ES2949999T3

ES2949999T3 - Moduladores de TREX1

Info

Publication number: ES2949999T3
Application number: ES19828476T
Authority: ES
Inventors: Anna Gardberg; Victor Gehling; Avinash Khanna; Julian Levell; Jonathan Wilson; Kennedy Taveras
Original assignee: Constellation Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Constellation Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2023-10-04
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CY1126082T1; IL283672A; JP2022510431A; DK3891145T3; WO2020118133A1; EA202191519A1; LT3891145T; MX2021006695A; KR20210102310A; US20220017502A1; EP3891145A1; PL3891145T3; PE20212070A1; HRP20230701T1; JP7471297B2; FI3891145T3; SI3891145T1; CA3122093A1; EP3891145B1; CO2021008816A2

Abstract

Se proporcionan compuestos de Fórmula (I): y sales y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, que son útiles para tratar una variedad de afecciones asociadas con TREX1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores de TREX1

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/776,301, presentada el 6 de diciembre de 2018.

Antecedentes

Se necesita una terapia inmunológica potencial para los cánceres relacionados con el reconocimiento de lo no propio por el sistema inmunitario innato, y para detectar y proteger contra el peligro potencial. Las células cancerosas difieren antigénicamente de sus contrapartes normales y emiten señales de peligro para alertar al sistema inmunitario de manera similar a una infección viral. Estas señales, que incluyen patrones moleculares asociados a daños (DAMP) y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), activan aún más el sistema inmunitario innato, lo que da como resultado la protección del huésped contra una variedad de amenazas (Front. Cell Infect. Microbiol. 2012, 2, 168).

El ADN monocatenario (ADNmc) y el ADN bicatenario (ADNbc) expresados ectópicamente son PAMP y/o DAMP conocidos, que están siendo reconocidos por la sintasa de GMP-AMP cíclico (cGAS), un detector de ácido nucleico (Nature 2011, 478, 515-518). Al detectar el ADN citosólico, cGAS cataliza la generación del dinucleótido cíclico 2',3 '-cGAMP, un segundo mensajero y activador potente de la proteína adaptadora transmembrana del RE estimuladora de genes de interferón (STING) (Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361). La activación de STING desencadena la fosforilación de IRF3 por medio de TBK1 lo que a su vez conduce a la producción de interferones de tipo I y la activación de genes estimulados por interferones (ISG); un requisito previo para la activación de la inmunidad innata y el inicio de la inmunidad adaptativa. La producción de interferones de tipo I constituye, por tanto, un puente clave entre la inmunidad innata y la adaptativa (Science 2013, 341, 903-906).

El exceso de IFN de tipo I puede ser perjudicial para el huésped e inducir autoinmunidad, por lo tanto, existen mecanismos de retroalimentación negativa que mantienen bajo control la activación inmunitaria mediada por IFN de tipo I. La exonucleasa I de reparación tres prima (TREX1) es una exonucleasa de ADN 3'-5' responsable de la eliminación de ADNmc y ADNbc expresados ectópicamente y, por lo tanto, es un represor clave de la vía cGAS/STING (PNAS 2015, 112, 5117-5122).

Los interferones de tipo I y las respuestas de citocinas proinflamatorias aguas abajo son fundamentales para el desarrollo de las respuestas inmunitarias y su eficacia. Los interferones de tipo I mejoran tanto la capacidad de las células dendríticas y los macrófagos para captar, procesar, presentar y presentar antígenos de manera cruzada a las células T, como su potencia para estimular células T al provocar la regulación positiva de las moléculas coestimuladoras tales como Cd 40, CD80 y CD86 (J. Exp. Med. 2011, 208, 2005-2016). Los interferones de tipo I también se unen a sus propios receptores y activan los genes sensibles a interferones que contribuyen a la activación de las células que intervienen en la inmunidad adaptativa (EMBO Rep. 2015, 16, 202-212).

Desde una perspectiva terapéutica, los interferones de tipo I y los compuestos que pueden inducir la producción de interferones de tipo I tienen potencial para el uso en el tratamiento de cánceres humanos (Nat. Rev Immunol. 2015, 15, 405-414). Los interferones pueden inhibir directamente la proliferación de células tumorales humanas. Además, los interferones de tipo I pueden mejorar la inmunidad antitumoral al desencadenar la activación de células del sistema inmunitario tanto innato como adaptativo. Es importante destacar que la actividad antitumoral del bloqueo de PD-1 requiere células T intratumorales preexistentes. Al convertir los tumores fríos en calientes y de esta manera provocar una inmunidad antitumoral espontánea, las terapias inductoras de IFN de tipo I tienen el potencial de expandir el grupo de pacientes sensibles a la terapia anti-PD1, así como también de mejorar la eficacia de la terapia anti-PD1.

Las terapias que están actualmente en desarrollo que inducen una respuesta de interferones de tipo I potente requieren administración focal o intratumoral para lograr un índice terapéutico aceptable. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos agentes con suministro sistémico y menor toxicidad para expandir el beneficio de las terapias inductoras de IFN de tipo I a pacientes sin lesiones periféricamente accesibles al tratamiento. Los estudios genéticos en seres humanos y ratones sugieren que la inhibición de TREX1 podría ser susceptible de una vía de suministro sistémico y, por lo tanto, los compuestos inhibidores de TREX1 podrían desempeñar un papel importante en el panorama de la terapia antitumoral. TREX1 es un determinante clave para la inmunogenicidad limitada de las células cancerosas sensibles al tratamiento con radiación [Trends in Cell Biol., 2017, 27 (8), 543-4; Nature Commun., 2017, 8, 15618]. TREX1 se induce por estrés genotóxico e interviene en la protección de células de glioma y melanoma frente a fármacos contra el cáncer [Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1833, 1832-43]. La terapia STACT-TREX1 muestra una sólida eficacia antitumoral en múltiples modelos de cáncer murino [Glickman y otros, Poster P235, 33rd Annual Meeting of Society for Immunotherapy of Cancer, Washington DC, Nov. 7-11, 2018]. Bruce y otros describen estudios estructurales y bioquímicos de la inhibición de TREX1 por metales [Protein Science, 2008, 17 (12), 2059-2069].

Las modalidades descritas en la presente descripción generalmente se refieren a agentes, compuestos, composiciones y compuestos para el uso en el tratamiento de enfermedades sensibles a inhibidores de TREX1. En esta invención se han sintetizado con éxito inhibidores de TREX1 selectivos sobre los inhibidores de TREX2.

En la presente descripción se proporcionan compuestos que tienen la fórmula I:

y sales farmacéuticamente aceptables y composiciones de los mismos, en donde A, R1, R2 y n son como se describe en la presente descripción. Los compuestos y composiciones descritos modulan TREX1 y son útiles en una variedad de aplicaciones terapéuticas tales como, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A ilustra los resultados de un experimento de atenuación génica de TREX1 en células tumorales B16F10 mediante el uso de CRISPR.

La Figura 1B ilustra que TREX1 atenuó la activación de la vía cGAS/STING en células tumorales B16F10.

La Figura 2: ilustra que los tumores en los que se había silenciado TREX tenían volúmenes más pequeños en comparación con los tumores de B16F10 originales.

La Figura 3: muestra que los tumores de B16F10 con desactivación génica de TREX1 exhibieron un aumento significativo en las células inmunitarias totales. Esto reflejó un aumento en el número de células T CD4 y CD8 infiltrantes de tumor, así como también de células dendríticas plasmacitoides (pDC).

La Figura 4: muestra la actividad de ciertos compuestos de la invención en la línea celular de carcinoma colorrectal humano HCT116.

Descripción detallada

1. Descripción general de los compuestos

En una primera modalidad, en la presente descripción se proporciona un compuesto de fórmula I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:

R1 es hidrógeno, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), cicloalquilo de 3 a 4 miembros, -O Rf, - SRf o -NR eRf; R2 es hidrógeno, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g) o cicloalquilo de 3 a 4 miembros;

X es un enlace, NR3, O, S o alquileno (R^g), en donde dicho alquileno (R^g) está opcionalmente sustituido con 1 a 2 grupos seleccionados de R4;

R3 es hidrógeno, alquilo (R^g), -C(O)Rd o -C(S)Rd;

R4 es halo, alquilo (R^g), fenilo, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHR₈, -NHC(S)NHR₈, -NHS(O)₂NHR₈, -C(S)Rb, S(O^Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, - C(S)ORd, -C(O)NHRe, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(s)Rd, -O R e, -SR e, -Oalquilo (C i-C ⁴)ORe o -N R eRf, en donde dicho fenilo para R4 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de halo, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), alcoxi (R^g) y haloalcoxi (Ci-C4);

El anillo A es fenilo, heteroarilo de 5 a 6 miembros, heterociclilo de 4 a 7 miembros o cicloalquilo de 3 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R5;

R5 es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), haloalcoxi (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb, -NHC(O)NHR₈, -NHC(S)NHR₈, -NHS(O^NHR₈, -C(S)Rb, S(O^Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NReRf, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -O R e, - SRe, -Oalquilo (R^g)ORe, -N R eRf, heteroarilo de 4 a 6 miembros, o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho fenilo para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, dicho alquilo (C₁-C₄) para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de ORh, -NRjRk, fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros, cada uno de dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros y heteroarilo de 4 a 6 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g;

cada R^g, Rh, Rj, Rk y Rm es independientemente hidrógeno, halo, alquilo (R^g), haloalquilo (Ci-C ⁴), alcoxi (C¹-C⁴), haloalcoxi (R^g), fenilo, -alquilfenilo (C₁-C₄), cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a 6 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, y en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para R^g, Rh, Rj y Rk está opcionalmente sustituido además con =O.

Cada Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf es independientemente hidrógeno, halo, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), alcoxi (R^g), haloalcoxi (R^g), fenilo, cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a 6 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde i) dicho alquilo (R^g) para Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, - ORh, -NR jRk; ii) cada uno de dicho fenilo, heteroarilo de 4 a 6 miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros para Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, y iii) dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf está opcionalmente sustituido además con =O.

2. Definiciones

Cuando se usa en conexión para describir un grupo químico que puede tener múltiples puntos de unión, un guión (-) designa el punto de unión de ese grupo a la variable a la que se define. Por ejemplo, -NHC(O)ORa y -NHC(S)ORa significan que el punto de unión de este grupo aparece en el átomo de nitrógeno.

Los términos "halo" y "halógeno" se refieren a un átomo seleccionado de flúor (fluoro, -F), cloro (cloro, -Cl), bromo (bromo, -Br) y yodo (yodo, -I).

El término "alquilo", cuando se usa solo o como parte de un resto más grande, tal como "haloalquilo" y similares, significa un radical hidrocarbonado saturado monovalente de cadena lineal o ramificada. A menos que se especifique de cualquier otra manera, un grupo alquilo típicamente tiene 1-4 átomos de carbono, es decir, alquilo (R^g).

El término "alquileno" se refiere a un hidrocarburo saturado divalente.

"Alcoxi" significa un radical alquilo unido a través de un átomo enlazador de oxígeno, representado por -O-alquilo. Por ejemplo, "alcoxi (R^g)" incluye metoxi, etoxi, proproxi y butoxi.

El término "haloalquilo" incluye grupos mono-, poli- y perhaloalquilo donde los halógenos se seleccionan independientemente de flúor, cloro, bromo y yodo.

"Haloalcoxi" es un grupo haloalquilo que está unido a otro resto por medio de un átomo de oxígeno tal como, por ejemplo, pero no se limitan a, -OCHCF²u -OCF³.

El término "heteroarilo" usado solo o como parte de un resto más grande se refiere a un radical aromático de 5 a 6 miembros que contiene 1-4 heteroátomos seleccionados de N, O y S. Heteroarilo incluye, por ejemplo, tienilo, furanilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, etc. Se entenderá que, cuando se especifica, los sustituyentes opcionales en un grupo heteroarilo pueden estar presentes en cualquier posición sustituible.

El término "heterociclilo" significa un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 4 a 7 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S. Un anillo heterociclilo puede estar unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable. Ejemplos de tales radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, terahidropiranilo, pirrolidinilo, piridinonilo, pirrolidonilo, piperidinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, morfolinilo, dihidrofuranilo, dihidropiranilo, dihidropiridinilo, tetrahidropiridinilo, dihidropirimidinilo, oxetanilo, azetidinilo y tetrahidropirimidinilo. También se entenderá que, cuando se especifique, los sustituyentes opcionales en un grupo heterociclilo pueden estar presentes en cualquier posición sustituible e incluyen, por ejemplo, la posición en la que está unido el heterociclilo (por ejemplo, en el caso de un heterociclilo opcionalmente sustituido o heterociclilo que está opcionalmente sustituido).

El término "cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico que tiene, a menos que se especifique de cualquier otra manera, de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo. Los grupos cicloalquilo monocíclicos incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, cicloheptenilo y ciclooctilo. Se entenderá que, cuando se especifique, los sustituyentes opcionales en un grupo cicloalquilo o cicloalifático pueden estar presentes en cualquier posición sustituible e incluyen, por ejemplo, la posición en la que está unido el grupo cicloalquilo o cicloalifático.

El término "TREX1" se refiere a la exonucleasa 1 de reparación tres prima o la exonucleasa 1 de reparación de ADN, que es una enzima que en seres humanos está codificada por el gen de TREX1. Mazur DJ, Perrino FW (Ago 1999). "Identification and expression of the TREX1 and TREX2 cDNA sequences encoding mammalian 3'— >5' exonucleases". J Biol Chem. 274 (28): 19655-60. doi:10.1074/jbc.274.28.19655. PMID 10391904; Hoss M, Robins P, Naven TJ, Pappin DJ, Sgouros J, Lindahl T (Ago 1999). "A human DNA editing enzyme homologous to the Escherichia coli DnaQ/MutD protein". EMBOJ. 18(13): 3868-75. doi:10.1093/emboj/18.13.3868. PMC 1171463. PMID 10393201. Este gen codifica la principal exonucleasa de ADN 3'->5' en células humanas. La proteína es una exonucleasa no procesativa que puede cumplir una función de corrección de lectura de una ADN polimerasa humana. También es un componente del complejo SET y actúa para degradar rápidamente los extremos 3' del ADN mellado durante la muerte celular mediada por la granzima A. Las células que carecen de TREX1 funcional muestran activación crónica de puntos de regulación de daños en el ADN y acumulación extranuclear de un ADN monocatenario endógeno sustrato. Parece que la proteína TREX1 normalmente actúa sobre una especie polinucleotídica de ADN monocatenario generada a partir del procesamiento de intermediarios de replicación anómalos. Esta acción de TREX1 atenúa la señalización de puntos de regulación de daños en el ADN y evita la activación inmunitaria patológica. TREX1 metaboliza el ADN monocatenario retrotranscrito de retroelementos endógenos en función de la vigilancia antiviral intrínseca de la célula, lo que da como resultado una respuesta de IFN de tipo I potente. TREX1 ayuda al VIH-1 a evadir la detección citosólica al degradar el ADNc viral en el citoplasma.

El término "TREX2" se refiere a la exonucleasa 2 de reparación tres prima que es una enzima que en seres humanos está codificada por el gen TREX2. Este gen codifica una proteína nuclear con actividad exonucleasa de 3' a 5'. La proteína codificada participa en la reparación de roturas de ADN bicatenarias y puede interactuar con la ADN polimerasa delta. Las enzimas con esta actividad intervienen en la replicación, reparación y recombinación del ADN. TREX2 es una exonucleasa 3' que se expresa predominantemente en queratinocitos y contribuye a la respuesta epidérmica al daño en el ADN inducido por UVB. Las propiedades bioquímicas y estructurales de TREX2 son similares a las de TREX1, aunque no son idénticas. Las dos proteínas comparten una estructura dimérica y pueden procesar ADNmc y ADNbc sustratos in vitro con valores de kcat casi idénticos. Sin embargo, varias características relacionadas con la cinética enzimática, los dominios estructurales y la distribución subcelular distinguen a TREX2 de TREX1. TREX2 presenta una afinidad 10 veces menor por los ^aDⁿsustratos in vitro en comparación con TREX1. A diferencia de TREX1, TREX2 carece de un dominio cOOH-terminal que pueda mediar las interacciones proteína-proteína. TREX2 se localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo, mientras que TREX1 se encuentra en el retículo endoplásmico y se moviliza al núcleo durante la muerte celular mediada por la granzima A o después del daño en el ADN.

Los términos "sujeto" y "paciente" pueden usarse indistintamente, y significan un mamífero que necesita tratamiento, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, ovejas, cabras y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares). Típicamente, el sujeto es un ser humano que necesita tratamiento.

El término "inhibir", "inhibición" o "que inhibe" incluye una disminución en la actividad de referencia de una actividad o proceso biológico.

Como se usa en la presente descripción, el término "tratamiento", "tratar" y "que trata" se refieren a revertir, aliviar, retrasar el inicio de, o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno, o uno o más de sus síntomas, como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas, es decir, tratamiento terapéutico. En otros aspectos, el tratamiento puede administrarse en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes del inicio de los síntomas (por ejemplo, a la luz de antecedentes de síntomas y/o a la luz de la exposición a un organismo particular u otros factores de susceptibilidad), es decir, tratamiento profiláctico. El tratamiento también puede continuarse después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo, para retrasar su reaparición.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Los portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones descritas en la presente descripción, incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Para el uso en medicamentos, las sales de los compuestos descritos en la presente descripción se refieren a "sales farmacéuticamente aceptables" no tóxicas. Las formas de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales ácidas/aniónicas o básicas/catiónicas farmacéuticamente aceptables. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, sales de ácidos inorgánicos (tales como ácido clorhídrico, ácidos bromhídrico, fosfórico, nítrico y sulfúrico) y de ácidos orgánicos (tales como ácido acético, ácidos bencenosulfónico, benzoico, metanosulfónico y p toluenosulfónico). Los compuestos de las presentes enseñanzas con grupos ácidos tales como ácidos carboxílicos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con base(s) farmacéuticamente aceptable(s). Las sales básicas farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, por ejemplo, sales de amonio, sales de metales alcalinos (tales como sales de sodio y potasio) y sales de metales alcalinotérreos (tales como sales de magnesio y calcio). Los compuestos con un grupo amonio cuaternario también contienen un contraanión tal como cloruro, bromuro, yoduro, acetato, perclorato y similares. Otros ejemplos de tales sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como el ácido glutámico.

El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto descrito en la presente descripción que provocará una respuesta biológica o médica beneficiosa o deseada de un sujeto, por ejemplo, una dosis de entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/día.

3.Compuestos

En una segunda modalidad, en la presente descripción se proporciona un compuesto de fórmula II:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables son como se describió anteriormente en la primera modalidad.

En una tercera modalidad, R2 es alquilo (R^g) en los compuestos de fórmula I o II.

En una cuarta modalidad, en la presente descripción se proporciona un compuesto de fórmula III:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables son como se describió anteriormente en la primera, segunda o tercera modalidad.

En una quinta modalidad, el anillo A en los compuestos de fórmula I, II o III es fenilo, piridilo, pirazolilo, ciclopropilo, ciclobutilo, azetidinilo o piperidinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con uno o dos R5, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera o cuarta modalidad. Alternativamente, como parte de una quinta modalidad, el anillo A en los compuestos de fórmula I, II o III es triazolilo, pirrolidinilo, diazepanilo o piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con uno o dos R5, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera o cuarta modalidad.

En una sexta modalidad, R5 en los compuestos de fórmula I, II o III es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), haloalcoxi (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)²Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -O R e, -Oalquilo (C i-C ⁴)ORe, -N R eRf, heteroarilo de 4 a 6 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho fenilo para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, dicho alquilo (R^g) para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de -O R h, -NR jRk, fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros, cada uno de dicho heteroarilo de 4 a 6 miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g; Ra es alquilo (R^g) opcionalmente sustituido con fenilo; Rb es alquilo (C¹-C⁴), fenilo, heteroarilo de 5 a 6 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho alquilo (R^g) está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, -O R h y -NRjRk, en donde cada uno de dicho fenilo, heteroarilo de 5 a 6 miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, y en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente sustituido además con =O; cada Rc es independientemente fenilo o alquilo (R^g); cada Rd es hidrógeno o alquilo (R^g); cada Re es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g) opcionalmente sustituido con ORh; cada Rf es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g), fenilo cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a 6 miembros o heterociclilo de 5 a 6 miembros, en donde cada uno de dicho fenilo, cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a 6 miembros y heterociclilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con R^g; cada R^ges independientemente alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), alcoxi (R^g), haloalcoxi (R^g) o halo; cada Rh es hidrógeno, alquilo (R^g) o —alquilfenilo (R^g); cada Rj es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g); cada Rk es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g) o cicloalquilo de 3 a 4 miembros; y cada Rm es alquilo (R^g), en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta o quinta modalidad.

En una séptima modalidad, R5 en los compuestos de fórmula I, II o III es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)²Rc, -C(O)ORd, - C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -Oalquilo (R^g)ORe, -N R eRf, heteroarilo de 4 a 6 miembros o heterociclilo de 5 a 6 miembros, en donde dicho alquilo (R^g) para R5 está opcionalmente sustituido con - ORh, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros, cada uno de dicho heteroarilo de 4 a 6 miembros y heterociclilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta modalidad.

En una octava modalidad, R5 en los compuestos de fórmula I, II o III es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)²Rc, -C(O)ORd, - C(O)NReRf, -NHC(O)Rd u -Oalquilo (R^g)ORe, -N R eRf, morfolinilo, piperazinilo o pirazolilo, en donde cada uno de dicho morfolinilo, piperazinilo y pirazolilo está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, dicho alquilo (R^g) para R5 está opcionalmente sustituido con -ORh, fenilo, pirazolilo, pirimidinilo o piridinilo, y en donde cada uno de dicho fenilo, pirazolilo, pirimidinilo y piridinilo de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta o séptima modalidad.

En una novena modalidad, cada Rf en los compuestos de fórmula I, II o III es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g), fenilo pirazolilo, piridinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, en donde cada uno de dicho fenilo pirazolilo, piridinilo, tetrahidropiranilo, y piperidinilo está opcionalmente e independientemente sustituido con alquilo (R^g), en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima u octava modalidad.

En una décima modalidad, cada R^gen los compuestos de fórmula I, II o III es independientemente alquilo (R^g), alcoxi (R^g) o halo, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava o novena modalidad.

En una decimoprimera modalidad, Rb en los compuestos de fórmula I, II o III es alquilo (R^g), fenilo, heteroarilo de 5 a 6 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a 6 miembros para Rb está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de halo y alcoxi (R^g), en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para Rb está opcionalmente sustituido con =O, y en donde dicho alquilo (R^g) para Rb está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, -O R h y - NRjRk, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena o décima modalidad.

En una decimosegunda modalidad, cada Rk en los compuestos de fórmula I, II o III es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g), en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima o decimoprimera modalidad.

En una decimotercera modalidad, Rb en los compuestos de fórmula I, II o III es alquilo (R^g), fenilo, piridinilo, pirazolilo, pirimidinilo o piperidinilo, en donde cada uno de dicho fenilo, piridinilo, pirazolilo y pirimidinilo para Rb está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de halo y alcoxi (R^g), en donde dicho alquilo (R^g) para Rb está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, OH y NMe², y en donde dicho piperidinilo para Rb está opcionalmente sustituido con =O, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera o decimosegunda modalidad.

En una decimocuarta modalidad, R3 en los compuestos de fórmula I, II o III es hidrógeno, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda o decimotercera modalidad

En una decimoquinta modalidad, R4 en los compuestos de fórmula I, II o III es fenilo o -NHC(O)ORa, en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda, decimotercera o decimocuarta modalidad.

En una decimosexta modalidad, X en los compuestos de fórmula I, II o III es un enlace o CH², en donde las variables restantes son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, decimoprimera, decimosegunda o decimotercera modalidad.

En la presente descripción se proporcionan además composiciones farmacéuticas que comprenden 1) un compuesto que tiene la fórmula I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables son como se describió anteriormente para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima o decimoprimera modalidad; y 2) un portador farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos que tienen la fórmula I se describen además en la Ejemplificación y se incluyen en la presente descripción. Se incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, así como también las formas neutras.

4. Usos, formulación y administración

Los compuestos y composiciones descritos en la presente descripción son generalmente útiles para modular la actividad de TREX1. En algunos aspectos, los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción inhiben la actividad de TREX1.

En algunos aspectos, los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción son útiles en el tratamiento de un trastorno asociado con la función de TREX1. Por tanto, en la presente descripción se proporcionan compuestos para el uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la función de TREX1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un compuesto descrito o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. También se proporciona el uso de un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un compuesto descrito o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con la función de TREX1. También se proporciona un compuesto descrito en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un compuesto descrito o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento de un trastorno asociado con TREX1.

En algunos aspectos, los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción son útiles en el tratamiento del cáncer.

En algunos aspectos, el cáncer tratado con los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción se selecciona de cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, leucemia, cáncer de páncreas, melanoma, melanoma múltiple, cáncer de cerebro, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, leucemia y cáncer de mama.

En algunos aspectos, el cáncer tratado con los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción se selecciona de cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal y melanoma. En ciertos aspectos, una composición farmacéutica descrita en la presente descripción se formula para la administración a un paciente que necesita dicha composición. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante pulverización por inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por medio de un depósito implantado. El término parenteral como se usa en la presente descripción incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intrasternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión. En algunas modalidades, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas que se conocen en la técnica mediante el uso de agentes humectantes o dispersantes adecuados y agentes de suspensión.

En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas se administran por vía oral.

La dosis y el régimen de tratamiento específicos para cualquier paciente en particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, y el juicio del médico tratante y la gravedad de la enfermedad particular que está siendo tratada. La cantidad de un compuesto descrito en la presente descripción en la composición también dependerá del compuesto particular en la composición farmacéutica.

Ejemplificación

Síntesis química

Los ejemplos representativos que siguen están destinados a ayudar a ilustrar la presente descripción y no están destinados a limitar el alcance de la invención ni deben interpretarse como tales.

Esquema de síntesis general

2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de 3-(3-bromo-5-metilfenil)-5-(2-m etoxi-2-oxoetil)-2-metil-2,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-5-carboxilato de metilo

A una solución agitada de SM (5,16 g, 26,341 mmol, 2 equiv), clorhidrato de N-metilhidroxilamina (1,10 g, 13,170 mmol, 1,00 equiv) en H₂O (25,00 ml), EtOH (25,00 ml) se añadió Na₂CO₃(0,837 g, 7,902 mmol, 0,6 equiv) en porciones a temperatura ambiente. La solución resultante se agitó durante 2 h a 80 °C. Hasta que la mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se añadió gota a gota 1,4-dimetil but-2-inodioato (2,06 g, 14,488 mmol, 1,1 equiv). Después, la mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h a temperatura ambiente. La solución resultante se extrajo con 3x30 ml de acetato de etilo y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se concentraron al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice con acetato de etilo/éterde petróleo (1:5). Esto dio como resultado 1,3 g de A1 (25 % de rendimiento) como un aceite amarillo claro. ESI-MS m/z = 385,0 [M+H]+. MWcalculado: 384,0. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,67 (t, J = 1,8 Hz, 1H), 7,49 (s, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,45 (d, J = 16,6 Hz, 1H), 3,19 (s, 3H), 3,07 (d, J = 16,6 Hz, 1H), 2,38 (d, J = 0,8 Hz, 3H).

Los siguientes intermediarios se sintetizaron mediante el uso de condiciones similares a las descritas en la etapa anterior junto con los materiales de partida apropiados.

Tabla 1

Etapa 2: Síntesis de 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo B1

En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se colocó 3—(3—bromo—5—metilfenil)—5—(2—metoxi—2—oxoetil)—2—metil—2,5— dihidro-1,2,4-oxadiazol-5-carboxilato de metilo (1,00 g, 2,596 mmol, 1,00 equiv), xileno (20,00 ml). La solución resultante se agitó durante 5 h a 145 °C. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración, se lavaron con hexano. El sólido se secó a presión reducida. Esto dio como resultado 210 mg de 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo (22 % de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS m/z = 353,0 [M+H]+. MW calculado: 352,0

Tabla 2

Etapa 3: Síntesis de 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (Ejemplo 1)

En un tubo sellado de 8 ml se colocó 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo (100,00 mg, 0,283 mmol, 1,00 equiv), THF (2,50 ml), 1,2-oxazol-4-amina (71,42 mg, 0,849 mmol, 3,00 equiv). A esto le siguió la adición gota a gota de una solución de iPrMgCl (2 M, 0,64 ml, 4,50 equiv) con agitación a -70 grados C. La solución resultante se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Después la reacción se inactivó mediante la adición de 2 ml de NH⁴Cl saturado (ac.). El valor de pH de la solución se ajustó a 3 con HCl (4 M). La solución resultante se extrajo con 3x5 ml de diclorometano y las capas orgánicas se combinaron y se concentraron al vacío. El producto crudo se purificó por HPLC preparativa (CH³CN/H²O/FA). Esto dio como resultado 32,9 mg de 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (28 % de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS m/z = 405,0 [M+H]+. MW calculado: 404,0. 1H RMN (300 MHz, DMSO-cfe) 511,82 (s, 1H), 10,95 (s, 1H), 9,31 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 3,30 (s, 3H), 2,39 (s, 3H).

Los siguientes ejemplos se sintetizaron mediante el uso de condiciones similares a las descritas en la etapa anterior junto con los materiales de partida apropiados.

Tabla 3

Síntesis de 5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-fenil-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (Ejemplo 8).

Se disolvieron 5-hidroxi-1-metil-6-oxo-2-fenil-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo (200 mg, 0,77 mmol, 1 equiv) e isoxazol-4-amina (0,096 g, 1,15 mmol, 1,5 equiv) en tolueno (1 ml) y la mezcla se enfrió hasta 0 °C. A esto se le añadió gota a gota trimetilaluminio 2 M en tolueno (0,768 ml, 1,53 mmol, 2,0 equiv) a 0 °C. Después la mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante 2 h y después se inactivó con una solución saturada de bicarbonato de sodio (0,2 ml) y se le añadió acetato de etilo (10 ml). Después la mezcla de reacción se secó con Na₂SO₄anhidro y se filtró. El sólido se lavó con acetato de etilo (3 x 10 ml) y la capa orgánica combinada se concentró a presión reducida. El producto crudo se purificó por HPLC de fase inversa para dar 5—hidroxi—N—(isoxazol—4—il)—1—metil—6—oxo—2—fenil— 1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida, 8 (25 mg, 15 %). ESI-MS m/z = 313,2 [M+H]+. MWcalculado: 312,29. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 59,13 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 7,42-7,50 (m, 5H), 3,22 (s, 3H).

Esquema: Síntesis de 2-cloro-N-(isoxazol-4-il)-5-metoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (C)

Etapa 1: Síntesis de 2-metoxi-3-oxobutanodioato de 1,4—dietilo (1)

En un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 1000 ml, purgado y mantenido con una atmósfera inerte de nitrógeno, se colocó etanol (600,0 ml), etanolato de sodio (31,7 g, 0,470 mmol, 1,10 equiv), se añadió oxalato de etilo (68,00 g, 465,6 mmol, 1,10 equiv) a temperatura ambiente. A esto le siguió la adición gota a gota de 2-metoxiacetato de etilo (50,00 g, 423,3 mmol, 1,00 equiv) con agitación a temperatura ambiente. La solución resultante se agitó durante toda 1 noche a 35 °C. La mezcla resultante se concentró al vacío para eliminar la mayor parte del etanol. El valor de pH de la solución se ajustó a 3 con cloruro de hidrógeno (1 mol/l) a 0 °C. La solución resultante se extrajo con 4x500 ml de acetato de etilo, se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. Esto dio como resultado 90 g (crudo) de 2-metoxi-3-oxobutanodioato de 1,4—dietilo (1) como un aceite marrón.

Etapa 2: Síntesis de 2-metoxi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioxoimidazolidin-4-iliden]acetato de etilo (2)

En un matraz de fondo redondo de 2000 ml, se colocó 2-metoxi-3-oxobutanodioato de 1,4—dietilo (1) (90,00 g, 412,5 mmol, 1,00 equiv), metilurea (30,60 g, 412,5 mmol, 1,00 equiv), ácido acético (1200,0 ml), cloruro de hidrógeno (400,0 ml, gas, 4 mol en dioxano). La solución resultante se agitó durante 3 h a 105 °C. La mezcla resultante se concentró al vacío. La mezcla resultante se lavó con 1 x500 ml de hexano. Esto dio como resultado 90 g (crudo) de 2-metoxi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioxoimidazolidin-4-iliden]acetato de etilo (2) como un sólido marrón. 1H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 88,75 (s, 1H), 7,47 (s, 0,4H), 5,09 (s, 2H), 4,51-4,30 (m, 3H), 3,85 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 3,07 (s, 1H), 2,14 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 1,45-1,42 (m, 2H), 1,42-1,37 (m, 3H).

Etapa 3. Síntesis de ácido 2-hidroxi-5-metoxi-1-metil-6-oxopirimidina-4-carboxílico (3)

En un matraz de fondo redondo de 2000 ml, se colocó 2-metoxi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioxoim idazolidin-4-iliden]acetato de etilo (2) (80,00 g, 350,6 mmol, 1,00 equiv), hidróxido de potasio (1 M en agua) (1400,0 ml). La solución resultante se agitó durante 3 h a 105 °C. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0 °C con un baño de agua/hielo. El valor de pH de la solución se ajustó a 3 con cloruro de hidrógeno (12 mol/l) a 0 °C, los sólidos se recogieron por filtración y el precipitado se secó al vacío. Esto dio como resultado 40 g de ácido 2-hidroxi-5-m etoxi-1-m etil-6-oxopirimidina-4-carboxílico (3) (rendimiento 57 %) como un sólido blanco. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 814,35 (s, 1H), 10,91 (s, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,14 (s, 3H).

Etapa 4. Síntesis de 2-hidroxi-5-metoxi-1-metil-6-oxopirimidina-4-carboxilato de etilo (4)

En un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 1000 ml, purgado y mantenido con una atmósfera inerte de argón, se colocó ácido 2-hidroxi-5-metoxi-1-metil-6-oxopirimidina-4-carboxílico (3) (20 g, 0,10 mmol, 1,00 equiv), etanol (400,0 ml). A esto le siguió la adición gota a gota de cloruro de acetilo (117,7 g, 1,500 mmol, 15,00 equiv) con agitación a 0 °C. La solución resultante se calentó a reflujo durante toda 1 noche. La mezcla de reacción se enfrió con un baño de agua/hielo. Los sólidos se recogieron por filtración. Esto dio como resultado 16 g de 2-hidroxi-5-m etoxi-1-m etil-6-oxopirimidina-4-carboxilato de etilo (4) (rendimiento: 70 %) como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,08 (s, 1H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,15 (s, 3H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

Etapa 5. Síntesis de 2-cloro-5-metoxi-1-metil-6-oxopirim idina-4-carboxilato de etilo (5)

En un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 1 l, purgado y mantenido con una atmósfera inerte de argón, se colocó 2-hidroxi-5-metoxi-1-metil-6-oxopirimidina-4-carboxilato de etilo (4) (16,0 g, 70,1 mmol, 1,00 equiv), dimetilanilina (1,20 g, 98,2 mmol, 1,40 equiv), tricloruro de fosforilo (320,0 ml). La solución resultante se agitó durante toda 1 noche a 100 °C. La mezcla resultante se concentró al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice con acetato de etilo/éter de petróleo (1/10-1/4). Esto dio como resultado 13,3 g de 2-cloro-5-m etoxi-1-metil-6-oxopirim idina-4-carboxilato de etilo (5) (rendimiento 77,0 %) como un sólido amarillo. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 84,32 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,54 (s, 3H), 1,30 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

Etapa 6. Síntesis de 2-cloro-5-metoxi-1-metil-N-(1,2-oxazol-4-il)-6-oxopirim idina-4-carboxamida (6)

A una solución agitada de 2-cloro-5-metoxi-1-metil-6-oxopirim idina-4-carboxilato de etilo (5) (1,00 g, 4,05 mmol, 1,00 equiv) y 1,2-oxazol-4-amina (340,9 mg, 4,050 mmol, 1,00 equiv) en tolueno (15,0 ml) se añadió trimetilaluminio (2 mol en tolueno) (4,1 ml, 8,10 mmol, 2,00 equiv) a temperatura ambiente en atmósfera de argón. La solución resultante se agitó con radiación de microondas durante 15 min a 80 °C. La mezcla de reacción se inactivó con agua/hielo a 0 °C. La solución resultante se extrajo con 3x40 ml de acetato de etilo, las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1x30 ml), se secaron con sulfato de sodio anhidro y se concentraron al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice con acetato de etilo/éterde petróleo (1/10-1/1). Esto dio como resultado 650 mg de 2-cloro-5-metoxi-1-metil-N-(1,2-oxazol-4-il)-6-oxopirim idina-4-carboxamida (6) (rendimiento 53,0 %) como un sólido amarillo claro. ESI-MS m/z = 285,2 [M+H]+. MW calculado: 284,21H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 810,84 (s, 1H), 9,28 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,62 (s, 3H).

Los siguientes ejemplos e intermediarios se sintetizaron mediante el uso de condiciones similares a las descritas en la etapa anterior, junto con los materiales de partida apropiados.

Tabla 4

El siguiente intermediario se sintetizó mediante el uso de condiciones similares a las descritas anteriormente junto con los materiales de partida apropiados.

Tabla 5

Síntesis de 2-(3-bromo-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (Ejemplo 15).

En un vial de 40 ml se añadieron 2-(3-bromo-2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)fenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida (300 mg, 0,531 mmol, 1,0 equiv) y THF (6,0 ml) a temperatura ambiente. A la mezcla anterior se añadió gota a gota T^bAF(1 M)/CH^sCOOH = 1:1 (1,20 ml, 2,0 equiv) durante 2 min a 0 °C. La mezcla resultante se agitó durante 5 h adicionales a temperatura ambiente. La mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo (1 x12 ml). La fase acuosa se extrajo adicionalmente con acetato de etilo (3 x10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera ( 2 x 7 ml), se secaron con sulfato de sodio anhidro. Después de la filtración, el filtrado se concentró a presión reducida. El producto crudo (300 mg) se purificó por HPLC preparativa (acetonitrilo/ácido fórmico/agua) para proporcionar 70 mg de 2-(3-bromo-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida, 15, con un rendimiento del 29 % como un sólido blanco. ESI-MS m/z = 451,0 [M+H]+. MW calculado: 450,0. 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 5 11,87 (s, 1H), 10,99 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 8,86 (s, 1H), 7,85 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,28 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,63 (t, J =5,4 Hz, 1H), 4,01-3,97 (m, 1H), 3,76-3,70 (m, 1H), 3,52-3,39 (m, 2H), 3,23 (s, 3H).

Tabla 6

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Síntesis de terc-butil-3-(5-etoxi-4-(isoxazol-4-ilcarbamoil)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idin-2-il)piperidina-1-carboxilato (Isómero A1):

Etapa-1: 2-(1-(terc-butoxicarbonil)-1,2,5,6-tetrahidropiridin-3-il)-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de etilo:

Una mezcla de 2-cloro-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de etilo (2 g, 7,67 mmol), 5 -(4,4,5,5)-tetrametil-1,3,2-dioxaborlan-2-il)-3,6-dihidropiridin-1(2H)-carboxilato de terc-butilo (2,96 g, 9,59 mmol) y carbonato de sodio (1,62 g, 15,34 mmol) en una solución de dioxano/agua (4:1, 50 ml) se desgasificó durante 20 minutos con gas argón. Se añadió PdCl2(dppf) (0,561 g, 0,76 mmol) y se continuó la desgasificación durante otros 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 4 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (30 ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna para obtener el compuesto del título (2,57 g, 82 %) como un sólido. LCMS: calculado 408,3; ESI-MS m/z = 408,61 [M+H]+1H RMN (400 MHz, DMSO-da): 81,23-1,31 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 2,25-2,40 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 3,45-3,50 (m, 2H), 4,05-4,10 (m, 2H), 4,16 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 4,31 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 6,26 (bs, 1H).

Etapa-2: Etil-2-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-3-il)-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato:

A una mezcla de 2-(1-(terc-butoxicarbonil)-1,2,5,6-tetrahidropiridin-3-il)-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxilato de etilo (2,57 g, 6,30 mmol) que se disuelve y se agita en una solución de metanol:acetato de etilo (1:3, 54 ml) se añadió Pd al 10 %/C (0,67 g, con 50 % de humedad). La reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de gas hidrógeno durante 3,5 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celite y se lavó con acetato de etilo (2 x 50 ml). El filtrado se concentró a presión reducida. El producto crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna para dar el compuesto del título (2,35 g, 91 %). LCMS: calculado 409,3, ESI-MS m/z = 410,4 [M+H]+

Etapa-3: ácido 2-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-3-il)-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxílico:

A una solución agitada de 2-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-3-il)-5-etoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de etilo (1,9 g, 4,64 mmol) en una mezcla de metanol:THF:HzO (1:1:1, 30 ml) se añadió NaOH (0,222 g, 5,56 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de completada la reacción, la reacción se concentró al vacío. La mezcla de reacción se disolvió en agua (10 ml) y se acidificó con HCl 1 N (pH-6). El producto se extrajo con metanol al 10 % en diclorometano (2 x 30 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (30 ml) y se evaporó al vacío para obtener el compuesto del título crudo (1,67 g, 94 %) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS: calculado 381,3; ESI-MS m/z = 382,5 [M+H]+

Etapa 4: ferc-butil-3-(5-etoxi-4-(isoxazol-4-ilcarbamoil)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idin-2-il)piperidina-1-carboxilato:

A una solución agitada de ácido 2-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-3-il)-5-etoxi-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxílico (1,67 g, 4,37 mmol) en DMF seco (16 ml) se añadió HATU (2,49 g, 6,56 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después se añadieron isoxazol-4-amina (0,441 g, 5,25 mmol) en DMF (0,5 ml) y DIPEa (1,5 ml, 8,75 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml). La capa orgánica combinada se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna Combiflash para dar el compuesto del título (1,67 g, 85 %) como una mezcla racémica. La resolución quiral del compuesto racémico puro (1,2 g) se realizó mediante el uso de HPLC preparativa quiral para dar 500 mg de cada uno de los enantiómeros. LCMS: Calculado 447,3; ESI-MS m/z = 448,60 [M+H]+HPLC quiral: CHIRALPAK AD-H; metanol al 30 % en COz líquido+DEA al 0,1 %. FR-1 (Isómero-A1): Rt= 7,66 min; FR-2 (Isómero-A2): Rt= 8,81 min; A1: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 81,21-1,25 (m, 3H), 1,41 (s, 9H), 1,46-1,57 (m, 2H), 1,71-1,74 (m, 2H), 2,02-2,04 (m, 1H), 2,76-2,98 (m, 2H), 2,99-3,15 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,85-4,15 (m, 1H), 4,10-4,15 (m, 2H), 8,78 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 10,56 (s, 1H). A2: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 8 1,21-1,29 (m, 3H), 1,41 (s, 9H), 1,46-1,57 (m, 2H), 1,71-1,74 (m, 2H), 2,02-2,04 (m, 1H), 2,78-2,98 (m, 2H), 2,99 3,15 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,85-4,15 (m, 1H), 4,10-4,15 (m, 2H), 8,78 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 10,57 (s, 1H).

Síntesis de 1-((2-((R)-1-(3,4-diclorobenzoil)piperidin-3-il)-4-(isoxazol-4-ilcarbamoil)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-il)oxi)etilcarbonato de etilo. (EJEMPLO 131)

Etapa-1: sal de clorhidrato de (R)-5-etox¡-N-(¡soxazol-4-¡l)-1-met¡l-6-oxo-2-(p¡per¡d¡n-3-¡l)-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida:

A una soluc¡ón ag¡tada de (R)-3-(5-etox¡-4-(¡soxazol-4-¡lcarbamo¡l)-1-met¡l-6-oxo-1,6-d¡h¡drop¡r¡m¡d¡n-2-¡l)p¡per¡d¡na-1-carbox¡lato de terc-but¡lo (0,20 g, 0,44 mmol) en mezcla de d¡clorometano (1,32 ml) y metanol (0,66 ml) se añad¡ó gota a gota HCl 4 M en d¡oxano (1 ml) a 0 °C. La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 1 h y se calentó a 40 °C durante 10 m¡n. La mezcla de reacc¡ón se concentró a sequedad y se dest¡ló azeotróp¡camente dos veces con metanol para proporc¡onar el compuesto del título (0,17 g, 99 %) como un sól¡do, que se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. LCMS: calculado 347,3, ESI-MS m/z = 348,48 [M H]+ Etapa-2: (R)-2-(1-(3,4-d¡clorobenzo¡l)p¡per¡d¡n-3-¡l)-5-etox¡-N-(¡soxazol-4-¡l)-1-met¡l-6-oxo-1,6-d¡h¡drop¡r¡m¡d¡na-4-carboxam¡da:

A una soluc¡ón ag¡tada de ác¡do 3,4-d¡clorobenzo¡co (0,101 g, 0,53 mmol) en DMF seco (1,7 ml) se añad¡ó HATU (0,252 g, 0,66 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 1 h. Después se añad¡eron sal de clorh¡drato de (R)-5-etox¡-N-(¡soxazol-4-¡l)-1-met¡l-6-oxo-2-(p¡per¡d¡n-3-¡l)-1,6-d¡h¡drop¡r¡m¡d¡na-4-carboxam¡da (0,170 g, 0,44 mmol) y DIPEA (0,25 ml, 1,33 mmol) a temperatura amb¡ente y la mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante 3 h. Una vez completada la reacc¡ón se d¡luyó con agua (15 ml) y se extrajo con acetato de et¡lo (2 x 20 ml). La capa orgán¡ca comb¡nada se lavó con b¡carbonato de sod¡o saturado frío (20 ml), se secó con Na₂SO₄anh¡dro y se concentró a pres¡ón reduc¡da. El producto crudo se pur¡f¡có por cromatografía en columna para dar un compuesto del título (0,21 g, 89 %) como un sól¡do. LCMS: Calculado 519,3, ESI-MS m/z = 520,27 [M+H] . 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 1,18-1,32 (m, 3H), 1,55-1,70 (m, 2H), 1,72-1,85 (m, 2H), 2,07 2,10 (m, 1H), 3,15-3,25 (m, 2H), 3,58 (s, 3H), 3,66-3,70 (m, 1H), 4,07-4,12 (m, 2H), 4,47-4,49 (m, 1H), 7,40-7,42(m, 1H), 7,70-7,73 (m, 2H), 8,74 (s, 1H,), 9,27 (s, 1H), 10,52 (s, 1H).

Etapa-3: (R)-2-(1-(3,4-d¡clorobenzo¡l)p¡per¡d¡n-3-¡l)-5-h¡drox¡-N-(¡soxazol-4-¡l)-1-met¡l-6-oxo-1,6-d¡h¡drop¡r¡m¡d¡na-4-carboxam¡da:

Una soluc¡ón ag¡tada de (R)-2-(1-(3,4-d¡clorobenzo¡l)p¡per¡d¡n-3-¡l)-5-etox¡-N-(¡soxazol-4-¡l)-1-met¡l-6-oxo-1,6-d¡h¡drop¡r¡m¡d¡na-4-carboxam¡da (0,608 g, 1,16 mmol) se d¡solv¡ó en d¡clorometano (36 ml). La soluc¡ón resultante se enfrió hasta 0 °C y se añad¡ó gota a gota BBr31 M en d¡clorometano (4,67 ml, 4,67 mmol). La mezcla de reacc¡ón se calentó hasta temperatura amb¡ente y se ag¡tó durante 5 h. Una vez completada, la mezcla de reacc¡ón se concentró y se dest¡ló azeotróp¡camente con d¡clorometano ( 2x 6 ml). El res¡duo se enfr¡ó hasta 0 °C y se añad¡ó metanol (5 ml) lentamente. La mezcla de reacc¡ón se concentró al vacío a sequedad. El res¡duo se dest¡ló azeotróp¡camente con metanol ( 2x 6 ml) para dar el compuesto crudo. El compuesto crudo se cargó en cel¡te y se pur¡f¡có por cromatografía en columna de fase ¡nversa med¡ante el uso de aceton¡tr¡lo y ác¡do fórm¡co al 0,1 % en agua para dar el Ejemplo 131 (0,246 g, 42 %). LCMS: Calculado 491,3, ESI-MS m/z = 492,3 [M+H]+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 1,44-1,62 (m, 2H), 1,80-1,95 (m, 2H), 2,07-2,10 (m, 1H), 3,15-3,25 (m, 2H), 3,57 (s, 3H), 3,60-3,70 (m, 1H), 4,34-4,52 (m, 1H), 7,40-7,42(m, 1H), 7,70-7,74 (m, 2H), 8,84-8,90 (m, 1H,), 9,30 (s, 1H), 10,42-10,55 (m, 1H), 11,48 (s, 1H).

Los s¡gu¡entes ejemplos e ¡ntermed¡ar¡os se s¡ntet¡zaron med¡ante el uso de cond¡c¡ones s¡m¡lares a las descritas en la etapa anterior, junto con los materiales de part¡da aprop¡ados.

Tabla 7

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Síntesis de 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida. (EJEMPLO 130)

Etapa 1: 3-ciano-3-metilpiperidina-1-carboxilato de terc—butilo:

A una solución agitada de 3-cianopiperidina-1-carboxilato de terc—butilo (5,0 g, 24 mmol) en THF seco (100 ml) se añadió LiHMDS (30,9 ml, 1 M en ^tHF, 30,9 mmol) a -78 °C. La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 30 min. Después se añadió Mel (2,22 ml, 35,7 mmol) a la misma temperatura. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se vertió en una mezcla de agua fría con hielo (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (50 ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto del título puro (3,5 g, 65 %).1H RMN (400 MHz, DMSO-da): 81,35 (s, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,66-1,70 (m, 1H), 1,78-1,81 (m, 2H), 1,87-2,10 (m, 1H), 2,80 (s, 2H), 3,90-4,20 (m, 2H).

Etapa-2: Sal de TFA de 3-metilpiperidina-3-carbonitrilo.

A una solución agitada de 3-ciano-3-metilpiperidina-1-carboxilato de terc-butilo (3,5 g, 15,6 mmol) en diclorometano (70 ml) se añadió gota a gota TFA (12,7 ml) a 0 °C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar el compuesto crudo. El compuesto crudo se trituró con éter dietílico para proporcionar el compuesto del título (3,0 g, 81 %) como una sal de TFA. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 81,40 (s, 3H), 1,63-1,69 (m, 2H), 1,76-1,81 (m, 1H), 1,91-2,06 (m, 1H), 2,82-2,89 (m, 1H), 3,01-3,09 ( m, 1H), 3,19-3,22 (m, 1H), 3,56-3,59 (m, 1H), 9,20 (bs, 1H).

Etapa-3: 1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidina-3-carbonitrilo.

A una solución agitada de ácido 3,4-diclorobenzoico (2,88 g, 15,1 mmol) en DMF seco (15 ml) se le añadió HATU (7,18 g, 18,9 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadió gota a gota DIPEA (7 ml, 38 mmol) seguido de la adición de sal de TFA de 3-metilpiperidina-3-carbonitrilo (3,0 g, 12,6 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con agua (30 ml) y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (50 ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna para dar el compuesto del título puro (2,8 g, 56 %). LCMS: Calculado 296,3, ESI-MS m/z = 297,2 [M+H]+.

Etapa-4: 1-(3,4-diclorobenzoil)-N-hidroxi-3-metilpiperidina-3-carboximidamida:

A una mezcla de 1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidina-3-carbonitrilo (4 g, 13,5 mmol), clorhidrato de hidroxilamina (2,80 g, 40,4 mmol) en etanol (100 ml) se añadió lentamente trietilamina (5,8 ml, 40,4 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se calentó a 70 °C durante 16 h, después se concentró, se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con metanol al 10 % en diclorometano (2 x 150 ml). La capa orgánica combinada se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título (5,0 g, 69 %) como un sólido. El producto crudo se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS: Calculado 329,3, ^eS|-MS m/z = 330,4 [M+H]+.

Etapa-5: 2-((E)-1-(3,4-diclorobenzoil)-N'-hidroxi-3-metilpiperidina-3-carboximidamido) maleato de dimetilo:

A una solución agitada de 1-(3,4-diclorobenzoil)-N-hidroxi-3-metilpiperidina-3-carboximidamida (5,0 g, 15 mmol) en cloroformo (100 ml) se añadió gota a gota acetilendicarboxilato de dimetilo (3,32 g, 23,4 mmol) a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se supervisó por la TLC y después se concentró para dar el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el compuesto del título puro (2,4 g, 33 %) como un sólido. LCMS: Calculado 471,2, ESI-MS m/z = 472,3 [M+H]+.

Etapa-⁶: 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroxi-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxilato de metilo.

Una solución de 2-((E)-1-(terc-butoxicarbonilo)-N-hidroxipiperidina-3-carboximidamido) maleato de dimetilo (2,0 g, 4,2 mmol) en xilenos (15 ml) se calentó en un microondas a 160 °C durante 10 min. La mezcla de reacción se concentró y se trituró con éter dietílico y hexanos para obtener un sólido. El residuo crudo se cargó en celite y se purificó por cromatografía en columna de fase inversa mediante el uso de acetonitrilo y ácido fórmico al ^{0 , 1}% en agua para dar el compuesto del título puro (0,40 g, 21 %). LCMS: LCMS: Calculado 439,4, ESI-MS m/z = 440,5 [M+H]+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): ⁸1,10 (s, 2H), 1,27 (s, 3H), 1,58-1,75 (m, 3H), 2,00-2,16 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,60-3,64 (m, 1H), 4,01 (bs, 1H), 7,26 (d, J =8,4, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,67 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 10,36 (s, 1H), 12,40-12,65 (m, 1H).

Etapa-7: 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo.

Una mezcla de 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroxi-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo (0,200 g, 0,454 mmol) se disolvió en DMSO (50 ml) y se enfrió a 0 °C. A esto, se le añadió gota a gota una solución de metóxido de magnesio (1,30 ml, 0,908 mmol, de ⁶a 10 % en metanol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró para eliminar el exceso de metanol. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0 °C y se añadió gota a gota Mel (0,116 ml, 1,81 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h, después se enfrió hasta 10 °C y se inactivó lentamente con HCl 1 N. El producto se extrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml). La capa orgánica combinada se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo crudo se cargó en celite y se purificó por cromatografía en columna de fase inversa mediante el uso de acetonitrilo y ácido fórmico al ^{0 , 1}% en agua para dar el compuesto del título puro (0,20 g, 97 %). LCMS: Calculado 453,4, ESI-MS m/z = 454,2 [M+H]+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶): ⁸1,39 (s, 3H), 1,59 (bs, 1H), 1,75 (bs, 1H), 2,01-2,07 (m, 2H), 3,15-3,25 (m, 1H), 3,32-3,52 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,83-3,86 (m, 1H), 3,99-4,02 (m, 1H), 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,69 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 10,32 (s, 1H).

Etapa-⁸: 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de metilo:

A una solución agitada de 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-5-hidroxi-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxilato de metilo (0,20 g, 0,44 mmol) en DMF (1 ml) se añadió K²CO³(0,121 g, 0,875 mmol) seguido de la adición de MeI (0,042 ml, 0,660 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Después de completada la reacción, esta se diluyó con agua (20 ml) y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (10 ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna para dar el compuesto del título puro (0,14 g, 67 %). LCMS: Calculado 467,4, ESI-MS m/z = 468,3 [M+H]+

Etapa-9: ácido 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idina-4 carboxílico:

A una solución agitada de 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-5-metoxi-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxilato de metilo (0,140 g, 0,298 mmol) en una mezcla de metanol:THF:agua (1:1:1, ⁶ml) se añadió NaOH (0,014 g, 0,36 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de completada la reacción, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con agua fría con hielo (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 10 ml). La capa acuosa combinada se acidificó con HCl 1 N a 0 °C y se extrajo con metanol al 10 % en diclorometano (2 x 30 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera ^{( 20}ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida para proporcionar el compuesto del título crudo. (0,130 g, 96 %). LCMS: Calculado 455,2, ESI-MS m/z = 456,6 [M+H]+

Etapa-10: 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-W -(isoxazol-4-il)-5-m etoxi-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida.

A una solución agitada de ácido 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-5-metoxi-1-m etil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxílico (0,140 g, 0,308 mmol) en DMF seco (1,4 ml) se añadió HATU (0,176 g, 0,462 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y después se añadieron DIPEA (0,17 ml, 0,99 mmol) e isoxazol-4-amina (0,038 g, 0,46 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, después se diluyó con agua (20 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (10 ml), se secó con Na²SO⁴anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna para dar el compuesto del título puro (0,135 g, 84 %) como un sólido. LCMS: Calculado 519,2, ESI-MS m/z = 520,4 [M+H]+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶): ⁸1,16-1,19 (m, 3H), 1,19-1,23 (m, 2H), 1,42-1,56 (m, 2H), 3,32-3,52 (m, 2H) 3,62 (s, 3H), 4,01-4,02 (m, 1H), 4,03 (s, 3H), 4,70-4,77 (m, 1H), 7,25-7,27 (m, 1H), 7,59-7,67 (m, 2H), 8,74 (s, 1H), 9,27 (s, 1H), 10,58 (bs, 1H).HPLC quiral: CHIRALPAK AD-H; 30 % (MEOH) en CO₂líquido DEA al 0,1 %: FR-1 (Isómero-1): R^t=9,39; FR-2 (Isómero-2): Rt=14,82.

Etapa-11: 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-m etilp iperidin-3-il)-5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida.

Una solución agitada de 2-(1-(3,4-diclorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-W -(isoxazol-4-il)-5-metoxi-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida FR-1 (0,030 g, 0,057 mmol) disuelta en diclorometano (2 ml) se enfrió hasta 0 °C y se añadió gota a gota BBr³1 M en diclorometano (0,28 ml, 0,29 mmol). Después la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de completada la reacción y después se concentró al vacío. Se añadió metanol (1 ml) y se agitó durante 30 min y se evaporó. El residuo se destiló azeotrópicamente con metanol (2 x 1 ml) para dar el compuesto crudo (120 mg). El residuo crudo se cargó en celite y se purificó por cromatografía en columna de fase inversa mediante el uso de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1 % en agua para dar el Ejemplo 130 (0,015 g, 51 %). LCMS: Calculado 505,2, ESI-MS m/z = 506,3 [M+H]+. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶): ⁸1,35-1,45 (m, 3H), 1,46-1,60 (m, 2H), 1,70-1,80 (m, 2H), 3,15-3,18 (m, 2H), 3,38-3,44 (m, 2H), 3,61 (s, 3H), 7,22-7,24 (m, 1H), 7,59-7,64 (m, 2H), 8,73 (s, 1H), 9,23 (s, 1H), 10,75 (bs, 1H), 11,58 (bs, 1H).

Síntesis de 5-hidroxi-W -(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (EJEMPLO 129)

Etapa-1: sal de clorhidrato de 5-etoxi-W -(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-2-(piperidin-3-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida:

A una solución agitada de 3-(5-etoxi-4-(isoxazol-4-ilcarbamoil)-1-metil-6-oxo-1,6-dihidropirim idin-2il)piperidina-1-carboxilato de terc-butilo [de la síntesis de A1] (0,35 g, 0,78 mmol) en una mezcla de diclorometano (3 ml) y metanol (0,5 ml) se añadió gota a gota HCl 4 M en dioxano (3 ml) a ⁰°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y se calentó hasta 40 °C durante 10 min. La mezcla de reacción se concentró a sequedad y se destiló azeotrópicamente dos veces con metanol para proporcionar el compuesto del título como un sólido (0,290 g, 97 %) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS: Calculado 347,5; ESI-MS m/z = 348,5 [M+H]+

Etapa-2: 5-etoxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida:

A una solución agitada de sal de clorhidrato de 5-e toxi-N -(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-2-(p iperid in-3-il)-1,6-dihidropirimidina-4-carboxamida (0,050 g, 0,130 mmol) en DMF (0,5 ml) se añadió trietilamina (0,055 ml, 0,391 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió (2-bromoetil)benceno (0,024 g, 0,130 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, después se concentró. El producto crudo obtenido se trituró con hexanos (5 ml) y se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título (0,050 g). El compuesto del título crudo se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS: Calculado 451,3; ESI-MS m/z = 452,4 [M+H]+ Etapa-3: 5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-2-(1-fenetilp iperidin-3-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida:

Una mezcla de 5-etoxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (0,05 g, 0,110 mmol) se disolvió en diclorometano (1 ml). La solución resultante se enfrió hasta 0 °Cy se añadió gota a gota BBr³1 M en diclorometano (0,22 ml, 0,22 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 h, después se añadió bicarbonato de sodio saturado (0,5 ml) y se diluyó además con metanol al 10 % en diclorometano. El residuo se secó con Na²SO⁴y se concentró a sequedad. El residuo crudo se cargó en celite y se purificó por cromatografía en columna de fase inversa mediante el uso de acetonitrilo y ácido fórmico al ^{0 , 1}% en agua para dar el compuesto del título puro (0,01 g, 21 %). LCMS: Calculado 423,4: ESI-Ms m/z = 424,5 [M+H] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶): 5 1,60-1,80 (m, 4H), 1,85-1,95 (m, 1H), 2,66-2,70 (m, 2H), 2,70-3,02 (m, ⁶H), 3,48 (s, 3H), 7,18-7,28 (m, 5H), 8,77 (s, 1H,), 9,13 (s, 1H), 10,25 (bs, 1H), 11,50 (bs, 1H).

Tabla ⁸

Síntesis de 5-hidroxi-N-(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-(piperidin-1-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (EJEMPLO 28)

Etapa-1:

Una mezcla de C⁶(200 mg, 0,769 mmol), piperidina (0,76 ml, 7,69 mmol) y DMSO se calentó a 110 °C durante 1 h. El avance de la reacción se supervisó por la TLC y se enfrió hasta temperatura ambiente tras el consumo de C⁶. La mezcla de reacción se vertió en una mezcla de agua con hielo (25 ml) y se agitó bien durante 15 min. El material sólido se filtró, se lavó con agua (3 x 10 ml) y se secó bien al vacío para proporcionar el producto puro como un sólido (172 mg, 72 %). ESI-MS m/z = 310,38 [M+H] MW calculado: 309,371H RMN (400 MHz, DMSO-da): 54,00 (q, 2H), 4,26 (q, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,04-3,06 (m, 4H), 1,57-1,62 (m, ⁶H), 1,20-1,30 (m, ⁶H).

Etapa-2: A una solución agitada de 5-etoxi-1-metil-6-oxo-2-(piperidin-1-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxilato de etilo (100 mg, 0,32 mmol), isoxazol-4-amina (35,3 mg, 0,42 mmol) en tolueno (1 ml) se añadió trimetilaluminio 2 M en tolueno (0,6 ml, 0,64 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 30 min bajo radiación de microondas. El completamiento de la reacción se confirmó por la TLC y la reacción se vertió en una mezcla de agua fría con hielo y se extrajo con acetato de etilo (2 x 10 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera (2 x 10 ml). La capa orgánica combinada se secó con Na²SO⁴y se evaporó al vacío para obtener el compuesto crudo como un sólido marrón claro (104 mg). El material crudo se usó en la siguiente etapa sin ninguna purificación. ESI-MS m/z = 348,5 [M+H] MW calculado: 347,3

Etapa-3: Se disolvió 5-etoxi-N-(isoxazol-4-il)-1-m etil-6-oxo-2-(piperidin-1-il)-1,6-dih idropirim idina-4-carboxamida ^{( 1 00}mg, 0,28 mmol) en diclorometano ⁽¹ml). La solución resultante, se enfrió hasta ⁰°C y se añadió gota a gota BBr³1 M en diclorometano (0,5 ml, 0,57 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se supervisó por la TLC (metanol al 10 % en diclorometano). Una vez completada, el solvente se eliminó al vacío. Se añadió agua fría con hielo al residuo y el sólido se filtró para obtener el producto crudo (83 mg). El producto crudo se purificó adicionalmente por RP-HPLC para dar el producto del Ejemplo 28, 5-h idroxi-N -(isoxazol-4-il)-1-metil-6-oxo-2-(piperidin-1-il)-1,6-dihidropirim idina-4-carboxamida (10 mg, 0,032 mmol, 11 %). ESI-MS m/z = 320,3 [M+H] MW calculado: 319,3 1H RMN (400 MHz, DMSO-d⁶): 5 11,19 (s, 1H), 10,54 (s, 1H), 9,31(s, 1H), 8,92 (s, 1H), 3,43 (s, 3H), 3,08 (s, 4H), 1,59-1,67 (m, ⁶H).

Tabla 9

Ensayos bioquímicos

1. Silenciamiento de TREX1 en células tumorales

La activación de la vía cGAS/STING tras la detección del ADN citosólico y la subsiguiente producción de IFN de tipo I puede ocurrir tanto en células tumorales como en células inmunitarias innatas, particularmente células dendríticas. Para evaluar si TREX1 mantiene bajo control la producción de IFN de tipo I mediante un modelo de tumor singénico frío bien descrito que experimenta un rechazo mediado por el sistema inmunitario tras la activación de IFN de tipo I por agonistas de STING, se atenuó el gen de TREX1 en células tumorales B16F10 mediante el uso de CRISPR (Figura 1A). La acumulación de ADN citosólico por medio de la transfección de ADN de las células tumorales dio como resultado un aumento de aproximadamente 5 veces en la producción de IFNp por parte de las células B16F10 con desactivación génica de TREX1 con relación a las células tumorales originales, lo que demuestra que TREX1 atenuaba la activación de la vía cGAS/STING en células tumorales B16F10 (Figura 1B).

2. Crecimiento de células tumorales B16F10 competentes y deficientes en TREX1 in vivo

Se evaluó el crecimiento in vivo de células tumorales B16F10 competentes y deficientes en TREX1. Se inocularon ratones C57BL/6J por vía subcutánea en el flanco derecho con 300000 células tumorales B16F10 originales o con desactivación génica de TREX1. Se recogieron los pesos corporales dos veces por semana, y las mediciones de los tumores, dos o tres veces por semana, desde que los tumores se volvieron medibles y durante el resto del estudio. Los tumores en los que se había silenciado TREX1 presentaban volúmenes notablemente más pequeños que los tumores B16F10 originales (Figura 2).

Los tumores se cosecharon el día 19, al finalizar el estudio, y se digirieron hasta suspensiones de células individuales para permitir la cuantificación por citometría de flujo de las poblaciones inmunitarias infiltrantes de tumores. Se encontró que los tumores de B16F10 con desactivación génica de TREX1 exhibían un aumento significativo en las células inmunitarias totales, lo que reflejaba un aumento en la cantidad de células T CD4 y CD⁸infiltrantes de tumor, así como también en las células dendríticas plasmacitoides (pDC) (Figura 3). Se sabe que las pDC desempeñan un papel central en la inducción de respuestas inmunitarias antitumorales específicas de antígeno, mientras que se sabe que las células T son los principales efectores de la eficacia antitumoral en ratones y seres humanos. El profundo cambio en el infiltrado inmunitario de los tumores deficientes en TREX1 sugiere, por tanto, que la inhibición del crecimiento de estos últimos tumores está, al menos en parte, mediada por el sistema inmunitario.

Ensayo bioquímico de TREX1

La potencia de los compuestos se evaluó a través de un ensayo de fluorescencia que mide la degradación de un ADNbc sustrato personalizado que posee un par fluoróforo-inactivador en hebras opuestas. La degradación del ADNbc libera fluoróforo libre para producir una señal fluorescente. Específicamente, 7,5 ^l de TREX1 humana de longitud completa etiquetada en el N-terminal con His-Tev (expresada en E. coli y purificada en el propio laboratorio) en tampón de reacción (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, DTT 2 mM, BSA 0,1 mg/ml, Tween-20 al 0,01 % (v/v) y MgCl²100 mM se añadieron a una placa ProxiPlate Plus negra de 384 pocillos (Perkin Elmer) que ya contenía el compuesto (150 nl) en concentraciones variables como una dosis-respuesta de 10 puntos en DMSO. A esto se añadió 7,5 |jl de ADNbc sustrato (hebra A: 5' TEX615/GCT AGG CAG 3'; hebra B: 5' CTG CCT AGC/IAbRQSp (Integrated DNA Technologies)) en tampón de reacción. Las concentraciones finales fueron TREX1 150 μM, ADNbc sustrato 60 nM en tampón de reacción con DMSO al 1,0 % (v/v). Después de 25 minutos a temperatura ambiente, las reacciones se inactivaron mediante la adición de 5 j l de tampón de parada (igual que el tampón de reacción más EDTA 200 mM). Las concentraciones finales en la reacción inactivada fueron TREX1 112,5 μM, ADN 45 nM y EDTA 50 mM en un volumen de 20 jl. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, las placas se leyeron en un instrumento Envision con fuente láser (Perkin-Elmer), que mide la fluorescencia a 615 nm después de la excitación con luz de 570 nm. Los valores de IC⁵⁰se calcularon mediante la comparación de la fluorescencia medida a una relación de 615 nm con relación a los pocillos de control preinactivados con tampón de parada (100 % de inhibición) y los controles sin inhibidor ^{( 0}% de inhibición) mediante el uso de ajustes no lineales de cuatro parámetros por mínimos cuadrados y Genedata o GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

Ensayo bioquímico de TREX2

La potencia de los compuestos se evaluó a través de un ensayo de fluorescencia que mide la degradación de un ADNbc sustrato personalizado que posee un par fluoróforo-inactivador en hebras opuestas. La degradación del ADNbc libera fluoróforo libre para producir una señal fluorescente. Específicamente, 7,5 j l de TREX2 humana etiquetada en el N-terminal con His-Tev (residuos M44-A279, expresada en E. coli y purificada en el propio laboratorio) en tampón de reacción (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, DTT 2 mM, BSA 0,1 mg/ml, Tween-20 al 0,01 % (v/v) y MgCh 100 mM) se añadieron a una placa ProxiPlate Plus negra de 384 pocillos (Perkin Elmer) que ya contenía el compuesto (150 nl) en concentraciones variables como una dosis-respuesta de 10 puntos en DMSO. A esto se añadió 7,5 j l de ADNbc sustrato (hebra A: 5' TEX615/GCT AGG CAG 3'; hebra B: 5' CTG CCT AGC/IAbRQSp (IDT)) en tampón de reacción. Las concentraciones finales fueron TREX2 2,5 nM, ADNbc sustrato 60 nM en tampón de reacción con DMSO al 1,0 % (v/v). Después de 25 minutos a temperatura ambiente, las reacciones se inactivaron mediante la adición de 5 j l de tampón de parada (igual que el tampón de reacción más EDTA 200 mM). Las concentraciones finales en la mezcla de reacción inactivada fueron TREX2 1,875 μM, ADN 45 nM y EDTA 50 mM en un volumen de 20 jl. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, las placas se leyeron en un instrumento Envision con fuente láser (Perkin-Elmer), que mide la fluorescencia a 615 nm después de la excitación con luz de 570 nm. Los valores de IC⁵⁰se calcularon mediante la comparación de la fluorescencia medida a una relación de 615 nm con relación a los pocillos de control preinactivados con tampón de parada (100 % de inhibición) y los controles sin inhibidor ^{( 0}% de inhibición) mediante el uso de ajustes no lineales de cuatro parámetros por mínimos cuadrados y Genedata o GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

Los resultados se muestran en la Tabla 1. IC⁵⁰de TREX1: A = <0,1 jM ; B = 0,1 a 1 jM ; C = 1 a 10 jM ; D = >10 jM . IC⁵⁰de TREX2: A = <1 jM , B = 1 a 10 jM , C = 10 a 100 jM , D = >100 jM .

Tabla 10

Las células duales HCT116 (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) se derivan de la línea celular de carcinoma colorrectal humano HCT116. Las células se han seleccionado para la integración estable de los genes indicadores de SEAP y luciferasa, cuya expresión está bajo el control de 5 elementos de respuesta en tándem para NF-κΒ/AP1 y STAT1/STAT2, respectivamente. La línea celular se usó para supervisar la inducción de interferones de tipo I y la señalización subsiguiente por medición de la actividad de la luciferasa Lucia secretada en el medio de cultivo.

Las células HCT116 se sembraron en placa(s) de 96 pocillos a 40 000 células/pocillo en 100 ul de DMEM complementado con FBS al 10 % y Hepes 25 mM (pH 7,2 - 7,5). Después de la sedimentación durante toda la noche, las células se trataron con TREXli durante 4 h (la fracción máxima de DMSO fue de 0,1 %) antes de transfectar 1 ug/ml de digestión por restricción de pBR322/BstNI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) con Lipofectamina LTX (ThermoFisher, Grand Island, NY, EE. UU.), de acuerdo con las recomendaciones del manual del producto. Brevemente, se diluyó Lipofectamina LTX (0,35 ul/pocillo) en OptiMEM (5 ul/pocillo). Se diluyó pBR322/BstNI (100 ng/pocillo) en OptiMEM (5 ul/pocillo) antes de añadir el reactivo Plus (0,1 ul/100 ng de ADN). Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de ADN se mezcló gota a gota con la Lipofectamina LTX diluida. Después de una incubación adicional de 10 min, se añadió a las células la mezcla de transfección (10 ul/pocillo). Las células se mantuvieron a 37 C durante 48 h antes de supervisar la actividad de la luciferasa Lucia del medio de cultivo celular.

Aunque hemos descrito una serie de modalidades, es evidente que nuestros ejemplos básicos pueden modificarse para proporcionar otras modalidades que utilicen los compuestos y métodos de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta invención se definirá en las reivindicaciones adjuntas y no en las modalidades específicas que se han representado a manera de ejemplo.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción se les otorga el significado comúnmente conocido por los expertos en la técnica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:

R1 es hidrógeno, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), cicloalquilo de 3 a 4 miembros, -ORf, -SR f o -N R eRf; R2 es hidrógeno, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g) o cicloalquilo de 3 a 4 miembros;

X es un enlace, NR3, O, S o alquileno (R^g), en donde dicho alquileno (R^g) está opcionalmente sustituido con 1 a 2 grupos seleccionados de R4;

R3 es hidrógeno, alquilo (R^g), -C(O)Rd o -C(S)Rd;

R4 es halo, alquilo (R^g), fenilo, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHR₈, - NHC(S)NHR₈, -NHS(O)₂NHR₈, -C(S)Rb, S(O)₂Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NHRe, - C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -N H c(s)R d, -O R e, -SR e, -Oalquilo (R^g)ORe o -N R eRf, en donde dicho fenilo para R4 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de halo, alquilo (C1-C 4), haloalquilo (C1-C 4), alcoxi (C1-C 4) y haloalcoxi (C1-C 4);

El anillo A es fenilo, heteroarilo de 5 a ⁶miembros, heterociclilo de 4 a 7 miembros o cicloalquilo de 3 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con ¹o ²grupos seleccionados de R5;

R5 es alquilo (C1-C 4), haloalquilo (C1-C 4), haloalcoxi (C1-C 4), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, - NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHR₈, -NHC(S)NHR₈, -NHS(O)²NHR₈, -C(S)Rb, S(O)²Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NReRf, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -O R e, -SR e, - Oalquilo (R^g)ORe, -N R eRf, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho fenilo para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, dicho alquilo (C1-C 4) para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de ORh, -NR jRk, fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros, cada uno de dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros y heteroarilo de 4 a ⁶miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (C1-C 4) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g;

cada R^g, Rh, Rj, Rk y Rm es independientemente hidrógeno, halo, alquilo (C1-C 4), haloalquilo (C1-C 4), alcoxi (R^g), haloalcoxi (R^g), fenilo, -alquilfenilo (R^g), cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, y en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para R^g, Rh, Rj y Rk está opcionalmente sustituido además con =O.

Cada Ra, Rb, Rc, Rd, Rey Rf es independientemente hidrógeno, halo, alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), alcoxi (R^g), haloalcoxi (R^g), fenilo, cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde i) dicho alquilo (R^g) para Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, -O R h, - NRjRk; ii) cada uno de dicho fenilo, heteroarilo de 4 a ⁶miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros para Ra, Rb, Rc, Rd, Re y Rf está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, y iii) dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para Ra, Rb, Rc, Rd, Rey Rf está opcionalmente sustituido además con =O.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de la fórmula II:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R2 es alquilo (R^g).

4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el anillo A es fenilo, piridilo, pirazolilo, ciclopropilo, ciclobutilo, azetidinilo o piperidinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con uno o dos R5

5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el anillo A es triazolilo, pirrolidinilo, diazepanilo o piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente e independientemente sustituido con uno o dos R5

⁶. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R5 es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), haloalcoxi (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, - C(O)Rb, S(O)²Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -O Re, -Oalquilo (R^g)ORc, - NReRf, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho fenilo para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, dicho alquilo (R^g) para R5 está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de -O R h, -NR jRk, fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros, cada uno de dicho heteroarilo de 4 a ⁶miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g;

Ra es alquilo (R^g) opcionalmente sustituido con fenilo;

Rb es alquilo (R^g), fenilo, heteroarilo de 5 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde dicho alquilo (R^g) está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, -O R h y -NRjRk, en donde cada uno de dicho fenilo, heteroarilo de 5 a ⁶miembros y heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g, y en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros está opcionalmente sustituido además con =O;

cada Rc es independientemente fenilo o alquilo (R^g);

cada Rd es hidrógeno o alquilo (R^g);

cada Re es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g) opcionalmente sustituido con ORh;

cada Rf es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g), fenilo, cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 5 a ⁶miembros, en donde cada uno de dicho fenilo, cicloalquilo de 3 a 4 miembros, heteroarilo de 4 a ⁶miembros y heterociclilo de 5 a ⁶miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con R^g;

cada R^ges independientemente alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), alcoxi (R^g), haloalcoxi (R^g) o halo; cada Rh es hidrógeno, alquilo (R^g) o -alquilfenilo (R^g);

cada Rj es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g);

cada Rk es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g) o cicloalquilo de 3 a 4 miembros; y

cada Rm es alquilo (R^g).

7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁶, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R5 es alquilo (R^g), haloalquilo (R^g), halo, fenilo, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)²Rc, - C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -Oalquilo (R^g)ORe, -N R eRf, heteroarilo de 4 a ⁶miembros o heterociclilo de 5 a ⁶miembros, en donde dicho alquilo (R^g) para R5 está opcionalmente sustituido con -O R h, fenilo o heteroarilo de 5 a ⁶miembros, cada uno de dicho heteroarilo de 4 a ⁶miembros y heterociclilo de 5 a ⁶miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de Rm, y en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros de los sustituyentes opcionales enumerados para alquilo (R^g) en R5 está opcionalmente e independientemente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de R^g.

⁸. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada Rf es independientemente hidrógeno, alquilo (R^g), fenilo pirazolilo, piridinilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, en donde cada uno de dicho fenilo pirazolilo, piridinilo, tetrahidropiranilo y piperidinilo está opcionalmente e independientemente sustituido con alquilo (R^g); y cada R^ges independientemente alquilo (R^g), alcoxi (R^g) o halo.

9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁸, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Rb es alquilo (R^g), fenilo, heteroarilo de 5 a ⁶miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, en donde cada uno de dicho fenilo y heteroarilo de 5 a ⁶miembros para Rb está opcionalmente e independientemente sustituido con ¹o ²grupos seleccionados de halo y alcoxi (R^g), en donde dicho heterociclilo de 4 a 7 miembros para Rb está opcionalmente sustituido con =O, y en donde dicho alquilo (R^g) para Rb está opcionalmente sustituido con 1 o 2 grupos seleccionados de fenilo, -O R h y - NRjRk

10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada Rk es independientemente hidrógeno o alquilo (R^g).

11. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es un alquileno (R^g) no sustituido.

12. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R4 es fenilo o -NHC(O)ORa.

13. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es un enlace o CH².

14. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento del cáncer.