ES2949108T3 - Aparato de muestreo para la separación de sangre completa - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona sistemas, dispositivos, kits y métodos para separar plasma o suero sanguíneo de sangre completa. La presente invención proporciona además sistemas, dispositivos y métodos para separar un volumen de plasma o suero sanguíneo de sangre completa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Aparato de muestreo para la separación de sangre completa
Campo de la invención
La presente invención proporciona dispositivos y métodos para separar un volumen de plasma sanguíneo o suero de la sangre completa.
Antecedentes de la invención
Se requieren varios procesos aguas arriba antes de que un fluido biológico complejo pueda analizarse para detectar analitos. La separación del plasma o el suero también es un proceso aguas arriba fundamental para la detección y el diagnóstico de enfermedades infecciosas. En un entorno de laboratorio, la separación del plasma de la sangre completa se lleva a cabo mediante la centrifugación de la sangre durante 20 minutos a 3000 g. Al hacerlo, los componentes sólidos de la sangre se asientan en el sedimento y el líquido sobrenadante consiste en plasma. Este protocolo generalmente requiere que un técnico cualificado pipetee manualmente el sobrenadante para su posterior análisis. Si bien los sistemas automatizados de preparación de muestras a gran escala pueden eliminar la etapa manual, estos instrumentos son instrumentación costosa, lo que los hace inadecuados para pruebas con recursos limitados o en el punto de atención.
Se han diseñado métodos para integrar la separación centrífuga de sangre con otras etapas aguas abajo a través de una plataforma de microfluidos. Sin embargo, estos métodos funcionan con un volumen extremadamente limitado de sangre completa, requieren el uso de un instrumento para crear la fuerza centrífuga, son propensos a la obstrucción y/o solo logran una pureza limitada. El uso de membranas sintéticas para separar la sangre del plasma evita algunos de los problemas que presentan los sistemas de centrifugación y microfluidos; sin embargo, los dispositivos son complejos debido a la necesidad de múltiples filtraciones y contienen materiales que retardan el flujo de sangre hacia los filtros.
La presente invención busca proporcionar un dispositivo de recolección y almacenamiento de fluidos corporales como una muestra seca que proporcione una mayor estabilidad/longevidad de la muestra y protección contra la contaminación o degradación.
La presente invención proporciona sistemas, dispositivos, kits y métodos para separar el plasma sanguíneo de la sangre completa. En particular, la presente invención proporciona sistemas, dispositivos y métodos para separar un volumen (por ejemplo, un volumen fijo) de plasma sanguíneo o suero del componente celular sanguíneo de la sangre completa.
El documento US6036659 describe un dispositivo de filtro de flujo lateral que se relaciona para separar las células sanguíneas de la sangre completa.
STAMATIALIS Y OTROS: "Medical applications of membranes: Drug delivery, artificial organs and tissue engineering", JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE, ELSEVIER BV, NL, volumen 308, núm. 1-2, 19 de diciembre de 2007 (2007-12-19), páginas 1-34describe una lámina plana enrollada en espiral alrededor de un núcleo cilíndrico que se usa para separar las células sanguíneas de la sangre completa.
Específicamente, la invención que se reivindica proporciona un aparato que permite la recolección, separación y secado de la sangre, así como también el almacenamiento en un cartucho cerrado, y usa una membrana en espiral que permite la separación de la sangre por flujo lateral en forma de espiral redonda.
Breve descripción de la invención
La presente invención proporciona un método para separar las células sanguíneas de la sangre completa de acuerdo con la reivindicación 1 y un dispositivo para separar el plasma o el suero de la sangre completa de acuerdo con la reivindicación 4. La invención puede integrarse en un aparato de un solo uso para la recolección y el almacenamiento de la sangre como una muestra seca que comprende componentes estructurales que forman una(s) cámara(s) circular(es) interior(es) que contiene(n) material(es) de recolección de muestra(s) y un desecante, el material de recolección de muestra está en comunicación continua con un tubo capilar o abertura que se extiende hacia el exterior del dispositivo y a través del cual el usuario introduce el fluido a recolectar. El diseño todo en uno del dispositivo lo hace ideal para la recolección de muestras de sangre en el campo, donde la recolección de muestras convencional sería difícil.
La invención proporciona un dispositivo que tiene una membrana filtrante en espiral que permite la separación de la sangre mediante el flujo lateral. La forma en espiral de la membrana permite la separación de los componentes de la sangre en virtud del flujo lateral.
La presente invención proporciona un método para separar las células sanguíneas de la sangre completa que comprende las etapas de: a) proporcionar: i) un módulo de filtro, en el que dicho módulo de filtro comprende una membrana en espiral que se configura para permitir el paso del plasma o el suero sanguíneo, pero no de otros componentes de la sangre tales como los glóbulos rojos o los glóbulos blancos; y ii) una muestra de sangre; b) aplicar dicha muestra de sangre a dicha membrana en espiral de dicho módulo de filtro; y c) filtrar dicha muestra de sangre a través de dicha membrana en espiral mediante el uso de un flujo lateral. En algunas modalidades, el módulo de filtro acomoda un volumen fijo de muestra de sangre.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una membrana de filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención;
La Figura 2 muestra un dispositivo de recolección de fluidos de acuerdo con una modalidad de la invención; La Figura 3A muestra el uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención;
La Figura 3B muestra los resultados del uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención; La Figura 4A muestra el uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención;
Las Figuras 4B a la 4D muestran los resultados del uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención;
La Figura 5A muestra el uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención;
La Figura 5B muestra los resultados del uso de un filtro en espiral de acuerdo con una modalidad de la invención. Descripción de las modalidades ilustrativas
La invención se dirige a un método para separar las células sanguíneas de la sangre completa y un dispositivo que se relaciona para separar las células sanguíneas de la sangre completa. La invención puede usarse en un dispositivo de muestreo de fluidos. El fluido que se muestrea es sangre. El dispositivo contiene uno o más materiales de muestreo adecuados para recolectar el fluido corporal. Los materiales de recolección de muestras pueden incluir, como ejemplos no limitantes, papel de filtro u otro soporte sólido hecho de materiales que incluyen nailon, polipropileno, poliéster, rayón, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa, éteres de celulosa mixta, filtros de microfibra de vidrio, algodón, microfibra de cuarzo, politetrafluoroetileno, fluoruro de polivinilideno y similares. En algunas modalidades preferidas de la invención, los materiales de recolección de muestras pueden tratarse químicamente para ayudar a la retención de muestras, la preparación de pruebas o aumentar la longevidad de las muestras, entre otras cosas. Los ejemplos no limitantes incluyen: inactivar bacterias y/o virus; desnaturalizar proteínas; lisar células, inactivar proteasas, ARNsas, ADNsas y otras enzimas, y/o ayudar en la preparación de muestras. En algunas modalidades preferidas, el material de muestreo puede perforarse o dividirse para proporcionar al muestreador o probador piezas de material de muestreo fácilmente separables.
En algunas modalidades de la invención, el material de recolección se coloca sobre un material de recolección de muestras, tal como un filtro que tiene una forma de espiral.
En algunas modalidades preferidas de la invención, el interior del dispositivo contiene un agente de secado o desecante para eliminar la humedad de la muestra. En modalidades adicionales de la invención, el agente de secado o desecante se separa del filtro por una barrera de tipo malla.
En ciertas modalidades, el interior del dispositivo contiene una barrera para calibrar la velocidad de secado de la muestra. La barrera se hace de materiales tales como papel de filtro, papel encerado, plásticos con pequeños orificios y se coloca entre la barrera de tipo malla y el desecante.
En algunas modalidades preferidas de la presente invención, el dispositivo comprende adicionalmente una lanceta, una aguja u otro mecanismo para perforar la piel con el fin de proporcionar acceso al fluido corporal particular.
En ciertas modalidades de la invención, el dispositivo que se reivindica proporciona un tamaño compacto para un fácil manejo. En modalidades adicionales de la invención, el dispositivo proporciona la separación de fluidos de una muestra pequeña (2-6 gotas) (de la sangre completa) y el secado y almacenamiento para el análisis aguas abajo. Adicionalmente, el dispositivo muestra una hemólisis baja de la muestra de sangre en la membrana en espiral. La presente invención proporciona sistemas, dispositivos, kits y métodos para separar el plasma o el suero sanguíneo de la sangre completa. En particular, la presente invención proporciona sistemas, dispositivos y métodos para separar un volumen (por ejemplo, un volumen fijo) de plasma sanguíneo o suero de la sangre completa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona sistemas y dispositivos para separar el plasma o el suero sanguíneo de la sangre completa. En algunas modalidades, los dispositivos separan el plasma o el suero sanguíneo de otros componentes sanguíneos (por ejemplo, de las células sanguíneas). En algunas modalidades, la presente invención proporciona un elemento de filtro. En algunas modalidades, se añade la sangre completa (por ejemplo, sin filtrar) a un elemento de filtro y la sangre se filtra (por ejemplo, por acción capilar, por gravedad, etc.) a través del elemento de filtro mediante el uso del flujo lateral. En algunas modalidades del dispositivo, pueden añadirse ciertos analitos al elemento de filtro como un estándar interno.
Una modalidad de la invención se refiere a un método para filtrar el plasma o el suero sanguíneo que comprende: a) proporcionar: i) un módulo de filtro, en el que dicho módulo de filtro comprende un filtro que se configura para permitir el paso del plasma o el suero sanguíneo, pero no de otros componentes sanguíneos; y ii) una muestra de sangre; b) aplicar dicha muestra de sangre a dicho filtro de dicho módulo de filtro; y c) filtrar dicho plasma o suero sanguíneo a través de dicho filtro.
Otra modalidad de la invención se dirige a un dispositivo para separar el plasma o el suero de la sangre completa que comprende a) un módulo de filtro, en el que dicho módulo de filtro comprende un filtro que se configura para permitir el paso del plasma o el suero sanguíneo, pero no de otros componentes sanguíneos.
La presente invención proporciona un elemento de filtro. En algunas modalidades, uno o más componentes sanguíneos (por ejemplo, los componentes celulares) se mueven más lentamente a través del elemento de filtro que el plasma sanguíneo. En algunas modalidades, los componentes sanguíneos distintos del plasma (por ejemplo, los componentes celulares) son incapaces de moverse a través del elemento de filtro. En algunas modalidades, el plasma sanguíneo avanza rápidamente (por ejemplo, más rápidamente que otros componentes sanguíneos) a través del elemento de filtro. En algunas modalidades, el elemento de filtro comprende un filtro capaz de separar el plasma sanguíneo de otros componentes sanguíneos en base a la capilaridad. El filtro es una membrana en espiral. Se muestra una membrana en forma de espiral, de acuerdo con una modalidad de la invención se muestra en la Figura 1.
Las ventajas/beneficios de usar una membrana en espiral incluyen un tamaño compacto que se ajusta en un cartucho (fácil manejo). Adicionalmente, una membrana en espiral permite la separación de fluidos de una muestra pequeña (2-6 gotas) (de la sangre completa) y el secado y el almacenamiento para pruebas aguas abajo. Además, el uso de una membrana en espiral reduce el nivel de hemólisis de la muestra de sangre durante el movimiento sobre la membrana en virtud del uso del movimiento lateral de la muestra sobre la membrana.
El dispositivo de la presente invención presenta ventajas/beneficios en comparación con los dispositivos de separación de sangre existentes. Estas ventajas incluyen la separación de células tales como los glóbulos rojos y los glóbulos blancos de la sangre completa; el uso de un agente de secado (desecante) que se separa de la membrana de muestreo por una malla de plástico con orificios de ventilación que permiten un secado rápido; y la capacidad de calibrar la velocidad de secado y, por lo tanto, controlar el área de muestra resultante.
Como se establece en la Figura 2, el dispositivo de la invención 100 que se reivindica comprende varios componentes. Se proporciona un cartucho 110 hermético a la humedad. Dentro del cartucho 110, el aplicador 120, la membrana de muestreo 130, la barrera de malla 140 y el desecante 150 se disponen como se muestra en la Figura 2. La barrera de malla 140 se dispone entre el desecante 150 y la membrana de muestreo 130 para evitar el contacto entre el desecante y la membrana de muestreo mientras se avanza en el proceso de secado. En ciertas modalidades, se inserta una barrera adicional 160 entre la barrera de malla 140 y el desecante 150. La barrera 160 calibra la velocidad de secado de la muestra y proporciona una lectura precisa del componente que se mide.
Ejemplos de trabajo
Se examinaron múltiples diseños en un intento de identificar una forma ideal que pudiera tomar ventaja de la plataforma existente HemaSpot, mientras que proporciona suficiente área superficial y longitud para permitir que el plasma/suero se separe de los glóbulos rojos, mientras permanece lo suficientemente concentrado para permitir un fácil aislamiento del material suficiente para el trabajo analítico. Si bien una línea recta para que la sangre se absorba es el diseño más obvio para el proceso de separación, una línea recta no se ajustaría en la plataforma HemaSpot, mientras que un diseño circular sería compacto y se ajustaría bien.
Después de investigar una serie de ensayos de diseño, todas diseñadas para ajustar debajo del aplicador HemaSpot y encima del desecante HemaSpot, se identificó un diseño en espiral final que podría proporcionar el área necesaria para hasta 150 μL de sangre completa y la longitud requerida para permitir la separación del componente de plasma o suero de la sangre completa.
Se realizaron ensayos para identificar el área del material que ocuparían los glóbulos rojos. Con la adición de 50, 75 y 100 μL de sangre completa (WB), se encontró que el área promedio de los glóbulos rojos (RBC) era de 4,0 mm-2/ μL WB. Para un estimado de 80 a 100 μL de WB de una punción en el dedo, el área que ocupan los RBC sería entre 320 y 400 mm-2.
Con este fin, se elaboraron formas en espiral (ver Figura 1 y 2) con una porción central que oscilaba entre aproximadamente 12-14 mm de diámetro, comprendiendo hasta 154 mm-2de área. Esta área es suficiente para contener los RBC de 40 μL de WB con un hematocrito promedio (HCT). Con el brazo en espiral de aproximadamente 8 mm de ancho alrededor del centro, se esperaría que los RBC se movieran solo un cuarto de la circunferencia alrededor de la espiral. El plasma o el suero ocuparía el resto del brazo en espiral.
En un ensayo experimental, se colocó una muestra de sangre en una membrana en espiral en una localización " 0" como se indica en la Figura 3A. Se tomaron punzones de 4 mm de la porción del plasma alrededor de la espiral para analizar cualquier efecto cromatográfico que pudiera tener el material de filtro sobre la proteína total. Una imagen de este arreglo se proporciona en la Figura 3A. Los resultados del análisis de las proteínas de cada uno de los cuatro punzones de dos ensayos se proporcionan en la Figura 3B. De la Figura 3B, puede observarse un efecto cromatográfico de la proteína total a medida que la localización del punzón se mueve lejos del frente de los glóbulos rojos. Cuanto más lejos esté la localización de la muestra del punzón, mayor será la concentración de proteína debido a la presencia de cantidades crecientes de plasma y suero en localizaciones del filtro más alejados del sitio de muestreo. Así, hay mayor cantidad de proteína a una distancia de 16 mm del sitio de muestreo que a 8 mm. Como se muestra en las Figuras 4A a 4C, se aplicó sangre humana fresca completa a la forma en espiral y se secó. Los punzones se retiraron como se indica (Figura 4A) y se extrajeron. El ADN se aisló mediante el uso de métodos estándar de DNAzol y se midió mediante la fluorescencia del Pico Green (Figura 4B). El ARN se aisló mediante métodos Trizol y se analizó por absorbancia a 260 y 280 nm (Figura 4C). Se analizó una molécula pequeña, nifedipina, mediante métodos LC-MS/MS (Figura 4D). Como se muestra en la Figura 4B, la mayor concentración de ADN se localiza en el sitio donde se introduce la muestra en el filtro. De manera similar, la concentración de ARN es mayor en el sitio donde se introduce la muestra en el filtro. Las concentraciones de ARN y ADN disminuyen drásticamente a medida que aumenta la distancia entre la localización del punzón y el sitio de muestreo.
Se aplicó sangre humana fresca completa a una membrana en espiral y se secó (Figura 5A). Los punzones se retiraron como se indica (Figura 5A) y se extrajeron. Los niveles de homocisteína se midieron mediante métodos LC-MS/MS (Figura 5B). Como se ve en la Figura 5B, hay una mayor cantidad de homocisteína en una localización del punzón 4, es decir, la localización más alejada del sitio de muestreo que en la localización del punzón 1, es decir, la localización más cercana al sitio de muestreo. Este resultado demuestra que los niveles de homocisteína son más altos en las áreas de plasma que en las áreas de células.
Las modalidades de la invención proporcionan la capacidad de tomar muestras de componentes específicos de la sangre completa de manera eficiente en una sola muestra. La presente invención proporciona un dispositivo y un método que ahorra tiempo y espacio para tomar muestras de la sangre completa mediante el uso de cantidades mínimas de muestra (2-6 gotas).
Aunque se han descrito modalidades particulares de la invención, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (10)
1. Un método para separar las células sanguíneas de la sangre completa que comprende las etapas de:
a) proporcionar:
i) un módulo de filtro, en el que dicho módulo de filtro comprende una membrana en espiral que se configura para permitir el paso del plasma o el suero sanguíneo, pero no de otros componentes sanguíneos tales como los glóbulos rojos o los glóbulos blancos; y
ii) una muestra de sangre;
b) aplicar dicha muestra de sangre a dicha membrana en espiral de dicho módulo de filtro; y
c) filtrar dicha muestra de sangre a través de dicha membrana en espiral mediante el uso de un flujo lateral.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho módulo de filtro se adapta para recibir un volumen fijo de dicha muestra de sangre.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el módulo de filtro es un cartucho que tiene una cámara interior que aloja el filtro.
4. Un dispositivo para separar el plasma o el suero de la sangre completa que comprende un módulo de filtro que se caracteriza por que dicho módulo de filtro comprende una membrana en espiral que se configura para permitir el paso lateral del plasma o el suero sanguíneo, pero no de otros componentes sanguíneos tales como los glóbulos rojos o los glóbulos blancos.
5. El dispositivo de la reivindicación 4, en el que dicho módulo de filtro se adapta para recibir un volumen fijo de la sangre completa.
6. El dispositivo de la reivindicación 4, que comprende además un agente de secado dentro del módulo de filtro.
7. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que el agente de secado se separa de la membrana en espiral por una barrera de tipo malla.
8. El dispositivo de la reivindicación 7, que comprende además una barrera para calibrar la velocidad de secado de la muestra.
9. El dispositivo de la reivindicación 4, en el que el módulo de filtro es un cartucho que tiene una cámara interior que aloja el filtro.
10. Un método para separar las células sanguíneas de la sangre completa mediante el uso del dispositivo de la reivindicación 4.
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