ES2941679T3

ES2941679T3 - Polipéptidos, células y procedimientos que implican CD16 modificados

Info

Publication number: ES2941679T3
Application number: ES15716303T
Authority: ES
Inventors: Bruce Walcheck; Dan Kaufman; Jianming Wu; Yawu Jing; Zhenya Ni
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2023-05-24
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: US11370825B2; AU2022204134B2; JP2017511135A; PT3122769T; JP2025004257A; US20200017570A1; CN106715467B; US12098182B2; JP2022121484A; CN106715467A; US20210332103A1; US20170174743A1; EP3122769B1; JP6795399B2; JP7091423B2; AU2019250155A1; EP4227318A1; AU2019250155B2; WO2015148926A1; JP7575426B2

Abstract

Esta descripción describe, en general, una forma modificada de CD 16, células genéticamente modificadas que expresan el CD 16 modificado y métodos que implican células genéticamente modificadas. La forma modificada de CD 16 puede exhibir una mayor actividad antitumoral y/o antiviral debido, al menos en parte, a una susceptibilidad reducida a la excreción mediada por ADAM17 tras la estimulación de células NK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos, células y procedimientos que implican CD16 modificados

Antecedentes

El documento US-2009/196870 describe proteínas de fusión de dominio de unión-inmunoglobulina que presentan un dominio de unión para una estructura afín tal como un antígeno, un contrarreceptor o similar.

El documento WO 2010/040091 describe nanoestructuras de ADN que promueven la interacción célula-célula y su uso. El documento EP1734119 describe variantes de CD16-II humanas, secuencias de ADN que las codifican, su uso en terapia y/o en diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias, así como composiciones farmacéuticas que las comprenden.

Resumen

Esta descripción describe, generalmente, una forma modificada de CD16, células modificadas genéticamente que expresan el CD16 modificado y procedimientos que implican las células modificadas genéticamente. La forma modificada de CD16 puede exhibir una mayor actividad antitumoral y/o antiviral debido, al menos en parte, a una susceptibilidad reducida a la eliminación mediada por metaloproteasa tras la estimulación con células NK.

Esta descripción describe una célula modificada genéticamente para expresar un polipéptido CD16 que tiene una región proximal de membrana y una modificación de aminoácidos en la región proximal de membrana.

Esta descripción describe una célula que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 que tiene región proximal a la membrana y una modificación de aminoácidos en la región proximal de la membrana.

En algunas descripciones, la modificación de aminoácidos refleja una adición de uno o más aminoácidos, una deleción de uno o más aminoácidos, o una sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la región proximal de la membrana de CD 16. En algunas de estas descripciones, la sustitución de uno o más aminoácidos incluye una sustitución del residuo de serina en la posición 197 de la SEQ ID NO:1.

La célula puede ser un Linfocito Citolítico Natural (NK), un neutrófilo, un monocito o una célula T.

El polipéptido CD16 modificado exhibe una susceptibilidad reducida a la eliminación mediada por ADAM17 en comparación con un polipéptido CD16 de tipo silvestre.

El polipéptido CD16 modificado presenta una susceptibilidad reducida a la escisión tras la estimulación con células NK en comparación con un polipéptido CD1 de tipo silvestre.

Esta descripción describe un procedimiento que generalmente implica administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una terapia que incluye (a) administrar al paciente un efector terapéutico NK y (b) administrar al paciente cualquier realización de la célula modificada genéticamente resumida anteriormente.

En algunas descripciones, el efector terapéutico NK incluye un agente terapéutico. El agente terapéutico puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo terapéutico. El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, puede unirse específicamente a un antígeno viral. En otras divulgaciones, el anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, se une específicamente a un antígeno tumoral.

En algunas divulgaciones, el agente terapéutico puede incluir un acoplador de linfocitos citolíticos biespecíficos (BiKE) o un acoplador de linfocitos citolíticos triespecíficos (TriKE).

Otra divulgación describe un procedimiento para mejorar la inmunoterapia a un paciente, en el que la inmunoterapia implica administrar al paciente un efector terapéutico NK. Generalmente, el procedimiento incluye administrar adicionalmente al paciente cualquier realización de la célula modificada genéticamente resumida anteriormente.

El resumen anterior no pretende describir cada realización descrita o cada implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud se proporcionan directrices mediante listas de ejemplos, cuyos ejemplos pueden utilizarse en varias combinaciones. En cada caso, la lista enumerada sirve solo como un grupo representativo y no debe interpretarse como una lista exclusiva.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Localización de sitios de escisión del ectodominio en CD16 humano. (A) Se sometieron péptidos trípticos de CD16 solubles inmunoprecipitados del sobrenadante celular de células NK humanas activadas con PMA o neutrófilos A análisis de espectrometría de masas. Se identificaron cuatro péptidos de alta confianza con extremos C no trípticos: 1 péptido de CD16 soluble liberado por células NK (Péptido #1, superior izquierdo) y 3 péptidos de CD16 soluble liberado por neutrófilos (Péptido #2, inferior izquierdo; Péptido #3, superior derecho; y Péptido #4, inferior derecho). (B) Ilustración de los Péptidos #1-4 (subrayados) y sitios de escisión putativos (puntas de flecha) en CD16a (SEQ ID NO: 1) y CD16b (SEQ ID NO: 2). El aminoácido 176 distingue a CD16a (F) de CD16b (V) en los péptidos identificados. Los aminoácidos 1 -16 indican secuencias señal predichas de CD16a y CD16b. Los aminoácidos 210-229 indican la región transmembrana de CD16a. La numeración de aminoácidos comienza con metionina en la secuencia señal. Las secuencias de aminoácidos de CD16a y CD16b son de las secuencias de referencia NCBI NM_000569,6 y NM_000570,4, respectivamente.

FIG. 2. Ilustración esquemática de la eliminación del ectodominio de CD16, la región de escisión y la mutación de serina-197 a prolina modificada. CD16a y CD16b experimentan la eliminación del ectodominio por ADAM17 dentro de una región proximal de membrana, como se indica. La región de escisión de CD16 dentro de la región proximal de membrana se basa en el análisis de espectrometría de masas que reveló tres sitios de escisión distintos en estrecha proximidad (puntas de flecha). Se realizó mutagénesis dirigida al sitio para sustituir serina-197 en CD16 (aminoácidos 190-202 de SEQ ID NO: 1) con una prolina (CD16/S197P).

FIG. 3. Efectos de la mutación de S197P modificada en CD16a y la eliminación de CD16b. Células HEK293 transfectadas (riñón embrionario humano) expresaron por separado CD16b y CD16b/S197P (A) o CD16a y CD16a/S197P (B) a niveles similares, según se determina por citometría de flujo (paneles a la izquierda). Los diferentes transfectantes se trataron con o sin PMA (15 ng/ml durante 30 minutos a 37 °C) y los niveles solubles de CD16 en el sobrenadante de medios se cuantificaron mediante ELISA (paneles a la derecha). Cada condición de tratamiento se repitió tres veces para cada experimento y los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los gráficos de barras muestran la media ± DE. La significación estadística se indica como ***P<0, 001. (C) Células HEK293 transfectadas expresaron L-selectina (CD62L) o L-selectina y CD16b/S197P. Se midieron los niveles superficiales de L-selectina y CD16b/S197P en células transfectadas y transfectadas de manera simulada usando citometría de flujo (gráficos de histograma). Se incubaron transfectantes que expresan L-selectina o L-selectina y CD16b/S197P en presencia o ausencia de PMA durante 30 minutos a 37 0C, y se determinó la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la tinción con L-selectina determinada (gráfico de barras). Cada condición de tratamiento se repitió tres veces para cada experimento y los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los gráficos de barras muestran la media ± DE. La significación estadística se indica como *P<0, 05. Para todos los gráficos de histograma, el eje x = Log 10 fluorescencia y el eje y = número de células.

FIG. 4. Efectos de la mutación de S197P modificada en la eliminación de CD 16a en células NK. Las células NK92 transducidas con vector vacío (solo vector), CD 16a o CD16a/S197P se trataron sin (Unstim) o con PMA (100 ng/ml) durante 30 minutos a 37 °C (A), con iL-12 e IL-18 (100 ng/ml y 400 ng/ml, respectivamente) durante 24 horas a 37 °C (B), o con células Raji y rituximab durante 60 minutos a 37 °C (C). Los niveles en la superficie celular de CD16a se determinaron mediante citometría de flujo. La tinción de anticuerpo de control negativo de isotipo compatible se indica mediante una línea de puntos. (D) Células NK92 parenterales y células transducidas que expresan CD16a o CD16a/S197P se trataron con células Raji y rituximab en presencia o ausencia del inhibidor ADAM17 BMS566394 (5 pM) durante 60 minutos a 37 °C. Los niveles solubles de CD16a se determinaron mediante ELISA. Cada condición de tratamiento se repitió tres veces y los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los gráficos de barras muestran la media ± DE. La significación estadística se indica como ***P<0, 001. Las células NK92(E) que expresan CD16a o CD16a/S197P se tiñeron con los mAb anti-ADAM17 M220, 623, 633, o un anticuerpo de control negativo de isotipo compatible, como se indica. (F) Células NK CD56 CD45+ derivadas de iPSC transducidas de manera simulada (panel a la izquierda) o iPSC que expresan CD16a o CD16a/S197P recombinante (paneles a la derecha) se incubaron con o sin células diana K562 durante cuatro horas a 37 0C. Para todos los gráficos de histograma, el eje x = Log 10 fluorescencia, el eje y = número de células, y los datos son representativos de al menos 3 experimentos independientes.

FIG. 5. Efectos de la mutación de S197P modificada en la función de CD 16a. (A) Células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P a niveles equivalentes (panel a la izquierda) se trataron con IgG humana monomérica (0-20 pg/ml). Como controles, las células también se trataron con IgA humana monomérica (20 pg/ml) y las células parentales NK92 se trataron con IgG (20 pg/ml) (bar). La unión de anticuerpos se determinó mediante citometría de flujo, como se describe en Materiales y Procedimientos. El gráfico de barras muestra la media ± DE de al menos tres experimentos separados. La significación estadística se indica como *P<0, 05 frente a IgG (0 pg/ml), IgA o células parentales de NK92 IgG. (B) Células NK92 transducidas de manera simulada o células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P se incubaron en ausencia (Unstim) o presencia de células Raji tratadas con o sin rituximab anti-CD20 para los instantes de tiempo indicados a 37 °C. La activación celular de NK92 se evaluó mediante la regulación por aumento en la tinción con CD107a mediante citometría de flujo. Para los gráficos de histograma, el eje x = Log 10 fluorescencia y el eje y = número de células. Los datos son representativos de al menos 3 experimentos independientes.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

Esta descripción describe, generalmente, una forma modificada de CD16a, células modificadas genéticamente que expresan el CD16a modificado y procedimientos que implican las células modificadas genéticamente. La forma modificada de CD16a puede exhibir una mayor actividad antitumoral y/o antiviral debido, al menos en parte, a una susceptibilidad reducida a la eliminación mediada por metaloproteasa tras la estimulación con células NK.

La presente invención se refiere más específicamente a una célula que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 modificado que comprende una región proximal de membrana y comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la región proximal de membrana de CD16, en donde la sustitución comprende la sustitución del residuo de serina con un residuo de prolina en la posición 197 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido CD16 modificado presenta una susceptibilidad reducida a la escisión en comparación con un polipéptido CD16 de tipo silvestre, y sus realizaciones adicionales.

A diferencia de muchos tipos de cáncer sólido, la tasa de supervivencia de las mujeres con cáncer de ovario epitelial ha cambiado poco en los últimos 30 años. Además, las terapias estándar actuales para el cáncer de ovario recurrente proporcionan una baja (<20 %) tasa de respuesta. A pesar de la sobreexpresión de HER2 por muestras de cáncer de ovario, el tratamiento con el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab proporciona solo respuestas limitadas en pacientes con cáncer de ovario avanzado. Esta resistencia al trastuzumab puede surgir de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por células NK disfuncionales. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de estrategias terapéuticas innovadoras. Se describe un enfoque novedoso para proporcionar estrategia de tratamiento terapéutico.

Una preocupación con el cáncer de ovario es que el medio en el que se desarrollan células tumorales puede ser altamente proinflamatorio y, por lo tanto, probablemente promover la escisión de CD16a en células NK infiltrantes y, en consecuencia, disminuir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Varios anticuerpos han surgido como terapias dirigidas eficaces para tratar neoplasias malignas humanas. Su eficacia se debe en parte a las interacciones de anticuerpos con FcYRIIIa/CD16a en Linfocitos Citolíticos Naturales (NK) y la inducción de la destrucción de células cancerosas por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. El receptor Fc de IgG humana CD16 (FcyRIII) consiste en dos isoformas: CD16a (FcyRIIIa) y CD16b (FcyRIIIb). CD16a se expresa por Linfocitos Citolíticos Naturales (NK) y CD16b se expresa por neutrófilos. La activación de células NK da como resultado una rápida regulación negativa en los niveles superficiales de ambas isoformas de CD16 mediante un procedimiento denominado eliminación de ectodominio - un evento proteolítico que implica la metaloproteasa ADAM17 y se produce en una única región extracelular proximal a la membrana plasmática (FIG.

1A).

Como se señaló anteriormente, los pacientes con cáncer de ovario pueden ser resistentes a las inmunoterapias mediadas por células NK, es decir, los tumores no son sensibles a las terapias mediadas por células NK. Por ejemplo, las células de cáncer de ovario expresan típicamente el receptor HER2 del factor de crecimiento epidérmico, pero su direccionamiento con el anticuerpo terapéutico trastuzumab ha proporcionado solo una respuesta clínica limitada. Esta resistencia puede resultar, al menos en parte, de la eliminación del ectodominio-es decir, la activación de las células NK por citocinas, la interacción de células diana y/o la infiltración tumoral puede dar como resultado una escisión de CD16a y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos deteriorados. Por lo tanto, el bloqueo del procedimiento de la eliminación del ectodominio tiene importancia clínica.

Hemos determinado los sitios de escisión de CD16a y CD16b usando espectrometría de masas y se clonaron los ADNc de CD16a y CD16b a partir de leucocitos de sangre humana. Cada ADNc se mutó de manera dirigida para inducir un cambio de aminoácido único. La serina en la ubicación 197 se cambió a una prolina. (FIG. 1B). Esta mutación bloquea la escisión de CD16a y CD16b, y previene su regulación negativa tras la activación celular. La expresión de CD16a resistente a la escisión en células NK expandidas ex vivo mantienen altos niveles superficiales de este receptor de Fc de IgG, lo que mejora la estimulación de células NK, la eficacia de los anticuerpos terapéuticos y la destrucción de células cancerosas.

ADAM17 tiene un número de sustratos de superficie celular, pero no posee secuencia consenso para la proteólisis que puede usarse para predecir el sitio de escisión de CD16a. Por lo tanto, se usó LC-MS-MS para determinar el sitio de escisión del extremo C en CD16 soluble liberado de leucocitos de sangre periférica humana activada. Se observaron tres ubicaciones de escisión putativas en la región proximal de la membrana de CD16 (FIG. 2, puntas de flecha), una región que es idéntica entre CD16a y CD16b. Aunque la proteólisis de ADAM17 no requiere una secuencia consenso, la estructura secundaria de la región de escisión es importante. En un intento de bloquear la escisión de CD16a, sustituimos serina-197 con una prolina (CD16a197P) para introducir un cambio conformacional.

Se identificó la ubicación de la escisión de CD16 mediante la inmunoprecipitación de CD16 del sobrenadante de medios de células NK activadas y, por separado, del sobrenadante medio de neutrófilos. El CD16 inmunoprecipitado se trató con PNGasaF para eliminar los N-glicanos, digeridos con tripsina y los péptidos generados sometidos a análisis espectrométrico de masas. Se identificaron cuatro patrones de péptidos diferentes de alta confianza que contenían extremos C no trípticos (FIG. 1A).

Para CD16 enriquecido a partir del sobrenadante de medios de células NK activadas, se observó solo un patrón de péptidos, que corresponde a aminoácidos glicina-174 a través de alanina-195 (Péptido #1, FIG. 1A) de SEQ ID NO:1. Las regiones proximales de membrana de CD16a y CD16b tienen secuencias de aminoácidos idénticas excepto por el residuo 176. Una fenilalanina en esta ubicación es indicativa de CD16a, que estaba presente en el Péptido #1 (FIG. 1A y B). Este Péptido reveló una posición de escisión de P1/P1 no tríptica en alanina-195/valina-196 (FIG. 1B).

Para CD16 enriquecido a partir del sobrenadante de medios de neutrófilos activados, se detectaron tres patrones de péptidos diferentes con extremos C no trípticos (Péptidos N.° 2-4, FIG. 1A y 1B). El Péptido #2 corresponde a los aminoácidos glicina-174 a través de alanina-195 de la SEQ ID NO:2, el Péptido #3 corresponde a los aminoácidos glicina-174 a través de valina 196 de SEQ ID NO:2, y el Péptido #4 corresponde a los aminoácidos asparagina-180 a través de treonina-198 de SEQ ID NO:2. El Péptido #2 y el Péptido #3 contenían una valina en la posición 176, indicativa de CD16b, y reveló las posiciones P1/P1 en la alanina-195/valina-196 y en valina-196/serina-197 (FIG. 1B). El Péptido #4 poseía una posición P1/P1’ en la treonina-198/isoleucina-199 (FIG. 1B). Aunque este péptido se derivó de CD16 soluble de neutrófilos enriquecidos, no contiene un aminoácido en la posición 176 para identificar la isoforma (FIG. 1B). Independientemente, el péptido de alta confianza reveló un tercer sitio de escisión en CD16. Tomados en conjunto, estos hallazgos demuestran la presencia de una región de escisión en CD16 en lugar de un único sitio de escisión específico.

Se examinó adicionalmente la región de escisión en CD16 usando mutagénesis dirigida al sitio para determinar si la escisión de CD16a y CD16b podría interrumpirse en ensayos basados en células. ADAM17 tiende a preferir una conformación ahelicoidal en la región del sustrato que interactúa con su sitio catalítico. Además, estudios proteómicos de las especificidades del sitio de escisión ADAM17 revelaron una preferencia muy baja por residuos de prolina en las posiciones P1’, P2’ o P3'. Por lo tanto, sustituimos serina-197 en las regiones de escisión de CD16a y CD16b con una prolina (S197P, como se indica en la FIG. 2).

CD16b y CD16b/S197P se expresaron por separado en la línea celular de riñón humano HEK293, que no expresa CD16 endógeno. Los transfectantes HEK293 expresaron CD16b o CD16b/S197P a niveles similares en su superficie (FIG. 3A). Los altos niveles de CD16b se liberaron de la HEK293 transfectada, que se aumentó adicionalmente tras su tratamiento con PMA, según lo determinado por ELISA (FIG. 3A). Sin embargo, los niveles solubles de CD16b/S197P generados por células HEK293 no tratadas o tratadas con PMA fueron notablemente inferiores a las de CD16b (FIG. 3A).

También examinamos los efectos de la mutación S197P en la escisión de CD 16a usando la misma estrategia. La expresión superficial de CD16a requiere asociación con los dímeros de cadena ^y. Por lo tanto, se usaron células HEK293 que expresan de manera estable la cadena ^yhumana. Comparando transfectantes HEK293 que expresan niveles superficiales equivalentes de CD16a o CD16a/S197P (FIG.3B), se determinaron los niveles solubles de cada receptor en el sobrenadante de medios de células no tratadas y tratadas con PMA. Nuevamente, se observaron niveles significativamente más bajos de CD16a/S197P soluble en comparación con CD16a (FIG. 3B).

Para evaluar si la mutación S197P modificada en CD16 podría interrumpir la actividad ADAM17, también se transfectaron células HEK293 que expresan o carecen de CD16b/S197P con L-selectina, un sustrato ADAM17 bien descrito expresado normalmente por leucocitos. Ambos transfectantes expresaron niveles equivalentes de L-selectina, que se regularon negativamente de manera similar después de su activación con PMA (FIG. 3C), lo que demuestra que la mutación S197P afectó la eliminación de CD16 y no la actividad de ADAM17.

Para evaluar los efectos de la mutación S197P en la eliminación de CD16a en células NK, se usó la línea celular NK humana NK92 (Gong y col., 1994, Leukemia 8:65 2-658). Estas células carecen de expresión de CD16a endógeno, pero CD16a recombinante puede expresarse de manera estable. Las células NK92 fueron transducidas para expresar por separado CD16a y CD16a/S197P. Las células que expresan niveles equivalentes de estos receptores se activaron con PMA y los niveles de CD16 de la superficie celular se examinaron mediante citometría de flujo. CD16a, pero no CD16a/S197P, se sometió a una marcada regulación negativa en la expresión de la superficie celular (FIG. 4A). IL-12 y IL-18 son estímulos fisiológicos de células NK que individualmente o en combinación pueden inducir la eliminación de CD16a. Las células NK92 tratadas con IL-12 e IL-18 demostraron una regulación negativa apreciable en su expresión de la superficie celular de CD16a pero no CD16a/S197P (FIG. 4B). El acoplamiento directo de la IgG unida a células por CD16a también puede inducir su eliminación, que se examinaron aquí incubando células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P con la línea celular de linfoma de Burkitt positiva para CD20 Raji en presencia o ausencia del mAb anti-CD20 rituximab. Células Raji tratadas con rituximab indujeron la regulación negativa de CD16a, pero no CD16a/S197P (FIG. 4C).

BMS566394 es un inhibidor de ADAM17 altamente selectivo con órdenes de potencia de magnitud mayor para ADAM17 que para otras metaloproteasas. BMS566394 bloqueó la eliminación de CD16a con una eficiencia similar a la mutación S197P, pero no tuvo ningún efecto de bloqueo adicional en las células NK92 activadas que expresan CD16a/S197P (FIG.

4D). Estos hallazgos proporcionan evidencia adicional de que ADAM17 es la sheddasa primaria que escinde el CD16a dentro de su región de escisión. Sin embargo, es posible que los niveles de expresión de ADAM17 no fueran equivalentes en las células NK92 que expresan CD 16a o CD16a/S197P, lo que representa su eliminación diferente. Por lo tanto, teñimos células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P con múltiples mAb anti-ADAM17 y observamos niveles idénticos en la superficie celular (FIG. 4E).

Para establecer el efecto de la mutación S197P en la eliminación de CD16a por células NK primarias, se usaron iPSC humanas para generar células NK modificadas. Los presentes inventores han informado previamente para derivar las células NK funcionales de las iPSC y su similitud con las células NK de la sangre periférica (Knorr y col., 2013 Stem Cells Transí Med 2:274-283; Ni y col., 2014, Stem Cells 32:1021-1031). ADNc de CD16a y CD16a/S197P se clonaron en un plásmido de transposón Sleping Beauty para la inserción génica y expresión estable en células iPSC, que posteriormente se diferenciaron en células NK maduras. Células NK derivadas de células iPSC transducidas de manera simulada expresaron niveles bajos de CD 16a endógena, mientras que CD 16a y CD16a/S197P transducidas se expresaron en niveles más altos (FIG. 4F). La activación de las células NK se produce a través de diversos receptores tras su interacción con las células K562, incluyendo BY55/CD160, dando como resultado la activación de ADAM17 y la eliminación de CD16a. Se estimularon las células NK derivadas de iPSC con células K562 y se encontró que CD16a se sometió a una marcada regulación negativa en la expresión de la superficie celular, mientras que la expresión de CD16a/S197P permaneció estable (FIG. 4F).

CD16a endógenos y recombinantes tienen suficiente afinidad para unirse a la IgG monomérica. Para examinar los efectos de la mutación S197P en la función de CD16a, se compararon las capacidades de unión de IgG de CD16a y CD16a/S197P. Células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P a niveles equivalentes se unen a IgG de una manera dependiente de la dosis similar (FIG. 5A). Los controles consistieron en la unión de IgA a las células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P, y la unión de IgG a las células parentales NK92. Ambos se produjeron esencialmente en niveles de fondo (FIG. 5A). Estos hallazgos demuestran una unión específica y equivalente de IgG por CD16a y CD16a/S197P.

CD16a es un potente receptor activador en las células NK, y se examinó si la mutación S197P modificada por ingeniería genética afectó la capacidad de CD16a para inducir la activación celular tras el acoplamiento de las células tumorales tratadas con anticuerpos. La activación celular de NK92 se evaluó midiendo la regulación positiva de CD107a, que se produce muy rápidamente tras la desgranulación y es un marcador sensible de la activación de células NK. Células NK92 transducidas de manera simulada incubadas con células Raji tratadas con o sin rituximab demostraron un nivel bajo y CD107a de regulación ascendente similar (FIG. 5B). Las células NK92 que expresan CD16a o CD16a/S197P a niveles equivalentes cuando se incuban con células Raji solo marginalmente reguladas por CD107a, mientras que su incubación con células Raji tratadas con rituximab dio como resultado una regulación aumentada considerable de CD107a (FIG. 5B). En conjunto, los hallazgos anteriores indican que la mutación de S197P modificada en CD16a no alteró su función.

Por lo tanto, se muestra que la mutación S197P modificada en CD16a y CD16b bloqueó eficazmente su eliminación en ensayos basados en células que implicaron ADAM17 nativo. La mutación S197P en CD 16a también bloqueó la eliminación del receptor en la línea celular NK humana NK92, pero no afectó la función del receptor. Las células NK92 que expresan niveles equivalentes de CD16a o CD16a/S197P se unieron a IgG monomérica con una eficiencia similar a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpos. Además, las células NK92 que expresan CD 16a o CD16a/S197P regulan positivamente el marcador de activación CD107a de una manera comparable tras su acoplamiento de rituximab unido a células Raji.

Células madre pluripotentes permiten la manipulación genética para generar células NK modificadas. Esta descripción describe la generación de células NK modificadas a partir de las iPSC transducidas que expresan CD16a o CD16a/S197P de tipo silvestre. Al igual que con las células NK92, CD16a se sometió a la eliminación en las células NK derivadas de iPSC, lo que demuestra la actividad de ADAM17 normal tras la activación celular, si bien CD16a/S197P no se eliminó.

La función citotóxica CD16a y NK puede experimentar una regulación negativa considerable en pacientes con cáncer. Los ADNc que codifican CD16a/S197P pueden usarse para generar células madre pluripotentes inducidas humanas estables (iPSC) y células madre embrionarias (ESC). Estas células madre pueden diferenciarse entonces en células NK primarias que expresan CD16a/S 197P. Otras poblaciones celulares que expresan CD16a/S197P resistente a la escisión (por ejemplo, monocitos) o CD16b/S197P (por ejemplo, neutrófilos) también pueden derivarse de hESC/iPSC.

Para generar una inmunoterapia de células NK para usarse en pacientes humanos contra diversas formas de cáncer o infección, las células NK que expresan CD16a/S197P pueden mediar la actividad aumentada de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCc - Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity) u otra actividad mediada por CD16a (por ejemplo, producción de IFNy y TNFa). Por ejemplo, las células NK que expresan CD16a/S 197P pueden combinarse con anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, trastuzumab o rituximab), un acoplador de linfocitos citolíticos biespecíficos (BiKE, por ejemplo, acoplador de linfocitos citolíticos biespecíficos CD16 x CD33, CD16 x CD19, o CD16 x EP-CAM) o un acoplador de linfocitos citolíticos triespecíficos (TriKE). También pueden producirse otras poblaciones celulares terapéuticas (por ejemplo, neutrófilos, monocitos, células T, etc.) con mayor actividad mediada por CD16.

La expresión de CD16a/S197P en las iPSC humanas o las ESC humanas puede producir una población de células NK con actividad de ADCC mejorada contra afecciones neoplásicas tales como, por ejemplo, cáncer de ovario de HER2. En algunos casos, la afección neoplásica puede tratarse con un anticuerpo terapéutico tal como, por ejemplo, trastuzumab. Células NK maduras pueden derivarse de células madre embrionarias humanas e iPSC.

CD16a y/o CD16a/S197P de tipo silvestre puede clonarse para generar una línea de iPSC estable o una línea ECS estable que expresa los receptores de CD16a individuales. Se puede usar cualquier procedimiento de clonación adecuado. Procedimientos de clonación ilustrativos incluyen, por ejemplo, procedimientos basados en virus, vectores de transposón (p.ej., Sleeping Beauty), o nucleofección. En un ejemplo, las iPSC pueden modificarse mediante el uso del vector de transposón Sleping Beauty. El vector puede contener un sistema de selección tal como, por ejemplo, proteína de fusión de resistencia a GFP/zeocina, que permite un sistema de selección dual (resistencia de zeocina y clasificación de citometría de flujo). Las iPSC pueden diferenciarse en células NK maduras, como se describió anteriormente (Ni y col., 2011, J. Virol.

85:43-50; Knorr y col. 2013, Stem Cells Transí Med 2:274-283; Woll y col., 2009, Blood 113:6094-6101). La expresión de receptores transgénicos en las iPSC puede conducir a un alto nivel de expresión en las células NK derivadas. La expresión de CD16 en las iPSC indiferenciadas puede interrumpir la diferenciación de las células NK. En tales casos, la expresión de CD16 puede retrasarse usando, por ejemplo, un promotor CD56 o de CD16a natural, de modo que la expresión de CD16 coincida mejor con la diferenciación normal de células NK.

Se pueden comparar células NK que expresan niveles equivalentes de CD16a de tipo silvestre frente a CD16a/S197P. Los niveles de expresión de las construcciones de CD16 se pueden adaptar mediante clasificación FACS basándose en la expresión de GFP, que se produce de manera proporcional a las construcciones de CD16. Los niveles de CD16a coincidentes se pueden verificar mediante FACS. La citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer de ovario que expresan HER2 puede evaluarse mediante un ensayo de liberación de cromo estándar en presencia o ausencia de un anticuerpo terapéutico tal como, por ejemplo, trastuzumab. Se puede evaluar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos con células de cáncer de ovario no marcadas con cromo. Se puede evaluar la producción de citocinas de células NK (por ejemplo, IFNy, TNFa) y niveles solubles de CD16a por ELISA, y los niveles de la superficie celular de CD16a y otros marcadores de activación (por ejemplo, CD107a, CD62L) por FACS.

El modelo de xenoinjerto de tumor humano descrito en el Ejemplo 3 puede usarse para evaluar la actividad anticancerosa de las células NK que expresan CD16a no escindible in vivo. A diferencia del CD16 humano, el CD16 de ratón no experimenta la eliminación del ectodominio en la estimulación celular y, por lo tanto, determina que los efectos de la eliminación del CD16a en la ADCC mediada por células NK no puede modelarse en ratones normales. La Tabla 1 proporciona un conjunto representativo de agrupaciones y tratamientos experimentales.

Tabla 1. Modelo de xenoinjerto tumoral

#Tratamiento realizado al menos dos veces y se agruparon los datos.

El crecimiento y/o la regresión tumoral se pueden controlar semanalmente mediante procedimientos convencionales que incluyen, por ejemplo, imágenes bioluminiscentes, ultrasonidos, CT, IRM, otra tecnología de formación de imágenes y/o pesar los ratones (Woll y col., 2009, Blood 1 13:60 94-6101). Los ratones también pueden sangrarse (por ejemplo, semanalmente) para cuantificar la supervivencia de las células NK humanas. La expresión y/o los niveles superficiales celulares de diversos marcadores de función efectora (por ejemplo, IFN^y, CD16a) pueden evaluarse usando técnicas convencionales tales como, por ejemplo, mediante FACS. Los ratones se pueden seguir durante cualquier período adecuado tal como, por ejemplo, 60 días. En el momento del sacrificio, se pueden examinar órganos internos (por ejemplo, bazo, hígado, pulmones, riñón y/o ovarios) para evidencia de metástasis (por ejemplo, por bioluminiscencia), como se describió previamente (Woll y col., 2009, Blood 113:6094-6101).

Nuestros análisis permiten definir y comparar la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y potencia in vivo de células NK derivadas de iPSC que expresan CD16a de tipo silvestre frente a CD16a/S197P. Por lo tanto, se describe en esta invención una forma modificada de CD16a, células modificadas genéticamente (por ejemplo, células NK, neutrófilos, monocitos, células T, etc.) que expresan el CD16a modificado y los procedimientos que implican las células modificadas genéticamente. Por ejemplo, las células NK que expresan la forma modificada de CD16a, CD16a/S197P, exhiben una mayor actividad del cáncer antiovárico debido, al menos en parte, a una susceptibilidad reducida a la eliminación mediada por ADAM17 tras la estimulación con células NK. Esto, a su vez, aumenta la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos al acoplar células cancerosas marcadas con anticuerpos tales como, por ejemplo, células cancerosas marcadas con un anticuerpo terapéutico. Además, el reconocimiento del anticuerpo por las células NK aumenta la estabilidad de contacto con las células tumorales y las células NK a través de otros receptores activadores, tales como NKG2D.

El término “y/o” significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados los términos “comprende” y variaciones de los mismos no tienen un significado limitativo cuando estos términos aparecen en la descripción y reivindicaciones; salvo que se indique lo contrario, “ un” , “ una” , “el” y “al menos uno” se usan indistintamente y significan uno o más de uno; y las menciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (p. ej., 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

En la descripción anterior, se pueden describir realizaciones particulares en aislamiento para mayor claridad. A menos que se especifique expresamente lo contrario que las características de una realización particular son incompatibles con las características de otra realización, ciertas realizaciones pueden incluir una combinación de características compatibles descritas en esta invención en relación con una o más realizaciones.

Para cualquier procedimiento descrito en la presente invención que incluya etapas discretas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según sea apropiado, cualquier combinación de dos o más etapas puede realizarse simultáneamente.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Espectrometría de masas

La recolección de sangre periférica de individuos sanos se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Minnesota según el protocolo núm. 9708M00134. El aislamiento de neutrófilos humanos y células NK se realizó como se describió previamente (Wang y col., 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Long y col., 2010, j Leukoc Biol. 87:1097-1101; Long y col., 2012, J Leukoc Biol. 92:667-672). Neutrófilos o células NK enriquecidas (1 x 107/ml en PBS; Mediatech, Inc. Manassas, VA) se activaron con PMA (15 ng/ml o 50 ng/ml, respectivamente; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 30 minutos a 37 °C. Los sobrenadantes celulares se filtraron (tamaño de poro de 0,45 pm) y se inmunoprecipitó CD16 usando el mAb 3G8 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y el kit de inmunoprecipitación Pierce directo (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), según las instrucciones del fabricante. El CD16 purificado se desglicosiló mediante la eliminación con dominio de unión a quitina-iT PNGasa F (New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA), según las instrucciones del fabricante. En resumen, se desnaturalizaron 10-20/pg de CD16 purificado en presencia de DTT 40 mM a 55 °C durante 10 minutos y luego se incubaron con 3 pl de REMOVE-IT PNGasa F (New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA) a 37 °C durante una hora. REMOVE-IT PNGase F después se eliminó de la reacción usando perlas magnéticas de quitina.

Se sometió CD16 a SDS-PAGE y se detectaron bandas de gel correspondientes a CD16 soluble mediante una tinción de proteína fluorescente al criptón (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), verificada por análisis de inmunotransferencia de CD16 de carriles adyacentes en el mismo gel, y luego se escindieron y se sometieron a digestión estándar en gel con tripsina. Los péptidos digeridos extraídos del gel se secaron y se reconstituyeron para cromatografía líquida-análisis de espectrometría de masas en 98: 2:0,01, agua: acetonitrilo: ácido fórmico y < 1 pg de alícuotas se analizaron mediante espectrometría de masas (VELOS ORBITRAP, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) en un modo de barrido dependiente de datos, como se describió anteriormente (Lin-Moshier y col., 2013, J Biol Chem. 288:355-367). Las búsquedas de la base de datos se realizaron con Protein Pilot 4.5 (AB Sciex, Framingham, MA), que usa el algoritmo de puntuación de Parágono (Shimlov y col., 2007, Mol Cell Proteomics6:1638-1655), frente a la secuencia de referencia de NCBIHommo sapiens base de datos de proteínas FASTA a la que se añadió la base de datos de contaminante (tegpm.org/cRAP/index, 109 proteínas). Los parámetros de búsqueda fueron: cisteína yodoacetamida; tripsina; instrumento Orbi MS (1 -3 ppm) Orbi MS/MS; foco de ID en modificaciones biológicas, que incluye la desamidación; un esfuerzo de búsqueda exhaustivo; y análisis de Tasa de Descubrimiento Falso (con base de datos invertida).

Generación de construcciones de expresión de ADNc

El CD16b se produce como dos variantes alélicas denominadas NA1 y NA2, que difieren en cuatro aminoácidos en la porción de extremo N de su región extracelular. Ambas variantes alélicas de CD 16b se escinden con una eficiencia similar por ADAM17. Para este estudio, se examinó solo la variante NA1. También hay dos variantes alélicas de CD16a que tienen un residuo de valina o fenilalanina en la posición 176. Estas dos variantes alélicas de CD16a se escindieron con una eficiencia similar por ADAM17. Para este estudio, se examinó solo la variante alélica de valina CD16a.

CD16a y CD16b se amplificaron a partir de ADNc de leucocitos humanos, se clonaron por separado en el plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en los sitios de enzimas de restricción BamHI y EcoRI como se describió anteriormente (Wang y col., 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Dong y col., 2014, Arthritis Rheumol. 66:1291-1299). Después, las construcciones se sometieron a mutagénesis dirigida al sitio Quik-Change (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante para convertir la serina en la posición 197 a una prolina en CD16a y CD16b. Todas las construcciones se secuenciaron para confirmar la presencia de la mutación prevista y la ausencia de cualquier mutación espontánea.

El ADNc de CD16a se clonó posteriormente en el vector de expresión retroviral bicistrónico pBMN-IRES-EGFP, proporcionado por el Dr. G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA), en los sitios de enzimas de restricción BamHI y EcoRI. Las construcciones de CD16a también se clonaron en un plásmido transposón bicistrónico Sleeping Beauty (pKT2-IRES-GFP:zeo) como se describió previamente (Wilber y col., 2007, Stem Cells 25:2919-2927; Tian y col., 2009, Stem Cells 27:2675-2685). Brevemente, CD16a y CD16a/S197P de tipo silvestre se amplificaron por PCR usando los cebadores: 5'-CCG GAA TTC CAG TGT GGC ATC ATG TGG CAG CTG CTC-3' (sentido, SEQ ID NO:XX) y 5'-CCG GAA TTC TCA TTT GTC TTG AGG GTC CTT TCT-3' (antisentido, SEQ ID NO:YY). Loa sitios EcoRI están subrayados. Los fragmentos de PCR con CD16a y CD16a/S197P digeridos por EcoRI se clonaron por separado en pKT2-IRES-GFP:zeo. La orientación y secuencia correcta de CD16a se confirmaron mediante análisis de PCR y secuenciación. Los presentes inventores han clonado previamente ADNc de L-selectina humana de longitud completa (CD62L) (Feehan y col., 1996, 1996, J Biol Chem.

271:7019-7024; Matala y col., 2001, J Immunol. 167:16 17-1623), que se transfirió al vector pcDNA3.1 en el sitio de la enzima de restricción Xbal. Se clonó ADNc de FcRy humano de longitud completa como se ha descrito anteriormente (Dong y col., 2014, Arthritis Rheumatol. 66:1291-1299), con la modificación de que se usó un vector pcDNA3.1.

Generación de líneas celulares que expresan L-selectina recombinante, CD16a y CD16b

Se cultivaron células HEK293 (una línea celular de riñón embrionario humano) y células NK92 (una línea de células NK humanas) (ATCC, Manassas, VA) según las instrucciones del depósito. Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con pcDNA3.1 con o sin CD16b, CD16b/S197P y/o L-selectina usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células HEK293 que expresan de manera estable FcRy humana se transfectaron transitoriamente con pcDNA3.1 con o sin CD16a o CD16a/S197P por la misma estrategia. Las células NK92 se transdujeron de manera estable con pBMN-IRES-EGFP con o sin CD16a o CD16a/S197P por procedimientos de generación e infección de retrovirus descritos previamente (Matala y col., 2001, J Immunol. 167:1617-1623; Walchecy y col., 2003, J Leukoc Biol. 74:389-394; Wang y col., 2009, J Immunol. 182:2449-2457). La expresión de construcción se evaluó mediante fluorescencia de EGFP y tinción con CD16, según lo determinado por citometría de flujo. Las iPSC humanas (UCBiPS7, derivadas de células CD34 de sangre del cordón umbilical) se mantuvieron en fibroblastos embrionarios de ratón (Knorr y col., 2013, Stem Cells Transí Med 2:274-283; Ni y col., 2014, Stem Cells 32:1021-1031). La expresión estable de CD16a o CD16a/S197P se realizó usando un sistema de transposón Sleping Beauty como se describió anteriormente (Wilber y col., 2007, Stem Cells 25:29 19-2927; Tian y col., 2009, Stem Cells 27:2675-2685). Brevemente, las iPSC se nucleofectaron con pKT2-IRES-GFP:zeo en combinación con ADN de transposasa en solución de nucleofector V (Lonza Inc., Gaithersburg, MD) usando el ajuste de programa B16. Las células nucleofectadas se suspendieron inmediatamente en medio de crecimiento de iPSC que contenía zeocina (50 pg/ml) y se sembraron en fibroblastos embrionarios de ratón. Derivación de células NK a partir de células CD16a-hESC y CD16a-iPSC

La diferenciación hematopoyética de las hESC y las iPSC se realizó como se describió previamente (Ng y col., 2005, Blood 10, 6 1601-1603; Ng y col., 2008, Nat Protocol 3:76 8-776; Le Garff-Tavernier y col., 2010, Aging Cell 9: 527-535). Brevemente, se sembraron 3000 células individuales por pocillo de placas de fondo redondo de 96 pocillos en medio BPEL con factor de células madre (SCF, 40 ng/ml), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 20 ng/ml) y proteína morfogénica ósea 4 (BMP4, 20 ng/ml). Los medios BPEL contenían medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, 86 ml, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA), F12 mezcla nutritiva con Glutamax I (86 mL, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA), albúmina de suero bovino al 10 % (BSA, 5 ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), alcohol polivinílico al 5 % (10 ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ácido linolénico (20 pl de solución de 1 g/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ácido linoleico (20 pl de solución de 1 g/ml, Sigma), solución de síntesis 500 x (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a-monotiogliceral (3,9 pl/100 ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), mezcla de hibridoma exenta de proteínas II (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA), ácido ascórbico (5 mg/ml, Sigma), GLUTAMAX I (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA), solución de insulina-transferina-selenio 100x (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA), penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA).

En el día 11 de la diferenciación hematopoyética, se transfirieron directamente cuerpos embrioides de centrifugación a placas de 24 pocillos con o sin células estromales EL 08-1D2 en medio NK suministrado con citocinas (Le Garff-Tavernier y col., 2010, Aging Cell 9:527-535). Después de 4-5 semanas de cultivo, las suspensiones celulares individuales se tiñeron con IgG acoplada a APC-, PE-, FITC- y PerCP-cy5,5 o anticuerpos específicos contra antígenos de superficie sanguíneos humanos: CD45-PE, CD56-APC, CD56-PE, CD16-PerCP-cyCP-cy5,5, NKG2D-PE, NKp44-PE, NKp46-PE, CD158b-FITC, CD158e1/2-FITC (BD Pharmingen, San Jose, CA), CD158a/h-PE y CD158i-PE (Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA). Las manchas de anticuerpos se evaluaron mediante citometría de flujo.

Estimulación celular

Se activaron células HEK293 y NK92 en medio RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) con 15 ng/ml y 100 ng/ml, respectivamente, PMA durante 30 minutos a 37 °C. Las células NK92 se activaron con IL-12 (PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ) e IL-18 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) a 100 ng/ml y 400 ng/ml, respectivamente, para los puntos de tiempo indicados. La activación celular de NK92 a través de CD16a se medió por su incubación con la línea celular de linfoma de Burkitt positivo para CD20 Raji (ATCC, cultivada según las instrucciones del depósito) (relación 1:1) tratada con el mAb anti-CD20 rituximab (1 pg/ml) (Genentech, Inc., South San Francisco, CA), como se describió anteriormente (Romee y col., 2013, eE Blood 121:3599-3608). El exceso de rituximab se eliminó lavando las células Raji. En algunos experimentos, las células NK92 se preincubaron durante 30 minutos con el inhibidor selectivo de ADAM17 BMS56694 (5 pM) (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). Las células NK derivadas de las iPSC se estimularon con la línea celular eritroémica humana K562 (ATCC, se cultivaron según las instrucciones del depósito), como se describió anteriormente (Romee y col., 2013, Blood 121:3599-3608). Brevemente, las células NK derivadas de iPSC se incubaron con células diana K562 (relación 2:1) durante cuatro horas a 37 °C.

Ensayo de unión a anticuerpos

La unión celular a IgG e IgA humana monomérica (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se realizó como se describió previamente con algunas modificaciones (Dong y col., 2014, Arthritis Rheumatol. 66:1291-1299). Células parentales de NK92 o células transducidas que expresan CD16a o CD16a/S197P a 5 x 106/ml en PBS se incubaron con IgG o IgA a las concentraciones indicadas por triplicado durante una hora a 4 °C. Las células se lavaron extensamente y se incubaron con anticuerpo Fc anti humano de burro (cadena pesada y ligera) conjugado con APC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) según las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron y luego se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Citometría de flujo y ELISA

Para la tinción celular, los sitios de unión de anticuerpos no específicos se bloquearon y las células se tiñeron con los anticuerpos indicados y se examinaron mediante citometría de flujo, como se describió previamente (Wang y col., 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Romee y col., 2013, Blood 121:35 99-3608). El análisis por citometría de flujo se realizó en instrumentos FACSCanto y LS RII (BD Biosciences, San Jose, CA). Se detectó CD16 humano por los mAbs 3G8 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) y DJ130c (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Se detectó CD107a por el mAb H4A3 (Biolegend, Inc., San Diego, CA). ADAM17 se detectó por los mAbs M220 (Doedens y col., 2000, J Biol chem. 275:14-598-14607), 111633 y 111623 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). La L-selectina humana se detectó por el mAb LAM 1-116 (Ancell Corp., Stillwater, MN). Se usaron mAbs de control negativo de isotipo coincidente para evaluar los niveles de tinción no específica. El ELISA de CD16 se realizó mediante un ensayo de perlas citométricas a medida, como se describió anteriormente (Wang y col., 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó usando el software Prism (GraphPad, San Diego, CA) usando ANOVA y la prueba t de Student donde fue apropiado. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo.

Ejemplo 2

Comparación de células NK que expresan niveles equivalentes de WT CD16a y CD16a197P (CD16a/S197P)

Los niveles de expresión de las construcciones de CD16 se corresponden mediante clasificación FACS basándose en la expresión de GFP (tal como se hace para células NK92 descritas anteriormente, FIG. 2), que se produce de manera proporcional a las construcciones de CD16. Los niveles de CD16a coincidentes se verifican por FACS para todos los ensayos. Como control, se evaluaron las células NK derivadas de iPSC modificadas con el vector de transposón Sleping Beauty vacío (que expresa solo GFP). Las células NK derivadas de iPSC expresan niveles bajos de CD16a endógeno (datos no mostrados). La citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer de ovario que expresan HER2 se evalúa mediante un ensayo estándar de liberación de cromo en presencia o ausencia de trastuzumab. También se realiza la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos con células de cáncer de ovario no marcadas con cromo. La producción de citocinas de las células NK (por ejemplo, IFNy, TNFa) y los niveles solubles de CD16a se evalúan mediante ELISA. Los niveles de la superficie celular de CD16a y otros marcadores de activación (por ejemplo, CD107a, CD62L) se evalúan mediante FACS.

Ejemplo 3

Modelo de xenoinjerto de tumor humano para analizar si las células NK derivadas de iPSC que expresan CD16a117P (CD16a/S197P) tienen actividad aumentada de cáncer antiovárico in vivo en presencia de trastuzumab.

Un modelo de xenoinjerto que usa NOD/SCZD/Yc-/-(NSG) y líneas celulares de cáncer de ovario de ratón humano diseñadas de manera estable para expresar luciferasa de luciérnaga para la obtención de imágenes bioluminiscentes (Geller y col., 2013, Cytotherapy 15:1297-1306) para ensayar la administración intraperitoneal (ip) de la actividad de células NK contra las células de cáncer de ovario. La línea celular de cáncer de ovario OVCAR3, que sobreexpresa HER2, se usa como la diana in vivo (Hellstrom y col., 2001 ,CancerRes 61:2420-2423). Los ratones hembra NSG (225 cGY) irradiados subletalmente se inyectan por vía intraperitoneal con OVCAR3 (2 x 105 células) generadas para expresar luciferasa para obtención de imágenes bioluminiscentes para cuantificar el crecimiento o regresión tumoral (Geller y col., 2013, Cytotherapy 15:12 97 1306). Se deja crecer tumores durante siete días antes de que los ratones reciban una única inyección intraperitoneal de 20 x 106 células NK. A continuación, se da a los ratones IL-2 (5 pg/ratón) cada dos días durante cuatro semanas como se describió anteriormente (Woll y col., 2009, Blood 113: 6094-6101) para promover supervivencia in vivo de las células NK. Trastuzumab se administra a una dosis de 50 pg por vía intraperitoneal una vez a la semana durante cuatro semanas, una dosis usada previamente en este modelo (Warrburton y col., 2004, Clinical cancer research 10:2512-2524). Se compara la potencia in vivo de células NK derivadas de iPSC que expresan niveles equivalentes de WT CD16 o CD16a197P (CDa6a/S197P). Los controles incluyen células NK derivadas de iPSC que expresan GFP solo (vector solo) y una cohorte de ratones que reciben solo células de cáncer de ovario. Todos los ratones obtienen el mismo tratamiento con IL-2.

El crecimiento/regresión tumoral se monitoriza semanalmente mediante obtención de imágenes bioluminiscentes y pesando los ratones, como se describió previamente (Woll y col., 2009, Blood 113: 6094-6101). Los ratones también se sangran semanalmente para cuantificar la supervivencia de las células NK humanas. Los niveles de expresión/superficie celular de diversos marcadores de función efectora (por ejemplo, IFN^y, CD16a) se evalúan mediante FACS. Los ratones se siguen durante ~60 días. En el momento del sacrificio, se examinan los órganos internos (bazo, hígado, pulmones, riñón y ovarios) mediante bioluminiscencia para evidencia de metástasis, como se describió previamente (Woll y col., 2009, Blood 113: 6094 6101).

Salvo que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etc., utilizados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente” Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se quieren obtener mediante la presente invención. Al menos, y no como intento de limitar la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debería interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos informados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo ordinarias.

A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Sin embargo, todos los valores numéricos contienen inherentemente un intervalo necesariamente resultante de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.

Todos los títulos son para conveniencia del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, a menos que se especifique lo contrario.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula que comprende:

un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 modificado que comprende una región proximal de membrana y comprende una sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la región proximal de membrana de CD16,

en donde la sustitución comprende la sustitución del residuo de serina con un residuo de prolina en la posición 197 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2

en donde el polipéptido CD16 modificado exhibe una susceptibilidad reducida a la escisión en comparación con un polipéptido CD16 de tipo silvestre.

2. La célula de la reivindicación 1, en donde la modificación del residuo de serina en la posición 197 da como resultado un cambio conformacional que bloquea la escisión de CD16.

3. La célula de la reivindicación 1, en donde la escisión de CD16 comprende la eliminación mediada por ADAM17.

4. La célula de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CD16 comprende además una valina en la posición 176 (176 V).

5. La célula de la reivindicación 1, en donde la célula es una Célula Citolítica Natural (NK), un neutrófilo, un monocito 0 una célula T.

6. La célula de la reivindicación 5, en donde la célula inmunitaria se diferencia de una iPSC o una ESC, en donde las iPSC o ESC comprenden el polinucleótido que codifica el polipéptido CD16 modificado.

7. La célula de la reivindicación 6, en donde las iPSC o ESC son una célula de línea celular estable.

8. La célula de la reivindicación 5, en donde la célula NK que comprende el polipéptido CD16 modificado exhibe al menos una de las siguientes características:

(a) aumento de la capacidad antitumoral;

(b) mayor capacidad antiviral;

(c) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada;

(d) aumento de la producción de IFN^yo TNFa;

(e) actividad mediada por CD16 aumentada;

(d) nivel de superficie más alto de CD16;

(e) nivel más bajo de CD16; soluble

(f) estimulación celular mejorada; y

(g) actividad anticancerígena in vivo aumentada,

en comparación con las células NK que expresan un polipéptido CD16 de tipo silvestre.

9. La célula de la reivindicación 1, en donde la célula comprende además un acoplador de linfocitos citolíticos biespecíficos (BiKE) o un acoplador de linfocitos citolíticos triespecíficos (T riKE).

10. La célula de la reivindicación 1, en donde el BiKE comprende un CD16 x CD33 BiKE, un CD16 x CD19 BiKE, o un CD16 x EP-CAM BiKE.

11. La célula según la reivindicación 1, en donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, y en la que el residuo de serina en la posición 197 de la SEQ ID NO: 1 o 2 está sustituido con un residuo de prolina.

12. La célula de la reivindicación 1, en donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

1 en donde el residuo en la posición 176 es una valina, o SEQ ID NO: 2, y en la que el residuo de serina en la posición 197 de SEQ ID NO: 1 o 2 está sustituido con un residuo de prolina.

13. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 para su uso en medicina en donde la célula se administra a un paciente que se trata con un efector terapéutico NK.

14. Una composición para su uso en medicina en donde la composición comprende la célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y en donde la composición comprende un efector terapéutico NK.

15. La composición para su uso de según la reivindicación 14, en donde el efector terapéutico NK es un agente terapéutico, opcionalmente en donde el agente terapéutico reconoce específicamente un antígeno tumoral o una diana viral; o en donde el agente terapéutico comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo; o en donde el agente terapéutico comprende trastuzumab o rituximab.