WO2017060550A1 - Una composición farmacéutica bactericida y virucida - Google Patents

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WO2017060550A1
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ibuprofen
nsaid
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inflammatory
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Adrian Javier MUÑOZ
Roxana Valeria ALASINO
Ariel Gustavo GARRO
Dante Miguel Beltramo
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Quimica Luar Srl
BOFARULL, Monica Liliana
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Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions for the treatment of lung and epithelial tissue conditions such as cystic fibrosis.
  • it is comprised between topical or nebulizing compositions.
  • Nonsteroidal anti-inflammatory drugs are a heterogeneous group of medicines that share their therapeutic actions (analgesic, anti-inflammatory and antipyretic) but which differ in their efficacy and relative toxicity
  • NSAIDs are relatively safe drugs, when administered in appropriate doses and in selected patients, they can present adverse effects and potentially serious interactions.
  • the side effects caused by NSAIDs affect various organs, but those caused at the gastrointestinal level are the most frequent.
  • Approximately 2-3% of patients taking NSAIDs for a year develop a gastrointestinal complication such as bleeding or high or low perforation.
  • 5-10% develop symptomatic ulcers and 30-50% develop dyspepsia that requires medical attention [Lanas, A., Pique, J.M., Ponce, J., Gastroenterol. Hepatol., 24, 22 (2001); Gastroenterol Hepatol., 24, 134 (2001) .2j.
  • Ibuprofen is considered a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), frequently used as an antipyretic and for the symptomatic relief of headache (headache), dental pain, muscle pain or myalgia, menstrual discomfort, mild neurological pain and post-surgical pain . It is also used to treat inflammatory conditions, such as those that occur in arthritis, rheumatoid arthritis and gouty arthritis. Generally the recommended dose for adults is about 1200 mg daily. However, under medical supervision, the maximum amount of ibuprofen for adults is 800 mg per dose or 3200 mg per day. There is little correlation between the severity of symptoms and the measured plasma levels.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug
  • the toxic effects are unlikely in doses below 100 mg / kg but can be severe above 400 mg / kg, (about 150 tablets of 200 mg for a normal man). However, high doses do not indicate that the clinical picture will be lethal. It is not possible to determine a precise lethal dose, as it can vary with age, weight and diseases associated with the patient.
  • symptoms are an excess of action and include abdominal pain, nausea, vomiting, drowsiness, dizziness, headache, ringing of ears and nystagmus. Rarely, the symptoms can be more severe, some are known as gastrointestinal bleeding, seizures, metabolic acidosis, hyperkalemia, hypotension, bradycardia, tachycardia, atrial fibrillation, coma, liver failure, acute renal failure, cyanosis, respiratory depression and cardiac arrest.
  • Ibuprofen by its structure, is a molecule practically insoluble in water, less than 1 mg is solubilized in 1 mL of water ( ⁇ 1 mg / mL).
  • the administration form of Ibuprofen for the treatment of all the cases mentioned above is always in the form of soft tablets or capsules in which Ibuprofen is in protonated form. This protonated form therefore makes Ibuprofen a molecule strongly insoluble in water.
  • Ibuprofen is soluble in organic solvents such as ethanol or acetone.
  • aqueous solutions can be prepared up to 1 M concentrations of pH 7.0-8.5, titrating Ibuprofen with alkaline solutions of sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide, or by the addition of diethanolamine, Tris (hydroxymethyl) aminomethane (THAM) or arginine, lysine or histidine.
  • THAM Tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • CMC critical micelle concentration
  • ibuprofen is largely fixed to plasma albumin, although in infants, this appears to be significantly lower (95%) compared to adult plasma (99%). Ibuprofen competes with bilirubin in albumin binding. Especially in the serum of newborns this could result, that the free bilirubin fraction could increase with high concentrations of ibuprofen.
  • Ibuprofen limits its bactericidal activity only to bacteria such as Escherichia coli (Celik I, Akbulut A, Kilic SS, Rahman A, Vural P, Canbaz M, Felek S. Effects of ibuprofen on the physiology and outcome of rabbit endotoxic shock. BMC infectious diseases. 2002; 2: 26-38.
  • Ibuprofen has anti-inflammatory activity on the lung of rabbits infected with Pseudomonas aeruginosa, but has no effect on the bacteria itself (Sordelli DO, Cerquetti MC, el-Tawil G, RamweII PW, Hooke AM, Bellanti JA, Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to P. aeruginosa, Eur J Respire Dis.
  • Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to Pseudomonas aeruginosa, Eur J Respir Dis. 1985 Aug; 67 (2): 118-27.) It is shown that the injection of sodium Ibuprofen is capable of reducing inflammatory capacity produced by a pulmonary infection of P aeruginosa, but does not affect the biological activity of the bacteria.
  • US Patent 20130178448 A1 describes an oral administration formulation of ibuprofen which is in the presence of different types of lipids such as triglycerides or other types of fatty acids and alcohol, which can be administered in liquid form or in tablets to be ingested by mouth in animals so as to achieve high levels of Ibuprofen in the blood for the treatment of diseases of lung origin.
  • the present report demonstrates that when ibuprofen is solubilized in a triglyceride emulsion, as with its interaction with albumin, it completely loses its bactericidal activity.
  • Ibuprofen when Ibuprofen is solubilized in water, it acquires surfactant properties, therefore, it can interact with lipid membranes affecting its stability.
  • the interaction between Ibuprofen and lipids and their toxicity depends on the aggregation state of Ibuprofen. It has been mentioned that at concentrations above its CMC Ibuprofen can damage the integrity of lipid membranes.
  • the present invention provides a composition that can be administered by nebulization for the treatment of cystic fibrosis that has an unexpected and surprising effect when acting as a bactericide for Gram + and Gram- type bacteria, especially with the ability to inhibit bacteria such as P. aeruginosa, S. aureus, B cepacia and also has a virucidal effect on those viruses with lipid envelope.
  • the composition of the present invention very simple and of insignificant adverse effects, against the continuous use of the usual antibiotics for the treatment of this disease.
  • One of the technical effects of the present invention is that the bactericidal effect of ibuprofen has been multiplied by 5 times as it is in hypertonic CINa solution, as can be seen in example 11 of the present specification.
  • Ibuprofen as a bactericidal and virucidal agent, in combination with saline solution.
  • the bactericidal and virucidal pharmaceutical composition applied to tissue epithelia such as pulmonary, nasal and oral, main object of the present invention, comprises a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) in a concentration between 5 and 500 mM solubilized in saline solution, preferably hypertonic comprising a concentration of between 0.3 and 2 Molar of NaCI which can be CIK; more preferably between 0.4 and 1.1 Molar of NaCl; more preferably even between 0.9 and 1.05 Molar of NaCl.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug
  • Its method of administration is selected from the set comprising inhalation, nebulization, mouthwash and topical.
  • non-steroidal anti-inflammatory preferably comprises a concentration between 5 and 180 mM; more preferably less than 180 mM; more preferably even between 5 and 50 mM.
  • said anti-inflammatory steroid is not arylpropionic selected from the group comprised by Ibuprofen, naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indomethacin, meclofenamate, mefenamic acid, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib , acetylated salicylates, non-acetylated salicylates, and combinations thereof; preferably ibuprofen.
  • said composition comprises a pH in aqueous solution between 6.0 and 8.5; preferably between 7.0 and 8.0; more preferably between 7.5 and 7.9.
  • the present invention can be realized either in a liquid state, or as a powder or lyophilisate, by drying or lyophilization respectively, from the hypertonic aqueous solution of said pharmaceutical composition.
  • the present invention further comprises an anesthetic agent selected from the set comprising xylocaine, lidocaine, carticaine, mepivacaine and mixtures thereof.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of cystic fibrosis in nebulized application to reach the lungs, as well as for the treatment of viral infections type Herpex simplex, applied on affected skin. It can also be used as a bactericidal mouthwash.
  • said pharmaceutical composition is in the absence of usual antibiotics for this disease.
  • antibiotics are, among others sodium colistimethate, tobramycin, ciprofloxacin, aztreonam lysine, levofloxacin, ciprofloxacin, fosfomycin, amphotericin B, vancomycin, gentamicin, ceftazidime, ampicillin and amikacin and mixtures thereof.
  • said composition further comprises said usual antibiotics.
  • the process of preparing said bactericidal and virucidal pharmaceutical composition, for application on tissue epithelia such as pulmonary, nasal and buccal, another object of the present invention comprises the following steps:
  • said NSAID is mixed with water and stirred to maintain the suspension of said NSAID;
  • NaOH is added until a pH between 6.8 and 8.5 is reached with gentle agitation, so as to allow the complete solubilization of said NSAID until a concentration of between 1 and 100 mg / mL is obtained; preferably, it is allowed to stand at room temperature for at least 12 hours .;
  • step b a hypertonic saline solution of NaCl with a concentration of between 0.3 and 2 M is added; d. the preparation of step d. It is filtered by 0.22 micron pore.
  • step e it is possible to add the following step:
  • the lyophilized composition of step e. it is resuspended in water or in a 5% glucose solution.
  • the present invention provides a bactericidal and virucidal pharmaceutical composition, for application on epithelia of tissues such as pulmonary, nasal and buccal, comprising a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) and a salt.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug
  • a salt is selected from the group comprised of sodium chloride, potassium and their combinations
  • such a composition comprises a pharmaceutical formulation to be diluted in water in the absence of any other component.
  • it preferably comprises a pharmaceutical formulation for the treatment of cystic fibrosis.
  • it preferably comprises a pharmaceutical formulation for the treatment of Herpes Simpex.
  • it preferably comprises a pharmaceutical formulation for mouthwash.
  • Figure N ° 6 Results of Example 7. Antimicrobial effect of IBU-Na on P. aeruginosa at different pH values.
  • Figure N ° 7 Results of example 8. Antimicrobial effect of IBU-Na on different bacterial strains.
  • Figure N ° 9 Results of Example 10. Antimicrobial effect of NAPROXEN in a population of Burkhordelia cepacia.
  • Figure N ° 10 Results of Example 11. Effect of ionic strength (CINa) on a culture of P. aeruginosa.
  • Figure N ° 11 Results of Example 12. Effect of the composition of the present invention, comprising IBU-Na with ionic strength (1M CINa) on a culture of P aeruginosa.
  • Figure No. 12 Results of Example 13. Bactericidal effect of the composition of the present invention, which comprises a hypertonic Ibuprofen solution as a function of time.
  • Figure N ° 13 Results of Example 14. Effect of the composition of the present invention comprising IBU-Na with ionic strength on a culture of P. aeruginosa at varying treatment time (minutes).
  • Figure No. 14 Results of Example 15. Effect of the composition of the present invention comprising ibuprofen (IBU-Na) with ionic strength (1 M CINa) on a culture of three bacterial strains.
  • IBU-Na ibuprofen
  • ionic strength (1 M CINa
  • Figure N ° 15 Results of Example 16. Effect of the presence of human ALBUMIN on the bactericidal activity of IBU-Na [20 m] in medium with ionic strength (CINa 1 M).
  • Figure N ° 16 Results of example 17. Effect of LIPOVENOS in the presence of Ionic Force (1M CINa) on a culture of P. aeruginosa.
  • Figure N ° 18 Results of example 20. Antimicrobial effect of TOBRAMYCIN in the presence of ionic force on P. aeruginosa.
  • the bactericidal pharmaceutical composition which also has virucidal effects, which is applied to epithelia of tissues such as pulmonary, nasal and oral, main object of the present invention, comprises a non-steroidal anti-inflammatory (NSAID) and a salt; wherein said NSAID is in a concentration between 5 and 500 mM and solubilized in saline solution of said salt.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory
  • saline solution is preferably hypertonic which comprises a concentration of between 0.3 and 2 Molar of a salt that is preferably NaCl, but can be any salt suitable for human consumption such as potassium chloride; more preferably between 0.4 and 1.1 Molar of NaCl; more preferably even between 0.9 and 1.05 Molar of NaCl.
  • non-steroidal anti-inflammatory preferably comprises a concentration between 5 and 180 mM; more preferably less than 180 mM; more preferably even between 5 and 50 mM.
  • non-steroidal anti-inflammatory is selected from the group comprised of Ibuprofen, naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indomethacin, meclofenamate, mefenamic acid, meloxicam, nabumetone, oxaprometin, piroxicamine, piroxicamine, piroproxin, citroxicatin, piroproxin, DCroxicatin, piroproxin, piroxamine acetylated salicylates, non-acetylated salicylates, and combinations thereof; preferably ibuprofen.
  • said composition comprises a pH in aqueous solution between 6.0 and 8.5; preferably between 7.0 and 8.0; more preferably between 7.5 and 7.9.
  • said pharmaceutical composition comprises ibuprofen or ibuprofen sodium in a concentration of 50 mM in a hypertonic saline solution of 1 M CINa.
  • the present invention can be realized either in a liquid state, or as a powder or lyophilisate, by drying or lyophilization respectively, from the hypertonic aqueous solution of said pharmaceutical composition.
  • Both the drying and freeze-drying process of pharmaceutical compositions is widely known in the state of the art, so it is not considered necessary to provide further details in this regard.
  • the present invention further comprises an anesthetic agent.
  • the anesthetic effect may accompany the composition of the present invention to calm the pain and discomfort caused by cystic fibrosis, but especially when used for the treatment of viruses such as Herpex.
  • Such an anesthetic agent It can be any of those accepted for pharmaceutical use. Among those preferred for the present invention are: xylocaine, lidocaine, carticaine, mepivacaine and mixtures thereof.
  • the present invention is a pharmaceutical composition that is useful for the treatment of cystic fibrosis in nebulized application to reach the lungs.
  • the present invention has advantages never before reported, because with very low doses of NSAIDs, not only an anti-inflammatory effect is achieved, but also bactericidal and virucidal, which does not generate resistant mucus and acts, although the It already exists.
  • the present invention is also applicable in the treatment of viral infections type Herpex simplex, applied on affected skin.
  • the present invention also has an effect as a bactericidal mouthwash.
  • said pharmaceutical composition is in the absence of usual antibiotics for this disease.
  • antibiotics are, among others sodium colistimethate, tobramycin, ciprofloxacin, aztreonam lysine, levofloxacin, ciprofloxacin, fosfomycin, amphotericin B, vancomycin, gentamicin, ceftazidime, ampicillin and amikacin and mixtures thereof.
  • composition further comprises said usual antibiotics.
  • the process of preparing said bactericidal and virucidal pharmaceutical composition, for application on tissue epithelia such as pulmonary, nasal and buccal, another object of the present invention comprises the following steps:
  • said NSAID is mixed with water and stirred to maintain the suspension of said NSAID;
  • step c a hypertonic saline solution of NaCl with a concentration of between 0.2 and 2 M is added; and. the preparation is filtered by 0.22 micron pore
  • step f it is possible to add the following step:
  • the lyophilized composition of step f. it is resuspended in distilled water or in a 5% glucose solution. Studies to characterize the bactericidal properties of NSAIDs and the composition of the present invention.
  • the tests were carried out on a non-nutritive liquid support (buffer solution) where the antimicrobial agent is mixed with quantified inoculums of pure bacterial cultures. After different incubation times, the material is plated on agar plates to be able to perform the quantification tests of the amount of bacteria that survive the treatment
  • the studies were carried out as described in Alasino et al. In 2007.
  • the different strains of virus with lipid envelope are incubated with increasing amounts of Ibuprofen for a period of time ranging from 60 to 120 minutes.
  • This material is then incubated with cells in culture that are susceptible to attack by these virus, presenting a marked cytopathic effect (formation of cell aggregates (rosettes) or cell death) that can be detected by observation under an optical microscope
  • the present invention describes a composition of Ibuprofen sodium alone, or associated with a hypertonic saline solution pH between 6.8 and 8.2, which has bactericidal properties against different bacteria such as Pseudomonas aeruginosa Burkhordelia cepacia Pseudomonas fluorescens Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Bacillus subtilis (Gram +), Staphylococcus aureus (Gram +) Bovine diarrhea virus, Herpes virus type I and II, vesicular stomatitis virus, hepatitis C virus, chickenpox virus.
  • bactericidal properties against different bacteria such as Pseudomonas aeruginosa Burkhordelia cepacia Pseudomonas fluorescens Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Bacillus subtilis (Gram +), Staphy
  • composition of the present invention with bactericidal and virucidal properties reach infectious diseases of bacterial type that directly affect mucous membranes such as buccal, pulmonary, or viral such as Herpes virus type I infections at the labial, buccal level, or vaginal, as well as in the case of cutaneous expression of Herpes virus type II.
  • bactericidal properties of a solution of IBU alone can be applied for the treatment of bacterial infections, and especially those at the pulmonary level produced by bacteria of the type of P aeruginosa, which is capable of producing Biofilms, as in the case of Cystic Fibrosis, a pathology that is very difficult to eliminate.
  • the composition of the present invention can be presented in liquid form, which means that it can be applied by a standard fogging system.
  • Nebulizers are the devices of choice for pulmonary administration of drugs. The current nebulizers, work by means of ultrasound pulses that are applied to a solution to produce a cloud in which the drugs to be transported are found. Patients normally breathe this cloud for several minutes until the solution is depleted, which is usually 1 to 5 mL per mist, which has some advantages as mentioned below.
  • IBU is a molecule of an anionic character, does not present interaction with strongly anionic biopolymers such as alginate and DNA, major materials that are present in the biofilm that appears in this pathology, as can happen with antibiotics currently used as is Tobramycin (Figure 2), which presents 5 primary amino groups in its structure.
  • the present invention comprises ibuprofen together with a solution of high ionic strength, allows as demonstrated herein, increase the efficacy of the bactericidal power 5 times, decrease the contact time to exert the bactericidal property from hours to few minutes.
  • composition of the present invention by presenting a hypertonic saline solution, allows it to act not only as a biofilm fluidizing agent, but also has a strong bactericidal effect, in addition to its known anti-inflammatory effect.
  • the advantage of this formulation over the current antiseptic formulations is that those that use Chlorhexidine over time produce a discoloration of the teeth, while it does not occur with the use of Ibuprofen.
  • the composition of the invention can be used in oral or labial infections caused by Herpex Simplex Type I virus since in addition to its antiviral effect it provides its anti-inflammatory effect during treatment, a desired condition to relieve discomfort during infection.
  • Said composition of the invention comprises at least one bioactive agent such as NSAIDs solubilized in aqueous medium which in addition to the classic anti-inflammatory property, in the present invention, has bactericidal and virucidal properties when said NSAID is formulated in a concentration that is found by under your Critical micellar concentration and in the presence of saline solution.
  • bioactive agent such as NSAIDs solubilized in aqueous medium which in addition to the classic anti-inflammatory property, in the present invention, has bactericidal and virucidal properties when said NSAID is formulated in a concentration that is found by under your Critical micellar concentration and in the presence of saline solution.
  • the process of making said composition comprises, by way of example, the following steps:
  • NSAID is placed in a container to which water is added and stirred to maintain the NSAID suspension
  • a basic solution such as NaHO is added until a pH of 7.0-8.5 is reached with gentle agitation, in order to allow the complete solubilization of said NSAID.
  • a basic solution such as NaHO is added until a pH of 7.0-8.5 is reached with gentle agitation, in order to allow the complete solubilization of said NSAID.
  • it is allowed to stand at room temperature for at least 12 hours.
  • the preparation is diluted to reach the desired NSAID concentration for the chosen treatment.
  • the sterilized material can be finally lyophilized for preservation or kept in a liquid state until use.
  • the lyophilized NSAID is resuspended in the original volume of: a- distilled water, b- in a solution 5% glucose.
  • NSAIDs may be selected from the group comprised by arylpropionic selected from the group comprised by Ibuprofen, naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indomethacin, meclofenamate, mefenamic acid, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, acetylated salicylates, non-acetylated salicylates, and combinations thereof.
  • arylpropionic selected from the group comprised by Ibuprofen, naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indomethacin, meclofenamate, mefenamic acid, meloxicam,
  • Salts of said NSAIDs such as Na, I or K. are preferred, which is why adding the sodium hydroxide solution forms the NSAID salt.
  • sodium ibuprofen (IBU-Na) is used, which has a higher solubility in aqueous solution than protonated ibuprofen (IBU-H).
  • the composition of the present invention comprises powdered NSAIDs, preferably sodium ibuprofen, and Na or K salt in a molar ratio of NSAIDs: salt between 1: 0.6 and 1: 400, preferably between 1: 10 and 1: 100
  • This powder can be diluted in water to obtain the pharmaceutical formulation of the invention.
  • the IBUPROFEN is in any of its forms.
  • the PROTONED IBUPROFEN will be identified with the following denomination: IBU-H.
  • SODIUM IBUPROFEN also known as SODIUM IBUPROFENATE or IBIPROFEN SODIUM SALT will be identified as IBU-Na in this specification.
  • This ibuprofen sodium may be free of water, in the form of monohydrate or in the form of dihydrate.
  • IBU-H solutions Solid Ibuprofen is dissolved (20 g in pure ethanol until 100 mL is completed), this represents a solution of 1 M IBU-H. In studies on the activity of these formulations a solution is used that, placed in the culture medium does not exceed 5% an ethanol concentration that does not affect the viability of the bacteria.
  • Preparation of the IBU-Na solution The stock solution of IBU-Na is prepared by weighing 20 grams of Ibuprofen, water is added up to 50 mL, and then with a solution of 4M NaHO, sufficient quantity is added to reach a pH between 7 and 8 and finally make up to 100 mL to reach a final concentration of 1 M of IBU-Na.
  • the Naproxen stock solution is prepared weighing 23 g of Naproxen, water is added up to 50 mL, and then with a solution of 4M NaHO, sufficient quantity is added to reach a pH between 7 and 8 and finally it is made up to 100 mL to reach a final concentration of 1 M Naproxen.
  • the preparation is diluted to the desired concentration of IBU-NA for the chosen treatment, according to the example.
  • the hypertonic saline solution is added to the previous preparation to reach a concentration of 1 M NaC1
  • the preparation is filtered by 0.22 micron pore.
  • compositions of between 1 and 100 mM of IBU-Na and hypertonic solutions are presented a final concentration of 1 M of CINa.
  • the procedures used are common in laboratory practice when making dilutions.
  • Freeze-dried commercial ATCC strains (KWIK-STIK Microbiologics) activated in tubes containing 10 mL of BHI Brain Heart Infusion medium (Biokar BK015HA) were used at 37 ° C for 24 hours.
  • Preparation 37 g of the formulated medium are dissolved in 1 L of distilled water, heated to complete dissolution and adjust the pH to 7.4 ⁇ 0.2 at 25 ° C; finally it is sterilized by autoclave for 15 minutes at 121 ° C.
  • the work consisted of incubating bacterial populations of known load in terms of CFU / mL, with the compounds mentioned in different molar concentrations. Batteries of "in vitro" assays were organized at different doses or concentrations and in 1.5 mL Eppendorf tubes without adding culture medium. For this, a 100 mM PBS phosphate buffer was maintained that maintained the physiological conditions during the duration of each test at 37 ° C.
  • composition in g / L of the medium is:
  • the medium was kept molten in a thermostated bath between 45-50 ° C because the sowing technique requires embedding and integrating the bacteria into the medium.
  • the plates were incubated inverted for an established time of 24-48 hours before proceeding to count each one in order to know the effective concentrations in each case and thus be able to establish comparisons with other treatments.
  • IBU-Na The effect of IBU-Na on the same strain of P. aeruginosa was characterized at a fixed concentration of bacteria by varying the concentration and contact time of the IBU. The test was performed at 37 ° C and subsequently the samples were plated.
  • IBU-Na P. aeruginosa CFU / mL ⁇ 10.
  • IBU-Na Antimicrobial effect of IBU-Na at two test concentrations [50 and 100 m] on the viability of Gram Positive and Negative bacterial strains, during 4 hours of contact at 37 ° C.
  • IBU-Na functions as an antimicrobial on different bacterial strains (Gram positive and negative).
  • IBU- Na Colony Count (CFU / mL ⁇ 10)
  • composition of the present invention which comprises IBU-Na with ionic strength (1M CINa) on a culture of P. aeruginosa.
  • composition of the present invention which comprises a hypertonic Ibuprofen solution as a function of time
  • composition of the present invention comprising IBU-Na with ionic strength on a culture of P. aeruginosa varying the treatment time (in minutes)
  • the present invention has a surprising and unexpected technical effect, by achieving an almost instantaneous synergistic effect (in relation to other therapies) that favors the interaction of Ibuprofen on microorganisms, and thus in just one minute achieve the drastic decline of a population of microorganisms typical of cystic fibrosis.
  • composition of the present invention comprising ibuprofen (IBU-Na) with ionic strength (1 M CINa) on a culture of three bacterial strains
  • ALBUMINA (mg / mL) with P. aeruginosa
  • LIPOVENOS MR has no effect on inoculum at the concentrations tested.
  • This example shows an assay to evaluate a Tobramycin antibiotic formulation in the presence of a 1M CINa solution on a population of P. aeruginosa for 4 hours at 37 ° C.
  • composition of the present invention is an insoluble compound that generates a progressive obstruction of the lungs in cystic fibrosis. Whereby it is possible to expect that in human tests the composition of the present invention will constitute a recommended therapy for this disease.
  • African green monkey kidney cells (Vero) (ATCC CCL-21), Madin-Darby bovine kidney cells (MDBK) (ATCC CCL-22) and human larynx epithelial tumor cells (Hep-2) (ATCC CCL -23) were propagated in minimal essential medium (MEM) supplemented with 10% irradiated fetal bovine serum containing 10,000 IU of penicillin and 2 mM glutamine.
  • MEM minimal essential medium
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • HSV Herpes Simplex 1 virus
  • the rubella virus (MV) strain was obtained from the commercial Rouvax vaccine (Paster Merieux. France) was propagated in Hep-2 cells.
  • Herpes Simplex virus (HSV) was provided by the UNC Institute of Virology
  • Viruses were propagated using cells susceptible to being infected, which were cultured at 37 C, until the complete total destruction of the cell monolayer.
  • the viruses associated with the cells were extracted by the use of three freeze-thaw cycles of the bottles where the cells were. The material was centrifuged at 3000 x g for 15 minutes and the supernatant was fractionated and stored at -70 C until use.
  • the infective activity of the viruses was determined by the titration method (by 1/10 dilutions) in 96-well plates (NUNC Life Technologies, Rockville, MD, USA) , using as a criterion the measurement of the cytopathic effect that occurs on the cells (aggregation and cell death) and is therefore determined by positive or negative.
  • Serial dilutions 1/10 of the viruses were prepared in quadruplicate and were incubated for 60 minutes at 37 ° C with gentle agitation with different concentrations of Ibuprofen ranging from 1 to 50 mM.
  • the virus solution with Ibuprofen is incubated in the presence of the cells and left 60 min. at 37 ° C in order to allow adsorption of viruses on cells so that they can exert their cytopathic effect. Then 150 uL of maintenance medium is added to each well without removing the inoculum. The incubation was carried out at 37 ° C in an oven containing 5% C02 atmosphere, with 90% relative humidity, for 3 days for In the case of HSV and VSV viruses, or up to 7 or 8 days for BVDV and MV viruses, to allow sufficient time to detect the appearance of! potential cytopathic effect
  • TCID50 mL- 50% cell culture infective dose
  • Inhibitory Dose 50 range in 10 5 and 10 7 logarithms colony forming units.

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Abstract

Una composición farmacéutica bactericida y virucida Una composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal,que comprendeun anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) en una concentración entre 5 y 500 mM y una sal, preferentemente solubilizado dicho AINE en solución salina hipertónica, aplicable a terapias de infecciones virales tipo Herpex simplex, para ser empleada como enjuague bactericida bucal, o bien para ser vehiculizada al pulmón mediante el uso de un nebulizador para fibrosis quística.

Description

DESCRIPCIÓN
UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA BACTERICIDA Y VIRUCIDA
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de afecciones pulmonares y de tejido epitelial tales como la fibrosis quística. En particular está comprendida entre las composiciones de uso tópico o para nebulizar.
Estado de la técnica
Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) son un grupo heterogéneo de medicamentos que comparten sus acciones terapéuticas (analgésica, antiinflamatoria y antipirética) pero que se diferencian en su eficacia y toxicidad relativa
Aunque los AINEs son fármacos relativamente seguros, cuando se administran en dosis adecuadas y en pacientes seleccionados, pueden presentar efectos adversos e interacciones potencialmente graves. Los efectos secundarios causados por los AINEs afectan a diversos órganos, pero los originados a nivel gastrointestinal son los más frecuentes. Aproximadamente un 2-3% de los pacientes que toman AINEs durante un año desarrollan una complicación gastrointestinal como hemorragia o perforación alta o baja. Durante ese periodo de tiempo un 5-10% desarrollan úlceras sintomáticas y un 30-50% desarrollan dispepsia que requiere atención médica [Lanas, A., Pique, J.M., Ponce, J., Gastroenterol. Hepatol., 24, 22 (2001); Gastroenterol. Hepatol., 24, 134 (2001).2j.
La molécula de Ibuprofeno con un PM de 206,3 g/mol, (Figura 1) al igual que otros derivados de 2-arilpropionato, los cuales incluyen; ketoprofeno, flurbiprofeno, naproxeno, etc. contiene un carbono quiral en la posición α (alfa-) del propionato.
El Ibuprofeno es considerado un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), utilizado frecuentemente como antipirético y para el alivio sintomático del dolor de cabeza (cefalea), dolor dental, dolor muscular o mialgia, molestias de la menstruación, dolor neurológico de carácter leve y dolor postquirúrgico. También se usa para tratar cuadros inflamatorios, como los que se presentan en artritis, artritis reumatoidea y artritis gotosa. Generalmente la dosis recomendada para adultos es de unos 1200 mg diarios. Sin embargo, bajo supervisión médica, la cantidad máxima de ibuprofeno para adultos es de 800 mg por dosis o 3200 mg por día. Hay poca correlación entre la severidad de los síntomas y los niveles plasmáticos medidos. Los efectos tóxicos son poco probables en dosis inferiores a 100 mg/kg pero pueden ser graves por encima de los 400 mg/kg, (alrededor de 150 comprimidos de 200 mg para un hombre normal). Sin embargo, dosis altas no indican que el cuadro clínico vaya a ser letal. No es posible determinar una dosis letal precisa, ya que puede variar con la edad, el peso y las enfermedades asociadas al paciente.
La mayoría de los síntomas son un exceso de la acción e incluyen dolor abdominal, náuseas, vómitos, somnolencia, mareos, dolor de cabeza, zumbido de oídos y nistagmo. Rara vez los síntomas pueden ser más graves, se conocen de algunos como hemorragia gastrointestinal, convulsiones, acidosis metabólica, hiperpotasemia, hipotensión, bradicardia, taquicardia, fibrilación auricular, coma, insuficiencia hepática, insuficiencia renal aguda, cianosis, depresión respiratoria y paro cardíaco.
El Ibuprofeno, por su estructura, es una molécula prácticamente insoluble en agua, se solubiliza menos de 1 mg en 1 mL de agua (< 1 mg/mL). La forma de administración del Ibuprofeno para el tratamiento de todos los casos mencionados anteriormente es siempre de forma de comprimidos o cápsulas blandas en las cuales el Ibuprofeno se encuentra en forma protonada. Esta forma protonada, hace por lo tanto al Ibuprofeno una molécula fuertemente insoluble en agua. Como contraparte, el Ibuprofeno resulta soluble en disolventes orgánicos como etanol o acetona.
La forma de solubilizar el Ibuprofeno en agua se puede realizar mediante la remoción del protón por algún catión. En tal sentido, se pueden preparar soluciones acuosas hasta concentraciones 1 M de pH 7.0 - 8.5, titulando el Ibuprofeno con soluciones alcalinas de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de magnesio, o bien por el agregado de dietanolamina, Tris(hidroximetil)aminometano (THAM) o arginina, lisina o histidina.
Debido a su estructura molecular, una vez solubilizado en el agua y dependiendo de su concentración, el Ibuprofeno se transforma en una molécula anf ¡pática con propiedades surfactantes con dos formas o estructuras, una por debajo de su concentración micelas crítica (CMC) que es de alrededor de 180 mM (Amphiphilic association of ibuprofen and two nonionic cellulose derivatives in aqueous solution- Annika Ridell, Hans Evertsson, Stefan Nilsson and Lars-Olof Sundeof- Journal of Pharmaceutical Sciences. Volume 88, Issue 11 , pages 1175-1181- Nov. 1999) y otra donde se encuentra por sobre su CMC donde se encuentra formando una micela. Los estudios in vitro indican que, al igual que otros AINE, el ibuprofeno se fija en gran medida a la albúmina plasmática, aunque en bebés, esto parece ser significativamente menor (95%) en comparación con el plasma de adultos (99%). El ibuprofeno compite con la bilirrubina en la fijación a la albúmina. Especialmente en el suero de los recién nacidos esto podría dar como consecuencia, que la fracción de bilirrubina libre podría aumentar con concentraciones altas de ibuprofeno.
En años recientes Hussein y Janabi publican un artículo (In Vitro Antibacterial Activity of Ibuprofen and Acetaminophen, J Glob Infecí Dis. 2010 May-Aug; 2(2): 105-108), donde se habla sobre la actividad antibacteriana in vitro de Ibuprofeno y acetominofeno. En este caso se menciona que Ibuprofeno limita su actividad bactericida sólo a bacterias como Escherichia coli (Celik I, Akbulut A, Kilic SS, Rahman A, Vural P, Canbaz M, Felek S. Effects of ibuprofen on the physiology and outcome of rabbit endotoxic shock. BMC infectious diseases. 2002;2:26-38. Bernard GR, Wheeler AP, Russell JA, Schein R, Summer WR, Steinberg KP, et al. The effects of ibuprofen on the physiology and survival of patients with sepsis. New Engl J Med. 1997. En este caso se demuestra que el Ibuprofeno presenta actividad antiinflamatoria sobre el pulmón de conejos infectados con Pseudomonas aeruginosa, pero no tiene efecto sobre la bacteria misma (Sordelli DO, Cerquetti MC, el- Tawil G, RamweII PW, Hooke AM, Bellanti JA. Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to P. aeruginosa. Eur J Respire Dis. 1985;67: 118-27). En otra parte de este trabajo se muestra que Ibuprofeno no presenta actividad sobre Campylobacter ylori en humanos (Graham DY, Klein PD, Opekun AR, Smith KE, Polasani RR, Evans DJ, et al. In vivo susceptibility of Campylobacter pylori. Am J Gastroenterol. 1989;84:233-8] y sobre Mycobacterium tuberculosis en los ratones (Byrne ST, Denkin SM, Zhang Y. Aspirin and ibuprofen enhance pyrazinamide treatment of murine tuberculosis. J Antimicrob Chemoth. 2007;59:313-6). En dicho estudio no se demuestra una actividad importante del Ibuprofeno ya que tampoco se observó efecto sobre bacterias tipo Serratia ni en Bacillus subtilis , así los autores presentan una variable actividad inhibitoria del Ibuprofeno. Cabe destacar que los estudios in vitro fueron realizados vehiculizando el Ibuprofeno en etanol, una condición tal que cuando la solución madre se diluye en medio acuoso produce la precipitación del propio Ibuprofeno.
En el trabajo de Sordielli y colaboradores (Sordelli DO, Cerquetti MC, el-Tawil G, RamweII PW, Hooke AM, Bellanti JA. Ibuprofen modifies the inflammatory response of the murine lung to Pseudomonas aeruginosa, Eur J Respir Dis. 1985 Aug;67(2): 118-27.) se muestra que la inyección del Ibuprofeno sódico, es capaz de reducir la capacidad inflamatoria producida por una infección pulmonar de P aeruginosa, pero no afecta la actividad biológica de las bacterias.
En un trabajo reciente Juan D Guzman y colaboradores (BMJ open junio 5 del 2015 "Antitubercular specific activity of ibuprofen and the other 2-arylpropanoic acids using the HT-SPOTi whole-cell phenotypic essay) se muestra que una formulación de Ibuprofeno y otros antiinflamatorios no esteroideos presentan propiedades bactericidas para el tratamiento de la tuberculosis. Mediante un test denominado HT-SPOTi, demuestran que el Ibuprofeno, pero aún más activo aparece el derivado 3,5-dinitro-lbuprofeno.
En otro trabajo publicado por el grupo del Dr. Ahmed Mohsenl (Antibacterial, Anti-biofilm Activity of Some Non-steroidal Anti-lnflammatory Drugs and N-acetyl Cysteine against Some Biofilm Producing Uropathogens - American Journal of Epidemiology and Infectious Disease, 2015, Vol. 3, No. 1 , 1-9) se muestra que drogas como los NSAID y N-actilcisteína afectan negativamente la adherencia de bacterias Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa and Proteus mirabilis sobre la superficie de los catéteres de uso urológico afectando la formación de los indeseables biofilms como así también muestran un importante efecto bactericida, lo cual puede ser muy beneficioso en el uso de las infecciones producidas por aplicaciones de catéteres.
En otro trabajo llevado a cabo por la Dra Cidalia Pina-Vaz y colaboradores (Antifungal activity of ibuprofen alone and in combination with fluconazole agains Candida species Journal Medical Microbiology - Vol 49, (2000) 831-840 ), se muestra que el ibuprofeno, solo o en combinación con fluconazol, son capaces de producir un marcado efecto antifúngico sobre distintas cepas de Candida, afectando la estabilidad de la membrana de modo de producir una marcada liberación de K intracelular que afecta la viabilidad del hongo
En otra patente US20120115897 A1 , se describe la formación de un complejo entre ibuprofeno y derivados de esteres del ácido ascórbico donde se demuestra que esta formulación puede mejorar la solubilidad en agua, facilitar la administración endovenosa, reduciendo e¡ tiempo de aplicación, haciendo que disminuya su efecto indeseado a nivel gastrointestinal aumentando su penetración en la barrera hematoencefálica, ¡a cual puede ser aplicada en distintas patologías como atritís, esclerosis múltiple, fibrosis cística y neumonía, en el tratamiento del ductus arterioso en infantes prematuros, problemas de hipoxia cerebral y ciertos cánceres.
Una práctica habitual en el estado del arte es preparar ibuprofeno en metanol, lo que permite que en la dilución de las soluciones se produzca la precipitación del mismo. También es habitual que este AINE se utilice de forma inyectable, esto trae como consecuencia dos problemas, el primero que el Ibuprofeno sódico presenta un fuerte efecto hemolítico, y segundo que el ibuprofeno rápidamente interacciona con albúmina, la proteína mayoritaria del plasma, que al acomplejarlo le inhibe fuertemente su actividad bactericida como se demuestra en los estudios de la presente memoria, donde claramente se demuestra que, en función de la concentración de Albúmina presente en el medio, decae la actividad bactericida del ibuprofeno.
Además, la patente US 20130178448 A1 describe una formulación de administración oral de ibuprofeno el cual se encuentra en presencia de diferentes tipos de lípidos como triglicéridos u otros tipos de ácidos grasos y alcohol, la cual puede ser administrada en forma líquida o en tabletas para ser ingeridas por boca en animales de modo que permitan alcanzar elevados niveles de Ibuprofeno en sangre para el tratamiento de enfermedades de origen pulmonar. La presente memoria demuestra que cuando el ibuprofeno es solubilizado en una emulsión de triglicéridos, al igual que lo que ocurre con su interacción con albúmina, pierde completamente su actividad bactericida.
Como se mencionó previamente, cuando el Ibuprofeno se solubiliza en agua, adquiere propiedades surfactantes, por lo tanto, puede interaccionar con membranas lipídicas afectando su estabilidad. La interacción entre Ibuprofeno y lípidos y su toxicidad depende del estado de agregación del Ibuprofeno. Se ha mencionado que a concentraciones superiores a su CMC Ibuprofeno puede dañar la integridad de las membranas lipídicas.
Por otra parte, existen antecedentes del uso de solución salina para el tratamiento de afecciones de las vías respiratorias por medio de nebulizaciones, en particular para el tratamiento de la fibrosis quística se utiliza la nebulización conjunta con antibióticos, siendo el más común la tobramicina. Además, existen antecedentes del uso de ibuprofeno como desinflamatorio para las mismas afecciones, pero por lo general mediante administración oral o endovenosa. Cabe destacar que para pacientes que padecen fibrosis quística, en general niños, el uso continuo de AINES provoca efectos adversos que suelen complicar el cuadro de la patología. Por otra parte, tal como se detalla en la presente memoria existen antecedentes que sugieren el uso de ibuprofeno como bactericida, aunque el estado del arte insinúa que no sería apropiado para ser usado contra P. aeruginosa ni contra Burkhordelia cepacia. Por último, un artículo publicado en Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery en mazo de 2009: "Analgesic Effect from Ibuprofen Nanoparticles Inhaled by Male Mice" divulga la nebulización de ibuprofeno sólido arrastrado por vapor a ratas evaluando su efecto antiinflamatorio y demostrando que se requiere entre 3 y 5 veces menos de concentración para que tenga un efecto equivalente al dosificado en forma oral.
La presente invención provee de una composición susceptible de ser administrada por nebulización para el tratamiento de la fibrosis quística que presenta un efecto inesperado y sorprendente al actuar como bactericida de bacterias tipo Gram + y Gram-, en especial con capacidad de inhibir bacterias como P. aeruginosa, S. aureus, B cepacia y además presenta efecto virucida sobre aquellos virus con envoltura lipídica. Siendo, la composición de la presente invención, muy simple y de efectos adversos insignificantes, frente al uso continuo de los antibióticos usuales para el tratamiento de esta enfermedad. Uno de los efectos técnicos de la presente invención es que el efecto bactericida del ibuprofeno se ha multiplicado por 5 veces al estar en solución hipertónica de CINa, tal como puede observarse en el ejemplo 11 de la presente memoria. Además los inventores han demostrado mediante ejemplos de aplicación de la presente invención, la capacidad del Ibuprofeno por sobre y especialmente por debajo de su concentración micelar crítica (CMC), para desestabilizar membranas de diferentes bacterias Gram + y Gram- y aquellos virus con envoltura lipídica, de modo que afectan su actividad biológica, lo que permite redefinir, gracias a la presente invención, al Ibuprofeno como un agente bactericida y virucida, en combinación con solución salina.
Breve descripción de la invención
La composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, objeto principal de la presente invención, comprende un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) en una concentración entre 5 y 500 mM solubilizado en solución salina, preferentemente hipertónica que comprende una concentración de entre 0,3 y 2 Molar de NaCI que puede ser CIK; más preferentemente entre 0,4 y 1 , 1 Molar de NaCI; más preferentemente aún entre 0,9 y 1 ,05 Molar de NaCI. Su forma de administración es seleccionada del conjunto comprendido por inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica. Donde dicho anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) comprende, preferentemente una concentración entre 5 y 180 mM; más preferentemente menor a 180 mM; más preferentemente aún entre 5 y 50 mM. Donde dicho anti-inflamatorio no esteroideo es arilpropiónico seleccionado del conjunto comprendido por Ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indometacina, meclofenamato, mefenamic ácido, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, salicilatos acetilados, salicilatos no acetilados, y sus combinaciones; preferentemente ibuprofeno. Y donde sus contraiones son los cationes monovalentes seleccionados del conjunto comprendido por sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos. Además, dicha composición comprende un pH en solución acuosa de entre 6,0 y 8,5; preferentemente entre 7,0 y 8,0; más preferentemente entre 7,5 y 7,9.
Además, la presente invención puede materializarse ya sea en estado líquido, o como polvo o liofilizado, mediante un secado o una liofilización respectivamente, a partir de la solución acuosa hipertónica de dicha composición farmacéutica.
En una forma preferida de realización la presente invención además comprende un agente anestésico seleccionado del conjunto comprendido por xilocaína, lidocaína, carticaína, mepivacaína y sus mezclas.
La presente invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de fibrosis quística en aplicación nebulizada para llegar a los pulmones, así como también para el tratamiento de infecciones virales tipo Herpex simplex, aplicada sobre piel afectada. También puede usarse como enjuague bactericida bucal.
En una forma preferida de llevar a la práctica la presente invención para el tratamiento de la fibrosis quística dicha composición farmacéutica está en ausencia de antibióticos usuales para esta enfermedad. Estos antibióticos usuales son, entre otros colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, aztreonam lisina, levofloxacino, ciprofloxacino, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina y amikacina y sus mezclas. En otra manera alternativa de llevar a la práctica la presente invención dicha composición además comprende dichos antibióticos usuales.
El proceso de elaboración de dicha composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, otro objeto de la presente invención, comprende los siguientes pasos:
a. se mezcla dicho AINE con agua y se agita para mantener la suspensión de dicho AINE;
b. se agrega NaOH hasta alcanzar un pH comprendido entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, de modo de permitir la completa solubilización de dicho AINE hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL; preferentemente, se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 hs.;
c. sobre la preparación del paso b. se agrega una solución salina hipertónica de NaCI con una concentración de entre 0,3 y 2 M; d. la preparación del paso d. se filtra mediante poro de 0,22 mieras.
En una forma preferida de realización de la presente invención dicho proceso comprende además el siguiente paso:
e. la solución filtrada del paso d. se liofiliza;
Por último, luego del paso e es posible agregar el paso siguiente:
f. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso e. se resuspende en agua o en una solución glucosada al 5%.
La presente invención provee una composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, que comprende un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y una sal. Donde, preferentemente comprende una relación molar entre dicho AINE y dicha sal de entre 1 :0,6 y 1 :400, más preferentemente entre 1 :10 y 1 : 100 y donde dicha sal es seleccionada del grupo comprendido por cloruro de Sodio, Potasio y sus combinaciones. Y preferentemente tal composición comprende una formulación farmacéutica para ser diluida en agua en ausencia de cualquier otro componente. Y donde preferentemente comprende una formulación farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis quística. Y donde preferentemente comprende una formulación farmacéutica para el tratamiento del Herpes Simpex. Y donde preferentemente comprende una formulación farmacéutica para enjuague bucal.
Breve descripción de las Figuras
Figura N° 1 : Estructura química de Ibuprofeno.
Figura N° 2: Estructura química de la TOBRAMICINA.
Figura N° 3: Resultados del ejemplo 4: Efectividad bactericida de soluciones de IBUPROFENO SÓDICO (IBUPROFENATO SÓDICO o SAL SÓDICA DE IBIPROFENO) IBU-Na e IBUPROFENO (IBUPROFENO PROTONADO) IBU-H en P. aeruginosa.
Figura N° 4: Resultados del ejemplo 5: Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na.
Figura N° 5: Resultados del ejemplo 6: Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa en función del tiempo.
Figura N° 6: Resultados del ejemplo 7. Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa a diferentes valores de pH. Figura N° 7: Resultados del ejemplo 8. Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre distintas cepas bacterianas.
Figura N° 8: Resultados del ejemplo 9. Efecto antimicrobiano del IBU-Na a distintas concentraciones sobre las 3 cepas bacterianas principales que se encuentran asociadas a la enfermedad Fibrosis Quística (FQ).
Figura N° 9: Resultados del ejemplo 10. Efecto antimicrobiano del NAPROXENO en una población de Burkhordelia cepacia.
Figura N° 10: Resultados del ejemplo 11. Efecto de la fuerza iónica (CINa) sobre un cultivo de P. aeruginosa.
Figura N° 11 : Resultados del ejemplo 12. Efecto de la composición de la presente invención, que comprende IBU-Na con fuerza iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P aeruginosa.
Figura N° 12: Resultados del ejemplo 13. Efecto bactericida de la composición de la presente invención, que comprende una solución de Ibuprofeno hipertónica en función del tiempo.
Figura N° 13: Resultados del ejemplo 14. Efecto de la composición de la presente invención que comprende IBU-Na con fuerza iónica sobre un cultivo de P. aeruginosa a variando el tiempo de tratamiento (minutos).
Figura N° 14: Resultados del ejemplo 15. Efecto de la composición de la presente invención que comprende ibuprofeno (IBU-Na) con fuerza iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de tres cepas bacterianas.
Figura N° 15: Resultados del ejemplo 16. Efecto de la presencia de ALBUMINA humana sobre la actividad bactericida del IBU- Na [20 m ] en medio con fuerza iónica (CINa 1 M).
Figura N° 16: Resultados del ejemplo 17. Efecto del LIPOVENOS en presencia de Fuerza Iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.
Figura N° 17: Resultados del ejemplo 19. Efecto antimicrobiano de la TOBRAMICINA en función de la concentración y del tiempo de contacto sobre P. aeruginosa.
Figura N° 18: Resultados del ejemplo 20. Efecto antimicrobiano de la TOBRAMICINA en presencia de fuerza iónica sobre P. aeruginosa.
Figura N° 19: Resultados del ejemplo 21. Efecto antimicrobiano del IBU-Na y la TOBRAMICINA en presencia de fuerza iónica sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa. Descripción detallada de la invención
La composición farmacéutica bactericida, que además tiene efectos virucidas, que se aplica sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, objeto principal de la presente invención, comprende un anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) y una sal; donde dicho AINE se encuentra en una concentración entre 5 y 500 mM y solubilizado en solución salina de dicha sal. Donde dicha solución salina es preferentemente hipertónica que comprende una concentración de entre 0,3 y 2 Molar de una sal que preferentemente es NaCI, pero puede ser cualquier sal apta para el consumo humano tal como cloruro de potasio; más preferentemente entre 0,4 y 1 ,1 Molar de NaCI; más preferentemente aún entre 0,9 y 1 ,05 Molar de NaCI. Su forma de administración es seleccionada del conjunto comprendido por inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica. Donde dicho anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) comprende, preferentemente una concentración entre 5 y 180 mM; más preferentemente menor a 180 mM; más preferentemente aún entre 5 y 50 mM. Donde dicho anti-inflamatorio no esteroideo es seleccionado del conjunto comprendido por Ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indometacina, meclofenamato, mefenamic ácido, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, salicilatos acetilados, salicilatos no acetilados, y sus combinaciones; preferentemente ibuprofeno. Y donde sus contraiones son los cationes monovalentes seleccionados del conjunto comprendido por sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos. Además, dicha composición comprende un pH en solución acuosa de entre 6,0 y 8,5; preferentemente entre 7,0 y 8,0; más preferentemente entre 7,5 y 7,9.
En una forma preferida de la presente invención dicha composición farmacéutica comprende ibuprofeno o ibuprofeno sódico en una concentración de 50 mM en una solución salina hipertónica de 1 M de CINa.
Además, la presente invención puede materializarse ya sea en estado líquido, o como polvo o liofilizado, mediante un secado o una liofilización respectivamente, a partir de la solución acuosa hipertónica de dicha composición farmacéutica. Tanto el proceso de secado como de liofilizado de composiciones farmacéuticas es ampliamente conocido en el estado de la técnica, por lo que no se considera necesario brindar mayores detalles al respecto.
En una forma preferida de realización la presente invención además comprende un agente anestésico. El efecto anestésico puede acompañar la composición de la presente invención para calmar el dolor y la molestia que provoca la fibrosis quística, pero por sobre todo cuando se utiliza para el tratamiento de virus tales como los Herpex. Tal agente anestésico puede ser cualquiera de los aceptados para uso farmacéutico. Entre los que se prefieren para la presente invención se encuentran: xilocaína, lidocaína, carticaína, mepivacaína y sus mezclas.
La presente invención es una composición farmacéutica que es útil para el tratamiento de fibrosis quística en aplicación nebulizada para llegar a los pulmones. En esta tremenda patología que afecta particularmente a niños, la presente invención presenta ventajas nunca antes reportadas, pues con muy bajas dosis de AINE se logra no sólo un efecto antiinflamatorio, sino bactericida y virucida, que no genera mucosidad resistente y que actúa, aunque la misma ya exista. La presente invención también es de aplicación en el tratamiento de infecciones virales tipo Herpex simplex, aplicada sobre piel afectada. La presente invención también tiene efecto como enjuague bactericida bucal. La combinación de la fuerza iónica con la presencia del AINE logra, con muy bajas dosis un efecto bactericida y virucida nunca antes reportado, que tiene como efecto técnico el uso de muy bajas concentraciones de AINE y la consecuente drástica disminución de efectos adversos comunes en estos antiinflamatorios.
En una forma preferida de llevar a la práctica la presente invención para el tratamiento de la fibrosis quística dicha composición farmacéutica está en ausencia de antibióticos usuales para esta enfermedad. Estos antibióticos usuales son, entre otros colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, aztreonam lisina, levofloxacino, ciprofloxacino, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina y amikacina y sus mezclas.
En otra manera alternativa de llevar a la práctica la presente invención dicha composición además comprende dichos antibióticos usuales.
El proceso de elaboración de dicha composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, otro objeto de la presente invención, comprende los siguientes pasos:
a. se mezcla dicho AINE con agua y se agita para mantener la suspensión de dicho AINE;
b. se agrega NaHO hasta alcanzar un pH comprendido entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, de modo de permitir la completa solubilización de dicho AINE hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL.;
c. se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 hs.;
d. sobre la preparación del paso c. se agrega una solución salina hipertónica de NaCI con una concentración de entre 0,2 y 2 M; e. la preparación se filtra mediante poro de 0,22 mieras
En una forma preferida de realización de la presente invención dicho proceso comprende además el siguiente paso:
f. la solución filtrada del paso e. de la reivindicación 1 1 se liofiliza;
Por último, luego del paso f es posible agregar el paso siguiente:
g. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso f. se resuspende en agua destilada o en una solución glucosada al 5%. Estudios para caracterizar las propiedades bactericidas del AINE y de la composición de la presente invención.
Existen numerosos y variados métodos de laboratorio que pueden ser usados para determinar "in vitro" la susceptibilidad de bacterias a diferentes agentes antimicrobianos como ensayos en placa de halos inhibitorios de crecimiento, test de crecimiento/inhibición en caldos nutritivos, kits comerciales, antibiogramas, etc.
En este caso, los ensayos se desarrollaron sobre un soporte líquido no nutritivo (solución buffer) donde se mezcla el agente antimicrobiano con inóculos cuantificados de cultivos bacterianos puros. Luego de distintos tiempos de incubación, el material se siembra en placas de agar para poder realizar los ensayos de cuantificación de la cantidad de bacterias que sobreviven al tratamiento
En los Ejemplos que se detallan más adelante, se describen las generalidades de los ensayos, que contiene entre otras, las actividades preliminares de acondicionamiento de cepas de trabajo, insumos, materiales y métodos, análisis de resultados obtenidos de la actividad biológica.
Estudios para caracterizar las propiedades virucidas del AINE y de la composición de la presente invención.
En el caso de la evaluación de la actividad virucida del AINE, preferntemente Ibuprofeno, se llevaron a cabo los estudios como se describió en Alasino y colaboradores en 2007. En este caso, las distintas cepas de virus con envoltura lipídica se incuban con cantidades crecientes de Ibuprofeno durante un período de tiempo que oscila entre 60 y 120 minutos. Luego este material se incuba con células en cultivo que son susceptibles al ataque de estos virus, presentando un marcado efecto citopático (formación de agregados celulares (rosetas) o bien muerte celular) que se puede detectar por observación al microscopio óptico
Potenciales aplicaciones de la presente invención en distintas patologías infecciosas En la presente invención se describe una composición de Ibuprofeno sódico solo, o asociado a una solución salina hipertónica pH entre 6,8 y 8,2, que presenta propiedades bactericidas contra diferentes bacterias como Pseudomonas aeruginosa, Burkhordelia cepacia, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Bacillus subtilis (Gram +), Staphylococcus aureus (Gram +), Enterococcus faecalis (Gram +) y virucidas que produce la inactivación de aquellos virus con envoltura lipídica como, virus de la diarrea bovina, Herpes virus tipo I y II, virus de estomatitis vesicular, virus de la hepatitis C, virus de la varicela.
Las aplicaciones de la composición de la presente invención con propiedades bactericidas y virucidas, alcanzan enfermedades infecciosas de tipo bacterianas que afectan directamente a mucosas como la bucal, la pulmonar, o bien virales como las infecciones por Herpes virus tipo I a nivel labial, bucal, o vaginal, como así también en el caso de la expresión cutánea de Herpes virus tipo II.
Ventajas de la composición de la presente invención en el tratamiento de diferentes infecciones
El uso de estas propiedades bactericidas de una solución de IBU sola, preferentemente en combinación con una solución hipertónica, puede ser aplicado para el tratamiento infecciones bacterianas, y especialmente aquellas a nivel pulmonar producidas por bacterias del tipo de P aeruginosa, que es capaz de producir biofilms, como en el caso de la Fibrosis Quística, una patología que resulta muy difícil de eliminar. La composición de la presente invención, puede presentarse en forma líquida, lo que hace que la misma pueda ser aplicada mediante un sistema de nebulización estandard. Los nebulizadores son los dispositivos de elección para la administración vía pulmonar de fármacos. Los actuales nebulizadores, trabajan mediante pulsos de ultrasonido que es aplicado a una solución para producir una nube en la que se encuentran los fármacos a vehiculizar. Los pacientes respiran normalmente esta nube durante varios minutos hasta que se agota la solución, la cual normalmente es de 1 a 5 mL por nebulización, lo cual presenta algunas ventajas como se menciona a continuación.
• En este caso la droga alcanzaría directamente al pulmón haciendo más efectiva su concentración en el órgano blanco para actuar sobre las bacterias P aeruginosa, S aureus metilicino resistente y B cepacia como se detalla en los ejemplos que se mencionan más adelante.
• Evitaría el empleo sistémico de AINES y de antibióticos, ya que al entrar en sangre se produce una dilución que afecta la concentración efectiva en el órgano blanco.
• Se evita que el AINE tenga contacto con componentes del plasma y más específicamente con la proteína albúmina con quien interacciona fuertemente y podría reducir su actividad bactericida.
• Especialmente el hecho de que el IBU, es una molécula de carácter aniónica, no presenta interacción con los biopolímeros fuertemente aniónicos como Alginato y ADN, materiales mayoritarios que se encuentran presentes en el biofilm que aparece en esta patología, como puede ocurrir con los antibióticos usados actualmente como es la Tobramicina (Figura 2) que presenta 5 grupos aminos primarios en su estructura.
• El hecho que la presente invención comprenda ibuprofeno junto con una solución de alta fuerza iónica, permite tal cual se demuestra en la presente memoria, aumentar 5 veces la eficacia del poder bactericida, disminuir el tiempo de contacto para ejercer la propiedad bactericida de horas a escasos minutos.
• La composición de la presente invención, al presentar una solución salina hipertónica permite que la misma pueda actuar no sólo como un agente fluidificador del biofilm, sino que presenta un contundente efecto bactericida, además de su efecto antiinflamatorio ya conocido.
En el caso particular del efecto bactericida de la composición de la presente invención en epitelio bucal, la ventaja de esta formulación sobre las actuales formulaciones antisépticas reside en que aquellas que utilizan Clorhexidina con el tiempo producen una coloración en los dientes, mientras que no ocurre con el uso del Ibuprofeno. Por otra parte, la composición de la invención puede ser utilizada en infecciones bucales o labiales producidas por virus Herpex Simplex Tipo I ya que además de su efecto antiviral aporta su efecto antiinflamatorio durante el tratamiento, una condición deseada para aliviar las molestias durante la infección.
El proceso para elaborar la composición de la presente invención
Dicha composición de la invención comprende al menos un agente bioactivo como son los AINEs solubilizado en medio acuoso que además de la clásica propiedad antiinflamatoria, en la presente invención, presenta propiedades bactericidas y virucidas cuando dicho AINE se encuentra formulado en una concentración que se encuentra por debajo de su concentración micelar crítica y en presencia de solución salina. El proceso de elaboración de dicha composición comprende a modo de ejemplo, las siguientes etapas:
• se coloca AINE en un recipiente al que se le agrega agua y se agita para mantener la suspensión de AINE,
· luego se le agrega una solución básica como NaHO hasta alcanzar un pH comprendido entre 7,0 - 8,5 con suave agitación, de modo de permitir la completa solubilización de dicho AINE. Preferentemente se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 hs.
• La preparación se diluye hasta alcanzar la concentración de AINE deseada para el tratamiento elegido.
• Sobre la preparación anterior se agrega solución salina de NaCI comprendida en un rango entre 0,2 y 2 M
• la preparación se filtra mediante poro de 0,22 mieras
• El material esterilizado puede ser finalmente liofilizado para su conservación o bien mantenido en estado líquido hasta su uso.
• Finalmente, al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador, o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, el AINE liofilizado se resuspende en el volumen original de: a- agua destilada, b- en una solución glucosada al 5%.
Dicho AINE puede ser seleccionado del conjunto comprendido por arilpropiónico seleccionado del conjunto comprendido por Ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indometacina, meclofenamato, mefenamic ácido, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, salicilatos acetilados, salicilatos no acetilados, y sus combinaciones.
Se prefieren las sales de dichos AINES tales como de Na, I o K. Es por ello que al agregarle la solución de hidróxido de sodio se forma la sal del AINE. Preferentemente se utiliza ibuprofeno sódico (IBU-Na), que presenta mayor solubilidad en solución acuosa que el ibuprofeno protonado (IBU-H).
La composición de la presente invención, comprende AINE en polvo, preferentemente ibuprofeno sódico, y sal de Na o K en una relación molar de AINE:sal de entre 1 :0,6 y 1 :400, preferentemente entre 1 :10 y 1 :100. Este polvo se puede diluir en agua para obtener la formulación farmacéutica de la invención. En la presente memoria descriptiva el IBUPROFENO es en cualquiera de sus formas. En particular el IBUPROFENO PROTONADO se identificará con la siguiente denominación: IBU-H.
Mientras que el IBUPROFENO SÓDICO, también conocido como IBUPROFENATO SÓDICO o SAL SÓDICA DE IBIPROFENO será identificado como IBU-Na en la presente memoria descriptiva. Este ibuprofeno sódico puede estar libre de agua, en forma de mono hidrato o en forma de dihidrato.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Preparación de las soluciones para los ensayos que se realizan en la presente memoria y en los siguientes ejemplos.
A continuación, se detallan modos de preparación de los componentes utilizados para la realización de la presente invención, que resultan ser los mejores conocidos por los inventores, pero que no son los únicos posibles.
Preparación de las soluciones IBU-H: Se disuelve Ibuprofeno sólido (20 g en etanol puro hasta completar 100 mL), esto representa una solución de IBU-H 1 M. En los estudios sobre la actividad de estas formulaciones se utiliza una solución que, puesta en el medio de cultivo no supere el 5% una concentración de etanol que no afecta la viabilidad de las bacterias. Preparación de la solución de IBU-Na: la solución madre de IBU-Na se prepara pesando 20 gr de Ibuprofeno, se agrega agua hasta los 50 mL, y luego con una solución de NaHO 4M se agrega cantidad suficiente para alcanzar un pH comprendido entre 7 y 8 y finalmente se enrasa a 100 mL para alcanzar una concentración final de 1 M de IBU-Na.
Preparación de la solución de Naproxeno: la solución madre de Naproxeno se prepara pesando 23 gr de Naproxeno, se agrega agua hasta los 50 mL, y luego con una solución de NaHO 4M se agrega cantidad suficiente para alcanzar un pH comprendido entre 7 y 8 y finalmente se enrasa a 100 mL para alcanzar una concentración final de 1 M de Naproxeno.
Preparación de la composición favorita de la presente invención:
Se siguen los siguientes pasos para la obtención de las distintas soluciones utilizadas para los ejemplos que siguen:
a. 2 gr de Ibuprofeno, se colocan en un Erlenmeyer a los que se le agrega 5 mL de agua y se agita para mantener la suspensión de Ibuprofeno, b. luego se le agrega NaHO 4 M hasta alcanzar un pH comprendido entre 7,0 - 8,5 con suave agitación, de modo de permitir la completa solubilización del IBU y finalmente se enrasa a 10 mL para lograr una concentración de 200 mg/mL. Se deja reposar a temperatura ambiente durante, al menos, 12 hs.
c. La preparación se diluye hasta alcanzar la concentración de IBU-NA deseada para el tratamiento elegido, según el ejemplo.
d. Sobre la preparación anterior se agrega la solución salina hipertónica para llegar a una concentración de NaC1 1 M
e. la preparación se filtra mediante poro de 0,22 mieras.
Para la obtención de la composición de la presente invención para la aplicación en los ensayos que se realizan en los ejemplos que siguen se llega, mediante el procedimiento descrito a composiciones de entre 1 y 100 mM de IBU-Na y soluciones hipertónicas que llegan a presentar una concentración final de 1 M de CINa. Los procedimientos utilizados son los habituales en la práctica de laboratorio al realizar diluciones.
Ejemplo 2
Activación y conservación del stock de cepas bacterianas de trabajo
Se utilizaron cepas comerciales liofilizadas ATCC (KWIK-STIK Microbiologics) activadas en tubos conteniendo 10 mL de medio BHI Brain Heart Infusión (Biokar BK015HA) a 37° C durante 24 hs.
Composición en g/L:
Infusión de cerebro y corazón 17,5
Peptona
Glucosa
Cloruro de sodio
Fosfato disódico
Preparación: Se disuelven 37 g del medio formulado en 1 L de agua destilada, se calienta hasta su completa disolución y ajusta el pH a 7,4 ± 0,2 a 25° C; finalmente se esteriliza por autoclave durante 15 minutos a 121°C.
Posterior al tiempo de activación de cada cepa en el medio referido y habiendo observado crecimiento efectivo por turbidez cercano al patrón 0,5 de la escala Me Farland, se aditivo a cada cultivo un 10% v/v de glicerol estéril como crioprotector; luego se distribuyó el contenido de cada tubo en alícuotas de 1 mi en tubos eppendorf de 1 ,5 mL. Estos fueron identificados como cepas stock y se conservaron a ultrabaja temperatura en freezer a -70° C (Ultra low temperature freezer Sanyo MDFU70V) para disponer de una reserva adecuada de cada cepa de trabajo.
Ejemplo 3
Ensayos de actividad antimicrobiana del IBU
Se realizaron pruebas de efectividad de IBU a diferentes concentraciones, tiempos de acción, fuerza iónica, variaciones de pH y con diversas poblaciones bacterianas; además se midieron concentraciones efectivas del antibiótico comercial Tobramicina (Figura 2)
Metodología de los ensayos
El trabajo consistió en incubar poblaciones bacterianas de carga conocida en términos de UFC/mL, con los compuestos mencionados en diferentes concentraciones molares. Se organizaron baterías de ensayos "in vitro" a diferentes dosis o concentraciones y en tubos Eppendorf de 1 ,5 mL sin adicionar medio de cultivo. Para ello se trabajó con un buffer fosfato PBS 100 mM que mantuvo las condiciones fisiológicas durante el período de duración de cada ensayo a 37° C.
Composición del Buffer PBS 100 mM :
8 g (137 mM) NaCI
0,2 g (2,7 mM) KCI
1 ,44 g (10 mM) NaHPO
. 0,24 g (2mM) KH2PO
1000 mL agua Milli Q
Al finalizar el tiempo de cada ensayo, se tomaron alícuotas de 100 uL y diluciones decimales de cada tubo que fueron sembradas en placas de Petri para recuento directo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en medio Mueller Hinton agar (MHA) aplicando el método estandarizado de difusión por placa fluida o vertida. A cada placa se le adicionaron 5 uL de una solución de colorante metabólico cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 1 % para mejorar el contraste de las colonias. Las placas fueron incubadas invertidas en estufa de cultivo por 24- 48 hs a 37° C y posteriormente se procedió al recuento directo con ajuste por factores de dilución y siembra para informar los resultados en términos de UFC/mL.
La composición en g/L del medio es:
Peptona 17,5
Almidón 1 ,5
Extracto de carne 4
Agar 15
Preparación:
Se disuelven 22,5 g del producto formulado en 1 L de agua destilada y se lleva a ebullición. Se ajusta el pH a 7,3 ± 0,2 a 25° C y esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121°C.
Durante los ensayos, el medio se conservó fundido en baño termostatizado entre 45-50° C porque la técnica de siembra requiere embeber e integrar las bacterias en el medio. Una vez solidificadas, las placas fueron incubadas invertidas durante un tiempo establecido de 24-48 hs antes de proceder al recuento de cada una a los fines de conocer las concentraciones efectivas en cada caso y así poder establecer comparaciones con otros tratamientos.
Ejemplo 4:
Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na e IBU-H en P. aeruginosa
Se muestran los resultados de un ensayo con soluciones de IBU-Na e IBU-H a distintas concentraciones molares crecientes sobre una población de P. aeruginosa durante un tiempo de incubación de 4 hs a 37° C y posterior siembra en placa.
Para realizar el ensayo de efectividad bactericida de la solución de IBU-H se garantizó una concentración final de etanol EtOH < 5 % para evitar la acción bactericida propia del disolvente.
IBU P. aeruginosa (UFC/mL ± 10) [mM] IBU- Na IBU- H
0 (Control) 1.700.000 1.700.000
1 1.700.000 1.700.000
5 1.700.000 1.700.000
10 760.000 480.000
20 300.000 200.000
50 50 1000
100 10 10
Ver Figura 3, donde los resultados de este ensayo demuestran que el IBU-Na tiene mayor capacidad bactericida que el IBU-H.
Ejemplo 5
Efectividad bactericida de soluciones de IBU-Na
En este ejemplo, se muestran los resultados de un ensayo con soluciones de IBU-Na a distintas concentraciones molares crecientes sobre 3 poblaciones de la misma cepa (P. aeruginosa) por un tiempo de incubación de 4 hs a 37° C y posterior siembra en placa.
Figure imgf000021_0001
Según se puede observar en la Figura 4, la conclusión de este estudio muestra que la dosis efectiva de IBU- Na depende de la carga bacteriana.
Ejemplo 6
Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa en función del tiempo
Se caracterizó el efecto del IBU- Na sobre la misma cepa de P. aeruginosa a una concentración fija de bacterias variando la concentración y el tiempo de contacto del IBU. El ensayo se realizó a 37° C y posteriormente las muestras fueron sembradas en placa.
Figure imgf000022_0001
Según se puede observar en la Figura 5, estos resultados muestran que se requiere un cierto tiempo de contacto o tratamiento con IBU- Na para obtener el efecto antimicrobiano; éste fue estandarizado para la mayoría de los ensayos en 4 horas.
Ejemplo 7
Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre P. aeruginosa a diferentes valores de pH.
Estudio sobre el efecto del pH del medio de incubación del ensayo sobre el potencial bactericida de una solución 50 mM de IBU- Na incubada durante 4 hs a 37° con un inoculo de P. aeruginosa
IBU- Na P. aeruginosa (UFC/mL ± 10)
[mM] pH 6,8 pH 7,3 pH 7,8
0 (Control) 200.000 200.000 200.000 50 10 10 600
Según se puede apreciar en la Figura 6, el resultado muestra que IBU- Na actúa como antimicrobiano en el rango de valores fisiológicos de pH. Ejemplo 8
Efecto antimicrobiano del IBU-Na sobre distintas cepas bacterianas
Efecto antimicrobiano del IBU-Na a dos concentraciones de ensayo [50 y 100 m ] sobre la viabilidad de cepas bacterianas Gram Positivas y Negativas, durante 4 horas de contacto a 37° C.
Figure imgf000023_0001
Tal como se puede observar en la Figura 7, el resultado muestra que el IBU- Na funciona como antimicrobiano sobre diferentes cepas bacterianas (Gram positivas y negativas).
Ejemplo 9
Efecto antimicrobiano del IBU-Na a distintas concentraciones sobre las 3 cepas bacterianas principales que se encuentran asociadas a la enfermedad Fibrosis Quística (FQ)
Efecto del IBU-Na a distintas concentraciones sobre la viabilidad de Staphylococcus aureus, Burkhordelia cepacia y Pseudomonas aeruginosa, durante 4 horas a 37° C. IBU- Na Recuento de Colonias (UFC/mL ± 10)
[mM ] Staphylococcus Burkhordelia Pseudomonas
0 (Control) 1.000.000 1.300.000 1.700.000
5 1.000.000 1.300.000 1.700.000
10 1.000.000 1.300.000 760.000
25 30.000 40.000 200.000
50 600 700 100
100 10 10 10
El resultado muestra que el IBU-Na presenta efecto sobre las tres cepas bacterianas más frecuentes que se encuentran presentes en la Fibrosis Quística (Figura 8) Ejemplo 10
Efecto antimicrobiano del NAPROXENO en una población de Burkhordelia cepacia
En este estudio, se analizó el efecto del Naproxeno a distintas concentraciones sobre una población de la cepa B. cepacia con ensayos de 4 hs de incubación a 37° C.
Figure imgf000024_0001
Tal como se muestra en la Figura 9. El resultado muestra que el Naproxeno muestra una menor actividad antimicrobiana comparada con el IBU-Na.
Ejemplo 11
Efecto de la fuerza iónica (CINa) sobre un cultivo de P. aeruginosa
En este estudio se analiza el efecto de la fuerza iónica (CINa) a diferentes concentraciones sobre un cultivo de P. aeruginosa en tratamientos de 4 horas a 37° C.
Figure imgf000025_0001
El estudio muestra que no se observa disminución en la población bacteriana por efecto de la fuerza iónica. (Figura 10)
Ejemplo 12
Efecto de la composición de la presente invención, que comprende IBU-Na con fuerza iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.
Estudio para evaluar el efecto bactericida del IBU-Na en presencia de Fuerza Iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P. aeruginosa durante 4 horas a 37° C.
Figure imgf000025_0002
El resultado muestra claramente que la fuerza iónica favorece la acción del IBU-Na, disminuyendo la dosis necesaria para obtener un efecto antimicrobiano en la población de bacterias ensayada. En la Figura 11 se observa claramente que con una concentración de 25 mM de IBU-Na se reduce el N° de UFC/mL a 1000, mientras que la composición de la presente invención con la fuerza iónica de CINa al 1 M logra el mismo resultado a una concentración cinco veces menor, es decir de unos 5 mM de IBU-Na.
Ejemplo 13
Efecto bactericida de la composición de la presente invención, que comprende una solución de Ibuprofeno hipertónica en función del tiempo
A continuación, se presenta el estudio para evaluar el efecto bactericida del IBU-Na en presencia de fuerza iónica (CINa 1 M) a distintos tiempos de incubación sobre un cultivo de P. aeruginosa. Tratamientos de 1 hora, 2 horas y 4 horas a 37° C pH 6,5.
Figure imgf000026_0001
Tal como puede observarse en la Figura 12, este resultado muestra que la Fuerza iónica permite acortar los tiempos de acción fijados anteriormente.
Ejemplo 14
Efecto de la composición de la presente invención que comprende IBU-Na con fuerza iónica sobre un cultivo de P. aeruginosa variando el tiempo de tratamiento (en minutos)
Este estudio muestra el efecto bactericida del IBU-Na 20 mM en presencia de fuerza iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P. aeruginosa. Tratamientos a distintos tiempos de incubación (1 , 3 y 10 minutos)
P. aeruginosa (UFC/mL ± 10)
Tiempo Preincubacion 10' con
IBU 20 mM con IBU 20 mM sin
(Minutos) Fuerza Iónica
Fuerza Iónica Fuerza Iónica
Posterior: IBU 20 mM 0
1.000.000 1.000.000 1.000.000
(Control)
1 10 1.000.000 1.000.000
3 10 1.000.000 1.000.000
10 10 1.000.000 1.000.000
Tal como puede observarse en la Figura 13, el resultado obtenido muestra que sólo el tratamiento combinado de Ibuprofeno en presencia de Fuerza Iónica (IBU-Na 20 mM + CINa 1 M) permite obtener un resultado sinérgico sobre el efecto antimicrobiano en función del tiempo.
Analizando otras alternativas, como puede verse en la tercer y cuarta columna de la tabla de este mismo ejemplo, con ibuprofeno solo sin fuerza iónica y un tratamiento disociado, preincubando un inoculo de P. aeruginosa 1x 108 UFC/mL durante 10 minutos en CINa 1 M y posterior lavado por dilución 1/10 en buffer conteniendo IBU 20 mM. Como resultado se establece que la Fuerza Iónica sola no afecta el inoculo; el pretratamiento de Fuerza Iónica y posterior tratamiento con Ibuprofeno, no provocó modificaciones en el inoculo respecto de los controles, tal como se observa en la cuarta columna de la tabla de este ejemplo. Tal como queda evidenciado en este ejemplo, la presente invención tiene un efecto técnico sorprendente e inesperado, al lograr un efecto sinérgico casi instantáneo (en relación a otras terapéuticas) que favorece la interacción del Ibuprofeno sobre los microorganismos, y así en sólo un minuto lograr la drástica disminución de una población de microorganismos típicos de la fibrosis quística.
Ejemplo 15
Efecto de la composición de la presente invención que comprende ibuprofeno (IBU- Na) con fuerza iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de tres cepas bacterianas
Ensayo para evaluar el efecto del IBU- Na con fuerza iónica (CINa 1 M) sobre 3 cepas bacterianas: P aeruginosa, S aureus y B cepacia en tratamientos por 4 horas a 37° C.
IBU- Na [mM] Recuento de Colonias (UFC/mL c/ CINa 1 M
P. aeruginosa S. aureus B. cepacia
0 3.000.000 1.000.000 1.700.000
12,5 250 100 100
25 10 10 10
50 10 10 10
Tal como se observa en la Figura 14, la presencia de una solución hipertónica favorece la acción antibacteriana del IBU-Na sobre las tres cepas de interés asociadas a la enfermedad FQ.
A continuación, se presentan ejemplos de aplicación que muestran cómo se ve afectado el efecto bactericida del Ibuprofeno cuando se administra ya por vía oral o por vía endovenosa. Estos ejemplos ponen de manifiesto aspectos que evidencian la altura inventiva de la presente composición, ya que se provee de una formulación que evita los factores que normalmente han ocultado los efectos bactericidas del Ibuprofeno.
Ejemplo 16
Efecto de la presencia de ALBUMINA humana sobre la actividad bactericida del IBU- Na [20 mM] en medio con fuerza iónica (CINa 1 M)
Estudio para evaluar el efecto de la presencia de una proteína del suero, la albúmina humana, una proteína reconocida con capacidad para interaccionar fuertemente con la molécula de Ibuprofeno sobre la actividad bactericida. En este caso se realizó la pre- incubación inicial de distintas concentraciones de Albúmina con IBU- Na [20 mM] a temperatura ambiente durante 1 hora; posteriormente se incubaron con las bacterias en presencia de Fuerza Iónica (CINa 1 M) para dar comienzo con el tratamiento final de 4 hs a 37° C.
ALBUMINA (mg/mL) con P. aeruginosa
IBU 20 mM y NaCI (1 M) (UFC/mL ± 10)
Control * 1.000.000 10 1.000.000
5 1500
2,5 10
* Albúmina 10 mg/mL sin IBU- Na
Tal como puede observarse en la Figura 15, la presencia de Albúmina interfiere en la acción antibacteriana del IBU- Na 20 mM. A partir de concentraciones de Albúmina inferiores a 10 mg/mL comienza a recuperarse el efecto bactericida del IBU- Na, lo que sugiere algún tipo de interacción.
Ejemplo 17
Efecto del LIPOVENOS R (triglicéridos de cadena media) en presencia de Fuerza Iónica (CINa 1 M) sobre un cultivo de P. aeruginosa.
Se incubó un inoculo de P. aeruginosa en presencia de LIPOVENOSMR + Fuerza Iónica (CINa 1 M) durante un tratamiento por 4 horas a 37° C.
Figure imgf000029_0001
Tal como puede observarse en la figura 16, el LIPOVENOSMR no produce ningún efecto sobre el inoculo en las concentraciones ensayadas
Ejemplo 18
Efecto del IBU- Na [20 mM] en presencia de LIPOVENOS R sobre la viabilidad de P aeruginosa. Preincubación inicial de LIPOVENOS a distintas concentraciones con IBU- Na 20 [mM] a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente se mezcló con las bacterias para comenzar el tratamiento de 4 hs a 37° C.
Figure imgf000030_0001
* LIPOVENOSMR 10%, sin IBU- Na
La presencia de LIPOVENOSMR hasta el 2,5%, presenta una marcada interferencia sobre la acción antibacteriana del IBU-Na 20 mM.
Ejemplo 19
Efecto antimicrobiano de la TOBRAMICINA en función de la concentración y del tiempo de contacto sobre P. aeruginosa
En este ensayo se realizó estudio para evaluar la actividad de un antibiótico conocido como es la Tobramicina sobre una población de P. aeruginosa en tratamientos de 1 h, 4 hs y O.N. a 37° C. y así comparar con los estudios de los ejemplos previos de la actividad del Ibuprofeno
P. aeruginosa
Tobramicina
[mM] (UFC/mL ± 10)
1 hora 4 horas O.N.
Control 2.000.000 2.000.000 2.000.000
1 1.000.000 30.000 30.000
2,5 60.000 20.000 10
5 30.000 1.000 10
10 1.000 10 10 Tal como puede observarse en la Figura 17, a medida que se incrementa el tiempo de contacto de las bacterias con el antibiótico Tobramicina, aumenta su efecto bactericida.
Ejemplo 20
Efecto antimicrobiano de la TOBRAMICINA en presencia de fuerza iónica sobre P. aeruginosa
En este ejemplo se muestra un ensayo para evaluar una formulación del antibiótico Tobramicina en presencia de una solución de CINa 1 M sobre una población de P. aeruginosa durante 4 hs a 37° C.
Figure imgf000031_0002
Tal como se observa en la Figura 18, con la presencia de fuerza iónica (CINa 1 M) se ve favorecido el efecto bactericida del antibiótico Tobramicina sobre una población de P. aeruginosa en un tiempo de contacto de 4 hs a 37° C. Ejemplo 21
Efecto antimicrobiano del IBU-Na y la TOBRAMICINA en presencia de fuerza iónica sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa
Estudio comparativo del efecto de IBU-Na y TOBRAMICINA en presencia de Fuerza Iónica (CINa 1 M) sobre un biofilm artificial de P. aeruginosa en presencia de una solución de alginato 2%. Los tratamientos se realizaron durante 4 horas a 37° C.
Figure imgf000031_0001
Biofilm + Fl (1) 2.000.000
(1) + IBU- Na 10 mM 25.000
(1) + IBU- Na 25 mM 200
(1) + Tobramicina 5 mM * 10
(1) + Tobramicina 10 mM * 10
* Formación de complejo insoluble
Tal como se puede observar en la figura 19, el ensayo muestra que el IBU-Na en presencia de fuerza iónica mantiene propiedades antimicrobianas a pesar de la barrera de alginato y no formó un complejo insoluble. Mientras que la Tobramicina formó un complejo insoluble durante los ensayos, aunque mantuvo efectiva su condición como antibiótico.
Cabe destacar que es un compuesto insoluble el que genera una obstrucción progresiva de los pulmones en la fibrosis quística. Con lo cual es posible esperar que en pruebas en humanos la composición de la presente invención se constituya en una terapia recomendada para esta enfermedad.
Ejemplo 22
Evaluación del potencial efecto citotóxico de nebulizaciones con Ibuprofeno en dos concentraciones sobre tejido pulmonar de ratas
En este estudio histopatológico se analizó el potencial efecto citotóxico del Ibuprofeno en pulmón, a concentraciones de 25 y 50 mM. Los grupos A y B corresponden a tratamientos replicados con 8 animales en cada concentración; éstos fueron nebulizados 1 hora por día durante 4 meses. Los restantes grupos C y D son similares que A y B, pero luego de los 4 meses en cada caso se los dejó unos 15 días más sin tratamiento alguno y luego se los sacrificó.
Figure imgf000032_0001
0
0
1
50 Intenso infiltrado
Congestión 0 0 NO NO mononuclear Escaso y focal
capilar
pe bronquial
25 0 1 0 0 1 NO NO
B 0
50 Intenso infiltrado 1 0 0 1 NO NO mononuclear
pe bronquial
0
25 Infiltrado mononuclear 1 0 0 1 NO NO pe vascular y
pe bronquiolar
C
0
50 Leve infiltrado 1 0 0 1 NO NO mononuclear
pe bronquial
0
25 Infiltrado mononuclear 1 0 0 1 NO NO pehvascular y
pehbronquiolar
D
0
50 Leve infiltrado 1 0 0 1 NO NO mononuclear
pehbronquial
De los resultados de los estudios anatomopatológicos mostrados en la Tabla, se puede concluir que la nebulización diaria de 60 minutos, durante un período de tiempo relativamente prolongado de 4 meses de una solución de Ibuprofeno 50 mM en ratas de la cepa Balb7c no produce alteraciones significativas en el tejido pulmonar que haga necesario su suspensión.
Ejemplo 23
Estudios de la actividad antiviral de una solución de Ibuprofeno A continuación, se describen los estudios "in vitro" donde se muestra la actividad de una solución de Ibuprofeno sódica para producir la inactivación de los virus denominados "envueltos" que son aquellos virus que presentan una envoltura lipídica. Cultivo de células utilizadas en el ensayo de actividad
Células de riñon de mono verde de Africa (Vero) (ATCC CCL-21) , células Madin-Darby de riñon bovino (MDBK) (ATCC CCL-22) y células de tumor epitelial de laringe humanas (Hep- 2) (ATCC CCL-23) fueron propagadas en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino irradiado conteniendo 10000 IU de penicilina y 2 mM glutamina. Virus utilizados en los ensayos de inactivación
El virus de la diarrea bovina BVDV fue provisto por INTA Castelar, y fue propagado en monocapas de células MDBK. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) (ATCC VR-158) y el virus Herpes Simplex 1 (HSV) fueron propagados en células VERO. La cepa de virus rubéola (MV) fue obtenida a partir de la vacuna comercial Rouvax (Paster Merieux. Francia) fue propagada en células Hep-2. El virus Herpes Simplex (HSV) fue provisto por el instituto de Virología de la UNC
Preparación de los stocks de virus
Los virus fueron propagados usando las células susceptibles de ser infectadas, las cuales fueron cultivadas a 37 C, hasta la completa destrucción total de la monocapa de células. Los virus asociados a las células fueron extraídos por el uso de tres ciclos de congelamiento- descongelamiento de las botellas donde estaban las células. El material fue centrifugado a 3000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante fue fraccionado y guardado a -70 C hasta su uso.
Estudios para evaluar la actividad virucida de una solución de IBUPROFENO y de la composición de la presente invención
Ensayos de infectividad de los virus HSV, BVDV, VSV y MV: la actividad infectiva de los virus fue determinada por el método de titulación (por diluciones 1/10) en placas de 96 pocilios (NUNC Life Technologies, Rockville, MD, USA), usando como criterio la medición del efecto citopático que se produce sobre las células (agregación y muerte celular) y por lo tanto se determina por positivo o negativo. Diluciones seriadas 1/10 de los virus fueron preparadas por cuadruplicado y fueron incubados por 60 minutos a 37° C con suave agitación con distintas concentraciones de Ibuprofeno que están comprendidas entre 1 y 50 mM. Luego de este período de tiempo, la solución de virus con Ibuprofeno se la incuba en presencia de las células y se dejan también 60 min. a 37° C a los fines de permitir la adsorción de los virus sobre las células para que puedan ejercer su efecto citopático. Luego se le agrega 150 uL de medio de mantenimiento a cada pocilio sin remover el inoculo, La incubación fue llevada a cabo a 37° C in una estufa conteniendo 5 % de atmosfera de C02, con 90% de humedad relativa, durante 3 días para el caso de los virus HSV y VSV o bien hasta 7 u 8 días para ios virus BVDV y MV, para dar tiempo suficiente para detectar la aparición de! potencial efecto citopático.
Determinación de ^a Dosis infectiva 50
La denominada Dosis infectiva del cultivo celular 50% (TCID50 mL- ) fue calculada por el método de análisis de Reed-Muench (L. J. Reed, H. Munch, Am. J. Hygiene 1938, 27, 493.) para pocilios infectados por virus positivos.
Resultados del ensayo sobre el efecto de Ibuprofeno a una concentración 50 mM sobre la capacidad infectiva de los virus.
Familia Genoma Tamaño (nM) Ibuprofeno TCID50 mL-1
HSV Herpes dsDNA 120-200 > 6.9
BVDV Flavi RssRNA 50-70 > 6.5
VSV Rhabdo SssRNA 70-170 > 7.7
MV Paramyxo SssRNA 150-300 > 5.0 Como puede observarse de los resultados obtenidos, la incubación de Ibuprofeno en presencia de los virus envueltos utilizados, produce un marcado efecto inhibitorio sobre la capacidad infectiva viral. Los títulos obtenidos expresados como Dosis Inhibitoria 50, oscilan en 105 y 107 logaritmos unidades formadoras de colonias.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiendo descrito y representado la naturaleza y alcance de la invención y la manera que la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de exclusivo derecho y propiedad:
1 Una composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, caracterizada porque comprende un anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) y una sal.
2 La composición farmacéutica bactericida y virucida, de aplicación sobre epitelios de tejidos como pulmonar, nasal y bucal, de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende dicho anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) en una concentración entre 5 y 500 mM solubilizado en solución salina de dicha sal.
3 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque su forma de administración es seleccionada del conjunto comprendido por inhalación, nebulización, enjuague bucal y tópica.
4 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) comprende una concentración entre 5 y 180 mM.
5 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo (AINE) comprende una concentración menor a 180 mM.
6 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicho antiinflamatorio no esteroideo (AINE) comprende una concentración entre 5 y 50 mM.
7 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo es seleccionado del conjunto comprendido por Ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indometacina, meclofenamato, mefenamic ácido, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, salicilatos acetilados, salicilatos no acetilados, y sus combinaciones.
8 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo comprende AINE arilpropiónico.
9 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque dicho anti- inflamatorio no esteroideo es seleccionado del conjunto comprendido por Ibuprofeno,
Naproxeno, Flurbiprofeno, ketoprofeno y sus combinaciones. 10 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo comprende ibuprofeno.
1 1 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque dicho anti-inflamatorio no esteroideo comprende como contraión a los cationes monovalentes seleccionados del conjunto comprendido por sodio, potasio, litio y combinaciones de los mismos.
12 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque comprende un pH en solución acuosa de entre 6,0 y 8,5.
13 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque comprende un pH en solución acuosa de entre 7,0 y 8,0.
14 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque comprende un pH en solución acuosa de entre 7,5 y 7,9.
15 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicha solución salina es hipertónica y comprende una concentración de entre 0,3 y 2 Molar de NaCI
16 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicha solución salina es hipertónica y comprende una concentración de entre 0,4 y 1 , 1 Molar de NaCI
17 La composición de la reivindicación 2 caracterizada porque dicha solución salina es hipertónica y comprende una concentración de entre 0,9 y 1 ,05 Molar de NaCI
18 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque además comprende un agente anestésico.
19 La composición de la reivindicación 18 caracterizada porque dicho agente anestésico es seleccionado del conjunto comprendido por xilocaína, lidocaína, carticaína y mepivacaína.
20 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque comprende un estado seleccionado del conjunto comprendido por líquido, polvo y liofilizado.
21 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque comprende una formulación farmacéutica para nebulizar a pacientes que padecen fibrosis quística.
22 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque comprende dicha composición para el tratamiento de la fibrosis quística en ausencia de antibióticos.
23 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque comprende una formulación farmacéutica para el tratamiento de infecciones virales tipo Herpex simplex, que se aplica sobre piel afectada. 24 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque comprende una formulación farmacéutica para enjuague bactericida bucal.
25 La composición de la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque además comprende antibióticos seleccionados del conjunto comprendido por colistimetato de sodio, tobramicina, ciprofloxacino, aztreonam lisina, levofloxacino, ciprofloxacino, fosfomicina, anfotericina B, vancomicina, gentamicina, ceftazidima, ampicilina, amikacina y sus mezclas.
26 La composición de la reivindicación 1 caracterizada porque la relación molar entre dicho AINE y dicha sal es de entre 1 :0,6 y 1 :400.
27 La composición de la reivindicación 1 caracterizada porque la relación molar entre dicho AINE y dicha sal es de entre 1 : 10 y 1 : 100.
28 La composición de la reivindicación 1 caracterizada porque dicha sal es seleccionada del grupo comprendido por cloruro de Sodio, Potasio y sus combinaciones.
29 La composición de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende una formulación farmacéutica para ser diluida en agua en ausencia de cualquier otro componente.
30 Un proceso de elaboración de la composición de la reivindicación 2 caracterizada porque comprende los siguientes pasos:
a. se mezcla dicho AINE con agua y se agita para mantener la suspensión de dicho AINE;
b. se agrega NaHO hasta alcanzar un pH comprendido entre 6,8 y 8,5 con suave agitación, de modo de permitir la completa solubilización de dicho AINE hasta obtener una concentración de entre 1 y 100 mg/mL.;
c. sobre la preparación del paso b. se agrega una solución salina hipertónica de NaCI con una concentración de entre 0,3 y 2 M;
d. la preparación del paso c. se filtra mediante poro de 0,22 mieras.
31 El proceso de la reivindicación 30 caracterizado porque comprende además el siguiente paso:
e. la solución filtrada del paso d. de la reivindicación 30 se liofiliza;
32 El proceso de la reivindicación 31 caracterizado porque comprende además el siguiente paso: f. al momento de su aplicación, ya sea para ser vehiculizada a pulmón mediante nebulizador o para ser aplicada en boca como enjuague bucal, la composición liofilizada del paso e. de la reivindicación 31 se resuspende en agua o en una solución glucosada al 5%.
33 El proceso de la reivindicación 30 caracterizado porque dicho AINE es seleccionado del conjunto comprendido por: Ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, indometacina, meclofenamato, mefenamic ácido, meloxicam, nabumetone, oxaprozin, piroxicam, sulindac, tolmetin, celecoxib, salicilatos acetilados, salicilatos no acetilados, y sus combinaciones.
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