ES2920052T3 - Formulaciones de alicaforsen - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con una nueva formulación del oligonucleótido de SEQ ID NO: 1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Formulaciones de alicaforsen
La presente invención es como se establece en las reivindicaciones y se refiere a una nueva formulación del oligonucleótido de SEQ ID NO:1.
Las superficies mucosas representan la primera interfaz entre el entorno interno del organismo anfitrión y el entorno externo. Por lo tanto, las superficies de las mucosas están enriquecidas con una variedad de estructuras celulares y acelulares que protegen al huésped de la exposición a patógenos o antígenos extraños. Estas importantes superficies están representadas por las superficies mucosas de la cavidad oral y nasal (senos), los sistemas pulmonar y digestivo y los tejidos mucosos que rodean el ojo.
Las células que componen la mucosa están equipadas para detectar y responder a una variedad de sustancias extrañas. Estas células también elaboran una serie de vías moleculares para comunicar dicha invasión a los tejidos circundantes y reclutar una afluencia de células inflamatorias e inmunitarias adicionales para combatir la infección, reparar los daños y, si es necesario, inducir respuestas inmunitarias específicas en forma de anticuerpos. Si bien estos mecanismos cumplen una función importante y, de hecho, salvadora para el organismo, su activación crónica y/o errónea puede conducir a una morbilidad y mortalidad considerables.
La afluencia crónica de células inflamatorias y la subsiguiente activación local de las células del sistema inmunitario son dos lugares principales donde se puede controlar la inflamación crónica de la mucosa. Estas respuestas forman parte del "sistema inmunitario innato". Las primeras células respondedoras del sistema inmunitario innato, tal como las células dendríticas y los macrófagos, ingieren agentes patógenos y liberan citocinas que atraen a las células secundarias, activas y defensivas de la sangre. Estas células invasoras secundarias deben ser "atraídas" al lugar de la inflamación por las moléculas de la superficie de las células que recubren los vasos sanguíneos locales (endotelio vascular). Estas moléculas se expresan a su vez en respuesta a las citocinas liberadas en el lugar de la invasión inicial del patógeno. Estas moléculas se unen a los receptores de las células sanguíneas circulantes y permiten la adhesión local y la posterior diapedesis en el lugar de la invasión. Las moléculas de adhesión se conocen como moléculas de adhesión intracelular (ICAM) y se ha descubierto una gran variedad de ellas. El bloqueo de la expresión y/o la función de las distintas ICAM ha conducido al desarrollo de varios productos terapéuticos para suprimir las enfermedades inflamatorias.
Las células del sistema inmunitario innato también tienen un repertorio bien desarrollado de receptores de superficie que detectan y se unen a componentes microbianos expresados por bacterias, virus, hongos y otros patógenos. Estos receptores se han denominado "receptores tipo Toll" (TLR) y actualmente se conocen hasta 12 miembros de esta familia en el genoma humano. Los ligandos de los TLR codificados por patógenos se dividen en tres grandes categorías: lípidos y lipopéptidos (TLR2/1; TLR2/6 y TLR4), proteínas (TLR5 y TLR11) y ácidos nucleicos (TLR3, 7, 8 y 9). La orientación terapéutica de determinados TLR se ha explotado como medio para estimular el sistema inmunitario (producción de vacunas) y se están desarrollando agentes dirigidos a otros TLR para inhibir determinadas funciones inmunitarias.
El documento WO 99/61462 A1 describe composiciones y procedimientos para la modulación de la expresión de moléculas de adhesión celular. El documento US 8168600 b2 describe composiciones y procedimientos que mejoran la administración de ácidos nucleicos y otras moléculas nucleosídicas por vía tópica. El documento US 8377897 B2 describe composiciones y procedimientos que mejoran la captación local y sistémica y el suministro de oligonucleótidos y ácidos nucleicos por vía de administración no parenteral. Yacyshyn et al. Gasto. 114(6) 1998 describe un ensayo controlado con placebo del oligonucleótido antisentido ICAM-1 en el tratamiento de la enfermedad de Crohn. El documento Wo 2015/166263 A1 describe una composición que comprende un oligonucleótido en antisentido para su uso en el tratamiento de enfermedades del tracto gastrointestinal inducidas por la radiación. El documento US 2007/135364 A1 describe una composición de oligonucleótidos en antisentido que se hibrida especialmente con ácidos nucleicos que encierran proteínas B7, y el uso de dichas composiciones para inhibir las expresiones de ARNm B7.
Por lo tanto, un agente terapéutico ideal para dirigirse a la inflamación de la mucosa y controlarla sería un agente con efectos tanto agudos como duraderos sobre la inflamación de la mucosa y que, de hecho, podría alterar la enfermedad.
La presente invención aborda esta cuestión.
La presente invención se refiere, como primer aspecto, a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de SEQ ID NO:1 con 40-200 mM de Na+ y 2-20 mM de Mg2+, en la que la columna vertebral del oligonucleótido contiene 20 modificaciones de fosforotioato.
La composición del primer aspecto también puede comprender una o más de hidroximetilcelulosa, metilparabeno sódico, propilparabeno sódico, fosfato sódico monobásico monohidratado, hidróxido sódico, ácido clorhídrico y/o agua.
La composición puede presentarse en forma de jarabe líquido, gel, película, crema, polvo, tableta, enema y/o partículas, preferentemente aptas para la inhalación.
La composición de la invención puede formularse como un gel, crema, loción, solución, suspensión, emulsión, ungüento, polvo o partícula que sea adecuada para la inhalación, tableta, pulverizados, aerosol, espuma, bálsamo, micropartícula, nanopartícula o bioadhesivo, y puede prepararse de manera que contenga liposomas, micelas y/o microesferas.
La composición puede tener los componentes en los siguientes intervalos
SEQ ID NO:1 4 mg
hidroximetilcelulosa 7-8 mg, opcionalmente 7,5 mg metilparabeno sódico 16,6 mM 2,8-3,0 mg
propilparabeno sódico 1,4 mM 0,28-3 mg
fosfato sódico monobásico monohidratado 37,5 mM 4,4-4,6 mg
en la que los intervalos dados son por ml con un total de 60 ml por dosis. Así, en un tratamiento de 240 mg en 60ml, el tratamiento es de 4 mg/ml. La dosis específica anterior puede ser una formulación de enema líquido.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a la composición del primer aspecto para su uso en medicina. El medicamento puede ser humano o veterinario. La medicina veterinaria incluye cualquier animal, incluyendo los animales de producción y/o los animales de compañía, en particular perros, gatos y/o equinos.
De acuerdo con el segundo aspecto de la invención, el medicamento puede ser para la prevención o el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad del muñón rectal, la proctitis inducida por la radiación, la pouchitis, el asma, la inflamación del ojo, el ojo seco, la rinitis o la sinusitis o la enfermedad de injerto contra huésped.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para hacer una composición del primer aspecto de la invención, comprendiendo el procedimiento combinar el oligonucleótido con 40-200 mM de Na+ y 2-20 mM de Mg2+.
Los procedimientos para hacer esta nueva composición son procedimientos estándar conocidos en la técnica.
La invención proporciona una composición, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición está en forma de enema y en la que la composición está formulada en una forma de dosificación para proporcionar una concentración de SEQ ID NO:1 a 4 mg/ml por día.
La composición puede estar en forma de enema y en la que la composición está formulada en una forma de dosificación para proporcionar una concentración de SEQ ID NO:1 a 0,25 - 4 mg/ml por día.
La SEQ ID NO:1 es la siguiente: 5'-gcccaagctg gcatccgtca-3'.
El oligonucleótido antisentido SEQ ID NO:1 también se conoce como alicaforsen.
También pueden ser necesarias ciertas mejoras en la formulación que contiene los oligonucleótidos de la SEQ ID NO:1 para ayudar a la retención del ingrediente activo en el sitio de aplicación. Por ejemplo, la formulación puede prepararse utilizando componentes que hacen que la formulación sea un líquido a temperatura ambiente, pero que se solidifique a un estado de gel a temperatura corporal. En otros casos, la formulación puede prepararse como un líquido y aplicarse a una superficie de la mucosa, tal como la mucosa nasal, seguida de la aplicación de un polvo seco inerte, tal como la metilcelulosa, para retener la formulación en el lugar de aplicación. En otros casos, una formulación de polvo seco de la composición puede mezclarse con el polvo seco inerte y aplicarse conjuntamente en el lugar de la mucosa.
Los oligonucleótidos SEQ ID NO:1 de acuerdo con esta invención comprenden preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 unidades de base de ácido nucleico. Es más preferido que dichos oligonucleótidos comprendan de aproximadamente 20 a 50 unidades de base de ácido nucleico, aún más preferido que tengan de aproximadamente 20 a 30 unidades de base de ácido nucleico, y más preferido que tengan de aproximadamente 20 a 22 unidades de base de ácido nucleico. Como se apreciará, una unidad de base de ácido nucleico es una combinación de base-azúcar convenientemente unida a una unidad de base de ácido nucleico adyacente a través de enlaces fosfodiéster u otros. Un experto en la técnica entenderá que aproximadamente 20 a aproximadamente 80 unidades de base de ácido nucleico incluyen 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 unidades de nucleobase.
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto en la técnica, y
generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una fusión adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a fusionarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que se puede utilizar. En consecuencia, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer más rigurosas las condiciones de reacción, mientras que las temperaturas más bajas lo serían menos. Para más detalles y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
Tal y como se define en el presente documento, las "condiciones rigurosas" o "condiciones altamente estrictas", pueden identificarse por aquellas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/0,0015 M de citrato de sodio/0,1 % de dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizador, tal como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0. 1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampón fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42 °C; o (3) emplear 50 % de formamida, 5xSSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1 % de pirofosfato de sodio, 5x de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 [mu]g/ml), 0.1 % de SDS y 10 % de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2xSSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50 % de formamida a 55 °C, seguidos de un lavado de alta intensidad consistente en 0,1xSSC con EDTA a 55 °C.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación de una noche a 37 °C en una solución que comprende: 20 % de formamida, 5xSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros en 1xSSC a aproximadamente 37-50 °C. El artesano experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
Tal y como se utiliza en el presente documento, las condiciones de moderada o alta rigurosidad pueden ser fácilmente determinadas por aquellos que tienen una habilidad ordinaria en la técnica basada en, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas son expuestas por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.
1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).
El oligonucleótido se modifica para incluir 20 enlaces de fosforotioato. La modificación con fosforotioato del oligonucleótido, mediante la sustitución de una molécula de azufre por una molécula de oxígeno no puente en cada enlace fosfodiéster, aumenta significativamente la resistencia a la exonucleasa en relación con el ADN no modificado y prolonga la vida media del fármaco (Geary et al., Anti-Cancer Drug Design,12:383-94, 1997). Los oligonucleótidos de fosforotión son mínimamente antigénicos, no citotóxicos y bien tolerados, y sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas están bien caracterizadas (véase por ejemplo Butler et al., Lab.Invest, 77:379-88, 1997 Mirabelli et al., Anti-Cancer Drug Des., 6:647-61, 1991).
Además de las modificaciones de la espina dorsal de fosforotioato, los expertos en la técnica conocen bien otras posibles modificaciones de la espina dorsal, del azúcar y de otro tipo.
La cantidad real administrada, así como la tasa y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., es, en última instancia, responsabilidad y discreción de los médicos generalistas y otros médicos, y suele tener en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado de cada paciente, el lugar de suministro, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los profesionales.
Por ejemplo, en una realización, una dosis adecuada puede ser de 2 mg/ml por día, por ejemplo, por enema.
En otra realización, una dosis mínima sería de 0,25 mg/ml por día, por ejemplo, por enema.
La composición puede administrarse una, dos, tres o cuatro veces al día o periódicamente.
La composición puede administrarse durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más semanas.
Por ejemplo, en una realización, una dosis adecuada por tratamiento puede ser de 0,05 mg a 400 mg. Un tratamiento puede administrarse de una a ocho veces al día.
Una concentración de dosis adecuada puede ser de 0,5 mg/ml a 10 mg/ml. Una dosis adecuada administrada a pacientes con asma puede ser de entre 0,5 a 5 ml, en particular alrededor de 1mL. Una dosis adecuada administrada
a pacientes con ojo seco o inflamación ocular puede estar entre 1-100 ul, en particular alrededor de 50 ul. Una dosis adecuada de enema administrada puede estar entre 10 a 100 ml, en particular alrededor de 60ml.
La composición puede administrarse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho veces al día o periódicamente.
La composición puede administrarse durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más semanas.
La composición puede administrarse durante 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días.
La composición puede ser para el agravamiento, la inflamación, el dolor y/o la secreción existentes en el lugar afectado o puede ser profiláctica (tratamiento preventivo). El tratamiento puede incluir efectos curativos, de alivio o profilácticos.
Ejemplos específicos de enfermedades tratables por la invención incluyen las condiciones inflamatorias de la mucosa descritas a continuación. Cada enfermedad requiere la afluencia de determinadas células inflamatorias de la sangre y la activación de las células inmunitarias que se han localizado en el lugar de la inflamación. Por lo tanto, estas enfermedades se tratan idealmente con un agente que pueda bloquear tanto la afluencia de células inflamatorias como la activación del sistema inmunitario innato, tal como se proporciona en la presente invención.
Las enfermedades inflamatorias del intestino incluyen la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), ambas son trastornos inflamatorios de la mucosa intestinal. La colitis ulcerosa se limita al intestino grueso, mientras que la enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier región de la mucosa intestinal, incluyendo la cavidad oral. Tanto la CU como la EC se caracterizan por la afluencia de células inflamatorias e inmunitarias en respuesta a estímulos ambientales y autoinmunes. Aunque la histopatología de las dos enfermedades difiere, se utilizan muchos agentes terapéuticos para tratar ambas afecciones, tal como los esteroides, los anticuerpos anti-TNF y la mesalamina.
La pouchitis es la inflamación de la mucosa intestinal distal que queda tras la extirpación quirúrgica del colon y la formación de una bolsa en J por anastomosis ileal-anal. La inflamación de la mucosa en la pouchitis es similar a la observada en la colitis ulcerosa, aunque puede tener una mayor implicación microbiana. Se caracteriza por la afluencia de células inflamatorias activadas y la activación del sistema inmunitario local.
La enfermedad del muñón rectal es una condición inflamatoria que afecta a la mucosa rectal que queda después de la colectomía.
El asma es un trastorno complejo y multifactorial que se caracteriza por episodios de disnea y sibilancias junto con una hiperreactividad de las vías respiratorias a una serie de estímulos. Se cree que la inflamación crónica de la mucosa de la pared de las vías respiratorias es el principal factor que impulsa las exacerbaciones asmáticas. Actualmente está bien establecido que las células T helper 2 (Th2) polarizadas se infiltran y acumulan en la mucosa bronquial de los asmáticos alérgicos, y que las citoquinas secretadas por estas células (interleucina-(IL)-4, IL-5, IL-9 e IL-13) son en gran medida responsables de las exacerbaciones agudas y de la promoción de las características patológicas del asma alérgica. La inhibición de la afluencia de células inflamatorias, a través de la regulación a la baja de ICAM-1 y la supresión de la respuesta inmune innata a través de la inhibición de TLR-9 es un enfoque terapéutico eficaz proporcionado por la presente invención. Este fue un descubrimiento sorprendente, ya que varios estudios han identificado a los agonistas de TLR9 como una terapia potencial para el asma. Varios ensayos clínicos han explorado el uso de agonistas del TLR9 para tratar el asma, por ejemplo, Astra Zeneca tiene un agonista del TLR9 AZD1419, con licencia de Dynavax, en fase 2a para pacientes con asma eosinofílica de moderada a grave por vía inhalada. El agonista del TLR9 suprime las respuestas Th2 (fase tardía) y potencia las respuestas Th1. Cytos Biotechnology ha realizado ensayos clínicos con el agonista del TLR-9 CYT003- QbG10 para tratar el asma bronquial alérgica. Otros agonistas de TLR9 que se han evaluado en la clínica para tratar el asma fueron AIC (Dynavax), AVE0675 y SAR-21609 (Sanofi-Aventis/Coley Pharmaceuticals); QAX-935 (Idera Pharmaceuticals/Novartis).
La sinusitis eosinofílica (ES) es una inflamación de la mucosa nasal caracterizada por la afluencia crónica de eosinófilos y otros monocitos y linfocitos de la sangre a la mucosa nasal en respuesta a antígenos ambientales. Esta reacción da lugar a una serie de síntomas, incluyendo secreción nasal (rinorrea), congestión y pólipos nasales. La sinusitis eosinofílica incluye sinusitis y rinitis. Un artículo de Licari A et al., (International Journal of Immunopathology Pharmacology, 2014 Oct-Dec;27(4):499-508) explica cómo las vías respiratorias superiores e inferiores pueden considerarse como una entidad única, interconectada por procesos inflamatorios coexistentes que comparten mecanismos etiopatogénicos comunes. El documento explica cómo los estudios anteriores han demostrado con creces la relación entre la rinosinusitis y el asma. Esto ha llevado a la introducción del concepto de "vías aéreas unidas", que también se ha incluido en el documento de la WHO document Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA); este concepto tiene importantes consecuencias también en el tratamiento de estos trastornos. La presente invención se utiliza para tratar la sinusitis eosinofílica.
La enfermedad de injerto contra huésped se produce tras el trasplante de médula ósea realizado para el tratamiento de cánceres de células sanguíneas tal como la leucemia. Durante el trasplante, los órganos que forman las células sanguíneas del huésped se eliminan mediante un tratamiento de radiación y se trasplanta la médula del donante (injerto) para restablecer la función del órgano. Aunque este procedimiento puede tratar eficazmente el cáncer, el
sistema inmunitario trasplantado puede empezar a "rechazar" los tejidos del huésped. Los tejidos sensibles son el hígado, la piel, los pulmones y el tracto gastrointestinal. La inmunosupresión sistémica se utiliza para controlar el rechazo en la mayoría de estos tejidos, pero la mucosa GI es particularmente difícil de tratar con terapias sistémicas. La inflamación que se produce en el intestino delgado y el colon se trata mejor con una terapia dirigida que se administra directamente en la cavidad del intestino. La presente invención en una formulación oral o enema rectal se utiliza para suprimir la enfermedad de injerto contra anfitrión.
En un artículo de Calcaterra et al, en el Journal of Immunology, (2008, 181, 6132-6139) los autores demuestran que la inhibición de TLR9 puede conducir al tratamiento de la EICH. Los autores utilizaron ratones inactivados C57BL/6 para demostrar que cuando se utilizaban ratones inactivados TLR9 como receptores de injertos, la supervivencia mejoraba en comparación con los ratones receptores de tipo silvestre. Los ratones fueron irradiados de forma mieloablativa e inyectados con 107 células de la médula ósea y 4 *107 esplenocitos obtenidos de donantes mayores y menores de Ag-dispares BALB/c. Los ratones receptores fueron monitorizados para detectar signos clínicos de ElCH, peso y supervivencia. Curiosamente, los ratones con un TLR4 inactivado no mostraron una mayor supervivencia frente a los ratones receptores de tipo silvestre. Todos los ratones de tipo silvestre y TLR4-/- sucumbieron a la EICH aguda grave en un plazo de 60 días, mientras que los ratones TLR9-/- mostraron una tasa de supervivencia significativamente mayor, con cuatro de los ocho ratones aún vivos al final del experimento. La puntuación clínica de la EICH en los ratones TLR9-/- también fue significativamente inferior a la de los ratones TLR 4-/- y C57B/6 y esto se correlacionó con la reducción del daño intestinal en el intestino delgado y, en menor medida, en el intestino grueso en los ratones TLR9-/-. Por último, al final del experimento, todos los ratones supervivientes TLR9-/- lograron una reconstitución inmunitaria completa, mostrando un 100 % de células linfocitarias de la sangre periférica del donante. Los resultados de este trabajo demuestran el importante papel que desempeña TLR9 en la patogénesis de la EICH.
La inflamación del ojo también puede tratarse con la presente invención. Tales condiciones son el ojo seco o la enfermedad de Sjogren, donde la reducción de la producción de líquido lagrimal provoca una inflamación local de la mucosa ocular. La enfermedad del ojo seco es una queja común de los pacientes oftalmológicos. Las condiciones de sequedad ocular no tratadas pueden provocar la erosión y la abrasión de la superficie celular epitelial de la córnea, lo que aumenta la susceptibilidad a las infecciones. La progresión de la enfermedad puede llevar a la ulceración de la córnea, e incluso a la pérdida de la vista. Las enfermedades y algunas afecciones físicas pueden predisponer a las personas a padecer el trastorno del ojo seco, incluyendo las alergias, la diabetes, la deficiencia de las glándulas lagrimales, el lupus, la enfermedad de Parkinson, el síndrome de Sjogren, la artritis reumatoide y la rosácea, entre otras. Los medicamentos para otras enfermedades pueden causar o exacerbar los trastornos del ojo seco, incluyendo los diuréticos, los antidepresivos, los medicamentos para la alergia, las píldoras anticonceptivas y los descongestionantes, entre otros. Los cambios relacionados con la edad también pueden inducir o exacerbar el ojo seco. Las mujeres posmenopáusicas experimentan cambios en los niveles hormonales que pueden instigar o empeorar la sequedad ocular, y los desequilibrios tiroideos pueden provocar cambios similares. Por último, el propio envejecimiento puede provocar una reducción de la producción de lípidos, con el consiguiente ojo seco.
La presente invención puede utilizarse para el tratamiento de la sequedad ocular, la enfermedad del ojo seco crónico (CDE) o el síndrome del ojo seco en un sujeto que necesite el mismo. Los sujetos que padecen sequedad ocular, enfermedad crónica del ojo seco (ECS) o síndrome del ojo seco pueden ser identificados mediante cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, los síntomas típicos de la sequedad ocular, la enfermedad del ojo seco crónico (ECS) o el síndrome del ojo seco incluyen, pero no se limitan a, síntomas tales como, por ejemplo sensación de escozor, ardor o picor en los ojos, mucosidad fibrosa dentro o alrededor de los ojos, aumento de la irritación ocular por el humo o el viento, fatiga ocular, sensibilidad a la luz, enrojecimiento de los ojos, sensación de objeto extraño en los ojos, dificultad para llevar lentes de contacto, períodos de lagrimeo excesivo, ojos hinchados, molestias oculares, dolor ocular y visión borrosa (que empeora al final del día o después de enfocar durante un período prolongado).
En algunas realizaciones, la sequedad ocular se diagnostica mediante la prueba de osmolaridad lagrimal. La prueba de osmolaridad de lagrimal mide el número de partículas sólidas en una lágrima. Cuanto más alta sea la osmolaridad lagrimal, normalmente indica que ésta tiene menos agua y más partículas, por ejemplo, sales, proteínas, lípidos y mucina. Una osmolaridad lagrimal inferior a 308 mOsms/L es normal, 308-320 mOsms/L es sequedad ocular leve, 320-340 mOsms/L es sequedad ocular moderada y más de 340 mOsms/L es sequedad ocular grave. La presente invención puede utilizarse para tratar la sequedad ocular leve, la sequedad ocular moderada, la sequedad ocular de moderada a grave y la sequedad ocular grave.
Los síntomas del ojo seco grave pueden incluir, entre otros, la inyección conjuntival (hiperemia); tal como la hiperemia conjuntival bulbar, la hiperemia conjuntival tarsal inferior, la hiperemia conjuntival bulbar nasal; la hiperemia del margen del párpado, la tinción corneal central y el enrojecimiento del ojo.
Más específicamente, el tratamiento incluye lo "terapéutico" y lo "profiláctico" y estos tipos de tratamiento deben considerarse en su contexto más amplio. El término "terapéutico" no implica necesariamente que un sujeto sea tratado hasta su total recuperación. Del mismo modo, "profiláctico" no significa necesariamente que el sujeto no acabe contrayendo una enfermedad.
En consecuencia, el tratamiento terapéutico y profiláctico incluye la mejora de los síntomas de una condición particular o la prevención o reducción del riesgo de desarrollar una condición particular. El término "profiláctico" puede considerarse como la reducción de la gravedad o de la aparición de una condición particular. "Profiláctico" también incluye la prevención de la reaparición de una condición particular en un paciente previamente diagnosticado con la condición. "Terapéutico" también puede reducir la gravedad de una enfermedad existente.
En resumen, la presente invención proporciona detalles que describen que:
• La inflamación de las mucosas puede tratarse de forma más eficaz con agentes que puedan dirigirse a múltiples vías del sistema inmunitario innato.
• El bloqueo de la afluencia de células inflamatorias/inmunitarias (ICAM-1) y el bloqueo de la activación de la respuesta inmunitaria innata (TLR-9) permiten conjuntamente una respuesta aguda y duradera.
• El oligonucleótido de 20 bases SEQ ID NO:1 conocido por bloquear ICAM-1, ejerce una respuesta tanto aguda como duradera porque también inhibe la activación de TLR-9.
• La secuencia primaria de SEQ ID NO:1 no predice su acción como antagonista de TLR-9.
• La secuencia primaria específica de la SEQ ID NO:1 sugiere posibles estructuras secundarias que podrían influir en la actividad del TLR-9, pero no predice las estructuras más estables u óptimas.
• Las condiciones que influyen en la estructura secundaria de SEQ ID NO:1 también influyen en su actividad como antagonista de t LR-9.
• Se ha descubierto que un oligonucleótido, con la secuencia primaria de SEQ ID NO:1, cuando se somete a condiciones que optimizan su estructura secundaria, es un agente de tratamiento más potente para la inflamación de la mucosa que lo predicho por la secuencia primaria sola.
Los TLR son un medio clave por el que el huésped reconoce y monta una respuesta inmune a las moléculas extrañas. También proporcionan un mecanismo por el que se vinculan las respuestas inmunitarias innata y adaptativa. En concreto, el TLR-9 reconoce el ADN bacteriano y vírico a través de ciertos motivos CpG no metilados que no están presentes en el ADN de los mamíferos. Por lo tanto, las células contenidas en la mucosa pueden "detectar" y responder a la presencia de ADN "extraño". La unión de estos ligandos activa el sistema inmunitario para que responda y elimine el patógeno.
También se sabe que los oligonucleótidos sintéticos (ODN) que contienen secuencias de dinucleótidos CpG pueden estimular respuestas inmunitarias a través de la vía TLR-9. Además, el uso de oligonucleótidos sintéticos ha demostrado su utilidad como inhibidores de las citoquinas inflamatorias y se sabe que estas acciones están mediadas por acciones inhibitorias sobre el TLR-9.
La literatura publicada que documenta las propiedades de los oligonucleótidos de ADN necesarios para la unión a TLR-9 es extensa y se ha centrado en secuencias tanto agonistas como antagonistas. Si bien se sabe que el motivo CpG es necesario para la actividad estimuladora, no se conocen secuencias canónicas que predigan absolutamente las secuencias antagonistas. Algunos inhibidores han sido descritos previamente en la técnica. Además de estos ODN inhibidores que contienen tripletes, varios grupos han informado de otras secuencias de ADN específicas que podrían inhibir la activación mediada por TLR-9 mediante los ODN que contienen CpG. Estos motivos "inhibidores" o "supresores" son ricos en secuencias poli "G" (por ejemplo, "GGG") o "GC", tienden a estar metilados y están presentes en el ADN de los mamíferos y de ciertos virus. Se han identificado otras secuencias inhibidoras que contienen un motivo "GGGG" dentro de las secuencias. Se ha observado que ciertos elementos repetitivos TTAGGG, presentes con alta frecuencia en los telómeros de los mamíferos, regulan a la baja la activación inmunitaria inducida por CpG, lo que demuestra que los oligonucleótidos sintéticos que contienen el elemento TTAGG imitan esta actividad y podrían ser eficaces en la prevención/tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes dependientes de Th1.
También se ha estudiado la estructura secundaria de los ODN como base para definir la estructura del ADN necesaria para la unión al TLR-9. Sin embargo, no parece haber una estructura secundaria que especifique absolutamente la afinidad de unión, aunque se observan efectos específicos de la secuencia sobre la estructura para alterar la actividad agonista o antagonista del ODN.
El hallazgo sorprendente es que SEQ ID NO:1 es un antagonista de TLR-9 y carece de actividad agonista. Además, la invención define las condiciones específicas que contribuyen a la estructura secundaria prevista de SEQ ID NO:1 y relacionan la estructura secundaria con el antagonismo de TLR-9.
Las siguientes figuras forman parte de la solicitud, donde;
La Figura 1 es un gráfico de respuesta a la dosis para la estimulación de SEQ ID NO:1 de TLR-9.
La Figura 2 es una respuesta a la dosis de inhibición de TLR-9 por SEQ ID NO:1.
La Figura 3 es un gráfico que muestra las curvas de inhibición de la SEQ ID NO:1 para ICAM-1 y TLR-9. La Figura 4 es una predicción termodinámica de la estabilidad del dúplex para la SEQ ID NO:1 y el hetero dúplex ODN2006 frente al homo dúplex SEQ ID NO:1.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la inhibición del TLR-9 activado por el ADN genómico de E c o li. La Figura 6 lo muestra: Superior - espectros de CD de SEQ ID NO:1 en ddH20 a 4 °C. Inferior - Espectros a 20-95 °C.
La Figura 7a muestra la intensidad del pico de 190 nm en función de la temperatura.
La Figura 7b muestra la intensidad del pico de 220 nm en función de la temperatura.
La Figura 8 muestra los espectros de la SEQ ID NO:1 en 5mM de espermina.
La Figura 9 muestra un esquema del montaje experimental.
La Figura 10 muestra los IC50 para la inhibición de la SEQ ID NO:1 de la activación deODN2006 del TLR-9. La Figura 11 muestra la evaluación de la tinción con fluoresceína de la córnea (CFS) de alicaforsen (dosis de 1mM y 10mM) en el modelo ratón de ojo seco con escopolamina en el día 6 y en el día 10. Cada círculo representa un ojo y la línea es la media del grupo. Se realizaron análisis ANOVA de dos vías y de una vía, seguidos de pruebas de Dunnett para comparaciones múltiples * p<0,05; ** p<0,001.
La Figura 12 muestra la evaluación del alicaforsen en el modelo murino de asma alérgica inducido por ovoalbúmina. ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett en comparación con el control del vehículo; *p<0,05; ** p<0,01. Prueba T no apareada de Student, de dos colas, que compara 1 mM de alicaforsen con el control del vehículo; # p<0,05.
La presente invención proporciona los siguientes ejemplos que no son limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Actividad inhibidora de TLR-9
La SEQ ID NO:1 se sometió a un cribado de la actividad dosis-respuesta para determinar la posible EC50 para la activación de TLR9 a siete dosis diferentes (0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 j M) por triplicado. Brevemente, la línea celular HEK 293 reportera de TLR9/NF-kB (Abeomics, San Diego, CA) se sembró en placas sólidas blancas de 96 pozos a 5 x104 células por pocillo durante 16 h. Las células se trataron con diferentes dosis de SEQ ID NO:1 así como con 20 ug/ml de CpG ODN-2006, un conocido agonista de TLR-9 por triplicado durante 16 h. A continuación, se midió y analizó la actividad luciferasa.
Como se muestra en la Figura 1, la SEQ ID NO:1 carecía de actividad agonista hasta concentraciones tan altas como 100 uM, mientras que una dosis de 1,0 uM de ODN2006 producía un aumento de 7,5 veces en la activación génica inducida por TLR-9.
La SEQ ID NO:1 se examinó a continuación para determinar la actividad de inhibición sensible a la dosis para determinar el IC50 contra la inducción de NF-kB mediada por TLR9 a siete dosis diferentes (0,1, 1, 5, 10, 25, 50 y 100 j M) por triplicado. Brevemente, la línea celular HEK 293 reportera de la luciferasa TLR9/NF-kB se sembró en placas sólidas blancas de 96 pozos a 5 x104 células por pocillo durante 16 h. Las células se pretrataron con diferentes dosis de SEQ ID NO:1 por triplicado durante 1 h. A continuación, las células se trataron con 20 ug/ml de CpG ODN2006 para activar TLR9. Tras 16 h, se midió y analizó la actividad de la luciferasa. Estos resultados se muestran en la Figura 2.
La actividad de SEQ ID NO:1 como antagonista de TLR-9 requiere concentraciones más altas que la inhibición de la expresión de ICAM-1. Las respuestas comparativas a la dosis se muestran en la Figura 3, en relación con la dosis utilizada en la formulación del enema.
De los datos de la Figura 3 se desprende que la dosis terapéutica de SEQ ID NO:1 utilizada para el tratamiento de la EII (659 uM) es suficiente para proporcionar niveles terapéuticos del fármaco para ambos mecanismos de acción.
También fue necesario descartar un efecto inhibidor directo de la SEQ ID NO:1 sobre la unión del activador ODN2006. Un cribado de las dos estructuras utilizando el programa Oligo Analyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies, Inc.) mostró que el alicaforsen era energéticamente más probable que formara un dímero consigo mismo que con el ODN2006. Esta comparación se muestra en la Figura 4.
Aunque los datos de la Figura 4 indican que es más probable que la SEQ ID NO:1 forme un homodímero que un heterodímero con el ODN2006, experimentos adicionales probaron la actividad antagonista de la SEQ ID n O:1 en presencia de ADN genómico de E. coli como activador. En este ensayo, la SEQ ID NO:1 siguió siendo antagonista de la activación del TLR-9 (Figura 5).
Ejemplo 2: Predicción de la Estructura Secundaria Óptima
El homodímero que se muestra en la Figura 4 es la estructura dúplex energéticamente más favorable para la SEQ ID NO:1. Lo que interesaba era saber si esta estructura secundaria podía influir en la actividad inhibidora del TLR-9 y en qué condiciones el dúplex era más estable
La estructura dúplex predicha está estabilizada por 4 enlaces de tipo Watson-Crick flanqueados por desajustes G-A y otros 2 pares G-C. Los motivos CpG permanecen sin restricciones en los extremos 3' no solapados para cada miembro del dúplex.
Por lo tanto, la SEQ ID NO:1 fue sometida a espectroscopia de dicroísmo circular (CD) para obtener información sobre la posible estructura secundaria. La CD del ADN puede utilizarse para detectar las 3 formas principales de la estructura dúplex (B, A y Z) y es sensible a las condiciones que alteran la estructura, tal como el calentamiento. Es interesante la estabilidad de cualquier estructura secundaria detectada a temperaturas fisiológicas o superiores. En la Figura 6 se muestra el espectro de CD de la muestra SEQ ID NO:1 en ddH20 a 4C. El perfil muestra rasgos característicos de los dúplex en la forma B del ADN, es decir, una banda positiva característica de baja intensidad a ~280 nm, dos bandas negativas de baja intensidad a ~210 nm y ~255 nm y una banda positiva intensa a ~190 nm
La banda positiva a 190 nm resultó ser sensible a la temperatura entre 4 °C y 20 °C. El calentamiento posterior a 80 °C mostró una pérdida de >85% de la intensidad de la señal. Esta señal de fondo se obtuvo a 40 °C, lo que hace poco probable que la estructura sea estable a la temperatura fisiológica bajo estas condiciones.
También se estudió la desnaturalización térmica adicional del dúplex putativo en presencia de Na+ a concentraciones de 50 mM y 150 mM. Se utilizó fluoruro de sodio ya que los iones Cl- interfieren con los espectros de CD en esta región UV.
Como puede verse en la Figura 7(a), la intensidad del pico de 190nm es más estable al calentamiento tanto bajo condiciones de 50 como de 150 mM de sodio, conservando al menos 50 % de su estructura a 40 °C. Además, la intensidad del pico de 190 nm volvió a los niveles de precalentamiento una vez que las muestras se enfriaron de nuevo a 20 °C. Esto implica que la estructura secundaria observada es reversible tras la fusión.
No se detectaron cambios significativos en el pico negativo a 210 nm tras el calentamiento. Sin embargo, se comprobó que el pico positivo a 220 nm respondía de forma similar al del pico de 190 nm. Estos datos se muestran en la Figura 7(b).
Se realizaron experimentos adicionales para comprobar la influencia del Mg++ y las poliaminas en la estabilidad de la estructura. Sorprendentemente, la poliamina, espermina a 5 mM en presencia de 50 mM de Na+ abolió completamente la estructura secundaria (Figura 8).
Esto podría ser una función de la columna vertebral de fosfato alterada de SEQ ID NO:1 que contiene 20 sustituciones de azufre en lugar de O- en cada grupo fosfato (fosforotioato).
Ejemplo 3: Influencia de los Cambios de Estructura en el Antagonismo de TLR-9
Para probar el efecto de los tratamientos que se sabe que estabilizan y/o desestabilizan la estructura secundaria de la SEQ ID NO:1, una serie de experimentos exploró el efecto del calor, el Na+, el Mg+ y la espermina en la actividad antagonista del TLR-9 de la SEQ ID NO:1. Las muestras y las condiciones de estas pruebas se diagraman en la Figura 9.
Brevemente, las muestras de SEQ ID NO:1 se disolvieron en un tampón Tris a pH 7,2 que incluía 50mM de NaCl, en presencia de 15mM de Mg++ o 5 mM de espermina o de ambos, Mg++ y espermina. Una de las muestras permaneció a temperatura ambiente, mientras que las restantes se calentaron a 90 °C durante 3 minutos y luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se diluyeron a las concentraciones indicadas y se incubaron con las células objetivo durante 1 hora, antes de añadir 1,0 uM de ODN2006 para estimular el TLR-9. Los resultados del experimento se muestran en la Figura 10.
Se puede ver en la Figura 10 que las condiciones que se observaron para alterar la estructura secundaria de la SEQ ID NO:1 también influyen en su actividad como inhibidor de TLR-9. También se observa que estas condiciones se mantuvieron durante la etapa de calentamiento y enfriamiento, donde tuvieron la oportunidad de influir en la estructura secundaria de la SEQ ID NO:1. Sin embargo, una vez diluido en el medio de cultivo celular, las condiciones se alterarían a las del medio y la temperatura volvería a ser 37 °C. Por lo tanto, las diferencias observadas son estables bajo condiciones fisiológicas normales.
Esta alteración de las condiciones, cuando las muestras se incuban con células, puede ser la razón por la que todavía se observa cierta actividad en las muestras tratadas con espermina, aunque los espectros de CD indicarían que las condiciones de preincubación eliminaron la estructura secundaria del dúplex. Alternativamente, los resultados observados con la espermina podrían representar la actividad inhibidora de TLR-9 restante de las moléculas no duplexadas (monómeros).
Ejemplo 4: Tratamiento de la Inflamación del Ojo con alicaforsen
Para probar el efecto de la SEQ ID NO:1 en la condición de inflamación del ojo, se investigó el efecto de dos concentraciones diferentes de alicaforsen en un modelo murino de ojo seco por administración de escopolamina.
Modelo de ratón murino de ojo seco
En un modelo de ratón, la aplicación de parches transdérmicos de escopolamina en la cola media se utiliza para reducir la producción de lágrimas acuosas y así imitar la insuficiencia de la glándula lagrimal. La función de la escopolamina es inducir un bloqueo farmacológico de los receptores colinérgicos en la glándula lagrimal y, por tanto, disminuir la producción acuosa. La desecación se amplifica al añadir el estrés ambiental. Los animales están expuestos a un entorno de baja humedad y a una corriente de aire constante.
Procedimiento Experimental
Animales utilizados en el estudio:
Especies: Ratón.
Cepa: C57BL/6N (pigmentado).
Edad: Aproximadamente 6-7 semanas (en el primer día de la inducción)
Número/sexo: 55 mujeres (estudio 40; reserva 15).
Durante todo el estudio, los animales tuvieron libre acceso a la comida y al agua. Se les alimentó con una dieta estándar de pellas secas. El agua del grifo estaba disponible ad libitum en botellas de plástico.
En este estudio se incluyeron 40 animales. Los animales se seleccionaron con base en su buena salud y su peso corporal homogéneo. En este estudio sólo participaron animales sanos sin defecto ocular visible (opacidad corneal). Los animales se distribuyeron aleatoriamente en los grupos del estudio mediante una función macro del programa informático Excel® con base en la media de las puntuaciones de tinción con fluoresceína de la córnea de ambos ojos el Día 3.
Se indujeron síntomas de ojo seco en ratones C57BL/6N pigmentados exponiéndolos a una habitación de ambiente controlado (humedad relativa aproximada < 25 %, temperatura 22 °C ± 2 °C), en una jaula con un flujo de aire de aproximadamente 15 L/min y la administración de escopolamina transdérmica (0,5 mg/72 h) durante once días.
Administración de escopolamina
Los ratones fueron tratados con la administración de escopolamina transdérmica (0,5 mg/72h; Scopoderm TTS®). El parche transdérmico de escopolamina se envolvió cerca de la base de la cola del ratón, asegurado con cinta de celofán. Los parches se reaplicaron cada 48 horas.
Vía y procedimiento de administración y justificación
Los ratones fueron distribuidos al azar en 4 grupos de 10 animales. El estudio se dividió en 2 conjuntos experimentales con 5 animales de cada grupo representados. Todos los ratones fueron tratados el primer día y luego durante 10 días en total de acuerdo con el siguiente régimen:
- Grupo Optimmune®: dos dosis diarias los Días 3 y 10 y tres dosis diarias los Días 4 a 9.
- grupo de alicaforsen (10 mM y 1 mM): una dosis al día.
- Grupo Vehículo: una dosis al día.
Todos los elementos de prueba, los elementos de control y el elemento de comparación se instilaron en ambos ojos (5 |jl por administración), utilizando una micropipeta.
La producción de lágrimas y los defectos de la córnea se evaluaron en la línea de base, en los Días 3, 6 y 10 utilizando hilo rojo de fenol (PRT) y tinción de fluorescencia corneal (CFS), respectivamente, para cada animal de los 4 grupos. Signos clínicos generales
Pesos corporales
Se registró el peso corporal de todos los animales.
Aspecto general
Cada día se observaron los signos clínicos generales y el aspecto de todos los animales.
Exámenes oculares
Se realizaron dos tipos de exámenes oculares:
A) Medición de la producción de lágrima acuosa prueba PRT.
La producción de lágrimas se midió con la prueba PRT (Zone-Quick, FCI-Ophthalmics) en ambos ojos, antes de la administración el Día 3 y al menos una hora después del segundo tratamiento para los demás días del estudio. El hilo se colocó en el cantus lateral del fórnix conjuntival lateral durante 30 segundos. El hilo mojado por las lágrimas se volvía rojo, lo que indicaba la producción de lágrimas acuosas. Estos datos se expresaron en milímetros.
B) Tinción de fluoresceína en la córnea (CFS)
En los diferentes puntos de tiempo, la medición se realizó antes de la administración en el Día 3 y al menos una hora después del segundo tratamiento para los demás días del estudio. Los ojos de los animales de todos los grupos se examinaron mediante observación con lámpara de hendidura utilizando luz azul tras la instilación de un colirio de fluoresceína al 0,5% (0,5 jl). La tinción puntiforme se registró con el sistema de clasificación estandarizado del National Eye Institute (NEI), que otorga una puntuación de 0 a 3 a cada una de las 5 zonas en las que se dividieron las córneas. Resultados:
Comportamiento de los animales y pesos corporales
Se observó una ligera pérdida de peso corporal en la mayoría de los animales de todos los grupos entre el Día 0 y el Día 10 debido a las condiciones de sequedad ocular. alicaforsen (10 mM y 1mM), el Vehículo y Optimmune® no afectaron el comportamiento de los animales.
Prueba PRT:
El Día 3, la producción de lágrimas disminuyó en todos los grupos. Los valores del grupo no tratado se mantuvieron estables hasta el Día 10. Estos datos mostraron una buena inducción del ojo seco en este modelo murino.
Prueba CFS:
Los resultados del CFS se resumen en la Tabla 1 y en la Figura 11:
T l 1: Ev l i n l ín m l
(continuación)
El grupo del vehículo tuvo síntomas de ojo seco desde el día 3 hasta el día 10, lo que demuestra que este estudio está validado.
Puntuaciones del CFS:
El grupo tratado con Optimmune® mostró puntuaciones de tinción con fluoresceína en la córnea inferiores a las del grupo del Vehículo el Día 6 (p = 0,0021) y el Día 10 (p= 0,0020).
Los grupos tratados con alicaforsen (1 mM y 10 mM) tuvieron puntuaciones de tinción de fluoresceína corneal similares a las del grupo del Vehículo en el Día 6.
Los grupos tratados con alicaforsen (1 mM y 10 mM) mostraron puntuaciones de tinción de fluoresceína corneal más bajas que el grupo del vehículo en el día 10 y el grupo tratado con alicaforsen (1 mM) mostró una diferencia significativa (p = 0,0429) en comparación con el vehículo.
Bajo estas condiciones experimentales, múltiples administraciones tópicas de alicaforsen (1 mM y 10 mM) fueron clínicamente bien toleradas.
El grupo del vehículo tuvo síntomas de ojo seco desde el día 3 hasta el día 10, lo que demuestra que este estudio está validado.
Los grupos de Optimmune® 0,2% y alicaforsen (1mM) mostraron una reducción estadísticamente significativa de los síntomas de sequedad ocular medidos por la tinción con fluoresceína de la córnea
Ejemplo 5: Tratamiento del asma con alicaforsen
Para probar el efecto del alicaforsen en afecciones tal como el asma, se trató con alicaforsen un modelo de ratón de asma alérgico inducido por ovoalbúmina (OVA).
Procedimiento:
El asma alérgica se modeló en ratones BALB/c hembra mediante una sensibilización inicial a OVA seguida de una posterior provocación intranasal de OVA purificado.
Los ratones fueron monitorizados a lo largo del estudio para detectar cambios en el peso corporal y signos generales de enfermedad. La respuesta alérgica al OVA se midió examinando el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) para detectar la afluencia de células inflamatorias y la presencia de la citoquina inflamatoria IL-13.
Además, los animales de los grupos experimentales fueron tratados mediante la administración intranasal (IN) de alicaforsen, a una concentración de dosificación de 1mM, vehículo de control (PBS), o dexametasona intraperitoneal (IP) como control antiinflamatorio positivo.
MATERIALES DE PRUEBA
Elementos de prueba
En las Tablas 2 y 3 siguientes se detallan los elementos de prueba y los materiales de prueba utilizados durante el estudio.
Tabla 2
Tabla 3
La dosificación de alicaforsen a una concentración de 1mM se preparó con base en un factor de contenido de fármaco de 0,878 y MW de 6795,9 g/mol. Las soluciones preparadas se almacenaron a 2-8°C durante la duración del estudio. Se añadió 1 ml de solución madre de dexametasona (4 mg/ml) a 3 ml de solución salina para una concentración de solución de 1 mg/ml.
OVA/Alumbre para la Sensibilización:
La OVAIbúmina de huevo de gallina (OVA) se disolvió en PBS a una concentración de 1 mg/ml. La solución de OVA de 1 mg/ml se diluyó 1:1 en adyuvante de alumbre y se almacenó a 2-8 °C durante la noche hasta su uso. La concentración final de dosificación fue de 100 |jg de o Va por 200 j l de mezcla OVA/alumbre.
OVA para el desafío:
Se agregó 1 ml de PBS estéril a 10 mg de OVA para una concentración de solución de 10 mg/ml.
Se añadieron 0,35 ml de solución madre de OVA a 1,75 ml de PBS para obtener una concentración de solución de 1,67 mg/ml. Concentración final de dosificación = 50 jg de OVA en 30 lL.
Animales utilizados en el estudio:
(continuación)
GRUPOS DE PRUEBA
En la Tabla 4 que figura a continuación se enumeran los grupos experimentales utilizados en el estudio.
Tabla 4
Inducción de la Enfermedad (Grupos 2-6):
Sensibilización por O VA:
En los días 0 y 14, se administró a cada animal una inyección IP de 200 j l de emulsión de OVA/Alum que contenía 100 jg de OVA.
Desafío OVA:
En los días 14 y 25-27, se administró a cada animal una provocación intranasal de 30 j l de PBS con 50 jg de OVA. Tratamiento con el elemento de prueba:
El alicaforsen se administró a una concentración de 1mM por vía intranasal (IN) en un volumen de 30 jl. Los tratamientos se realizaron en los mismos días que la provocación con OVA, en los días 14 y 25-27 del estudio (4 tratamientos en total). Los tratamientos se administraron 1 hora después de la provocación con OVA.
Tratamiento de Control Positivo:
Se administraron 10 mg/kg de dexametasona en 200 j l de volumen/animal (por vía intraperitoneal) en los días de estudio 14 y 25-27 (4 tratamientos totales).
Observaciones y Exámenes:
Signos Clínicos:
Se realizaron exámenes cuidadosos diariamente. Se incluyeron observaciones de cambios en la piel, el pelaje, los ojos, las membranas mucosas, la aparición de secreciones y excreciones y la actividad autonómica. Se registraron los cambios significativos en la marcha, la postura y la respuesta a la manipulación, o la presencia de comportamientos extraños, temblores, convulsiones, sueño y coma.
Peso Corporal:
El peso corporal de los animales se determinó poco antes del comienzo del estudio y, a partir de entonces, dos veces por semana.
Terminación, Muestreo de Tejidos y Análisis Posteriores:
El día 28, todos los ratones fueron eutanasiados mediante una sobredosis de detamina xilacina y desangrado. Recogida y Análisis del BALF:
Se realizó un lavado bucoalveolar en los animales eutanasiados. Brevemente, se colocó un angiocatéter en la tráquea. Se instiló 1 ml de PBS en los pulmones y se dejó que fluyera de nuevo hacia la jeringa; luego se instiló el PBS y se retiró de nuevo. El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) resultante se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos. La porción no celular del BALF se almacenó a -80 °C. Los niveles de IL-13 se analizaron mediante la tecnología Luminex.
La porción celular del BALF se utilizó para analizar el influjo celular. El número total de leucocitos dentro del BALF y los diferentes tipos de células presentes se examinaron mediante citometría de flujo.
Granulocitos: CD45+; No autofluorescente; Gr-1
Eosinófilos: CD45+; No autofluorescente; Gr-1+; Siglec F+
Resultados:
Los animales sensibilizados y desafiados con la proteína OVA mostraron signos de enfermedad a la terminación del experimento, incluyendo un aumento significativo de la afluencia alveolar de leucocitos totales, granulocitos y eosinófilos en comparación con los ratones ingenuos. Además, los animales enfermos mostraron niveles significativamente mayores de IL-13 en el BALF.
El tratamiento con el control positivo dexametasona redujo significativamente las poblaciones de granulocitos y eosinófilos y los niveles de IL-13 en el BALF, indicando una reducción de la respuesta alérgica al OVA.
La administración intranasal de alicaforsen (1mM) resultó en niveles significativamente menores de leucocitos totales (células CD45+) en el BALF y redujo significativamente la proporción de eosinófilos. También hubo una reducción significativa de la frecuencia total de granulocitos en el grupo tratado con 1mM de alicaforsen en comparación con el grupo del vehículo. Además, el tratamiento con 1mM de alicaforsen condujo a niveles significativamente menores de IL-13 en el BALF. Estos datos indican una reducción de la respuesta alérgica al OVA.
Los resultados se muestran en la Figura 12 y en la Tabla 5 a continuación, los resultados demuestran el efecto antiinflamatorio del alicaforsen en un modelo murino de asma alérgica.
Tabla 5 Análisis de flujo de la media de BALF, error estándar de la media (SEM) y expresión de IL-13 en la media de
BALF SEM .
Claims (14)
1. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de SEQ ID NO:1, 40-200 mM de Na+ y 2-20mM de Mg2+; en la que la columna vertebral del oligonucleótido contiene 20 modificaciones de fosforotioato.
2. Una composición como se reivindicó en la reivindicación 1, en la que el Na+ es 100-190 mM.
3. Una composición como se reivindicó en la reivindicación 2, en la que el Na+ es 140-160mM.
4. Una composición como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una o más de hidroximetilcelulosa, metilparabeno sódico, propilparabeno sódico, fosfato sódico monobásico monohidratado, hidróxido sódico, ácido clorhídrico y/o agua.
5. Una composición como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición se presenta en forma de jarabe líquido, gel, película, crema, polvo, comprimido y/o enema.
6. Una composición como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende los siguientes componentes en las siguientes concentraciones:
SEQ ID NO:1 4 mg/ml
hidroximetilcelulosa 7-8 mg/ml
metilparabeno sódico 2,8-3,0 mg/ml
propilparabeno sódico 0,28-3 mg/ml
fosfato sódico monobásico monohidratado 4,4-4,6mg/ml
7. Una composición como se reivindicó en la reivindicación 6, en la que la concentración de:
a) la hidroximetilcelulosa es 7,5 mg/ml
b) el metilparabeno sódico es 16,6 mM
c) el propilparabeno sódico es 1,4 mM
d) el fosfato sódico monobásico monohidratado es 37,5 mM.
8. Una composición Una composición como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en medicina.
9. Una composición para su uso, como se reivindicó en la reivindicación 8, en la que el uso es para la prevención o el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, el muñón rectal, la proctitis inducida por la radiación, la pouchitis, el asma, la inflamación del ojo, el ojo seco, la rinitis, la sinusitis o la enfermedad de injerto contra anfitrión.
10. Una composición para uso como se reivindicó en la reivindicación 8, en la que la composición está en forma de enema y en la que se administran 2 mg/ml del oligonucleótido en un volumen de 10-100 ml por día.
11. Una composición para uso como se reivindicó en la reivindicación 8, en la que la composición está en forma de enema y en la que se administran 2 mg/ml del oligonucleótido en un volumen de 60 ml por día.
12. Un procedimiento para hacer una composición como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el procedimiento combinar el oligonucleótido con el 40-200 mM de Na+ y el 2-20mM de Mg2+.
13. Una composición, como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición está en forma de enema y en la que la composición está formulada en una forma de dosificación para proporcionar una concentración del oligonucleótido a 2mg/ml.
14. Una composición, como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición está en la forma de enema y en la que la composición está formulada en una forma de dosificación para proporcionar una concentración del oligonucleótido de 1-4 mg/ml.
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