados de las mismas.
Otros ejemplos de glicoproteínas recombinantes que pueden analizarse pero que no están abarcadas por los procedimientos de la invención incluyen proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente similares a la totalidad o a una parte de una de las siguientes proteínas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando de flt3 (documento WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligando para el activador del receptor de NF-kappa B (RANKL, documento WO 01/36637), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, documento WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, patente de Australia N° 588819), factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de células madre (patente de Estados Unidos N° 6.204.363), factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos, RANTES, proteína 2 similar a fibrinógeno humano (FGL2; número de acceso del NCBI NM_00682; Rüegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62) hormona del crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a la insulina, hormona paratiroidea, interferones, incluidos interferones a, interferón y e interferones de consenso (patentes de Estados Unidos N° 4.695.623 y 4.897.471), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares a sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagón, interleucinas, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor inhibidor de la leucemia y oncostatina-M. Las descripciones de glucoproteínas recombinantes que pueden analizarse según los procedimientos de la invención se pueden encontrar, por ejemplo, en Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, todos los volúmenes (Aggarwal yGutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993); y The Cytokine Handbook, Vol. 1 y 2 (Thompson y Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).
Además, los procedimientos divulgados son útiles para analizar glucanos liberados de las glucoproteínas recombinantes que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de aminoácidos de un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente, un antagonista de dicho receptor o cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente y/o proteínas sustancialmente similares a dichos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR en inglés, denominadas p55 y p75, patente de Estados Unidos N° 5.395.760 y patente de Estados Unidos N° 5.610.279), receptores de interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; patente EP N° 0460846, patente de Estados Unidos N° 4.968.607 y patente de Estados Unidos N° 5.767.064), antagonistas del receptor de IL-1 (patente de Estados Unidos N° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (patentes de Estados Unidos N° 5.981.713, 6.096.728 y 5.075.222), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (patente<e>P N° 0367 566 y patente de Estados Unidos N° 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores del factor inhibidor de oncostatina-M y leucemia, receptor activador de NF-kappa B (RANK, documento WO 01/36637 y patente de Estados Unidos N° 6.271.349), osteoprotegerina (patente de Estados Unidos N° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluidos receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o receptor inductor de la apoptosis (AIR).
Otras glucoproteínas recombinantes que se pueden analizar, pero que no están abarcadas por los procedimientos de la invención, incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de aminoácidos de los antígenos de diferenciación (denominadas proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a cualquiera de estos. Dichos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., Eds., Kobe, Japón, 1996). En seminarios posteriores se divulgan proteínas CD similares. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.).
Los procedimientos divulgados están adaptados, en particular, al análisis de restos de ácido siálico en glucoproteínas recombinantes que son proteínas de fusión. Las proteínas de fusión pueden comprender la totalidad o una parte de cualquiera de las proteínas anteriores fusionadas con otra proteína o dominio de proteína. Las proteínas de fusión particularmente útiles son las proteínas de fusión Fc. Una serie de dichas proteínas de fusión está disponible comercialmente o se encuentra en desarrollo. Los ejemplos de proteínas de fusión que se pueden analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, etanercept, aflibercept, rilonacept, belatacept, abatacept y alefacept.
Las glucoproteínas recombinantes enzimáticamente activas o sus ligandos también se pueden analizar con los procedimientos de la invención, pero no están abarcadas por los mismos. Los ejemplos incluyen proteínas que comprenden la totalidad o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una proteína sustancialmente similar a una de las mismas: una desintegrina y miembras de la familia del dominio de metaloproteinasa, incluyendo la enzima convertidora de TNF-alfa, diversas cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y otras numerosas enzimas y sus ligandos.
Las proteínas recombinantes que son anticuerpos también se pueden analizar usando los procedimientos de la invención. El término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas de cualquier isotipo o subclase o a una región de unión a antígeno de las mismas que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique de otra forma, incluyendo anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos, multiespecíficos, monoclonales, policlonales y oligómeros o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se incluyen proteínas que tienen un fragmento o una región de unión a antígeno, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpos, Fd, dAb, maxicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias, fragmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión de antígeno específico a un polipéptido diana. El término "anticuerpo" incluye, pero sin limitación, aquellos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan mediante medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo.
Los ejemplos de los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, aquellos que reconocen una cualquiera o una combinación de proteínas, que incluyen, pero sin limitación, las proteínas mencionadas anteriormente y/o los antígenos siguientes: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de iL-23, subunidad p40 compartida de iL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de<IL-1>8<, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos (véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.272.064 y 5.149.792),>B7RP-1, B7RP-2, V eGf , TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de EGF (véase la patente de Estados Unidos N° 6.235.883), receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvlII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4;véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), receptor de BAFF, BCMA, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFNy, receptores de TRAIL 1,2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno citotóxico asociado a linfocitos T), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1 , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.Los ejemplos específicos de anticuerpos conocidos que se pueden analizar usando los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab, guselkumab, ozogamicina, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.
Los ejemplos de las citocinas que son glucoproteínas incluyen, pero sin limitación, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-17 (incluyendo, pero sin limitación, monómeros, homodímeros y heterodímeros de IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D y IL-17E (también conocidos como IL-25)), IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23 y subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23.
Una vez descrita la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.
Ejemplos
Abreviaturas
ACN: Acetonitrilo
AEX: Cromatografía de intercambio aniónico
CAD: Detector de aerosol cargado
CEX: Cromatografía de intercambio catiónico
CNLSD: Detección de dispersión de luz por nucleación por condensación
DMB: 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno
ELSD: Detector de dispersión de luz por evaporación
HIC: Cromatografía de interacción hidrófoba
HILIC: Cromatografía de interacción hidrófila
HPAEC-PAD: Cromatografía de intercambio aniónico y detección amperométrica pulsada
LLOD: Límite inferior de detección
LOD: Límite de detección
LOQ: Límite de cuantificación
NANA: Ácido N-acetilneuramínico
Neu5Ac Ácido N-acetilneuramínico
NGNA: Ácido N-glicolilneuramínico
NQAD: Detector de analitos en nanocantidades
PAD: Detector amperométrico pulsado
RP-HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
TFA: Ácido trifluoroacético
WCPC: Recuento de partículas por condensación basada en agua
CL-EM: Cromatografía líquida-espectrometría de masas
Procedimientos y materiales
Se adquirieron columnas de amida PolyGLYCOPLEX (50 x 4,0 mm con 5 g) y (100 x 2,1 mm, 5 g) de PolyLC. Se adquirieron una columna XBridge C18 (4,6 x 250 mm con 5 g) y una columna analítica YMC-Pack ODS-AQ (2,0 x 150 mm con 3 g) de Waters. Se adquirieron una columna Kinetex C18 (4,6 x 100 mm con 2,6 g) y una columna de azúcar de modo mixto (cromatografía de exclusión por tamaño/iónica) (8,0 x 300 mm con 6 g) de Phenomenex y Shodex, respectivamente. Se adquirieron columnas de intercambio aniónico y catiónico (4,6 x 150 mm con 3 g) de Sepax Technologies. Se adquirieron 1-heptanosulfonato de sodio, hidrogenosulfato de trimetiltetradecilamonio, ácido L-glutámico, ácido L-aspártico, NANA y NGNA de Sigma Aldrich. Se adquirió sialidasa-A de Prozyme. Se adquirieron viales de muestreador automático de HPLC, insertos de vidrio y tapas de viales de Agilent. Se usaron dos glucoproteínas internas (Glucoproteínas A y B) que contenían ácido siálico (NANA) unido a N y O como proteínas modelo para el estudio.
Ejemplo 1
1. Examen inicial de las columnas de HPLC con diversas químicas
La selección de una columna adecuada es una parte importante del desarrollo de cualquier procedimiento de HPLC. Por lo tanto, se llevó a cabo una evaluación exhaustiva de múltiples químicas de columnas. A fin de retener y cuantificar el ácido siálico, se evaluaron diversas columnas de RP-HPLC, incluyendo la columna X-bridge C18, la columna YMC-Pack ODS-AQ C18 y la columna Kinetex C18 en condiciones de fases móviles ácidas (TFA al 0,1% y TFA/ACN al 0,1% como fases móviles A y B, respectivamente) y neutras (tampón de fosfato 50 mM, pH 7,0 y ACN como las fases móviles inicial y de elución, respectivamente). También se llevó a cabo una evaluación a un pH intermedio usando fosfato de trietilamina 10 mM a pH 4,4 como fase móvil inicial y acetonitrilo como fase móvil de elución. En todos los casos, se mantuvo inicialmente un gradiente isocrático al 5% de B durante 5 minutos antes de la aplicación de un gradiente lineal con un incremento del 4% por minuto hasta que se alcanzó el 95% de B. Se aplicó un caudal de 1 ml/min en todos los casos.
Dado que el análisis por RP-HPLC en presencia de reactivos de pares iónicos adecuados puede aumentar la retención de analitos cargados (Sharma, Glick y Vouros, 2012), tales como el ácido siálico, también se exploró la cromatografía de pares iónicos mediante la adición de o bien un reactivo de pares iónicos catiónico cargado positivamente o un agente de pares iónicos aniónico cargado negativamente a la fase móvil a una concentración final 5 mM. Se usó una solución de 1-heptanosulfonato de sodio como reactivo de pares iónicos catiónico (Calhoun y King, 2007) e hidrogenosulfato de trimetiltetradecilamonio como reactivo de pares iónicos aniónico (Remsburg, 2007). Los análisis cromatográficos de pares iónicos se llevaron a cabo en una columna X-bridge C18 usando TFA al 0,1% con un reactivo de pares iónicos 5 mM como fase móvil A y TFA al 0,1% con un reactivo de pares iónicos 5 mM/ACN como fase móvil B de elución. En todos los casos, se aplicó un gradiente lineal del 5% de B al 95% de B en el transcurso de 20 minutos. Tal como describen Isakau, Robert y Shingel (2009), se evaluó una columna de azúcar de modo mixto de cromatografía de exclusión por tamaño/iónica (SEC/IEX) de Shodex en modo isocrático a un caudal de 1 ml/min usando metanol al 50% como fase móvil. Dicha cromatografía SEC/IEX se ha reconocido como una técnica eficaz para la determinación simultánea de aniones y cationes después de una inyección de muestra individual en la columna de separación (Mori, Taoda, Itabashi, Ikedo y Tanaka, 2006). El patrón de ácido siálico (NANA) a una concentración de 1 mg/ml se diluyó en serie hasta 0,0156 mg/ml y a partir de la misma se inyectaron 100 gl de cada patrón.
Como el detector NQAD no es compatible con un alto contenido de sal, las columnas AEX y CEX se evaluaron usando un gradiente de pH en lugar de un gradiente de sal. Se realizó la cromatografía de intercambio iónico en el gradiente de pH usando columnas catiónicas y aniónicas de Sepax. Con el pKa conocido (2,6) de ácido siálico (NANA), se aplicó un gradiente de pH lineal partiendo de un pH 2,2 y terminando en un pH 3,6 mediante el uso de glicina/HCl 10 mM para la cromatografía de intercambio aniónico y un gradiente lineal de pH 3,6 a pH 2,2 mediante el uso de glicina/HCl 10 mM para la cromatografía de intercambio catiónico. Todos los análisis se llevaron a cabo en sistemas Agilent 1100 o 1200 equipados con un NQAD de QUANT Technologies.
RESULTADOS: Los resultados de evaluación de diversas técnicas de separación sugirieron que la cuantificación del ácido siálico no derivatizado no era factible con técnicas cromatográficas, tales como RP-HPLC, cromatografía de pares iónicos, cromatografía de exclusión por tamaño/iónica de modo mixto y cromatografía de intercambio iónico (en el modo de gradiente de pH). Los resultados obtenidos a partir de la evaluación de las columnas de RP-HPLC sugirieron que el ácido siálico fuertemente polar no podría retenerse en condiciones de pH ácidas, neutras o intermedias. El fenómeno observado no fue inesperado, ya que los grupos polares muy enriquecidos en ácido siálico (carbonilo, oxilo, carboxílico, amina y múltiples hidroxilos) inhiben su unión a las columnas de RP-HPLC. Aunque las columnas de RP-HPLC facilitan la retención del ácido siálico marcado fluorescente extremadamente hidrófobo (Zauner, Deelder y Wuhrer, 2011), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar es difícil de retener en una columna de RP-HPLC. El intento que se realizó para aumentar la hidrofobicidad del ácido siálico utilizando reactivos de pares iónicos no tuvo éxito. El análisis por RP-HPLC de ácido siálico en presencia de reactivos de pares iónicos catiónicos y aniónicos no ayudó a mejorar la retención del ácido siálico no derivatizado en la columna de RP-HPLC. Aunque los enfoques intentados deben trabajarse sobre bases teóricas, el resultado negativo podría ser consecuencia del hecho de que la cantidad recomendada por el proveedor del reactivo de pares iónicos 5 mM puede no haber sido suficiente para una unión adecuada. Basándose en la literatura publicada, la cantidad de los reactivos de pares iónicos debe ser significativamente superior en moléculas fuertemente polares tales como el ácido siálico. Por ejemplo, se usó una solución acuosa 60 mM de reactivo de pares iónicos de triisopropanolamina para la determinación de ácidos siálicos en fluidos biológicos usando cromatografía de pares iónicos de fase inversa (Siskos y Spyridk, 1999). Se puede explorar el aumento de la cantidad de reactivos de pares iónicos.
Los resultados de evaluación de la columna de azúcar de modo mixto de cromatografía de exclusión por tamaño/iónica (dimensiones: 8 x 300 mm) indicaron que la sensibilidad del procedimiento no fue suficiente para la aplicación prevista. El patrón de ácido siálico con concentraciones < 1 mg/ml no presentó ningún pico en 100 gl de inyección en esta columna. Como el umbral de detección del procedimiento se encuentra por debajo del intervalo deseado (de 0,015 a 1.0 mg/ml), no se realizó una optimización adicional de este procedimiento. La misma columna con unas dimensiones menores podría ayudar a mejorar la sensibilidad del procedimiento. Sin embargo, aún no hay disponibles columnas con dimensiones menores. No se muestran los cromatogramas obtenidos a partir de cualquiera de los análisis mencionados anteriormente, ya que ninguno de los mismos presentó picos distintos de los picos de inyección.
Las fases estacionarias que contienen estructuras poliméricas de derivados de poli-succinimida con grupos funcionales, tales como PolyGLYCOPLEX, aspartamida de polisulfoetilo y aspartamida de polihidroxietilo, son más adecuadas, ya que se usan ampliamente para separar diversos compuestos fuertemente polares (Ikegami, Tomomatsu, Takubo, Horie y Tanaka, 2008).
Ejemplo 2
2.Evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX para la separación de NANA-NGNA
Esta evaluación se llevó a cabo para evaluar el uso de una columna de amida PolyGLYCOPLEX para la separación y la cuantificación de NANA y NGNA en proteínas que contienen ambas formas de ácidos siálicos. Aunque los procedimientos de RP-HPLC son adecuados para la retención del ácido siálico marcado fluorescente extremadamente hidrófobo (Zauner, Deelder y Wuhrer, 2011), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar es difícil de retener en una columna de RP-HPLC. Por lo tanto, se exploró la cromatografía HILIC. Para separar diversos compuestos fuertemente polares se han utilizado fases estacionarias que contienen estructuras poliméricas de derivados de polisuccinimida con grupos funcionales, tales como PolyGLYCOPLEX, aspartamida de polisulfoetilo y aspartamida de polihidroxietilo (Ikegami, Tomomatsu, Takubo, Horie y Tanaka, 2008). La columna de amida PolyGLYCOPLEX (100 x 2.1 mm, 3 p) de PolyLC se evaluó en condiciones isocráticas utilizando la fase móvil que contenía acetonitrilo con fosfato de trietilamina 10 mM (80:20 en v/v) a un pH de 4,4. Los patrones de NANA y NGNA a 1 mg/ml se diluyeron 1:10 con agua, en primer lugar, y, después, los dos patrones se mezclaron a una relación de 1:1 antes de preparar inyecciones de 10 pl. Después de la inyección de la mezcla de NANA-NGNA, también se inyectaron por separado 5 pl de cada uno de los patrones de NANA-NGNA. Se llevaron a cabo análisis en el sistema Agilent 1100 usando el ajuste de NQAD mostrado a continuación.
Parámetros de NQAD
RESULTADOS: Tal como se representa en la figura 1, el análisis llevado a cabo en la columna de amida PolyGLYCOPLEX usando acetonitrilo con fosfato de trietilamina 10 mM a pH de 4,4 en condiciones isocráticas proporcionó una excelente separación entre NANA y NGNA. Las asignaciones de pico se realizaron mediante la inyección de NANA y NGNA por separado. Sin embargo, el grado de arrastre fue tan grave (datos no mostrados) que si se inyecta NGNA después de NANA, no se podría obtener un cromatograma de NGNA limpio sin tener un nivel traza de NANA y viceversa. El problema del arrastre junto con la variabilidad de ejecución a ejecución inherente a los procedimientos isocráticos nos llevó a descartar este procedimiento. Aunque se puede desarrollar y adoptar un protocolo de limpieza de columna para resolver el problema del arrastre, este puede influir en la exactitud de los resultados de cuantificación.
Ejemplo 3
3. Optimización del procedimiento de PolyGLYCOPLEX para la separación de NANA-NGNA
Los resultados de evaluación de las columnas de amida de PolyGLYCOPLEX de 5 y 10 cm en diferentes condiciones de fase móvil se muestran en las secciones 3.1 a 3.4. Los resultados de evaluación de las temperaturas de evaporador se muestran en la sección 3.5.
3.1 Optimización de la cromatografía
En este ejemplo, se evaluó y se optimizó la columna de amida PolyGLYCOPLEX en diferentes condiciones de fase móvil y diversos ajustes de la temperatura de evaporador de NQAD. Dado que la columna de amida PolyGLYCOPLEX superó a otras químicas de columna en términos de retención del ácido siálico no derivatizado, se seleccionó la columna de amida PolyGLYCOPLEX para una optimización adicional a fin de lograr la mejor separación posible entre NANA y NGNA sin tener el problema del arrastre. Aunque esta sección (sección 3.1) detalla la optimización cromatográfica del procedimiento, la sección 3.2 describe las condiciones utilizadas para la optimización de la temperatura de evaporador de NQAD. Las diferentes condiciones cromatográficas evaluadas son las enumeradas a continuación.
• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles
• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN al 100% y TFA al 0,1% como fases móviles
• Columna de PolyGLYCOPLEX de 5 cm con ACN al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles
• Columna de PolyGLYCOPLEX de 10 cm con ACN y ácido fórmico al 20% como fases móviles
Se evaluó una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm o de 5 cm usando ACN como fase móvil inicial. Se usaron las fases móviles de elución de ácido fórmico o de TFA al 0,1% enumeradas anteriormente. El patrón de NANA a 1 mg/ml se diluyó a 1:10 con agua y se realizaron inyecciones con 0, 2, 4, 6, 8 y 10 pl. Además de eso, se inyectaron patrones de NANA y NGNA (la misma preparación de muestra que en la sección 2) para evaluar la capacidad del procedimiento para separar NANA y NGNA. Los análisis se llevaron a cabo en el sistema Agilent 1200. Los parámetros de NQAD son los mismos que en la sección 2. Se llevaron a cabo múltiples experimentos mediante el cambio de la composición del gradiente inicial, variando del 0% de B al 35% de B. En todos los casos, el % inicial de B se mantuvo constante durante 1 minuto antes de la aplicación del gradiente lineal de 15 minutos hasta que se alcanzó el 95% de B. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal se mantuvo a 0,5 ml/min.
RESULTADOS: De las diversas composiciones de gradiente inicial que se evaluaron, una composición de gradiente inicial del 20% parece ser ligeramente mejor en términos de separación entre NANA y NGNA. Un cromatograma representativo de la separación de NANA-NGNA utilizando la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm (usando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B) en las composiciones de gradiente inicial del 15, 20 y 25% se muestra en las figuras 4, 5 y 6, respectivamente.
A diferencia del problema del arrastre encontrado anteriormente en la ejecución isocrática (sección 1), no se observó este arrastre en ninguna de las condiciones de gradiente evaluadas. La evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido trifluoroacético al 0,1% como fases móviles A y B proporcionó una simetría de ruido y picos basal que fue inferior a lo deseable. Los resultados de evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 10% como fases móviles A y B proporcionaron una separación entre NANA y NGNA (figura 7) que no fue tan buena como la separación lograda en la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm en las mismas condiciones de análisis (figura 5). La evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 10 cm utilizando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 20% como fases móviles A y B indicó que el ácido fórmico al 20% como fase móvil B es mejor que el ácido fórmico al 10% en términos de lograr picos más agudos y una separación ligeramente mejor entre NANA y NGNA (figura 2A frente a figura 5). La figura 2B representa un cromatograma de NANA y NGNA inyectados por separado, así como una mezcla. Se sometió a ensayo la superposición de cromatograma del patrón de NANA en concentraciones múltiples y no se encontró ningún problema de arrastre.
3.2 Optimización de la temperatura de evaporador de NQAD
La temperatura de evaporador (el parámetro más crítico del NQAD) se optimizó para maximizar la evaporación del disolvente del eluyente, al tiempo que se mantuvo la volatilidad mínima del ácido siálico para lograr una relación de señal a ruido óptima. Otros ajustes de temperatura (temperatura de nebulizador, temperatura óptica, temperatura de crecimiento y temperatura de acondicionador) son constantes y no se pueden variar. El ajuste de la temperatura de evaporador se varió de 35 a 60 °C (35, 40, 45, 50, 55 y 60 °C) para determinar la temperatura de evaporador óptima a la que se puede lograr la mejor relación de señal a ruido. La evaluación se llevó a cabo usando la columna de amida PolyGLYCOPLEX (50 x 4 mm, 5 p) con ACN al 100% y ácido fórmico al 20% como fases móviles A y B, respectivamente. Todos los parámetros de NQAD, excepto la temperatura de evaporador, fueron los mismos que en el ejemplo 2. La composición de fase móvil inicial del 20% de B se mantuvo durante 1 minuto antes de aplicarse el gradiente. Se aplicó un incremento lineal del 8,3% de B/min, de tal manera que se alcanzó el 95% de B a los 10 minutos. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal de columna se mantuvo a 1,0 ml/min.
RESULTADOS: La intensidad de señal, así como el ruido basal, fue directamente proporcional al grado de la temperatura de evaporador. Se logró una relación de señal a ruido óptima a una temperatura de evaporador de 40 °C.
Ejemplo 4
4. Columna de amida PolyGLYCOPLEX corta para la cuantificación de NANA
A fin de cuantificar el NANA en las muestras en las que está ausente el NGNA, se evaluó una columna de amida PolyGLYCOPLEX corta (50 x 4,6 mm, 3 pm). A fin de aumentar la vida de columna, se usó un menor porcentaje de ácido fórmico como fase móvil de elución en lugar de ácido fórmico al 20%. Como un porcentaje menor de ácido fórmico no es lo suficientemente fuerte como para eluir el ácido siálico fuertemente polar de la columna de amida PolyGLYCOPLEX, se llevó a cabo una evaluación en un enfoque de gradiente novedoso. En este enfoque, el gradiente de la fase móvil se cambió de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución tan pronto como se realizó la inyección, de tal manera que el ácido siálico unido se eluye en un entorno isocrático de la fase móvil de elución. La evaluación se llevó a cabo para determinar las composiciones y el caudal de las fases móviles óptimas, así como el mejor gradiente. El NANA liberado de PNGasaF se sometió a un análisis de HPLC/NQAD antes y después de la filtración para determinar la necesidad de filtración. Los parámetros de evaluación detallados se describen en las secciones 4.1 a 4.4.
Los resultados de evaluación de la columna de amida PolyGLYCOPLEX corta (50 x 4,6 mm, 3 pm) con un menor porcentaje de ácido fórmico como fase móvil de elución son adecuados para la cuantificación de NANA, siempre que el cambio de la condición de fase móvil inicial a la condición de fase móvil de elución se produzca poco después de realizarse la inyección. En esta condición de gradiente, se logran un valor basal estable y una simetría de picos adecuada a medida que se produce la elución del ácido siálico (NANA) durante el entorno isocrático de la fase móvil de elución. Los resultados de análisis de las diferentes fases móviles de elución, las diferentes condiciones de gradiente y los diferentes caudales mostrados en las secciones 4.1 a 4.3 indicaron que se logran los mejores resultados con ácido fórmico al 1 % a un caudal de 1,5 ml/min con el uso del gradiente 2. Los resultados mostrados en la sección 4.3 sugirieron que no se requiere la filtración de muestra posterior a la PNGasaF. Los cromatogramas representativos del patrón de ácido siálico (NANA) y el ácido siálico (NANA) liberado por PNGasaF de las glucoproteínas usando las condiciones optimizadas se muestran en las figuras 3A y 3B, respectivamente. Una gráfica de regresión lineal representativa de los patrones de NANA se muestra en la figura 8.
4.1 Evaluación de ácido fórmico al 0,5% frente a ácido fórmico al 1,0%
Aunque se usó acetonitrilo al 100% como fase móvil inicial, se usó ácido fórmico al 0,5% o al 1,0% como fase móvil de elución para este conjunto de experimentos. Todos los parámetros de NQAD, excepto la temperatura de evaporador, fueron los mismos que en la sección 2. Se aplicó la temperatura de evaporador optimizada de 40 °C. El cambio de gradiente de fase móvil A (ACN al 100%) a fase móvil B (ácido fórmico al 1,0%) se indujo para que se produjera 1 minuto después de la inyección. Después del cambio de gradiente, se mantuvo la condición isocrática de ácido fórmico al 1,0% durante 10 minutos. La temperatura de columna se mantuvo a temperatura ambiente y el caudal se mantuvo a 1,0 ml/min.
RESULTADOS: Los cromatogramas superpuestos y apilados de dos fases móviles de elución (ácido fórmico al 0,5% y al 1% como fases móviles de elución) demostraron que el cromatograma generado con ácido fórmico al 1% presentó una mejor simetría de picos que con ácido fórmico al 0,5%, por lo tanto, se seleccionó ácido fórmico al 1% en vez de al 0,5%.
4.2 Evaluación de los gradientes 1 y 2
Todos los parámetros, excepto el gradiente de HPLC, fueron los mismos que en la sección 4.1. Se usaron ACN al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente. Aunque el cambio de gradiente de ACN al 100% a ácido fórmico al 1,0% se indujo para que se produjera en 1,0 minuto para el gradiente 2, la duración para el cambio de gradiente se redujo de 1,0 minuto a 0,1 minutos para el gradiente 1.
RESULTADOS: Los cromatogramas obtenidos a partir del gradiente 1 (cambio rápido del gradiente de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución en 0,1 minutos) y del gradiente 2 (cambio del gradiente de la fase móvil inicial a la fase móvil de elución en 1,0 minuto) no fueron muy diferentes entre sí. Sin embargo, se seleccionó el gradiente 2 con un tiempo de retención más largo porque la separación entre el ácido siálico y los patrones de idoneidad del sistema (eluido de ácido L-glutámico y ácido L-aspártico) es mejor con el gradiente 2.
4.3 Evaluación de diferentes caudales
Se aplicó el gradiente 2 de HPLC descrito en la sección 4.2 a múltiples caudales (1,0, 1,2 y 1,5 ml/min) usando acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente. Todos los parámetros de NQAD fueron los mismos que en la sección 4.1.
RESULTADOS: Los análisis llevados a cabo en diferentes caudales mostraron que la mejor simetría de picos se logra a un caudal de 1,5 ml/min.
4.4 Evaluación de la digestión de muestra filtrada frente a no filtrada
Las muestras digeridas con sialidasa se inyectaron con y sin filtración con Centricon. La intención de la filtración con Centricon era separar el ácido siálico (NANA) de la proteína interferente y otros componentes de matriz. Se llevó a cabo un análisis en una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm usando los ajustes de NQAD y gradiente de HPLC optimizados mostrados a continuación. Se usaron acetonitrilo al 100% y ácido fórmico al 1,0% como fases móviles A y B, respectivamente.
Gradiente de HPLC
Ajustes de NQAD
Los patrones de NANA en el intervalo de 1 a 32 nmol/20 gl de inyección se prepararon a partir de un patrón de NANA liofilizado de Sigma. Se sometió a ensayo un patrón de idoneidad del sistema, ya que este es una parte fundamental de muchos procedimientos analíticos para garantizar la validez de rendimiento del sistema integrado que consiste en los equipos, los componentes electrónicos, las funciones analíticas y las muestras que se van a analizar. La inyección de 20 gl de la mezcla de idoneidad del sistema, que consistía en 1,0 mg/ml de cada uno de ácido L-glutámico y ácido L-aspártico, se incluyó en cada ejecución analítica.
RESULTADOS: Los perfiles cromatográficos, así como las respuestas de pico del NANA, fueron comparables entre las muestras filtradas y no filtradas. A fin de lograr una mayor eficacia durante el análisis, se puede excluir la alternativa de filtración, que requiere mucho tiempo, ya que es evidente que la cuantificación de NANA no se ve interferida por la proteína residual y otros componentes de matriz.
Ejemplo 5
5. Evaluación de comparabilidad del procedimiento de HPLC/NQAD frente a otros procedimientos ortogonales El procedimiento de HPLC corta con el gradiente 2 descrito en la sección 4.2 a un caudal de 1,5 ml/min se comparó frente a los procedimientos de HPAEC-PAD y HPLC/DMB para determinar en que medida se correlacionan los resultados obtenidos a partir del procedimiento de HPLC/NQAD.
5.1 Preparación de muestra para los análisis de HPLC/NQAD, HPAEC-PAD y HPLC/DMB:
En el estudio comparativo, se usaron las técnicas específicas de procedimiento para la liberación de NANA de la glucoproteína. Las condiciones de digestión enzimática usadas para HPLC/NQAD y HPAEC-PAD se describen en las secciones 5.1.1 y 5.1.2, respectivamente. La hidrólisis ácida y la posterior derivatización de DMB realizadas para el procedimiento de HPLC/DMB se describen en la sección 5.1.3. Las etapas de cálculo para la determinación de los picomoles de NANA por inyección se muestran de la forma siguiente.
Las ecuaciones usadas para la determinación de los picomoles de proteína por inyección, así como los picomoles de NANA/picomoles de proteína, son tal como se muestran en las secciones 5.1.1 a 5.1.3.
5.1.1 Digestión de sialidasa-A de las muestras para el procedimiento de HPLC/NQAD:
Para la digestión enzimática, se mezclaron 10 pl de una muestra de 5,0 mg/ml (50 pg) con 12 pl de sialidasa-A (Prozyme) y 4 pl de tampón de reacción 5X y 4 pl de agua Milli-Q. Las muestras se incubaron en un baño de agua a 37 °C ± 3 °C durante 4 horas ± 15 minutos, que se estableció como la condición de digestión óptima a lo largo del transcurso de tiempo de reacción. Al final de la incubación, se añadieron 30 pl de agua para llevar el volumen total a 60 pl. Se usó la siguiente ecuación para el cálculo de los picomoles de proteína por inyección para el procedimiento de HPLC/NQAD:
5.0 mg/ml * 10 pl * (1 julio]' MWen pt;}y (L0,h picomol/ julio!) * (1/60 p¡ ) * 20 jil
En la que 5,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 60 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.
Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X1 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.1.
5.1.2 Digestión de sialidasa-A de las muestras para el procedimiento de HPAEC-PAD:
A fin de liberar el ácido siálico de las muestras de glucoproteína, se mezclaron 10 pl de una muestra de 1,0 mg/ml con 2 pl de sialidasa-A (Prozyme) y 4 pl de tampón de reacción 5X y 4 pl de agua Milli-Q. Las muestras se incubaron en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C durante 4 horas ± 15 minutos, que se estableció como la condición de digestión óptima a lo largo del transcurso de tiempo de reacción. Al final de la incubación, se añadieron 780 pl de agua para llevar el volumen total a 800 pl. Se usó la ecuación siguiente para el cálculo de los picomoles de proteína por inyección para el procedimiento de HPAEC/PAD:
1.0 mgfail * 10 pí * (! pinol/MWenpg) * ( IO1' picóme! pinol) * (1/800 pl ) * 20 pl
En la que 1,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 800 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.
Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X2 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.2.
5.1.3 Hidrólisis ácida y derivatización de DMB para el procedimiento de HPLC/DMB:
El ácido N-acetilneuramínico (NANA) de las muestras de glucoproteínas se liberó mediante una hidrólisis con ácido acético 8 M seguida de una derivación de columna previa con reactivo fluorescente 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno (DMB). El ácido A-acetilneuramínico forma un derivado de quinoxalinona sumamente fluorofórico cuando se somete a tratamiento con DMB (Lin, Inoue e Inoue, 2000). Se usó la ecuación siguiente para el cálculo de los picomoles de proteína para el procedimiento de HPLC/DMB.
En la que 1,0 mg/ml es la concentración de la muestra, MW es el peso molecular de la proteína, 60 pl es el volumen final de la muestra y 20 pl es el volumen de inyección.
Los picomoles de NANA/picomoles de proteína se determinan mediante la división de los picomoles de NANA/inyec. calculados basándose en la ecuación presentada en la sección 5.1 divididos por los X3 picomoles/inyec. calculados a partir de la sección 5.1.3.
5.2 Análisis de muestra y evaluación de comparabilidad
Las glucoproteínas A y B se sometieron a ensayos paralelos en los procedimientos de HPLC/NQAD y HPLC/DMB, así como en el procedimiento de HPAEC-PAD. En el procedimiento de HPLC/NQAD, se analizó el NANA liberado de sialidasa-A usando los parámetros cromatográficos y los ajustes de NQAD descritos en la sección 4.4. En el procedimiento de HPLC/DMB, se llevó a cabo un análisis en el sistema Waters Alliance equipado con un detector de fluorescencia. Se usó una columna ultrasphere ODS (Beckman) para la separación. La fase móvil para la separación isocrática de NANA y NGNA consistió en el 78% de agua/21% de metanol/0,3% de acetonitrilo. El eluido de columna se controló usando un detector fluorescente a 374 nm y 448 nm de longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. En el procedimiento de HPAEC-PAD, se analizó el NANA liberado de sialidasa-A usando hidróxido de sodio 0,1 M e hidróxido de sodio 0,1 M con acetato de sodio 1 M como fases móviles A y B, respectivamente. Se aplicó un gradiente lineal del 5% de B al 18% de B a lo largo de un periodo de 35 minutos. El eluido se controló usando un detector amperométrico pulsado (PAD). La concentración de NANA obtenida a partir del procedimiento de HPLC/NQAD se comparó frente a los resultados obtenidos a partir de los procedimientos de HPLC/DMB y HPAEC-PAD para determinar la comparabilidad del procedimiento de HPLC/NQAD con los dos procedimientos ortogonales.
RESULTADOS: Los resultados de comparabilidad del HPLC/NQAD frente al HPAEC-PAD y e1 HPLC/DMB se muestran a continuación en las tablas 1 y 2, respectivamente. Aunque los procedimientos ortogonales (HPAEC-PAD y HPLC/DMB) se usan para la cuantificación del ácido siálico de la glucoproteína-A, el procedimiento HPAEC-PAD es el único procedimiento disponible para la glucoproteína-B. Por lo tanto, el procedimiento HPLC/NQAD solo se comparó frente a HPAEC-PAD para la glucoproteína-B. Los resultados del HPLC/NQAD fueron comparables a los procedimientos ortogonales para las muestras sometidas a ensayo.
Tabla 1: Comparación de HPLC/NQAD frente a HPAEC-PAD
Tabla 2: Comparación de HPLC/NQAD frente a HPLC/DMB
Ejemplo 6
6. Calificación del ensayo de cuantificación de NANA con la columna de amida PolyGLYCOPLEX
El procedimiento de columna corta (con la columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm) descrito en la sección 4.4 se sometió a la calificación formal del procedimiento. El procedimiento de HPLC/NQAD corta (con una columna de amida PolyGLYCOPLEX de 5 cm) cumplió con todos los criterios de calificación en cuanto a la exactitud, la linealidad y la precisión de ensayo (repetibilidad y precisión intermedia). El LOD y LOQ del procedimiento se determinaron como 0,32 y 0,86 nmol/inyec., respectivamente. Los resultados detallados se muestran en las secciones 6.1 a 6.4.
6.1 Evaluación de exactitud del procedimiento de HPLC/NQAD
A fin de evaluar la exactitud, se realizó un estudio de adición en el que se añadieron cantidades conocidas de NANA a diversas concentraciones en la glucoproteína-A. Las muestras con adición y sin adición se sometieron después a un análisis de HPLC/NQAD después de la digestión con sialidasa. Las concentraciones de NANA obtenidas para las muestras sin adición se restaron de las muestras con adición, que, después, se compararon frente a la cantidad conocida de NANA añadido para determinar las recuperaciones reales. A fin de verificar, además, la exactitud, se realizó un análisis de espectrometría de masas en un eluido de HPLC/NQAD de glucoproteína-A digerida enzimáticamente.
RESULTADOS: Tal como se ilustra en la tabla 3, los resultados de los experimentos de adición y recuperación demostraron que las recuperaciones de NANA añadido en la glucoproteína-A a diversos niveles se encuentran dentro del intervalo del 90-110%. Las trazas de TIC y los espectros de masas correspondientes indicaron que el pico de NANA obtenido a partir del procedimiento de HPLC/NQAD era puro y que ningún otro componente interferente se coeluyó con el NANA.
Tabla 3: Resultados de adición recuperación
6.2 Evaluación del intervalo dinámico lineal
El intervalo dinámico lineal del ensayo se determinó mediante la ejecución de los conjuntos de patrones de NANA a diversas concentraciones.
Tal como se ilustra en la tabla 4, se ha determinado que el intervalo dinámico lineal del ensayo se encuentra en el intervalo de 1-32 nmol/inyec. con un coeficiente de determinación (R2) = > 0,99. La gráfica de regresión lineal correspondiente se muestra en la figura 9.
Tabla 4: Resultados de la evaluación del intervalo dinámico lineal
6.3 Evaluación de la precisión de procedimiento
La precisión de procedimiento, el grado de concordancia entre una serie de mediciones obtenidas a partir de múltiples muestras del mismo tipo de muestra en las condiciones prescritas, se evaluó a dos niveles, repetibilidad y precisión intermedia.
6.3.1 Repetibilidad
La repetibilidad o la precisión entre ensayos se expresa en las mismas condiciones de funcionamiento durante un intervalo de tiempo corto. A fin de demostrar la repetibilidad del procedimiento, se analizó el ácido siálico liberado (NANA) de la glucoproteína-A en 6 inyecciones de réplica. La desviación estándar relativa calculada a partir de múltiples inyecciones se comparó con el objetivo de rendimiento previsto determinado a partir de la ecuación de Horwitz (Horwitz, 1982) presentada a continuación.
En la que C es la concentración del analito en la muestra en mg/ml.
RESULTADOS: El %RSD de 0,96 determinado a partir de la evaluación de repetibilidad se encontraba dentro del objetivo de rendimiento de %RSD < 4 establecido basándose en la ecuación de Horwitz, que se cumplió totalmente. La precisión de un procedimiento analítico que normalmente se expresa como desviación estándar o %RSD de una serie de mediciones se muestra en la tabla 5.
T l : R l l r i ili l r ín -A
6.3.2 Precisión intermedia
La precisión intermedia se expresa como variaciones dentro de los laboratorios, tales como diferentes días, diferentes analistas, diferentes equipos, etc. A fin de evaluar la precisión intermedia, se llevó a cabo un análisis por parte de dos analistas en diferentes días. Las precisiones intermedias observadas se compararon con el objetivo de rendimiento previsto determinado a partir de la ecuación de Horwitz.
RESULTADOS: La precisión intermedia se estableció mediante el análisis de la glucoproteína-A en dos días diferentes y por parte de dos analistas. El %RSD de 0,95 se encuentra dentro del objetivo de rendimiento de %RSD < 6 establecido mediante la ecuación de Horwitz. La precisión de un procedimiento analítico que se expresa como la varianza, la desviación estándar o el coeficiente de variación de una serie de mediciones se muestra en la tabla 6.
T l : R l r i i n in rm i
6.4 Evaluación de LOD/LOQ
Aunque el LOD describe la concentración de analito más baja que probablemente se distinguirá de manera fiable del ruido, el LOQ es la concentración más pequeña que se puede medir de manera fiable mediante el procedimiento analítico. Un enfoque tradicional y típico para estimar el LOD y el LOQ consiste en la medición de réplicas (normalmente n=20) de un calibrador cero o muestra en blanco y la conversión de la respuesta en nmol/inyección usando la ecuación de regresión lineal derivada de la curva patrón. Para la determinación del LOD y el LOQ, se analizaron 30 réplicas de muestras en blanco de matriz (agua) y 10 réplicas de los patrones de ácido siálico más bajos (1 nanomol/inyección). La curva patrón construida a partir de patrones de ácido siálico analizados simultáneamente facilita la conversión de las respuestas en nmol/inyección.
El LOD y el LOQ se determinaron a partir de los datos generados a partir de 30 ejecuciones de réplicas de muestra en blanco y 10 ejecuciones de réplicas de los patrones de ácido siálico más bajos (1,0 nmol/inyec.). Los datos en bruto se convirtieron en nmol/inyec. usando la ecuación de regresión lineal. Aunque se usó la media 3,3 de SD para determinar el LOD, se usó la media 10 de SD para determinar el LOQ. Tal como se muestra en la tabla 7, el LOD y el LOQ del procedimiento, determinados a partir de 30 inyecciones en blanco, fueron de 0,32 y 0,86 nmol/inyec., respectivamente. El valor observado promedio de 0,99 nmol/inyec. determinado a partir de 10 inyecciones de los patrones de ácido siálico más bajos se encuentra bien dentro del valor esperado de 1,0 nmol/inyec., lo que verifica la exactitud de los patrones más bajos. El %RSD entre los múltiples valores de los patrones más bajos es del 9%, lo que verifica la precisión de los patrones más bajos.
Tabla 7: Determinación de LOD/LOQ basada en 30 inyecciones en blanco, verificación basada en 10 inyecciones del r n i i li m 1 n n m lin .
Análisis
Basándose en los datos resumidos en la tabla 1, no se continuó, además, con el procedimiento de RP-HPLC para cuantificar el ácido siálico no derivatizado. A pesar del uso común del RP-HPLC para la cuantificación del ácido siálico derivatizado de DMB (1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno), el ácido siálico no derivatizado fuertemente polar no se pudo retener en el RP-HPLC sin alguna forma de derivatización previa. La tabla 1 resume también la aplicación positiva y negativa de otros modos de química de columna (cromatografía de pares iónicos, cromatografía de exclusión iónica, cromatografía de intercambio catiónico y aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba) para la cuantificación del ácido siálico no derivatizado.
La evaluación limitada llevada a cabo para aumentar la hidrofobicidad para mejorar la unión del ácido siálico no derivatizado a la columna de RP-HPLC por medio de la utilización de reactivos de pares iónicos no tuvo éxito. Dado que la cromatografía de pares iónicos se evaluó únicamente con un alcance limitado, los futuros investigadores pueden explorar esta área mediante el uso de diversos reactivos de pares iónicos aniónicos y catiónicos diferentes a diversas concentraciones para mejorar la unión.
Dado que el detector NQAD no es compatible con un alto contenido de sal, no se realizaron la AEX ni la CEX con gradientes de sal. Por la misma razón, también se excluyó de la evaluación la cromatografía de interacción hidrófoba.
Tanto la cromatografía de intercambio aniónico como catiónico con un gradiente de pH se evaluaron sin ningún resultado exitoso. La evaluación de la columna de cromatografía de exclusión iónica de modo mixto no es prometedora debido a la deficiente sensibilidad asociada a una dimensión de columna más grande.
Tal como se muestra en las figuras 2 y 3, las columnas de HILIC PolyGLYCOPLEX y X-bridge son adecuadas para la retención del ácido siálico no derivatizado. Como la columna de amida PolyGLYCOPLEX presentó un valor basal relativamente mejor que la columna X-bridge, se seleccionó la columna de amida PolyGLYCOPLEX para la optimización adicional. Con el uso de la columna de amida PolyGLYCOPLEX, se logró una simetría de picos aceptable en dos condiciones de elución: (1) una columna de 10 cm con acetonitrilo como fase móvil A y ácido fórmico al 20% como fase móvil B y (2) una columna de 5 cm con acetonitrilo como fase móvil A y ácido fórmico al 1% como fase móvil B. Aunque la primera opción es más adecuada para las situaciones en las que los analitos tienen tanto NANA como NGNA presente en los mismos (figura 4), la segunda opción es ideal si las glucoproteínas contienen únicamente NANA (figura 6).
La respuesta de pico comparable presentada por las muestras filtradas y no filtradas con Centricon (digestión de glucoproteína sometida a tratamiento con sialidasa) sugiere que la interferencia de matriz de la glucoproteína u otros componentes de matriz no es un problema. Por lo tanto, la filtración con Centricon aplicada para retirar la proteína y los componentes de matriz no es una etapa necesaria.
Tal como se resume en las tablas 2 y 3, los resultados de cuantificación del ácido siálico obtenidos a partir de HPLC/NQAD están en buena concordancia con los procedimientos ortogonales. La recuperación del 95-105% (tabla 4) obtenida a partir del experimento de adición y recuperación (glucoproteína-A con adición de NANA a diversos niveles), así como los resultados comparables del procedimiento de HPLC/NQAD con los procedimientos ortogonales (tablas 2 y 3), apoyan, además, la exactitud del procedimiento.
El intervalo lineal del procedimiento de HPLC/NQAD es de 1-32 nmol/inyec. con un coeficiente de determinación (R) = > 0,99 (tabla 5). Los %RSD del 0,96% y el 0,95% (tablas 6 y 7) determinado a partir de la repetibilidad (precisión entre ensayos) y la precisión intermedia se encontraban ampliamente dentro del objetivo de rendimiento de < 4% y < 6% de RSD, respectivamente, establecidos a partir de la ecuación de Horwitz.
No se produce un ahorro de tiempo significativo en los tiempos de análisis cromatográfico, ya que los tiempos de análisis son comparables en HPLC/NQAD, HPAEC/PAD y HPLC/DMB con los tiempos de ejecución respectivos de 30 minutos, 31 minutos y 35 minutos. Sin embargo, el procedimiento de HPLC/NQAD proporciona un beneficio de coste sobre el procedimiento de HPLC/DMB, ya que se elimina la etapa de derivatización costosa que requiere mucho tiempo.
Desde la perspectiva de la programación, resulta beneficioso la retirada de la derivatización. Por ejemplo, se espera que el proceso de secado de la muestra en Speed Vac se complete en aproximadamente 2 horas. Sin embargo, a menudo este puede variar de vez en cuando y añadir más incertidumbre a la línea de tiempo del ensayo. Aunque el tiempo de preparación y el tiempo de análisis de la muestra son comparables entre HPLC/NQAD y HPAEC/PAD, HPLC/NQAD supera a HPAEC/PAD en términos de fiabilidad y facilidad de uso.
Conclusión
Como el resto de ácido siálico de las proteínas terapéuticas influye en las propiedades biológicas y fisicoquímicas, además de desempeñar un papel importante en el mantenimiento de la semivida sérica, la cuantificación del ácido siálico en las glucoproteínas es una etapa analítica requerida en la caracterización de las proteínas bioterapéuticas. El procedimiento de HPLC/NQAD sin derivatización descrito en el presente documento es una técnica eficaz y fiable para la cuantificación exacta del ácido siálico no derivatizado en proteínas terapéuticas recombinantes. El ácido siálico liberado enzimáticamente de proteínas terapéuticas separadas mediante la columna de HILIC de PolyGLYCOPLEX se puede detectar y cuantificar usando un detector de analitos en nanocantidades (NQAD). Aunque la medición exacta del contenido de ácido siálico es crítica en muchas proteínas terapéuticas, las técnicas actualmente empleadas, tales como HPAEC/PAD y HPLC/DMB, se enfrentan a diversos problemas. Mientras que el procedimiento de HPLC/DMB requiere una derivatización tediosa, el procedimiento de HPAEC/PAD presenta problemas, tales como el ensuciamiento de electrodos y altos costes de mantenimiento. Además de eliminar la variabilidad asociada a la derivatización, el procedimiento de HPLC/NQAD ha demostrado un intervalo dinámico lineal, así como una excelente precisión, repetibilidad, fiabilidad, exactitud y facilidad de uso con una comparabilidad aceptable con los procedimientos habitualmente usados HPAE-pA d y HPLC/DMB.
Referencias
1. Byrne, B., Donohoe, G. y O'Kennedy, R. (2007). Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of bio-pharmaceutical proteins and living cells. Drug Discovery Today 12(7/8): 319 326.
2. Hildenbrandt, G. y Aronson, N. (1979). Uptake of asialo-gycophorin by the perfused rat liver and isolated hepatocytes. Biochemica Et Biophysica Acta 587(3): 373-80.
3. Ganesa, C., Granda, B. W. y Mattaliano, R. J. (2003). Sialylation levels influence oligosaccharide quantitation:
Analyzing response variability using high-pH anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection. Biopharm International 16(6): 44-48.
4. Hutchinson JP; Li J; Farrell W; Groeber E; Szucs R; Dicinoski G y Haddad PR. (2011). Comparison of the response of four aerosol detectors used with ultra high pressure liquid chromatography. Journal of Chromatography 1281(12): 1446-55.
5. Olsovská J; Kamenik Z; Cajthaml T. (2009). Hyphenated ultra high-performance liquid chromatography-Nano Quantity Analyte Detector technique for determination of compounds with low UV absorption. Journal of Chromatography 1261(30): 5774-8.
6. Kimball, B., Arjo, W., Johnston, J. (2004). Single point calibration with non-linear detector: Carbohydrate analysis of conifer needles by hydrophobic interaction chromatography-evaporative light scattering detector. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 27(12): 1835-1848.
7. Cintron, J y Risley, D. (2013). Hydrophilic interaction chromatography with aerosol-based detectors for polar compounds lacking UV chromophore in an intravenous formulation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 78-79:14-18.
8. Sharma, V.K., Glick, J., Vouros, P. (2012). Reversed-phase ion-pair liquid chromatography electro spray ionization tandem mass spectrometry for separation, sequencing and mapping of sites of base modification of isomeric oligonucleotide adducts using monolithic column. Journal of Chromatography A 1245 (6): 65-74.
9. Calhoun, A.R., King, A.D. (2007). The solubility of ethane in aqueous solutions of sodium 1-pentanesulfonate, sodium 1-hexanesulfonate, sodium 1-heptanesulfonate, and sodium 1-octanesulfonate at 25 °C. Journal of Colloid and Interface Science 309 (2): 505-510.
10. Remsburg, J. W. (2007). Multiply charged cationic pairing agents for trace analysis of anionic species by electro spray ionization mass spectrometry. (N° de orden 1447279, The University of Texas at Arlington). ProQuest Dissertations and Theses 77.
11. Isakau, H., Robert, M. y Shingel, K. (2009). A novel derivatization-free method of formaldehyde and propylene glycol determination in hydro gels by liquid chromatography with refractometric detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49(3): 594-600.
12. Mori, M., Taoda, H., Itabashi, H., Ikedo, M. y Tanaka, K. (2006). Use of combined ion-exclusion and cation exchange chromatography to study photooxidation of ionic nitrogen compounds on a titanium dioxide photo catalyst. ACTA CHROMATOGRAPHICA 1 (16): 28-37.
13. Horwitz,W. 1982. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Analytical Chemistry 54:67-76.
14. Zauner, G., Deelder, M. y Wuhrer, M. (2011). A recent advance in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) for structural glycomics. Electrophoresis. 32(24): 3456-3466.
15. Ikegami, T., Tomomatsu, K., Takubo, H., Horie, K., Tanaka, N. (2008). Separation efficiencies in hydrophilic interaction chromatography. J. Chromatography 1184(1-2): 474-503.
16. Duy, S., Besteiro, S., Berry, L., Perigaud, C., Bressolle, F., Vial, H.J., Lefebvre-Tournier, I. (2012). A quantitative liquid chromatography tandem mass spectrometry method for metabolomic analysis of Plasmodium falciparum lipid related metabolites. Analytica Chemica Acta 739(20): 47-56.
17. Lin, S.L., Inoue, S. yInoue, Y. (2000). Acid-base properties of the reaction product of sialic acid with flurogenic reagent, 1-2-diamino-4.5-methylethylene dioxybenzene (DMB) Carbohydrate Research 329(2): 447-451.
18. Horwitz, W. (1982). Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Analytical Chemistry 541): 67-76.
19. Siskos, PA. y Spyridk, MH. (1999). Determination of sialic acids in biological fluids using reversed-phase ionpair high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl 724(2): 205-12.
Claims (16)
1. Un procedimiento de determinación de la cantidad de un resto glucano en un anticuerpo recombinante, comprendiendo el procedimiento digerir el anticuerpo con una glicosidasa para liberar glucano y cuantificar el glucano utilizando detección de dispersión de luz por nucleación por condensación, en el que el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende separar el glucano liberado del anticuerpo antes de la etapa de cuantificación.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la etapa de separación implica cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), tal como cromatografía de interacción hidrófila (HILIC).
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de dispersión de luz por nucleación por condensación utiliza un detector de analito en nanocantidades (NQAD).
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es de cualquier isotipo o subclase.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se aísla de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está destinado a aplicaciones terapéuticas.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto glucano de un anticuerpo es un atributo de calidad crítico.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo reconoce uno o más antígenos seleccionados de entre: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1 a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, subunidad p35 de IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, subunidad p19 de IL-23, subunidad p40 compartida de IL-12/IL-23, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-17, subunidades del receptor de IL-18, FGL2, PDGF-p y análogos de los mismos, B7RP-1, B7RP-2, VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-p1, c-fms, receptor de EGF, receptor de CGRP, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), FGF21, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, EGFRvIII, estimulador de linfocitos B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4), receptor de BAFF, BCMA, April, ST2, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, HER-3, una glucoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o de páncreas, epítopos asociados a cáncer o proteínas asociadas expresados en células cancerosas de cáncer de mama, de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón y/o de riñón y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TSLP, IFN<y>, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), angiopoyetina 1 (Ang1), angiopoyetina 2 (Ang2), leucointegrina adhesina, glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), muerte celular programada 1 (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1), ligando 2 de muerte celular programada (PDL-2), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3), receptor de F<c>-<y>-1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB),Streptococcus mutansyStaphlycoccus aureus.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se selecciona de entre adalimumab, alirocumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, dupilumab, eculizumab, gemtuzumab guselkumab, ozogamicin, golimumab, ibritumomab, ixekizumab, ipilimumab, tiuxetan, labetuzumab, lebrikizumab, mapatumumab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, nivolumab, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pembrolizumab, ranibizumab, rituximab, romosozumab, rovelizumab, rilotumumab, tildrakizumab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, tremelimumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab y zanolimumab.
13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el resto glucano es uno o más de ácido siálico, galactosa terminal, glucanos unidos a N y glucanos unidos a O.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el resto glucano es ácido siálico y la glucosidasa es sialidasa.
15. El procedimiento de la reivindicación 13 o 14, en el que el ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneurámico.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que se determina la cantidad de ácido N-acetilneuramínico y/o ácido N-glicolilneuramínico o en el que se determina la relación de ácido N-acetilneuramínico a ácido N-glicolilneuramínico.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462082014P | 2014-11-19 | 2014-11-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2962593T3 true ES2962593T3 (es) | 2024-03-20 |
Family
ID=54754830
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES19155593T Active ES2962593T3 (es) | 2014-11-19 | 2015-11-19 | Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes |
ES15802326T Active ES2727380T3 (es) | 2014-11-19 | 2015-11-19 | Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES15802326T Active ES2727380T3 (es) | 2014-11-19 | 2015-11-19 | Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11275090B2 (es) |
EP (2) | EP3221465B1 (es) |
JP (2) | JP2018502287A (es) |
AU (1) | AU2015349809B2 (es) |
CA (1) | CA2968372A1 (es) |
ES (2) | ES2962593T3 (es) |
HK (1) | HK1244037B (es) |
MX (1) | MX2017006463A (es) |
WO (1) | WO2016081770A1 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107045019B (zh) * | 2016-09-30 | 2019-08-16 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法 |
CN106908528A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-06-30 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 蛋白类药物中唾液酸的检测方法 |
KR101923662B1 (ko) * | 2017-12-28 | 2018-11-30 | (주)글라이칸 | 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 고감도 분석방법 및 이를 이용한 분석용 킷트 |
JP7343890B2 (ja) * | 2019-04-26 | 2023-09-13 | 国立大学法人東海国立大学機構 | シアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用 |
EP3983781A4 (en) * | 2019-06-14 | 2023-05-10 | Agilent Technologies, Inc. | METHODS AND KITS FOR IMPROVING THE FLUORESCENCE SIGNAL OF DMB-LABELED SIALIC ACIDS |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
AU588819B2 (en) | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
US4968607A (en) | 1987-11-25 | 1990-11-06 | Immunex Corporation | Interleukin-1 receptors |
US5075222A (en) | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
AU643427B2 (en) | 1988-10-31 | 1993-11-18 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
US5395760A (en) | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
EP0417563B1 (de) | 1989-09-12 | 2000-07-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | TNF-bindende Proteine |
US6204363B1 (en) | 1989-10-16 | 2001-03-20 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
US5149792A (en) | 1989-12-19 | 1992-09-22 | Amgen Inc. | Platelet-derived growth factor B chain analogs |
US5272064A (en) | 1989-12-19 | 1993-12-21 | Amgen Inc. | DNA molecules encoding platelet-derived growth factor B chain analogs and method for expression thereof |
US5350683A (en) | 1990-06-05 | 1994-09-27 | Immunex Corporation | DNA encoding type II interleukin-1 receptors |
AU651596B2 (en) | 1990-06-05 | 1994-07-28 | Immunex Corporation | Type II interleukin-1 receptors |
US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
US5981713A (en) | 1994-10-13 | 1999-11-09 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Antibodies to intereleukin-1 antagonists |
KR101004174B1 (ko) | 1995-06-29 | 2010-12-24 | 임뮤넥스 코포레이션 | 세포소멸을 유도하는 시토킨 |
US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
US6096728A (en) | 1996-02-09 | 2000-08-01 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US6337072B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-01-08 | Hyseq, Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof |
WO2001036637A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Immunex Corporation | Receptor activator of nf-kappa b |
GB0304253D0 (en) * | 2003-02-25 | 2003-03-26 | Polymer Lab Ltd | Apparatus |
WO2009117312A2 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Waters Technologies Corporation | Apparatus and methods for making analyte particles |
JP2012511722A (ja) * | 2008-12-10 | 2012-05-24 | オールテック・アソシエイツ・インコーポレーテッド | 蒸発光散乱検出器などのデバイスに使用されることに適した構成部品 |
CN102239173A (zh) * | 2008-12-19 | 2011-11-09 | 动量制药公司 | 与修饰的聚糖相关的方法 |
NZ593816A (en) | 2009-01-22 | 2012-11-30 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Galactose-alpha-1, 3-galactose-containing n-glycans in glycoprotein products derived from cho cells |
JP5615537B2 (ja) * | 2009-12-02 | 2014-10-29 | 東光薬品工業株式会社 | 抗病原性微生物剤、並びに、マスク及びフィルター |
WO2012107572A1 (en) | 2011-02-10 | 2012-08-16 | Leiden University Medical Center | Method for the purification of a glycan and/or a glycoconjugate by chromatography using a stationary phase comprising cotton |
WO2013130604A1 (en) * | 2012-02-27 | 2013-09-06 | Biogen Idec Ma Inc. | High-throughput method for sialic acid quantitation |
JP6317328B2 (ja) * | 2012-04-11 | 2018-04-25 | ビオベラティブ テラポイティクス インコーポレーテッドBioverativ Therapeutics Inc. | グリコサミノグリカンを検出する方法 |
US8834796B2 (en) * | 2012-04-13 | 2014-09-16 | Waters Technologies Corporation | Chromatographic optical detection system |
WO2014072503A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Dsm Ip Assets B.V. | A method for analyzing a solution, a device for analyzing a solution as well as a system for analyzing a solution |
US9169331B2 (en) * | 2012-12-21 | 2015-10-27 | Dionex Corporation | Separation of glycans by mixed-mode liquid chromatography |
-
2015
- 2015-11-19 CA CA2968372A patent/CA2968372A1/en not_active Abandoned
- 2015-11-19 EP EP15802326.7A patent/EP3221465B1/en active Active
- 2015-11-19 ES ES19155593T patent/ES2962593T3/es active Active
- 2015-11-19 AU AU2015349809A patent/AU2015349809B2/en active Active
- 2015-11-19 JP JP2017526951A patent/JP2018502287A/ja active Pending
- 2015-11-19 EP EP19155593.7A patent/EP3540071B1/en active Active
- 2015-11-19 ES ES15802326T patent/ES2727380T3/es active Active
- 2015-11-19 MX MX2017006463A patent/MX2017006463A/es unknown
- 2015-11-19 WO PCT/US2015/061684 patent/WO2016081770A1/en active Application Filing
- 2015-11-19 US US15/525,794 patent/US11275090B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-15 HK HK18103621.1A patent/HK1244037B/zh unknown
-
2020
- 2020-06-24 JP JP2020108523A patent/JP7055837B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2015349809B2 (en) | 2022-02-10 |
US11275090B2 (en) | 2022-03-15 |
AU2015349809A1 (en) | 2017-05-25 |
EP3221465A1 (en) | 2017-09-27 |
HK1244037B (zh) | 2019-11-15 |
EP3221465B1 (en) | 2019-03-13 |
ES2727380T3 (es) | 2019-10-15 |
JP2018502287A (ja) | 2018-01-25 |
US20180321252A1 (en) | 2018-11-08 |
MX2017006463A (es) | 2018-04-20 |
EP3540071B1 (en) | 2023-09-06 |
JP2020187128A (ja) | 2020-11-19 |
JP7055837B2 (ja) | 2022-04-18 |
EP3540071A1 (en) | 2019-09-18 |
CA2968372A1 (en) | 2016-05-26 |
WO2016081770A1 (en) | 2016-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2962593T3 (es) | Cuantificación de resto glucano en glucoproteínas recombinantes | |
Gstöttner et al. | Fast and automated characterization of antibody variants with 4D HPLC/MS | |
Duivelshof et al. | Therapeutic Fc‐fusion proteins: current analytical strategies | |
Zhang et al. | Glycan analysis of therapeutic glycoproteins | |
Maeda et al. | Analysis of nonhuman N-glycans as the minor constituents in recombinant monoclonal antibody pharmaceuticals | |
Shah et al. | LC-MS/MS peptide mapping with automated data processing for routine profiling of N-glycans in immunoglobulins | |
EP2975401B1 (en) | Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples | |
EP2909632B1 (en) | Improved method of mapping glycans of glycoproteins | |
Camperi et al. | Fast and automated characterization of monoclonal antibody minor variants from cell cultures by combined protein-A and multidimensional LC/MS methodologies | |
ES2619677T3 (es) | Método de separación para anticuerpos fucosilados | |
Regl et al. | A generic HPLC method for absolute quantification of oxidation in monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins using UV and MS detection | |
EP3196646B1 (en) | Methods of mapping protein variants | |
Buettner et al. | Multi-attribute monitoring of complex erythropoetin beta glycosylation by GluC liquid chromatography–mass spectrometry peptide mapping | |
CN115210564A (zh) | 用于天然液相色谱-质谱的平台 | |
BR112021011194A2 (pt) | Método e sistema de identificar e quantificar a fragmentação do anticorpo | |
Liu et al. | Assessment of the quality and structural integrity of a complex glycoprotein mixture following extraction from the formulated biopharmaceutical drug product | |
CN112074537A (zh) | 具有经调节的聚糖谱的抗体 | |
US20230025648A1 (en) | Label-free n-glycan quantification methods | |
ZHENG et al. | 1 CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY HETEROGENEITY BY HPLC ANALYSIS | |
Wenz | Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System |