ES2923784T3 - Regulador del crecimiento de las plantas de alta resistencia al estrés y procedimiento de preparación y uso del mismo - Google Patents

Regulador del crecimiento de las plantas de alta resistencia al estrés y procedimiento de preparación y uso del mismo Download PDF

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Abstract

Se describen un regulador del crecimiento de plantas resistente a un alto estrés y una preparación y uso del mismo. En particular, el compuesto proporcionado por la presente invención es un sustituto de ABA para mejorar significativamente la resistencia al estrés de las plantas y, por lo tanto, tiene una perspectiva de aplicación muy amplia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Regulador del crecimiento de las plantas de alta resistencia al estrés y procedimiento de preparación y uso del mismo
Campo técnico
La presente invención se relaciona con el campo de la botánica, en particular con el regulador de crecimiento de plantas de alta resistencia al estrés y con la preparación y uso del mismo.
Técnica antecedente
El ácido abscísico (ABA) es un factor clave que equilibra las hormonas endógenas de las plantas y el metabolismo de las sustancias activas relacionadas con el crecimiento, que tiene la capacidad de promover que las plantas absorban agua y fertilizantes en equilibrio y coordinar el metabolismo in vivo, puede regular eficazmente la raíz/corona de las plantas, y el crecimiento vegetativo y el crecimiento reproductivo en las plantas, y desempeña un papel importante en la mejora de la calidad y el rendimiento de los cultivos. A través de la aplicación de ABA, hay un importante efecto de actividad fisiológica y valor de aplicación en la mejora de la calidad de los productos agrícolas y muchos otros aspectos. Además, el ABA exógeno puede provocar el cierre rápido de los estomas de las hojas y la inhibición de la transpiración, lo que puede utilizarse para la preservación de la flor, o para evitar el marchitamiento durante el proceso de transporte del cultivo del trasplante de plántulas. El ABA también puede controlar la diferenciación de las yemas florales, regular la fase de floración, lo que posee un gran valor de aplicación en los aspectos de la flor y la jardinería.
El ABA puede mejorar el crecimiento de los cultivos en condiciones de baja temperatura, sequía, frío primaveral, sal y otros entornos de crecimiento no deseados. Por lo tanto, el ABA se utiliza ampliamente en el césped, las tierras de labranza y los jardines, especialmente en las zonas con escasez de agua, como la región occidental, lo que es de gran importancia para el desarrollo de la industria agrícola de China.
Sin embargo, el (+)-ABA activo natural es inestable y difícil de sintetizar, lo que se traduce en un elevado coste de producción. Por lo tanto, el ABA no se ha utilizado ampliamente para la producción agrícola, mientras que científicos de todo el mundo están desarrollando alternativas al ABA natural.
El documento WO 2016/022915 A1 divulga derivados de sulfonamida, procesos e intermedios para prepararlos, composiciones reguladoras del crecimiento vegetal que los comprenden y procedimientos para utilizarlos para controlar el crecimiento de las plantas, mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico y/o inhibir la germinación de las semillas.
El documento WO 2014/210555 A1 divulga compuestos agonistas que activan los receptores ABA y formulaciones agrícolas que comprenden los compuestos agonistas.
El documento WO 2015/155154 A1 se refiere al uso de sulfonamidas de oxo tetrahidroquinolina sustituidas o sales de las mismas para aumentar la tolerancia al estrés de las plantas con respecto al estrés abiótico y/o para aumentar el rendimiento de la planta.
El documento CN 104 363 760 A divulga compuestos agonistas que activan los receptores ABA, y formulaciones agrícolas que comprenden los compuestos agonistas.
El documento CN 104170823 A divulga un pequeño compuesto molecular para mejorar la resistencia de las plantas al estrés.
Hasta ahora, aunque se han desarrollado algunas alternativas al ABA, la actividad de estas alternativas es insatisfactoria, cuyo valor de aplicación en la producción agrícola es bajo. Además, algunas alternativas son menos respetuosas con el medio ambiente.
Por lo tanto, existe una necesidad urgente en el arte de desarrollar compuestos que sean respetuosos con el medio ambiente y que puedan aumentar eficazmente la resistencia de las plantas al estrés.
Sumario de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar compuestos que sean respetuosos con el medio ambiente y que puedan aumentar eficazmente la resistencia al estrés de las plantas, así como la preparación y los usos de los mismos.
La invención se define en las reivindicaciones. Los aspectos que no están comprendidos en el ámbito de las reivindicaciones se divulgan y son meramente informativos.
En el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato del mismo,
Figure imgf000003_0001
en el que,
Ri es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo Ci-C3;
R2 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R3 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R4 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R5 es halógeno, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, SF5 o cicloalquilo C3-C8;
R6 es alquilo C1-C7 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C7 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C7 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, o -Ra-O-Rb sustituido o no sustituido, en el que Ra es alquileno C1-C2 y Rb es H, alquilo C1-C3; y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, - CN, -N(Rb)2 y nitro;
R7 se selecciona del grupo que consiste en: H, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C10 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -ORb, -CN y -N(Rb)2; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido; donde el heterociclilo contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, -CN, -N(Rb)2 , y nitro;
R8, R9, R1o se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C8, cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido; donde "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, -CN, -N(Rb)2, y nitro;
R11 es H, alquilo C1-C3, o haloalquilo C1-C3;
X es NR13, O, o S, donde R13 no es ninguno o se selecciona del grupo que consiste en: H, halógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3, haloalquilo C1-C3y una combinación de los mismos;
m=1 o 2;
" ^ r - " representa un enlace simple o un enlace doble. X siendo CR12, en el que R12 se selecciona del grupo que consiste en: H, halógeno, alquilo Ci-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3, haloalquilo Ci-C3, y una combinación de los mismos, siempre que, cuando X sea CR12, sea un doble enlace también se divulga en el presente documento pero no está cubierto por la invención reivindicada.
En otra realización preferida, R6 es alquilo C1-C7 , alquenilo C2-C7, alquinilo C2-C7, cicloalquilo C3-C7, o -Ra-O-Rb, donde Ra es alquileno C1-C2 y Rb es H, alquilo C1-C3.
En otra realización preferida, R7 se selecciona del grupo que consiste en: alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquino C2-C6 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C10 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -ORb, -CN y -N(Rb)2; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido; donde el heterociclilo contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, -CN, -N(Rb)2, y nitro.
En otra realización preferida, R7 es H.
En otra realización preferida, cuando X es CRi2, R8, R9, R10 no son H al mismo tiempo.
En otra realización preferida, cuando X es CR12, R8, R9, R10 son H al mismo tiempo.
En otra realización preferida, cuando R13 no es ninguno, es un doble enlace y m=1.
En otra realización preferida, cuando R13 se selecciona del grupo que consiste en: H, halógeno, alquilo C 1-C 3 , alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3, haloalquilo C 1-C 3 y una combinación de los mismos, es un enlace simple y m=1 o 2. En otra realización preferida, cuando X es O o S, es un enlace simple.
En otra realización preferida, el halógeno comprende F, Cl, Br o I.
En otra realización preferida, el halógeno es F.
En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de fórmula Ia:
Figure imgf000004_0001
donde las definiciones de R1-R10, y m se describen como arriba.
En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de fórmula Ib:
Figure imgf000004_0002
donde las definiciones de R1-R10, R13, m, y se describen como arriba. En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de fórmula Ic:
Figure imgf000005_0001
donde las definiciones de R1-R10, y m se describen como arriba.
En otra realización divulgada no cubierta por la invención reivindicada, el compuesto tiene una estructura de fórmula
Figure imgf000005_0002
donde las definiciones de R1-R10, R12, y m se describen como arriba.
En otra realización preferida, todos los R1, R2, R3 y R4 son H.
En otra realización preferida, 1,2, 3 o 4 de R1, R2, R3 y R4 son halógenos.
En otra realización preferida, el halógeno comprende F, Cl, Br o I.
En otra realización preferida, el halógeno es F.
En otra realización preferida, 4 de R1, R2, R3 y R4 son F.
En otra realización preferida, R5 es alquilo C1-C3 , haloalquilo C1-C3 , SF5 o cicloalquilo C3-C6.
En otra realización preferida, R5 es metilo o ciclopropilo.
En otra realización preferida, R6 es un alquilo C1-C5 sustituido o no sustituido, un alquenilo C2-C5 sustituido o no sustituido, un alquino C2-C5 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo C3-C5 sustituido o no sustituido, o un -Ra-O-Rb sustituido o no sustituido, en el que Ra es alquileno C1-C2 y Rb es H, o alquilo C1-C3; y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, -CN, -N(Rb)2 , o nitro.
En otra realización preferida, R6 es n-propilo, etilo, isopropilo, isobutilo o fluoro n-propilo.
En otra realización preferida, R6 es alquilo C3, alquenilo C3 o alquinilo C3 .
En otra realización preferida, R6 es n-propilo.
En otra realización preferida, R7 se selecciona del grupo que consiste en: H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C8 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -OH, -CN y -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; en el que el heterociclilo contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, -CN, -NH2, y nitro; y R8, R9, R10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C6, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, - CN, -NH2 , y nitro.
En otra realización preferida, R7 se selecciona del grupo que consiste en: H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C8 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -OH, -CN y -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde el heterociclilo contiene 1 heteroátomo seleccionado entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, -CN, -NH2 y nitro; y R8, R9 , R10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C6, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, - CN, -NH2 , y nitro.
En otra realización preferida, R7 se selecciona del grupo que consiste en: alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C4 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C8 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -OH, -CN y -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; en el que el heterociclilo contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados de entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, -CN, -NH2, y nitro; y R8, R9, R10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C6, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, - CN, -NH2 , y nitro.
En otra realización preferida, R7 se selecciona del grupo que consiste en: alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C4 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C4 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C8 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -OH, -CN y -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde el heterociclilo contiene 1 heteroátomo seleccionado entre N, O, S, y "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, -CN, -NH2 y nitro; y R8, R9 , R10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C6, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2 ; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido; donde "sustituido" significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OH, - CN, -NH2 , y nitro.
En otra realización preferida, R7, R8, R9 y R10 son los grupos específicos correspondientes a cada compuesto específico en los Ejemplos de esta solicitud.
En otra realización preferida, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0002
El compuesto
Figure imgf000009_0001
se divulga en el presente documento pero no está cubierto por la invención reivindicada.
En otra realización preferida, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000010_0001
En el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención para la preparación de una formulación agrícola o una composición, que se utiliza para (i) la mejora de la resistencia de la planta al estrés; (ii) la preparación de un agonista para el receptor de ABA; y/o (iii) la preparación de un inhibidor para la germinación de la semilla.
En otra realización preferida, el agonista promueve la interacción de la proteína PYL del receptor ABA con la proteína fosfatasa PP2C.
En otra realización preferida, la formulación agrícola o la composición se utiliza para uno o más de los siguientes usos:
(i) promover la interacción de la proteína PYL del receptor del ABA con la proteína fosfatasa PP2C;
(ii) reducir la transpiración de las hojas;
(iii) inhibir la germinación de las semillas.
En otra realización preferida, la resistencia al estrés es una resistencia al estrés abiótico relacionada con el ABA. En otra realización preferida, la resistencia al estrés se selecciona del grupo que consiste en: una resistencia a la sequía, una tolerancia al frío, una tolerancia a la sal, una resistencia a la presión osmótica, una resistencia al calor y una combinación de ellas.
En otra realización preferida, la planta es una planta que contiene receptor(es) ABA de la familia PYR / PYL.
En otra realización preferida, la planta comprende un musgo, un helecho, una gimnosperma, una monocotiledónea y una dicotiledónea.
En otra realización preferida, la planta comprende una planta agrícola, una planta hortícola y una planta forestal. En otra realización preferida, la planta comprende una planta leñosa y una hierba.
En otra realización preferida, la planta comprende una planta completa, un órgano (tal como una raíz, un tallo, una hoja, una rama, una flor, un fruto o una semilla), un tejido (tal como un callo) o una célula.
En otra realización preferida, la planta se selecciona del grupo que consiste en: Poaceae, Asteraceae, Liliaceae, Cruciferae, Rosaceae, Leguminosae, Theaceae, Sterculiaceae, Pinaceae, Juglandaceae, Piperaceae, Magnoliaceae, Ericaceae, Actinidiaceae, Vitaceae, Begoniaceae, Bromeliaceae, Ginkgoaceae, Illiciaceae, Zingiberaceae, Punicaceae, Apocynaceae, Berberidaceae, Rutaceae, Solanaceae, Cupressaceae, Aquifoliaceae, Palmae, y una combinación de ellas.
En otra realización preferida, la planta se selecciona del grupo que consiste en : Arabidopsis, tabaco, algodón, lechuga, arroz, trigo, maíz, cacahuete, sorgo, avena, centeno, caña de azúcar, soja, patata, trigo sarraceno, pimiento, uva, pera, manzana, plátano, ginseng, tomate, cayena, berenjena, coliflor, col china, colza, pepino, sandía, cebolla, girasol, lirio, rosa, crisantemo, peonía, clavel, alcanforero, parasol chino, pino y una combinación de ellos.
En el tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación agrícola que comprende:
(i) un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo según el primer aspecto de la presente invención; y
(ii) un portador agrícola aceptable.
En otra realización preferida, en la formulación agrícola, el contenido del componente (i) es de 0,1-1000 pM, preferentemente 1-200 pM, más preferentemente 5-100 pM.
En otra realización preferida, la formulación agrícola contiene 0,0001-99 % en peso, preferentemente 0,1-90 % en peso del componente (i), basado en el peso total de la formulación agrícola.
En otra realización preferida, la formulación agrícola comprende además un agente adicional resistente a la sequía (tal como un agente de cubrimiento de semillas resistente a la sequía, un agente de retención de humedad resistente a la sequía o un agente de aspersión resistente a la sequía) u otros ingredientes activos agrícolas.
En otra realización preferida, el ingrediente activo agrícola se selecciona del grupo que consiste en: fungicidas, herbicidas, pesticidas, nematicidas, insecticidas, activadores de plantas, sinergistas, reguladores del crecimiento de las plantas y acaricidas.
En otra realización preferida, la formulación agrícola comprende además un tensioactivo (tal como un tensioactivo catiónico, un tensioactivo aniónico, un tensioactivo anfotérico o un tensioactivo no iónico).
En otra realización preferida, la forma de dosificación de la formulación agrícola se selecciona del grupo que consiste en: soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, agentes espumantes, pastas, gránulos, aerosoles y una combinación de los mismos.
En el cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para mejorar la resistencia al estrés de las plantas, administrando a una planta un compuesto de fórmula I, o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo según el primer aspecto de la presente invención o una formulación agrícola según el tercer aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida, la administración se selecciona del grupo que consiste en: asperjar o irrigar.
En otra realización preferida, la dosificación a administrar es de 2-100 g / hectárea, preferentemente 4-80 g / hectárea, más preferentemente 6-60 g / hectárea.
En otra realización preferida, la dosificación a administrar es de 1-5000 pg / planta, preferentemente de 10-2500 pg / planta, más preferentemente de 20-1000 pg / planta.
En el quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo, que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula I-A con un compuesto de fórmula I-S2 en un disolvente inerte, formando así un compuesto de fórmula I
Figure imgf000011_0001
En cada fórmula, Ri, R2, R3 , R4, Rs, R6, R7, Rs, R9 , R10, R11, m, X, se definen como en el primer aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida, el disolvente inerte se selecciona del grupo que consiste en: N, N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), acetonitrilo (ACN) y una combinación de ellos.
En otra realización preferida, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente aglutinante de ácidos.
En otra realización preferida, el agente aglutinante de ácidos se selecciona del grupo que consiste en: carbonato de potasio (K2CO3), trietilamina (Et3N), piridina (Py), y una combinación de los mismos.
En otra realización preferida, en el paso (a), la temperatura de reacción es de 0-150 °C (o temperatura de reflujo), preferentemente 10-60 °C, más preferentemente 20-40 °C.
En otra realización preferida, en el paso (a), el tiempo de reacción es de 0,1-72 horas, más preferentemente 1-24 horas, más preferentemente 8-20 horas, más preferentemente 4-12 horas.
En otra realización preferida, en la fórmula l-A, X es O, y es un enlace simple.
En otra realización preferida, el compuesto I-S2 se prepara por el siguiente procedimiento:
(i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula I-SS1 con tiourea en un disolvente inerte, formando así un compuesto de fórmula I-S2
Figure imgf000012_0001
en cada fórmula, Ri, R2, R3, R4 y R5 se definen como en el primer aspecto de la presente invención, X2 es un grupo saliente (tal como Cl, Br o I).
En otra realización preferida, el disolvente inerte se selecciona del grupo que consiste en: etanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano y una combinación de los mismos.
En otra realización preferida, la reacción se lleva a cabo en presencia de ácido.
En otra realización preferida, el ácido se selecciona del grupo que consiste en: ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y una combinación de los mismos.
En otra realización preferida, en el paso (i), la temperatura de reacción es de 0-150 °C (o temperatura de reflujo), preferentemente 10-50 °C, más preferentemente 15-25 °C.
En otra realización preferida, en el paso (i), el tiempo de reacción es de 0,1-72 horas, más preferentemente 1-24 horas, más preferentemente 2-12 horas.
Debe entenderse que, dentro del alcance de la presente invención, cada característica técnica de la presente invención descrita anteriormente y en lo que sigue (tal como ejemplos) puede combinarse entre sí para formar una solución técnica nueva o preferida, que no se enumera aquí debido a las limitaciones de espacio.
Descripción de la figura
La Figura 1 muestra múltiples compuestos de la presente invención, incluyendo 0224 (Figura 1a), 0304 (Figura 1b), 0706, 0708, 0713, 0715 (Figura 1c), 1028c (Figura Id), 0428 (1e), 1022B (If) (no según la invención) y NC0F4 (1g) pueden unirse a un complejo receptor PYL2-HAB 1 de Arabidopsis thaliana, inhibiendo así la actividad de la proteína fosfatasa HAB1. A concentraciones más bajas, todos los compuestos mencionados exhiben efectos inhibitorios, y los efectos inhibitorios de la mayoría de los compuestos son mejores o significativamente mejores que los del ABA.
La figura 2 muestra que varios compuestos de la presente invención presentan un efecto dependiente de la dosis como agonista del receptor PYL. En el que una curva dosis-respuesta de 0224 y 0304 con los receptores PYR1 (Figura 2a), PYL1 (Figura 2b), pY l2 (Figura 2c) y PYL7 (Figura 2d) de Arabidopsis thaliana , y las curvas dosis-respuesta de cuatro compuestos (0706, 0708, 0713 y 0715) (Figura 2e), los compuestos 0428 (Figura 2f) 1022B (Figura 2g) (no de acuerdo con la invención) y NCOF4 (Figura 2h) con un agonista del receptor PYL2 de Arabidopsis thaliana muestran que los compuestos descritos anteriormente pueden promover la interacción de la proteína fosfatasa HAB1 y los receptores PYL de Arabidopsis thaliana , y la interacción presenta un efecto dependiente de la dosis. Los valores EC50 muestran que la afinidad de los compuestos mencionados con los receptores correspondientes es significativamente mayor que la del ABA. La figura 3 muestra los efectos del compuesto 0224 y del ABA en la germinación de semillas de Col-0 y de los mutantes triples pyr1;pyl1;pyl4 a una concentración de 1 pM. Col-0 se siembra en la mitad izquierda y el triple mutante pyr1;pyl1;pyl4 se siembra en la mitad derecha en cada placa de cultivo. 4 días después de la germinación de las semillas (6 días después de la siembra) de los mutantes triples pyr1;pyl1;pyl4 , se toman las fotos. El tratamiento con DMSO es un grupo de control. Los resultados muestran que el compuesto 0224 puede inhibir la germinación de las semillas de Col-0, mientras que el efecto inhibitorio sobre la germinación de las semillas del triple mutante pyr1;pyl1;pyl4 se reduce significativamente, lo que indica que la inhibición del compuesto 0224 sobre la germinación de las semillas en Arabidopsis thaliana está mediada a través de los receptores de ABA, más que por efectos tóxicos.
La figura 4 muestra que el tratamiento de los compuestos 0224, 0304, 0706, 0715 o 0428 de la presente invención ha reducido significativamente la tasa de transpiración de las hojas, lo que ha provocado un aumento de la temperatura de las hojas en Arabidopsis. En la Figura 4a se muestra que tras el tratamiento con 5 |jM de ABA o el compuesto 0224, la temperatura de la hoja aumenta significativamente en comparación con la del tratamiento de control (DMSO), y la duración del compuesto 0224 es mayor. La figura 4b muestra que tras el tratamiento con el compuesto 0304 de 5 j M, la temperatura de la hoja aumenta significativamente en comparación con el tratamiento de control (DMSO). Mientras que después de disminuir la concentración del compuesto 0224 a 2 j M o 1 j M, la temperatura de la hoja sigue aumentando significativamente en comparación con la del tratamiento de control (DMSO), y el efecto disminuye gradualmente, lo que indica que existe un efecto dependiente de la concentración para el efecto inhibidor del compuesto 0224 en la transpiración de la hoja. La figura 4c muestra que tras el tratamiento con 5 j M del compuesto 0706 o 0715, la temperatura de la hoja aumenta significativamente en comparación con la del tratamiento de control (DMSO), cuya duración es equivalente a la del 0224. La figura 4d muestra que después de tratar con 5 j M, 2 j M y 1 j M del compuesto 0428, la temperatura de la hoja se incrementa significativamente en comparación con el tratamiento con DMSO, y la temperatura de la hoja se incrementa con el aumento de la concentración, lo que indica que hay un efecto dependiente de la concentración para el efecto inhibidor del compuesto 0428 en la transpiración de la hoja.
La figura 5 muestra que después de tratar con los compuestos 0224 y 0304 de la presente invención, la tasa de transpiración de la hoja de soja se reduce significativamente, lo que resulta en un aumento de la temperatura de la hoja. 14 días después de la siembra, las plantas de soja se dejan de regar y se rocían con el compuesto 0224, o 0304 de la presente invención o ABA. En comparación con el grupo de control (DMSO), 20 j M del compuesto 0224 o 0304 pueden reducir significativamente la tasa de transpiración de la hoja de soja, y el efecto inhibidor es mejor que el del ABA en la misma concentración.
La figura 6 muestra que el tratamiento con el compuesto 0224 de la presente invención ha reducido significativamente la tasa de transpiración de la hoja de algodón, lo que resulta en un aumento de la temperatura de la hoja. 25 días después de la siembra, las plantas de algodón se dejaron de regar y se asperjaron con el compuesto 0224 de la presente invención o con ABA. En comparación con el grupo de control (DMSO), el compuesto 0224 de 20 j M puede reducir significativamente la tasa de transpiración de la hoja de algodón, y el efecto inhibidor es mejor que el del ABA a la misma concentración.
La figura 7 muestra los resultados de los experimentos de sequía en el suelo de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis thaliana es fotografiada antes de la sequía y cuatro semanas después de la misma. La Arabidopsis thaliana del grupo de control (tratada con DMSO) se ha marchitado cuatro semanas después de la sequía, mientras que la Arabidopsis tratada con el compuesto 0224, 0706 o 0715 sigue creciendo normalmente.
La figura 8 muestra los resultados de los experimentos de sequía del suelo en la soja. La soja de la figura 5 se vuelve a regar después de 6 días de sequía. Las fotos muestran el estado de crecimiento de la soja un día después de volver a regar. El crecimiento de la soja tratada con el compuesto 0224 o 0304 es significativamente mejor que el del grupo de control (DMSO) o el de la soja tratada con la misma concentración de ABA.
La figura 9 muestra los resultados de los experimentos de sequía del suelo en el algodón. El algodón de la Figura 6 se vuelve a regar después de 6 días de sequía, y el compuesto 0224 de la presente invención o el ABA se asperjan una vez cada 3 días durante este período. Las fotos muestran el estado de crecimiento del algodón antes del rehidratado y un día después del rehidratado. El crecimiento del algodón tratado con el compuesto 0224 es significativamente mejor que el del grupo de control (DMSO) o el del algodón tratado con la misma concentración de ABA.
La figura 10 muestra un cambio transcripcional de los genes relacionados con el estrés inducido por el ABA en Arabidopsis thaliana de tipo salvaje después de tratar con 10 j M del compuesto 1022B de la presente invención durante 6 horas. El tratamiento con DMSO y la misma concentración de ABA se utilizan como grupo de control negativo y positivo, respectivamente. Los resultados muestran que los niveles transcripcionales de los cuatro genes relacionados con el estrés inducidos por el compuesto 1022B de la presente invención son todos mayores que los del ABA.
Las figuras 11a y 11b muestran una estructura bidimensional de la interacción entre ABA (a), o los compuestos de la presente invención (0428) (b) y múltiples residuos de aminoácidos dentro de la estructura de bolsillo del complejo PYL2-HAB1, respectivamente. Las moléculas de agua, los átomos de nitrógeno, los átomos de oxígeno y los átomos de halógeno se muestran en la figura, las líneas de puntos representan los enlaces de hidrógeno y los números indican la distancia entre dos átomos / moléculas (la unidad es Angstroms (?). Los resultados muestran que, de forma similar al ABA, el compuesto 0428 de la presente invención forma varios enlaces de hidrógeno con los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de bolsillo de PYL2, excepto que la formación de estos enlaces de hidrógeno no requiere la mediación de la molécula de agua, lo que permite una unión más estrecha del compuesto 0428 al complejo PYL2-HAB1.
La figura 12 muestra los resultados de los experimentos de sequía en el suelo con Arabidopsis. Las plantas de Arabidopsis de tipo salvaje (Col-0) cultivadas durante 3 semanas en un entorno de día corto se dejan de regar y se rocían con 5 pM de ABA o con el compuesto 0428 de la presente invención. En la figura se muestra el estado de crecimiento de la planta el día y 14 días después de la primera aspersión de los compuestos, respectivamente. La planta rociada con la solución de DMSO se utiliza como control negativo. Los resultados muestran que la planta rociada con el compuesto 0428 muestra una mejor condición de crecimiento que la del grupo de control y la rociada con ABA.
La figura 13 muestra una curva dosis-respuesta de los agonistas del receptor GmPYL6 de soja y OsPYL2 de arroz de los compuestos de la presente invención (tal como el compuesto 0428) y ABA. El compuesto 0428 puede promover la interacción de la proteína fosfatasa HAB1 de Arabidopsis con GmPYL6 de soja o OsPYL2 de arroz, y esta interacción es dependiente de la dosis.
Las figuras 14a y 14b muestran los resultados de los experimentos de sequía del suelo en la soja y el maíz, respectivamente. Se seleccionan el maíz en el período de boca pequeña y la soja en la etapa de triple trifoliación, y los compuestos de la presente invención (tal como, el compuesto 0428) se rocían el primer día y el segundo día después del inicio de la sequía. En la figura se muestra el estado general de crecimiento del maíz tras 4 días de tratamiento de sequía y de la soja tras 9 días de tratamiento de sequía. La concentración del compuesto 0428 en el experimento es de 50 pM. La condición de crecimiento del maíz y la soja tratados con el compuesto 0428 es significativamente mejor que la del grupo de control.
La figura 15 muestra el efecto del compuesto 0428 y del ABA en la germinación de semillas de Col-0 y del triple mutante pyr1;pyl1;pyl4 a una concentración de 2 pM. Col-0 se siembra en la mitad izquierda y el triple mutante pyr1;pyl1;pyl4 se siembra en la mitad derecha de la placa de cultivo. Las fotos están tomadas 7 días después de la germinación de las semillas (9 días después de la siembra) de los mutantes triples pyr1;pyl1;pyl4 . El tratamiento con DMSO se utiliza como grupo de control. Los resultados muestran que el compuesto 0428 puede inhibir la germinación de la semilla de Col-0, pero el efecto inhibitorio sobre la germinación de la semilla de los mutantes triples pyr1;pyl1;pyl4 se reduce significativamente, lo que indica que la inhibición de la germinación de la semilla del compuesto 0428 en la Arabidopsis está mediada a través de los receptores de ABA, en lugar de efectos tóxicos.
La figura 16 muestra que el tratamiento con el compuesto 0224 de la presente invención ha reducido significativamente la tasa de transpiración de la hoja de trigo, dando lugar a un aumento de la temperatura de la hoja. 18 días después de la siembra, se deja de regar las plantas de trigo y se asperja el compuesto 0224 de la presente invención. En comparación con el grupo de control (DMSO), el compuesto 0224 100 pM puede reducir significativamente la tasa de transpiración de la hoja de trigo.
La figura 17 muestra los resultados de los experimentos de sequía del suelo en el trigo. El trigo de la Figura 16 fue fotografiado después de 6 días de sequía, y las fotos muestran que la condición de crecimiento del trigo tratado con 100 pM de compuesto 0224 o ABA es significativamente mejor que la del grupo de control (DMSO).
Descripción detallada
Después de un extenso y profundo estudio, los presentes inventores han desarrollado en primer lugar una clase de alternativas de ABA (los compuestos de la presente invención) con altas actividades de ácido abscísico (ABA). Los compuestos de la presente invención pueden mejorar significativamente la multirresistencia de la planta (tal como la resistencia a la sequía, la tolerancia al frío, etc.). Además, los compuestos de la presente invención son fáciles de preparar, y tienen ventajas tales como una excelente compatibilidad con el medio ambiente y una acción rápida, etc., por lo que tienen una amplia perspectiva de aplicación. Sobre esta base, los inventores completan la presente invención.
Los experimentos han demostrado que los compuestos de la presente invención pueden unirse a un número de receptores PYR/PYL, y su actividad in vitro es mejor que la del Ácido Abscísico (ABA), y pueden aumentar significativamente la resistencia al estrés de una variedad de plantas diferentes.
Definición del grupo
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "sustituido o no sustituido" significa que el grupo puede no estar sustituido, o que el H del grupo está sustituido con uno o más (tal como, 1-10, preferentemente 1-5, más preferentemente 1-3, más preferentemente 1-2) sustituyentes.
Tal como se utiliza aquí, la "sustitución" o "sustituido" significa que el grupo tiene uno o más (preferentemente 1-6, más preferentemente 1-3) sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, hidroxilo, -NH2, nitro, -CN, alquilo C1-C4 , haloalquilo C1-C4 , alcoxilo C1-C4 , cicloalquilo C3-C6, carboxilo C1-C3, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo C1-C7" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 7 átomos de carbono, como el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el butilo, el isobutilo, el sec-butilo, el t-butilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquilos C1-C7 sustituidos o no sustituidos.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo C1-C6" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, como el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el butilo, el isobutilo, el sec-butilo, el t-butilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquilos C1-C6 sustituidos o no sustituidos.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo C1-C4" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, como el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el butilo, el isobutilo, el sec-butilo, el t-butilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquilos C1-C4 sustituidos o no sustituidos.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo C1-C3" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 3 átomos de carbono, como el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquilos C1-C3 sustituidos o no sustituidos.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquileno C1-C2" se refiere a un grupo hidrocarburo divalente que tiene 1-2 átomos de carbono, como el metileno, el etileno o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el alquileno C1-C2 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alquenilo C2-C7" se refiere a un grupo alquenilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 7 átomos de carbono, como el etenilo, el alilo, el 1-propenilo, el isopropenilo, el 1 -butenilo, el 2-butenilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquenilo C2-C7 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza aquí, el término "alquenilo C2-C6" se refiere a un grupo alquenilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, como el etenilo, el alilo, el 1-propenilo, el isopropenilo, el 1 -butenilo, el 2-butenilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "alquenilo C2-C3" se refiere a un grupo alquenilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 3 átomos de carbono, como el etenilo, el alilo, el 1-propenilo, el isopropenilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alquenilo C2-C3 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "alquinilo C2-C7" se refiere a un grupo alquinilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 7 átomos de carbono, como el etilo, el propinilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el alquinilo C2-C7 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "alquinilo C2-C6" se refiere a un grupo alquinilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, como el etilo, el propinilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el alquinilo C2-C6 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza aquí, el término "alquinilo C2-C3" se refiere a un grupo alquinilo lineal o ramificado que tiene de 2 a 3 átomos de carbono, como el etilo, el propinilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el alquinilo C2-C3 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza aquí, el término "cicloalquilo C3-C8" se refiere a un alquilo cíclico que tiene de 3 a 8 átomos de carbono, como el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo, el cicloheptilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza aquí, el término "cicloalquilo C3-C7" se refiere a un alquilo cíclico que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, como el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo, el cicloheptilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza aquí, el término "cicloalquilo C3-C6" se refiere a un alquilo cíclico que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, como el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo, el cicloheptilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye el cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza aquí, el término "heterociclilo C5-C10" se refiere a un grupo saturado, parcialmente saturado o insaturado (pero no aromático) que tiene un anillo simple o un anillo fusionado (incluidos los sistemas de anillos con puente y los sistemas de espiroanillos, que tienen de 5 a 10 átomos de carbono y de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, azufre u oxígeno). En un sistema de anillos fusionados, uno o más anillos pueden ser cicloalquilos, arilos o heteroarilos, siempre que el punto de unión pase por anillos no aromáticos. El término incluye el heterociclo sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "heterociclilo C5-C8" se refiere a un grupo saturado, parcialmente saturado o insaturado (pero no aromático) que tiene un solo anillo o un anillo fusionado (incluidos los sistemas de anillos con puente y los sistemas de espirales, que tienen de 5 a 8 átomos de carbono y de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, azufre u oxígeno). En un sistema de anillos fusionados, uno o más anillos pueden ser cicloalquilos, arilos o heteroarilos, siempre que el punto de unión pase por anillos no aromáticos. El término incluye el heterociclio sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "haloalquilo C1-C3" se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 3 átomos de carbono en el que el hidrógeno está sustituido con uno o más halógenos, por ejemplo, halometilo, haloetilo, halopropilo, haloisopropilo o similares. Cuando no se especifica lo contrario, el término incluye haloalquilo C1-C3 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alcoxi C1-C6" se refiere a un grupo que tiene una estructura "(alquilo C1-C6)-O-", por ejemplo, CH3-O-, C2H5-O-, C3H7-O-, (CH3)2CH-O-, nC4Hg-O-, fC^g-O-, o similares, y cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alcoxi C1-C4" se refiere a un grupo que tiene una estructura "(alquilo C1-C4)-O-", por ejemplo, CH3-O-, C2H5-O-, C3H7-O-, (CH3)2CH-O-, nC4Hg-O-, fC4Hg-O-, o similares, y cuando no se especifica lo contrario, el término incluye alcoxi C1-C4 sustituido o no sustituido.
Tal y como se utiliza aquí, el término "halógeno" se refiere al flúor, cloro, bromo o yodo, preferentemente flúor o cloro, más preferentemente flúor.
Tal como se utiliza aquí, el término "halogenado" se refiere a un grupo que está sustituido con uno o más de los mismos o diferentes átomos de halógeno descritos anteriormente, que puede estar parcialmente halogenado o perhalogenado, como el trifluorometilo, el pentafluoroetilo, el heptafluoroisopropilo o similares.
Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, se presentan como racematos, mezclas racémicas, enantiómeros simples, compuestos diastereoméricos y diastereómeros simples. El centro asimétrico que puede existir depende de la naturaleza de los distintos sustituyentes de la molécula. Cada uno de estos centros asimétricos producirá independientemente dos isómeros ópticos, y todos los posibles isómeros ópticos y mezclas diastereoméricas y compuestos puros o parcialmente puros están incluidos en el ámbito de esta invención. La invención incluye todas las formas isoméricas de los compuestos.
Compuestos de la presente invención y procedimiento de preparación de los mismos
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "compuestos de la presente invención", "sustitutos de ABA de la presente invención" y "compuesto de fórmula I" pueden utilizarse indistintamente, y todos ellos se refieren a compuestos que tienen la estructura mostrada en la Fórmula I. Además, los términos también incluyen sales, isómeros ópticos, racematos y/o solvatos (tal como hidratos) de los compuestos de fórmula I,
Figure imgf000016_0001
en los que R1-R10, R11, m, X y " ^ ^ " se definen como anteriormente.
En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de la Fórmula la:
Figure imgf000017_0001
donde R1-R10, y m se definen como arriba.
En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de Fórmula Ib:
Figure imgf000017_0002
donde
En otra realización preferida, el compuesto tiene una estructura de Fórmula Ic:
Figure imgf000017_0003
donde R1-R10, y m se definen como arriba.
En otra realización divulgada no cubierta por la invención reivindicada, el compuesto tiene una estructura de Fórmula Id:
Figure imgf000018_0001
donde R1-R10, R12 y m se definen como arriba.
El procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula I según la presente invención se describe más específicamente a continuación, pero no se pretende limitar la invención de ninguna manera. Los compuestos de la presente invención también pueden prepararse convenientemente mediante una combinación de varios procedimientos de síntesis descritos en la presente especificación o conocidos en la técnica, y tales combinaciones están fácilmente disponibles para los expertos en la materia. En general, en el procedimiento de preparación de la presente invención, la mayoría de las reacciones se llevan a cabo en un disolvente inerte a una temperatura de 0 °C a 150 °C (o temperatura de reflujo) (preferentemente, 10-60 °C, o 20-40 °C) durante un periodo de tiempo (tal como, 0,1-72 horas, preferentemente 2-20 horas).
Tal y como se utiliza aquí, la temperatura ambiente se refiere a 4-35 °C, preferentemente 20-30 °C.
Preferentemente, los compuestos de fórmula I según la presente invención pueden prepararse mediante los siguientes esquemas, los procedimientos ejemplares descritos en los ejemplos y la literatura publicada pertinente utilizada por los expertos en la materia.
Típicamente, el procedimiento de preparación de los compuestos de Fórmula Ia de la presente invención puede incluir, pero no se limita a, los siguientes esquemas.
Esquema I (tomando como ejemplo X=O, R 6 =propilo. R 7 =metilo. R 8 =H, R 9 =H, R i o =H, m=1)
(1) Preparación de 1-propil-4-metil-6-amino-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona:
Figure imgf000019_0001
En el paso 1, en primer lugar, se hace reaccionar el compuesto de fórmula I-1 con N,N'-carbonildiimidazol (CDI) en un disolvente inerte (tal como el tetrahidrofurano) a una cierta temperatura (tal como, por ejemplo, 20-40 ° C) durante un período de tiempo, formando así un compuesto de fórmula I-2.
Paso 2: en presencia de un álcali (tal como el hidruro de sodio), se hace reaccionar el compuesto de fórmula I-2 con yodopropano en un disolvente inerte (tal como la N- N- dimetilformamida) a una cierta temperatura (tal como 20-40 ° C) durante un período de tiempo, formando así un compuesto de fórmula I-3.
Paso 3: En presencia de un ácido (tal como el ácido sulfúrico), hacer reaccionar el compuesto de fórmula I-3 con nitrato de potasio a una cierta temperatura (tal como 0-10 ° C) durante un período de tiempo, formando así un compuesto de fórmula 1-4.
Paso 4: En un disolvente inerte (tal como el metanol), el compuesto de fórmula Ia-4 se somete a una reacción de reducción con paladio sobre carbono como catalizador a una determinada temperatura (tal como 20-40 ?C), formando así un compuesto de fórmula 1-5.
(2) Preparación del cloruro de 4-metilhaloobencilsulfonilo:
Figure imgf000019_0002
Paso 5: En un disolvente inerte (tal como etanol, acetonitrilo), hacer reaccionar el compuesto de fórmula I-SS1 (tal como bromuro de 2, 3, 5, 6-tetrafluoro-4-metilbencil o cloruro de 2, 3, 5, 6-tetrafluoro- 4-metilbencil) con tiourea, formando así un producto de reacción; y, a continuación, en presencia de un ácido (tal como el ácido clorhídrico concentrado), hacer reaccionar el producto de reacción con clorito de sodio en un disolvente inerte (tal como el acetonitrilo) a una temperatura determinada (tal como 15-25 ?C), formando así un compuesto de fórmula I-S2.
(3) Preparación de un compuesto de fórmula la
Figure imgf000020_0001
Paso 6: en presencia de un agente aglutinante de ácido (tal como carbonato de potasio), hacer reaccionar el compuesto de fórmula 1-5 con el compuesto de fórmula I-S2 en un disolvente inerte (tal como DMF) a una cierta temperatura (tal como 20-50 ?C) durante un período de tiempo, formando así un compuesto de fórmula Ia.
En el esquema I, X2 es un grupo saliente, que es cloro, bromo o yodo. Otros sustituyentes y grupos son los definidos en la memoria descriptiva.
Formulaciones agrícolas
Las sustancias activas (compuestos de fórmula I, o sales de los mismos, o isómeros ópticos de los mismos, o racematos de los mismos, o solvatos de los mismos) de la presente invención pueden prepararse en formulaciones agrícolas de manera convencional, por ejemplo, soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, agentes espumantes, pastas, gránulos, aerosoles, materiales naturales y sintéticos impregnados con sustancias activas, microcápsulas en polímeros, materiales de recubrimiento para semillas.
Estas formulaciones pueden producirse por procedimientos conocidos, por ejemplo, mezclando los compuestos activos con extensores que son diluyentes o portadores líquidos o licuados o sólidos y, opcionalmente, con tensioactivos, es decir, emulsionantes y/o dispersantes y/o formadores de espuma. Por ejemplo, cuando se utiliza agua como diluyente, también se pueden utilizar disolventes orgánicos como auxiliares.
Es básicamente adecuado cuando se utiliza un disolvente líquido como diluyente o portador, por ejemplo, hidrocarburos aromáticos como xileno, tolueno o alquilnaftaleno; hidrocarburos aromáticos clorados o alifáticos clorados como clorobenceno, cloruro de vinilo o cloruro de metileno; hidrocarburos alifáticos como el ciclohexano, o parafinas como las fracciones de aceite mineral; alcoholes y sus éteres y ésteres como el etanol o el etilenglicol; cetonas como la acetona, la metil etil cetona, la metil isobutil cetona o la ciclohexanona; o disolventes polares menos utilizados como la dimetilformamida y el dimetil sulfóxido, y el agua.
En el caso de los diluyentes o portadores licuados, se refieren a un líquido que se convertirá en gas a una temperatura y una presión atmosféricas, como un propulsor en aerosol, como los hidrocarburos halogenados, así como el butano, el propano, el nitrógeno y el dióxido de carbono.
El portador sólido puede ser minerales naturales molidos como caolín, arcilla, talco, cuarzo, arcilla activada, montmorillonita o tierra de diatomeas, así como minerales sintéticos molidos como ácido silícico altamente disperso, alúmina y silicatos. Los portadores sólidos de los gránulos son zirconios naturales molidos y fraccionados como la calcita, el mármol, la piedra pómez, la sepiolita y la dolomita, así como gránulos sintetizados mediante polvo grueso inorgánico y orgánico, y materiales orgánicos como partículas de serrín, cáscara de coco, mazorcas de maíz, tallos de tabaco, etc.
Los emulsionantes no iónicos y aniónicos pueden utilizarse como emulsionantes y/o formadores de espuma. Por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, por ejemplo éteres de poliglicol de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alquilo e hidrolizado de albúmina. Los dispersantes incluyen, por ejemplo, licores residuales de lignina y sulfito y metilcelulosa.
En la formulación pueden utilizarse aglutinantes, como la carboximetilcelulosa y polímeros naturales y sintéticos en forma de polvos, gránulos o emulsiones, como la acacia, el alcohol polivinílico y el acetato de polivinilo.
Pueden utilizarse colorantes, por ejemplo, tintes inorgánicos como el óxido de hierro, el óxido de cobalto y el azul de Prusia; tintes orgánicos como los tintes azoicos o los tintes metálicos de cianina de titanio; y oligoelementos como las sales de hierro, manganeso, boro, cobre, cobalto, aluminio y zinc y similares.
En la presente invención, la "formulación agrícola" es generalmente un regulador del crecimiento vegetal agrícola, que comprende un compuesto de fórmula I o una sal, un isómero óptico, un racemato o un solvato del mismo como ingrediente activo para mejorar la resistencia al estrés de la planta (tal como la resistencia a la sequía); y un portador agrícolamente aceptable.
Tal como se utiliza en el presente documento, el "portador aceptable desde el punto de vista agrícola" es un disolvente, suspensión o excipiente aceptable desde el punto de vista agrícola que se utiliza para suministrar los compuestos de fórmula I o sales, isómeros ópticos, racematos o solvatos de los mismos de la presente invención a una planta. El portador puede ser líquido o sólido. Un portador agrícolamente aceptable adecuado para su uso en la presente invención se selecciona del grupo que consiste en: agua, tampones, DMSO, tensioactivos como Tween-20, y una combinación de los mismos. En la presente invención se puede utilizar cualquier portador agrícolamente aceptable conocido por los expertos en la materia.
Las formulaciones agrícolas de la presente invención pueden formularse con otros agentes resistentes a la sequía en una mezcla para que estén presentes en sus formulaciones de producto o en las formas de dosificación preparadas a partir de estas formulaciones, dichos otros agentes resistentes a la sequía incluyen (pero no se limitan a) agentes de cubrimiento de semillas resistentes a la sequía, agentes de retención de humedad resistentes a la sequía o agentes de aspersión resistentes a la sequía.
Además, las formulaciones agrícolas de la presente invención también pueden formularse con sinergistas en una mezcla para que estén presentes en sus formulaciones de producto o en las formas de dosificación preparadas a partir de estas formulaciones, y estos sinergistas son compuestos que potencian la acción del compuesto activo. Dado que el propio compuesto activo es activo, no se pueden añadir sinergistas.
Las formas de dosificación de las formulaciones agrícolas de la presente invención pueden ser variadas, pudiendo utilizarse todas aquellas que permitan la entrega efectiva del ingrediente activo en la planta in vivo . Desde el punto de vista de la facilidad de preparación y administración, la formulación agrícola preferida es una aspersión o una solución.
Las formulaciones agrícolas de la presente invención suelen contener de 0,0001 a 99% en peso, preferentemente de 0,1 a 90% en peso, de los compuestos de la presente invención, basándose en el peso total de la formulación agrícola. La concentración de los compuestos de la presente invención en las formulaciones comerciales o formas de dosificación utilizadas puede ser muy variada. La concentración de los compuestos de la presente invención en las formulaciones comerciales o formas de dosificación utilizadas puede oscilar entre el 0,0000001-100% (g/v), preferentemente entre el 0,0001 y el 1% (g/v).
Procedimiento para mejorar la resistencia de las plantas al estrés
La presente invención proporciona un procedimiento para mejorar la resistencia al estrés de las plantas, como la resistencia a la sequía, la tolerancia al frío, que comprende los pasos de: administrar a una planta un compuesto de fórmula I o una sal, un isómero óptico, un racemato o un solvato del mismo, o una formulación agrícola correspondiente del mismo.
La administración puede llevarse a cabo por varios procedimientos ya conocidos, por ejemplo, rociando, atomizando, espolvoreando o sembrando al voleo el compuesto o la formulación agrícola que contiene el compuesto sobre las hojas de la planta, el material de propagación, o por otras maneras de contactar la planta con el compuesto o la formulación agrícola que contiene el compuesto, si para contactar las semillas, éstas son tratadas por recubrimiento, envoltura u otras maneras. Otro procedimiento para tratar las plantas o semillas directamente antes de la siembra es introducir la formulación agrícola de la presente invención en el suelo u otro medio que se vaya a sembrar. En algunas realizaciones, también se puede utilizar un portador, que puede estar en estado sólido o líquido como se ha descrito anteriormente.
En una realización preferida, el compuesto o la formulación agrícola que contiene el compuesto también puede suministrarse a la planta mediante aspersión (tal como la aspersión con aviones) o irrigación.
Las principales ventajas de la presente invención son:
Por primera vez, se ha desarrollado una clase de alternativas de ABA (compuestos de la presente invención) con una alta actividad de ácido abscísico (ABA). Los compuestos de la presente invención pueden mejorar significativamente una variedad de resistencias al estrés (tal como la resistencia a la sequía, la tolerancia al frío, etc.) de la planta. Además, los compuestos de la presente invención son fáciles de preparar y tienen una excelente compatibilidad con el medio ambiente, por lo que tienen una amplia perspectiva de aplicación. Sobre esta base, se ha completado la presente invención.
Los experimentos han demostrado que los compuestos de la presente invención (tal como los compuestos 0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715, 0428, 1022b (no según la invención) y similares) pueden unirse a un número de receptores PYL diferentes, cuya actividad in vitro es significativamente mejor que la del ácido abscísico (ABA) y pueden mejorar significativamente la resistencia al estrés de una variedad de plantas diferentes.
(1) La presente invención ha sintetizado por primera vez una serie de alternativas altamente activas del ácido abscísico (ABA) natural. Los compuestos de la presente invención pueden mejorar significativamente una variedad de resistencias al estrés en las plantas (tal como la resistencia a la sequía y la tolerancia al frío). Además, todos los isómeros ópticos o racematos de los presentes compuestos tienen una elevada actividad.
(2) La actividad de los compuestos de la presente invención es significativamente mejor que el ácido abscísico (ABA) y los análogos del a Ba existentes.
(3) Los compuestos de la presente invención pueden promover la interacción entre una pluralidad de proteínas receptoras PYR/PYL y la proteína fosfatasa p P2C Ha B1.
(4) Los procedimientos de síntesis de los compuestos de la presente invención son sencillos y de bajo coste.
La presente invención se describe con más detalle a continuación, haciendo referencia a realizaciones específicas. Debe entenderse que estos ejemplos son sólo para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la misma. Las condiciones de los procedimientos experimentales que no se indican específicamente en los siguientes ejemplos suelen ajustarse a las condiciones convencionales descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o según las condiciones descritas en el Journal of Microbiology: An Experimental Handbook (editado por James Cappuccino y Natalie Sherman, Pearson Education Press) o las condiciones propuestas por el fabricante. Salvo que se indique lo contrario, los porcentajes y las partes son en peso y partes en peso.
A menos que se especifique lo contrario, los materiales y reactivos utilizados en los ejemplos de la presente invención son todos productos disponibles en el mercado.
Materiales y procedimientos generales
Materiales
Las plantas modelo utilizadas en los experimentos son todas variedades convencionales o comerciales disponibles, entre las que se encuentra Arabidopsis thaliana : Ecotipo Colombia (Col-0) y mutantes de síntesis de ABA basados en el ecotipo Col-0 aba2-1 y triple mutante (pyr1;-pyl1;-pyl4) de los receptores PYL. Las variedades de soja son las disponibles comercialmente Shandou 125 (0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715 y 1028c) y Hanxia 10 (0428, 1022B (no según la invención) y NC0F4), las variedades de algodón son las disponibles comercialmente upland cotton R15, y las variedades de trigo son las disponibles comercialmente Xinong 979, las variedades de maíz son las disponibles comercialmente Yedan 13.
Los compuestos de la presente invención (tal como 0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715, 1028c, 0428, 1022B (no según la invención) y NC0F4, etc.) se muestran en cada ejemplo.
Crecimiento de la planta
La temperatura de crecimiento para Arabidopsis thaliana es de 22 ?C. El fotoperiodo de las plantas cultivadas en un medio de crecimiento vegetal es de día largo (24 horas de luz), y el fotoperiodo de las plantas cultivadas en el suelo (tal como en los experimentos de transpiración de hojas y de sequía en el suelo) es de día corto (8 horas de luz /16 horas de oscuridad), y la intensidad de la luz es de 75 pmol - m-2 - s-1.
La temperatura de crecimiento para la soja y el algodón es de 26 °C y el fotoperiodo es de 14 horas de luz /10 horas de oscuridad. La temperatura de crecimiento del maíz es de 27 °C y el fotoperiodo es de 11 horas de luz y 13 horas de oscuridad. La temperatura de crecimiento para el trigo es de 27 °C, y el fotoperiodo es de 11 horas de luz /13 horas de oscuridad. La intensidad de la luz es de 400 pmol - itt2 - s-1.
A menos que se indique lo contrario, todos los medios de crecimiento de plantas utilizados en los experimentos son medios sólidos de 1/2 MS (Murashige y Skoog) que contienen 1% (p/v) de sacarosa y 0,6% (p/v) de agar (comprados a Phyto Technology Labotories Company).
Expresión y purificación de proteínas
El procedimiento de construcción de plásmidos recombinantes para los genes de Arabidopsis thaliana PYL1 (secuencia de aminoácidos 36-211), PYL2 (secuencia de aminoácidos 14-188) con etiquetas duales de 6*His y secuencia SUMO y el gen de Arabidopsis thaliana HAB1 (secuencia de aminoácidos 172-511) con la secuencia de etiqueta de biotina se describe en detalle en "A gate-latch-lock mechanism for hormone signaling by abscisic acid receptors" (Nature, Vol 462, 2009). El procedimiento de construcción de los plásmidos recombinantes para PYR1 y PYL7 (secuencia codificadora del gen completo) y GmPYL6 de soja y OsPYL2 de arroz con etiquetas duales de 6*His y secuencia SUMO es el mismo que el de PYL2 de Arabidopsis.
El plásmido recombinante anterior se transforma en una célula competente de E. coli BL21 (DE3) (comprada a la empresa NEB), y se inocula en 200 ml de medio líquido LB que contiene resistencia a Amp (comprada a la empresa OXOID) y se cultiva durante la noche a 37 °C a 200 rpm; y se inocula en 2 L de medio líquido LB que contiene resistencia a Amp en una relación de 1:50-1:100 para un cultivo prolongado, y se cultiva a 37 ?C, a 200 rpm durante 3-4 horas, y a una temperatura baja de 16 °C hasta que la OD600 sea de aproximadamente 0,8-1,0. Los plásmidos recombinantes para PYR1 / PYL1 / PYL2 / PYL7 /GmPYL6/OsPYL2 con etiquetas duales de 6*His y secuencia SUMO se indujeron durante la noche con 100 pM de IPTG, mientras que el plásmido recombinante HAB1 con la secuencia de etiqueta de biotina se indujo simultáneamente con 100 pM de IPTG y 40 pM de biotina.
Después de 16 horas de inducción, la solución bacteriana se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos a 4 °C en una centrífuga de alta capacidad de baja velocidad, y se recogieron las células bacterianas. Las células bacterianas se resuspendieron en 50 ml de tampón de extracción (que contenía 20 mM de Tris, pH 8,0, 200 mM de NaCl y 10% (v / v) de glicerol) por cada 2 L de solución bacteriana y luego se sometieron a presión de ruptura a 1000 Pa y 4 ?C durante 3-5 veces. Las células rotas fueron sometidas a ultracentrifugación, centrifugadas a 16000 rpm durante 30 minutos, y este proceso se repitió dos veces. El sobrenadante se recogió y se sometió a una columna de cromatografía de afinidad.
Para las proteínas PYR / PYL con etiquetas duales de 6*His y secuencias SUMO, se utilizaron 50 ml de columna Ni de cromatografía de afinidad (columna Ni-NTA de 50 ml, disponible en GE). En primer lugar, la columna se equilibró con 600 ml de tampón B al 10% (que contiene 20 mM de Tris, PH 8,0, 200 mM de NaCl, 500 mM de imidazol y 10% de glicerol), y a continuación se eluyó con 200 ml de tampón B al 50% y, finalmente, se eluyó con 100 ml de tampón B al 100%. Las proteínas para el análisis de cristales se mezclaron con la enzima ulp 1 a una relación molar de 1000: 1 para la diálisis enzimática durante la noche. Las proteínas digeridas se sometieron de nuevo a cromatografía de afinidad en una columna de Ni. La solución recogida se sometió a una columna de filtración en gel HiLoad 26/60 Superdex200 (disponible comercialmente en GE) y se eluyó con una solución de elución (que contenía 25 mM de Tris, pH 8,0, 200 mM de acetato de amonio, 1 mM de ditiotreitol y 1 mM de EDTA) para seguir separando y purificando la proteína.
Para una proteína HAB1 con una secuencia de etiqueta de biotina, se sometió a una columna de afinidad MBP de 50 ml (disponible en GE). La columna se equilibró primero con 600 ml de tampón C al 10% (que contiene 20 mM de Tris, pH 8,0, 200 mM de NaCl, 10 mM de maltosa y 10% de glicerol), y se eluyó con 200 ml de tampón C al 50% y, finalmente, se eluyó con 100 ml de tampón C al 100%. La solución de recogida se sometió a una columna de filtración en gel HiLoad 26/60 Superdex200 y se eluyó con una solución de elución (que contenía 20 mM de Tris, pH 8,0, 200 mM de NaCl y 10% de Glicerol) para separar y purificar aún más la proteína.
Ensayo AlphaScreen
Se utilizó el kit AlphaScreen (disponible en Perkin Elmer), y el procedimiento fue el siguiente: un tampón de 10 ? (50 mM MOPS, pH 7,4, 50 mM NaF, 50 mM CHAPS, 0.1 mg / ml de albúmina de suero bovino ) diluido al 1:10, cada uno de los 100 nM de HAB1 con secuencia de etiqueta de biotina y de la proteína PYR-i/PYL1/PYL2/PYL7/GmPYL6/OsPYL2 con etiquetas duales de 6*His y secuencias SUMO, las concentraciones correspondientes de (+)-ABA/0224/0304/0706/0708/0713/0715/0428/NC0F4, y 5 pg/ml de perlas donantes y perlas aceptoras (disponibles en Perkin Elmer) estaban contenidos en 150 pl de sistema experimental. Después de incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad, se colocó en un Envision Plate Reader (disponible en Perkin Elmer) bajo el procedimiento programado AlphaScreen para las lecturas.
Ensayo de la actividad fosfatasa de HABI
50 mM de imidazol, pH 7,2, 5mM de MgCh, 0,1% de p-mercaptoetanol, 0,5 pg • ml '1 de BSA, 100 nM de proteína HAB1 con una secuencia de etiqueta de biotina, 500 nM de proteína del receptor PYL2 con una secuencia de etiqueta dual 6*His-SUMO y la correspondiente concentración de (+)-ABA/0224/0304/0706/0708/0713/0715/1028c/0428/1022B*/NC0F4 (* = no según la invención) estaban contenidos en el sistema de reacción. El sistema de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de una nueva reacción durante 30 minutos tras añadir un polipéptido fosforilado con 11 amonoácidos como sustrato. El polipéptido fosforilado es el aminoácido 170-180 de la proteína quinasa SnRK2.6, en el que la serina fosforilada en la posición 175 (con una secuencia de HSQPKpSTVGTP, comprada a la empresa Kingsley) era un sitio objetivo de desfosforilación de HAB1 conocido. Después de 30 minutos, se añadió el reactivo cromogénico (adquirido en BioVision) y se leyó la absorbancia a 650 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices).
Análisis de la expresión génica
Se tomó la planta entera o las hojas y se realizó la extracción de ARN mediante procedimientos convencionales. Tras la transcripción inversa, se llevó a cabo la PCR cuantitativa por fluorescencia. Se tomaron tres muestras biológicas para cada tratamiento que se realizó dos veces. Se utilizó el gen ACT7 como gen de referencia.
Análisis de cristales de proteínas
Antes de la cristalización, las proteínas PYL2 y HABI de Arabidopsis thaliana con etiqueta eliminada por digestión se mezclaron con (+)-ABA o el compuesto 0428 en una relación molar de 1: 1: 5 y se concentró a 6 mg / ml para la formación de cristales. La formación de cristales se llevó a cabo por el procedimiento de gota colgante; el tampón de pozo para la cristalización contenía tartrato de di-sodio 0,2 M y 20% de PEG 3350. Al cabo de un día, se pudieron ver los cristales, que crecieron hasta 100-120 pm en unos 3-4 días. Los cristales se analizaron por difracción de rayos X y se recogieron los datos de difracción, y se analizó la estructura del complejo según el modelo de estructura del receptor PYR / PYL correspondiente.
Experimentos de germinación de semillas y sequía en el suelo
(1) Germinación de las semillas
Tomemos como ejemplo los compuestos 0428 y 0224 de la presente invención. Las semillas del ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana y del triple mutante del receptor PYL (pyr1;pyl1;pyl4) se esterilizaron con NaClO y se colocaron a 4 °C durante 3 días de vernalización, y luego se sembraron en 1/2 medio sólido MS que contenía 1 pM de compuesto (+)-ABA/0224 o 0,05% de DMSO (control) o en 1/2 medio sólido MS que contenía 2 pM de (+)-ABA/compuesto 0428 de la presente invención o 0,05% de DMSO (control). Se sembraron simultáneamente dos líneas de plantas en cada medio de 6 cm de diámetro, con 15-20 semillas sembradas para cada línea y 4 repeticiones para cada compuesto. El medio de cultivo se colocó a 22 °C con cultivo de día largo. Las semillas germinadas en un medio sólido que contenía 1 pM de compuesto (+)-ABA/0224 se fotografiaron 6 días después de la siembra, y las semillas germinadas en un medio sólido que contenía 2 pM de compuesto (+)-ABA/0428 se fotografiaron 9 días después de la siembra.
(2) Experimento de transpiración de las hojas de las plantas
El mutante de síntesis de ABA aba2-1 se utilizó en el experimento de transpiración de hojas de Arabidopsis . Bajo condiciones de estrés ambiental, el contenido de ABA endógeno en este mutante no aumenta, y es sólo 1/40 del de la Arabidopsis Col-0 de tipo salvaje bajo la misma condición. Por lo tanto, este mutante se utiliza para excluir el efecto del ABA endógeno en el experimento de transpiración. Las plantas se asperjaron con una solución que contenía 0,05% de tween-20 y las concentraciones correspondientes de (+)-ABA/0224/0304/0706/0715/0428 o 0,05% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) después de tres semanas de riego continuo con una cantidad de 1,2 ml/maceta. Los experimentos de transpiración foliar de la soja se llevaron a cabo a 26°C con iluminación de día largo y la soja se asperjó con una solución que contenía 0,1% de tween-20 y 20pM de compuesto (+)-ABA/0224/0304 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) 14 días después de la siembra con una cantidad de 4 ml/maceta; los experimentos de transpiración foliar de los algodones se asperjaron con una solución que contenía 0,1% de tween-20 y 20 pM de compuesto (+)-ABA/0224 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMSO, respectivamente, 25 días después de la siembra con una cantidad de 4 ml/maceta; los experimentos de transpiración foliar de los trigos se asperjaron con una solución que contenía 0,1% de tween-20 y 100 pM de compuesto (+)-ABA/0224 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) 18 días después de la siembra con una cantidad de 6 ml/maceta. Se tomaron imágenes diariamente con la cámara termográfica FLIR A655sc a la misma hora antes y después de la aspersión.
(3) Experimento sobre la sequía del suelo
Las semillas del ecotipo Col-0 de Arabidopsis se esterilizaron con NaClO y luego se sembraron en medio sólido 1/2 MS a 4 ?C durante 3 días de vernalización. Después de 6 días de crecimiento, se seleccionaron las plántulas bien crecidas que tenían un tamaño uniforme y se transfirieron a macetas de 8 ?7 ?6 cm3. Cada maceta se llenó con el mismo peso de tierra y se transfirió el mismo número de plantas (seis plantas) para reducir el error experimental. Todas las macetas se sometieron a un cultivo de día corto a 22 °C. Después de dos semanas, se suspendió el riego para el tratamiento de la sequía. Una solución que contenía 0,05% de Tween-20 y 5pM de 0224/0706/0715/0428 o 0,05% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) se asperjó sobre la superficie de las hojas una vez por semana con una cantidad de aspersión de 2 ml de solución/maceta. La posición de la maceta se cambió cada día durante el proceso de sequía para reducir el error causado por los factores ambientales. Durante todo el periodo de sequía, la solución se asperjó dos veces en total y se registraron las fotos después de cuatro semanas.
La soja, el algodón y el trigo para los experimentos de transpiración de las hojas se utilizaron simultáneamente para los experimentos de sequía del suelo, cada maceta se llenó con el mismo peso de suelo para reducir el error experimental. Todas las plantas de soja se sometieron a un cultivo de día largo a 26 °C. 14 días después de la siembra, se suspendió el riego y se seleccionaron las plantas con la condición de crecimiento consistente para el tratamiento de sequía. Al comienzo de la sequía, se asperjó una vez sobre la superficie de las hojas una solución que contenía 0,1% de Tween-20 y 20pM de (+)-ABA/0224/0304 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control), con una cantidad de 4 ml de solución por maceta. Mientras tanto, se cambió la posición de la maceta y se volvió a regar 6 días después de la sequía, y las fotos se tomaron 1 día después de volver a regar. El experimento de sequía del algodón fue similar al de la soja, el riego se detuvo 25 días después de la siembra, las plantas con la condición de crecimiento consistente fueron seleccionadas para el tratamiento de sequía. Al comienzo de la sequía, se asperjó una solución que contenía 0,1% de Tween-20 y 20pM de (+)-ABA/0224 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMs O (control) sobre la superficie de las hojas una vez con una cantidad de 4 ml de solución/maceta, y luego se asperjó una vez cada 3 días. Mientras tanto, se cambió la posición de la maceta y se volvió a regar 6 días después de la sequía, y las fotos se tomaron antes de volver a regar y 1 día después de hacerlo. En el experimento de sequía del trigo, el trigo con la condición de crecimiento consistente 16 días después de la siembra fue seleccionado para el tratamiento de sequía, al comienzo de la sequía, una solución con 0,1% de Tween-20 y 100 ^M (+)-ABA/0224 o 0,1% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) fue asperjado una vez, y luego asperjado una vez cada 3 días con una cantidad de asperjado de 4 ml/maceta. Mientras tanto, se cambió la posición de la maceta y las fotos se tomaron 6 días después de la sequía.
Los experimentos de sequía en el suelo utilizados para el compuesto 0428 en soja y maíz fueron similares a los utilizados para el compuesto 0224 en soja, con una sola planta en cada maceta. Todas las plantas de soja se cultivaron durante un día largo a 26 °C. Se interrumpió el riego cuando la planta tenía tres hojas en cada uno de los tres grupos y se seleccionaron las plantas con un crecimiento constante para el tratamiento de sequía. En cuanto al maíz, se interrumpió el riego durante el período de boca de campana pequeña para el tratamiento de la sequía. Una solución que contenía 0,05% de Tween-20 y 50 ^M de (+)-0428 o 0,05% de Tween-20 y 0,05% de DMSO (control) se asperjó una vez sobre la superficie de las hojas el primer y el segundo día de la sequía, respectivamente, con una cantidad de aspersión de 4 ml / maceta. Mientras tanto, la posición de la maceta también se cambió. La soja se volvió a regar 9 días después de la sequía, el maíz se volvió a regar 4 días después de la sequía y las fotos se tomaron al día siguiente.
Ejemplo 1 Preparación del compuesto 0224
1.1 Preparación de 4-metil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000025_0001
Se añadieron 3,4 g de 1-(2-aminofenil) etanol y 1,6 g de CDI en 50 ml de tetrahidrofurano anhidro, y la reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución de HCl 1M y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. La concentración se realizó a presión reducida. La purificación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 3,8 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 93%. 1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 10,16 (s, 1H), 7,25 (t, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,02 (t, 1H), 6,08 (d, 1H), 5,49 (m, 1H), 1,57 (d, 3H) ppm.
1.2 Preparación de 4-metil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000025_0002
Se añadieron 3,0 g de 4-metil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en 80 ml de N,N-dimetilformamida, y se agitó bajo baño de agua helada, se añadieron 1,05 equivalentes de hidruro de sodio en lotes, después de la adición, la mezcla se agitó durante 0,5 horas. Se añadieron gota a gota 1,05 equivalentes de yodopropano, se retiró el baño de agua helada y la reacción se llevó a cabo durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida para dar 3,1 g de 4-metil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona como aceite, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional, y el rendimiento crudo fue del 85%.
1.3 Preparación de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000026_0001
Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico en un matraz que contenía 3,0 g de 4-metil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona bajo baño de hielo y se agitó intensamente durante 0,5 horas; se añadió lentamente 1,1 equivalente de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico se añadió lentamente gota a gota con un embudo de goteo, se mantuvo la temperatura del baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 h. Se filtró y la torta del filtro se lavó con abundante agua. El producto crudo se recristalizó con etanol para dar 2,5 g de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona con un rendimiento del 74%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-da): 58,27 (dd, 1 H), 8,05 (d, 1 H), 7,07 (d, 1 H), 5,47 (m, 1 H), 3,82 (t, 2H), 1,78 (m, 2H), 1,77 (d, 3H), 1,04 (t, 3H) ppm.
1.4 Preparación de la 6-amino-4-metil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol -2-ona
Figure imgf000026_0002
Se añadieron 1,7 g de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en metanol y se añadió carbón de paladio como catalizador. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno tres veces y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas y se eliminó el sólido. La purificación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,5 g de un sólido amarillo con un rendimiento del 90%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-da): 56,77 (d, 1 H), 6,60 (dd, 1 H), 6,48 (d, 1 H), 5,27 (m, 1 H), 3,82 (t, 2H), 3,49(s, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,63(d, 3H), 0,98 (t, 3H) ppm.
1.5 Preparación del cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo
Figure imgf000026_0003
El cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilo y 1 equivalente de tiourea se disolvieron en etanol y luego la mezcla se calentó lentamente a reflujo, después de que la reacción se realizó durante 4-6 horas, la solución de reacción se concentró. Se añadió acetonitrilo y ácido clorhídrico concentrado. La temperatura se controló por debajo de 5-10 °C, se añadieron 3,5 equivalentes de clorito sódico por lotes bajo agitación intensa. La reacción se realizó a 15-20 °C durante 8-16 horas. La reacción se detuvo añadiendo agua y se extrajo con acetato de etilo durante tres veces, y el licor de extracción se concentró para dar un sólido amarillo claro, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.
1.6 Preparación del compuesto 0224
Figure imgf000027_0001
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metiM-propiM,4-dihidrobenzoxazol-2-ona y 1 equivalente de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo en DMF y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente de unión de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo, y se secó sobre sulfato sódico anhidro para concentrar la fase orgánica. El producto crudo se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,7 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 75%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,18 (s, 1H), 7,17-7,06 (m, 3H), 5,36 (m, 1H), 4,61 (s,2H), 3,77 (m, 2H), 2,22 (s,3H), 1,61 (m, 2H), 1,49 (d, 3H), 0,92 (t, 3H)ppm.
Ejemplo 2 Preparación del compuesto 0304
2.1 Preparación de 2-(2-aminofenil)propan-2-ol
Figure imgf000027_0002
Se añadieron 5,0 g de o-aminoacetofenona en 150 ml de tetrahidrofurano anhidro y se añadieron gota a gota 2 equivalentes de yoduro de metilo y magnesio en solución de tetrahidrofurano a -40 grados Celsius. La reacción se calentó lentamente hasta la temperatura ambiente y se agitó durante 12 horas. La reacción se inactivó añadiendo cloruro de amonio acuoso saturado y se extrajo con acetato de etilo. La mezcla se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró para dar 4,2 g de un producto amarillo crudo, sin purificación adicional y el rendimiento fue del 75%.
2.2 Preparación de la 4,4-dimetil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000027_0003
Se añadieron 3,4 g de 2-(2-aminofenil)-2-propanol y 5,5 g de CDI en 50 ml de tetrahidrofurano anhidro y la mezcla se hizo reaccionara temperatura ambiente durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución de HCl 1M y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se destiló a presión reducida para dar 3,7 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 92%.
1HRMN (400 MHz, CDCls): 59,61 (s, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,15 (d, 1 H), 7,07 (m, 1 H), 6,92 (dd, 1H), 1,74 (s, 6H) ppm.
2.3 Preparación de la 4,4-dimetil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000028_0001
Se añadieron 4,0 g de 4,4-dimetil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en 80 ml de N,N-dimetilformamida y se agitó bajo baño de hielo, se añadieron 1,05 equivalentes de hidruro de sodio por lotes. Después de la adición, la mezcla se agitó durante 0,5 horas; se añadieron gota a gota 1,05 equivalentes de yodopropano, se retiró el baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo la solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo, y la fase orgánica se combinó y se lavó con solución saturada de cloruro de sodio, la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida. La purificación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 2,9 g de 4,4-dimetil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona como aceite con un rendimiento del 60%.
1HRMN(400MHz, CDCla):57,33(m, 1H), 7,20-7,18(d, 1H), 7,10 (m, 1H), 6,96 (d, 1H), 3,91 (t, 2H), 1,76(m, 2H), 1,71(s, 6H), 1,02 (t, 3H)ppm.
2.4 Preparación de la 4,4-dimetil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol -2-ona
Figure imgf000028_0002
Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico en un matraz que contenía 2,0 g de 4,4-dimetil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona bajo baño de agua helada y se agitó intensamente durante 0,5 horas; se añadieron lentamente 1,1 equivalentes de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico gota a gota con un embudo de goteo, se mantuvo la temperatura del baño de hielo y se realizó la reacción durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 horas. Se filtró y la torta del filtro se lavó con abundante agua. El producto crudo se recristalizó con etanol para dar 1,8 g de 4,4-dimetil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona con un rendimiento del 78%.
1HRMN (400 MHz, CDCls): 58,25(dd, 1H)8,08 (d, 1 H), 7,06 (d, 1 H), 3,97 (t, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,76(s, 6H), 1,05 (t, 3H).
2.5 Preparación de la 6-Amino-4,4-dimetil-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol -2-ona
Figure imgf000028_0003
Se añadieron 1,8 g de 4,4-dimetil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en 100 ml de metanol y se añadieron 100 mg de paladio sobre carbono como catalizador bajo una atmósfera de nitrógeno. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno durante tres veces. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas, se eliminó el sólido y se concentró el filtrado. La purificación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,4 g de un sólido amarillo-marrón con un rendimiento del 90%.
1HRMN (400 MHz, CDCls): 56,76 (d, 1 H), 6,65 (dd, 1 H), 6,53 (d, 1 H), 3,84 (t, 2H), 3,34 (s, 2 H), 1,74 (m, 2H), 1,64 (s, 6H), 0,99 (t, 3H) ppm.
2.6 Preparación del compuesto 0304
Figure imgf000029_0001
Se añadieron 0,8 g de 6-amino-4,4-dimetiM-propiM,4-dihidrobenzoxazol-2-ona y 1,1 equivalentes de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo por lotes a DMF y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo y se secó sobre sulfato sódico anhidro. La fase orgánica se concentró y el producto crudo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,1 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 70%.
1HRMN (400 MHz, CDCls): 57,23 (dd, 1 H), 7,10 (d, 1H), 6,91 (d, 1H), 4,49 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 2,25 (s, 3H), 1,76 (m,2H), 1,67 (s, 6H), 1,03 (t, 3H) ppm.
Ejemplo 3 Preparación del compuesto 0706
3.1 Preparación de 4-metil-6-nitro-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000029_0002
Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico en un matraz que contenía 3,0 g de 4-metil-1,4-dihidrobenzoxazol -2-ona bajo baño de agua helada y se agitó intensamente durante 0,5 horas; se añadieron lentamente 1,1 equivalentes de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico gota a gota utilizando un embudo de goteo. Se mantuvo la temperatura del baño de hielo y la reacción se perfromó durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 h. Se filtró y la torta de filtración se lavó con abundante agua. El producto crudo se recristalizó con etanol para dar 2,5 g de 4-metil-6-nitro-1,4-dihidrobenzoxazol -2-ona con un rendimiento del 77%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,87 (s, 1H), 8,20-8,18 (d, 1 H), 8,13 (s, 1H), 7,07-7,05 (d, 1H), 5,68-5,64 (m, 1H), 1,64-1,62 (d, 3H) ppm.
3.2 Preparación de la 4-metil-6-nitro-1-etil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000029_0003
Se añadieron 3,0 g de 4-metil-6-nitro-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en 80 ml de N,N-dimetilformamida y se agitó la mezcla bajo baño de agua helada, se añadieron 1,05 equivalentes de hidruro de sodio por lotes, después de la adición, se agitó la mezcla durante 0,5h. Se añadieron gota a gota 1,05 equivalentes de yodoetano, se retiró el baño de agua helada y la reacción se llevó a cabo durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó y se lavó con cloruro sódico acuoso saturado, y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente y el exceso de yodoetano se destilaron a presión reducida para dar 3,1 g de 4-metil-6-nitro-1-etil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona. El siguiente paso se llevó a cabo sin purificación adicional y el rendimiento crudo fue del 85%.
3.3 Preparación de la 6-amino-4-metil-1-etil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona
Figure imgf000030_0001
Se añadieron 2,0 g de 4-metil-6-nitro-1-etil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona en metanol y se añadió carbono de paladio como catalizador. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno durante tres veces. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas y se eliminó el sólido para dar 1,7 g de sólido. El producto crudo no se sometió a una purificación adicional, y el rendimiento crudo fue del 89%.
3.4 Preparación del compuesto 0706
Figure imgf000030_0002
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metil-1-etil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona y 1 equivalente de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo a DMF y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente de unión de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró la fase orgánica. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,8 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 82%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,18 (s, 1H), 7,18-7,06 (m, 3H), 5,42 (m, 1H), 4,61 (s,2H), 3,86 (q, 2H), 2,22(s,3H),1,48 (d,3H), 1,19 (t, 3H)ppm.
Ejemplo 4 Preparación del compuesto 0708
El procedimiento de preparación del intermedio de 0708 fue el mismo que el de 0706, excepto que se utilizó 2-yodopropano en lugar de 1-yodoetano
Figure imgf000030_0003
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metil-1-isopropil-1,4-dihidrobenzoxazol-2-ona y 1 equivalente de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo a DMF y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró la fase orgánica. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,6 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 72%.1
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,19 (s, 1H), 7,20-7,07 (m, 3H), 5,29 (m, 1H), 4,61 (s,2H), 4,30 (m, 1H), 2,21(s,3H),1,50-1,44 (m,9H)ppm.
Ejemplo 5 Preparación del compuesto 0713
El procedimiento de preparación del intermedio de 0713 fue el mismo que el de 0706, excepto que se utilizó 1-yodoisobutilo en lugar de 1-yodoetano
Figure imgf000031_0001
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metiM-isobutiM,4-dihidrobenzoxazol-2-ona y 1 equivalente de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo a DMF y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró la fase orgánica. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,3 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 63%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,14 (s, 1H), 7,10-7,02 (m, 3H), 5,34 (q, 1H), 4,57 (s,2H), 3,69 (d, 2H), 2,23-2,17(m,4H),1,46 (d,3H),0,87-0,84(dd,6H)ppm.
Ejemplo 6 Preparación del compuesto 0715
El procedimiento de preparación del intermedio de 0715 fue el mismo que el de 0706, excepto que se utilizó 1-fluoro-3-yodopropano en lugar de 1-yodoetano
Figure imgf000031_0002
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metil-1-(3-fluoropropil)-1,4- dihidrobenzoxazol-2-ona y 1 equivalente de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo a DMF, y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró la fase orgánica. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,4 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 71%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,19 (s, 1H), 7,18-7,06 (m, 3H), 5,42 (q, 1H), 4,61 (s,2H), 4,61(t,1H),4,50(t,1H), 3,95 (t, 2H), 2,22 (s,3H),2,06-1,94 (m,2H), 1,51 (d,3H)ppm.
Ejemplo 7 Preparación del compuesto 0428
7.1 Preparación de la 1,4-Dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona
Figure imgf000031_0003
Se añadieron 3,0 g de alcohol 2-aminobenzílico y 1,6 g de urea a 80 ml de DMF, y se elevó la temperatura a 150°C. La reacción se realizó durante 12 horas. La reacción se inactivó mediante la adición de una solución saturada de cloruro de sodio y se extrajo con acetato de etilo durante tres veces. La fase orgánica se combinó y se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y ácido clorhídrico 2N para eliminar el alcohol 2-aminobencílico no reaccionado y la urea. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y se destiló a presión reducida para dar 3,0 g de 1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona. La pureza detectada por HPLC fue del 92%, y el siguiente paso se llevó a cabo sin purificación adicional. El rendimiento fue del 83%.1
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 55,27(s, 2H),6,85-7,27(m, 4H), 10,15(s, 1H) ppm.
7.2 Preparación de la 1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona
Figure imgf000032_0001
Se añadieron 2,0 g de 1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona a 80 ml de N,N-dimetilformamida, y se añadieron 1,05 equivalentes de hidruro de sodio por lotes mientras se agitaba bajo baño de agua helada. Después de la adición, la mezcla se agitó durante 0,5 horas; se añadieron gota a gota 1,05 equivalentes de yodopropano, se retiró el baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida para dar 2,2 g de 1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona como aceite. La pureza detectada por HPLC fue del 92% y el siguiente paso se llevó a cabo sin purificación adicional. El rendimiento fue del 88%.
7.3 Preparación de la 6-nitro-1-propil-1,4-dihidro-2H-3, 1-benzoxazin-2-ona
Figure imgf000032_0002
Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico a un matraz que contenía 2 g de 1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona bajo baño de agua helada, y se agitó intensamente durante 0,5 h; se añadieron lentamente 1,1 equivalentes de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico gota a gota utilizando un embudo de goteo. Se mantuvo la temperatura del baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 h. Se filtró y la torta de filtración se lavó con abundante agua. Se secó bajo luz infrarroja y el producto crudo se recristalizó con etanol para dar 1,8 g de 6-nitro-1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona con un rendimiento del 77%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 50,93(t, 3H),1,63(m, 2H), 3,85(t, 2H), 5,39(s, 2H), 7,37(m, 1H), 8,22(m, 2H) ppm.
7.4 Preparación de la 6-amino-1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona
Figure imgf000032_0003
Se añadieron 1,8 g de 6-nitro-1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona al metanol, y se añadió carbón de paladio como catalizador. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno durante tres veces. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas y se eliminó el sólido. El filtrado se concentró para dar 1,4 g de 6-amino-1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona. El siguiente paso se llevó a cabo sin purificación adicional. El rendimiento crudo fue del 90%.
7.5 Preparación del cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo
Figure imgf000033_0001
Se disolvieron 1,0 g de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilo y 1 equivalente de tiourea en 40 ml de etanol y se calentaron lentamente a reflujo. Tras 4-6 horas de reacción, la solución de reacción se concentró para dar un sólido blanco. Se añadieron 10 ml de acetonitrilo y 4 ml de ácido clorhídrico concentrado. La temperatura se controló por debajo de 5-10°C, y se añadieron 2,25 g de clorito sódico por lotes con agitación intensa. La reacción se realizó a 15-20°C durante 8-16 horas. La reacción se detuvo añadiendo agua y se extrajo con acetato de etilo durante tres veces. El licor del extracto se concentró para dar cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo. El siguiente paso se llevó a cabo sin purificación adicional.
7.6 Preparación del compuesto 0428
Figure imgf000033_0002
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-1-propil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona y 1,2 equivalentes de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo a 20 ml de DMF, y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró. El producto crudo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,5 g del compuesto 0428 con un rendimiento del 70%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 50,92(t, 3H), 1,60(m, 2H), 2,27 (s, 3H), 3,77(t, 2H), 4,60(s, 2H), 5,17(s, 2H), 7,10-7,18(m, 3H), 10,19(s, 1H) ppm.
Ejemplo 8 Preparación del compuesto 1022B (no según la invención) 8.1 Preparación de la 1-propil-2(1H)-quinolinona
Figure imgf000033_0003
Se añadieron 4,0 g de 2-hidroxiquinolina a 100 ml de DMF y se agitó bajo baño de agua helada. Se añadieron 1,1 equivalentes de hidruro de sodio en l lotes. Tras la adición, se mantuvo la temperatura y se agitó la mezcla durante 0,5 horas; se añadieron gota a gota 1,1 equivalentes de yodopropano, y se retiró el baño de hielo y agua, la reacción se llevó a cabo durante 12 horas; la reacción se inactivó con una solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida para dar un producto crudo aceitoso. La separación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 3,3 g de 1-propil-2(1H)-quinolinona como líquido aceitoso incoloro con un rendimiento del 62%.1
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 50,95(t, 3H), 1,62(m, 2H), 4,18(t, 2H), 6,63(d, 1H), 7,25(t,1H), 7,60(m, 2H), 7,72(d, 1H), 7,90(d, 1H) ppm.
8.2 Preparación de la 6-nitro-1-propil-2(1H)-quinolinona
Figure imgf000034_0001
Se añadieron 40 ml de ácido sulfúrico a un matraz que contenía 2,0 g de 1-propil-2(1H)-quinolinona bajo baño de agua helada, y se agitó intensamente durante 0,5 horas; se añadieron lentamente gota a gota 15 ml de 1,1 equivalentes de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico con un embudo de goteo. Se mantuvo la temperatura del baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 horas. Se filtró y la torta del filtro se lavó con abundante agua. El secado se realizó bajo luz infrarroja. El producto crudo se recristalizó con etanol para dar 1,7 g de 6-nitro-1-propil-2(1H)-quinolinona con un rendimiento del 72%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-da): 50,95(t, 3H), 1,63(m, 2H), 4,24(t, 2H), 6,76(d,1H), 7,76(d,1H), 8,12 (d,1 H), 8,35(d, 1H), 8,71(s,1H) ppm.
8.3 Preparación de la 6-amino-1-propil-2(1H)-quinolinona
Figure imgf000034_0002
Se añadieron 1,7 g de 6-nitro-1-propil-2(1H)-quinolinona a 80 ml de metanol, y se añadió carbón de paladio como catalizador. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno durante tres veces. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas y se eliminó el sólido. El filtrado se concentró para dar 1,4 g de 6-amino-1-propil-2(1H)-quinolinona. El producto crudo se obtuvo sin purificación adicional y el rendimiento fue del 90%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-da): 50,92(t, 3H), 1,60(m, 2H), 4,08(t, 2H), 5,08(s, 2H), 6,46 (d,1H), 6,79(s, 1H), 6,94 (d,1H), 7,29(d, 1H), 7,66 (d, 1H) ppm.
8.4 Preparación del cloruro de p-metilhalobencilsulfonilo
Figure imgf000034_0003
Se añadieron 1,0 g de bromuro de p-metilbencilo y 1 equivalente de tiourea a 40 ml de etanol y luego se calentó lentamente a reflujo y la solución se volvió clara. Tras 4-6 horas de reacción, la solución de reacción se concentró para dar un sólido blanco. Se añadieron 10 ml de acetonitrilo y 4 ml de ácido clorhídrico concentrado. La temperatura se controló por debajo de 5-10 °C, se añadieron 2,25 g de clorito sódico por lotes con agitación intensa. La reacción se realizó a 15-20°C durante 8-16 horas. La reacción se detuvo añadiendo agua y se extrajo con acetato de etilo durante tres veces. El licor del extracto se concentró para dar cloruro de p-metilbencilsulfonilo. El producto crudo se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación.
8.5 Preparación del compuesto 1022B
Figure imgf000035_0001
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-1-propil-2(1H)-quinolinona y 1,2 equivalentes de cloruro de p-metilbencilsulfonilo a 20 ml de DMF, y se añadieron 3 equivalentes de carbonato de potasio como agente aglutinante de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó durante 12-16 horas. Después, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo durante tres veces y la fase orgánica se combinó y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró y el producto crudo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,3 g del compuesto 1022B con un rendimiento del 70%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 50,95(t, 3H), 1,62(m, 2H), 2,27 (s, 3H), 4,18(t, 2H), 4,42 (s, 2H), 6,60 (d, 1H), 7,12-7,17(m, 4H), 7,40(d, 1H), 7,45(s, 1H), 7,55(d, 1H), 7.83(d, 1H) ppm; 13CRMN (100 MHz, DMSO-d6) 5 11.53, 20.99, 21.54, 43.35, 57.34,116.08, 119.20, 121.17, 122.14, 124.01, 126.89, 129.46, 131.34, 133.02, 135.97, 138.12, 139.45, 161.12 ppm.
Ejemplo 9 Preparación del compuesto NC0F4
9.1 preparación de 2-aminometil-4-nitroanilina
Figure imgf000035_0002
Se añadieron 5,0 g de 2-ciano-4-nitroanilina a 200 ml de tetrahidrofurano seco, y se añadieron gota a gota 3,5 equivalentes de solución de borano tetrahidrofurano y se agitó bajo baño de agua helada. Tras la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche; la reacción se inactivó añadiendo lentamente, gota a gota, la solución saturada de cloruro de amonio. La mezcla se extrajo añadiendo diclorometano. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida para dar 4,2 g de 2-aminometil-4-nitroanilina con un rendimiento del 83%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 58,05(d, 1H), 7,88(dd, 1H), 6,70-6,59(m, 3H), 3,63(s, 2H)ppm.
9.2 preparación de la 6-nitro-3,4- dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000035_0003
Se añadieron 4,5 g de 2-aminometil-4-nitroanilina a 250 ml de tetrahidrofurano seco y se añadieron 1,5 equivalentes de CDI bajo agitación. Tras la adición, la mezcla se calentó a reflujo y se agitó durante la noche; se destiló el tetrahidrofurano a presión reducida y la mezcla se extrajo con agua y diclorometano. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro para dar 6-nitro-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona con un rendimiento del 74%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 59,78(s, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,04(m, 1H), 7,17(d, 1H), 6,93(d, 1H), 4,43(s, 2H)ppm.
9.3 Preparación de la 1-propil-6-nitro-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000035_0004
El procedimiento de síntesis es el mismo que el del Ejemplo 7.2, excepto que se utiliza 6-nitro-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona en lugar de 1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-cetona. El producto crudo se sometió directamente al siguiente paso sin purificación adicional, y el rendimiento crudo fue del 56%.
9.4 Preparación de la 1-propil-6-amino-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona.
Figure imgf000036_0001
El procedimiento de síntesis es el mismo que el del Ejemplo 7.4, excepto que se utiliza 1-propil-6-nitro-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona en lugar de 6-nitro-1-propil 1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona. El producto crudo no se sometió a una purificación adicional, el rendimiento crudo fue del 87%.
9.5 Preparación del NC0F4
Figure imgf000036_0002
El procedimiento de síntesis es el mismo que el del Ejemplo 7.6, excepto que se utiliza 1-propil-6-amino-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona en lugar de 6-amino-1-propil-1,4-dihidro -2H-3,1- benzoxazin-2-ona.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,0(s, 1H), 7,06-6,90(m, 4H,), 4,56(s, 2H), 4,20(s, 2H), 3,69(s, 2H), 2,24(s, 3H), 1,52(m,2H), 0,89(t, 3H)ppm.
Ejemplo 10 Preparación del compuesto 1028c
10.1 Preparación de la amina del ácido N-(1-(2-aminofenil)etiliden)-t-butilsulfínico
Figure imgf000036_0003
Se añadieron 2,0 g de 2-aminoacetofenona y 1 equivalente de tert-butilsulfinamida a 2 equivalentes de titanato de tetraetilo, se llenó de nitrógeno y se selló el tubo y se calentó a 75 °C y la mezcla se agitó durante 16 horas y se enfrió a temperatura ambiente, y se vertió en salmuera helada, se inactivó la reacción y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 2,7 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 74%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 7,66 (d, 1 H), 7,43 (s, 2H), 7,20(t, 1 H), 6,75 (d, 1 H), 6,58 (t, 1H), 2,68(s, 3H), 1,18(s,9H) ppm.
10.2 Preparación de la amina del ácido N-(1-(2-aminofenil)-t-butilsulfínico
Figure imgf000036_0004
Se disolvieron 2,5 g de amina de ácido N-(1-(2-aminofenil)etiliden)t-butilsulfínico en tetrahidrofurano anhidro absoluto, se controló la solución a -78 °C, y se añadió lentamente gota a gota el complejo de dimetilsulfuro de borano en solución de tetrahidrofurano bajo una atmósfera de nitrógeno. Tras la adición, la mezcla se agitó durante 3 horas; la reacción se inactivó añadiendo gota a gota la salmuera saturada, y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 2,3 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 91%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 57,16(d, 1 H), 6,96 (t, 1H), 6,64(d, 1 H), 6,56(t, 1 H), 5,37(d,1H),4,95 (s, 2H), 4,40(m, 1H), 4,14(d,3H) 1,11(s,9H)ppm.
10.3 Preparación de 2-(1-aminoetil)anilina
Figure imgf000037_0001
Se disolvieron 2,2 g de amina de ácido N-(1-(2-aminofenil)etil)-t-butilsulfínico en metanol y ácido clorhídrico 4M (1:1), y la solución se agitó durante la noche; y se concentró bajo presión reducida, y el pH se ajustó a alcalino. La reacción extraída se realizó añadiendo salmuera saturada / acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró a presión reducida para dar 1,2 g de producto con un rendimiento del 91%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 57,05(d, 1 H), 6,89 (t, 1H), 6,56(d, 1 H), 6,50(t,1H),5,27(s,2H),4,03 (q, 1H), 3,37(en pico de agua)1,27(d,3H)ppm.
10.4 Preparación de 4-metil-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000037_0002
Se disolvieron 1,2 g de 2-(1-aminoetil)anilina en 70 ml de tetrahidrofurano anhidro, se añadieron 1,2 equivalentes de trifosgeno (BTC) en lotes y la reacción se realizó a temperatura ambiente durante 12 horas; la reacción se inactivó añadiendo una solución de HCl 1M y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente se destiló a presión reducida para dar 1,2 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 82%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 59,06(s,1H),7,12-6,84(m, 4 H), 6,77 (d, 1H), 4,45(m, 1H), 1,31(d, 3H)ppm.
10.5 Preparación de 4-metil-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000037_0003
Se añadieron 1,2 g de 4-metil-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona a 80 ml de N,N-dimetilformamida, y se añadieron 1,05 equivalentes de hidruro de sodio por lotes y se agitó bajo baño de agua helada. Después de la adición, la mezcla se agitó durante 0,5 h; se añadieron gota a gota 1,05 equivalentes de yodopropano, se retiró el baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 12 h; la reacción se inactivó añadiendo la solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con acetato de etilo, y la fase orgánica se combinó y se lavó con solución saturada de cloruro de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente y el exceso de yodopropano se destilaron a presión reducida para dar 1,4 g de producto aceitoso, que no se sometió a una purificación adicional, y el rendimiento fue del 92%.
10.6 Preparación de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000038_0001
Se añadieron 20 ml de ácido sulfúrico a un matraz que contenía 1,2 g de 4-metil-1-propil-3,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona bajo baño de hielo y la mezcla se agitó intensamente durante 0,5 horas; se añadieron lentamente 1,1 equivalentes de nitrato de potasio en solución de ácido sulfúrico gota a gota a través de un embudo de goteo, se mantuvo la temperatura del baño de hielo y la reacción se llevó a cabo durante 1-2 horas; la solución de reacción se vertió en agua helada y se agitó durante 0,5 horas. Se filtró y la torta del filtro se lavó con abundante agua. El producto crudo se recristalizó con etanol para dar 1,1 g de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona con un rendimiento del 72%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 58,11(dd, 1H)8,10 (s, 1 H), 7,54 (d, J=1,6 Hz,1 H), 7,18(d, J=8,8 Hz,1H),4,62 (m, 1H), 3,81 (m, 2H), 1,55(m, 2H), 1,33(d, 3H),0,90 (t, 3H)ppm.
10.7 Preparación de la 6-amino-4-metil-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona
Figure imgf000038_0002
Se añadieron 1,1 g de 4-metil-6-nitro-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona a 100 ml de metanol, y se añadieron 40 mg de carbono de paladio como catalizador bajo una atmósfera de nitrógeno. El sistema de reacción se recargó con hidrógeno durante tres veces. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. La solución de la reacción se filtró a través de un embudo de arena de vidrio cargado con tierra de diatomeas, se eliminó el sólido y se concentró el filtrado. La purificación se realizó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,2 g de un sólido amarillo-marrón con un rendimiento del 93%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 56,75 (s, 1 H), 6,65 (d, J=8,8 Hz,1 H), 6,46 (dd, 1 H), 6,37 (d, J=2,0 Hz,1H), 4,75 (s, 2 H), 4,26(m, 1H), 3,67 (m, 2H),1,51(m, 2H),1,25(d, J=6,4 Hz,3H) 0,86 (t, J=7,2 Hz,3H) ppm.
10.8 Preparación del 1028c
Figure imgf000038_0003
Se añadieron 1,0 g de 6-amino-4-metil-1-propil-1,4-dihidroquinazolin-2(1H)-ona y 1,1 equivalentes de cloruro de 2,3,5,6-tetrafluoro-4-metilbencilsulfonilo en lotes a DMF y se añadieron 3 equivalentes de trietilamina (TEA) como agente de unión de ácidos. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 12-16 horas. Una vez completada la reacción, se añadió agua helada y la mezcla se extrajo con acetato de etilo y se secó sobre sulfato sódico anhidro. La fase orgánica se concentró y el producto crudo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice para dar 1,1 g de un sólido amarillo claro con un rendimiento del 70%.
1HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 510,0(s,1H),7,07-7,04 (m, 2 H), 6,98(d, J=2,4 Hz,1H), 6,92 (d, J=8,8 Hz,1H), 4,56 (s, 2H), 4,35(m,1H), 3,75 (m, 2H), 3,03 (s, 3H), 1,52 (m, 2H), 1,25 (d, J=6,4 Hz, 3H), 0,87 (t, J=7,2 Hz, 3H) ppm.
Ejemplo 11 Ensayo in vitro de la actividad del compuesto 0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715, 1028c, 0428, l022B (no según la invención) y NC0F4
Los experimentos bioquímicos in vitro sugirieron que un múltiplo de compuestos de la presente invención, como los agonistas eficientes del receptor PYL, tenían altas afinidades de unión a una pluralidad de receptores PYL y promovían la unión de los receptores PYL e inhibían la actividad de la proteína fosfatasa PP2C.
11.1 Experimentos bioquímicos in vitro y prueba de actividad de la proteína fosfatasa PP2C
Los resultados se mostraron en la Figura 1a-1g. El experimento de actividad de la proteína fosfatasa HAB1, en el que se utilizó un polipéptido fosforilado por SnRK2.6 fosforilado se utilizó como sustrato, mostró que todos los compuestos 0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715, 1028c, 0428, 1022B (no según la invención) y NC0F4 podían promover la unión entre el receptor PYL2 y la proteína fosfatasa PP2C (HAB1), inhibiendo así el efecto de desfosforilación de HAB1 sobre el polipéptido fosforilado SnRK2.6. Además, a baja concentración, el efecto de la mayoría de los compuestos fue mejor o significativamente mejor que el del ABA a la misma concentración.
11.2 Experimento AlphaScreen
Se utilizó la tecnología AlphaScreen para probar la capacidad de los compuestos de la presente invención para promover la unión del receptor PYL a la proteína fosfatasa PP2C (HAB1).
Los resultados experimentales mostraron que había un efecto dependiente de la dosis de los compuestos 0224 y 0304 sobre la capacidad de unión del complejo de receptores PYL -proteína fosfatasa HAB1. En el caso de los receptores PYR1, PYL1, PYL2 y PYL7 de Arabidopsis, los compuestos 0224 y 0304 tuvieron una afinidad significativamente mayor por los receptores que el ABA, siendo el valor de la EC50 de 0224 y 0304 con el complejo receptor PYR1 - proteína fosfatasa hAb 1 de 1/40 y 1/24 del ABA, respectivamente (Fig. 2a). 2a), el valor EC50 de 0224 y 0304 con el complejo receptor PYL1 - proteína fosfatasa HAB1 fue de 1/8 y 1/7 de ABA, respectivamente (Fig. 2b), el valor EC50 de 0224 y 0304 con el complejo receptor PYL2 - proteína fosfatasa HAB1 fue de 1/29 y 1/15 de ABA, respectivamente (Fig. 2c), el valor EC50 de 0224 y 0304 con el complejo receptor PYL7 - proteína fosfatasa HAB1 fue de 1/10 de ABA (Fig. 2d). Los compuestos 0706, 0708, 0713, 0715, 0428, 1022B (no según la invención) y NC0F4 también mostraron una mejor afinidad por el receptor PYL2 que el ABA, donde el valor de la EC50 de 0706, 0708, 0713 y 0715 fue aproximadamente 1/5-1/8 del ABA (Figura 2e). El valor EC50 del compuesto 0428 fue aproximadamente 1/8 del de ABA (Fig. 2f), el valor EC50 de 1022B (no según la invención) fue un orden de magnitud inferior al de ABA (Fig. 2g), y la capacidad de unión del receptor PYL2 a HAB1 tiene un efecto dependiente de la dosis con los compuestos mencionados. El compuesto NCOF4 mostró una mejor afinidad por el receptor PYR1 que el ABA, con un valor EC50 de aproximadamente 1/11 del ABA (Fig. 2h).
Los resultados anteriores sugirieron que los compuestos 0224, 0304, 0706, 0708, 0713, 0715, 1028c, 0428, 1022B (no según la invención) y NC0F4 fueron los agonistas del receptor PYL más eficientes que el ABA.
Además, los experimentos utilizando GmPYL6 de soja (gen homólogo de Arabidopsis PYL2) y OsPYL2 de arroz (gen homólogo de Arabidopsis PYL2) y AtHAB 1 de Arabidopsis mostraron que el compuesto 0428 también tenía afinidades significativamente más altas para la proteína GmPYL6 de soja y la proteína OsPYL2 de arroz que la de ABA, y el valor EC50 era sólo alrededor de 1/14 y 1/3 de ABA, respectivamente.
Los resultados anteriores sugirieron que el anterior múltiplo de compuestos de la presente invención era una serie de agonistas del receptor PYL más eficiente que los compuestos existentes como el ABA.
Además, cuando las concentraciones de otros compuestos de la presente invención probados in vitro oscilaron entre 0,01 y 100 |j M, todos los compuestos de la presente invención mostraron una afinidad significativa por el receptor PYR/PYL.
Ejemplo 12 Ensayo de inhibición de la germinación y de actividad de resistencia a la sequía para una pluralidad de compuestos de la presente invención (tal como 0428, 0224, 0304, 0706, 0715, etc.)
12.1 Efecto de inhibición en la germinación de semillas de Arabidopsis
Los resultados se mostraron en la Figura 3 y en la Figura 15. Se tomaron como ejemplo los compuestos 0224 y 0428.
1 j M del compuesto 0224 o 2 j M del compuesto 0428 pudieron inhibir la germinación de semillas del ecotipo Col-0, pero no pudieron inhibir la germinación de semillas del triple mutante PYR/PYL pyrl; pyll; pyl4. Los resultados anteriores mostraron que el efecto inhibidor de la germinación de los compuestos de la presente invención (tal como los compuestos 0224 y 0428) se debió a la activación de una vía intrínseca de señalización del ABA en la planta, en lugar de causar toxicidad a la semilla de la planta.
12.2 Inhibición de la transpiración foliar en Arabidopsis, soja, algodón y trigo
En este experimento, el cambio de temperatura de la superficie de la hoja fue observado y registrado por una cámara infrarroja, reflejando así la fuerza de la transpiración de la planta. Cuanto mayor sea la transpiración, menor será la temperatura de la hoja.
Los resultados del experimento de transpiración de las hojas de Arabidopsis se muestran en la Figura 4. Después de asperjar 5 pM de ABA, el compuesto 0224 (Figura 4a) o el compuesto 0304 (Figura 4b) sobre Arabidopsis aba2-1, la temperatura de las hojas fue mayor que la del grupo de control con DMSO, lo que indica que las plantas tratadas con el compuesto tenían una transpiración más débil. Cuatro días después de la aspersión, la temperatura de las hojas de las plantas rociadas con el compuesto 0224 o 0304 seguía siendo significativamente más alta que la del control DMSO, incluso después de que la concentración se redujera a 2 pM o 1 pM, cuatro días después de la aspersión, la temperatura de las hojas de las plantas rociadas con la concentración correspondiente del compuesto 0224 seguía siendo significativamente más alta que la del control DMSO (Figura 4b), mientras que cuatro días después de la aspersión, la temperatura de la superficie de las hojas de la planta rociada con 5 pM de ABA había descendido al nivel anterior a la aspersión. Los resultados anteriores mostraron que el efecto inhibitorio de los compuestos 0224 y 0304 sobre la transpiración de las hojas de Arabidopsis thaliana fue mejor que el del ABA, y hubo un efecto dependiente de la dosis en la inhibición de la transpiración, en el que el 0224 tuvo un mejor efecto. Después de asperjar Arabidopsis aba2-1 con 5 pM del compuesto 0706 o 0715, la temperatura de la hoja también aumentó significativamente en comparación con el tratamiento de control (DMSO) y la duración fue equivalente a la del 0224 (Figura 4c). Por otro lado, la temperatura de la hoja tratada con el compuesto 5 pM/2 pM/1 pM 0428 durante un día también fue mayor que la del grupo de control con DMSO, indicando que la transpiración de las plantas tratadas con el compuesto se debilitó, y mientras tanto el compuesto 0428 tuvo un efecto dependiente de la dosis en la inhibición de la transpiración (Fig. 4d).
Los resultados de los experimentos de transpiración de las hojas en la soja, el algodón y el trigo se muestran en la Fig. 5 y la Fig. 6. Los experimentos sobre la inhibición de la transpiración de las hojas en la soja mostraron que dos días después de la aspersión, para las plantas rociadas con 20 pM del compuesto 0224 o 0304, la temperatura de las hojas seguía siendo significativamente más alta que la de las plantas del grupo de control rociadas con DMSO, lo que indicaba que la transpiración de las hojas de soja seguía estando inhibida en ese momento, mientras que la temperatura de las hojas de las plantas rociadas con la misma concentración de ABA no presentaba ninguna diferencia con respecto a la del grupo de control (Figura 5). Los experimentos sobre la inhibición de la transpiración de la hoja en el algodón mostraron que dos días después de la aspersión, para las plantas rociadas con 20 pM del compuesto 0224, la temperatura de la hoja seguía siendo significativamente más alta que la de las plantas del grupo de control rociadas con DMSO, mientras que la temperatura de la hoja de las plantas rociadas con la misma concentración de ABA no tenía ninguna diferencia con la del grupo de control (Figura 6). Los experimentos sobre la inhibición de la transpiración de las hojas en el trigo mostraron que un día después de la aspersión, en el caso de las plantas rociadas con 100 pM del compuesto 0224 o ABA, la temperatura de las hojas seguía siendo significativamente mayor que la de las plantas del grupo de control asperjado con DMSO, lo que indica que la transpiración de las hojas de trigo seguía estando inhibida en ese momento (Figura 16). Los resultados mostraron que el compuesto 0224 no sólo puede inhibir la transpiración de las hojas en los cultivos de dicotiledóneas, como la soja y el algodón, sino que también puede inhibir la transpiración de las hojas en los cultivos de monocotiledóneas, como el trigo. Los resultados anteriores mostraron que los compuestos 0224 y 0304 en la soja y el compuesto 0224 en el algodón y el trigo también tuvieron el mismo efecto de inhibición de la transpiración de las hojas que en Arabidopsis thaliana.
12.3 La resistencia potenciada a la sequía en Arabidopsis, soja, algodón, maíz y trigo
Se dejó de regar el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana que había crecido en el suelo durante dos semanas, se asperjó la hoja con una solución que contenía 5 pM del compuesto 0224/0706/0715 o 0,05% de DMSO (control) una vez a la semana durante la sequía, con una cantidad de asperjado de 2 ml de solución/maceta, dos veces en total y se añadió un tensioactivo Tween-20 al 0,05% (v/v) a la solución para mejorar el efecto penetrante del agente de asperjado en la epidermis de la hoja. Después de cuatro semanas de tratamiento de sequía, el grupo de control asperjado con DMSO había muerto por la sequía, mientras que las plantas rociadas con 5 pM del compuesto 0224/0706/0715 seguían sobreviviendo (FIG. 7 ). Se realizó el mismo procedimiento para el tratamiento de la sequía y se fotografió la Arabidopsis tratada con (+)-ABA o 0428 dos semanas después de la sequía. Como se muestra en la Figura 12, debido a la baja concentración, el crecimiento de las plantas rociadas con 5 pM (+)-ABA no tuvo ninguna diferencia con el de las plantas del grupo de control asperjado con DMSO, mientras que el crecimiento de Arabidopsis rociada con 5 pM 0428 fue significativamente mejor que el de las plantas del grupo de control asperjado con DMSO y las plantas rociadas con 5 pM (+)-ABA.
La soja se sembró durante 14 días y el algodón durante 25 días, respectivamente. Se seleccionaron plantas del mismo tamaño para los experimentos de sequía en el suelo. La soja se asperjó con una solución acuosa que contenía 20 pM del compuesto ABA/0224/0304 o 0,05% de DMSO (control) una vez después del inicio de la sequía, mientras que el algodón se asperjó con una solución acuosa que contenía 20 pM del compuesto ABA/0224 o 0,05% una vez cada 3 días después del inicio de la sequía. A la solución anterior se añadió el tensioactivo Tween-20 al 0,1% (v/v) para mejorar el efecto de penetración del agente de aspersión en la epidermis de las hojas. Al volver a regar después de 6 días de sequía, la soja rociada con 20 pM del compuesto 0224 o 0304 (Fig. 8) y el algodón asperjado con 20 pM del compuesto 0224 (Fig. 9) tuvieron un crecimiento significativamente mejor después de volver a regar que el grupo de control asperjado con DMSO y las plantas rociadas con la misma concentración de ABA.
En otro grupo de experimentos, se llevaron a cabo experimentos de sequía en el suelo en plantas de soja con tres hojas en tres grupos o en plantas de maíz durante el período de la trompeta pequeña del mismo tamaño. Tras el inicio de la sequía, se asperjó una solución acuosa que contenía 50 pM del compuesto 0428 o 0,05% de DMSO (control) una vez al día durante dos días, y también se añadió a la solución el tensioactivo Tween-20 al 0,1% (v/v). Se volvió a regar después de 4 días de tratamiento de sequía para el maíz y después de 9 días de tratamiento de sequía para la soja, respectivamente, la soja (Figura 14a) y el maíz (Figura 14b) asperjados con 50 pM de compuesto 0428 tuvieron un crecimiento significativamente mejor después de volver a regar que el grupo de control asperjado con DMSO.
En otro grupo de experimentos, se sembró trigo durante 16 días y se seleccionaron plantas del mismo tamaño para los experimentos de sequía en el suelo. El trigo se asperjó con una solución acuosa que contenía 100 pM del compuesto ABA/0224 o 0,1% de DMSO (control) una vez cada 3 días después del inicio de la sequía, y se añadió a la solución anterior el tensioactivo Tween-20 al 0,1% (v/v) para mejorar el efecto de penetración del agente de asperjado en la epidermis de la hoja. Tras 6 días de sequía, el trigo del grupo de control se marchitó, mientras que el trigo tratado con 100 pM del compuesto 0224 o ABA se mantuvo erguido, y el crecimiento fue significativamente mejor que el del grupo de control (DMSO) (FIG. 16 ).
Los resultados anteriores mostraron que los compuestos de la presente invención tenían un efecto significativo de mejora de la resistencia a la sequía tanto en plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas.
Ejemplo 13 el compuesto 1022B podría inducir la expresión del gen relacionado con el estrés que responde al ABA (no según la invención)
Los inventores analizaron el efecto del compuesto 1022B añadido exógenamente sobre la expresión de los genes de la planta.
Los resultados del análisis de expresión génica mostraron que el compuesto 1022B podía inducir la expresión de genes relacionados con el estrés que responden al ABA, y la mayoría de los niveles de expresión eran iguales o superiores a los inducidos por el a Ba exógeno a la misma concentración (Fig. 10). Entre las plantas de semillero de 10 días de edad de Arabidopsis thaliana de tipo salvaje (Col-0), el nivel de expresión de 4 genes conocidos relacionados con el estrés ambiental inducido por a Ba (COR i 5a, COR47, RAB18 y RD29b) se incrementó significativamente después del tratamiento con 10 pM del compuesto 1022B, que superó significativamente el nivel en las plantas tratadas con 10 pM de ABA al mismo tiempo.
Los resultados mostraron que el efecto de inducción del compuesto 1022B en la mayoría de los genes relacionados con el estrés ambiental fue significativamente mejor que el del ABA.
Ejemplo 14 Estructura del complejo PYL2-0428-HAB1
La estructura cristalina del complejo PYL2-0428-HAB 1 formado con el compuesto 0428 de la presente invención se examinó utilizando el procedimiento de análisis de cristales de proteínas descrito en el procedimiento general. La resolución del cristal del complejo PYL2-0428-HAB1 es de 2,4 angstroms, y el control es a Ba . En la Fig. 11a y 11b se muestran los bocetos de la estructura bidimensional de dos cristales complejos.
Como se ve en la Fig. 11a y 11b, 0428 estaba presente en la estructura de bolsillo de PYL2, y cuatro átomos de oxígeno en la estructura de ABA podían formar enlaces de hidrógeno con múltiples residuos de aminoácidos en la estructura de bolsillo de PYL2 y HAB1 por medio de varias moléculas de agua. Los átomos de oxígeno y los átomos de nitrógeno del grupo sulfonamida del compuesto 0428, así como los átomos de oxígeno del anillo de quinoleína, también podrían formar enlaces de hidrógeno. Además, los sustituyentes halógenos (átomo de flúor) en el p-xileno también podrían formar enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos en la estructura de bolsillo de PYL2 para mejorar aún más la afinidad del compuesto 0428 al receptor PYL2.
Debe entenderse que, después de leer las enseñanzas anteriores de la presente invención, los expertos en la materia pueden realizar diversos cambios o modificaciones que entran en el ámbito de las reivindicaciones tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato del mismo,
Figure imgf000042_0001
donde,
R1 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R2 es H, halógeno, alquilo Ci-C3 o haloalquilo Ci-C3;
R3 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R4 es H, halógeno, alquilo C1-C3 o haloalquilo C1-C3;
R5 es halógeno, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, SF5 o cicloalquilo C3-C8;
R6 es alquilo C1-C7 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C7 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C7 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, o -Ra-O-Rb sustituido o no sustituido, en el que Ra es alquileno C1-C2 y Rb es H, alquilo C1-C3; y sustituido significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, - CN, -N(Rb)2, y nitro;
R7 se selecciona del grupo que consiste en: H, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, heterociclilo C5-C10 sustituido o no sustituido, Rc-C(O)-, -ORb, -CN y -N(Rb)2; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido; en el que el heterociclilo contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados entre N, O, S, y el sustituido significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, -CN, -N(Rb)2, y nitro;
Rs, R9, R10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en:
(i) H;
(ii) alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C3-C8, cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, halógeno, Rc-C(O)-, -OH, -NH2; Rc se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, mercapto, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido; donde sustituido significa sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -ORb, - CN, -N(Rb)2, y nitro;
R11 es H, alquilo C1-C3, o haloalquilo C1-C3;
X es NR13, O, o S, donde R13 no es ninguno, o se selecciona del grupo que consiste en: H, halógeno, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, alquinilo C2-C3, haloalquilo C1-C3y una combinación de los mismos;
m=1 o 2;
representa un enlace simple o un enlace doble.
2. El compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato, del mismo de la reivindicación 1, donde el compuesto tiene una estructura de fórmula Ia:
Figure imgf000043_0001
donde las definiciones de R1-R10, y m se describen como arriba.
3. El compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato, del mismo de la reivindicación 1, donde el compuesto tiene una estructura de fórmula Ib:
Figure imgf000043_0002
4. El compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato, del mismo de la reivindicación 1, donde el compuesto tiene una estructura de fórmula Ic:
Figure imgf000043_0003
donde las definiciones de R1-R10, m se describen como arriba.
5. El compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato del mismo de la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001

Figure imgf000046_0001
6. El compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico o un racemato, o un solvato del mismo de la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000047_0001
7. Uso de un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo de la reivindicación 1 para la preparación de una formulación agrícola o una composición, que se utiliza para (i) la mejora de la resistencia al estrés de las plantas; (ii) la preparación de un agonista para el receptor de ABA; y/o (iii) la preparación de un inhibidor de la germinación de semillas.
8. Una formulación agrícola que comprende:
(i) un compuesto representado por la fórmula (I), o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo de la reivindicación 1; y
(ii) un portador agrícola aceptable.
9. Un procedimiento para mejorar la resistencia de la planta al estrés, en el que se administra a una planta un compuesto de fórmula I, o una sal, o un isómero óptico, o un racemato, o un solvato del mismo de la reivindicación 1 o una formulación agrícola de la reivindicación 8.
10. Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo, que comprende los pasos de: (a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula I-A con un compuesto de fórmula I-S2 en un disolvente inerte, formando así un compuesto de fórmula I;
Figure imgf000047_0002
En cada fórmula, Ri, R2, R3, R4 , Rs, R6, R7 , Rs, R9, R10, R11, m, X, y se definen como en la reivindicación 1.
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