KR20210102310A - Trex1의 조절인자 - Google Patents

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KR20210102310A
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안나 가드버그
빅터 에스. 겔링
아비나쉬 칸나
줄리안 알. 레벨
조나단 이. 윌슨
케네디 타베라스
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콘스텔레이션 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

하기 화학식 I의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 조성물이 제공되며, 이들은 TREX1과 관련된 다양한 병태를 치료하는데 유용하다.
[화학식 I]

Description

TREX1의 조절인자
관련 출원
본 출원은 2018년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/776,301호에 우선권을 주장하며, 그 전체내용은 여기에 참조로 포함된다.
선천성 면역계의 비-자기 인식과 관련된 암과 잠재적인 위험을 탐지하고 보호하기 위해서는 잠재적인 면역 요법이 필요하다. 암세포는 정상적인 세포와 항원적으로 다르며, 바이러스 감염과 유사하게 면역계에 경고하는 위험 신호를 방출한다. 손상-관련 분자 패턴(DAMP) 및 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)을 포함하는 이러한 신호는 선천성 면역계를 더욱 활성화시켜 다양한 위협으로부터 숙주를 보호한다(Front. Cell Infect. Microbiol. 2012, 2, 168).
이소성 발현된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 및 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 공지된 PAMP 및/또는 DAMP로서, 핵산 센서인 사이클릭 GMP-AMP 신타제(cGAS)에 의해 인식되고 있다(Nature 2011, 478, 515-518). 세포질 DNA를 감지하면, cGAS는 인터페론 유전자의 ER 막관통 어댑터 단백질 자극기(STING)의 강력한 두 번째 메신저이자 활성제인 사이클릭 디뉴클레오타이드 2',3'-cGAMP의 생성을 촉매한다(Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361). STING 활성화는 TBK1을 통한 IRF3의 인산화를 유발하여, 선천성 면역 활성화와 적응 면역 개시의 전제 조건인, I형 인터페론 생산과 인터페론 자극 유전자(ISG)의 활성화를 차례로 유도한다. 따라서, I형 인터페론의 생산은 선천성 면역과 적응 면역 사이의 중요한 가교 역할을 한다(Science 2013, 341, 903-906).
과량의 I형 IFN은 숙주에 해로울 수 있으며, 자가면역을 유도할 수 있으므로, I형 IFN-매개된 면역 활성화를 억제하는 음성 피드백 메커니즘이 존재한다. 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 I(TREX1)은 이소성 발현 ssDNA 및 dsDNA의 제거를 담당하는 3'-5' DNA 엑소뉴클레아제이므로, cGAS/STING 경로의 주요 억제인자이다(PNAS 2015, 112, 5117-5122).
I형 인터페론 및 다운스트림의 전-염증성 사이토카인 반응은 면역 반응 및 그들의 효과의 발달에 중요하다. I형 인터페론은 수지상 세포와 대식세포가 T 세포에 항원을 흡수, 처리, 존재 및 교차-제시하는 능력과 CD40, CD80 및 CD86과 같은 공동-자극 분자의 상향-조절을 유도하여 T 세포를 자극하는 능력을 향상시킨다(J. Exp. Med. 2011, 208, 2005-2016). I형 인터페론은 또한 자체 수용체에 결합하여 적응 면역에 관여하는 세포의 활성화에 기여하는 인터페론 반응 유전자를 활성화한다(EMBO Rep. 2015, 16, 202-212).
치료적 관점에서, I형 인터페론 및 I형 인터페론 생산을 유도할 수 있는 화합물은 인간 암의 치료에 사용될 가능성이 있다(Nat. Rev Immunol. 2015, 15, 405-414). 인터페론은 인간 종양 세포 증식을 직접 억제할 수 있다. 또한, I형 인터페론은 선천성 면역계와 적응 면역계 모두에서 세포의 활성화를 촉발시켜 항-종양 면역을 강화할 수 있다. 중요한 것은, PD-1 봉쇄의 항-종양 활성에는 기존 종양 내 T 세포가 필요하다는 것이다. 차가운 종양을 뜨겁게 만들어 자발적인 항-종양 면역을 유도함으로써, I형 IFN-유도 요법은 항 PD-1 요법에 반응하는 환자 풀을 확장하고 항-PD1 요법의 효과를 향상시킬 수 있다.
강력한 I형 인터페론 반응을 유도하는 현재 개발중인 요법은 허용 가능한 치료 지수를 달성하기 위해 초점 또는 종양 내 투여를 필요로 한다. 따라서, 말초 치료 접근 가능한 병변없이 환자에게 I형 IFN-유도 요법의 이점을 확대하기 위해 전신 전달 및 더 낮은 독성을 갖는 새로운 작용제가 여전히 필요하다. 인간 및 마우스 유전 연구는 TREX1 억제가 전신 전달 경로에 순응할 수 있으므로, TREX1 억제 화합물이 항-종양 치료 환경에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. TREX1은 방사선 치료에 반응하는 암세포의 제한된 면역원성에 대한 주요 결정인자이다[Trends in Cell Biol., 2017, 27 (8), 543-4; Nature Commun., 2017, 8, 15618]. TREX1은 유전독성 스트레스에 의해 유도되며, 신경교종 및 흑색종 세포를 항암제로 보호하는 데 관여한다[Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1833, 1832-43]. STACT-TREX1 요법은 여러 뮤린 암 모델에서 강력한 항-종양 효능을 보여준다[Glickman et al, Poster P235, 33rd Annual Meeting of Society for Immunotherapy of Cancer, Washington DC, Nov. 7-11, 2018].
개요
본원에 기재된 실시형태는 일반적으로 TREX1 억제제에 반응하는 질환을 치료하기 위한 작용제, 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. TREX2 억제제보다 선택적인 TREX1 억제제는 본 발명에서 성공적으로 합성되었다.
본원에는 화학식 I을 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 조성물이 제공된다:
Figure pct00001
(I);
여기서 A, R1, R2 및 n은 본원에 기재된 바와 같다. 개시된 화합물 및 조성물은 TREX1을 조절하고, 예를 들어 암 치료와 같은 다양한 치료 용도에 유용하다.
도 1a는 CRISPR을 사용하여 B16F10 종양 세포에서 TREX1의 녹다운 실험 결과를 나타낸다.
도 1b는 TREX1이 B16F10 종양 세포에서 cGAS/STING 경로의 활성화를 약화시킨 것을 나타낸다.
도 2: TREX가 침묵된 종양이 부모 B16F10 종양에 비해 더 적은 부피를 가짐을 나타낸다.
도 3: TREX1 녹아웃 B16F10 종양이 전체 면역 세포에서 상당한 증가를 나타냄을 보여준다. 이는 CD4 및 CD8 T 세포뿐만 아니라 형질세포양 수지상 세포(pDC)에 침투하는 종양의 수의 증가를 반영했다.
도 4: 인간 HCT116 결장직장 암종 세포주에서 특정 본 발명의 화합물의 활성을 보여준다.
1. 화합물의 일반적인 설명
제1 실시형태에서, 본원에는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00002
(I)
여기서:
R1은 수소, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 3원 내지 4원 사이클로알킬, -ORf, -SRf, 또는 -NReRf이고;
R2는 수소, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 또는 3원 내지 4원 사이클로알킬이며;
X는 결합, NR3, O, S, 또는 (C1-C4)알킬렌이며, 여기서 상기 (C1-C4)알킬렌은 R4로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
R3은 수소, (C1-C4)알킬, -C(O)Rd, 또는 -C(S)Rd이며;
R4는 할로, (C1-C4)알킬, 페닐, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHRg, -NHC(S)NHRg, -NHS(O)2NHRg, -C(S)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NHRe, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -ORe, -SRe, -O(C1-C4)알킬ORe, 또는 -NReRf이되, 여기서, R4에 대한 상기 페닐은 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 및 할로(C1-C4)알콕시로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고;
고리 A는 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴, 4원 내지 7원 헤테로사이클릴, 또는 3원 내지 7원 사이클로알킬이며, 이들 각각은 R5로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며;
R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알콕시, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHRg, -NHC(S)NHRg, -NHS(O)2NHRg, -C(S)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NReRf, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -ORe, -SRe, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴, 여기서 R5에 대한 상기 페닐은 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 ORh, -NRjRk, 페닐, 및 5원 내지 6원 헤테로아릴로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 및 4원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rm으로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, 여기서 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 임의의 치환기들의 상기 페닐 및 5원 내지 6원 헤테로아릴은 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며;
Rg, Rh, Rj, Rk, 및 Rm은 각각 독립적으로 수소, 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 페닐, -(C1-C4)알킬페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 Rg, Rh, Rj 및 Rk에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 추가로 선택적으로 치환되며.
Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf는 각각 독립적으로 수소, 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 i) Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, -NRjRk로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며; ii) Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf에 대한 상기 페닐, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, iii) Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 추가로 =O로 선택적으로 치환된다.
2. 정의
여러개의 부착 지점이 있을 수 있는 화학기를 설명하기 위해 사용되는 경우 하이픈(-)은 해당 기가 정의된 가변 기에 대한 부착 지점을 나타낸다. 예를 들어, -NHC(O)ORa 및 -NHC(S)ORa는 이 기의 부착 지점이 질소 원자 상에서 발생함을 의미한다.
용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소(플루오로, -F), 염소(클로로, -Cl), 브롬(브로모, -Br) 및 요오드(요오도, -I)로부터 선택된 원자를 지칭한다.
용어 "알킬"은 단독으로 또는 "할로알킬" 등과 같은 더 큰 모이어티의 일부로 사용될 때 포화 직쇄 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 알킬기는 전형적으로 1~4개의 탄소 원자, 즉 (C1-C4)알킬을 갖는다.
용어 "알킬렌"은 2가 포화 탄화수소를 지칭한다.
"알콕시"는 -O-알킬로 표시되는 산소 연결 원자를 통해 부착된 알킬 라디칼을 의미한다. 예를 들어, "(C1-C4)알콕시"는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 부톡시를 포함한다.
용어 "할로알킬"은 할로겐이 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 독립적으로 선택되는 모노, 폴리 및 퍼할로알킬기를 포함한다.
"할로알콕시"는 산소 원자를 통해 또 다른 모이어티에 부착된 할로알킬기, 예를 들어, -OCHCF2 또는 -OCF3이다.
단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 1~4개의 헤테로원자를 함유하는 5원 내지 6원 방향족 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴은 예를 들어 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 등을 포함한다. 특정될 때 헤테로아릴기 상의 임의의 치환기가 임의의 치환 가능한 위치 상에 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
용어 "헤테로사이클릴"은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 4원 내지 7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리를 의미한다. 헤테로사이클릴 고리는 임의의 헤테로원자 또는 안정된 구조를 만드는 탄소 원자에서 그의 펜던트기에 부착될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예는 제한없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 테라하이드로피라닐, 피롤리디닐, 피리디노닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 모르폴리닐, 디하이드로푸라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리디닐, 디하이드로피리미디닐, 옥세타닐, 아제티디닐 및 테트라하이드로피리미디닐을 포함한다. 또한, 특정될 때, 헤테로사이클릴기 상의 임의의 치환기가 임의의 치환 가능한 위치 상에 존재할 수 있고, 예를 들어 (예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로사이클릴의 경우) 헤테로사이클릴이 부착된 위치를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
용어 "사이클로알킬"은 달리 명시되지 않는 한 3 내지 10개의 탄소 고리 원자들을 갖는 사이클릭 탄화수소를 지칭한다. 모노사이클릭 사이클로알킬기는 제한없이, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로헵테닐, 및 사이클로옥틸을 포함한다. 특정될 때, 사이클로알킬 또는 지환족기 상의 임의의 치환체는 임의의 치환가능한 위치에 존재할 수 있고, 예를 들어 사이클로알킬 또는 지환족 기가 부착된 위치를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
용어 "TREX1"은 인간에서 TREX1 유전자에 의해 코딩되는 효소인 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 1 또는 DNA 복구 엑소뉴클레아제 1을 지칭한다. Mazur DJ, Perrino FW (Aug 1999). "Identification and expression of the TREX1 및 TREX2 cDNA sequences encoding mammalian 3'-->5' exonucleases". J Biol Chem. 274 (28): 19655-60. doi:10.1074/jbc.274.28.19655. PMID　10391904; Hoss M, Robins P, Naven TJ, Pappin DJ, Sgouros J, Lindahl T (Aug 1999). "A human DNA editing enzyme homologous to the Escherichia coli DnaQ/MutD protein". EMBO J. 18 (13): 3868-75. doi:10.1093/emboj/18.13.3868. PMC　1171463. PMID　10393201. 이 유전자는 인간 세포에서 주요 3'→5' DNA　엑소뉴클레아제를 코딩한다. 단백질은 인간 DNA 중합효소에 대한 교정 기능을 제공할 수 있는 비가공 엑소뉴클레아제이다. 또한 SET 복합체의 구성요소이며, 그랜자임 A-매개 세포 사멸 동안 닉 DNA의 3' 말단을 빠르게 분해하는 역할을 한다. 기능성 TREX1이 없는 세포는 만성 DNA 손상 체크포인트 활성화와 내인성 단일-가닥 DNA 기질의 핵외 축적을 보여준다. TREX1 단백질은 일반적으로 비정상 복제 중간체를 처리하여 생성된 단일-가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드 종에 작용하는 것으로 보인다. TREX1의 이러한 작용은 DNA 손상 체크포인트 신호를 약화시키고, 병적 면역 활성화를 방지한다. TREX1은 세포-내인성 항바이러스 감시의 기능으로 내인성 레트로요소의 역전사된 단일-가닥 DNA를 대사하여 강력한 I형 IFN 반응을 유발한다. TREX1은 HIV-1이 세포질에서 바이러스 cDNA를 분해하여 세포질 감지를 회피하도록 돕는다.
용어 "TREX2"는 인간에서 TREX2 유전자에 의해 코딩되는 효소인 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2를 지칭한다. 이 유전자는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 핵 단백질을 코딩한다. 코딩된 단백질은 이중-가닥 DNA 파손 복구에 참여하고, DNA 중합효소 델타와 상호작용할 수 있다. 이 활성을 가진 효소는 DNA 복제, 복구 및 재조합에 관여한다. TREX2는 주로 각질형성세포에서 발현되며, UVB-유도 DNA 손상에 대한 표피 반응에 기여하는 3'-엑소뉴클레아제이다. TREX2 생화학적 및 구조적 특성은 TREX1과 유사하지만, 동일하지는 않다. 두 단백질은 이합체 구조를 공유하고, 거의 동일한 kcat 값으로 시험관 내에서 ssDNA 및 dsDNA 기질을 처리할 수 있다. 그러나, 효소 역학, 구조적 도메인 및 세포 내 분포와 관련된 몇 가지 특징은 TREX2를 TREX1과 구별시킨다. TREX2는 TREX1에 비해 시험관 내에서 DNA 기질에 대해 10배 낮은 친화도를 나타낸다. TREX1과 달리, TREX2에는 단백질-단백질 상호작용을 매개할 수 있는 COOH-말단 도메인이 없다. TREX2는 세포질과 핵 모두에 국한된 반면, TREX1은 소포체에서 발견되며, 그랜자임 A-매개 세포 사멸 또는 DNA 손상 후에 핵으로 이동한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 치료가 필요한 포유동물, 예를 들어 반려동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 기니피그 등)을 의미한다. 전형적으로 대상체는 치료가 필요한 인간이다.
용어 "억제하다", "억제" 또는 "억제하는"은 생물학적 활성 또는 처리의 기준선 활성의 감소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 질환 또는 장애의 진행 또는 이의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 발병 지연 또는 억제하는 것을 지칭한다. 일부 양태에서, 치료, 즉 치료적 치료는 하나 이상의 증상이 발생한 후에 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 치료는 증상없이 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상이 시작되기 전에(예를 들어, 증상의 이력 및/또는 유전적 또는 기타 민감성 요인에 비추어), 예를 들어 예방적 치료에 비추어 민감성 있는 개체에게 투여될 수 있다. 치료는 또한, 예를 들어 재발을 지연시키기 위해 증상이 해결된 후에도 치료를 계속할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 제형화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 비독성 담체, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 본원에 기재된 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클은 이온 교환기, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충액 물질, 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
의약에 사용하기 위해, 본원에 기재된 화합물의 염은 비독성 "약제학적으로 허용되는 염"을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염 형태는 약제학적으로 허용되는 산성/음이온성 또는 염기성/양이온성 염을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물의 적합한 약제학적으로 허용되는 산 부가 염은 예를 들어, 무기산(예컨대, 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산 및 황산) 및 유기산(예컨대, 아세트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 메탄설폰산, 및 p-톨루엔설폰산)의 염을 포함한다. 카르복실산과 같은 산성기를 갖는 본 교시의 화합물은 약제학적으로 허용되는 염기(들)와 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 염기성 염은 예를 들어 암모늄 염, 알칼리 금속 염(예컨대, 나트륨 및 칼륨 염) 및 알칼리 토금속 염(예컨대, 마그네슘 및 칼슘 염)을 포함한다. 4차 암모늄기를 갖는 화합물은 또한 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 아세테이트, 과염소산염 등과 같은 반대음이온을 함유한다. 이러한 염의 다른 예는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 메탄설포네이트, 니트레이트, 벤조에이트 및, 글루탐산과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 대상체의 원하는 또는 유익한 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 본원에 기재된 화합물의 양을 지칭하며, 예를 들어 0.01 내지 100 mg/kg 체중/일의 투여량을 의미한다.
3. 화합물
제2 실시형태에서, 본원에는 화학식 II의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00003
(II)
여기서, 가변기들은 제1 실시형태에서 상기 기재된 바와 같다.
제3 실시형태에서, R2는 화학식 I 또는 II의 화합물에서 (C1-C4)알킬이다.
제4 실시형태에서, 본원에는 화학식 III의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00004
(III)
여기서, 가변기들은 제1, 제2 또는 제3 실시형태에서 상기 기재된 바와 같다.
제5 실시형태에서, 화학식 I, II, 또는 III의 화합물에서 고리 A는 페닐, 피리딜, 피라졸릴, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 아제티디닐, 또는 피페리디닐이고, 이들 각각은 1 또는 2개의 R5로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3 또는 제4 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제5 실시형태의 일부로서, 화학식 I, II, 또는 III의 화합물에서 고리 A는 트리아졸릴, 피롤리디닐, 디아제파닐, 또는 피페라지닐이고, 이들 각각은 1 또는 2개의 R5로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3 또는 제4 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제6 실시형태에서, 화학식 I, II, 또는 III의 화합물에서 R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알콕시, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -ORe, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 R5에 대한 상기 페닐은 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 -ORh, -NRjRk, 페닐, 및 5원 내지 6원 헤테로아릴로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, 상기 4원 내지 6원 헤테로아릴 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 R5에서 상기 페닐 및 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고; Ra는 페닐로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이고, 여기서 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, 및 -NRjRk에서 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, 여기서 상기 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴, 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 추가로 선택적으로 치환되며; 각각의 Rc는 독립적으로 페닐 또는 (C1-C4)알킬이고; 각각의 Rd는 수소 또는 (C1-C4)알킬이고; 각각의 Re는 독립적으로 수소 또는 ORh로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고; 각각의 Rf는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 페닐 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 5원 내지 6원 헤테로사이클릴이고, 여기서 상기 페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 및 5원 내지 6원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고; 각각의 Rg는 독립적으로 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 또는 할로이고; 각각의 Rh는 수소, (C1-C4)알킬, 또는 -(C1-C4)알킬페닐이고; 각각의 Rj는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬이고; 각각의 Rk는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 또는 3원 내지 4원 사이클로알킬이고; 각각의 Rm은 (C1-C4)알킬이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제7 실시형태에서, 화학식 I, II, 또는 III의 화합물에서 R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 5원 내지 6원 헤테로사이클릴이며, 여기서 R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 -ORh, 페닐, 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴로 선택적으로 치환되고, 상기 4원 내지 6원 헤테로아릴 및 5원 내지 6원 헤테로사이클릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 상기 페닐 및 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제8 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, 또는 -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 모르폴리닐, 피페라지닐, 또는 피라졸릴이며, 여기서 상기 모르폴리닐, 피페라지닐, 및 피라졸릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 -ORh, 페닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 또는 피리디닐로 선택적으로 치환되고, 여기서 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 상기 페닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 및 피리디닐은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제9 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 각각의 Rf는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 페닐 피라졸릴, 피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 피페리디닐이고, 여기서 상기 페닐 피라졸릴, 피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 및 피페리디닐은 각각 (C1-C4)알킬로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 제8 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제10 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 각각의 Rg는 독립적으로 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 또는 할로이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 제9 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제11 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이고, 여기서 Rb에 대한 상기 페닐 및 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 할로 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 선택적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, 및 -NRjRk로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제12 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 각각의 Rk는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제13 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 피리디닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 또는 피페리디닐이고, 여기서 Rb에 대한 상기 페닐, 피리디닐, 피라졸릴, 및 피리미디닐은 각각 할로 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, OH, 및 NMe2로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, Rb에 대한 상기 피페리디닐은 =O로 선택적으로 치환되고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 또는 제12 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제14 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 R3은 수소이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제15 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 R4는 페닐 또는 -NHC(O)ORa이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 또는 제14 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제16 실시형태에서, 화학식 I, II 또는 III의 화합물에서 X는 결합 또는 CH2이고, 여기서 나머지 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 또는 제13 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
또한, 1) 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다:
Figure pct00005
(I)
여기서 가변기들은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 실시형태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
화학식 I을 갖는 화합물은 예증에 추가로 개시되고, 본 개시내용에 포함된다. 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 중성 형태가 포함된다.
4. 용도, 제형화 및 투여
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 일반적으로 TREX1의 활성을 조절하는 데 유용하다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 약제학적 조성물은 활성 TREX1을 억제한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 약제학적 조성물은 TREX1 기능과 관련된 장애를 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본원에는 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, TREX1 기능과 관련된 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 또한, TREX1 기능과 관련된 장애를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 기재된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 개시된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다. 또한 TREX1과 관련된 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 개시된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 약제학적 조성물은 암 치료에 유용하다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 약제학적 조성물에 의해 치료되는 암은 결장암, 위암, 갑상선암, 폐암, 백혈병, 췌장암, 흑색종, 다발성 흑색종, 뇌암, CNS 암, 신장암, 전립선암, 난소암, 백혈병 및 유방암으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 약제학적 조성물에 의해 치료되는 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 결장직장암 및 흑색종으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 이러한 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하기 위해 제형화된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측, 질 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내, 흉골 내, 척수강 내, 간내, 병변 내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 경구, 복강 내 또는 정맥 내로 투여된다. 본원에 기재된 약제학적 조성물의 멸균 주사 가능한 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당 업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여된다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료 요법은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 치료 의사의 판단 및 치료할 특정 질환의 심각도를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 조성물 중 본원에 기재된 화합물의 양은 또한 약제학적 조성물 중 특정 화합물에 따라 달라질 것이다.
예증
화학 합성
하기의 대표적인 실시예는 본 개시내용을 설명하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도도 아니고, 그렇게 해석되어서도 안된다.
일반 합성 계획
Figure pct00006
2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드
Figure pct00007
단계 1: 메틸 3-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-(2-메톡시-2-옥소에틸)-2-메틸-2,5-디하이드로-1,2,4-옥사디아졸-5-카르복실레이트의 합성
Figure pct00008
실온에서 H2O(25.00 mL), EtOH(25.00 mL) 중의 SM(5.16 g, 26.341 mmol, 2당량), N-메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(1.10 g, 13.170 mmol, 1.00당량)의 교반된 용액에 Na2CO3(0.837 g, 7.902 mmol, 0.6당량)를 나누어서 첨가했다. 생성된 용액을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물이 실온으로 냉각될 때까지 1,4-디메틸 부트-2-인디오에이트(2.06 g, 14.488 mmol, 1.1당량)를 적가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 3x30 mL의 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기층을 합하여 염수로 세척하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 에테르(1:5)와 함께 실리카 겔 컬럼 상에 적용하였다. 이로써 1.3 g의 A1(25% 수율)을 연황색 오일로 수득하였다. ESI-MS m/z = 385.0 [M+H]+. 계산된 MW: 384.0. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.67 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.45 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.07 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 0.8 Hz, 3H).
하기 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
단계 2: 메틸 2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트 B1의 합성
Figure pct00012
100-mL 둥근 바닥 플라스크에 메틸 3-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-(2-메톡시-2-옥소에틸)-2-메틸-2,5-디하이드로-1,2,4-옥사디아졸-5-카르복실레이트(1.00 g, 2.596 mmol, 1.00당량), 자일렌(20.00 mL)을 넣었다. 생성된 용액을 145℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과하여 수집하고, 헥산으로 세척하였다. 고체를 감압하에 건조시켰다. 이로써 210 mg의 메틸 2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(22% 수율)를 백색 고체로 수득하였다. ESI-MS m/z = 353.0 [M+H]+. 계산된 MW: 352.0
하기 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
단계 3: 2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 1)의 합성
Figure pct00015
8-mL 밀봉된 튜브에 메틸 2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(100.00 mg, 0.283 mmol, 1.00당량), THF(2.50 mL), 1,2-옥사졸-4-아민(71.42 mg, 0.849 mmol, 3.00당량)을 넣었다. 이어서, -70℃에서 교반하면서 iPrMgCl(2M, 0.64 mL, 4.50당량)의 용액을 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응을 2 mL의 포화 NH4Cl(수성) 첨가에 의해 켄칭하였다. 용액의 pH 값은 HCl(4 M)로 3으로 조정되었다. 생성된 용액을 3x5 mL의 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 합하고 진공하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 Prep-HPLC(CH3CN/H2O/FA)로 정제하였다. 이로써 32.9 mg 2-(3-브로모-5-메틸페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(28% 수율)를 백색 고체로 수득하였다. ESI-MS m/z = 405.0 [M+H]+. 계산된 MW: 404.0. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 11.82 (s, 1H), 10.95 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 3.30 (s, 3H), 2.39 (s, 3H).
하기 실시예는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00016
Figure pct00017
5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-페닐-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 8)의 합성.
Figure pct00018
메틸 5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-2-페닐-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(200 mg, 0.77 mmol, 1당량) 및 이속사졸-4-아민(0.096 g, 1.15 mmol, 1.5당량)를 톨루엔(1 mL)에 용해시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔(0.768 ml, 1.53 mmol, 2.0당량) 중 이 2 M 트리메틸알루미늄에 0℃에서 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 포화 중탄산나트륨 용액(0.2 ml)으로 켄칭시키고, 여기에 에틸 아세테이트(10 ml)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 여과하였다. 고체를 에틸 아세테이트(3 x 10 ml)로 세척하고 합한 유기층을 감압하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 역상 HPLC로 정제하여 5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-페닐-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드, 8(25 mg, 15%)를 수득하였다. ESI-MS m/z = 313.2 [M+H]+. 계산된 MW: 312.29. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.13 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 7.42-7.50 (m, 5H), 3.22 (s, 3H).
도식: 2-클로로-N-(이속사졸-4-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(C)의 합성
Figure pct00019
단계 1: 1,4-디에틸 2-메톡시-3-옥소부탄디오에이트(1)의 합성
Figure pct00020
불활성 질소 분위기로 퍼징 및 유지된 1000-mL 3구 둥근-바닥 플라스크에 에탄올(600.0 mL), 나트륨 에탄올레이트(31.7 g, 0.470 mmol, 1.10당량)를 넣고, 에틸 옥살레이트(68.00 g, 465.6 mmol, 1.10당량)를 실온에서 첨가하였다. 이어서 실온에서 교반하면서 에틸 2-메톡시아세테이트(50.00 g, 423.3 mmol, 1.00당량)를 적가하였다. 생성된 용액을 35℃에서 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 농축하여 대부분의 에탄올을 제거하였다. 용액의 pH 값은 0℃에서 염화수소(1 mol/L)로 3으로 조정되었다. 생성된 용액을 4x500 mL의 에틸 아세테이트로 추출하여 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공하에 농축시켰다. 그 결과 갈색 오일로서 1,4-디에틸 2-메톡시-3-옥소부탄디오에이트(1) 90 g(미정제)을 갈색 오일로서 생성하였다.
단계 2: 에틸 2-메톡시-2-[(4E)-1-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일리덴]아세테이트 (2)의 합성
Figure pct00021
2000-mL 둥근-바닥 플라스크에 1,4-디에틸 2-메톡시-3-옥소부탄디오에이트(1)(90.00 g, 412.5 mmol, 1.00당량), 메틸우레아 (30.60 g, 412.5 mmol, 1.00당량), 아세트산(1200.0 mL), 염화수소(400.0 mL, 가스, 디옥산 중 4 mol)를 넣었다. 생성된 용액을 105℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 생성된 혼합물을 1 x500 ml의 헥산으로 세척하였다. 그 결과 에틸 2-메톡시-2-[(4E)-1-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일리덴]아세테이트(2) 90 g(미정제)이 갈색 고체로서 생성되었다. 1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 8.75 (s, 1H), 7.47 (s, 0.4H), 5.09 (s, 2H), 4.51-4.30 (m, 3H), 3.85 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 3.07 (s, 1H), 2.14 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 1.45-1.42 (m, 2H), 1.42-1.37 (m, 3H).
단계 3. 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실산 (3)의 합성
Figure pct00022
2000-mL 둥근-바닥 플라스크에 에틸 2-메톡시-2-[(4E)-1-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일리덴]아세테이트(2)(80.00 g, 350.6 mmol, 1.00당량), 수산화칼륨(물 중 1M)(1400.0 mL)을 넣었다. 생성된 용액을 105℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물/얼음 욕을 사용하여 0℃로 냉각시켰다. 용액의 pH 값을 0℃에서 염화수소(12 mol/L)로 3으로 조정하고, 고체를 여과로 수집하고, 침전물을 진공에서 건조시켰다. 이로써 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실산(3) 40 g(수율 57%)이 백색 고체로 생성되었다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.35 (s, 1H), 10.91 (s, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.14 (s, 3H).
단계 4. 에틸 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(4)의 합성
Figure pct00023
아르곤의 불활성 분위기로 퍼징 및 유지된 1000-mL 3-구 둥근 바닥-플라스크에 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실산(3)(20 g, 0.10 mmol, 1.00당량), 에탄올(400.0 mL)을 넣었다. 이어서, 0℃에서 교반하면서 아세틸 클로라이드(117.7 g, 1.500 mmol, 15.00당량)를 적가하였다. 생성된 용액을 하룻밤 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 물/얼음 욕으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하였다. 이로써 16 g의 에틸 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(4)(수율: 70%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
단계 5. 에틸 2-클로로-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(5)의 합성
Figure pct00024
아르곤의 불활성 분위기로 퍼징 및 유지된 1-L 3구 둥근-바닥 플라스크에 에틸 2-하이드록시-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(4)(16.0 g, 70.1 mmol,1.00당량), 디메틸아닐린1.20 g, 98.2 mmol, 1.40당량), 포스포릴 트리클로라이드(320.0 mL)를 넣었다. 생성된 용액을 100℃에서 하룻밤동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 에테르(1/10-1/4)를 사용하여 실리카 겔 컬럼에 적용하였다. 이에 따라 13.3 g의 에틸 2-클로로-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(5)(수율 77.0%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
단계 6. 2-클로로-5-메톡시-1-메틸-N-(1, 2-옥사졸-4-일)-6-옥소피리미딘-4-카르복사미드 (6)의 합성
Figure pct00025
톨루엔(15.0mL) 중 에틸 2-클로로-5-메톡시-1-메틸-6-옥소피리미딘-4-카르복실레이트(5)(1.00　g,　4.05 mmol,　1.00당량) 및 1,2-옥사졸-4-아민 (340.9　mg,　4.050　mmol,　1.00당량)의 교반된 용액에 아르곤 대기하에 실온에서 트리메틸알루미늄(톨루엔 중 2 mol)(4.1　mL,　8.10　mmol,　2.00당량)을 첨가했다. 생성된 용액을 80℃에서 15분 동안 마이크로파 방사선과 함께 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 물/얼음으로 켄칭시켰다. 생성된 용액을 3x40 mL의 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기층을 염수(1x30 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 에테르(1/10-1/1)와 함께 실리카 겔 컬럼에 적용하였다. 이로써 650mg의 2-클로로-5-메톡시-1-메틸-N-(1, 2-옥사졸-4-일)-6-옥소피리미딘-4-카르복사미드(6)(수율 53.0%)가 연황색 고체로 수득되었다. ESI-MS m/z = 285.2 [M+H] +. 계산된 MW: 284.2 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.84 (s, 1H), 9.28 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.62 (s, 3H).
하기 실시예 및 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
하기 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00029
2-(3-브로모-2-(2-하이드록시에톡시)페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 15)의 합성.
Figure pct00030
실온에서 40 mL 바이알에 2-(3-브로모-2-(2-((tert-부틸디메틸실릴)옥시) 에톡시)페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(300 mg, 0.531 mmol, 1.0당량) 및 THF (6.0 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물에 TBAF(1M)/CH3COOH =1:1(1.20 mL, 2.0당량)을 0℃에서 2분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 추가로 5시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트(1 x12 mL)로 추출하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(3 x10 mL)로 추가로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(2 x 7 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시켰다. 여과 후 여액을 감압 농축하였다. 미정제 생성물(300 mg)을 Prep-HPLC(아세토니트릴/포름산/물)로 정제하여 70 mg의 2-(3-브로모-2-(2-하이드록시에톡시)페닐)-5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드, 15를 29% 수율로 흰색 고체로서 수득하였다. ESI-MS m/z = 451.0 [M+H]+. 계산된 MW: 450.0. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.87 (s, 1H), 10.99 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.63 (t, J =5.4 Hz, 1H), 4.01-3.97 (m, 1H), 3.76-3.70 (m, 1H), 3.52-3.39 (m, 2H), 3.23 (s, 3H).
하기 실시예 및 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
tert-부틸-3-(5-에톡시-4-(이속사졸-4-일카르바모일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-2-일)피페리딘-1-카르복실레이트(이성질체 A1)의 합성:
Figure pct00046
단계-1: 에틸 2-(1-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,5,6-테트라하이드로피리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트:
디옥산/물(4:1, 50 mL)의 용액 중 에틸 2-클로로-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(2 g, 7.67 mmol), tert-부틸 5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카르복실레이트(2.96 g, 9.59 mmol) 및 탄산나트륨(1.62 g, 15.34 mmol)의 혼합물을 아르곤 가스로 20분 동안 탈기시켰다. PdCl2(dppf)(0.561 g, 0.76 mmol)를 첨가하고, 추가 10분 동안 탈기를 계속했다. 반응 혼합물을 90℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 물(100 mL)에 넣고 에틸 아세테이트(2 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고 감압하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체 형태의 표제 화합물(2.57 g, 82%)을 얻었다. LCMS: 계산치 408.3; ESI-MS m/z = 408.61 [M+H] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.23-1.31 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 2.25-2.40 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.45-3.50 (m, 2H), 4.05-4.10 (m, 2H), 4.16 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.31 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 6.26 (bs, 1H).
단계-2: 에틸-2-(1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트:
에틸 2-(1-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,5,6-테트라하이드로피리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(2.57 g, 6.30 mmol)의 혼합물에 메탄올:에틸 아세테이트(1:3, 54 mL) 용액을 용해시키고 교반하고 10% Pd/C(0.67 g, 50% 수분 포함)을 첨가하였다. 반응을 3.5시간 동안 수소 가스 분위기하에 실온에서 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(2 x 50 mL)로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축시켰다. 수득된 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(2.35 g, 91%)을 수득하였다. LCMS: 계산치 409.3, ESI-MS m/z = 410.4 [M+H] +
단계-3: 2-(1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실산:
메탄올:THF:H2O(1:1:1, 30 mL)의 혼합물 중의 에틸-2-(1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(1.9 g, 4.64 mmol)의 교반된 용액에 NaOH(0.222 g, 5.56 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응을 진공하에 농축시켰다. 반응 혼합물을 물(10 mL)에 용해시키고 1N HCl(pH-6)로 산성화시켰다. 생성물을 디클로로메탄(2 x 30 mL) 중 10% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(30 mL)로 세척하고 진공하에 증발시켜 미정제 표제 화합물(1.67 g, 94%)을 얻었으며, 이를 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. LCMS: 계산치 381.3; ESI-MS m/z = 382.5 [M+H] +
단계-4: tert -부틸-3-(5-에톡시-4-(이속사졸-4-일카르바모일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-2-일)피페리딘-1-카르복실레이트:
건조 DMF(16 mL) 중 2-(1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-3-일)-5-에톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실산(1.67 g, 4.37 mmol)의 교반된 용액에 HATU(2.49 g, 6.56 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, DMF(0.5 mL) 및 DIPEA(1.5 mL, 8.75 mmol) 중 이속사졸-4-아민(0.441 g, 5.25 mmol)을 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 물(20 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(2 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압하에 농축하였다. 미정제 생성물을 Combiflash 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 라세미 혼합물로서 표제 화합물(1.67 g, 85%)을 수득하였다. 라세미 순수 화합물(1.2 g)의 키랄 분리는 키랄 분취용 HPLC를 사용하여 수행하여, 각각의 거울상 이성질체 500 mg을 얻었다. LCMS: 계산치 447.3; ESI-MS m/z = 448.60 [M+H] + 키랄 HPLC: CHIRALPAK AD-H; 액체 CO2 중 30% 메탄올 + 0.1% DEA. FR-1 (이성질체-A1): RT= 7.66분; FR-2 (이성질체-A2): RT= 8.81분; A1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.21-1.25 (m, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.46-1.57 (m, 2H), 1.71-1.74 (m, 2H), 2.02-2.04 (m, 1H), 2.76-2.98 (m, 2H), 2.99-3.15 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.85-4.15 (m, 1H), 4.10-4.15 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 10.56 (s, 1H). A2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.21-1.29 (m, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.46-1.57 (m, 2H), 1.71-1.74 (m, 2H), 2.02-2.04 (m, 1H), 2.78-2.98 (m, 2H), 2.99-3.15 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.85-4.15 (m, 1H), 4.10-4.15 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 10.57 (s, 1H).
1-((2-((R)-1-(3,4-디클로로벤조일)피페리딘-3-일)-4-(이속사졸-4-일카르바모일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-5-일)옥시)에틸 에틸 카르보네이트(실시예 131)의 합성
Figure pct00047
단계-1: ( R )-5-에톡시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 하이드로클로라이드 염:
디클로로메탄(1.32 mL) 및 메탄올(0.66 mL)의 혼합물 중 tert-부틸 (R)-3-(5-에톡시-4-(이속사졸-4-일카르바모일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-2-일)피페리딘-1-카르복실레이트(0.20 g, 0.44 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 디옥산(1 mL) 중 4 M HCl을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 10분 동안 40℃로 가온시켰다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 메탄올로 2회 공비 혼합하여 표제 화합물(0.17 g, 99%)을 고체로서 수득하고, 이를 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. LCMS: 계산치 347.3, ESI-MS m/z = 348.48 [M + H] +
단계-2: ( R )-2-(1-(3,4-디클로로벤조일)피페리딘-3-일)-5-에톡시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드:
건조 DMF(1.7 ml) 중 3,4-디클로로벤조산(0.101 g, 0.53 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 HATU(0.252 g, 0.66 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, (R)-5-에톡시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 하이드로클로라이드 염(0.170 g, 0.44 mmol) 및 DIPEA(0.25 mL, 1.33 mmol)를 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 완료시 반응을 물(15 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 차가운 포화 중탄산나트륨(20 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체로서 표제 화합물(0.21 g, 89%)을 수득하였다. LCMS: 계산치 519.3, ESI-MS m/z = 520.27 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.18-1.32 (m, 3H), 1.55-1.70 (m, 2H), 1.72-1.85 (m, 2H), 2.07-2.10 (m, 1H), 3.15-3.25 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.66-3.70 (m, 1H), 4.07-4.12 (m, 2H), 4.47-4.49 (m, 1H), 7.40-7.42(m, 1H), 7.70-7.73 (m, 2H), 8.74 (s, 1H,), 9.27 (s, 1H), 10.52 (s, 1H).
단계-3: ( R )-2-(1-(3,4-디클로로벤조일)피페리딘-3-일)-5-하이드록시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드:
(R)-2-(1-(3,4-디클로로벤조일)피페리딘-3-일)-5-에톡시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(0.608 g, 1.16 mmol)의 교반된 용액에 디클로로메탄(36 mL)을 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각시키고, 디클로로메탄(4.67 mL, 4.67 mmol) 중 1M BBr3을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 5시간 동안 교반하였다. 완료되면, 반응 혼합물을 농축하고 디클로로메탄(2 x 6 mL)으로 공비 혼합하였다. 잔류물을 0℃로 냉각시키고, 메탄올(5 mL)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 메탄올(2 x 6 mL)로 공비 혼합하여 미정제 화합물을 얻었다. 미정제 화합물을 셀라이트에 로딩하고, 아세토니트릴 및 물 중 0.1% 포름산을 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 실시예 131(0.246 g, 42%)을 얻었다. LCMS: 계산치 491.3, ESI-MS m/z = 492.3 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.44-1.62 (m, 2H), 1.80-1.95 (m, 2H), 2.07-2.10 (m, 1H), 3.15-3.25 (m, 2H), 3.57 (s, 3H), 3.60-3.70 (m, 1H), 4.34-4.52 (m, 1H), 7.40-7.42(m, 1H), 7.70-7.74 (m, 2H), 8.84-8.90 (m, 1H,), 9.30 (s, 1H), 10.42-10.55 (m, 1H), 11.48 (s, 1H).
하기 실시예 및 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 130)의 합성
Figure pct00051
단계-1: tert -부틸 3-시아노-3-메틸피페리딘-1-카르복실레이트:
건조 THF(100 mL) 중 tert-부틸 3-시아노피페리딘-1-카르복실레이트(5.0 g, 24 mmol)의 교반된 용액에 LiHMDS(30.9 mL, THF 중 1M, 30.9 mmol)를 -78℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 그런 다음, MeI(2.22 mL, 35.7 mmol)를 동일한 온도에서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 빙냉수(100 mL)의 혼합물에 붓고, 에틸 아세테이트(2 x 150 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(3.5 g, 65%)을 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 1.35 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.66-1.70 (m, 1H), 1.78-1.81 (m, 2H), 1.87-2.10 (m, 1H), 2.80 (s, 2H), 3.90-4.20 (m, 2H).
단계-2: 3-메틸피페리딘-3-카르보니트릴 TFA 염.
디클로로메탄(70 mL) 중의 tert-부틸 3-시아노-3-메틸피페리딘-1-카르복실레이트(3.5 g, 15.6 mmol)의 교반된 용액에 TFA(12.7 mL)를 0℃에서 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제 화합물을 얻었다. 미정제 화합물을 디에틸 에테르로 분쇄하여 TFA 염으로서 표제 화합물(3.0 g, 81%)을 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 1.40 (s, 3H), 1.63-1.69 (m, 2H), 1.76-1.81 (m, 1H), 1.91-2.06 (m, 1H), 2.82-2.89 (m, 1H), 3.01-3.09 (m, 1H), 3.19-3.22 (m, 1H), 3.56-3.59 (m, 1H), 9.20 (bs, 1H).
단계-3: 1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-카르보니트릴.
건조 DMF(15 mL) 중 3,4-디클로로 벤조산(2.88 g, 15.1 mmol)의 교반된 용액에 HATU(7.18 g, 18.9 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. DIPEA(7 mL, 38 mmol)를 적가한 다음, 실온에서 3-메틸피페리딘-3-카르보니트릴 TFA 염(3.0 g, 12.6 mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 물(30 mL)로 희석하고, 수층을 에틸 아세테이트(2 x 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(2.8 g, 56%)을 얻었다. LCMS: 계산치 296.3, ESI-MS m/z = 297.2 [M+H]+.
단계 4: 1-(3, 4-디클로로벤조일)- N -하이드록시-3-메틸피페리딘-3-카르복스이미다미드:
에탄올(100 ml) 중 1-(3,4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-카르보니트릴(4 g, 13.5 mmol), 하이드록실아민 하이드로클로라이드(2.80 g, 40.4 mmol)의 혼합물을 트리에틸아민 (5.8 ml, 40.4 mmol)에 0℃에서 천천히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 가열한 다음, 농축하고 물(100 mL)로 희석하고 디클로로메탄(2 x 150 mL) 중 10% 메탄올로 추출했다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축하여 고체 형태의 표제 화합물(5.0 g, 69%)을 얻었다. 미정제 생성물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
LCMS: 계산치 329.3, ESI-MS m/z = 330.4 [M+H]+.
단계-5: 디메틸 2-((E)-1-(3, 4-디클로로벤조일)- N '-하이드록시-3-메틸피페리딘-3-카르복스이미다미도) 말레에이트:
클로로포름(100 mL) 중 1-(3,4-디클로로벤조일)-N-하이드록시-3-메틸피페리딘-3-카르복스이미다미드(5.0 g, 15 mmol)의 교반된 용액에 디메틸 아세틸렌디카르복실레이트(3.32 g, 23.4 mmol)를 0℃에서 적가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 TLC로 모니터링한 다음, 농축하여 미정제 생성물을 얻었으며, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(2.4 g, 33%)을 고체 형태로 얻었다. LCMS: 계산치 471.2, ESI-MS m/z = 472.3 [M+H]+.
단계-6: 메틸 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트.
자일렌(15 mL) 중 디메틸 2-((E)-1-(tert-부톡시카르보닐)-N'-하이드록시피페리딘-3-카르복스이미다미도) 말레에이트(2.0 g, 4.2 mmol)의 용액을 마이크로파에서 160℃에서 10분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르 및 헥산으로 분쇄하여 고체를 얻었다. 미정제 잔류물을 셀라이트에 로딩하고, 물 중 아세토니트릴 및 0.1% 포름산을 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(0.40 g, 21%)을 얻었다. LCMS: LCMS: 계산치 439.4, ESI-MS m/z = 440.5 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.10 (s, 2H), 1.27 (s, 3H), 1.58-1.75 (m, 3H), 2.00-2.16 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.60-3.64 (m, 1H), 4.01 (bs, 1H), 7.26 (d, J = 8.4, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.67 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 10.36 (s, 1H), 12.40-12.65 (m, 1H).
단계-7: 메틸 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트.
메틸 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(0.200 g, 0.454 mmol)의 혼합물을 DMSO(50 mL)에 용해시키고, 이를 0℃로 냉각시켰다. 여기에 마그네슘 메톡사이드 용액(1.30 mL, 0.908 mmol, 메탄올 중 6~10%)을 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하여 과량의 메탄올을 제거하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 MeI(0.116 mL, 1.81 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 10℃로 냉각하고, 1N HCl로 천천히 켄칭시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트(2 x 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 미정제 잔류물을 셀라이트에 로딩하고 물 중 아세토니트릴 및 0.1% 포름산을 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(0.20 g, 97%)을 얻었다. LCMS: 계산치 453.4, ESI-MS m/z = 454.2 [M+H]+. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.39 (s, 3H), 1.59 (bs, 1H), 1.75 (bs, 1H), 2.01-2.07 (m, 2H), 3.15-3.25 (m, 1H), 3.32-3.52 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.83-3.86 (m, 1H), 3.99-4.02 (m, 1H), 7.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 10.32 (s, 1H).
단계-8: 메틸 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트:
DMF(1mL) 중 메틸 2-(1-(3,4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(0.20 g, 0.44 mmol)의 교반된 용액에 K2CO3(0.121 g, 0.875 mmol)을 첨가한 다음 MeI(0.042 mL, 0.660 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 물(20 mL)로 희석하고 수층을 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(0.14 g, 67%)을 얻었다. LCMS: 계산치 467.4, ESI-MS m/z = 468.3 [M+H]+
단계-9: 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실산:
메탄올:THF:물(1:1:1, 6 mL)의 혼합물 중 메틸 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트 (0.140 g, 0.298 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 NaOH(0.014 g, 0.36 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 감압 농축하고, 빙냉수(10 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(2 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 수성 층을 0℃에서 1 N HCl로 산성화하고, 디클로로메탄(2 x 30 mL) 중 10% 메탄올로 추출했다. 합한 유기 층을 염수(20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축하여 미정제 표제 화합물(0.130 g, 96%)을 수득하였다. LCMS: 계산치 455.2, ESI-MS m/z = 456.6 [M+H]+
단계-10: 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)- N -(이속사졸-4-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드.
건조 DMF(1.4 mL) 중 2-(1-(3,4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실산(0.140 g, 0.308 mmol)의 교반된 용액에 실온에서 HATU(0.176 g, 0.462 mmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, DIPEA(0.17 mL, 0.99 mmol) 및 이속사졸-4-아민(0.038 g, 0.46 mmol)을 실온에서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 물(20 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출했다. 합한 유기층을 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 표제 화합물(0.135 g, 84%)을 고체 형태로 얻었다. LCMS: 계산치 519.2, ESI-MS m/z = 520.4 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.16-1.19 (m, 3H), 1.19-1.23 (m, 2H), 1.42-1.56 (m, 2H), 3.32-3.52 (m, 2H) 3.62 (s, 3H), 4.01-4.02 (m, 1H), 4.03 (s, 3H), 4.70-4.77 (m, 1H), 7.25-7.27 (m, 1H), 7.59-7.67 (m, 2H), 8.74 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 10.58 (bs, 1H).키랄 HPLC: CHIRALPAK AD-H; 액체 CO2 중 30%(MEOH) + 0.1% DEA: FR-1(이성질체-1): RT=9.39; FR-2(이성질체-2): RT=14.82.
단계-11: 2-(1-(3, 4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-5-하이드록시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-1, 6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드.
디클로로메탄(2 mL)에 용해된 2-(1-(3,4-디클로로벤조일)-3-메틸피페리딘-3-일)-N-(이속사졸-4-일)-5-메톡시-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 FR-1(0.030 g, 0.057 mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시키고, 디클로로메탄(0.28 mL, 0.29 mmol) 중 1M BBr3을 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 진공하에 농축하였다. 메탄올(1 mL)을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 증발시켰다. 잔류물을 메탄올(2 x 1ml)과 공비하여 미정제 화합물(120 mg)을 얻었다. 미정제 잔류물을 셀라이트 상에 로딩하고 아세토니트릴 및 물 중 0.1% 포름산을 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 실시 예 130(0.015 g, 51%)을 얻었다. LCMS: 계산치 505.2, ESI-MS m/z = 506.3 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.35-1.45 (m, 3H), 1.46-1.60 (m, 2H), 1.70-1.80 (m, 2H), 3.15-3.18 (m, 2H), 3.38-3.44 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 7.22-7.24 (m, 1H), 7.59-7.64 (m, 2H), 8.73 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 10.75 (bs, 1H), 11.58 (bs, 1H).
5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(1-페네틸피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 129)의 합성
Figure pct00052
단계-1: 5-에톡시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 하이드로클로라이드 염:
디클로로메탄(3 mL) 및 메탄올(0.5 mL)의 혼합물 중 tert-부틸 3-(5-에톡시-4-(이속사졸-4-일카르바모일)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리미딘-2-일)피페리딘-1-카르복실레이트[A1의 합성으로부터](0.35 g, 0.78 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 디옥산(3 mL) 중 4 M HCl을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 10분 동안 40℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고 메탄올로 2회 공비혼합하여 표제 화합물을 고체(0.290 g, 97%)로 수득하고, 이를 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. LCMS: 계산치 347.5; ESI-MS m/z = 348.5 [M+H] +
단계-2: 5-에톡시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(1-페네틸피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드:
DMF(0.5 mL) 중 5-에톡시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 하이드로클로라이드 염(0.050 g, 0.130 mmol)의 교반된 용액에 트리에틸아민(0.055 mL, 0.391 mmol)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. (2-브로모에틸)벤젠(0.024 g, 0.130 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 수득된 미정제 생성물을 헥산(5 mL)으로 분쇄하고 진공하에 건조시켜 표제 화합물(0.050 g)을 수득하였다. 미정제 표제 화합물을 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. LCMS: 계산치 451.3; ESI-MS m/z = 452.4 [M+H] +
단계-3: 5-하이드록시- N -(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(1-페네틸피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드:
5-에톡시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(1-페네틸피페리딘-3-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(0.05 g, 0.110 mmol)의 혼합물을 디클로로메탄(1 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각시키고, 디클로로메탄(0.22 mL, 0.22 mmol) 중 1 M BBr3을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음, 포화 중탄산나트륨(0.5 mL)을 첨가하고, 디클로로메탄 중 10% 메탄올로 추가로 희석하였다. 잔류물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 미정제 잔류물을 셀라이트 상에 로딩하고, 물 중 아세토니트릴 및 0.1% 포름산을 사용하는 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 순수한 표제 화합물(0.01 g, 21%)을 수득하였다. LCMS: 계산치 423.4: ESI-MS m/z = 424.5 [M+H] +
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.60-1.80 (m, 4H), 1.85-1.95 (m, 1H), 2.66-2.70 (m, 2H), 2.70-3.02 (m, 6H), 3.48 (s, 3H), 7.18-7.28 (m, 5H), 8.77 (s, 1H,), 9.13 (s, 1H), 10.25 (bs, 1H), 11.50 (bs, 1H).
하기 실시예 및 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00053
5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-1-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(실시예 28)의 합성
Figure pct00054
단계-1:
C6(200 mg, 0.769 mmol), 피페리딘(0.76 ml, 7.69 mmol) 및 DMSO의 혼합물을 110℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 TLC로 모니터링하고, C6 소비시 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 얼음물(25 ml)의 혼합물에 붓고 15분 동안 잘 교반하였다. 고체 물질을 여과하고, 물(3 x 10 ml)로 세척하고, 진공하에 잘 건조하여 고체로서 순수한 생성물(172 mg, 72%)을 얻었다. ESI-MS m/z = 310.38 [M+H] + 계산된 MW: 309.371H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 4.00 (q, 2H), 4.26 (q, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.04-3.06 (m, 4H), 1.57-1.62 (m, 6H), 1.20-1.30 (m, 6H).
단계-2: 톨루엔(1 mL) 중 에틸 5-에톡시-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-1-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복실레이트(100 mg, 0.32 mmol), 이속사졸-4-아민(35.3 mg, 0.42 mmol)의 교반된 용액에 톨루엔(0.6ml, 0.64mmol) 중 2M 트리메틸 알루미늄을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 마이크로파 조사하에 30분 동안 80 ℃에서 가열하였다. 반응 완료는 TLC로 확인하고 빙냉수 혼합물에 반응 혼합물을 붓고, 에틸 아세테이트(2 x 10ml)로 추출하였다. 유기층을 염수(2 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 증발시켜 미정제 화합물을 연갈색 고체(104 mg)로 얻었다. 미정제 물질은 정제없이 다음 단계에 사용되었다. ESI-MS m/z = 348.5 [M+H] + 계산된 MW: 347.3
단계-3: 5-에톡시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-1-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드(100 mg, 0.28 mmol)를 디클로로메탄(1 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액에 0℃로 냉각시키고 디클로로메탄(0.5 mL, 0.57 mmol) 중 1M BBr3을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응은 TLC(디클로로메탄 중 10% 메탄올)로 모니터링했다. 완료되면, 용매를 진공 하에서 제거했다. 빙냉수를 잔류물에 첨가하고, 고체를 여과하여 미정제 생성물(83 mg)을 얻었다. 미정제 생성물을 RP-HPLC로 추가로 정제하여 실시예 28, 5-하이드록시-N-(이속사졸-4-일)-1-메틸-6-옥소-2-(피페리딘-1-일)-1,6-디하이드로피리미딘-4-카르복사미드 생성물(10 mg, 0.032 mmol, 11%)을 얻었다. ESI-MS m/z = 320.3 [M+H] + 계산된 MW: 319.3 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.19 (s, 1H), 10.54 (s, 1H), 9.31(s, 1H), 8.92 (s, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.08 (s, 4H), 1.59-1.67 (m, 6H).
하기 실시예 및 중간체는 적당한 출발 물질과 함께 상기 단계에서 기재된 것과 유사한 조건을 사용하여 합성되었다.
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
생화학적 분석
1. 종양 세포에서 TREX1 침묵시키기
세포질 DNA의 감지 및 후속 I형 IFN 생성시 cGAS/STING 경로의 활성화는 종양 세포 및 선천성 면역 세포, 특히 수지상 세포 모두에서 발생할 수 있다. TREX1이 STING 작용제에 의한 I형 IFN의 활성화시 면역-매개 거부를 겪는 잘 설명된 저온 동계 종양 모델에 의해 I형 IFN의 생산을 억제하는지 여부를 평가하기 위해 TREX1을 CRISPR을 사용하여 B16F10 종양 세포에서 녹다운시켰다(도 1a). 종양 세포의 DNA 트랜스펙션을 통한 세포질 DNA의 축적은 모 종양 세포에 비해 TREX1 녹아웃 B16F10 세포에 의한 IFNβ 생산을 약 5배 증가시켰으며, 이는 TREX1이 B16F10 종양 세포에서 cGAS/STING 경로의 활성화를 약화시켰음을 입증했다(도 1b).
2. 생체 내 TREX1-적격 및 -결핍 B16F10 종양 세포의 성장
생체 내 TREX1-적격 및 -결핍 B16F10 종양 세포의 성장을 평가하였다. C57BL/6J 마우스는 오른쪽 옆구리에 300,000개의 부모 또는 TREX1 녹아웃 B16F10 종양 세포를 피하로 접종했다. 체중은 주당 2회 수집되었고, 종양 측정은 종양이 측정 가능해졌을 때 시작하여, 남은 연구 기간 동안 주당 2~3회 수집되었다. TREX1이 침묵된 종양은 모 B16F10 종양보다 훨씬 더 적은 부피로 나타났다(도 2).
연구 종료 후 19일에 종양을 수확하고 단일 세포 현탁액으로 분해하여 종양-침윤 면역 집단의 유세포분석 정량화를 가능하게 했다. TREX1 녹아웃 B16F10 종양은 전체 면역 세포에서 유의미한 증가를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 CD4 및 CD8 T 세포뿐만 아니라 형질세포양 수지상 세포(pDC)에 침투하는 종양의 수의 증가를 반영한다(도 3). pDC는 항원-특이적 항-종양 면역 반응의 유도에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있는 반면, T 세포는 마우스와 인간에서 항-종양 효능의 주요 이펙터로 알려져 있다. 따라서, TREX1이 결핍된 종양의 면역 침윤의 중대한 변화는 후자 종양의 성장 억제가 적어도 부분적으로 면역-매개됨을 시사한다.
TREX1 생화학 분석
반대 가닥에 형광단-켄칭제 쌍을 갖는 맞춤형 dsDNA 기질의 분해를 측정하는 형광 분석을 통해 화합물 효능을 평가하였다. dsDNA의 분해는 자유 형광단을 방출하여 형광 신호를 생성한다. 구체적으로, 반응 완충액(50 mM Tris(pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.1mg/mL BSA, 0.01%(v/v) Tween-20 및 100 mM MgCl2)에서 7.5 μL의 N-말단 His-Tev 태그가 부착된 전장 인간 TREX1(대장균에서 발현되고 실내에서 정제됨)을 384-웰 Black ProxiPlate Plus(Perkin Elmer)에 첨가했으며, 이는 DMSO 내에 이미 다양한 농도의 화합물(150 nL)을 10 포인트 용량-반응으로 포함하였다. 여기에 반응 완충액 중 7.5 μL의 dsDNA 기질(가닥 A: 5' TEX615/GCT AGG CAG 3'; 가닥 B: 5' CTG CCT AGC/IAbRQSp(Integrated DNA Technologies))을 첨가했다. 최종 농도는 1.0% DMSO(v/v)가 포함된 반응 완충액에서 150 pM TREX1, 60 nM dsDNA 기질이었다. 실온에서 25분 후, 5 μL의 정지 완충액(반응 완충액 + 200 mM EDTA와 동일)을 첨가하여 반응을 켄칭했다. 켄칭된 반응에서의 최종 농도는 112.5 pM TREX1, 45 nM DNA 및 50 mM EDTA(부피 20 μL)였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 레이서 소스 Envision(Perkin-Elmer)에서 판독하여, 570 nm 광에서 여기 w/ 후 615 nm에서 형광을 측정하였다. IC50 값은 615 nm 비율에서 측정된 형광을 비선형 최소 제곱 4 매개변수 맞춤 및 Genedata 또는 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.) 중 하나를 사용하여 w/ 정지 완충액(100% 억제)으로 전-켄칭된 대조군 웰과 억제제 없는(0% 억제) 대조군과 비교하여 계산했다.
TREX2 생화학 분석
반대 가닥에 형광단-켄칭제 쌍을 갖는 맞춤형 dsDNA 기질의 분해를 측정하는 형광 분석을 통해 화합물 효능을 평가하였다. dsDNA의 분해는 자유 형광단을 방출하여 형광 신호를 생성한다. 구체적으로, 반응 완충액(50 mM Tris(pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.1mg/mL BSA, 0.01%(v/v) Tween-20 및 100 mM MgCl2)에서 7.5 μL의 N-말단 His-Tev 태그가 부착된 인간 TREX2(잔기 M44-A279, 대장균에서 발현되고 실내에서 정제됨)을 384-웰 Black ProxiPlate Plus(Perkin Elmer)에 첨가했으며, 이는 DMSO 내에 이미 다양한 농도의 화합물(150 nL)을 10 포인트 용량-반응으로 포함하였다. 여기에 반응 완충액 중 7.5 μL의 dsDNA 기질(가닥 A: 5' TEX615/GCT AGG CAG 3'; 가닥 B: 5' CTG CCT AGC/IAbRQSp(IDT))을 첨가했다. 최종 농도는 1.0% DMSO(v/v)가 포함된 반응 완충액에서 2.5 nM TREX2, 60 nM dsDNA 기질이었다. 실온에서 25분 후, 5 μL의 정지 완충액(반응 완충액 + 200 mM EDTA와 동일)을 첨가하여 반응을 켄칭했다. 켄칭된 반응 혼합물에서의 최종 농도는 1.875 pM TREX2, 45 nM DNA 및 50 mM EDTA(부피 20μL)였다. 실온에서 5-분 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 레이서 소스 Envision(Perkin-Elmer)에서 판독하여, 570 nm 광에서 여기 w/ 후 615 nm에서 형광을 측정하였다. IC50 값은 615 nm 비율에서 측정된 형광을 비선형 최소 제곱 4 매개변수 맞춤 및 Genedata 또는 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.) 중 하나를 사용하여 w/ 정지 완충액(100% 억제)으로 전-켄칭된 대조군 웰과 억제제 없는(0% 억제) 대조군과 비교하여 계산했다.
결과는 표 1에 제시되어있다. TREX1 IC50 : A = <0.1 μM; B = 0.1 내지 1 μM; C = 1 내지 10 μM; D = >10 μM. TREX2 IC50 : A = <1 μM, B = 1 내지 10 μM, C = 10 내지 100 μM, D = >100 μM.
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
HCT116 세포 분석
HCT116 이중 세포(Invivogen, San Diego, CA, USA)는 인간 HCT116 결장직장 암종 세포주로부터 유래된다. SEAP 및 루시퍼라제(Luciferase) 리포터 유전자의 안정적인 통합을 위해 세포가 선택되었으며, 이 발현은 각각 NF-KB/AP1 및 STAT1/STAT2에 대한 5개의 직렬 반응 요소의 제어하에 있다. 세포주는 배양 배지에서 분비되는 루시아 루시퍼라제의 활성을 측정하여 I형 인터페론 유도 및 후속 신호전달을 모니터링하는 데 사용되었다.
HCT116 세포는 10% FBS 및 25 mM Hepes(pH 7.2~7.5)가 보충된 100 uL DMEM에서 40,000개 세포/웰로 96-웰 플레이트(들)에 플레이팅되었다. 밤새 침강시킨 후, 제품 설명서 권장 사항에 따라, 세포를 4시간 동안 TREX1i(최대 DMSO 분획은 0.1%임)로 처리한 후 1 ug/mL pBR322/BstNI 제한 분해물(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 리포펙타민(Lipofectamine) LTX(ThermoFisher, Grand Island, NY, USA)으로 트랜스펙션시켰다. 간단히 말해서, 리포펙타민 LTX(0.35 uL/웰)를 OptiMEM(5 uL/웰)에 희석했다. pBR322/BstNI(100 ng/웰)를 OptiMEM(5 uL/웰)에 희석한 후, Plus 시약(0.1 uL/100 ng DNA)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 배양한 후, DNA 혼합물을 희석된 리포펙타민 LTX와 혼합하여 적가하였다. 추가 10분 인큐베이션 후, 트랜스펙션 혼합물(10 uL/웰)를 세포에 첨가했다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 유지시킨 후, 세포 배양 배지로부터 Lucia 루시퍼라제 활성을 모니터링하였다.
이것의 다수의 실시형태를 설명하였지만, 본 개시내용의 화합물 및 방법을 이용하는 다른 실시형태를 제공하기 위해 본 기본 실시예가 변경될 수 있음이 명백하다. 따라서, 본 개시내용의 범위는 예로서 표현된 특정 실시형태보다는 첨부된 청구범위에 의해 정의되어야 한다는 것을 이해할 것이다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌(문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동 계류중인 특허 출원을 포함)의 내용은 본 명세서에 전체적으로 참고로 명시적으로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에게 일반적으로 알려진 의미에 따른다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00062
    (I)
    여기서:
    R1은 수소, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 3원 내지 4원 사이클로알킬, -ORf, -SRf, 또는 -NReRf이고;
    R2는 수소, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 또는 3원 내지 4원 사이클로알킬이며;
    X는 결합, NR3, O, S, 또는 (C1-C4)알킬렌이며, 여기서 상기 (C1-C4)알킬렌은 R4로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
    R3은 수소, (C1-C4)알킬, -C(O)Rd, 또는 -C(S)Rd이며;
    R4는 할로, (C1-C4)알킬, 페닐, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb,-NHC(O)NHRg, -NHC(S)NHRg, -NHS(O)2NHRg, -C(S)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NHRe, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -ORe, -SRe, -O(C1-C4)알킬ORe, 또는 -NReRf이되, 여기서, R4에 대한 상기 페닐은 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 및 할로(C1-C4)알콕시로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고;
    고리 A는 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴, 4원 내지 7원 헤테로사이클릴, 또는 3원 내지 7원 사이클로알킬이며, 이들 각각은 R5로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며;
    R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알콕시, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -NHC(S)ORa, -C(O)Rb, -NHC(O)NHRg, -NHC(S)NHRg, -NHS(O)2NHRg, -C(S)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(S)ORd, -C(O)NReRf, -C(S)NHRe, -NHC(O)Rd, -NHC(S)Rd, -ORe, -SRe, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 R5에 대한 상기 페닐은 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 ORh, -NRjRk, 페닐, 및 5원 내지 6원 헤테로아릴로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 및 4원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rm으로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, 여기서 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 임의의 치환기들의 상기 페닐 및 5원 내지 6원 헤테로아릴은 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며;
    Rg, Rh, Rj, Rk, 및 Rm은 각각 독립적으로 수소, 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 페닐, -(C1-C4)알킬페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 Rg, Rh, Rj 및 Rk에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 추가로 선택적으로 치환되며,
    Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf는 각각 독립적으로 수소, 할로, (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 i) Ra, Rb, Rc, Rd, Re 및 Rf에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, -NRjRk로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며; ii) Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf에 대한 상기 페닐, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로부터 선택되는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되며, iii) Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 추가로 =O로 선택적으로 치환된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 화합물:
    Figure pct00063
    (II).
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, R2는 (C1-C4)알킬인, 화합물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 III의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 화합물:
    Figure pct00064
    (III).
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리 A는 페닐, 피리딜, 피라졸릴, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 아제티디닐, 또는 피페리디닐이고, 이들 각각은 1 또는 2개의 R5로 선택적으로 및 독립적으로 치환되는, 화합물.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고리 A는 트리아졸릴, 피롤리디닐, 디아제파닐, 또는 피페라지닐이고, 이들 각각은 1 또는 2개의 R5로 선택적으로 및 독립적으로 치환되는, 화합물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알콕시, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, S(O)Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -ORe, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이며, 여기서 R5에 대한 상기 페닐은 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 ORh, -NRjRk, 페닐, 및 5원 내지 6원 헤테로아릴로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, 상기 4원 내지 6원 헤테로아릴 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 R5에서 상기 페닐 및 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고;
    Ra는 페닐로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고;
    Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이고, 여기서 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, 및 -NRjRk에서 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되며, 여기서 상기 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴, 및 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 추추가로 선택적으로 치환되며;
    각각의 Rc는 독립적으로 페닐 또는 (C1-C4)알킬이고;
    각각의 Rd는 수소 또는 (C1-C4)알킬이고;
    각각의 Re는 독립적으로 수소 또는 ORh로 선택적으로 치환된 (C1-C4)알킬이고;
    각각의 Rf는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 페닐 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 5원 내지 6원 헤테로사이클릴이고, 여기서 상기 페닐, 3원 내지 4원 사이클로알킬, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 및 5원 내지 6원 헤테로사이클릴은 각각 Rg로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고;
    각각의 Rg는 독립적으로 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로(C1-C4)알콕시, 또는 할로이고;
    각각의 Rh는 수소, (C1-C4)알킬, 또는 -(C1-C4)알킬페닐이고;
    각각의 Rj는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬이고;
    각각의 Rk는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 또는 3원 내지 4원 사이클로알킬이고;
    각각의 Rm은 (C1-C4)알킬인, 화합물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 4원 내지 6원 헤테로아릴, 또는 5원 내지 6원 헤테로사이클릴이며, 여기서 R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 -ORh, 페닐, 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴로 선택적으로 치환되고, 상기 4원 내지 6원 헤테로아릴 및 5원 내지 6원 헤테로사이클릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 상기 페닐 및 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되는, 화합물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, R5는 (C1-C4)알킬, 할로(C1-C4)알킬, 할로, 페닐, -NHC(O)ORa, -C(O)Rb, S(O)2Rc, -C(O)ORd, -C(O)NReRf, -NHC(O)Rd, 또는 -O(C1-C4)알킬ORe, -NReRf, 모르폴리닐, 피페라지닐, 또는 피라졸릴이며, 여기서 상기 모르폴리닐, 피페라지닐, 및 피라졸릴은 각각 Rm으로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, R5에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 -ORh, 페닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 또는 피리디닐로 선택적으로 치환되고, 여기서 R5에서 (C1-C4)알킬에 대해 열거된 선택적 치환기의 상기 페닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 및 피리디닐은 각각 Rg로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되는, 화합물.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Rf는 독립적으로 수소, (C1-C4)알킬, 페닐 피라졸릴, 피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 피페리디닐이고, 여기서 상기 페닐 피라졸릴, 피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 및 피페리디닐은 각각 (C1-C4)알킬로 선택적으로 및 독립적으로 치환되는, 화합물.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Rg는 독립적으로 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 또는 할로인, 화합물.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 5원 내지 6원 헤테로아릴 또는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이고, 여기서 Rb에 대한 상기 페닐 및 5원 내지 6원 헤테로아릴은 각각 할로 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 4원 내지 7원 헤테로사이클릴은 =O로 선택적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, -ORh, 및 -NRjRk로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되는, 화합물.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Rk는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4)알킬인, 화합물.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, Rb는 (C1-C4)알킬, 페닐, 피리디닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 또는 피페리디닐이고, 여기서 Rb에 대한 상기 페닐, 피리디닐, 피라졸릴, 및 피리미디닐은 각각 할로 및 (C1-C4)알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 및 독립적으로 치환되고, 여기서 Rb에 대한 상기 (C1-C4)알킬은 페닐, OH, 및 NMe2로부터 선택된 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되고, Rb에 대한 상기 피페리디닐은 =O로 선택적으로 치환되는, 화합물.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, R3은 수소인, 화합물.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X는 치환되지 않은 (C1-C4)알킬렌인, 화합물.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, R4는 페닐 또는 -NHC(O)ORa인, 화합물.
  18. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X는 결합 또는 CH2인, 화합물.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 대상체의 TREX1 억제에 반응하는 질환을 치료하는 방법으로, 치료적 유효량의 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 청구항 17의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
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