ES2928399T3

ES2928399T3 - Composición farmacéutica bactericida que comprende ibuprofeno

Info

Publication number: ES2928399T3
Application number: ES16853143T
Authority: ES
Inventors: Luis Alberto Arganaras; Adrian Javier Munoz; Roxana Valeria Alasino; Ariel Gustavo Garro; Dante Miguel Beltramo
Original assignee: Quimica Luar SRL
Current assignee: Quimica Luar SRL
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2016-10-04
Publication date: 2022-11-17
Anticipated expiration: 2036-10-04
Also published as: AR102172A1; EP3360547B1; EP3360547A1; EP3360547A4; US11925612B2; US20180296509A1; US20210275476A1; US10973787B2; WO2017060550A1; PL3360547T3; PT3360547T; US20240325332A1; BR112018006431A2

Abstract

Una composición farmacéutica bactericida y virucida Una composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal,que comprendeun anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) en una concentración entre 5 y 500 mM y una sal, preferentemente solubilizado dicho AINE en solución salina hipertónica, aplicable a terapias de infecciones virales tipo Herpex simplex, para ser empleada como enjuague bactericida bucal, o bien para ser vehiculizada al pulmón mediante el uso de un nebulizador para fibrosis quística.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica bactericida que comprende ibuprofeno

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas bactericidas para el tratamiento de afecciones pulmonares y de tejido epitelial tales como la fibrosis quística. En particular, la presente invención es una composición bactericida destinada al uso tópico o a las nebulizaciones. Más en particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica bactericida para ser aplicada en tejidos epiteliales, tales como tejidos pulmonares, nasales y orales, que comprende ibuprofeno tal como se define en las reivindicaciones, así como a un proceso para preparar dicha composición.

Estado de la técnica

Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) son un grupo heterogéneo de medicamentos que comparten sus acciones terapéuticas (analgésica, antiinflamatoria y antipirética) pero que se diferencian en su eficacia y toxicidad relativa

Aunque los AINEs son fármacos relativamente seguros, cuando se administran en dosis adecuadas y en pacientes seleccionados, pueden presentar efectos adversos e interacciones potencialmente graves. Los efectos secundarios causados por los AINEs afectan a diversos órganos, pero los originados a nivel gastrointestinal son los más frecuentes. Aproximadamente un 2-3% de los pacientes que toman AINEs durante un año desarrollan una complicación gastrointestinal como hemorragia o perforación alta o baja. Durante ese periodo de tiempo un 5-10% desarrollan úlceras sintomáticas y un 30-50% desarrollan dispepsia que requiere atención médica [Lanas, A., Pique, J.M., Ponce, J., Gastroenterol. Hepatol., 24, 22 (2001); Gastroenterol. Hepatol., 24, 134 (2001).2].

La molécula de ibuprofeno con un PM de 206,3 g/mol, (Figura 1) al igual que otros derivados de 2-arilpropionato, los cuales incluyen; ketoprofeno, flurbiprofeno, naproxeno, etc. contiene un carbono quiral en la posición a (alfa-) del propionato.

El ibuprofeno es considerado un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), utilizado frecuentemente como antipirético y para el alivio sintomático del dolor de cabeza (cefalea), dolor dental, dolor muscular o mialgia, molestias de la menstruación, dolor neurológico de carácter leve y dolor postquirúrgico. También se usa para tratar cuadros inflamatorios, como los que se presentan en artritis, artritis reumatoidea y artritis gotosa. Generalmente la dosis recomendada para adultos es de unos 1200 mg diarios. Sin embargo, bajo supervisión médica, la cantidad máxima de ibuprofeno para adultos es de 800 mg por dosis o 3200 mg por día.

Hay poca correlación entre la severidad de los síntomas y los niveles plasmáticos medidos. Los efectos tóxicos son poco probables en dosis inferiores a 100 mg/kg pero pueden ser graves por encima de los 400 mg/kg, (alrededor de 150 comprimidos de 200 mg para un paciente normal). Sin embargo, dosis altas no indican que el cuadro clínico vaya a ser letal. No es posible determinar una dosis letal precisa, ya que puede variar con la edad, el peso y las enfermedades asociadas al paciente.

La mayoría de los síntomas son un exceso de la acción e incluyen dolor abdominal, náuseas, vómitos, somnolencia, mareos, dolor de cabeza, zumbido de oídos y nistagmo. Rara vez los síntomas pueden ser más graves, se conocen de algunos como hemorragia gastrointestinal, convulsiones, acidosis metabólica, hiperpotasemia, hipotensión, bradicardia, taquicardia, fibrilación auricular, coma, insuficiencia hepática, insuficiencia renal aguda, cianosis, depresión respiratoria y paro cardíaco.

El ibuprofeno, por su estructura, es una molécula prácticamente insoluble en agua, se solubiliza menos de 1 mg en 1 mL de agua (< 1 mg/mL). La forma de administración del ibuprofeno para el tratamiento de todos los casos mencionados anteriormente es siempre en forma de comprimidos o cápsulas blandas en las cuales el ibuprofeno se encuentra en forma protonada. Esta forma protonada, hace por lo tanto al ibuprofeno una molécula fuertemente insoluble en agua. Como contraparte, el Ibuprofeno resulta soluble en disolventes orgánicos como etanol o acetona. La forma de solubilizar el ibuprofeno en agua se puede realizar mediante la remoción del protón por algún catión. En tal sentido, se pueden preparar soluciones acuosas hasta concentraciones 1 M de pH 7.0 - 8.5, titulando el ibuprofeno con soluciones alcalinas de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de magnesio, o bien por el agregado de dietanolamina, Tris(hidroximetil)aminometano (THAM) o arginina, lisina o histidina.

Debido a su estructura molecular, una vez solubilizado en el agua y dependiendo de su concentración, el ibuprofeno se transforma en una molécula anfipática con propiedades surfactantes con dos formas o estructuras, una por debajo de su concentración de micelas crítica (CMC) que es de alrededor de 180 mM (“Amphiphilic association of ibuprofen and two nonionic cellulose derivatives in aqueous solution” - Annika Ridell, Hans Evertsson, Stefan Nilsson and Lars-Olof Sundeof- Journal of Pharmaceutical Sciences. Volume 88, Issue 11, páginas 1175-1181- Nov. 1999) y otra donde se encuentra por sobre su CMC donde se encuentra formando una micela.

Los estudios in vitro indican que, al igual que otros AINEs, el ibuprofeno se fija en gran medida a la albúmina plasmática, aunque en bebés, esto parece ser significativamente menor (95%) en comparación con el plasma de adultos (99%). El ibuprofeno compite con la bilirrubina en la fijación a la albúmina. Especialmente en el suero de los recién nacidos esto podría dar como consecuencia, que la fracción de bilirrubina libre podría aumentar con concentraciones altas de ibuprofeno.

En años recientes Hussein y Janabi publican un artículo (“In Vitro Antibacterial Activity of Ibuprofen and Acetaminophen”, J Glob Infect Dis. 2010 May-Ago; 2(2): 105-108), donde se habla sobre la actividad antibacteriana in vitro de ibuprofeno y acetominofeno. En este artículo se menciona que ibuprofeno limita su actividad bactericida sólo a bacterias como Escherichia coli (Celik I, Akbulut A, Kilic SS, Rahman A, Vural P, Canbaz M, Felek S. Effects of ibuprofen on the physiology and outcome of rabbit endotoxic shock. BMC infectious diseases. 2002;2:26-38. Bernard GR, Wheeler AP, Russell JA, Schein R, Summer WR, Steinberg KP, y otros. “The effects of ibuprofen on the physiology and survival of patients with sepsis”. New Engl J Med. 1997. En este caso se demuestra que el ibuprofeno presenta actividad antiinflamatoria sobre el pulmón de conejos infectados con Pseudomonas aeruginosa, pero no tiene efecto sobre la bacteria misma (Sordelli DO, Cerquetti MC, el-Tawil G, Ramwell PW, Hooke AM, Bellanti JA. “Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to P. aeruginosa”. Eur J Respire Dis. 1985;67:118-27). Este trabajo también muestra que el ibuprofeno no presenta actividad sobre Campylobacter pylori en humanos (Graham DY, Klein PD, Opekun AR, Smith KE, Polasani RR, Evans DJ, y otros. “In vivo susceptibility of Campylobacter pylori”. Am J Gastroenterol. 1989;84:233-8] y sobre Mycobacterium tuberculosis en los ratones (Byrne ^{s T ,}Denkin ^{S m ,}Zhang Y. “Aspirin and ibuprofen enhance pyrazinamide treatment of murine tuberculosis”. J Antimicrob Chemoth. 2007;59:313-6). En dicho estudio no se demuestra una actividad importante del ibuprofeno ya que tampoco se observó efecto sobre bacterias tipo Serratia ni en Bacillus subtilis , así los autores presentan una variable actividad inhibitoria del ibuprofeno. Cabe destacar que los estudios in vitro fueron realizados vehiculizando el ibuprofeno en etanol, una condición tal que cuando la solución madre se diluye en medio acuoso produce la precipitación del propio ibuprofeno.

En el trabajo de Sordielli y otros (Sordelli DO, Cerquetti MC, el-Tawil G, Ramwell PW, Hooke AM, Bellanti JA. “Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to Pseudomonas aeruginosa”, Eur J Respir Dis. 1985 Ago;67(2):118-27.) se muestra que la inyección del ibuprofeno sódico, es capaz de reducir la capacidad inflamatoria producida por una infección pulmonar de P. aeruginosa, pero no afecta la actividad biológica de las bacterias.

En un trabajo reciente Juan D Guzman y otros (BMJ open junio 5 del 2015 “Antitubercular specific activity of ibuprofen and the other 2-arylpropanoic acids using the HT-SPOTi whole-cell phenotypic essay) se muestra que una formulación de ibuprofeno y otros antiinflamatorios no esteroideos presentan propiedades bactericidas para el tratamiento de la tuberculosis. Mediante un test denominado HT-SPOTi, demuestran que el ibuprofeno es antibiótico, pero aún más activo aparece el derivado 3,5-dinitro-ibuprofeno.

En otro trabajo publicado por el grupo del Dr. Ahmed Mohsen1 (“Antibacterial Activity of Antibiofilm of Some Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs and N-acetyl Cysteine against Some Biofilm Producing Uropathogens” - American Journal of Epidemiology and Infectious Disease, 2015, Vol. 3, No. 1, 1-9) se muestra que fármacos como los AINEs y N-actilcisteína afectan negativamente la adherencia de bacterias Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y P. aeruginosa sobre la superficie de los catéteres de uso urológico afectando la formación de los indeseables biofilms como así también muestran un importante efecto bactericida, lo cual puede ser muy beneficioso en el uso de las infecciones producidas por aplicaciones de catéteres.

En otro trabajo llevado a cabo por la Dra Cidalia Pina-Vaz y otros (“Antifungal activity of ibuprofen alone and in combination with fluconazole agains Candida species”. Journal Medical Microbiology - Vol 49, (2000) 831-840 ), se muestra que el ibuprofeno, solo o en combinación con fluconazol, son capaces de producir un marcado efecto antifúngico sobre distintas cepas de Candida, afectando la estabilidad de la membrana para producir una marcada liberación de K intracelular que afecta la viabilidad del hongo

En otra patente US20120115897 A1, se describe la formación de un complejo entre ibuprofeno y derivados de esteres del ácido ascórbico donde se demuestra que esta formulación puede mejorar la solubilidad en agua, facilitar la administración intravenosa, reduciendo el tiempo de aplicación, haciendo que disminuya su efecto indeseado a nivel gastrointestinal aumentando su penetración en la barrera hematoencefálica, la cual puede ser aplicada en distintas patologías como atritis, esclerosis múltiple, fibrosis cística y neumonía, en el tratamiento del ductus arterioso en infantes prematuros, problemas de hipoxia cerebral y ciertos cánceres.

Una práctica habitual en el estado de la técnica es preparar ibuprofeno en metanol, lo que permite que en la dilución de las soluciones se produzca la precipitación del mismo. También es habitual que este AINE se utilice de forma inyectable, esto trae como consecuencia dos problemas, el primero que el ibuprofeno sódico presenta un fuerte efecto hemolítico, y segundo que el ibuprofeno rápidamente interacciona con albúmina, la proteína mayoritaria del plasma, que al acomplejarlo le inhibe fuertemente su actividad bactericida como se demuestra en los estudios de la presente memoria, donde claramente se demuestra que, en función de la concentración de albúmina presente en el medio, decae la actividad bactericida del ibuprofeno.

Además, la patente US 20130178448 A1 describe una formulación de administración oral de ibuprofeno el cual se encuentra en presencia de diferentes tipos de lípidos como triglicéridos u otros tipos de ácidos grasos y alcohol, la cual puede ser administrada en forma líquida o en tabletas para ser ingeridas oralmente en animales para que permitan alcanzar elevados niveles de Ibuprofeno en sangre para el tratamiento de enfermedades de origen pulmonar. La presente memoria demuestra que cuando el ibuprofeno es solubilizado en una emulsión de triglicéridos, al igual que lo que ocurre con su interacción con albúmina, pierde completamente su actividad bactericida.

El documento US2008/260863A1 divulga el uso de una solución salina hipertónica, con o sin una amplia variedad de posibles agentes adicionales, en el tratamiento de la fibrosis quística. En particular, se mencionan los AINEs entre una larga lista de compuestos antiinflamatorios potencialmente útiles que pueden utilizarse opcionalmente en combinación con la composición salina del documento US2008/260863A1.

Como se mencionó previamente, cuando el ibuprofeno se solubiliza en agua, adquiere propiedades surfactantes, por lo tanto, puede interaccionar con membranas lipídicas afectando su estabilidad. La interacción entre ibuprofeno y lípidos y su toxicidad depende del estado de agregación del ibuprofeno. Se ha mencionado que a concentraciones superiores a su CMC ibuprofeno puede dañar la integridad de las membranas lipídicas.

Por otra parte, existen antecedentes del uso de solución salina para el tratamiento de afecciones de las vías respiratorias por medio de nebulizaciones, en particular para el tratamiento de la fibrosis quística se utiliza la nebulización conjunta con antibióticos, siendo el más común la tobramicina. Además, existen antecedentes del uso de ibuprofeno como antiinflamatorio para las mismas afecciones, pero por lo general mediante administración oral o intravenosa. Cabe destacar que para pacientes que padecen fibrosis quística, en general niños, el uso continuo de AINES provoca efectos adversos que suelen complicar el cuadro de la patología. Además, tal como se detalla en la presente memoria existen antecedentes que sugieren el uso de ibuprofeno como bactericida, aunque el estado de la técnica insinúa que no sería apropiado para ser usado contra P. aeruginosa ni contra Burkhordelia cepacia. Por último, un artículo publicado en Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery en mazo de 2009: “Analgesic Effect from Ibuprofen Nanoparticles Inhaled by Male Mice” divulga la nebulización de ibuprofeno sólido arrastrado por vapor a ratas evaluando su efecto antiinflamatorio y demostrando que se requiere entre 3 y 5 veces menos de concentración para que tenga un efecto equivalente al dosificado en forma oral.

La presente invención proporciona una composición susceptible de ser administrada por nebulización para el tratamiento de la fibrosis quística que presenta un efecto inesperado y sorprendente al actuar como bactericida de bacterias tipo Gram y Gram-, en especial con capacidad de inhibir bacterias como P. aeruginosa, S. aureus, B cepacia. La composición de la presente invención es muy simple y de efectos adversos insignificantes, frente al uso continuo de los antibióticos usuales para el tratamiento de esta enfermedad. Uno de los efectos técnicos de la presente invención es que el efecto bactericida del ibuprofeno se ha multiplicado por 5 veces al estar en solución hipertónica de NaCl, tal como puede observarse en el ejemplo 11 de la presente memoria. Además, los inventores han demostrado mediante ejemplos de aplicación de la presente memoria, la capacidad del ibuprofeno por encima y especialmente por debajo de su concentración micelar crítica (CMC), para desestabilizar membranas de diferentes bacterias Gram y Gram-, para que afecten su actividad biológica, lo que permite redefinir, gracias a la presente invención, al ibuprofeno como un agente bactericida, en combinación con solución salina.

Breve descripción de la invención

Las referencias a los métodos de tratamiento en la "Breve descripción de la invención" y en la "Descripción detallada de la invención" deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en el tratamiento de tejidos epiteliales como los tejidos pulmonares, nasales y orales.

La composición farmacéutica bactericida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, objeto principal de la presente invención, comprende ibuprofeno en una concentración entre 5 y 500 mM solubilizado en una solución salina hipertónica que comprende una concentración de entre 0,3 y 2 Molar de una sal adecuada para el consumo humano; preferiblemente entre 0,4 y 1,1 Molar de NaCl; más preferiblemente entre 0,9 y 1,05 Molar de NaCl. Su forma de administración es seleccionada del grupo que comprende inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica. Donde dicho ibuprofeno tiene, preferiblemente, una concentración entre 5 y 180 mM; más preferiblemente menor a 180 mM; más preferiblemente entre 5 y 50 mM. Y donde sus contraiones son los cationes monovalentes seleccionados del grupo que comprende sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos. Además, dicha composición comprende un pH en solución acuosa de entre 6,0 y 8,5; preferiblemente entre 7,0 y 8,0; más preferiblemente entre 7,5 y 7,9.

Además, la presente invención puede materializarse ya sea en estado líquido, o como polvo o liofilizado, mediante un secado o una liofilización respectivamente, a partir de la solución acuosa hipertónica de dicha composición farmacéutica.

En una realización preferida, la presente invención además comprende un agente anestésico seleccionado del grupo que comprende xilocaína, lidocaína, carticaína, mepivacaína y sus mezclas.

La presente invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de fibrosis quística en aplicación nebulizada para llegar a los pulmones. También puede usarse como enjuague bactericida bucal.

En una forma preferida de implementar la composición según la presente invención para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística, dicha composición farmacéutica está en ausencia de antibióticos usuales para esta enfermedad. Estos antibióticos usuales incluyen colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, levofloxacino, ciprofloxacino aztreonam, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina y amikacina y sus mezclas.

En otra forma alternativa de implementar la presente invención dicha composición además comprende dichos antibióticos usuales.

El proceso de elaboración de dicha composición farmacéutica bactericida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, otro objeto de la presente invención comprende los siguientes pasos:

A. se mezcla dicho ibuprofeno con agua y se agita para mantener la suspensión del ibuprofeno;

B. se agrega NaOH hasta alcanzar un pH de entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, para permitir la completa solubilización de dicho ibuprofeno hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL; preferiblemente, se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 h.;

C. sobre la preparación del paso B. se agrega una solución salina hipertónica de NaCl con una concentración de entre 0,3 y 2 M;

D. la preparación del paso D. se filtra mediante poro de 0,22 micras.

En una realización preferida de la presente invención dicho proceso comprende además el siguiente paso:

E. la solución filtrada del paso D. se liofiliza;

Por último, después del paso E, es posible agregar el paso siguiente:

F. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso E. se resuspende en agua o en una solución glucosada al 5%.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica bactericida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, que comprende ibuprofeno y una sal, como se define en las reivindicaciones. Donde, preferiblemente comprende una relación molar entre dicho ibuprofeno y dicha sal de entre 1:0,6 y 1:400, más preferiblemente entre 1:10 y 1:100 y en donde dicha sal es seleccionada del grupo que consta de cloruro de sodio, potasio y sus combinaciones. Y, preferiblemente, tal composición comprende una formulación farmacéutica para ser diluida en agua en ausencia de cualquier otro componente. Y donde, preferiblemente, comprende una formulación farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis quística. Y donde, preferiblemente, comprende una formulación farmacéutica para enjuague bucal.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Estructura química del ibuprofeno.

Figura 2: Estructura química de la tobramicina.

Figura 3: Resultados del ejemplo 4: Efectividad bactericida de soluciones de IBUPROFENO SÓDICO (IBUPROFENATO SÓDICO o SAL SÓDICA DE IBIPROFENO) IBU-Na e IBUPROFENO (IBUPROFENO PROTONADO) IBU-H en P. aeruginosa.

Figura 4: Resultados del ejemplo 5: Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na.

Figura 5: Resultados del ejemplo 6: Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa en función del tiempo. Figura 6: Resultados del ejemplo 7. Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa a diferentes valores de pH.

Figura 7: Resultados del ejemplo 8. Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre distintas cepas bacterianas.

Figura 8: Resultados del ejemplo 9. Efecto antimicrobiano del IBU-Na a distintas concentraciones sobre las 3 cepas bacterianas principales que se encuentran asociadas a la enfermedad Fibrosis Quística (FQ).

Figura 9: Resultados del ejemplo 10. Efecto antimicrobiano del naproxeno en una población de Burkhordelia cepacia.

Figura 10: Resultados del ejemplo 11. Efecto de la fuerza iónica (NaCl) sobre un cultivo de P. aeruginosa.

Figura 11: Resultados del ejemplo 12. Efecto de la composición de la presente invención, que comprende IBU-Na con fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.

Figura 12: Resultados del ejemplo 13. Efecto bactericida de la composición de la presente invención, que comprende una solución de ibuprofeno hipertónica en función del tiempo.

Figura 13: Resultados del ejemplo 14. Efecto de la composición de la presente invención que comprende IBU-Na con fuerza iónica sobre un cultivo de P. aeruginosa a variando el tiempo de tratamiento (minutos).

Figura 14: Resultados del ejemplo 15. Efecto de la composición de la presente invención que comprende ibuprofeno (IBU-Na) con fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de tres cepas bacterianas.

Figura 15: Resultados del ejemplo 16. Efecto de la presencia de albúmina humana sobre la actividad bactericida del IBU- Na [20 m] en medio con fuerza iónica (NaCl 1M).

Figura 16: Resultados del ejemplo 17. Efecto del LIPOVENOS en presencia de fuerza Iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.

Figura 17: Resultados del ejemplo 19. Efecto antimicrobiano de la tobramicina en función de la concentración y del tiempo de contacto sobre P. aeruginosa.

Figura 18: Resultados del ejemplo 20. Efecto antimicrobiano de la tobramicina en presencia de fuerza iónica sobre P. aeruginosa.

Figura 19: Resultados del ejemplo 21. Efecto antimicrobiano del IBU-Na y la tobramicina en presencia de fuerza iónica sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa.

Descripción detallada de la invención

La composición farmacéutica bactericida, que se aplica sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, objeto principal de la presente invención como se define en las reivindicaciones. Comprende ibuprofeno y una sal; en donde dicho ibuprofeno se encuentra en una concentración entre 5 y 500 mM y solubilizado en solución salina de dicha sal. En donde dicha solución salina es hipertónica y comprende una concentración de entre 0,3 y 2 Molar de una sal que preferiblemente es NaCl, pero puede ser cualquier sal apta para el consumo humano tal como cloruro de potasio; más preferiblemente entre 0,4 y 1,1 Molar de NaCl; aún más preferiblemente entre 0,9 y 1,05 Molar de NaCl. Su forma de administración es seleccionada del grupo que comprende inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica. En donde dicho ibuprofeno comprende, preferiblemente, una concentración entre 5 y 180 mM; más preferiblemente menor a 180 mM; aún más preferiblemente entre 5 y 50 mM. Y donde sus contraiones son los cationes monovalentes seleccionados del grupo que comprende sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos. Además, dicha composición comprende un pH en solución acuosa de entre 6,0 y 8,5; preferiblemente entre 7,0 y 8,0; más preferiblemente entre 7,5 y 7,9.

En una realización preferida de la presente invención dicha composición farmacéutica comprende ibuprofeno o ibuprofeno sódico en una concentración de 50 mM en una solución salina hipertónica de 1 M de NaCl.

Además, la presente invención puede prepararse ya sea en estado líquido, o como polvo o liofilizado, mediante un secado o una liofilización respectivamente, a partir de la solución acuosa hipertónica de dicha composición farmacéutica. Tanto el proceso de secado como de liofilizado de composiciones farmacéuticas es ampliamente conocido en el estado de la técnica, por lo que no se considera necesario brindar mayores detalles al respecto. En una realización preferida, la presente invención además comprende un agente anestésico. El efecto anestésico puede acompañar la composición de la presente invención para calmar el dolor y la molestia que provoca la fibrosis quística. Tal agente anestésico puede ser cualquiera de los aceptados para uso farmacéutico.

Entre los anestésicos que se prefieren para la presente invención se encuentran: xilocaína, lidocaína, carticaína, mepivacaína y sus mezclas.

La presente invención es una composición farmacéutica bactericida que es útil para el tratamiento de fibrosis quística en aplicación nebulizada para llegar a los pulmones. En esta tremenda patología que afecta particularmente a niños, la presente invención presenta ventajas nunca antes reportadas, pues con muy bajas dosis de ibuprofeno se logra no sólo un efecto antiinflamatorio, sino bactericida, que no genera mucosidad resistente y que actúa, aunque la misma ya exista. La presente invención también tiene efecto como enjuague bactericida bucal. La combinación de la fuerza iónica con la presencia del ibuprofeno logra, con muy bajas dosis un efecto bactericida nunca antes reportado. Técnicamente, el uso de muy bajas concentraciones de ibuprofeno y la consecuente drástica disminución de efectos adversos comunes en estos medicamentos antiinflamatorios.

En una realización preferida de la presente invención para el tratamiento de la fibrosis quística dicha composición farmacéutica está en ausencia de antibióticos usuales para esta enfermedad. Estos antibióticos usuales son colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, levofloxacino, ciprofloxacino aztreonam, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina y amikacina y sus mezclas.

En otra realización alternativa de la presente invención dicha composición además comprende dichos antibióticos usuales.

El proceso de elaboración de dicha composición farmacéutica bactericida para la aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, otro objeto de la presente invención, comprende los siguientes pasos:

B. se agrega NaOH hasta alcanzar un pH de entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, para permitir la completa solubilización de dicho ibuprofeno hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL.;

C. se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 h.;

D. sobre la preparación del paso C. se agrega una solución salina hipertónica de NaCl con una concentración de entre 0,2 y 2 M;

E. la preparación se filtra mediante poro de 0,22 micras

F. la solución filtrada del paso E. se liofiliza;

Por último, después del paso F es posible agregar el paso siguiente:

G. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso F. se resuspende en agua destilada o en una solución glucosada al 5%.

Estudios para caracterizar las propiedades bactericidas del ibuprofeno y de la composición de la presente invención. Existen numerosos y variados métodos de laboratorio que pueden ser usados para determinar “in vitro” la susceptibilidad de bacterias a diferentes agentes antimicrobianos como ensayos en placa de halos inhibitorios de crecimiento, test de crecimiento/inhibición en caldos nutritivos, kits comerciales, antibiogramas, etc.

En este caso, los ensayos se desarrollaron sobre un soporte líquido no nutritivo (solución tampón) donde se mezcla el agente antimicrobiano con inóculos cuantificados de cultivos bacterianos puros. Después de distintos tiempos de incubación, el material se siembra en placas de agar para poder realizar los ensayos de cuantificación de la cantidad de bacterias que sobreviven al tratamiento

En los Ejemplos que se detallan más adelante, se describen las generalidades de los ensayos, que contiene entre otras, las actividades preliminares de acondicionamiento de cepas de trabajo, insumos, materiales y métodos, análisis de resultados obtenidos de la actividad biológica.

Estudios para caracterizar las propiedades virucidas del ibuprofeno y de la composición de la presente invención, no según la invención.

En el caso de la evaluación de la actividad virucida del ibuprofeno, se llevaron a cabo los estudios como se describió en Alasino y otros en 2007.

En este caso, las distintas cepas de virus con envoltura lipídica se incuban con cantidades crecientes de ibuprofeno durante un período de tiempo que oscila entre 60 y 120 minutos. Después este material se incuba con células en cultivo que son susceptibles al ataque de estos virus, presentando un marcado efecto citopático (formación de agregados celulares (rosetas) o bien muerte celular) que se puede detectar por observación al microscopio óptico Potenciales aplicaciones de la presente invención en distintas patologías infecciosas

La presente invención proporciona una composición de ibuprofeno sódico asociado a una solución salina hipertónica pH entre 6,8 y 8,2, que presenta propiedades bactericidas contra diferentes bacterias como Pseudomonas aeruginosa, Burkhordelia cepacia, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtilis (Gram ), Staphylococcus aureus (Gram ), Enterococcus faecalis (Gram ).

Las aplicaciones de la composición de la presente invención con propiedades bactericidas pueden usarse para el tratamiento de enfermedades infecciosas de tipo bacterianas que afectan directamente a mucosas como la bucal o la pulmonar.

Ventajas de la composición de la presente invención en el tratamiento de diferentes infecciones

El uso de estas propiedades bactericidas de una solución de IBU en combinación con una solución hipertónica, es beneficiosa para el tratamiento de infecciones bacterianas, especialmente aquellas a nivel pulmonar producidas por bacterias del tipo de P. aeruginosa, que es capaz de producir biofilms, como en el caso de la fibrosis quística, una patología que resulta muy difícil de curar. La composición de la presente invención puede presentarse en forma líquida, lo que hace que la misma pueda ser aplicada mediante un sistema de nebulización estándar. Los nebulizadores son los dispositivos de elección para la administración vía pulmonar de fármacos. Los actuales nebulizadores, trabajan mediante pulsos de ultrasonido que es aplicado a una solución para producir una nube en la que se encuentran los fármacos a vehiculizar. Los pacientes respiran normalmente esta nube durante varios minutos hasta que se agota la solución, la cual normalmente es de 1 a 5 mL por nebulización, lo cual presenta algunas ventajas como se menciona a continuación.

• En este caso el medicamento alcanzaría directamente al pulmón haciendo más efectiva su concentración en el órgano diana para actuar sobre las bacterias P. aeruginosa, S aureus metilicino resistente y B cepacia como se detalla en los ejemplos que se mencionan más adelante.

• Evitaría el empleo sistémico de ibuprofeno y de antibióticos, ya que al entrar en sangre se produce una dilución que afecta la concentración efectiva en el órgano diana.

• Se evita que el ibuprofeno tenga contacto con componentes del plasma y más específicamente con la proteína albúmina con quien interacciona fuertemente y podría reducir su actividad bactericida.

• Especialmente el hecho de que el IBU, es una molécula de carácter aniónica, no presenta interacción con los biopolímeros fuertemente aniónicos como Alginato y ADN, materiales mayoritarios que se encuentran presentes en el biofilm que aparece en esta patología, como puede ocurrir con los antibióticos usados actualmente como es la tobramicina (Figura 2) que presenta 5 grupos aminos primarios en su estructura.

• El hecho que la presente invención comprenda ibuprofeno junto con una solución de alta fuerza iónica permite tal cual se muestra en la presente memoria, aumentar 5 veces la eficacia del poder bactericida, disminuir el tiempo de contacto para ejercer la propiedad bactericida de horas a escasos minutos.

• La composición de la presente invención, al presentar una solución salina hipertónica permite que la misma pueda actuar no sólo como un agente fluidificador del biofilm, sino que presenta un contundente efecto bactericida, además de su efecto antiinflamatorio ya conocido.

En el caso particular del efecto bactericida de la composición de la presente invención en epitelio bucal, la ventaja de esta formulación sobre las actuales formulaciones antisépticas reside en que aquellas que utilizan Clorhexidina con el tiempo producen una coloración en los dientes, mientras que no ocurre con el uso del ibuprofeno.

Proceso para elaborar la composición de la presente invención

Dicha composición de la invención comprende al menos un agente bioactivo como es el ibuprofeno solubilizado en medio acuoso que además de la clásica propiedad antiinflamatoria, en la presente invención, presenta propiedades bactericidas cuando dicho ibuprofeno se encuentra formulado en una concentración que se encuentra por debajo de su concentración micelar crítica y en presencia de solución salina. El proceso de elaboración de dicha composición comprende las siguientes etapas:

• se coloca ibuprofeno en un recipiente al que se le agrega agua y se agita para mantener el ibuprofeno en suspensión,

• después se le agrega una solución básica como NaOH hasta alcanzar un pH de entre 7,0 - 8,5 con suave agitación, para permitir la completa solubilización de dicho ibuprofeno, para obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL. Preferiblemente se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 h.

• La solución salina hipertónica de NaCl se añade a la preparación previa, comprendida entre un rango de 0.3 a 2M,

• la preparación se filtra mediante poro de 0,22 micras

• El material esterilizado puede ser finalmente liofilizado para su conservación o bien mantenido en estado líquido hasta su uso.

• Finalmente, al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador, o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, el ibuprofeno liofilizado se resuspende en el volumen original de: a- agua destilada, b- en una solución glucosada al 5%.

Se prefieren las sales de dicho ibuprofeno tales como de Na, I o K. Es por ello que al agregarle la solución de hidróxido de sodio se forma la sal del ibuprofeno. Preferiblemente se utiliza ibuprofeno sódico (IBU-Na), que presenta mayor solubilidad en solución acuosa que el ibuprofeno protonado (IBU-H).

La composición de la presente invención comprende ibuprofeno en polvo, preferiblemente ibuprofeno sódico, y sal de Na o K en una relación molar de AINE:sal de entre 1:0,6 y 1:400, preferiblemente entre 1:10 y 1:100.

Este polvo se puede diluir en agua para obtener la formulación farmacéutica de la invención.

En la presente memoria descriptiva, IBUPROFENO significa ibuprofeno en cualquiera de sus formas. En particular el IBUPROFENO PROTONADO se identificará con la siguiente denominación:

IBU-H.

Mientras que el IBUPROFENO SÓDICO, también conocido como IBUPROFENATO SÓDICO o SAL DE IBUPROFENO SÓDICO se identificará como IBU-Na en el presente documento. Este ibuprofeno sódico puede estar libre de agua en forma de monohidrato o dihidrato

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Preparación de las soluciones para los ensayos que se realizan en la presente memoria y en los siguientes ejemplos.

A continuación, se detallan modos de preparación de los componentes utilizados para la realización de la presente invención, que resultan ser los mejores conocidos por los inventores, pero que no son los únicos posibles.

Preparación de las soluciones IBU-H: Se disuelve ibuprofeno sólido (20 g en etanol puro hasta completar 100 mL), esto representa una solución de IBU-H 1M. En los estudios sobre la actividad de estas formulaciones se utiliza una solución que, puesta en el medio de cultivo no supere el 5% una concentración de etanol que no afecta la viabilidad de las bacterias.

Preparación de la solución de IBU-Na: la solución madre de IBU-Na se prepara pesando 20 gr de ibuprofeno, se agrega agua hasta los 50 mL, y después con una solución de NaOH 4M se agrega cantidad suficiente para alcanzar un pH comprendido entre 7 y 8 y finalmente se enrasa a 100 mL para alcanzar una concentración final de 1 M de IBU-Na.

Preparación de la solución de naproxeno - no según la invención: la solución madre de naproxeno se prepara pesando 23 gr de naproxeno, se agrega agua hasta los 50 mL, y después con una solución de NaOH 4M se agrega cantidad suficiente para alcanzar un pH comprendido entre 7 y 8 y finalmente se enrasa a 100 mL para alcanzar una concentración final de 1 M de naproxeno.

Preparación de la composición favorita de la presente invención:

Se siguen los siguientes pasos para la obtención de las distintas soluciones utilizadas para los ejemplos que siguen: a. 2 gr de ibuprofeno se colocan en un Erlenmeyer a los que se le agrega 5 mL de agua y se agita para mantener la suspensión de ibuprofeno,

b. después se le agrega NaOH 4 M hasta alcanzar un pH comprendido entre 7,0 - 8,5 con suave agitación, para permitir la completa solubilización del IBU y finalmente se enrasa a 10 mL para lograr una concentración de 200 mg/mL. Se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 h.

c. La preparación se diluye hasta alcanzar la concentración de IBU-Na deseada para el tratamiento elegido, según el ejemplo.

d. Sobre la preparación anterior se agrega la solución salina hipertónica para llegar a una concentración de NaCl 1 M

e. la preparación se filtra mediante poro de 0,22 micras.

Para la obtención de la composición de la presente invención para la aplicación en los ensayos que se realizan en los ejemplos que siguen se llega, mediante el procedimiento descrito a composiciones de entre 1 y 100 mM de IBU-Na y soluciones hipertónicas que llegan a presentar una concentración final de 1 M de NaCl. Los procedimientos utilizados son los habituales en la práctica de laboratorio al realizar diluciones.

Ejemplo 2

Activación y conservación del stock de cepas bacterianas de trabajo

Se utilizaron cepas comerciales liofilizadas ATCC (KWIK-STIK Microbiologics) activadas en tubos conteniendo 10 mL de medio BHI Brain Heart Infusion (Biokar BK015HA) a 37° C durante 24 h.

Composición en g/L:

• Infusión de cerebro y corazón 17,5

• Peptona 10

• Glucosa 2

• Cloruro de sodio 5

• Fosfato disódico 2,5

Preparación: Se disuelven 37 g del medio formulado en 1 L de agua destilada, se calienta hasta su completa disolución y ajusta el pH a 7,4 ± 0,2 a 25° C; finalmente se esteriliza por autoclave durante 15 minutos a 121°C. Posterior al tiempo de activación de cada cepa en el medio referido y habiendo observado crecimiento efectivo por turbidez cercano al patrón 0,5 de la escala Mc Farland, se aditivó a cada cultivo un 10% v/v de glicerol estéril como crioprotector; después se distribuyó el contenido de cada tubo en alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf de 1,5 mL. Estos fueron identificados como cepas stock y se conservaron a ultrabaja temperatura en un congelador a -70° C (Ultra low temperature freezer Sanyo MDFU70V) para disponer de una reserva adecuada de cada cepa de trabajo. Ejemplo 3

Ensayos de actividad antimicrobiana del IBU

Se realizaron pruebas de efectividad de IBU a diferentes concentraciones, tiempos de acción, fuerza iónica, variaciones de pH y con diversas poblaciones bacterianas; además se midieron concentraciones efectivas del antibiótico comercial tobramicina (Figura 2)

Metodología de los ensayos

El trabajo consistió en incubar poblaciones bacterianas de carga conocida en términos de UFC/mL, con los compuestos mencionados en diferentes concentraciones molares. Se organizaron baterías de ensayos “in vitro” a diferentes dosis o concentraciones y en tubos Eppendorf de 1,5 mL sin adicionar medio de cultivo. Para ello se trabajó con un tampón fosfato PBS 100 mM que mantuvo las condiciones fisiológicas durante el período de duración de cada ensayo a 37° C.

Composición del tampón PBS 100 mM:

8 g (137 mM) NaCl

0,2 g (2,7 mM) KCl

1,44 g (10 mM) NaHPO

0,24 g (2mM) KH2PO

1000 mL agua Milli Q

Al finalizar el tiempo de cada ensayo, se tomaron alícuotas de 100 uL y diluciones decimales de cada tubo que fueron sembradas en placas de Petri para recuento directo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en medio Mueller Hinton agar (MHA) aplicando el método estandarizado de difusión por placa fluida o vertida.

A cada placa se le adicionaron 5 uL de una solución de colorante metabólico cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 1% para mejorar el contraste de las colonias. Las placas fueron incubadas invertidas en estufa de cultivo por 24 48 h a 37° C y posteriormente se procedió al recuento directo con ajuste por factores de dilución y siembra para informar los resultados en términos de UFC/mL.

La composición en g/L del medio es:

Peptona 17,5

Almidón 1,5

Extracto de carne 4

Agar 15

Preparación:

Se disuelven 22,5 g del producto formulado en 1 L de agua destilada y se lleva a ebullición. Se ajusta el pH a 7,3 ± 0,2 a 25° C y esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Durante los ensayos, el medio se conservó fundido en baño termostatizado entre 45-50° C porque la técnica de siembra requiere embeber e integrar las bacterias en el medio. Una vez solidificadas, las placas fueron incubadas invertidas durante un tiempo establecido de 24-48 h antes de proceder al recuento de cada una a los fines de conocer las concentraciones efectivas en cada caso y así poder establecer comparaciones con otros tratamientos. Ejemplo 4:

Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na e IBU-H en P. aeruginosa

Se muestran los resultados de un ensayo con soluciones de IBU-Na e IBU-H a distintas concentraciones molares crecientes sobre una población de P. aeruginosa durante un tiempo de incubación de 4 h a 37° C y posterior siembra en placa.

Para realizar el ensayo de efectividad bactericida de la solución de IBU-H se garantizó una concentración final de etanol EtOH < 5 % para evitar la acción bactericida propia del disolvente.

Ver Figura 3, donde los resultados de este ensayo demuestran que el IBU-Na tiene mayor capacidad bactericida que el IBU-H.

Ejemplo 5

Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na

En este ejemplo, se muestran los resultados de un ensayo con soluciones de IBU-Na a distintas concentraciones molares crecientes sobre 3 poblaciones de la misma cepa (P. aeruginosa) por un tiempo de incubación de 4 h a 37° C y posterior siembra en placa.

Según se puede observar en la Figura 4, la conclusión de este estudio muestra que la dosis efectiva de IBU- Na depende de la carga bacteriana.

Ejemplo 6

Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa en función del tiempo

Se caracterizó el efecto del IBU- Na sobre la misma cepa de P. aeruginosa a una concentración fija de bacterias variando la concentración y el tiempo de contacto del IBU. El ensayo se realizó a 37° C y posteriormente las muestras fueron sembradas en placa.

Según se puede observar en la Figura 5, estos resultados muestran que se requiere un cierto tiempo de contacto o tratamiento con IBU- Na para obtener el efecto antimicrobiano; éste fue estandarizado para la mayoría de los ensayos en 4 horas.

Ejemplo 7

Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa a diferentes valores de pH.

Estudio sobre el efecto del pH del medio de incubación del ensayo sobre el potencial bactericida de una solución 50 mM de IBU- Na incubada durante 4 h a 37° con un inóculo de P. aeruginosa

Según se puede apreciar en la Figura 6, el resultado muestra que IBU- Na actúa como antimicrobiano en el rango de valores fisiológicos de pH.

Ejemplo 8

Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre distintas cepas bacterianas

Efecto antimicrobiano del IBU-Na a dos concentraciones de ensayo [50 y 100 mM] sobre la viabilidad de cepas bacterianas Gram Positivas y Negativas, durante 4 horas de contacto a 37° C.

Tal como se puede observar en la Figura 7, el resultado muestra que el IBU- Na funciona como antimicrobiano sobre diferentes cepas bacterianas (Gram positivas y negativas).

Ejemplo 9

Efecto antimicrobiano del IBU-Na a distintas concentraciones sobre las 3 cepas bacterianas principales que se encuentran asociadas a la enfermedad Fibrosis Quística (FQ)

Efecto del IBU-Na a distintas concentraciones sobre la viabilidad de Staphylococcus aureus, Burkhordelia cepacia y Pseudomonas aeruginosa, durante 4 horas a 37° C.

El resultado muestra que el IBU-Na presenta efecto sobre las tres cepas bacterianas más frecuentes que se encuentran presentes en la fibrosis quística (Figura 8)

Ejemplo 10 - No según la invención

Efecto antimicrobiano del naproxeno en una población de Burkhordelia cepacia

En este estudio, se analizó el efecto del naproxeno a distintas concentraciones sobre una población de la cepa B. cepacia con ensayos de 4 h de incubación a 37° C.

Tal como se muestra en la Figura 9. El resultado muestra que el naproxeno muestra una menor actividad antimicrobiana comparada con el IBU-Na.

Ejemplo 11

Efecto de la fuerza iónica (NaCl) sobre un cultivo de P. aeruginosa

En este estudio se analiza el efecto de la fuerza iónica (NaCl) a diferentes concentraciones sobre un cultivo de P. aeruginosa en tratamientos de 4 horas a 37° C.

El estudio muestra que no se observa disminución en la población bacteriana por efecto de la fuerza iónica. (Figura 10)

Ejemplo 12

Efecto de la composición de la presente invención, que comprende IBU-Na con fuerza iónica (NaCI 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.

Estudio para evaluar el efecto bactericida del IBU-Na en presencia de fuerza Iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa durante 4 horas a 37° C.

El resultado muestra claramente que la fuerza iónica favorece la acción del IBU-Na, disminuyendo la dosis necesaria para obtener un efecto antimicrobiano en la población de bacterias ensayada. En la Figura 11 se observa claramente que con una concentración de 25 mM de IBU-Na se reduce el N° de UFC/mL a 1000, mientras que la composición de la presente invención con la fuerza iónica de NaCl al 1M logra el mismo resultado a una concentración cinco veces menor, es decir de unos 5 mM de IBU-Na.

Ejemplo 13

Efecto bactericida de la composición de la presente invención, que comprende una solución de ibuprofeno hipertónica en función del tiempo

A continuación, se presenta el estudio para evaluar el efecto bactericida del IBU-Na en presencia de fuerza iónica (NaCl 1M) a distintos tiempos de incubación sobre un cultivo de P. aeruginosa. Tratamientos de 1 hora, 2 horas y 4 horas a 37° C pH 6,5.

Tal como puede observarse en la Figura 12, este resultado muestra que la fuerza iónica permite acortar los tiempos de acción fijados anteriormente.

Ejemplo 14

Efecto de la composición de la presente invención que comprende IBU-Na con fuerza iónica sobre un cultivo de P. aeruginosa variando el tiempo de tratamiento (en minutos)

Este estudio muestra el efecto bactericida del IBU-Na 20 mM en presencia de fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa. Tratamientos a distintos tiempos de incubación (1, 3 y 10 minutos)

Tal como puede observarse en la Figura 13, el resultado obtenido muestra que sólo el tratamiento combinado de ibuprofeno en presencia de fuerza iónica (IBU-Na 20 mM NaCl 1M) permite obtener un resultado sinérgico sobre el efecto antimicrobiano en función del tiempo.

Analizando otras alternativas, como puede verse en la tercer y cuarta columna de la tabla de este mismo ejemplo, con ibuprofeno solo sin fuerza iónica y un tratamiento disociado, preincubando un inóculo de P. aeruginosa 1x 108 UFC/mL durante 10 minutos en NaCl 1M y posterior lavado por dilución 1/10 en tampón conteniendo IBU 20 mM. Como resultado se establece que la fuerza iónica sola no afecta el inóculo; el pretratamiento de fuerza iónica y posterior tratamiento con ibuprofeno no provocó modificaciones en el inóculo respecto de los controles, tal como se observa en la cuarta columna de la tabla de este ejemplo. Tal como queda evidenciado en este ejemplo, la presente invención tiene un efecto técnico sorprendente e inesperado, al lograr un efecto sinérgico casi instantáneo (en relación a otras terapéuticas) que favorece la interacción del ibuprofeno sobre los microorganismos, y así en sólo un minuto lograr la drástica disminución de una población de microorganismos típicos de la fibrosis quística.

Ejemplo 15

Efecto de la composición de la presente invención que comprende ibuprofeno (IBU-Na) con fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de tres cepas bacterianas

Ensayo para evaluar el efecto del IBU- Na con fuerza iónica (NaCl 1M) sobre 3 cepas bacterianas: P aeruginosa, S aureus y B cepacia en tratamientos por 4 horas a 37° C.

Tal como se observa en la Figura 14, la presencia de una solución hipertónica favorece la acción antibacteriana del IBU-Na sobre las tres cepas de interés asociadas a la enfermedad FQ.

A continuación, se presentan ejemplos de aplicación que muestran cómo se ve afectado el efecto bactericida del ibuprofeno cuando se administra ya por vía oral o por vía intravenosa. Estos ejemplos ponen de manifiesto aspectos que evidencian la altura inventiva de la presente composición, ya que se provee de una formulación que evita los factores que normalmente han ocultado los efectos bactericidas del ibuprofeno.

Ejemplo 16

Efecto de la presencia de albúmina humana sobre la actividad bactericida del IBU-Na [20 mM] en medio con fuerza iónica (NaCl 1M)

Estudio para evaluar el efecto de la presencia de una proteína del suero, la albúmina humana, una proteína reconocida con capacidad para interaccionar fuertemente con la molécula de ibuprofeno sobre la actividad bactericida. En este caso se realizó la pre-incubación inicial de distintas concentraciones de albúmina con IBU- Na [20 mM] a temperatura ambiente durante 1 hora; posteriormente se incubaron con las bacterias en presencia de fuerza iónica (NaCl 1M) para dar comienzo con el tratamiento final de 4 h a 37° C.

Tal como puede observarse en la Figura 15, la presencia de albúmina interfiere en la acción antibacteriana del IBU-Na 20 mM. A partir de concentraciones de albúmina inferiores a 10 mg/mL comienza a recuperarse el efecto bactericida del IBU- Na, lo que sugiere algún tipo de interacción.

Ejemplo 17 - No según la invención

Efecto del LIPOVENOSMR (triglicéridos de cadena media) en presencia de fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.

Se incubó un inóculo de P. aeruginosa en presencia de LIPOVENOSMR Fuerza Iónica (NaCl 1M) durante un tratamiento por 4 horas a 37° C.

Tal como puede observarse en la figura 16, el LIPOVENOSMR no produce ningún efecto sobre el inóculo en las concentraciones ensayadas

Ejemplo 18

Efecto del IBU- Na [20 mM] en presencia de LIPOVENOS MR sobre la viabilidad de P aeruginosa.

Preincubación inicial de LIPOVENOS MR a distintas concentraciones con IBU- Na 20 [mM] a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente se mezcló con las bacterias para comenzar el tratamiento de 4 h a 37° C.

La presencia de LIPOVENOSMR hasta el 2,5%, presenta una marcada interferencia sobre la acción antibacteriana del IBU-Na 20 mM.

Ejemplo 19 - No según la invención

Efecto antimicrobiano de la tobramicina en función de la concentración y del tiempo de contacto sobre P. aeruginosa En este ensayo se realizó estudio para evaluar la actividad de un antibiótico conocido como es la tobramicina sobre una población de P. aeruginosa en tratamientos de 1 h, 4 h y O.N. a 37° C. y así comparar con los estudios de los ejemplos previos de la actividad del ibuprofeno

Tal como puede observarse en la Figura 17, a medida que se incrementa el tiempo de contacto de las bacterias con el antibiótico Tobramicina, aumenta su efecto bactericida.

Ejemplo 20 - No según la invención

Efecto antimicrobiano de la tobramicina en presencia de fuerza iónica sobre P. aeruginosa

En este ejemplo se muestra un ensayo para evaluar una formulación del antibiótico tobramicina en presencia de una solución de NaCl 1M sobre una población de P. aeruginosa durante 4 h a 37° C.

Tal como se observa en la Figura 18, con la presencia de fuerza iónica (NaCI 1M) se ve favorecido el efecto bactericida del antibiótico tobramicina sobre una población de P. aeruginosa en un tiempo de contacto de 4 h a 37° C.

Ejemplo 21

Efecto antimicrobiano del IBU-Na y la tobramicina en presencia de fuerza iónica sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa

Estudio comparativo del efecto de IBU-Na y tobramicina en presencia de fuerza iónica (NaCl 1M) sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa en presencia de una solución de alginato 2%. Los tratamientos se realizaron durante 4 horas a 37° C.

Tal como se puede observar en la figura 19, el ensayo muestra que el IBU-Na en presencia de fuerza iónica mantiene propiedades antimicrobianas a pesar de la barrera de alginato y no formó un complejo insoluble. Mientras que la tobramicina formó un complejo insoluble durante los ensayos, aunque mantuvo efectiva su condición como antibiótico.

Cabe destacar que es un compuesto insoluble el que genera una obstrucción progresiva de los pulmones en la fibrosis quística. Con lo cual es posible esperar que en pruebas en humanos la composición de la presente invención se constituya en una terapia recomendada para esta enfermedad.

Ejemplo 22

Evaluación del potencial efecto citotóxico de nebulizaciones con ibuprofeno en dos concentraciones sobre tejido pulmonar de ratas

En este estudio histopatológico se analizó el potencial efecto citotóxico del ibuprofeno en pulmón, a concentraciones de 25 y 50 mM. Los grupos A y B corresponden a tratamientos replicados con 8 animales en cada concentración; éstos fueron nebulizados 1 hora por día durante 4 meses. Los restantes grupos C y D son similares que A y B, pero después de los 4 meses en cada caso se los dejó unos 15 días más sin tratamiento alguno y después se los sacrificó.

De los resultados de los estudios anatomopatológicos mostrados en la Tabla, se puede concluir que la nebulización diaria de 60 minutos, durante un período de tiempo relativamente prolongado de 4 meses de una solución de ibuprofeno 50 mM en ratas de la cepa Balb7c no produce alteraciones significativas en el tejido pulmonar que haga necesario su suspensión.

Ejemplo 23 - No según la invención

Estudios de la actividad antiviral de una solución de ibuprofeno

A continuación, se describen los estudios “in vitro” donde se muestra la actividad de una solución de ibuprofeno sódica para producir la inactivación de los virus denominados “envueltos” que son aquellos virus que presentan una envoltura lipídica.

Cultivo de células utilizadas en el ensayo de actividad

Células de riñón de mono verde de Africa (Vero) (ATCC CCL-21) , células Madin-Darby de riñón bovino (MDBK) (ATCC CCL-22) y células de tumor epitelial de laringe humanas (Hep-2) (ATCC CCL-23) fueron propagadas en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino irradiado conteniendo 10000 IU de penicilina y 2 mM glutamina.

Virus utilizados en los ensayos de inactivación

El virus de la diarrea bovina BVDV fue proporcionado por INTA Castelar, y fue propagado en monocapas de células MDBK. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) (ATCC VR-158) y el virus Herpes Simplex 1 (HSV) fueron propagados en células VERO. La cepa de virus rubeola (MV) fue obtenida a partir de la vacuna comercial Rouvax (Paster Merieux. Francia) fue propagada en células Hep-2. El virus Herpes Simplex (HSV) fue proporcionado por el instituto de Virología de la UNC, Universidad Nacional de Córdoba.

Preparación de los stocks de virus

Los virus fueron propagados usando las células susceptibles de ser infectadas, las cuales fueron cultivadas a 37 C, hasta la completa destrucción total de la monocapa de células. Los virus asociados a las células fueron extraídos por el uso de tres ciclos de congelamiento-descongelamiento de las botellas donde estaban las células. El material fue centrifugado a 3000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante fue fraccionado y guardado a -70 C hasta su uso. Estudios para evaluar la actividad virucida de una solución de ibuprofeno y de la composición de la presente invención

Ensayos de infectividad de los virus HSV, BVDV, VSV y MV: la actividad infectiva de los virus fue determinada por el método de titulación (por diluciones 1/10) en placas de 96 pocillos (NUNC Life Technologies, Rockville, MD, USA), usando como criterio la medición del efecto citopático que se produce sobre las células (agregación y muerte celular) y por lo tanto se determina por positivo o negativo. Diluciones seriadas 1/10 de los virus fueron preparadas por cuadruplicado y fueron incubados por 60 minutos a 37° C con suave agitación con distintas concentraciones de ibuprofeno que están comprendidas entre 1 y 50 mM. Después de este período de tiempo, la solución de virus con ibuprofeno se la incuba en presencia de las células y se dejan también 60 min. a 37° C a los fines de permitir la adsorción de los virus sobre las células para que puedan ejercer su efecto citopático. Después se le agrega 150 uL de medio de mantenimiento a cada pocillo sin remover el inóculo.

La incubación fue llevada a cabo a 37° C in una estufa conteniendo 5 % de atmósfera de CO2, con 90% de humedad relativa, durante 3 días para el caso de los virus HSV y VSV o bien hasta 7 u 8 días para los virus BVDV y MV, para dar tiempo suficiente para detectar la aparición del potencial efecto citopático.

Determinación de la Dosis Infectiva 50

La denominada Dosis infectiva del cultivo celular 50% (TCID50 mL-1) fue calculada por el método de análisis de Reed-Muench (Reed U, H. Munch, Am. J. Hygiene 1938, 27, 493.) para pocillos infectados por virus positivos.

Resultados del ensayo sobre el efecto de ibuprofeno a una concentración 50 mM sobre la capacidad infectiva de los virus.

Virus Características de los Virus Reducción del nivel viral mL-1 Familia Genoma Tamaño (nM) Ibuprofeno TCID50 mL-1

HSV Herpes dsDNA 120-200 > 6.9 BVDV Flavi RssRNA 50-70 > 6.5 VSV Rhabdo SssRNA 70-170 > 7.7 MV Paramyxo SssRNA 150-300 > 5.0

Como puede observarse de los resultados obtenidos, la incubación de ibuprofeno en presencia de los virus envueltos utilizados produce un marcado efecto inhibitorio sobre la capacidad infectiva viral. Los títulos obtenidos expresados como Dosis Inhibitoria 50, oscilan en 105 y 107 logaritmos unidades formadoras de colonias.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Composición farmacéutica bactericida para ser aplicada en tejidos epiteliales como los tejidos pulmonares, nasales y orales que comprende ibuprofeno en una concentración entre 5 y 500 mM solubilizado en una solución salina hipertónica que comprende una concentración entre 0,3 y 2 M de una sal apta para el consumo humano, y caracterizada porque un valor de pH, en solución acuosa, está comprendido en el rango de 6,0 a 8,5.

2. - La composición de la reivindicación 1, en la que su forma de administración se selecciona del grupo que consiste en inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica.

3. - La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ibuprofeno comprende una concentración entre 5 y 180 mM.

4. - La composición de la reivindicación 1, en la que el ibuprofeno comprende como contraión a los cationes monovalentes seleccionados del grupo que consta de sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos.

5. - La composición de la reivindicación 1, en la que la solución salina hipertónica es una solución de NaCl.

6. - La composición de la reivindicación 1, que comprende, además, un agente anestésico.

7. - La composición de la reivindicación 6, en la que dicho agente anestésico se selecciona del grupo que consta de xilocaína, lidocaína, mepivacaína y carticaína.

8. - La composición de la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica se encuentra en un estado líquido, polvo o liofilizado.

9. - La composición de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística, que comprende una formulación farmacéutica para nebulización.

10. - La composición de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística en ausencia de antibióticos.

11. - La composición de la reivindicación 1, que comprende una formulación farmacéutica para el enjuague bucal bactericida.

12. - La composición de la reivindicación 1, que además comprende antibióticos seleccionados del grupo que consta de colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, levofloxacino, ciprofloxacino aztrenonam, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina, amikacina y sus mezclas.

13. - La composición de la reivindicación 1, en la que la relación molar entre dicho ibuprofeno y la sal de dicha solución salina hipertónica está entre 1:0,6 y 1:400.

14. - La composición de la reivindicación 1, en la que dicha sal se selecciona del grupo que consta de cloruro de sodio, cloruro de potasio y combinaciones de los mismos.

15. - La composición de la reivindicación 1, que comprende una formulación farmacéutica para diluir en agua en ausencia de cualquier otro componente.

16. - Un proceso de elaboración de la composición de la reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos: A. se mezcla dicho ibuprofeno con agua y se agita para mantener su suspensión;

B. se agrega NaOH hasta alcanzar un pH comprendido entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, para permitir la completa solubilización de dicho ibuprofeno hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL.;

C. sobre la preparación del paso B., se agrega una solución salina hipertónica de NaCl con una concentración de entre 0,3 y 2 M;

D. la preparación del paso C. se filtra mediante poro de 0,22 micras.

17. - El proceso de la reivindicación 16, que comprende además el siguiente paso:

E. la solución filtrada del paso D., de la reivindicación 16 se liofiliza;

18. - El proceso de la reivindicación 17, que comprende además el siguiente paso:

F. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso E. de la reivindicación 17 se resuspende en agua o en una solución glucosada al 5%.