ES2926545T3 - Aminopirazoles como inhibidores selectivos de la quinasa Janus - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de fórmula I que son inhibidores selectivos de JAK y, como tales, son útiles para el tratamiento de enfermedades mediadas por JAK tales como dermatitis atópica, artritis y cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aminopirazoles como inhibidores selectivos de la quinasa Janus

Antecedentes de la invención

Las proteína quinasas son un grupo de enzimas que regulan la actividad de sus dianas proteicas mediante la adición de grupos fosfato al sustrato de la proteína. Las quinasas se subdividen por su diana en Serina/Treonina quinasas y Tirosina quinasas, y juegan un papel esencial en muchos procesos fisiológicos incluidos división celular, diferenciación, homeostasis celular y transducción de la señal.

Los miembros de la familia de quinasas Janus (JAK) de tirosina quinasas no receptoras tienen cuatro miembros; JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. La familia JAK está implicada en la transducción de la señal intracelular de >70 citoquinas diferentes. Las citoquinas se unen a sus receptores en la superficie de la célula, dando como resultado la dimerización del receptor y la posterior activación/fosforilación de las tirosina quinasas JAK. Los residuos de tirosina específicos del receptor, a continuación, se fosforilan, mediante las JAK activadas y sirven como sitios de anclaje para las proteínas STAT. Las STAT se fosforilan mediante las JAK, dimerizan, a continuación, se someten a translocación al núcleo donde se unen a elementos específicos del ADN y activan la transcripción génica. JAK1 señala junto con todas las isoformas de JAK de una forma dependiente de citoquinas.

Las JAK son fundamentales para múltiples funciones fisiológicas. Esto se evidencia mediante estudios que usan modelos de ratón diseñados mediante ingeniería genética que son deficientes en JAK específicas (K. Ghoreschi, A. Laurence, J. J. O'Shea, Immunol. Rev. 228, 273 (2009)), y la identificación de mutaciones en las enzimas JAK que se han asociado a enfermedades en seres humanos. (J. J. O'Shea, M. Pesu, D. C. Borie, P. S. Changelian, Nat. Rev. Drug Discov. 3, 555 (2004)). Y. Sun et al., Immunity. 25, 745 (2006)).

Estos datos genéticos de ratón y humanos relacionan la ruta Jak/STAT con varias enfermedades y trastornos incluyendo, pero sin limitación, trastornos hiperproliferativos y cáncer tales como leucemia y linfomas, trastornos inmunitarios e inflamatorios tales como el rechazo al trasplante, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, alergias, artritis reumatoide, dermatitis atópica y alérgica, diabetes de tipo I, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple.

El documento WO 2013/041042 divulga pirazol carboxamidinas como inhibidores de quinasa Janus que son útiles para el tratamiento de artritis reumatoide, asma, EPOC y cáncer. Los compuestos de la presente divulgación son de la siguiente fórmula

El documento WO2013/040863 divulga cicloalquilnitrilo pirazol carboxamidas sustituidas que son inhibidores de la quinasa Janus 1 útiles para tratar, por ejemplo, asma, enfermedades obstructiva de las vías respiratorias, artritis, enfisema, cáncer, miastenia grave, la enfermedad de Grave y la enfermedad de Alzheimer.

El documento WO2014/146490 divulga compuestos de 2-(3-amino-4-oxo-4,5-dihidro-pirazol(4,3-c)piridin-1-il)-ciclobutanecarbonitrilo sustituidos que son inhibidores de quinasa Janus usados para tratar, por ejemplo, artritis reumatoide, asma crónico, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes.

Las citoquinas que utilizan la ruta de señalización JAK-STAT se han implicado en la patogénesis y el mantenimiento de la dermatitis atópica y alérgica. Estas incluyen IL-4 y IL-6 proinflamatorias e IL-13 [Carmi-Levy et al., Clinic Rev Allerg Immunol (2011), 41:245), Ong y Leung, Curr. Allergy Asthma Rep. (2006), 6(5):384)], citoquinas implicadas en la respuesta alérgica, así como IL-31, una citoquina implicada en provocar pruritos [Dillon et al., Nat. Immunol. (2004), 5(7): 752]. Notablemente, los receptores de estas citoquinas anteriormente mencionadas implicadas en la dermatitis atópica y alérgica utilizan JAK1, junto con JAK2, JAK3 o Tyk2, para generar señalización intracelular y provocar efectos biológicos [Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M, Holt VE 3°, Silvennoinen O, O'Shea JJ., Genome Biol. 2004;5(12):253].

En perros con dermatitis alérgica o atópica, la administración de oclacitinib, un inhibidor de JAK con selectividad modesta para JAK1, produce una mejora rápida del prurito y reduce las lesiones [Cosgrove et al., Vet. Derm. (2013), 24:479; Cosgrove et al., Vet. Derm. (2013), 24:587]. A dosis más altas, oclacitinib produce una reducción en los recuentos de hematocritos, hemoglobina y reticulocitos, presumiblemente debido a la inhibición de JAK2 [FOI Summary NADA 141-345; Gonzales et al., J. Vet. Pharmacol. Therapeut. (2014), 37:317]. Colectivamente, estos datos sugieren firmemente que la inhibición de JAK1 es un tratamiento eficaz para la dermatitis alérgica y atópica en perros, y que un compuesto con mayor selectividad para JAK1 sobre las otras enzimas JAK conferirá un índice terapéutico mejorado.

Apoquel® es un fármaco veterinario cuyo principio activo es oclacitinib que está autorizado para el control de prurito asociado a la dermatitis atópica y el control de la dermatitis atópica en perros de al menos 12 meses de edad (véase, FOI Summary for NADA 141-345, 14 de mayo de 2013). Véase también, las patentes de Estados Unidos n.° 6.890.929; 7.687.507; 8133899 y 8.987.283.

Se evaluó la seguridad de Apoquel® en unos fundamentales 6 meses, margen de la buena práctica de laboratorio (BPL) del estudio de seguridad. El producto se administró por vía oral, dos veces al día durante 6 días, seguido de una vez por día durante 20 semanas, a perros a 1, 3 y 5 veces la dosis de exposición máxima de 0,6 mg/kg (la dosis clínica recomendada es de 0,4 mg/kg) durante un total de 26 semanas (6 meses). Aunque el producto generalmente era bien tolerado a todas las dosis, había efectos del artículo a prueba en todos los grupos coherentes con la acción farmacológica de la clase de fármaco. Estos incluían: papilomas (considerados relacionados con el artículo a prueba, pero no relacionados con la dosis); quistes interdigitales (pododermatitis, etc.) (probablemente relacionados con la dosis); disminuciones en la masa de glóbulos rojos; disminuciones en la albúmina de suero; disminución de la celularidad del tejido linfoide asociado a los intestinos (GALT), bazo y ganglios linfáticos mesentéricos/cervicales; disminución de la celularidad de la médula ósea del esternón y del femoral. La mayoría de estos efectos eran suaves y parecían no progresivos (véase el informe para la evaluación de CVMP para ApOq UEL (EMEA/V/C/002688/0000); EMA/481054/2013).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona compuestos novedosos que son inhibidores de las JAK. La invención también proporciona un método para el tratamiento y la prevención de enfermedades y trastornos mediados por JAK usando los novedosos compuestos, así como composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos.

Descripción de las figuras

La Figura 1 presenta los resultados del Compuesto 1 cuando se ensaya en el modelo de picor inducido por IL-31. La Figura 1 A muestra la comparación del Compuesto 1 con el placebo y Apoquel.

La Figura 1 B muestra el efecto de tres dosis diferentes del Compuesto 1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona compuestos de fórmula I o sales farmacéuticamente aceptables o estereoisómeros de los mismos:

En una realización, el compuesto de Fórmula I es

En una realización, los compuestos de la presente invención son inhibidores selectivos de JAK1 con respecto a JAK2 y JAK3. En una realización, los compuestos de la presente invención son inhibidores selectivos de JAK1 con respecto a JAK2 o JAK3. La determinación de la selectividad relativa para un compuesto dado de inhibición de JAK1 se define cuando la razón relativa (valor de la CI50 de JAK2/valor de la CI50 de JAK1) es de al menos 2. También, la razón relativa (valor de la CI50 de JAK3/valor de la CI50 de JAK1) es de al menos 500.

En otra realización más, para un compuesto dado, las razones relativas (valor de la CI50 de JAK2/valor de la CI50 de JAK1) es de al menos 5 o al menos 10. En otra realización, la razón relativa (valor de la CI50 de JAK3/valor de la CI50 de JAK1) es de al menos 500 o al menos 750 o al menos 1.000. Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable, o un estereoisómero del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otra realización es un compuesto de Fórmula I para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad mediada por JAK-1 que comprende administrar a un mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I.

Una realización adicional es un compuesto de fórmula I para su uso en un método de tratamiento en donde la enfermedad mediada por JAK-1 es una que puede mejorar mediante la inhibición selectiva de una quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK 2 y JAK 3.

En otra realización, la enfermedad se selecciona entre dermatitis alérgica, dermatitis atópica, artritis, queratoconjuntivitis seca, enfermedades o trastornos autoinmunitarios y cáncer.

En otra realización, la enfermedad es dermatitis atópica.

En una realización, la enfermedad es una enfermedad o trastorno autoinmunitario.

En una realización, la enfermedad es artritis.

En otra realización, el mamífero es un mamífero animal de compañía.

En otra realización, el animal de compañía es un perro, un gato, o un caballo.

En una realización, la enfermedad es queratoconjuntivitis seca.

En una realización adicional, la administración es por vía oral, parenteral o tópica.

En otra realización, la inhibición selectiva es de quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK2.

En otra realización, la inhibición selectiva es de quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK3.

En una realización adicional, la razón de JAK2(CI50)/JAK1(CI50) es de al menos 5, al menos 10, al menos 12.

En otra realización, la razón de JAK3(CI50)/JAK1(CI50) es de al menos 1.000 o al menos 750 o al menos 500.

En otra realización, la dosis diaria del compuesto es de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 3,0 mg/kg o aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 1,0 mg/kg de peso corporal.

La evidencia que respalda la inhibición y la selectividad de JAK1

Los resultados de los ensayos clínicos con inhibidores de JAK múltiples Tofacitinib (JAK1/JAK2/JAK3) (Kremer et al., Arthritis and Rheumatism 2009 "The safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active RA", Fleishman et al, Arthritis and Rheumatism 2010 "Tofacitinib in patients with active RA", Fleishman et al, NEJM 2012 "Placebo controlled trial of Tofacitinib monotherapy in RA") y Baricitinib (JAK1/JAK2) (Greenwald et al, ACR annual meeting Nov de 2010 "A randomized dose-ranmging, PBO-controlled study of TNCB028050, a selective JAK1 and JAK2 inhibitor, in subjects with active RA") respaldan la hipótesis de que pueden conseguirse altos niveles de eficacia a través de dirigir la inhibición de JAK. Sin embargo, acontecimientos adversos limitantes de la dosis han limitado la eficacia y el uso de estos agentes. Se observaron AA hematopoyéticos significativos, específicamente anemia, en pacientes que tomaban tanto Tofacitinib como Baricitinib, con una mayor incidencia y gravedad a dosis más altas. Se anticipa que esto es debido a la inhibición de la señalización de EPO, un factor de crecimiento fundamental para el desarrollo de los glóbulos rojos que se señala por JAK2. La inhibición de EPO también conduce a una incapacidad de recuperarse de la anemia de enfermedad crónica. Aproximadamente el 40 % de los pacientes con AR padecen de anemia de enfermedad crónica (Masson. Joint Bone Spine 2011 "Rheumatopid Anemia", Han et al, J Rheumatology 2007 "Association of anemia and physical disability among patients with Ra "). El paradigma del actual tratamiento es tratar la inflamación que causa esta anemia, sin embargo, el tratamiento con inhibidores de JAK múltiples que inhiben también la señalización de EPO contrarresta los beneficios sobre los niveles de hemoglobina del tratamiento de la inflamación. Los inhibidores de JAK1 específicos no afectaría a la señalización EPO, no estarían limitados por los AA de la anemia, y permitirían recuperar los niveles de hemoglobina después de que se invirtiera la inflamación.

Evidencia clínica adicional que respalda la hipótesis de que JAK1 viene de Tocilizumab, una anticuerpo que se dirige contra el receptor de IL-6 (señales de IL-6 a través de jAK1 y JAK2). Los altos niveles de eficacia se consiguen con este agente biológico sin inducir anemia, y la anemia de la inflamación se invierten con éxito (Emery et al, Ann Rheum Dis 2008 "IL-6 receptor inhibition with tocilizumab improves treatment outcomes in patients with RA refractory to anti-TNF biologicals: results of a 24-week multicenter randomized placebo-controlled trial", Mashizume et al, Rheumatol Int. 2010 "Tocilizumab, a humanized anti-IL-6 receptor antibody, improved anemia in monkey arthritis by suppressing IL-6 induced hepcidin production").

"Paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a un mamífero que ha sido el objeto de tratamiento, observación o experimento.

"Mamífero" significa animales mamíferos. El mamífero puede ser macho o hembra. El mamífero puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en ser humano, bovino (por ejemplo, vaca), porcino (por ejemplo, cerdo), ovino (por ejemplo, oveja), caprino (por ejemplo, cabras), equino (por ejemplo, caballos), canino (por ejemplo, perros domésticos), felino (por ejemplo, gatos domésticos), Lagomorpha (conejos), roedores (por ejemplo, ratas o ratones), Procyon lotor (por ejemplo, mapaches). En realizaciones particulares, el mamífero es un animal de compañía (por ejemplo, canino, felino o equino).

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa esa cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, un sistema, animal o ser humano que está siendo buscada por un investigador, veterinario, médico u otro facultativo.

El término "tratamiento" o "tratar" incluye aliviar, mejorar, paliar o reducir de otra forma los signos y síntomas asociados con una enfermedad o trastorno.

El término "composición", como en composición farmacéutica, pretende incluir un producto que comprende el(los) principio(s) activo(s), y el(los) ingrediente(s) inerte(s) (excipientes farmacéuticamente aceptables) que componen el vehículo, así como cualquier producto que sea el resultado, directa o indirectamente, de la combinación, formación de complejos o agregación de dos o más ingredientes cualesquiera o de la disociación de uno o más de los ingredientes o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición preparada premezclando un compuesto de fórmula I, y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Isómeros ópticos - Diastereómeros - Isómeros geométricos - Tautómeros

Los compuestos de fórmula I contienen uno o más centros asimétricos y, por tanto, pueden aparecer como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros individuales, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales. Se pretende que la presente invención comprenda todas dichas formas isoméricas de los compuestos de fórmula I, tanto como especies individuales o mezclas de las mismas.

Algunos de los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos y, a menos que se especifique de otro modo, se entiende que incluyen los isómeros geométricos E y Z.

Las realizaciones específicas de la presente invención incluyen un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en los compuestos objeto de los Ejemplos en el presente documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros asimétricos y, por tanto, pueden aparecer como "estereoisómeros" que incluyen racematos y mezclas racémicas, mezclas enantioméricas, enantiómeros individuales, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales. Cada uno de estos centros asimétricos producirá independientemente dos isómeros ópticos, y se pretende que todos los posibles isómeros ópticos y diastereómeros tanto en mezclas como compuestos puros o parcialmente purificados estén incluidos en el ámbito de la presente invención. La presente invención pretende comprender todas esas formas isoméricas de estos compuestos. Cuando los enlaces al carbono quiral se representan gráficamente como líneas rectas en las Fórmulas de la invención, se entiende que ambas configuraciones (R) y (S) del carbono quiral y, por lo tanto, ambos enantiómeros y mezclas de los mismos, están abarcados por la Fórmula. Por ejemplo, la Fórmula I muestra la estructura de la clase de compuestos sin una estereoquímica específica. Cuando los compuestos de la presente invención contienen un centro quiral, el término "estereoisómero" incluye tanto enantiómeros como mezclas de enantiómeros, tal como la mezcla 50:50 específica que se denomina mezcla racémica.

Las mezclas diastereoméricas se pueden separar en sus diastereómeros individuales basándose en sus diferencias físico químicas por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, por cromatografía y/o cristalización fraccionada. Los enantiómeros se pueden separar convirtiendo la mezcla enantiomérica en una mezcla diastereomérica por reacción con un compuesto ópticamente activo apropiado (por ejemplo, un auxiliar quiral, tal como un alcohol quiral o cloruro de ácido de Mosher), separando los diastereómeros y convirtiendo (por ejemplo, mediante hidrólisis) los diastereómeros individuales en los correspondientes enantiómeros puros. También pueden separarse los enantiómeros mediante el uso de una columna de HPLC quiral.

Los centros quirales de la presente invención pueden tener una configuración S o R como se define en las recomendaciones de la IUPAC de 1974. El uso de los términos "sal", "solvato", "éster", "profármaco" y similares, pretende aplicarse igualmente a la sal, solvato, éster y profármaco de enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, isómeros posicionales, racematos o profármacos de los compuestos de la invención.

Sales

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Las sales procedentes de bases inorgánicas incluyen de aluminio, amonio, calcio, cobre, férricas, ferrosas, litio, magnesio, sales mangánicas, manganosas, potasio, sodio, zinc y similares. Las sales procedentes de bases orgánicas no tóxicas, farmacéuticamente aceptables, incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etil-morfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

Cuando el compuesto de la presente invención es básico, se pueden preparar sales a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y orgánicos. Dichos ácidos incluyen ácido acético, bencensulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, ácido p-toluenosulfónico, y similares.

Se entenderá que, a menos que se indique de otra manera, las referencias al compuesto de fórmula I, así como compuestos específicos, se entiende que también incluyen las sales farmacéuticamente aceptables.

Adicionalmente, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de la presente invención pueden existir en forma de polimorfos, y está previsto que todas estas formas queden incluidas en la presente invención. Además, algunos de los compuestos de la presente invención pueden formar solvatos con agua (hidratos) o disolventes orgánicos habituales. Dichos solvatos se incluyen dentro del alcance de esta invención.

Compuestos marcados

En los compuestos de la Fórmula I genérica, los átomos pueden presentar sus abundancias isotópicas naturales, o uno o más de los átomos pueden enriquecerse artificialmente en un isótopo particular que tiene el mismo número atómico, pero una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra predominantemente en la naturaleza. Se entiende que la presente invención incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de los compuestos de Fórmula I genérica. Por ejemplo, las diferentes formas isotópicas de hidrógeno (H) incluyen protio (1H) y deuterio (2H). El protio es el isótopo de hidrógeno predominante que se encuentra en la naturaleza. El enriquecimiento en deuterio puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas, tales como aumento de la semivida in vivo o reducción de los requerimientos de dosificación, o puede proporcionar un compuesto útil como patrón para la caracterización de muestras biológicas. Los compuestos de Fórmula I genérica enriquecidos isotópicamente se pueden preparar sin una experimentación excesiva mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos en los Esquemas y Ejemplos en el presente documento usando reactivos y compuestos intermedios adecuados isotópicamente enriquecidos. Utilidades

El compuesto de fórmula I o sus sales farmacéuticamente aceptables y composiciones farmacéuticas se pueden usar para tratar o prevenir un variedad de afecciones o enfermedades mediadas por las quinasas Janus, especialmente enfermedades o afecciones que se puedan mejorar por la inhibición de una quinasa Janus tal como JAK1, JAK2 o JAK3. Dichas afecciones y enfermedades incluyen, pero sin limitación:

(1) artritis, incluyendo artritis reumatoide, artritis juvenil, y artritis psoriásica; (2) asma y otras enfermedades obstructivas de las vías respiratorias, incluyendo asma crónica, asma tardía, hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis, asma bronquial, asma alérgica, asma intrínseca, asma extrínseca, asma debida al polvo, obstrucción recurrente de las vías respiratorias, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica incluyendo enfisema; (3) enfermedades o trastornos autoinmunitarios, incluyendo los designados como trastornos autoinmunitarios de un único órgano o de un único tipo de célula, por ejemplo, tiroiditis autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria, o anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, colitis ulcerosa y glomerulopática membranosa, las consideradas que implican un trastorno autoinmunitario sistémico, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, síndrome similar a Sjogren, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica, poliarteritis nodosa y pénfigo y enfermedades autoinmunitarias adicionales, que pueden estar basadas en linfocitos B (humorales) o en linfocitos T, incluyendo espondilitis anquilosante, granulomatosis de Wegener, alopecia autoinmunitaria, diabetes de tipo I o de inicio juvenil, y tiroiditis; (4) cánceres o tumores, incluido el cáncer del tracto alimentario/gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de piel incluyendo tumor de mastocitos y carcinoma de células escamosas, cáncer de mama y mamario, cáncer de ovario, cáncer de próstata, linfoma, leucemia, incluida la leucemia mielógena aguda y la leucemia mielógena crónica, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer muscular, cáncer de huesos, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, melanoma incluido el melanoma oral y el melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mielomas incluidos el mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, retinopatía diabética proliferativa, y trastornos asociados a la angiogénesis, incluidos los tumores sólidos; (5) diabetes, incluyendo la diabetes de tipo I y las complicaciones derivadas de la diabetes; (6) enfermedades, trastornos o afecciones oculares incluyendo las enfermedades autoinmunitarias del ojo, queratoconjuntivitis, conjuntivitis primaveral, uveítis y uveítis inducida por lentes, queratitis, queratitis herpética, queratitis de conos, distrofia corneal epitelial, queratoleucoma, pénfigo ocular, escleritis, síndrome similar a Vogt-Koyanagi-Harada, queratoconjuntivitis seca (sequedad del ojo), flictenula, iridociclitis, sarcoidosis, oftalmopatía endocrina, oftalmitis del simpático, conjuntivitis alérgica y neovascularización ocular; (7) inflamaciones intestinales, alergias o afecciones intestinales, incluyendo la enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedades celíacas, proctitis, gastroenteritis eosinófila y mastocitis; (8) enfermedades neurodegenerativas incluyendo enfermedad de las neuronas motoras, síndrome de disfunción cognitiva, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, , isquemia cerebral, o enfermedad neurodegenerativa causada por una lesión traumática, golpe, neurotoxicidad por glutamato o hipoxia; lesión por isquemia/reperfusión en apoplejía, isquemia miocárdica, isquemia renal, ataque cardíaco, hipertrofia cardíaca, ateroesclerosis y arteriesclerosis, hipoxia de órgano y agregación plaquetaria; (9) dermopatías, afecciones o trastornos que incluyen dermatitis atópica, eccema, psoriasis, esclerodermia, prurito y otras afecciones pruríticas; (10) reacciones alérgicas que incluyen anafilaxia, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria alérgica, angioedema, asma alérgica, o reacción alérgica a picaduras de insectos, alimentos, fármacos o polen; (11) rechazo de trasplante, incluyendo rechazo de trasplante de los islotes del páncreas, rechazo de trasplante de médula ósea, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplante de órganos y células tales como la médula ósea, cartílago, córnea, corazón, disco intervertebral, islotes, riñón, miembros, hígado, pulmón, músculo, mioblastos, nervios, páncreas, piel, intestino delgado o tráquea, y xenotrasplantes.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno mediado por JAK que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I. En una realización, dichas enfermedades incluyen asma y artritis reumatoide. En otra realización, la enfermedad es dermatitis atópica.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mediado por JAK.

Intervalos de dosis

La magnitud de una dosis profiláctica o terapéutica de un compuesto de fórmula I, por supuesto, variará con la naturaleza y la gravedad de la afección que se va a tratar y con el compuesto de fórmula I concreto y su ruta de administración. También variará de acuerdo con varios factores que incluyen la edad, el peso, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la respuesta del paciente individual. En general, la dosis diaria es de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal de un mamífero, preferentemente de 0,01 mg a aproximadamente 10 mg por kg. En otra realización, la dosis diaria es de aproximadamente 0,2 mg por kg a aproximadamente 1,0 mg/kg de peso corporal de un mamífero. En otra realización, la dosis diaria es de aproximadamente 0,1 mg por kg a aproximadamente 3,0 mg/kg de peso corporal de un mamífero. Por otro lado, en algunos casos, puede ser necesario usar dosis no comprendidas en dichos límites.

La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales vehículo para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación prevista para la administración por vía oral puede contener de 0,05 mg a 5 g de principio activo, combinado con una cantidad adecuada y conveniente de material vehículo, que puede variar de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 99,95 por ciento de la composición total. Las formas farmacéuticas unitarias generalmente contendrán de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 0,4 g de un principio activo, normalmente 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg o 400 mg.

Composiciones farmacéuticas

Otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula I con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la técnica, los vehículos y excipientes de formulación fisiológicamente aceptables son bien conocidos y están descritos, por ejemplo, en "Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20a Edición, 2000). Todos estos principios, vehículos y excipientes deben ser de manera sustancial farmacéutica o veterinariamente puros, y no tóxicos en las cantidades empleadas y deben ser compatibles con los principios farmacéuticamente activos (es decir, el compuesto de Fórmula l). Para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades, los compuestos, fórmula I, se pueden administrarse por vía oral, por pulverización para inhalación, por vía tópica, parenteral o rectal en formas farmacéuticas unitarias que contienen excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales, adyuvantes y vehículos. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión. Además del tratamiento de animales de sangre caliente como ratones, ratas, caballos, ganado bovino, ovejas, perros, gatos, etc., el compuesto de la invención es eficaz en el tratamiento de seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el principio activo pueden estar en forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, para proporcionar preparaciones sabrosas y farmacéuticamente elegantes. Los comprimidos contienen el principio activo en una premezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden no recubrirse o recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción en el tubo gastrointestinal y proporcionar de esta forma una acción sostenida durante un periodo de tiempo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de acción retardada tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden revestir mediante la técnica descrita en las patentes de Estados Unidos 4.256.108; 4.166.452; y 4.265.874 para formar comprimidos osmóticos terapéuticos para una liberación controlada.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar en forma de cápsulas de gelatina dura donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o en forma de cápsulas de gelatina blanda, en donde los principios activos están mezclados con disolventes solubles en agua tales como propilenglicol, diferentes PEG y etanol, o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen el principio activo en premezcla con excipientes adecuados para fabricar suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes suspensores, por ejemplo, carmelosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietilenado, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado. Las suspensiones acuosas pueden contener también uno o más conservantes, por ejemplo, etilo o n-propilo, phidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa, sacarina o aspartamo.

Pueden formularse suspensiones oleosas suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Para proporcionar una preparación oral de sabor agradable, se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente y agentes aromatizantes. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante, tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo en premezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión se ejemplifican mediante los ya mencionados anteriormente. Excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y colorantes, también pueden estar presentes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar también en forma de una emulsión de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser fosfátidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión oleosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butano diol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. También se pueden usar codisolventes tales como metanol, propilenglicol o polietilenglicoles. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles en forma de un disolvente o un medio de suspensión. Con este fin se puede emplear cualquier aceite suave no volátil, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico, encuentran uso en la preparación de los inyectables.

Los compuestos de fórmula I también se pueden administrar en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco.

Para uso tópico, se emplean cremas, pomadas, geles, soluciones o suspensiones, etc., que contienen el compuesto de fórmula (I). (Para los fines de la presente solicitud, la aplicación tópica incluirá lavados bucales y gargarismos). Las formulaciones tópicas generalmente comprenderán un vehículo farmacéutico, codisolvente, emulsionante, potenciador de la penetración, sistema conservante, y emoliente.

En una realización alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse para administración oftálmica.

Combinaciones con otros fármacos

Para el tratamiento y la prevención de enfermedades mediadas por JAK, el compuesto de fórmula I se puede administrar simultáneamente con otros agentes terapéuticos. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades mediadas por JAK que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I y uno o más agentes terapéuticos adicionales. En particular, para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, EPOC, asma y rinitis alérgica, un compuesto de fórmula I se puede combinar con agentes tales como: (1) inhibidores de TNF-a tales como Remicade® y Enbrel®); (2) inhibidores no selectivos de COX-I/COX-2 (tales como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiónicos tales como naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindaco, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina); (3) inhibidores de COX-2 (tales como meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib y etoricoxib); (4) otros agentes para el tratamiento de la artritis reumatoide que incluyen metotrexato a baja dosis, lefunomida, ciclesonida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u oro parenteral u oral; (5) inhibidor de la síntesis de leucotrieno, un inhibidor de la 5-lipoxigenasa (5-LO) o un antagonista de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) tal como zileutón; (6) antagonista del receptor LTD4, tales como zafirlukast, montelukast y pranlukast; (7) inhibidor de PDE4 tal como roflumilast; (8) antagonistas del receptor antihistamínico H1 tales como cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, astemizol, azelastina y clorfeniramina; (9) agentes simpaticomiméticos vasoconstrictores agonistas del adrenoceptor a l y a2, tales como propilhexedrina, fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefedrina, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, clorhidrato de tetrahidrozolina, clorhidrato de xilometazolina y clorhidrato de etilnorepinefrina; (10) agentes anticolinérgicos tales como bromuro de ipratropio, bromuro de tiotropio, bromuro de oxitropio, bromuro de aclindinio, glicopirrolato, pirenzepina y telenzepina; (11) agonistas del p-adrenoceptor tales como metaproterenol, isoproterenol, isoprenalina, albuterol, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, orciprenalina, bitolterol mesilato, y pirbuterol, o metilxantaninas, incluyendo teofilina y aminofilina, cromoglicato de sodio; (12) mimético del factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-1); (13) glucocorticoides inhalados con efectos secundarios sistémicos reducidos, tales como prednisona, prednisolona, flunisolida, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, budesonida, propionato de fluticasona, ciclesonida y furoato de mometasona.

MÉTODOS DE SÍNTESIS ESQUEMAS Y EJEMPLOS

Las abreviaturas usadas en el presente documento tienen los siguientes significados tabulados. Las abreviaturas no tabuladas a continuación tienen los significados habitualmente utilizados, salvo que se indique otra cosa de forma específica.

Abreviaturas de grupos alquilo

MÉTODOS DE SÍNTESIS

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con los siguientes esquemas generales usando materiales adecuados, y se ilustran adicionalmente por los ejemplos específicos posteriores. Los compuestos ilustrados en los ejemplos no deben interpretarse como que forman el único género que se considera como la invención. Los ejemplos ilustrativos de a continuación, por lo tanto, no están limitados por los compuestos enumerados o por cualquier sustituyente particular empleado con fines ilustrativos. La numeración de los sustituyentes, como se muestra en los esquemas, no se correlaciona necesariamente con la usada en las reivindicaciones y a menudo, por claridad, un único sustituyente se muestra unido al compuesto donde se permiten múltiples sustituyentes según las definiciones de la presente invención anteriormente en el presente documento. Los expertos en la materia comprenderán rápidamente que pueden usarse variaciones conocidas de las condiciones y procesos de los siguientes procedimientos preparativos para preparar estos compuestos. A continuación, se ilustrará la invención en los siguientes ejemplos no limitantes, en los que, a menos que se indique otra cosa:

Todas las reacciones se agitaron (mecánicamente, barrita agitadora/placa agitadora, o por batido) y se llevaron a cabo en una atmósfera inerte de nitrógeno o argón salvo que se indique lo contrario de forma específica.

Todas las temperaturas son grados Celsius (°C) a menos que se indique otra cosa.

La temperatura ambiente es de 15-25 °C.

La mayoría de los compuestos se purificaron mediante HPLC preparativa en fase invertida, MPLC sobre gel de sílice, recristalización y/o enjuague (suspensión en un disolvente seguido de filtración del sólido). El curso de las reacciones fue seguido mediante cromatografía en capa fina (TLC), y/o LCMS y/o RMN y los tiempos de reacción se proporcionan solo como ilustración.

Todos los productos finales se analizaron mediante RMN y LCMS.

Los compuestos intermedios se analizaron por RMN y/o TLC y/o LCMS.

Método 1

MATERIALES COMERCIALMENTE DISPONIBLES/ANTERIORMENTE DESCRITOS

La siguiente tabla enumera fuentes comerciales, y las rutas de síntesis anteriormente divulgadas de los materiales químicos utilizados en la síntesis de los compuestos intermedios, y en los Ejemplos de la presente invención. No se pretende que la lista sea exhaustiva, exclusiva o limitante de ninguna manera.

COMPUESTOS INTERMEDIOS

Los siguientes procedimientos experimentales detallan la preparación de los materiales químicos usados en la síntesis de los Ejemplos de la presente invención. Los procedimientos ejemplificados tienen solamente fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en forma alguna.

A una solución de cianuro de trimetilsililo (28,0 g, 288 mmol) en diclorometano (100 ml) se añadieron secuencialmente tetrahidro-4H-piran-4-ona 1 (24 g, 243 mmol) y triflato de trimetilsililo (1,6 g, 7,2 mmol) a 0 °C. La solución resultante se agitó a 0 °C durante 1 hora antes de la adición de piridina (300 ml) y cloruro de fosforilo (110 g, 719 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante 12 horas y, a continuación, se vertió en una mezcla de solución de ácido clorhídrico acuosa 2 N (600 ml), hielo picado (180 ml) y éter (600 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó vigorosamente durante 15 minutos y, a continuación, se extrajo con éter (3x1 l). Toda la solución orgánica se lavó con salmuera (2x300 ml), se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna rápida con 1-2 % de acetato de etilo en hexano para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 86,62-6,59 (m, 1H), 4,29-4,21 (m, 2H), 3,78 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,34-2,30 (m, 2H).

Compuesto intermedio 5: 3-Amino-1-((3R,4S) o (3S,4R)-4-ciano-tetrahidro-2H-piran-3-M)-1H-pirazol-4-carboxamida

Una mezcla de 3-amino-1H-pirazol-4-carboxamida 4 (804 g, 4.59 mol), 3,6-dihidro-2H-piran-4-carbonitrilo 2 (1.000 g, 9,17 mol) y DBU (2.435 g, 16 mol) en etanol (800 ml) se agitó a 70 °C durante una noche bajo nitrógeno y, a continuación, se concentró al vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna rápida de gel de sílice con 2-5 % de metanol en diclorometano para proporcionar una mezcla racémica del compuesto del título y su enantiómero como un sólido amarillo (269 g, 25 % de rendimiento).

Separación quiral: se disolvieron 380 g del compuesto racémico en ACN/MeOH (1:1) hasta una concentración de 25 mg/ml. Las inyecciones de 16 ml se realizaron en una SFC preparativa Thar 350 (Columna: ChiralPak IC-10 pM, 300x50 mm; Fase móvil: 45 % de 2-propanol, CO2 al 55 %; Caudal: 220 ml/min; Temperatura de la columna: 38 °C). Después de la separación, las fracciones se secaron por evaporación rotatoria. El segundo pico (elución más lenta) se usó para preparar los siguientes compuestos.

1H RMN (500 MHz, DMSO-da) 58,03 (s, 1H), 7,36 (s a, 1H), 6,80 (s a, 1H), 5,36 (s, 2H), 4,86-4,31 (td, J = 10,5, 4,5 Hz, 1H), 3,91-3,88 (dd, J = 11,5, 4,5 Hz, 1H), 3,86-3,83 (m, 1H), 3,53-3,50 (m, 2H), 3,39-3,33 (td, J = 11,5, 2 Hz, 1H), 2,10-2,07 (m, 1H), 1,95-1,87 (m, 1H). LRMS (ESI) calc. para C10H14N5O2 [M+H]+: 236, Encontrado: 236.

Compuesto intermedio 10: 2,6-difluoro-4-hidrazinilpiridina

A un matraz de fondo redondo secado al horno con barrita agitadora magnética bajo una atmósfera de N2 se añadieron 2,4,6-trifluoropiridina 9 (7 g, 52,6 mmol, 1 equiv), THF (52,6 ml, 1 M) e hidrazina (5,1 ml, 105 mmol, 2 equiv). La mezcla de reacción se calentó a 50 °C durante 2 h y después se enfrió a temperatura ambiente. El material en bruto se trituró con agua (2 x 25 ml) y hexanos (25 ml) y, a continuación, se secó en vacío durante una noche. El sólido resultante se recristalizó en EtOAc para producir 2,6-difluoro-4-hidrazinilpiridina 10 (4,5 g, 31 mmol).

1H RMN (500 MHz, DMSO-da) 58,42 (s, 1H), 6,16 (s a, 2H), 4,46 (s, 2H).

Compuestos intermedio 11: 4-bromo-2,6-difluoropiridina

A un matraz de fondo redondo secado al horno con barrita agitadora magnética bajo una atmósfera de N2 se añadieron 2,6-difluoro-4-hidrazinilpiridina 10 (13,24 g, 91 mmol), y cloroformo (97 ml, 0,78 M) seguido de adición gota a gota (por embudo de adición) de bromo (9,40 ml, 182 mmol, 2 equiv) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 6 h y, a continuación, se enfrió hasta la temperatura ambiente y se filtró a través de celite. El filtrado se lavó con Na2CO3 ac. sat (25 ml)., salmuera (25 ml), se secó sobre Na2SO4 y, a continuación, se filtró a través de celite y se concentró en vacío. El 4-bromo-2,6-difluoropiridina 11 (11,8 g, 60,8 mmol) en bruto se usó sin purificación adicional. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,04 (s, 2H).

Compuesto intermedio 8: 4-bromo-2-fluoro-6-metoxipiridina

A un matraz de fondo redondo secado al horno con barrita agitadora magnética bajo una atmósfera de N2 se añadieron 4-bromo-2,6-difluoropiridina 11 (10,8 g, 55,7 mmol), y metanol (111 ml, 0,5 M) seguido de metóxido de sodio (10,83 g ml, 50,1 mmol, 0,9 equiv) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó hasta 40 °C durante 1 h y después se enfrió hasta temperatura ambiente. La suspensión se repartió entre EtOAc (100 ml) y agua (50 ml). Los compuestos orgánicos se lavaron con salmuera (25 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron a través de celite y se concentraron en vacío. El residuo en bruto se purificó usando cromatografía en columna (0-100 % de EtOAc en hexanos, gradiente) para producir 4-bromo-2-fluoro-6-metoxipiridina 8 (7,29 g, 35,4 mmol). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 57,77 (s, 1H), 7,63 (s, 1H), 3,86 (2, 3H).

Ejemplo 1: 1-((3R,4S) o (3S,4fi)-4-cianotetrahidro-2H-piran-3-M)-3-((2-fluoro-6-metoxipiridm-4-N)ammo)-1H-pirazol-4-carboxamida

Un matraz de 3 cuellos de 500 ml se equipó con un condensador de reflujo y J-KEM thermocouple, a continuación, se cargó con 3-amino-1-((3R,4S)-4-cianotetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-4-carboxamida 5 (10,0 g, 42,5 mmol), 4-bromo-2-fluoro-6-metoxipiridina 8 (14,1 g, 63,7 mmol), acetato de potasio (6,26 g, 63,8 mmol) y 2-propanol (150 ml). La mezcla de reacción se roció con gas dinitrógeno durante 20 min, a continuación, se añadieron Pd2(dba)3 (1,95 g, 2,13 mmol) y 2-d/-ferc-butilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenil (2,00 g, 4,71 mmol). A continuación, la mezcla de reacción se calentó hasta 80 °C durante 16,5 h. Después de enfriar hasta 23 °C, se añadió acetona (150 ml) y la mezcla se agitó durante 10 min, a continuación, se filtró a través de celite con elución de acetona. El filtrado se concentró sobre gel de sílice en vacío y se purificó por cromatografía en columna rápida (ISCO 220g cartridge, elución en gradiente con 3-6 % de metanol-diclorometano). Las fracciones que contenían el producto se concentraron para producir 1-((3R,4S) o (3S,4R)-4-cianotetrahidro-2H-piran-3-il)-3-((2-fluoro-6-metoxipiridin-4-il)amino)-1H-pirazol-4-carboxamida como un sólido de color amarillo brillante.

1H RMN (600 MHz, DMSO-d6): 69,63 (s, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,66 (d, 2H), 4,59 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,65 - 3,58 (m, 2H), 3,46 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,94 (m, 1H). LRMS (ESI) calc. para C16H17FN6O3 [M+H]+: 361, Encontrado: 361.

ENSAYOS BIOLÓGICOS

Procedimientos experimentales

Protocolo de ensayo enzimático Jak Biochemical HTRF

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad catalítica de JAK1, JAK2, JAK3, y TYK2 se cuantificó usando un dominio catalítico purificado recombinante marcado con GST para cada enzima (Invitrogen/ Life Technologies/ ThermoFisher, n.° de catálogo: JAK1, N.° M4290; JAK2, N.° M4290; JAK3, N.° M4290; TYK2 N° M4290) en un formato de ensayo bioquímico HTRF. Las reacciones emplearon un sustrato peptídico común, LCB-EQEDEPEGDYFEWLW-NH2 (Merck). El protocolo de ensayo básico es el siguiente: En primer lugar, 50 nl de compuestos diluidos en DMSO se dispensaron a los pocillos de una placa de ensayo seca de 384 pocillos (Perkin Elmer Opti-plate, n.° de catálogo 6007290) usando un dispensador acústico Labcyte Echo 555. Las posteriores adiciones de reactivo emplearon un sistema automático de manejo de líquidos Agilent Bravo. Después, 18 pl de 1,11X enzima, añadido a la menor concentración posible para obtener un control de fondo 10 veces por encima que mantenía la reacción a la velocidad inicial durante el trascurso de la reacción (véase, la tabla de a continuación) y se añadieron 1,11X sustrato en el tampón de ensayo IX (tampón de quinasa de Invitrogen N.° PV3189, DTT 2 mM, 0,05 % de BSA) a los pocillos, se agitaron y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para dejar que el compuesto se uniera y alcanzara el equilibrio. Después de esta etapa, se añadieron 2 pl de 10X ATP en tampón de ensayo IX para iniciar la reacción de la quinasa, manteniendo la concentración de ATP a una concentración igual a la Km aparente calculada para cada preparación enzimática (véase la tabla de a continuación) y las placas se agitaron y, a continuación, se incubaron a 23 °C durante 80 minutos. Al final de la incubación, se añadió 20 pl de 2X tampón de detención (estreptavidina-Dylight 650 (ThermoFisher n.° 84547B/100 ml), anticuerpo pY20 marcado con Europio (Perkin Elmer N.° AD0067), EDTA, HEPES, y Triton) para parar rápidamente la reacción. Las placas se agitaron y se centrifugaron y, a continuación, se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se leyeron en un Perkin Elmer Envision (Aex = 337 nm, Aem = 665 y 615 nm, tiempo de retardo de TRF = 20 us). Señal HTRF = 10.000 * lectura a 665 nm / lectura a 615 nm. Después de la normalización respecto a los controles sin tratar, se calculó el porcentaje de inhibición de la señal HTRF para cada concentración de compuesto. La representación gráfica del porcentaje de inhibición frente al log del valor de la concentración del compuesto se hizo como se ha descrito anteriormente para los ensayos celulares para calcular los valores de CI50. Las condiciones de reacción finales fueron:

Enzima [E] (nM) [péptido] (pM) [ATP] (pM) [Eu-pY20] (nM) [SA-Dylight] (nM)

JAK1 1,0 0,75 30,1 9 312,5

JAK2 0,0075 0,75 7,0 9 312,5

JAK3 0,015 0,75 1,7 9 312,5

Tyk2 2,0 0,75 9,3 9 312,5

Las concentraciones del compuesto fueron 1496, 499, 175, 49,9, 18,7, 6,2, 2,1, 0,75, 0,24, 0,075, y 0,0125 nM. La [DMSO] final se ajustó al 0,25 %.

Rendimiento del ensayo y datos del control de calidad:

Se hizo un seguimiento del rendimiento de los ensayos enzimáticos calculando los valores del índice significante mínimo (MRS) a través de ensayos que se realizan para todas las moléculas de referencia de JAK y selectivas:

Ensayos de interacción de JAK con la ruta celular:

La inhibición de la actividad de las quinasas JAK1 y JAK2 en células intactas se cuantificó en modo antagonista usando tecnología de indicador transcripcional CellSensor® (Life Technologies/ ThermoFisher: https://www.thermofisher. com/us/en/home/industrial/pharma-biopharma/drug-discovery-development/target-andlead-identification-and-validation/pathway-biology/cellular-pathway-analysis/cellsensor-cell-lines.html), en dos líneas celulares independientes modificadas por ingeniería genética para detectar la señalización de IL4, IL6 y de EPO. En resumen, las líneas celulares CellSensor® (véase los detalles de más adelante para cada ensayo) que llevaban gen indicador de p-Lactamasa establemente integrado bajo control de los elementos STAT cis-reguladores específicos sensibles a la ruta que se está monitorizando se trataron previamente con los compuestos de ensayo diluidos en serie en DMSO (véase la sección de preparación y dosificación de compuestos y la sección de citoquinas agonistas). Tras la incubación con compuestos, se añadieron IL6 o EPO a cada línea celular cognado a una concentración igual a una dosis necesaria para alcanzar el 80 % de la repuesta máxima (CE80). Después de la estimulación con citocinas, se detectaron los niveles celulares de la actividad de la p-Lactamasa in situ usando el kit de carga LiveBLAzer™ (sustrato LiveBLAzer™-FRET B/G, CCF4-AM de Life Technologies), en donde la fluorescencia del sustrato (que emite fluorescencia a 405 nm) y el producto escindido (que emite fluorescencia a 488 nm) se cuantificó en el lector Acumen Explorer ex3 (TTP Labtech). Los valores de fluorescencia normalizados que informan del porcentaje de inhibición de los pocillos tratados con los compuestos de prueba se representaron en una gráfica en función del Log del valor de la concentración de cada una de diez dosis seleccionadas para construir una curva dosis-respuesta (DRC) usando una ecuación de respuesta a la dosis adecuada de 4 parámetros para calcular la concentración necesaria para conseguir el 50 % de inhibición de la actividad máxima (CI50, o valor de potencia) en el programa informático Assay Data Analyzer (Merck Frosst Canada & Co - 2003). El porcentaje de inhibición se calculó en función de los niveles de beta lactamasa medidos en los pocillos tratados control con DMSO, 0 % de inhibición, frente a los niveles de p -Lactamasa en pocillos tratados con una dosis de un inhibidor pan-JAK suficiente para conseguir el 100 % de bloqueo de la producción de p -Lactamasa. La incubación con compuestos, citoquinas y LiveBLAzer™ se llevó a cabo a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejido mantenida a 90 % de humedad y CO2 al 5 %.

Los emparejamientos de agonista y línea celular para cuantificar la inhibición funcional de las rutas reguladas por JAK fueron los siguientes:

Ruta de interleuquina 6 (IL6) - JAK1IJAK2 - STAT4: Células CellSensor™ SIE-bla ME-180 que llevan un gen indicador de p -Lactamasa establemente integrado bajo control del elemento inducible por Sis (SIE).

Ruta de eritropoyetina (EPO) - JAK2 - STAT5: Células CellSensor irfl-bla TF-1 llevan un gen indicador de p -Lactamasa establemente integrado bajo control de los elementos de respuesta a STAT5 en el promotor del gen del factor regulador de interferón (IRF1).

Preparación y dosificación de compuestos y citoquinas: Se diluyeron en serie 1:3 diez veces en DMSO soluciones madre del compuesto madre 10 mM preparadas en DMSO, usando un sistema automático de manejo de líquido Tecan Freedom EVO-2200 en microplaca de polipropileno de 384 pocillos Echo Qualified (384PP), fondo plano, claro (Labcyte, N.° Ca P-05525). Se dispensaron sesenta nl de cada dosis de compuesto usando un dispensador acústico ECHO 550 (Labcyte) en microplacas tratadas de poliestireno TC negro de fondo claro y plano de 384 pocillos (Corning N.° Cat. 3712). Cada línea celular CellSensor® posteriormente se sembró en placa según las instrucciones del proveedor (30.000 células en 32 ul/pocillo) y se mezcló con el compuesto. Tras una incubación de 60 minutos, posteriormente, las células se estimularon mediante la adición de 8 pl de citoquina cognada (dosis CE80 de IL6 y EPO) y se incubaron durante unas 3 horas adicionales, antes de añadir el sustrato LiveBLAzer™-FRET B/G. Las dosis finales del compuesto ensayadas fueron: 14977; 4992; 1664; 554; 184; 61,6; 20,5; 6,8; 2,3 y 0,76 nM. La concentración de DMs O final se mantuvo al 0,15 %.

Rendimiento del ensayo y datos del control de calidad: Se usaron tres parámetros para validar la calidad de cada realización de ensayo individual para asegurar el desarrollo de amplia relación de la actividad estructural (SAR) que permitió discernir las diferencias entre los compuestos cuya potencia variaba en 3-4 veces menos:

(A) Para verificar que esa estimulación con citoquina estaba dentro del aceptable /- 5 % de la dosis necesaria para conseguir el 80 % de estimulación, CE80, se incluyó una curva de dosis-respuesta (DCR) del agonista de 16 puntos en cada placa y esta DCR se usó para calcular de nuevo el nivel de estimulación alcanzado a través de la placa. Las dosis superiores de las DCR fueron: 500 ng/ml para IL6 y 100 ng/ml para EPO.

(B) Se incluyeron DCR para dos compuestos de referencia en cada placa de ensayo que contenía un total de 32 compuestos por placa:

Compuesto de referencia N.° A, una molécula selectiva JAK1, doce veces más potente en el ensayo de IL6 CellSensor: CI50 = 51,9 /- 23,6 nM, N = 627 durante el ensayo de EPO CellSensor: CI50 = 623,5 /-132,3 nM, N = 617. La actividad en el ensayo de IL4 CellSensor fue: CI50 = 25,7 /-8,4 nM, N = 307 Compuesto de referencia N.° B, un inhibidor pan-JAK, que presentó potencia en dos a tres veces a través de ambos ensayos. Ensayo de IL6/JAK1-JAK2: CI50 = 21 /-9,1 nM, N = 652 durante el ensayo de EPO/JAK2: CI50 = 39,5 /- 12,4 nM, N = 626

(C) La reproducibilidad del ensayo a través de placas replicadas y las realizaciones independientes se monitorizaron calculando el índice significante mínimo (MSR, véase Eastwood et al., Journal of Biomolecular Screening 11(X); 2006) haciendo un seguimiento de los valores de potencia de CI50 para ambos compuestos de referencia.

DATOS BIOLÓGICOS

Los ejemplos de la presente invención se evaluaron en los ensayos de unión de JAK1, JAK2 y JAK3 in vitro y los ensayos de interacción con la ruta celular de IL-6 y EPO, como se ha descrito anteriormente. La Tabla 1 tabula los valores de CI50 de la presente invención en los ensayos de unión de JAK1, JAK2 y JAK3 in vitro y los ensayos de interacción con la ruta celular de IL-6 y EPO, así como la razón de las CI50 de JAK2/JAK1, las CI50 de JAK3/JAK1 y las CI 50 de EPO/IL-6. La Tabla 2 tabula los parámetros farmacocinéticos de la presente invención en el perro después de la administración IV. La Tabla 3 muestra los datos comparables para otros compuestos JAK1.

 Tabla 2

Ejemplos comparativos

Tabla 3

continuación

Estudio de seguridad para el Compuesto 1.

Se llevó a cabo un estudio de seguridad de animal objetivo piloto de 6 semanas para el Compuesto 1. El fármaco se administró por vía oral, como comprimido, dos por día durante 6 semanas a perros a 1, 3 y 5 veces la dosis de exposición máxima de 0,5 mg/kg o una vez por día durante 6 semanas a perros a 5 veces la dosis de exposición máxima de 1 mg/kg. No se observaron efectos relacionados con el artículo a prueba en las observaciones clínicas, observaciones fecales, el peso corporal, cambio de peso corporal, consumo de comida, los parámetros del examen físico, presión arterial, oftalmología o cardiología. No se observaron efectos relacionados con el artículo a prueba en las evaluaciones postmortem, incluyendo los pesos de los órganos y los hallazgos macroscópicos y microscópicos. Basándose en los hallazgos de este estudio, el nivel sin efecto adverso observado (NOAEL) es de 5,0 mg/kg/día como una dosis de una vez al día o 2,5 mg/kg BID. Se plateó la hipótesis de que la selectividad a JAK-1 del Compuesto 1 proporciona un mayor margen de seguridad en comparación con un compuesto menos selectivo tal como oclacitinib (Apoquel®). Estos datos del estudio de seguridad animal objetivo piloto proporcionan evidencias para esta hipótesis, y sugiere que el Compuesto 1 puede tratar eficazmente la dermatitis atópica canina con un margen mejorado de seguridad.

Compuesto 1 en el modelo de picor inducido por IL-31

Como una medida de la inhibición in vivo de JAK-1, y mediante la extensión de la eficacia clínica anticipada del Compuesto 1, se evaluó el Compuesto 1 en un modelo farmacodinámico relevante y se incluyó una referencia clínica. Se ha demostrado que la interleuquina canina-31 (cIL-31) está implicada en el prurito asociado a la dermatitis atópica y alérgica en perros [Gonzales et al., Vet Dermatol 2013; 24: 48-e12 ], e IL-31 puede activar las moléculas de señalización de JAK-1 y JAK-2 después de unirse a su complejo receptor [Zhang et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 19 (2008) 347-356]. La administración de cIL-31 a perros Beagle produce una respuesta prurítica fuerte que se puede inhibir por tratamiento anterior con el inhibidor de JAK oclacitinib [Gonzales et al., Vet Dermatol 2016; 27: 34-e10]. Usando un diseño de estudio cruzado, no enmascarado, aleatorizado, se administró el Compuesto 1 (1 mg/kg de peso corporal), Apoquel® o el placebo a perros Beagle de laboratorio 2 h antes de una exposición a cIL-31 (Tmáx aproximado del Compuesto 1 y Apoquel®). Los perros se observaron durante 2 h después de la exposición a cIL-31, y se registró el tiempo en el que los animales presentaban comportamientos pruríticos. En este estudio, el Compuesto 1 significativamente suprimió el prurito inducido por cIL-31; la magnitud fue similar a Apoquel. En un segundo estudio usando un diseño cruzado, no enmascarado, aleatorizado, se evaluaron varias dosis del Compuesto 1 (0,5, 0,1 y 0,05 mg/kg de peso corporal); También se incluyeron los tratamientos con Apoquel® y placebo. El compuesto 1 suprimió significativamente el prurito a la dosis de 0,5 mg/kg de peso corporal, pero no a las dosis de 0,1 y 0,5 mg/kg de peso corporal. La magnitud del efecto fue similar entre 0,5 mg/kg de Compuesto 1 y Apoquel®. Véanse las Figuras 1A y 1B.

Bibliografía

Zhang Q., P. Putheti, Q. Zhou, Q. Liu, W. Gao. Structures and biological functions of IL-31 and IL-31 receptors. Cytokine & growth factor reviews 19 (2008) 347-356.

Gonzales, A., W.R. Humphrey, J.E. Messamore, T.J. Fleck, G.J. Fici, J.A. Shelly, J.F. Teel, G.F. Bammert, S.A. Dunham, TE. Fuller y R.B. McCall. Interleukin-31: its role in canine pruritus and naturally occurring canine atopic dermatitis. Vet Dermatol 2013; 24: 48-e12.

Gonzales, A, T.J. Fleck, W.R. Humphrey, B. A. Galvan, M.M. Aleo, S.P. Mahabir, J.-K. Tena, K.G. Greenwood y R.B. McCall. IL-31-induced pruritus in dogs: a novel experimental model to evaluate nti-pruritic effects of canine therapeutics. Vet Dermatol 2016; 27: 34-e10.

Evaluación clínica: El compuesto se está evaluando en un estudio demostrativo preliminar enmascarado y aleatorizado en perros con un diagnóstico de dermatitis atópica. El objetivo de este estudio es evaluar la eficacia y la tolerabilidad del compuesto frente a la dermatitis atópica en perros de propiedad del cliente. El compuesto se administra a dos dosis y se compara con un control placebo. Los perros se dosifican por vía oral dos veces al día durante hasta 14 días seguido de una vez al día durante hasta 28 días, y se evalúan los pruritos y las lesiones de la piel usando la escala análoga visual de prurito (PVAS) y las herramientas de puntuación del índice de extensión y gravedad de la dermatitis atópica canina (CADESI-4), respectivamente.

El CADESI-4 es una escala de gravedad para clasificar las lesiones de la piel en ensayos clínicos para el tratamiento de perros con dermatitis atópica (AD). Los tipos de lesión (eritema, liquenificación y alopecia/excoriación) se puntúan de 0 a 3 en cada uno de los 20 sitios corporales, para una puntuación máxima de 180, con puntos de referencia propuestos para lesiones de la piel de AD leve, moderadas y graves de 10, 35 y 60, respectivamente. La PVAS es una escala análoga visual que contiene características de tanto la gravedad del picor como de los comportamientos asociados a picor. Comúnmente usados para determinar la gravedad de los pruritos en ensayos clínicos para el tratamiento de perros con AD.

CADESI-4: Thierry, O., Manolis, S., Nuttall, T., Bensignor, E., Griffin, C., Hill, P., for the International Committee on Allergic Diseases of Animals (ICADA). Validation of the Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index (CADESI)- 4, a simplified severity scale for assessing skin lesions of atopic dermatitis in dogs. Vet, Dermatol. 25:77-e25, 2014

PVAS: Hill, P.B., Lau, P., y Rybnicek, J. Development of an owner-assessed scale to measure the severity of pruritus in dogs. Vet. Dermatol. 18:301-308, 2007.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula I o una sal o un estereoisómero farmacéuticamente aceptables del mismo:

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es

3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o una sal o un estereoisómero del mismo farmacéuticamente aceptables, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por JAK-1 en un mamífero que lo necesita.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la enfermedad mediada por JAK-1 es una que puede mejorase mediante la inhibición selectiva de una quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK 2 y JAK 3.

6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en dermatitis alérgica, dermatitis atópica, artritis, queratoconjuntivitis seca, enfermedades o trastornos autoinmunitarios y cáncer.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad es dermatitis atópica.

8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en donde el mamífero es un mamífero animal de compañía.

9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 en donde el animal de compañía es un perro, un gato o un caballo.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en donde la administración es por vía oral, parenteral o tópica.

11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde la inhibición selectiva es de quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK2.

12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde la inhibición selectiva es de quinasa Janus JAK1 con respecto a JAK3.

13. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la razón de JAK2(CI50)/^jA^k 1(CI50) es de al menos 5, al menos 10, al menos 12.

14. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-13, en donde la dosis diaria del compuesto es de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg o de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg o de 0,1 mg/kg a 3,0 mg/kg o de 0,2 mg/kg a 1,0 mg/kg de peso corporal.

15. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la razón de JAK3(CI5^o)/JAK1(CI5^o) es de al menos 1.000 o de al menos 750 o de al menos 500.