ES2907862T3

ES2907862T3 - Activadores de histona acetiltransferasa y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2907862T3
Application number: ES19205945T
Authority: ES
Inventors: Yan Feng; Mauro Fa; Ottavio Arancio; Shixian Deng; Donald W Landry; Yitshak Francis
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: JP2016196459A; JP2013513618A; WO2011072243A1; JP2020059733A; JP2018027960A; ES2764999T3; EP2509590A4; EP3632901A1; EP3632901B1; JP6093180B2; EP2509590A1; EP2509590B1

Abstract

Un compuesto, en el que el compuesto es: **(Ver fórmula)** o **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN

Activadores de histona acetiltransferasa y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

Los trastornos neurodegenerativos cognitivos se caracterizan por disfunción sináptica, anomalías cognitivas y/o la presencia de cuerpos de inclusión por todo el SNC que contienen, por ejemplo, pero sin limitarse a fragmentos de beta-amiloide nativo, Tau nativa y fosforilada, alfa-sinucleína nativa y fosforilada, lipofuscina, TARDBP escindida (TDB-43), en diversos porcentajes y en relación con la enfermedad específica.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por pérdida de memoria, disfunción sináptica y acumulación de péptidos amiloide p (Ap). Está provocada en parte por niveles aumentados de péptido amiloide-p 1-42 (AP42). Aunque la enfermedad de Alzheimer (AD) se describió hace casi un siglo, los mecanismos moleculares que conducen a su desarrollo se desconocen todavía. Desde un punto de vista neuropatológico, se caracteriza por la presencia de placas de amiloide y ovillos neurofibrilares asociados con degeneración neuronal, mientras que el rasgo distintivo clínico es una pérdida de memoria progresiva asociada con varios síntomas neuropsiquiátricos.

Las histona acetiltransferasas (HAT) están implicadas en la acetilación de histonas (que conduce a activación génica), descondensación de cromosomas, reparación de ADN y modificación de sustratos distintos de histonas. El documento WO2004/053140 da a conocer diferentes compuestos como moduladores de histona acetiltransferasas.

Sumario de la invención

Los compuestos de la presente solicitud son los siguientes compuestos 6-9:

Un aspecto de la invención proporciona un método para examinar compuestos seleccionados de los compuestos 6-9 para tratar estados asociados con depósitos de péptido amiloide-beta acumulados. El método comprende (a) administrar un compuesto activador de HAT seleccionado de los compuestos 6-9 a un modelo de animal de acumulación de depósitos de péptido amiloide-beta; y (b) seleccionar un compuesto activador de HAT seleccionado de los compuestos 6-9 que puede modular la acetilación de histonas tras la administración del compuesto activador de HAT en un modelo de animal de acumulación de depósitos de péptido amiloide-beta.

Un aspecto de la invención proporciona además un método para identificar un compuesto activador de histona acetiltransferasa (HAT) seleccionado de los compuestos 6-9 para tratar estados asociados con depósitos de péptido amiloide-beta acumulados, en el que el método comprende seleccionar un compuesto activador de HAT seleccionado de los compuestos 6-9 que tiene una o más de las siguientes características: (a) la CE⁵⁰del compuesto es de no más de aproximadamente 1000 nM; (b) la actividad de acetilación de histonas in vitro selecciona como diana la proteína histona H2, H3 y/o H4; (c) el compuesto penetra la barrera hematoencefálica; (d) o una combinación de las mismas. En una realización, el compuesto tiene una masa molecular menor de aproximadamente 500 Da, tiene un área de superficie polar menor de aproximadamente 90 A², tiene menos de 8 enlaces de hidrógeno, o una combinación de las mismas, con el fin de penetrar la barrera hematoencefálica.

Un aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para la reducción de los depósitos de proteína amiloide beta (Ap) en un sujeto en el que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto activador de HAT seleccionado de los compuestos 6-9 disminuyendo de ese modo los depósitos de proteína Ap en el sujeto. En una realización, el sujeto presenta niveles anómalamente elevados de placas de amiloide beta. En otra realización, el sujeto está aquejado de enfermedad de Alzheimer, demencia por cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión o angiopatía amiloide cerebral. En una realización adicional, el depósito de proteína Ap comprende un isómero Ap⁴⁰, un isómero Ap⁴², o una combinación de isómeros. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona además el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto activador de HAT. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona además el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Otro aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para el aumento de retención de memoria en un sujeto aquejado de una enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En una realización, la enfermedad neurodegenerativa comprende adrenoleucodistrofia (ALD), alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar mortal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva, demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiples tipos con características variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, tabes dorsal o encefalopatía tóxica. En una realización, el compuesto es YF2. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona además el uso de los compuestos 6-9 en un método para el aumento de la plasticidad sináptica en un sujeto aquejado de una enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición que aumenta la acetilación de histonas en el sujeto, en el que la composición comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En una realización, la enfermedad neurodegenerativa comprende adrenoleucodistrofia (ALD), alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar mortal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva, demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiples tipos con características variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele- Richardson-Olszewski, tabes dorsal o encefalopatía tóxica. En otra realización, la plasticidad sináptica comprende aprendizaje, memoria, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la plasticidad sináptica comprende potenciación a largo plazo (LTP). En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona además el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para la mejora de los síntomas de enfermedad de Parkinson en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto activador de HAT. En una realización, el compuesto activador de HAT puede ser un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos. En una realización, los síntomas de enfermedad de Parkinson comprenden temblor, bradicinesia, discinesia, rigidez, inestabilidad postural, distonía, acatisia, demencia, coordinación motora macroscópica alterada, o una combinación de los síntomas enumerados. En otra realización, la inestabilidad postural comprende desequilibrio alterado, coordinación alterada, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención también proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En una realización, el cáncer comprende linfoma de células B, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de vejiga, linfoma de células T, mieloma, leucemia, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, neoplasias hematopoyéticas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, carcinoma de células renales, hepatoma, adenocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de próstata, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de tiroides, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de ovario, melanoma primario o metastásico, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, cáncer de cerebro, angiosarcoma, hemangiosarcoma, sarcoma óseo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, macroglobulinemia de Waldenstroom, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma de pulmón, carcinoma epitelial, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, retinoblastoma, leucemia, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, linfoma, mieloma múltiple y carcinoma medular.

Un aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de enfermedad de Huntington en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto activador de HAT. En una realización, el compuesto activador de HAT puede ser un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas

realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto aumenta la

acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas

H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende

la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una

combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para el tratamiento de una

enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad terapéutica de una

composición que comprende un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9, tratando de ese modo la enfermedad

neurodegenerativa en el sujeto. En otras realizaciones, la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg

de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso

corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal,

al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos

aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos

aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la composición cruza la barrera

hematoencefálica. En una realización, la enfermedad neurodegenerativa comprende adrenoleucodistrofia (ALD),

alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica

(enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de

Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de

Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar mortal, degeneración del

lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad

de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia

espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick,

enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria,

enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva,

demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder,

degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiples tipos con

características variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele- Richardson-Olszewski, tabes dorsal o

encefalopatía tóxica. En otra realización, la plasticidad sináptica comprende aprendizaje, memoria, o una combinación

de los mismos. En algunas realizaciones, la plasticidad sináptica comprende potenciación a largo plazo (LTP). En

otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de

histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones

adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9,

H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en un método para disminuir cuerpos de inclusión

en un sujeto aquejado de un trastorno neurodegenerativo, comprendiendo el método administrar a un sujeto una

cantidad terapéutica de una composición que comprende un compuesto activador de HAT seleccionado de los

compuestos 6-9, disminuyendo de ese modo los cuerpos de inclusión en el sujeto. En una realización, los cuerpos de

inclusión comprenden péptidos beta-amiloide, proteínas Tau nativas y fosforiladas, alfa-sinucleína nativa y fosforilada,

lipofuscina, TARDBP escindida (TDB-43), o una combinación de las mismas. En otra realización, el sujeto presenta

niveles anómalamente elevados de placas de amiloide beta. En una realización adicional, los péptidos beta-amiloide

comprenden un isómero AP40, un isómero AP42, o una combinación de isómeros. En otras realizaciones, la cantidad

eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximad

corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente

al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg

aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 orporal, al men aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 orporal, al men aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 orporal, al men aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 orporal, al men aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 orporal, al men aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de

realizaciones, la composición cruza la barrera hematoencefálica. En una realización, la enfermedad neurodegenerativa

comprende adrenoleucodistrofia (ALD), alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de

Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten

(también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE),

enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob,

insomnio familiar mortal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a

VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad

de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva, demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiples tipos con características variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, tabes dorsal o encefalopatía tóxica. En otra realización, la plasticidad sináptica comprende aprendizaje, memoria, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la plasticidad sináptica comprende potenciación a largo plazo (LTP). En otras realizaciones, el compuesto aumenta la acetilación de histonas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas. En realizaciones adicionales, la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de acetilación de histona 3 del hipocampo de ratones.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra el condicionamiento por miedo contextual de ratones con déficit de memoria infundidos con AP42. Solo los compuestos 6-9 son compuestos según esta invención. Todos o los otros compuestos mencionados en la descripción o los dibujos son compuestos de referencia.

La figura 3 es la estructura química del compuesto principal YF2, un agonista/activador de HAT.

La figura 4 es la estructura química del compuesto 6J (CTB), N-(4-cloro-3-trifluorometil-fenil)-2-etoxi-benzamida. 6J no tenía solubilidad y precipitó tan pronto como se puso en H2O.

La figura 5 es la estructura química del compuesto MOM (YF1). YF1 se administró a 25 mg/kg a ratones WT (por vía i.p.). Se extirparon el hígado e hipocampo de los ratones 1 h después del tratamiento. El hipocampo e hígado no tenían aumento en los niveles de AcH3.

La figura 6 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de acetilación de H3 en el hígado e hipocampo.

La figura 7 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de acetilación de H3 en el hígado, el córtex y el hipocampo de ratones a los que se les administraron mediante sonda nasogástrica y por vía i.p. mg/kg del agonista de HAT, MOM. Posteriormente se sometieron los ratones a tratamiento de acondicionamiento por miedo para observar si el fármaco es activo tras la inducción de aprendizaje.

La figura 8 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de acetilación de H3 en el córtex y el hipocampo. Se les administró a los ratones MOM por medio de una cánula (100 |ig/|il por lado) o se les administró a los ratones YF2 (50 mg/kg, por vía i.p.).

La figura 9 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de acetilación de H3 en el hipocampo. Se les administró a los ratones YF2 (por vía i.p. disuelto en solución salina) a 5 mg/kg, 10 mg/kg, o 20 mg/kg.

La figura 10 es un gráfico de barras que demuestra las respuestas de acondicionamiento por miedo señalado después de la administración del activador de HAT, YF2, a ratones tratados con amiloide-beta (Ap o A-beta).

La figura 11 es un gráfico de barras que demuestra las respuestas de acondicionamiento por miedo contextuales después de la administración del activador de HAT, YF2, a ratones tratados con amiloide-beta (Ap o A-beta).

La figura 12 es un gráfico de barras que demuestra la evaluación del umbral sensorial en ratones tratados con vehículo, YF2 solo, Ap solo o YF2 más Ap.

La figura 13 es un gráfico que muestra la cinética del agonista de HAT, YF2, en la sangre. Se administró YF2 (20 mg/kg por vía i.p.) a ratones y luego se tomaron muestras de sangre de las colas a diferentes puntos de tiempo. La figura 14 es un gráfico que muestra los resultados del laberinto de agua de brazos radiales para ratones a los que se les administró el agonista de HAT, YF2.

La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de los ensayos de plataforma para ratones a los que se les administró el activador de HAT, YF2.

La figura 16 es un gráfico que muestra la velocidad de los ratones durante el laberinto de agua de brazos radiales a los que se les administró el activador de HAT, YF2.

La figura 17 es un gráfico que muestra que TSA revierte la alteración de CA1-LTP en cortes de ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad. Gráfico de resumen que muestra que la inhibición de HDAC de 30 min mejora LTP en ratones APP/PS1 sin efecto sobre los compañeros de camada WT. *p<0,05 en comparación con cortes de APP/PS1 tratados con vehículo (ANOVA de dos vías). La barra horizontal representa la aplicación de TSA. Las 3 flechas corresponden a la ráfaga 0. Ratones APP/PS1 tratados con TSA y WT (n=7 y n=8, respectivamente), ratones APP/PS1 y WT tratados con vehículo (n=6).

La figura 18 es un gráfico que muestra que la inhibición de HDAC mejora FC contextual en ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad. (Nivel inicial) Compañeros de camada APP/PS1 y WT tratados con TSA o vehículo no muestran diferencias en la congelación inmediata en la cámara de entrenamiento. (24 h) FC contextual realizado 24 h después del entrenamiento muestra una reducción de la congelación en ratones APP/PS1 tratados con vehículo en comparación con compañeros de camada WT tratados con vehículo. El tratamiento con TSA mejora el déficit en las respuestas de congelación en ratones APP/PS1, y no tiene efecto en ratones WT. * p<0,05 frente a APP/PSI-vehículo. (n=13 para todos los grupos).

La figura 19 es un esquema de un híbrido de CBP/Gal4 y un plásmido indicador en el que la expresión de luciferasa está dirigida por un promotor de levadura Gal4. CBP es una proteína de unión a CREB.

La figura 20 son gráficos que muestran el papel de CBP y su región de HAT sobre la transcripción tras la estimulación con PS1. La figura 20A representa la actividad luciferasa relativa en células F11 cotransfectadas con 2 |ig de un constructo de promotor-indicador que contiene sitios de unión a ADN de Gal4 en el sentido de 5' del gen de luciferasa y constructos que contienen o bien CBP funcional (WT-CBP) o bien un mutante que carece de actividad de HAT (WY-CBP) unidos al dominio de unión al ADN de Gal4. Se transfectaron las células con WT o PS1 mutada. Los valores se expresan en relación con el nivel de luciferasa en células de control, neurales transfectadas con Gal-luciferasa y Gal-CBP. n=3 por cada grupo. t=7,788, p= 0,0015 frente al control; * p<0,05 frente al control. La figura 20B muestra la actividad luciferasa basal en células F11 cotransfectadas con 2 |ig de sitios de unión a ADN de Gal4 en el sentido de 5' del gen de luciferasa y constructos que contienen o bien WT-CBP o bien WY-CBP unidos al dominio de unión al ADN de Gal4. No se encontraron diferencias significativas.

La figura 21 muestra fotografías de inmunotransferencias de tipo Western que muestran que la expresión endógena de CBP y PCAF se reduce en ratones APP/PS1. Se observó una disminución en los niveles de PCAf y CBP, pero no en p300 o GCN5, en ratones infundidos con Ap. Ratones APP/PS1 de 4 meses de edad presentaban niveles de CBP reducidos en comparación con los controles WT.

La figura 22 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra que la expresión de H4 acetilada se reduce en ratones APP/PS1 1 hora después de FC contextual. El tratamiento con TSA, 2 horas antes del entrenamiento, rescató el defecto de nivel de acetilación de histona 4 de ratones Tg. n=3 por cada grupo.

La figura 23 es un esquema que muestra que se recluta CBP para actuar como puente entre CREB fosforilada unida al ADN y la maquinaria de transcripción basal ubicada en el sitio de iniciación de la transcripción. Además, CBP actúa como HAT, haciendo que la cromatina sea más accesible y aumentando la transcripción de genes asociados a memoria. A diferencia de CBP, las HDAC eliminan un grupo acetilo de las histonas, restringiendo por tanto el acceso de la maquinaria de transcripción al ADN (se modificó la figura a partir de [B1]).

La figura 24 representa que la inhibición de HDAC mejora el acondicionamiento por miedo contextual en ratones en los que los hipocampos dorsales se infundieron con una preparación que contenía AP42 oligomérico. La figura 24A es una representación esquemática de cánulas implantadas bilateralmente en los hipocampos dorsales. La figura 24B es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western de Tris-tricina PAGE que representa el análisis de la preparación de Ap en condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, que muestra diferentes bandas correspondientes a monómeros (4,5 kDa), trímeros (13,5 kDa) y tetrámeros (18 kDa). La figura 24C es un gráfico que representa: (Nivel inicial) Infusiones bilaterales de AP42 humano (200 nM en un volumen final de 1 |il lentamente a lo largo de 1 min) en hipocampos dorsales, 15 min antes del entrenamiento, no afectan a la congelación inmediata en la cámara de entrenamiento o bien conjuntamente con TSA o bien vehículo inyectado (por vía i.p) 2 h antes del entrenamiento. (24 h) El acondicionamiento por miedo contextual realizado 24 h después del entrenamiento muestra una reducción de la congelación en ratones infundidos con Ap a los que se les inyectó vehículo en comparación con ratones infundidos con vehículo a los que se les inyectó vehículo. El tratamiento con TSA mejora el déficit en las respuestas de congelación en ratones infundidos con Ap, y no tiene efecto en ratones infundidos con vehículo. (Ratones infundidos con Ap con inyección de TSA: n=14, ratones infundidos con Ap con inyección de vehículo: n=12, ratones infundidos con vehículo con inyección de TSA: n=8 y ratones infundidos con vehículo con inyección de vehículo: n=11).

La figura 25 representa la reducción de la acetilación de histonas en ratones APP/PS1. La figura 25A es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western (parte superior) y los resultados normalizados en forma gráfica (parte inferior). Inmunotransferencia de tipo Western de extractos proteicos de ratones APP/PS1 y WT, a los que se les inyectaron vehículo y TSA 2 horas antes del entrenamiento, y sacrificados 1 hora después del acondicionamiento por miedo contextual. Los animales APP/PS1 tratados con vehículo mostraron una disminución en los niveles de H4 acetilada. Sin embargo, los ratones APP/PS1 tratados con TSA mostraron una potenciación de la acetilación de H4, alcanzando los mismos niveles de acetilación que los ratones WT tratados con TSA. Los resultados se normalizaron frente a ratones WT tratados con vehículo. n=4 por cada grupo excepto para ratones WT tratados con TSA con n=5. La figura 25B es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western (parte superior) y los resultados normalizados en forma gráfica (parte inferior). Los niveles de acetilación de H4 basales en ratones APP/PS1 y compañeros de camada WT, que se expusieron al contexto sin recibir un choque eléctrico, eran similar n=3 por cada grupo. Los datos mostrados en la figura 25A y la figura 25B se presentan como una razón de H4 acetilada con respecto a H4 total.

La figura 26 es un esquema de síntesis que muestra la síntesis y la evaluación de la actividad de HAT del agonista MOM. La figura 26A muestra que el ácido o-etoxibenzólico se sometió a reflujo en SOCl²(1,66 g, 10 mmol) durante la noche. La eliminación del disolvente orgánico a vacío dio el correspondiente cloruro de benzoílo, que se disolvió en 20 ml de CH²Cl², seguido por la adición de 4-cloro-3-trifluorometilanilina (1,96 g, 10 mmol). La disolución resultante se puso en un baño de hielo-H²O y se añadieron 20 ml de disolución acuosa de NaHCO³saturada gota a gota. Entonces se permitió que la mezcla reaccionara a temperatura ambiente durante 4 horas. Se separó la fase orgánica y se lavó con HCl 2 N, H²O y salmuera. Tras secarse sobre Na²SO⁴, se eliminó el disolvente orgánico a vacío para producir un compuesto cristalino blanquecino como producto deseado (3,1 g, rendimiento del 90%). La figura 26B es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra que los niveles endógenos de H3 acetilada aumentan mediante MOM (100 |ig en 1 |il infundido en los hipocampos dorsales a través de cánulas) en hipocampos de ratón que se recogieron 2 h después de la administración del agonista.

La figura 27 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra que la acetilación de histonas se reduce en ratones infundidos con Ap (A-beta). Los animales infundidos con A-beta tratados con vehículo mostraron una disminución en los niveles de H3/4 acetilada tanto antes como después siguiendo la memoria asociativa.

La figura 28 es un esquema de la acetilación de histonas y el papel de HAT en la misma. YF2 es un ejemplo de un compuesto que activa HAT.

La figura 29 es un esquema de la síntesis del compuesto activador de HAT, YF2.

La figura 30 es un esquema que muestra el papel de un inhibidor de HDAC (HDACi; por ejemplo, TSA) en la acetilación y desacetilación de histonas.

La figura 31 son gráficos que muestran el efecto de YF2 sobre la viabilidad de células cancerosas en células NCI45 ADR-RES (figura 31A; cáncer de ovario), células U251 (figura 31B; células de glioblastoma), células Hs578T (figura 31C; células de cáncer de mama) y células CCRF-CEM (figura 31D; células de leucemia). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

Las figuras 32A-B son gráficos que muestran el efecto de YF2 sobre la proliferación de células cancerosas en células NCI-ADR-RES (figura 32A; cáncer de ovario) y células U251 (figura 32B; células de glioblastoma).

Las figuras 32C-D son gráficos que muestran el efecto de YF2 sobre la proliferación de células cancerosas en células Hs578T (figura 32C; células de cáncer de mama) y células CCRF-CEM (figura 32D; células de leucemia).

La figura 33 es una tabla que muestra las mediciones de CI⁵⁰para YF2 y vinblastina (VBL) sobre la viabilidad celular (columna de Cell Titer Glo) y la proliferación celular (columna de Cyquant) en células NCI-ADR-RES (cáncer de ovario), células U251 (células de glioblastoma), células Hs578T (células de cáncer de mama), células CCRF-CEM (células de leucemia), células ACHN (células de carcinoma renal humano) y células A549 (células de carcinoma de pulmón humano).

La figura 34 es un gráfico que muestra la especificidad de YF2. YF2 activa la proteína de unión a CREB (CBP) y la histona acetiltransferasa, GCN5.

La figura 35 son gráficos que muestran el efecto de YF2 sobre la viabilidad de células cancerosas en células ACHN (figura 35A; células de carcinoma renal humano) y células A549 (figura 35B; células de carcinoma de pulmón humano). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

La figura 36 son gráficos que muestran el efecto de YF2 sobre la proliferación de células cancerosas en células ACHN (figura 36A; células de carcinoma renal humano) y células A549 (figura 36B; células de carcinoma de pulmón humano).

La figura 37 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 10.

La figura 38 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 20.

La figura 39 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 11.

La figura 40 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 12.

La figura 41 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 14.

La figura 42 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 13.

La figura 43 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 15. El esquema de síntesis continúa en una segunda página en la línea discontinua.

La figura 44 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 16.

La figura 45 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 17.

La figura 46 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 18.

La figura 47 son gráficos que muestran el efecto de vinblastina sobre la viabilidad de células cancerosas en células NCI-ADR-RES (figura 47A; cáncer de ovario), células U251 (figura 47B; células de glioblastoma), células Hs578T (figura 47C; células de cáncer de mama) y células CCRF-CEM (figura 47D; células de leucemia). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

La figura 48 son gráficos que muestran el efecto de vinblastina sobre la viabilidad de células cancerosas en células ACHN (figura 48A; células de carcinoma renal humano) y células A549 (figura 48B; células de carcinoma de pulmón humano). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

Las figuras 49A-B son gráficos que muestran el efecto de vinblastina sobre la proliferación de células cancerosas en células NCI-ADR-RES (figura 49A; cáncer de ovario) y células U251 (figura 49B; células de glioblastoma). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

Las figuras 49C-D son gráficos que muestran el efecto de vinblastina sobre la proliferación de células cancerosas en células Hs578T (figura 49C; células de cáncer de mama) y células CCRF-CEM (figura 49D; células de leucemia). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

La figura 50 son gráficos que muestran el efecto de vinblastina sobre la proliferación de células cancerosas en células ACHN (figura 50A; células de carcinoma renal humano) y células A549 (figura 50B; células de carcinoma de pulmón humano). Los valores representan un promedio de 3 pocillos. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

La figura 51 es un esquema de síntesis para el compuesto activador de HAT, 19.

La figura 52 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC 1.

La figura 53 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC3/NCOR2. La figura 54 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC5FL. La figura 55 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC7.

La figura 56 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC8.

La figura 57 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC10.

La figura 58 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC11.

La figura 59 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de Sirtuina 1. La figura 60 es un

gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de Sirtuina 2. La figura 61 gráfico que muestra el efecto del inhibidor de HDAC, SAHA, sobre la actividad de HDAC1.

La figura 62 es un gráfico que muestra el efecto del inhibidor de HDAC, SAHA, sobre la actividad de HDAC3/NCOR2.

La figura 63 es un gráfico que muestra el efecto del inhibidor de HDAC, SAHA, sobre la actividad de HDAC6.

La figura 64 muestra que una administración aguda de YF2 aumentaba la acetilación específica de H3, H4 y H2B en lisados de hipocampo. n=3 y p<0,05 por grupo.

La figura 65 es una fotografía de una inmunotransferencia de tipo Western que muestra que YF2 (por vía i.p., 5 mg/kg) era capaz de rescatar la disminución inducida por Ap en los niveles de acetilación de H3 (n=3 por cada grupo, p<0,05). Se infundió Ap (200 nM en un volumen final de 1 |il a lo largo de 1 min, 75 min antes de que se sacrificaran los ratones) a través de cánulas sobre hipocampos dorsales.

Las figuras 66A-B son gráficos que muestran el efecto beneficioso de YF2 sobre la disfunción cognitiva y sináptica inducida por AP⁴². YF2 mejora el déficit de LTP en cortes tratados con AP⁴²(figura 66A; el gráfico representa el promedio de los últimos 5 min de registro a los 60 min después del tétanos) P<0,05. YF2 mejora el déficit de memoria por miedo contextual en ratones infundidos con AP⁴², P<0,01 (figura 66B).

La figura 66C es un gráfico que muestra el efecto beneficioso de YF2 sobre la disfunción cognitiva inducida por AP⁴²usando una prueba de laberinto de agua/memoria de referencia. YF2 mejora el déficit de memoria de referencia en ratones infundidos con AP⁴², P<0,01.

La figura 67 muestra gráficos que representan el efecto beneficioso de YF2 frente al defecto de la memoria en ratones APP/PS1 usando pruebas de memoria de referencia o acondicionamiento por miedo. YF2 mejora el déficit de memoria de referencia (figura 67A) y por miedo contextual (figura 67B) en ratones APP/PS1 en comparación con compañeros de camada WT (P<0,02 para ambas pruebas).

Las figuras 68A-B muestran que YF2 rescata la reducción en los niveles de H3 acetilada tras la infusión de AP⁴².

La figura 69 son gráficos que muestran la latencia y velocidad en alcanzar una plataforma visible y una evaluación en campo abierto de YF2 en ratones infundidos con AP⁴².

La figura 70 muestra que los niveles de acetilación de histonas se reducen en pacientes con AD. En comparación con el control, los pacientes con enfermedad de Alzheimer mostraron una disminución en la acetilación de residuos de histona importantes para la memoria.

La figura 71 es un gráfico que muestra las propiedades farmacocinéticas de YF2. La cantidad de YF2 en el cerebro es mayor que en el plasma. YF2 se absorbe rápidamente en el cerebro (véase la tabla 14). Las semividas de eliminación de YF2 en el cerebro y el plasma son de ~40 min. La distribución de YF2 en el cerebro es rápida. YF2 no induce ningún efecto adverso hasta 300 mg/kg (por vía i.p.) en experimentos de toxicidad aguda.

La figura 72A son curvas de respuesta a la dosis para la activación de CBP, p300, PCAF y GCN5 humanos por diferentes concentraciones de YF2.

La figura 72B es una tabla que representa los valores de CE⁵⁰calculados de CBP, p300, PCAF y GCN5.

La figura 73 es un gráfico que muestra los valores de inhibición del crecimiento de líneas celulares del NIH para el tratamiento con YF2 10 |iM.

La figura 74 es un gráfico que muestra el efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la actividad de HDAC6.

Descripción detallada de la invención

Se cree que los cambios amnésicos tempranos en la enfermedad de Alzheimer (AD) están vinculados a la disfunción sináptica. Se ha encontrado que el p-amiloide (Ap), un péptido que está presente en altas cantidades en la enfermedad, inhibe la memoria^[P1P2]y su modelo electrofisiológico, la potenciación a largo plazo (LTP)^[P3-P8]. Se sabe que la memoria está modulada por la epigenética a través de la regulación de la expresión génica. La epigenética se define como el mecanismo que cambia la expresión génica “marcando” el ADN o sus proteínas asociadas, a través de procedimientos tales como metilación del ADN y modificación de histonas (H), sin cambiar la propia secuencia de ADN ^[P9]. La modificación de histonas mediante, por ejemplo, la adición o eliminación de grupos funcionales acetilo o metilo provoca que la estructura de la cromatina se abra o se cierre, de modo que la información contenida dentro del ADN se hace más o menos accesible a los factores de transcripción. Por tanto, no es sorprendente que la desregulación de uno de los mecanismos epigenéticos pudiera conducir a alteración de la memoria. Por ejemplo, la reducción de la acetilación de histonas provoca que la estructura de la cromatina se cierre, de modo que la información contenida dentro del ADN podría ser menos accesible a factores de transcripción y formación de memoria^[P9].

La principal estrategia que se usa actualmente para regular por incremento la acetilación de histonas implica la inhibición de las histona desacetilasas (HDAC), enzimas que eliminan un grupo acetilo de las histonas. Sin embargo, el efecto pleiotrópico de la inhibición inespecífica de HDAC puede obstaculizar el potencial terapéutico de los inhibidores de HDAC[P10-P13].

Las HAT comparten un motivo altamente conservado que contiene un sitio de unión de acetil-CoA. Las HAT pueden estar implicadas en la patología de cáncer, asma, enfermedades neurodegenerativas e infección viral. Esto indica que activadores de HAT específicos son posibles herramientas para la investigación farmacológica y podrían encontrar aplicaciones terapéuticas. Hasta la fecha solo un grupo ha notificado activadores de HAT. Sin embargo, sus compuestos no son solubles ni penetran en la membrana, lo que no los hace buenos candidatos a fármacos para el tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente.

Esta invención trata sobre la síntesis de una nueva clase de activadores de HAT, que tienen buena potencia, excelente solubilidad, perfiles farmacocinéticos razonables y buena permeabilidad de la membrana y la barrera hematoencefálica (BHE), por tanto, pueden usarse como un nuevo medicamento con una cantidad mínima de efectos secundarios para pacientes con enfermedades neurodegenerativas y cánceres.

La invención proporciona compuestos con actividad histona acetiltransferasa, potencia de activación de HAT, alta selectividad, farmacocinética razonable y buena permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Estos compuestos pueden usarse para minimizar los efectos secundarios para pacientes con AD, la tercera enfermedad más costosa en los EE.UU., tal como mejorar la cognición o memoria en AD y patologías similares al Alzheimer, así como para minimizar los efectos secundarios para sujetos aquejados de otras enfermedades neurodegenerativas. Los compuestos de la invención también pueden desarrollarse como fármacos anticancerígenos.

En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para identificar activadores de HAT que pueden acetilar proteínas histona aumentando así la expresión génica en un sujeto dando como resultado memoria y cognición potenciadas.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona la utilización de agonistas de HAT como potenciadores de la memoria en sujetos normales (por ejemplo, un sujeto no aquejado de una enfermedad neurodegenerativa). En realizaciones adicionales, la invención proporciona la utilización de agonistas de HAT como potenciadores de la memoria en sujetos en envejecimiento (por ejemplo, un sujeto que tiene > 55 años). En realizaciones adicionales, la invención proporciona la utilización de agonistas de HAT como potenciadores de la memoria para otros estados asociados con disminución/deterioro cognitivo. Los ejemplos no limitativos de estados asociados con disminución/deterioro cognitivo incluyen una variedad de síndromes asociados con retraso mental y síndromes asociados con discapacidades del aprendizaje, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick, una enfermedad por cuerpos de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, síndrome de Down, atrofia multisistémica, degeneración neuronal con acumulación de hierro cerebral de tipo I (enfermedad de Hallervorden-Spatz), insuficiencia autonómica pura, trastorno del comportamiento del sueño REM, deterioro cognitivo leve (MCI), angiopatía amiloide cerebral (CAA), déficit cognitivo leve, envejecimiento, demencias vasculares mixtas con enfermedad de Alzheimer, una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por deposición anómala de amiloide, y cualquier combinación de los mismos.

Para reducir el conjunto de candidatos de compuestos activadores de HAT que van a someterse a prueba en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, tales como animales que presentan niveles elevados de cuerpos de inclusión, por ejemplo modelos animales de acumulación de Ap (por ejemplo, modelos animales de AD), o, por ejemplo, un modelo de ratón para la enfermedad de Huntington, los activadores de HAT pueden examinarse o seleccionarse en primer lugar basándose en su posesión de determinadas características, tales como tener una o más de: una CE⁵⁰no mayor de aproximadamente 100 nM; una actividad de acetilación de histonas in vitro; y la capacidad de penetrar la BHE.

En algunas realizaciones, el conjunto de candidatos de activadores de HAT que van a someterse a prueba en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, tales como, pero sin limitarse a, animales que presentan niveles elevados de cuerpos de inclusión, por ejemplo modelos animales de acumulación de Ap (por ejemplo, modelos animales de AD ), o, por ejemplo, un modelo de ratón para la enfermedad de Huntington, puede examinarse o seleccionarse en primer lugar basándose en estrategias de “química médica”. Por ejemplo, basándose en el análisis de la estructura de los activadores de HAT notificados, puede generarse una clase de armazones estructuralmente relacionados, pero no obstante formalmente independientes, que van a considerarse candidatos a activadores de HAT. Los compuestos derivados de estos armazones pueden examinarse y seleccionarse en primer lugar en modelos computacionales. Los compuestos con la puntuación más alta se sintetizarán y someterán a prueba para determinar su potencia. En esta fase, el esfuerzo de síntesis se guiará por los resultados de las pruebas de potencia/selectividad. Los compuestos con potencia y selectividad satisfactorias (compuestos principales) se estudiarán adicionalmente para determinar su PK, biodisponibilidad/penetración cerebral y actividades fuera de diana (seguridad). Los compuestos seleccionados pueden someterse a prueba en los modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, tales como, pero sin limitarse a, animales que presentan niveles elevados de cuerpos de inclusión, por ejemplo modelos animales de acumulación de Ap (por ejemplo, modelos animales de AD), o un modelo de ratón para enfermedad de Huntington para determinar si aumentan la expresión génica en un sujeto, dando como resultado memoria y cognición potenciadas. Tal como se usa en el presente documento, un compuesto activador de HAT no excluye necesariamente la posibilidad de que el compuesto también pueda inhibir otras HAT.

Acetilación y metilación de ADN e histonas

El ADN eucariota está altamente organizado y empaquetado en el núcleo. La organización y el empaquetamiento se logran a través de la adición de proteínas, incluyendo las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, que forman una estructura compleja, la cromatina, junto con ADN (véase la figura 28). La modificación de las histonas centrales es de importancia fundamental para los cambios conformacionales de la cromatina. El nivel de acetilación se refiere a actividad de transcripción, y entonces la acetilación induce una conformación de cromatina abierta que permite el acceso de la maquinaria de transcripción a los promotores. La histona desacetilasa (HDAC) e histona acetiltransferasa (HAT) son enzimas que influyen en la transcripción desacetilando o acetilando selectivamente los grupos D-amino de lisinas ubicadas cerca de los extremos amino terminales de las proteínas histonas centrales. La acetilación de la cromatina se correlaciona con la actividad transcripcional (eucromatina), mientras que la desacetilación se correlaciona con el silenciamiento génico. De manera interesante, se mostró que el aumento de la acetilación de H3 en el área CA1 del hipocampo (un área en el cerebro que desempeña un importante papel en la memoria a largo plazo) se produce tras la memoria asociativa. Adicionalmente, al inhibir HDAC, eran capaces de manipular los cambios en la cromatina y potenciar la formación de memoria a largo plazo.

La acetilación y desacetilación de histonas se reconocen cada vez más por su contribución a la regulación estrecha de la activación y el silenciamiento génico, respectivamente. Por tanto, no es sorprendente que la desregulación de estos mecanismos pueda conducir a la alteración de la expresión génica asociada a la memoria, dando como resultado varios síndromes asociados con retraso mental.

Histonas. El ADN se enrolla en primer lugar alrededor de un complejo de octámero de histonas (H) formando unidades nucleosomales, dando el aspecto de perlas sobre una cuerda [B31]. A su vez, estas unidades nucleosomales se pliegan dando una fibra de cromatina de orden superior [B32]. Cada complejo de octámeros de histonas contiene dos copias de histonas H3 y H4 bordeadas por dos copias de histonas 2A y 2B [B32]. H1 y su variante aviar H5 son histonas ligadoras que unen el nucleosoma y tanto los sitios de entrada como de salida del ADN, bloqueando por tanto el ADN en su lugar y permitiendo la formación de una estructura de orden superior. Cada histona tiene un dominio globular, que media en interacciones histona-histona, y una extensión de 'cola' N-terminal. Los núcleos de histona y en particular sus colas son diana para un número considerable de modificaciones covalentes, tales como acetilación, ubiquitinación, sumoilación, fosforilación, citrulinación, ADP-ribosilación y metilación [B33]. Se encontró que las modificaciones de histonas asociadas con transcripción génica activa, tales como metilación de Lys4 de H3 y acetilación de Lys56 de H3, conducían a expresión génica. Por otro lado, se encontró que las modificaciones de histonas asociadas con la inactivación de la transcripción génica, tales como metilación de Lys27 de H3 y ubiquitinación de Lys119 de H2A provocaban silenciamiento génico. De particular interés para esta solicitud son las histonas 2B, 3 y 4 porque se ha mostrado que están implicadas en procesos de memoria [B l9, B25].

HAT y HDAC. Se ha propuesto que las modificaciones de histonas y sus combinaciones están implicadas en la regulación génica modificando la accesibilidad de la cromatina y actuando como sitios de acoplamiento para factores de transcripción y enzimas modificadoras [B34, B35]. Una de las modificaciones de histonas más estudiadas es la acetilación de los residuos de lisina conservados evolutivamente en los extremos N-terminales de histonas por histona acetiltransferasa (HAT). En cambio, se encontró que la desacetilación de histonas, catalizada por histona desacetilasa (HDAC), empaquetaba el ADN dando una forma más condensada, limitando el acceso de factores de transcripción y actuando por tanto como un silenciador génico [B36]. Las HAT implicadas en la regulación de la expresión génica incluyen al menos tres grupos de enzimas [B37]. El control general no desreprimible (Gcn5) es el miembro fundador de las Gcn5 N-acetiltransferasas (GNAT). Los miembros de la familia GNAT incluyen Gcn5, PCAF, Elp3, HAT1m Hpa2 y Nut1. La familia MYST se nombra después de los miembros fundadores de la familia: Morf, Ybf2, Sas2 y Tip60 [B37]. Además, otras proteínas incluyendo CBP/p300, Taf1 y varios coactivadores de receptores nucleares se ha mostrado que presentan actividad de HAT intrínseca. Sin embargo, estas proteínas no contienen un dominio consenso y por tanto representan una “clase huérfana” de enzimas HAT [B37].

Las HDAC forman complejos de represor con activadores de la transcripción y con otras HDAC [B38]. Las HDAC de mamífero pueden dividirse en las familias clásicas y de proteína relacionada con regulador 2 de información silenciosa (SiR2) (sirtruina) [B39]. En seres humanos, los miembros de la familia clásica tienen otra subdivisión, que incluye las clases I, II y IV, que comparten similitud de secuencia y requieren Zn+ para la actividad desacetilasa. Las HDAc de clase I (HDAC 1-3, HDAC8) están relacionadas con el represor génico de levadura Rpd3p, y son subunidades de al menos dos complejos de correpresor distintos, el complejo de Sin3 y el complejo de NuRD. Las HDAC de clase II (HDAC4-7, 9 y 10) son similares a la HDAC Hdalp de levadura, actúan como represores génicos y se han implicado en diversos papeles en diferenciación y desarrollo celulares. La clase IV comprende HDAC11, que tiene algunas características de tanto HDAC de clase I como de clase II. La familia de sirtruina incluye HDAC de clase III (SIRT1-7), que son similares a SiR2 de levadura. Las HDAC de clase III son bioquímica y estructuralmente distintas de la familia clásica y requieren NAD+ como cofactor. Las HDAC parecen estar implicadas en el silenciamiento génico y la formación de heterocromatina en los centrómeros y telómeros (para una revisión véase [B40]).

Las alteraciones en las modificaciones epigenéticas incluyendo acetilación y mutilación de ADN e histonas pueden contribuir a cambios en la expresión génica en cáncer y enfermedades neurológicas. La adición de un grupo acetilo sobre las histonas por histona acetiltransferasas (HAT) potencia la expresión génica, mientras que su eliminación por histona desacetilasas (HDAC) reduce la expresión génica. Se ha encontrado una reducción en la acetilación de histonas en una variedad de dolencias tales como tumores, trastornos del estado del ánimo y enfermedades neurodegenerativas. Los ejemplos de HAT incluyen, pero no se limitan a GCN5, GCN5L, PCAF, Ha T1, ELP3, HPA2, ESA1, SAS2, SAS3, TIP60, HBO1, MOZ, MORF, MOF, SRC1, SRC3, TIF2, GRIP1, ATF-2 [véanse Lee y Workman (2007) Nat Rev Mol Cell Biol., 8(4):284-95, Marmorstein (2001) J Molec Biol. 311: 433-444; y Kimura et al., (2005) J Biochem. 138(6): 647-662, que se incorporan cada uno en el presente documento mediante referencia en su totalidad]. En una realización, el compuesto activador de HAT de la invención se refiere a GCN5, GCN5L, HAT1, PCAF, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el compuesto activador de HAT de la invención se refiere a proteínas que presentan actividad de HAT intrínseca, tales como coactivadores de receptores nucleares (por ejemplo, CBP/p300 y Tafl). En otra realización, la acetilación de histonas H2, H3 y/o H4 aumenta. En algunas realizaciones, el compuesto activador de HAT es YF2, representado en la figura 3.

Se ha mostrado que el aumento de la acetilación de histonas mejora el desenlace en una amplia variedad de enfermedades tan diversas como asma, enfermedad infecciosa y enfermedades psiquiátricas. Aunque están actualmente en marcha ensayos clínicos de varios inhibidores de HDAC, la estrategia alternativa en la que la acetilación de histonas se aumenta mediante la activación de HAT no se ha explorado extensamente. Por ejemplo, los compuestos en la publicación de patente estadounidense n.° US2009076155 y la publicación PCT n.° WO2004053140 tienen escala solubilidad y permeabilidad por la membrana. Además, los compuestos dados a conocer en las solicitudes de patente no dan a conocer ningún dato para el tratamiento de ninguna enfermedad.

Ningún activador de HAT está actualmente en ensayos farmacológicos, sin embargo varios inhibidores de HDAC están actualmente en ensayos clínicos. Algunos de estos inhibidores de HDAC (HDACi) han mostrado eficacia terapéutica en ensayos preclínicos. Sin querer restringirse a la teoría, los activadores de HAT pueden ser un candidato a fármaco útil con un papel similar a HDACi. Sin embargo, los activadores de HAT anteriormente disponibles tenían poca solubilidad y permeabilidad por la membrana, haciéndolos inadecuados como fármacos.

Varios HDACi están en ensayos para cáncer, algunos de los cuales son, por ejemplo, 4SC-202 (Nycomed, Alemania), que está en fase preclínica; AR-42 (Arno therapeutics, Parsippany, N j) que está en fase preclínica; belinostat (TopoTarget, Rockaway, NJ) que está en ensayos clínicos en fase II; y entinostat (Bayer Schering) que está en ensayos clínicos en fase II. Por ejemplo, en la tabla 3 de Lane y Chabner (2009, J Clin Oncol., 27(32):5459-68; incorporado en el presente documento mediante referencia en su totalidad), se comentan ensayos clínicos seleccionados de inhibidores de HDAC, que incluyen vorinostat, depsipéptido y MGCD0103. En la tabla 2 de Lane y Chabner (2009, J Clin Oncol., 27(32):5459-68; incorporado en el presente documento mediante referencia en su totalidad), se comentan inhibidores de HDAC seleccionados en desarrollo o uso clínico, que incluyen compuestos de ácido hidroxámico (por ejemplo, vorinostat, tricostatina A, LAQ824, panobinostat, belinostat y ITF2357), compuestos de tetrapéptidos cíclicos (por ejemplo, depsipéptido), compuestos de benzamida (por ejemplo, entinostat y MGCD0103) y compuestos de ácidos alifáticos de cadena corta (por ejemplo, ácido valproico, butirato de fenilo y pivanex).

Algunos HDACi están o estaban desarrollándose para enfermedades neurológicas, tales como un HDACi de Merck (Whitehouse Station, NJ) que está usándose para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas; y HDACi de TopoTarget (Rockaway, NJ) que estaba usándose para el tratamiento de enfermedad de Huntington, ahora abandonado; isovaleramida NPS-1776 (NPS Pharmaceutical, Bedminster, Nueva Jersey) que estaba usándose para trastorno bipolar, epilepsia y migrañas, ahora abandonado; y un inhibidor de histona acetiltransferasa para cáncer de TopoTarget A/S (K0benhavn, Dinamarca), que se abandonó en la fase preclínica.

En el presente documento, se muestran la síntesis de una nueva clase de activadores de HAT con solubilidad y permeabilidad por la membrana mejoradas y su potencia in vitro así como en un modelo animal (véanse los EJEMPLOS). Los datos in vitro y de comportamiento muestran que un compuesto activador de HAT de la invención, YF2, puede acetilar la histona H3 en el cerebro y mejorar los déficits de memoria en un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, el activador de hAt mostrado en la figura 3 puede usarse como terapia adyuvante en varios cánceres, enfermedades psiquiátricas y neurodegenerativas y puede mejorar la eficacia y seguridad del tratamiento para estos trastornos. Además, el compuesto activador de hAt , YF2, tiene un resto que no se mencionó en las solicitudes de patente a las que se hizo referencia anteriormente que mejora significativamente la solubilidad y la permeabilidad por la membrana y la barrera hematoencefálica (BHE). Véanse Abel y Zukin (2008) Current Opinion in Pharmacology 8:57-64; y Lee y Workman (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8:284-295.

En una realización, puede usarse un compuesto activador de HAT para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita. Los ejemplos no limitativos de cánceres incluyen linfoma de células B, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de vejiga, linfoma de células T, mieloma, leucemia, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, neoplasias hematopoyéticas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, carcinoma de células renales, hepatoma, adenocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de próstata, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de tiroides, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de ovario, melanoma primario o metastásico, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, cáncer de cerebro, angiosarcoma, hemangiosarcoma, sarcoma óseo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, macroglobulinemia de Waldenstroom, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma de pulmón, carcinoma epitelial, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, retinoblastoma, leucemia, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, linfoma, mieloma múltiple y carcinoma medular.

En una realización, un compuesto activador de HAT puede usarse para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto que lo necesita. Los ejemplos no limitativos de enfermedades neurodegenerativas incluyen adrenoleucodistrofia (ALD), alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar mortal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva, demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (múltiples tipos con características variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, tabes dorsal y encefalopatía tóxica.

Transcripción génica y memoria

En la figura 23 se muestra una representación esquemática de los procesos implicados en la transcripción génica y memoria. En el cerebro, se requiere la fosforilación de CREB para la capacidad de CREB de unirse a CBP y para estimular la expresión génica asociada a la memoria. CBP funciona como coactivador que facilita interacciones con la maquinaria de transcripción basal y a través de su actividad de HAT actividad cataliza la acetilación de las histonas, provocando una pérdida de represión cromosómica y aumentando la transcripción de genes asociados a memoria. De acuerdo con este esquema, se encontró que mutaciones en el dominio CBP de HAT provocaban alteración de LTM. Por ejemplo, Korzus et al. demostraron que ratones dominantes negativos para CBP inducibles, sin actividad CBP HAT, presentaban memoria a corto plazo normal mientras que la LTM estaba alterada [B8]. Además, la LTM alterada se rescató mediante la supresión de la expresión transgénica y mediante la administración de inhibidor de HDAC [B8].

La relevancia de la desacetilación de histonas en procesos de memoria se subraya mediante un estudio de Levenson et al. [B26]. En este trabajo, la acetilación de H3 en el área CA1 del hipocampo (un área en el cerebro que desempeña importantes papeles en la LTM) se encontró que estaba aumentada tras el entrenamiento para acondicionamiento por miedo contextual, una forma de memoria asociativa en la que los ratones asocian un contexto novedoso con un estímulo aversivo. Sin embargo, la inhibición de HDAC potenció la LTM [B26]. De acuerdo con este estudio, la inhibición de HDAC puede ser beneficiosa en determinados trastornos neurodegenerativos, tales como enfermedad de Huntington, atrofia muscular espinal, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia y síndrome de Rubinstein-Taybi [B19, B25, B41, B42]. De manera interesante, es probable que el efecto de inhibidores de HDAC dependa de las HDAC específicas, como la sobreexpresión específica de neuronas de HDAC2, pero no de HDAC1, densidad de espinas dendríticas reducida, número de sinapsis, plasticidad sináptica y formación de memoria [B43]. A la inversa, la deficiencia de HDAC2 aumentó el número de sinapsis y facilitó la memoria, similar al tratamiento crónico con inhibidores de HDAC en ratones [B43]. Conjuntamente, estos hallazgos indican que la inhibición de HDAC puede proporcionar un camino terapéutico para la alteración de la memoria en enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por trastornos cognitivos tales como AD.

Maquinaria de transcripción y AD

Recientes estudios han vinculado la disfunción de CREB/CBP con AD. Animales transgénicos APP(K670N:M671L) mostraban una disminución en la fosforilación de CREB en el nivel aguas debajo de la cascada de receptor a-7-nicotínico (a7-nAChR)/ERK/MAPK [B44, B45]. La perfusión de cortes de hipocampo con una preparación que contenía AP42 oligomérico reveló una reducción del aumento inducido por tétanos en la fosforilación de CREB, proporcionando una clave para los mecanismos que subyacen a los cambios mediados por Ap en LTP [B12]. Consecuente con estos resultados, Ap bloqueaba el aumento inducido por glutamato en la fosforilación de CREB en cultivos de hipocampo de rata [B11]. Gong et al. también encontraron que rolipram, un inhibidor de PDE IV selectivo que aumenta los niveles de AMPc y por tanto la fosforilación de CREB, mejora los déficits tanto en LTP como en aprendizaje contextual en el ratón transgénico doble APP/PS1 [B46]. Este efecto protector se debe posiblemente a la activación de CREB que podría conducir al reclutamiento de CBP y por tanto a la acetilación de histonas. Otra investigación demostró que en la inactivación doble condicional de p S1 y 2 (PS cDKO), los ratones mostraban LTP y memoria alterada que se amplificaban con la edad. Además, ratones PS cDKO mostraban una reducción en los niveles de CBP y en la expresión génica dependiente de CRE en la corteza cerebral, lo que contribuye probablemente a la posterior degeneración neuronal [B15]. Además, un reciente estudio ha demostrado que PS1 silvestre (wild type, WT) estimula la capacidad de transcripción de CBP y p300, mientras que el mutante asociado a AD de PS1 (M146L) no tiene este efecto [B18, B47]. En estos experimentos, se observó una respuesta a PS1 WT con un constructo que contenía la región 721-1679 de CBP, que contiene el dominio acetiltransferasa de CBP [B18]. Además, se mostró que la pérdida de CBP y la desacetilación de histonas tienen lugar durante la muerte neuronal, que se indujo mediante un anticuerpo dirigido a APP en neuronas corticales primarias [B48].

Enfermedad de Alzheimer - Un ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa

Una visión emergente de los procesos implicados en la alteración de la memoria indica que la sutileza y variabilidad de los síntomas amnésicos más tempranos, que se producen en ausencia de cualquier otro signo clínico de lesión cerebral, podrían deberse a cambios diferenciados en la función de una única sinapsis, producidos al menos en parte, por Ap [B11, B27-B29].

Varias pruebas han mostrado que la LTM y plasticidad sináptica se basan en expresión génica tras una fase de inducción temprana caracterizada por la activación de varias rutas (para una revisión, véase [B30]). Más recientemente, se ha descubierto que una regulación fina de genes relacionados con memoria y plasticidad sináptica a largo plazo implica factores epigenéticos [B6]. De hecho, modificaciones epigenéticas, tales como metilación del ADN y modificaciones postraduccionales de histonas, afectan profundamente a la capacidad de las polimerasas para interaccionar con el marco de lectura abierto de ADN sin cambiar la propia secuencia de ADN. Por tanto, no sería sorprendente que la desregulación de los mecanismos epigenéticos pudiera conducir a la alteración de la expresión génica y plasticidad sináptica asociadas con la memoria [B6], contribuyendo a la patogenia de enfermedades caracterizadas por trastornos cognitivos, tales como AD.

El proceso de almacenamiento de memoria se ha descrito como un diálogo entre genes y sinapsis [B2]. La formación de memoria a largo plazo (LTM) depende de la transcripción génica [B3], la síntesis de nuevas proteínas [B4] y cambios estructurales de la sinapsis [B5]. Además, la regulación apropiada de la expresión génica en LTM se modula por la epigenética [B6]. La epigenética se define como el mecanismo que cambia la expresión génica “marcando” el ADN o sus proteínas asociadas, a través de procedimientos tales como modificación de histonas y metilación del ADN, sin cambiar la propia secuencia de ADN [B7]. Se sabe que las colas N-terminales de las proteínas histonas experimentan modificaciones postraduccionales, tales como acetilación, ubiquitinación, sumoilación, fosforilación, citrulinación, ADPribosilación y metilación de histonas que pueden dictar las transiciones entre estados de la cromatina transcripcionalmente activa o transcripcionalmente silenciosa [B7]. Por tanto, no es sorprendente que la desregulación de uno de estos mecanismos pudiera conducir a alteración de la expresión génica asociada a la memoria y a trastornos cognitivos.

La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por pérdida neuronal, placas seniles extracelulares y ovillos neurofibrilares intracelulares, que conducen a pérdida de memoria. La AD comienza supuestamente como un trastorno sináptico producido, al menos en parte, por Ap (Selkoe, D.J. Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science (Nueva York, N.Y 298, 789-791 (2002)). La reducción inducida por Ap en la potenciación a largo plazo (LTP), una correlación fisiológica de la plasticidad sináptica que se cree que subyace al aprendizaje y la memoria, y la fosforilación del factor de transcripción de la memoria CREB, se mejoran por donadores de óxido nítrico (NO) y análogos de GMPc (Puzzo, D., et al. Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity. J Neurosci 25, 6887-6897 (2005)). A la inversa, la supresión genética de NO-sintasa 2 (NOS2) da como resultado un empeoramiento del fenotipo de AD en ratones que expresan proteína precursora de amiloide (APP) mutada (Colton, C.A., et al. NO synthase 2 (NOS2) deletion promotes multiple pathologies in a mouse model Alzheimer's disease. Proceedings o f the National Academy of Sciences o f the United States o f America 103, 12867-12872 (2006)). Estos hallazgos muestran que la regulación por incremento de la ruta de NO puede ser protectora en AD.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo progresivo crónico, en el que se cree que las fases más tempranas están vinculadas a disfunción sináptica que conduce a trastornos de la memoria. En este sentido, se ha encontrado que el p-amiloide (Ap) inhibe la memoria[A1A2] y su modelo celular, la potenciación a largo plazo (LTP)[A3_A8]. Ap es el producto proteolítico de una proteína precursora más grande, la proteína precursora de amiloide (APP), que en su forma mutante se ha encontrado que está implicada en AD familiar (FAD)[A9]. Posteriormente, se encontró que dos genes asociados a AD, presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 (PS2)[A10A11], estaban implicados en FAD también[A12]. Las presenilinas son parte del complejo de y-secretasa responsable de la escisión de APP y la producción del péptido AP42[A13].

La AD se caracteriza neuropatológicamente por pérdida neuronal, placas seniles extracelulares (SP) y ovillos neurofibrilares intracelulares (NFT). Las SP se componen principalmente de agregados de Ap. El principal componente de los NFT es la proteína de unión a microtúbulos tau. Clínicamente, la AD se caracteriza por disfunción cognitiva y comienza como un trastorno sináptico que implica a áreas progresivamente más grandes del cerebro a lo largo del tiempo [S1]. Una visión emergente de los procesos implicados en la alteración sináptica muestra que la sutileza y variabilidad de los síntomas amnésicos más tempranos, que se producen en ausencia de cualquier otro signo clínico de lesión cerebral, pueden deberse a cambios diferenciados en la función de una única sinapsis, producidos, al menos en parte, por Ap [S5, S7, S10, S11].

Una diana importante para desarrollar una terapia causal para la enfermedad de Alzheimer está representada por las sinapsis. Las alteraciones sinápticas están altamente correlacionadas con la gravedad de la demencia clínica [S1, S2], mientras que otras variables importantes tales como placas seniles y ovillos neurofibrilares están implicadas en un menor grado [S1]. La importancia de las alteraciones sinápticas en AD se ha confirmado mediante estudios de modelos de ratones transgénicos (Tg) de AD [S3] así como de potenciación a largo plazo (LTP), un modelo celular ampliamente estudiado de aprendizaje y memoria (L&M) [S4], que se altera tras la aplicación de amiloide-p (Ap) tanto en cortes como in vivo [S3, S5-S12]. Se ha encontrado que Ap inhibe notablemente LTP. Estudios electrofisiológicos que usan ratones que producen Ap humano, Tg han revelado a menudo déficits significativos en la transmisión sináptica basal y/o LTP en el hipocampo [S23-S30].

Se sabe que la regulación de la expresión génica en la memoria a largo plazo está modulada por la epigenética. La epigenética se define como el mecanismo que cambia la expresión génica “marcando” el ADN o sus proteínas asociadas, a través de procesos tales como metilación del a Dn y modificación de histonas, sin cambiar la propia secuencia de ADN[A14]. La modificación de histonas mediante, por ejemplo, la adición o eliminación de grupos funcionales acetilo o metilo provoca que la estructura de la cromatina se abra o se cierre, de modo que la información contenida dentro del ADN se hace más o menos accesible a los factores de transcripción. Por tanto, no es sorprendente que la desregulación de uno de los mecanismos epigenéticos pudiera conducir a la alteración de la expresión génica asociada a la memoria. Estudios de los mecanismos que subyacen a la disfunción sináptica y de la memoria en AD han indicado papeles centrales del factor de transcripción CREB (proteína de unión a CRE) y el coactivador proteína de unión a CREB (CBP).

Estudios recientes han vinculado la maquinaria de transcripción con la enfermedad de Alzheimer (AD), una patología caracterizada por trastornos profundos de la memoria. Tanto el factor de transcripción CREB (proteína de unión a CRE) como el coactivador proteína de unión a CREB (CBP), dos moléculas que se sabe que están asociadas con la cromatina y los procesos de la memoria [B8-B10], es probable que desempeñen papeles centrales en los mecanismos que subyacen a la disfunción sináptica y de la memoria en AD. Se mostró que fármacos que potencian la fosforilación de CREB mejoran la memoria y potenciación a largo plazo (LTP), un tipo de plasticidad sináptica que se cree que subyace al aprendizaje y la memoria, tanto en modelos de ratón de AD como tras la exposición a dosis subletales de Ap42, un producto proteolítico de la proteína precursora de amiloide (APP) [B11-B14]. Además, los niveles de CBP están reducidos en ratones que carecen de presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 (PS2) funcionales [B15], dos genes que se han implicado en AD [B16, B17]. Además, PS1 silvestre (WT) estimula la capacidad de transcripción de CBP, mientras que la mutación PS1(M146L) no tiene este efecto [B18].

Tras la exposición a dosis subletales de Ap42 y en modelos de ratón de AD, se mostró que los fármacos que potencian la fosforilación de CREB mejoran la LTP y la memoria[A5A15'A171. La desregulación de la actividad histona acetiltransferasa (HAT) de CBP altera la expresión génica asociada a la memoria[A18]. Además, los niveles de CBP cerebrales están reducidos en ratones que carecen de PS1 y PS2 funcionales[A19]. Además, PS1 silvestre (WT) estimula la capacidad de transcripción de CBP, mientras que la mutación de PS1(M146L) no tiene este efecto[A20].

NO es una molécula central en procesos bioquímicos celulares. El gas se ha establecido como una molécula mensajera importante en diversas etapas de la fisiología cerebral, desde el desarrollo hasta la plasticidad sináptica y el aprendizaje y la memoria. En la investigación de la AD, se ha encontrado que el NO tiene un efecto protector sobre el daño inducido por Ap del sistema nervioso [S38-S40]. Estudios realizados sobre células PC12, neuronas simpáticas y neuronas del hipocampo, han mostrado que el tratamiento con el generador de NO S-nitrosopenicilamina ejerce un efecto neuroprotector debido a la inhibición del factor proapoptótico caspasa-2 mediante nitrosilación [S39], mientras que la inhibición de la síntesis de NO mediante éster metílico de N-nitro-L-arginina no protege frente a la neurotoxicidad inducida por Ap. Se ha encontrado que Ap altera la generación de NO disminuyendo la transducción de señales del receptor de NMDA [S38], restando disponibilidad de NADPH para la NO-sintasa (NOS) [S41], o inhibiendo la fosforilación de la serina-treonina cinasa Akt [S42]. Además, la deleción de i-NOS mejora la patología de AD en los ratones APP [S43]. Por tanto, los fármacos que potencian la cascada de NO tienen un efecto beneficioso frente a AD [S44].

A pesar de que la función neuroprotectora del NO es clara e indiscutible, el gas se ha considerado también como un agente importante de neuropatología y muerte celular cuando se produce en altas cantidades. Altas cantidades de NO conducen a la generación de una cantidad significativa de peroxinitritos que son responsables del estrés oxidativo y nitrosativo en la muerte celular inducida por Ap [S45- S51]. De hecho, la liberación de bajas cantidades de NO por las formas constitutivas de NOS que incluyen tanto las isotermas neuronal como la endotelial, n-NOS y e-NOS, promueve la plasticidad sináptica y el aprendizaje, mientras que la producción incontrolada de altas cantidades del gas por la forma inducible de NOS (i-NOS) puede promover estrés oxidativo y nitrosativo por medio de la producción de peroxinitrito [S45-S51]. Por tanto, tanto la regulación por disminución inducida por Ap de la cascada de NO que bloquea la plasticidad y la memoria como la generación de peroxinitritos que conduce a muerte celular, pueden desempeñar papeles en la AD. El estado actual de la investigación farmacológica que aprovecha estos descubrimientos se centra tanto en hallar modos de regular por incremento la cascada de NO y por tanto provocar neuroprotección, así como en hallar modos de bloquear los efectos tóxicos de los peroxinitritos con el fin de limitar la neuropatología [S52].

Activadores de HAT optimizados para enfermedades del SNC y cáncer

Ninguno de los activadores de HAT comercialmente disponibles se desarrollaron para tener las características requeridas para su administración en una enfermedad crónica del SNC, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas (tales como AD, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington), o para cáncer. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para identificar un agente o compuesto para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (tales como AD, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la acumulación de Ap o enfermedades caracterizadas por niveles elevados de cuerpos de inclusión) que comprenden seleccionar el agente o compuesto basándose en tener una o más características que hacen que el compuesto esté optimizado para tratar enfermedades del SNC. Por ejemplo, las características pueden comprender: una CE⁵⁰no mayor de aproximadamente 100 nM; actividad de acetilación de histonas in vitro; la capacidad de penetrar la BHE; o una combinación de las mismas. En una realización, el compuesto activador de HAT es YF2, representado en la figura 3.

En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para identificar o diseñar agentes o compuestos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tratamiento de estados asociados con, pero sin limitarse a, cuerpos de inclusión elevados (por ejemplo, estados asociados con acumulación de Ap, alfa-sinucleína, lipofuscina, TARDBPTDP- 43 escindida y/o proteína Tau), en donde se usan métodos de química médica asistidos por ordenador para identificar y/o diseñar agentes o compuestos adaptados para satisfacer una o más de las características mencionadas anteriormente y/o para adecuar las concentraciones de diversos bioensayos descritos en el presente documento.

La invención proporciona generalmente métodos para identificar compuestos que pueden usarse para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto. La invención proporciona métodos para identificar compuestos que pueden usarse para tratar a sujetos que presentan placas de amiloide beta anómalamente elevadas, o niveles de proteína Tau elevados, niveles de alfa-sinucleína elevados, o inclusiones, o nivel de lipofuscina o inclusiones, o nivel de TARDBP-TDP-43 escindida o inclusión, o acumulación de inclusiones de TARDBP/TDP-43 escindida. Además, la invención proporciona métodos para identificar compuestos que pueden usarse para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, demencia por cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y cáncer. Los métodos pueden comprender la identificación de compuestos o agentes de prueba (por ejemplo, péptidos (tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos), moléculas pequeñas, ácidos nucleicos (tales como ARNip o ARN antisentido), u otros agentes) que pueden unirse a una molécula de polipéptido de HAT y/o activar o potenciar la actividad biológica de un polipéptido de HAT o su expresión. En una realización, el compuesto es un activador de HAT (por ejemplo un compuesto activador de HAT que tiene la fórmula (I), (II), (III), (IV), (V), o (VI). En otra realización, el compuesto activador de HAT es YF2, representado en la figura 3.

El término “modular”, tal como aparece en el presente documento, se refiere a un cambio en la actividad o expresión de una molécula proteica. Por ejemplo, la modulación puede provocar un aumento o una disminución en la actividad de la proteína, las características de unión o cualquier otra propiedad biológica, funcional o inmunológica de una molécula proteica de secretasa.

En una realización, un compuesto activador de HAT puede ser un fragmento peptídico de una proteína HAT que se une a una proteína histona acetiltransferasa. Por ejemplo, la molécula de activador de HAT puede abarcar cualquier porción de al menos aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5. El fragmento puede comprender al menos aproximadamente 10 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos, al menos aproximadamente 40 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos, al menos aproximadamente 60 aminoácidos o al menos aproximadamente 75 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En una realización, el fragmento peptídico está dirigido a una proteína HAT, tal como GCN5, GCN5L, HAT1 o PCAF.

La secuencia de polipéptido de una proteína HAT, HAT1 humana, se representa en SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos de hAT1 humana se muestra en SEQ ID NO: 2. La información de secuencia relacionada con HAT1 está accesible en bases de datos públicas mediante los números de registro de GenBank NM_003642 (para ARNm) y NP_003633 (para proteína). HAT1 también se conoce como KAT1 (K(lisina) acetiltransferasa 1). La proteína codificada por este gen es una histona acetiltransferasa (HAT) de tipo B que está implicada en la acetilación rápida de histonas citoplasmáticas recién sintetizadas, que a su vez se importan al núcleo para la deposición de novo sobre cadenas de ADN nacientes. La acetilación de histonas, particularmente de histona H4, desempeña un papel importante en el ensamblaje de cromatina dependiente de replicación.

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima HAT1 (residuos 1-419):

1 MAGFGAMEKF LVEYKSAVEK KLAEYKCNTN TAIELKLVRF PEDLENDIRT FFPEYTHQLF

61 GDDETAFGYK GLKILLYYIA GSLSTMFRVE YASKVDENFD CVEADDVEGK IRQIIPPGFC

121 TNTNDFLSLL EKEVDFKPFG TLLHTYSVLS PTGGENFTFQ IYKADMTCRG FREYHERLQT

181 FLMWFIETAS FIDVDDERWH YFLVFEKYNK DGATLFATVG YMTVYNYYVY PDKTRPRVSQ

241 MLILTPFQGQ GHGAQLLETV HRYYTEFPTV LDITAEDPSK SYVKLRDFVL VKLCQDLPCF

301 SREKLMQGFN EDMAIEAQQK FKINKQHARR VYEILRLLVT DMSDAEQYRS YRLDIKRRLI

361 SPYKKKQRDL AKMRKCLRPE ELTNQMNQIE ISMQHEQLEE SFQELVEDYR RVIERLAQE

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima HAT1 (residuos 1-1682), en la que el ATG subrayado indica el comienzo del marco de lectura abierto:

1 ctgtgcggtc acttccggcc cgggagcgcg cgggttgatt cgtccttcct cagccgcggg 61 tgatcgtagc tcggaaa tg g cgggatttgg tgctatggag aaatttttgg tagaatataa 121 gagtgcagtg gagaagaaac tggcagagta caaatgtaac accaacacag caattgaact 181 aaaattagtt cgttttcctg aagatcttga aaatgacatt agaactttct ttcctgagta 241 tacccatcaa ctctttgggg atgatgaaac tgcttttggt tacaagggtc taaagatcct 301 gttatactat attgctggta gcctgtcaac aatgttccgt gttgaatatg catctaaagt 361 tgatgagaac tttgactgtg tagaggcaga tgatgttgag ggcaaaatta gacaaatcat 421 tccacctgga ttttgcacaa acacgaatga tttcctttct ttactggaaa aggaagttga 481 tttcaagcca ttcggaacct tacttcatac ctactcagtt ctcagtccaa caggaggaga 541 aaactttacc tttcagatat ataaggctga catgacatgt agaggctttc gagaatatca 601 tgaaaggctt cagacctttt tgatgtggtt tattgaaact gctagcttta ttgacgtgga 661 tgatgaaaga tggcactact ttctagtatt tgagaagtat aataaggatg gagctacgct 721 ctttgcgacc gtaggctaca tgacagtcta taattactat gtgtacccag acaaaacccg 781 gccacgtgta agtcagatgc tgattttgac tccatttcaa ggtcaaggcc atggtgctca 841 acttcttgaa acagttcata gatactacac tgaatttcct acagttcttg atattacagc

901 ggaagatcca tccaaaagct atgtgaaatt acgagacttt gtgcttgtga agctttgtca 961 agatttgccc tgtttttccc gggaaaaatt aatgcaagga ttcaatgaag atatggcgat 1021 agaggcacaa cagaagttca aaataaataa gcaacacgct agaagggttt atgaaattct 1081 tcgactactg gtaactgaca tgagtgatgc cgaacaatac agaagctaca gactggatat 1141 taaaagaaga ctaattagcc catataagaa aaagcagaga gatcttgcta agatgagaaa 1201 atgtctcaga ccagaagaac tgacaaacca gatgaaccaa atagaaataa gcatgcaaca 1261 tgaacagctg gaagagagtt ttcaggaact agtggaagat taccggcgtg ttattgaacg 1321 acttgctcaa gagtaaagat tatactgctc tgtacaggaa gcttgcaaat tttctgtaca 1381 atgtgctgtg aaaaatctga tgactttaat tttaaaatct tgtgacattt tgcttatact 1441 aaaagttatc tatctttagt tgaatatttt cttttggaga gattgtatat tttaaaatac 1501 tgtttagagt ttatgagcat atattgcatt taaagaaaga taaagcttct gaaatactac 1561 tgcaattgct tcccttctta aacagtataa taaatgctta gttgtgatat gttaatgtgt 1621 gatgatatga ttcttaaata cttacaataa acctcattct taaatactta aaaaaaaaaa 1681 aa

La secuencia de polipéptido de una proteína HAT, PCAF humana, se representa en SEQ ID NO: 3. La secuencia de nucleótidos de PCAF humana se muestra en SEQ ID NO: 4. La información de secuencia relacionada con PCAF está accesible en bases de datos públicas mediante los números de registro de GenBank NM_003884 (para ARNm) y NP_003875 (para proteína). PCAF también se conoce como KAT2B (K(lisina) acetiltransferasa 2B). CBP y p300 son proteínas nucleares grandes que se unen a muchos factores específicos de secuencia implicados en crecimiento y/o diferenciación celulares, incluyendo c-jun y la oncoproteína adenoviral E1A. La proteína codificada por este gen se asocia con p300/CBP. Tiene actividad de unión in vitro e in vivo con CBP y p300, y compite con E1A por sitios de unión en p300/CBP. Tiene actividad histona acetilo transferasa con histonas centrales y partículas centrales de nucleosomas, indicando que esta proteína desempeña un papel directo en la regulación transcripcional.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima PCAF (residuos 1-832):

1 MSEAGGAGPG GCGAGAGAGA GPGALPPQPA ALPPAPPQGS PCAAAAGGSG ACGPATAVAA

61 AGTAEGPGGG GSARIAVKKA QLRSAPRAKK LEKLGVYSAC KAEESCKCNG WKNPNPSPTP

121 PRADLQQIIV SLTESCRSCS HALAAHVSHL ENVSEEEMNR LLGIVLDVEY LFTCVHKEED

181 ADTKQVYFYL FKLLRKSILQ RGKPWEGSL EKKPPFEKPS IEQGVNNFVQ YKFSHLPAKE

241 RQTIVELAKM FLNRINYWHL EAPSQRRLRS PNDDISGYKE NYTRWLCYCN VPQFCDSLPR

301 YETTQVFGRT LLRSVFTVMR RQLLEQARQE KDKLPLEKRT LILTHFPKFL SMLEEEVYSQ

361 NSPIWDQDFL SASSRTSQLG IQTVINPPPV AGTISYNSTS SSLEQPNAGS SSPACKASSG

421 LEANPGEKRK MTDSHVLEEA KKPRVMGDIP MELINEVMST ITDPAAMLGP ETNFLSAHSA

481 RDEAARLEER RGVIEFHWG NSLNQKPNKK ILMWLVGLQN VFSHQLPRMP KEYITRLVFD

541 PKHKTLALIK DGRVIGGICF RMFPSQGFTE IVFCAVTSNE QVKGYGTHLM NHLKEYHIKH

601 DILNFLTYAD EYAIGYFKKQ GFSKEIKIPK TKYVGYIKDY EGATLMGCEL NPRIPYTEFS

661 VIIKKQKEII KKLIERKQAQ IRKVYPGLSC FKDGVRQIPI ESIPGIRETG WKPSGKEKSK

721 EPRDPDQLYS TLKSILQQVK SHQSAWPFME PVKRTEAPGY YEVIRFPMDL KTMSERLKNR

781 YYVSKKLFMA DLQRVFTNCK EYNPPESEYY KCANILEKFF FSKIKEAGLI DK

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima PCAF (residuos 1-4824), en la que el ATG subrayado indica el comienzo del marco de lectura abierto:

i gcggaaaaga ggccgtgggg ggcctcccag cgctggcaga caccgtgagg ctggcagccg 61 ccggcacgca cacctagtcc gcagtcccga ggaacatgtc cgcagccagg gcgcggagca 121 gagtcccggg caggagaacc aagggagggc gtgtgctgtg gcggcggcgg cagcggcagc 181 ggagccgcta gtcccctccc tcctggggga gcagctgccg ccgctgccgc cgccgccacc 241 accatcagcg cgcggggccc ggccagagcg agccgggcga gcggcgcgct agggggaggg 301 cgggggcggg gaggggggtg ggcgaagggg gcgggagggc gtggggggag ggtctcgctc 361 tcccgactac cagagcccga gagggagacc ctggcggcgg cggcggcgcc tgacactcgg 421 cgcctcctgc cgtgctccgg ggcggcatcrt ccgaggctgg cggggccggg ccgggcggct 481 gcggggcagg agccggggca ggggccgggc ccggggcgct gcccccgcag cctgcggcgc 541 ttccgcccgc gcccccgcag ggctccccct gcgccgctgc cgccgggggc tcgggcgcct 601 gcggtccggc gacggcagtg gctgcagcgg gcacggccga aggaccggga ggcggtggct 661 cggcccgaat cgccgtgaag aaagcgcaac tacgctccgc tccgcgggcc aagaaactgg 721 agaaactcgg agtgtactcc gcctgcaagg ccgaggagtc ttgtaaatgt aatggctgga 781 aaaaccctaa cccctcaccc actcccccca gagccgacct gcagcaaata attgtcagtc 841 taacagaatc ctgtcggagt tgtagccatg ccctagctgc tcatgtttcc cacctggaga 901 atgtgtcaga ggaagaaatg aacagactcc tgggaatagt attggatgtg gaatatctct 961 ttacctgtgt ccacaaggaa gaagatgcag ataccaaaca agtttatttc tatctattta 1021 agctcttgag aaagtctatt ttacaaagag gaaaacctgt ggttgaaggc tctttggaaa 1081 agaaaccccc atttgaaaaa cctagcattg aacagggtgt gaataacttt gtgcagtaca 1141 aatttagtca cctgccagca aaagaaaggc aaacaatagt tgagttggca aaaatgttcc 1201 taaaccgcat caactattgg catctggagg caccatctca acgaagactg cgatctccca 1261 atgatgatat ttctggatac aaagagaact acacaaggtg gctgtgttac tgcaacgtgc 1321 cacagttctg cgacagtcta cctcggtacg aaaccacaca ggtgtttggg agaacattgc 1381 ttcgctcggt cttcactgtt atgaggcgac aactcctgga acaagcaaga caggaaaaag 1441 ataaactgcc tcttgaaaaa cgaactctaa tcctcactca tttcccaaaa tttctgtcca 1501 tgctagaaga agaagtatat agtcaaaact ctcccatctg ggatcaggat tttctctcag 1561 cctcttccag aaccagccag ctaggcatcc aaacagttat caatccacct cctgtggctg 1621 ggacaatttc atacaattca acctcatctt cccttgagca gccaaacgca gggagcagca 1681 gtcctgcctg caaagcctct tctggacttg aggcaaaccc aggagaaaag aggaaaatga 1741 ctgattctca tgttctggag gaggccaaga aaccccgagt tatgggggat attccgatgg 1801 aattaatcaa cgaggttatg tctaccatca cggaccctgc agcaatgctt ggaccagaga 1861 ccaattttct gtcagcacac tcggccaggg atgaggcggc aaggttggaa gagcgcaggg 1921 gtgtaattga atttcacgtg gttggcaatt ccctcaacca gaaaccaaac aagaagatcc 1981 tgatgtggct ggttggccta cagaacgttt tctcccacca gctgccccga atgccaaaag 2041 aatacatcac acggctcgtc tttgacccga aacacaaaac ccttgcttta attaaagatg 2101 gccgtgttat tggtggtatc tgtttccgta tgttcccatc tcaaggattc acagagattg 2161 tcttctgtgc tgtaacctca aatgagcaag tcaagggcta tggaacacac ctgatgaatc 2221 atttgaaaga atatcacata aagcatgaca tcctgaactt cctcacatat gcagatgaat 2281 atgcaattgg atactttaag aaacagggtt tctccaaaga aattaaaata cctaaaacca 2341 aatatgttgg ctatatcaag gattatgaag gagccacttt aatgggatgt gagctaaatc 2401 cacggatccc gtacacagaa ttttctgtca tcattaaaaa gcagaaggag ataattaaaa 2461 aactgattga aagaaaacag gcacaaattc gaaaagttta ccctggactt tcatgtttta 2521 aagatggagt tcgacagatt cctatagaaa gcattcctgg aattagagag acaggctgga 2581 aaccgagtgg aaaagagaaa agtaaagagc ccagagaccc tgaccagctt tacagcacgc 2641 tcaagagcat cctccagcag gtgaagagcc atcaaagcgc ttggcccttc atggaacctg 2701 tgaagagaac agaagctcca ggatattatg aagttataag gttccccatg gatctgaaaa 2761 ccatgagtga acgcctcaag aataggtact acgtgtctaa gaaattattc atggcagact 2821 tacagcgagt ctttaccaat tgcaaagagt acaacccccc tgagagtgaa tactacaaat 2881 gtgccaatat cctggagaaa ttcttcttca gtaaaattaa ggaagctgga ttaattgaca 2941 agtgattttt tttcccctct gcttcttaga aactcaccaa gcagtgtgcc taaagcaagg 3001 tggtttagtt ttttacaaag aattggacat gatgtattga agagacttgt aaatgtaata 3061 attagcactt ttgaaaaaac aaaaaacctc cttttagctt ttcagatatg tatttaaatt 3121 gaagtcatag gacattttta ttttatggaa tagattttaa tctatttact actattaagg 3181 taaattttct atggcatgtc cattagctat ttcatgatag atgattaggg gtttcctcaa 3241 aacctgtgtg tgaggaaatt gcacacagta gcaaaatttg gggaaatcca taacattttc 3301 agaccatgaa tgaatgtttc catttttttc taatggaatg tgagagttta cttttatttt 3361 attctgaagg actttaagga agggatacat gattttaaaa aagcctgtaa gaggtgaaat 3421 atgtgatgtt tgaagtctct ttatagactt tttatatata ttttttaaaa cactcatcta 3481 gatgaggtgc tttgagcagt tctgaaaaat gcagttccag gaaagcaact gctttggttc 3541 ctaaggaaga aattctaaat aatgcaaact tttaaaataa gcatctaggt ttttgataat 3601 tctgtctact tacaacaaac ttgttagtac ataaccacta ttttaataat tattttctct 3661 acacaaatgt gtaatatcat atttgacttt gcttatgcag gccataagtt ccaaaagata 3721 atttccctgc ccacaaaggc ataaacttga aaacacatga gattgaatca acatgcttta 3781 ataggaaaag atgtatggtc tatatatgta tcaatctggt gaatcctcgt tctaataaag 3841 gttctttttc ttttctatga tacacacagc cacgctgata atatgcaaat gaacattttc 3901 ctttatgtct ctccagataa tgtttattgt ctgaggtaaa ttaaattccc accagggttt 3961 gctgtcagta ttttaacacc cacattagta tatgcgtcca gggtcataac cccctaaaat 4021 ccatcatgca accttattaa tctgtcttgg gattccagtt tagtgcttgg atttatttcc 4081 tgattacact acatagaaaa gtgagacatc tgccattccc aactctggga aaaccaacta 4141 atatacaacc atataaatga aggccatctt gatggtctca acactaattt ttatgatgca 4201 aatttataca ctgatttttg taaaggacaa agttttaaaa gcgtatttaa cttgatgttt 4261 tctatcagca taaataaaat ggtcatgaat agtcattaaa aacagttgcc agtgataatc 4321 tgcatgaagg aaaaagaacc ctgcaaatgg ctattgagtt ggaagtattg tttttgatat 4381 gtaagagata ttcagaatgc tcacactgaa aatgcctcaa ctttttaaag tgtaagaaac 4441 caccatgagt ggtgtctaga tttctaatga agaatcatga tacagtttgg attaagtatc 4501 ttggactggt tttaaacagt gctttgtacc ggatctgctg aagcatctgt ccagctggta 4561 tcctgtgaaa gtttgttatt ttctgagtag acattcttat agagtattgt ctttaaaatc 4621 agattgtctc ttctatattg aaagcatttt tatgttttct aatttaaaaa ttaatatttt 4681 cttatagata ttgtgcaata aagctgaagt agaatgtgtg gtttttgcaa atgctttaac 4741 agctgataaa aattttacat ttgtaaaatt aatatattgt actggtacaa aatagtttta 4801 aattatattt taaaaagctt ccaa

La secuencia de polipéptido de una proteína HAT, GCN5L humana, se representa en SEQ ID NO: 5. La secuencia de nucleótidos de GCN5L humana se muestra en SEQ ID NO: 6. La información de secuencia relacionada con GCN5L está accesible en bases de datos públicas mediante los números de registro de GenBank NM_021078 (para ARNm) y NP_066564.2 (para proteína). GCN5L también se conoce como KAT2A (K(lisina) acetiltransferasa 2A). KAT2A, o GCN5, es una histona acetiltransferasa (HAT) que funciona principalmente como activador transcripcional. También funciona como represor de NF-kappa-B promoviendo la ubiquitinación de la subunidad NF-kappa-B RELA de una manera independiente de HAT (Mao et al., Genes Dev. 1 de abril de 2009; 23(7):849-61).

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima GCN5L (residuos 1-837):

1 MAEPSQAPTP APAAQPRPLQ SPAPAPTPTP APSPASAPIP TPTPAPAPAP AAAPAGSTGT 61 GGPGVGSGGA GSGGDPARPG LSQQQRASQR KAQVRGLPRA KKLEKLGVFS ACKANETCKC 121 NGWKNPKPPT APRMDLQQPA ANLSELCRSC EHPLADHVSH LENVSEDEIN RLLGMWDVE 181 NLFMSVHKEE DTDTKQVYFY LFKLLRKCIL QMTRPWEGS LGSPPFEKPN IEQGVLNFVQ 241 YKFSHLAPRE RQTMFELSKM FLLCLNYWKL ETPAQFRQRS QAEDVATYKV NYTRWLCYCH 301 VPQSCDSLPR YETTHVFGRS LLRSIFTVTR RQLLEKFRVE KDKLVPEKRT LILTHFPKFL 361 SMLEEEIYGA NSPIWESGFT MPPSEGTQLV PRPASVSAAV VPSTPIFSPS MGGGSNSSLS 421 LDSAGAEPMP GEKRTLPENL TLEDAKRLRV MGDIPMELVN EVMLTITDPA AMLGPETSLL 481 SANAARDETA RLEERRGIIE FHVIGNSLTP KANRRVLLWL VGLQNVFSHQ LPRMPKEYIA 541 RLVFDPKHKT LALIKDGRVI GGICFRMFPT QGFTEIVFCA VTSNEQVKGY GTHLMNHLKE 601 YHIKHNILYF LTYADEYAIG YFKKQGFSKD IKVPKSRYLG YIKDYEGATL MECELNPRIP 661 YTELSHIIKK QKEIIKKLIE RKQAQIRKVY PGLSCFKEGV RQIPVESVPG IRETGWKPLG 721 KEKGKELKDP DQLYTTLKNL LAQIKSHPSA WPFMEPVKKS EAPDYYEVIR FPIDLKTMTE 781 RLRSRYYVTR KLFVADLQRV IANCREYNPP DSEYCRCASA LEKFFYFKLK EGGLIDK

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos silvestre humana correspondiente a la proteína HAT, la enzima GCN5L (residuos 1-3127), en la que el ATG subrayado indica el comienzo del marco de lectura abierto:

i ggttgcccat gcggccctag ggctgggagc gcggcgccgc tctccgctgc gggggaggcc 61 a tqgcgqaac cttcccaggc cccgaccccg gccccggctg cgcagccccg gccccttcag 121 tccccagccc ctgccccaac tccgactcct gcacccagcc cggcttcagc cccgattccg 181 actcccaccc cggcaccagc ccctgcccca gctgcagccc cagccggcag cacagggact 241 ggggggcccg gggtaggaag tgggggggcc gggagcgggg gggatccggc tcgacctggc 301 ctgagccagc agcagcgcgc cagtcagagg aaggcgcaag tccgggggct gccgcgcgcc 361 aagaagcttg agaagctagg ggtcttctcg gcttgcaagg ccaatgaaac ctgtaagtgt 421 aatggctgga aaaaccccaa gccccccact gcaccccgca tggatctgca gcagccagct 481 gccaacctga gtgagctgtg ccgcagttgt gagcacccct tggctgacca cgtatcccac 541 ttggagaatg tgtcagagga tgagataaac cgactgctgg ggatggtggt ggatgtggag 601 aatctcttca tgtctgttca caaggaagag gacacagaca ccaagcaggt ctatttctac 661 ctcttcaagc tactgcggaa atgcatcctg cagatgaccc ggcctgtggt ggaggggtcc 721 ctgggcagcc ctccatttga gaaacctaat attgagcagg gtgtgctgaa ctttgtgcag 781 tacaagttta gtcacctggc tccccgggag cggcagacga tgttcgagct ctcaaagatg 841 ttcttgctct gccttaacta ctggaagctt gagacacctg cccagtttcg gcagaggtct 901 caggctgagg acgtggctac ctacaaggtc aattacacca gatggctctg ttactgccac 961 gtgccccaga gctgtgatag cctcccccgc tacgaaacca ctcatgtctt tgggcgaagc 1021 cttctccggt ccattttcac cgttacccgc cggcagctgc tggaaaagtt ccgagtggag 1081 aaggacaaat tggtgcccga gaagaggacc ctcatcctca ctcacttccc caaattcctg 1141 tccatgctgg aggaggagat ctatggggca aactctccaa tctgggagtc aggcttcacc 1201 atgccaccct cagaggggac acagctggtt ccccggccag cttcagtcag tgcagcggtt 1261 gttcccagca cccccatctt cagccccagc atgggtgggg gcagcaacag ctccctgagt 1321 ctggattctg caggggccga gcctatgcca ggcgagaaga ggacgctccc agagaacctg 1381 accctggagg atgccaagcg gctccgtgtg atgggtgaca tccccatgga gctggtcaat 1441 gaggtcatgc tgaccatcac tgaccctgct gccatgctgg ggcctgagac gagcctgctt 1501 tcggccaatg cggcccggga tgagacagcc cgcctggagg agcgccgcgg catcatcgag 1561 ttccatgtca tcggcaactc actgacgccc aaggccaacc ggcgggtgtt gctgtggctc 1621 gtggggctgc agaatgtctt ttcccaccag ctgccgcgca tgcctaagga gtatatcgcc 1681 cgcctcgtct ttgacccgaa gcacaagact ctggccttga tcaaggatgg gcgggtcatc 1741 ggtggcatct gcttccgcat gtttcccacc cagggcttca cggagattgt cttctgtgct 1801 gtcacctcga atgagcaggt caagggttat gggacccacc tgatgaacca cctgaaggag 1861 tatcacatca agcacaacat tctctacttc ctcacctacg ccgacgagta cgccatcggc 1921 tacttcaaaa agcagggttt ctccaaggac atcaaggtgc ccaagagccg ctacctgggc 1981 tacatcaagg actacgaggg agcgacgctg atggagtgtg agctgaatcc ccgcatcccc 2041 tacacggagc tgtcccacat catcaagaag cagaaagaga tcatcaagaa gctgattgag 2101 cgcaaacagg cccagatccg caaggtctac ccggggctca gctgcttcaa ggagggcgtg 2161 aggcagatcc ctgtggagag cgttcctggc attcgagaga caggctggaa gccattgggg 2221 aaggagaagg ggaaggagct gaaggacccc gaccagctct acacaaccct caaaaacctg 2281 ctggcccaaa tcaagtctca ccccagtgcc tggcccttca tggagcctgt gaagaagtcg 2341 gaggcccctg actactacga ggtcatccgc ttccccattg acctgaagac catgactgag 2401 cggctgcgaa gccgctacta cgtgacccgg aagctctttg tggccgacct gcagcgggtc 2461 atcgccaact gtcgcgagta caaccccccg gacagcgagt actgccgctg tgccagcgcc 2521 ctggagaagt tcttctactt caagctcaag gagggaggcc tcattgacaa gtaggcccat 2581 ctttgggccg cagccctgac ctggaatgtc tccacctcgg attctgatct gatccttagg 2641 gggtgccctg gccccacgga cccgactcag cttgagacac tccagccaag ggtcctccgg 2701 acccgatcct gcagctcttt ctggaccttc aggcaccccc aagcgtgcag ctctgtccca 2761 gccttcactg tgtgtgagag gtctcctggg ttggggccca gcccctctag agtagctggt 2821 ggccagggat gaaccttgcc cagccgtggt ggcccccagg cctggtcccc aagagctttg 2881 gaggcttgga ttcctgggcc tggcccaggt ggctgtttcc ctgaggacca gaactgctca 2941 ttttagcttg agtgatggct tcaggggttg gaagttcagc ccaaactgaa gggggccatg 3001 ccttgtccag cactgttctg tcagtctccc ccaggggtgg ggggtatggg gaccattcat 3061 tccctggcat taatccctta gagggaataa taaagctttt tatttctctg tgaaaaaaaa 3121 aaaaaaa

Los fragmentos incluyen todas las posibles longitudes de aminoácidos de entre e incluyendo aproximadamente 8 y 100 aminoácidos aproximadamente, por ejemplo, longitudes de entre aproximadamente 10 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 15 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 20 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 35 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 40 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 50 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 70 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 75 y 100 aminoácidos, o entre aproximadamente 80 y 100 aminoácidos. Estos fragmentos peptídicos pueden obtenerse comercialmente o sintetizarse por medio de métodos de síntesis en fase líquida o fase sólida (Atherton etal., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra). Los fragmentos peptídicos de HAT pueden aislarse a partir de una fuente natural, diseñarse por ingeniería genética o prepararse químicamente. Estos métodos se conocen bien en la técnica.

Un compuesto activador de HAT también puede ser una proteína, tal como un anticuerpo (monoclonal, policlonal, humanizado, y similares), o un fragmento de unión del mismo, dirigido contra una enzima histona acetiltransferasa, tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1. Un fragmento de anticuerpo puede ser una forma de un anticuerpo distinta de la forma de longitud completa e incluye porciones o componentes que existen dentro de anticuerpos de longitud completa, además de fragmentos de anticuerpo que se han modificado por ingeniería genética. Los fragmentos de anticuerpos pueden incluir, pero sin limitarse a, Fv de cadena sencilla(scFv), diacuerpos, Fv, y (Fab')2, triacuerpos, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, regiones de entramado, regiones constantes, y similares (véanse, Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Los anticuerpos pueden obtenerse comercialmente, generarse a petición o sintetizarse frente a un antígeno de interés según métodos establecidos en la técnica (Janeway et al., (2001) Immunobiology.5a ed., Garland Publishing).

La inhibición de ARN que codifica para una proteína HAT puede modular eficazmente la expresión de un gen de HAT (por ejemplo, GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1) a partir del cual se transcribe el ARN. Se seleccionan inhibidores del grupo que comprende: ARNip, ARN de interferencia o iARN; ARNbc; ADN transcritos por ARN polimerasa III; ribozimas; y ácido nucleico antisentido, que puede ser ARN, ADN o ácido nucleico artificial.

Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ADN, ARN y ADN/ARN antisentido, actúan bloqueando directamente la traducción del ARNm uniéndose a ARNm seleccionado como diana e impidiendo la traducción de proteínas. Por ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia de ADN que codifican para un polipéptido de HAT, por ejemplo, mediante técnicas de fosfodiéster convencionales (Dallas et al., (2006) Med. Sci. Monit.12(4):RA67-74; Kalota et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburger et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:243-59).

El ARNip comprende una estructura bicatenaria que contiene de desde aproximadamente15 hasta aproximadamente 50 pares de bases, por ejemplo desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 25 pares de bases, y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un ARN o gen diana expresado dentro de la célula. Las secuencias de nucleótidos antisentido incluyen, pero no se limitan a: morfolinos, polinucleótidos de 2'-O-metilo, ADN, ARN y similares. Los ADN transcritos por a Rn polimerasa III contienen promotores, tales como el promotor U6. Estos ADN pueden transcribirse para producir ARN en horquilla pequeños en la célula que pueden funcionar como ARNip o ARN lineales que pueden funcionar como ARN antisentido. El compuesto activador de HAT puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos sintéticos, o cualquier combinación adecuada de manera que el ARN y/o gen diana se inhiba. Además, estas formas de ácido nucleico pueden ser de cadena individual, doble, triple o cuádruple (véanse por ejemplo Bass (2001) Nature, 411,428 429; Elbashir et al., (2001) Nature, 411,494 498; y las publicaciones PCT n.os WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409, WO 00/44914).

En algunas realizaciones, un compuesto activador de HAT puede ser una molécula pequeña que se une a una enzima histona acetiltransferasa, tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1, y altera su función. Las moléculas pequeñas son un grupo diverso de sustancias sintéticas y naturales que tienen generalmente bajos pesos moleculares. Pueden aislarse de fuentes naturales (por ejemplo, plantas, hongos, microbios y similares), se obtienen comercialmente y/o están disponibles como bibliotecas o colecciones, o se sintetizan. Las moléculas pequeñas candidatas que interaccionan con una proteína HAT pueden identificarse por medio de examen in silico o examen de alto rendimiento (HTP) de bibliotecas combinatorias. La mayoría de los productos farmacéuticos convencionales, tales como aspirina, penicilina y muchos compuestos quimioterápicos, son moléculas pequeñas, pueden obtenerse comercialmente, pueden sintetizarse químicamente o pueden obtenerse a partir de bibliotecas al azar o combinatorias tal como se describe a continuación (Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6).

El conocimiento de la secuencia primaria de una molécula de interés, tal como un polipéptido de HAT, y la similitud de esa secuencia con otras proteínas de la misma familia de histona acetiltransferasa (tal como la familia de GNAT, la familia de MYST o la familia deGCN5 [véanse Lee y Owrkman (2007) Nat Rev Mol Cell Biol., 8(4):284-95, Marmorstein (2001) J Molec Biol. 311: 433-444; y Kimura et al., (2005) J Biocehm. 138(6): 647-662]), puede proporcionar información en cuanto a los inhibidores o antagonistas de la proteína de interés. La identificación y el examen de antagonistas puede facilitarse adicionalmente determinando características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría por resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación de la estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño o la identificación racional de antagonistas, además de agonistas proteicos.

La invención proporciona métodos para examinar e identificar compuestos útiles para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto. La invención proporciona métodos para identificar compuestos que pueden usarse para tratar a sujetos que presentan, por ejemplo, placas de amiloide beta anómalamente elevadas, o niveles de proteína Tau elevados, o niveles de alfa-sinucleína elevados, o inclusiones, o nivel de lipofuscina o inclusiones, o nivel de TARDBP-TDP-43 escindida o inclusión, o acumulación de inclusiones de TARDBP/TDP-43 escindida, o una combinación de los mismos. En una realización, el método comprende seleccionar un compuesto activador de HAT que comprende una o ambas de las siguientes características: (a) la CE⁵⁰del compuesto es de no más de aproximadamente 1000 nM; (b) el compuesto penetra la barrera hematoencefálica; (c) el compuesto potencia la acetilación de histonas (por ejemplo acetila la proteína histona H3 o H4), o una combinación de las mismas. En una realización adicional, el compuesto, por ejemplo el activador de HAT, tiene una CE⁵⁰de al menos aproximadamente 0,1 nM, al menos aproximadamente 1 nM, al menos aproximadamente 5 nM, al menos aproximadamente 10 nM, al menos aproximadamente 25 nM, al menos aproximadamente 50 nM, al menos aproximadamente 100 nM, al menos aproximadamente 200 nM, al menos aproximadamente 300 nM, al menos aproximadamente 400 nM, al menos aproximadamente 500 nM, al menos aproximadamente 600 nM, al menos aproximadamente 700 nM, al menos aproximadamente 800 nM, o al menos aproximadamente 900 nM. En algunas realizaciones, el compuesto activador de HAT puede tener una masa molecular menor de aproximadamente 500 Da con el fin de penetrar la barrera hematoencefálica. En otras realizaciones, el compuesto activador de HAT puede tener un área de superficie polar menor de aproximadamente 90 A²y debe tener 8 o menos enlaces de hidrógeno con el fin de penetrar la barrera hematoencefálica. El examen y la identificación del compuesto pueden comprender examen in silico, acoplamiento molecular, examen in vivo, examen in vitro, o una combinación de los mismos.

Pueden examinarse compuestos de prueba, tales como compuestos activadores de HAT, a partir de bibliotecas grandes de compuestos sintéticos o naturales (véanse Wang et al., (2007) Curr Med Chem, 14(2):133-55; Mannhold (2006) Curr Top Med Chem, 6 (10):1031-47; y Hensen (2006) Curr Med Chem 13(4):361-76). Actualmente se usan numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de compuestos basados en sacáridos, péptidos y ácidos nucleicos. Están disponibles comercialmente bibliotecas de compuestos sintéticos de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.) y Microsource (New Milford, Conn.). Una biblioteca química poco común está disponible de Aldrich (Milwaukee, Wis.). Alternativamente, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales de por ejemplo Pan Laboratories (Bothell, Wash.) o MycoSearch (N.C.), o pueden producirse fácilmente. De manera adicional, se modifican fácilmente bibliotecas y compuestos naturales y producidos de manera sintética a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales (Blondelle et al., (1996) Tib Tech 14:60).

En la técnica se conocen bien métodos para preparar bibliotecas de moléculas y muchas bibliotecas están disponibles comercialmente. Las bibliotecas de interés en la invención incluyen bibliotecas de péptidos, bibliotecas de oligonucleótidos al azar, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, y similares. Las bibliotecas de péptidos degenerados pueden prepararse fácilmente en solución, en forma inmovilizada como bibliotecas de presentación de péptidos de flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación de fagos. Los ligandos peptídicos pueden seleccionarse de bibliotecas combinatorias de péptidos que contienen al menos un aminoácido. Pueden sintetizarse bibliotecas de peptoides y restos sintéticos no peptídicos. Tales bibliotecas pueden sintetizarse adicionalmente que contienen restos sintéticos no peptídicos, que están menos sujetos a degradación enzimática en comparación con sus homólogos que se producen de manera natural. También se pretende que las bibliotecas incluyan, por ejemplo, pero sin limitarse a, bibliotecas de péptidos sobre plásmidos, bibliotecas de polisomas, bibliotecas de aptámeros, bibliotecas de péptidos sintéticos, bibliotecas de moléculas pequeñas sintéticas, bibliotecas de neurotransmisores y bibliotecas químicas. Las bibliotecas también pueden comprender estructuras heterocíclicas o de carbono cíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales descritos en el presente documento.

También pueden generarse y examinarse bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas. Una biblioteca combinatoria de compuestos orgánicos pequeños es una colección de análogos estrechamente relacionados que difieren entre sí en uno o más puntos de diversidad y se sintetizan mediante técnicas orgánicas usando procesos de múltiples etapas. Las bibliotecas combinatorias incluyen una gran cantidad de compuestos orgánicos pequeños. Se prepara un tipo de biblioteca combinatoria por medio de métodos de síntesis en paralelo para producir una matriz de compuestos. Una matriz de compuestos puede ser una colección de compuestos identificables por sus direcciones espaciales en coordenadas cartesianas y dispuestos de manera tal que cada compuesto tenga un núcleo molecular común y uno o más elementos de diversidad estructural variable. Los compuestos en una matriz de compuestos de este tipo se producen en paralelo en recipientes de reacción diferenciados, con cada compuesto identificado y rastreado por su dirección espacial. Se proporcionan ejemplos de mezclas de síntesis en paralelo y métodos de síntesis en paralelo en el documento estadounidense con número de serie 08/177.497, presentado el de enero de 1994 y su correspondiente solicitud de patente publicada PCT WO95/18972, publicada el 13 de julio de 1995 y la patente estadounidense n.° 5.712.171 concedida el 27 de enero de 1998 y su correspondiente solicitud de patente publicada PCT WO96/22529, que se incorporan en el presente documento mediante referencia.

Se describen ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente en Fodor et al., (1991) Science 251:767-773; Houghten et al., (1991) Nature 354:84-86; Lam et al., (1991) Nature 354:82-84; Medynski, (1994) BioTechnology 12:709-710; Gallop et al., (1994) J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyer et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., (1992) Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; publicación PCT n.° WO 93/20242, con fecha de 14 de octubre de 1993; y Brenner et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.

Se describen ejemplos de bibliotecas de presentación de fagos en Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Devlin et al., (1990) Science, 249:404-406; Christian, et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, (1992) J. Immunol. Met.

152:149-157; Kay et al., (1993) Gene 128:59-65; y publicación PCT n.° WO 94/18318.

Las bibliotecas basadas en traducción in vitro incluyen pero no se limitan a las descritas en la publicación PCT n.°WO 91/05058; y Mattheakis et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.

En un ejemplo no limitativo, pueden examinarse bibliotecas no peptídicas, tales como una biblioteca de benzodiazepinas (véase, por ejemplo, Bunin et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712). También pueden usarse bibliotecas de peptoides, tales como las descritas por Simon et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371. Otro ejemplo de una biblioteca que puede usarse, en la que las funcionalidades amida en los péptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria químicamente transformada, se describe por Ostresh et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142.

La estructura geométrica tridimensional de un sitio activo, por ejemplo la de un polipéptido de HAT, puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X, que puede determinar una estructura molecular completa. Puede usarse RMN en fase sólida o líquida para determinar determinadas distancias intramoleculares. Cualquier otro método 52 experimental de determinación de la estructura puede usarse para obtener estructuras geométricas parciales o completas. Las estructuras geométricas pueden medirse con un ligando complejado, natural o artificial, que puede aumentar la precisión de la estructura del sitio activo determinada. En una realización, un compuesto que se une a una proteína HAT, tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1, puede identificarse por medio de: (1) proporcionar una biblioteca electrónica de compuestos de prueba; (2) proporcionar coordenadas atómicas enumeradas en la entrada de PDB n.° 1YGH o 2RC4, para al menos 20 residuos de aminoácido para el sitio activo de acetiltransferasa de la proteína HAT (el dominio HAT), en el que las coordenadas tienen una desviación cuadrática media del mismo, con respecto a al menos el 50% de los átomos Ca, de no más de aproximadamente 2 A, en un formato legible por ordenador; (3) convertir las coordenadas atómicas en señales eléctricas legibles por un procesador informático para generar un modelo tridimensional de la proteína HAT; (4) realizar un método de procesamiento de datos, en el que los compuestos de prueba electrónicos de la biblioteca se acoplan sobre el modelo tridimensional de la proteína HAT; y determinar qué compuesto de prueba se ajusta en el sitio activo del modelo tridimensional de la proteína HAT, identificando de ese modo qué compuesto se uniría a una proteína HAT. En otra realización, el método puede comprender además: sintetizar u obtener el compuesto que se determina que se acopla al sitio activo de la proteína HAT; poner en contacto la proteína HAT con el compuesto en una condición adecuada para la unión; y determinar si el compuesto modula la expresión de la proteína HAT o expresión de ARNm, o la actividad de la proteína HAT usando un ensayo de diagnóstico.

Se conocen en la técnica métodos para predecir el efecto sobre la conformación de la proteína de un cambio en la secuencia de la proteína, y el experto en la técnica puede por tanto diseñar una variante que funciona como antagonista según métodos conocidos. Un ejemplo de un método de este tipo se describe por Dahiyat y Mayo en Science (1997) 278:82 87, que describe el diseño de proteínas de novo. El método puede aplicarse a una proteína conocida para variar solo una porción de la secuencia de polipéptido. De manera similar, Blake (patente estadounidense n.° 5.565.325) enseña el uso de estructuras de ligandos conocidas para predecir y sintetizar variantes con función similar o modificada.

Otros métodos para preparar o identificar péptidos que se unen a una diana se conocen en la técnica. Puede usarse la impronta molecular, por ejemplo, para la construcción de novo de estructuras macromoleculares tales como péptidos que se unen a una molécula. Véanse, por ejemplo, Kennet J. Shea, Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites, TRIP vol. 2, n.° de mayo de 1994; Mosbach, (1994) Trends in Biochem. Sci., 19(9); y Wulff, G., en Polimeric Reagents and Catalysts (Ford, W. T., Ed.) ACS Symposium Series n.° 308, págs. 186-230, American Chemical Society (1986). Un método para preparar miméticos de una proteína HAT implica las etapas de: (i) polimerización de monómeros funcionales alrededor de un sustrato conocido (el molde) que presenta una actividad deseada; (ii) eliminación de la molécula molde; y luego (iii) polimerización de una segunda clase de monómeros en el hueco dejado por el molde, para proporcionar una nueva molécula que presenta una o más propiedades deseadas que son similares a las del molde. También pueden prepararse otras moléculas de unión tales como polisacáridos, nucleósidos, fármacos, nucleoproteínas, lipoproteínas, hidratos de carbono, glicoproteínas, esteroides, lípidos y otros materiales biológicamente activos. Este método es útil para diseñar diversos miméticos biológicos que son más más estables que sus homólogos naturales, porque se preparan mediante la polimerización por radicales libres de monómeros funcionales, dando como resultado un compuesto con una estructura principal no biodegradable. Otros métodos para diseñar tales moléculas incluyen, por ejemplo, diseño de fármacos basado en relaciones de estructura-actividad, que requieren la síntesis y evaluación de varios compuestos y modelado molecular.

La invención también proporciona métodos in vivo e in vitro para identificar un compuesto que se une a una proteína HAT. En una realización, el método comprende: (a) obtener un tejido y/o células que expresan una proteína HAT (tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1); (b) poner en contacto el tejido y/o la célula con una fuente de ligando durante un periodo de tiempo eficaz; (c) medir una respuesta de mensajero secundario, en el que la respuesta es indicativa de un ligando que se une a una proteína HAT; (d) aislar el ligando de la fuente de ligando; y (e) identificar la estructura del ligando que se une a una proteína HAT, identificando de ese modo qué compuesto se uniría a una proteína HAT.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fuente de ligando” puede ser cualquier biblioteca de compuestos descrita en el presente documento, o una biblioteca de neurotransmisores que puede usarse para examinar compuestos que actuarían como un agonista de una proteína HAT (tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1). El examen de las bibliotecas de compuestos enumeradas en el presente documento [véase también la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0009163], en combinación con estudios con animales in vivo y ensayos funcionales, puede usarse para identificar compuestos activadores de HAT que pueden usarse para tratar sujetos aquejados de depósitos de Ap anómalos, tales como AD o para tratar cáncer.

Un compuesto activador de HAT puede ser un compuesto que aumenta la actividad y/o expresión de una molécula de HAT (por ejemplo, GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1) in vivo y/o in vitro. Los compuestos activadores de HAT pueden ser compuestos que ejercen su efecto sobre la actividad de una proteína HAT por medio de la expresión, por medio de modificaciones postraduccionales o por otros medios. En una realización, un compuesto activador de HAT puede aumentar la expresión de ARNm o proteína HAT, o la actividad acetiltransferasa en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 99% o el 100%.

Pueden identificarse, mediante diversos ensayos, compuestos o agentes de prueba que se unen a una molécula de HAT (tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1), y/o tienen un efecto estimulador sobre la actividad o la expresión de una molécula de HAT. El ensayo puede ser un ensayo de unión que comprende la medición directa o indirecta de la unión de un compuesto de prueba o un ligando de hAt conocido al sitio activo de una proteína HAT. El ensayo puede ser también un ensayo de actividad que comprende la medición directa o indirecta de la actividad de una molécula de HAT. El ensayo puede ser también un ensayo de expresión que comprende la medición directa o indirecta de la expresión de un ARNm o proteína de HAT. Los diversos ensayos de examen pueden combinarse con un ensayo in vivo que comprende medir el efecto del compuesto de prueba sobre la función cognitiva y sináptica en un modelo animal para trastornos neurodegenerativos, tales como, pero sin limitarse a, AD o enfermedad de Huntington.

El ensayo de diagnóstico de los métodos de examen de la invención también puede implicar la monitorización de la expresión de una molécula de HAT. Por ejemplo, pueden identificarse inhibidores de la expresión de una molécula de hAt por medio de la puesta en contacto de una célula o tejido positivo para HAT con un compuesto de prueba y la determinación de la expresión de una proteína HAT o ARNm de HAT en la célula. El nivel de expresión de proteína o ARNm de una molécula de HAT en presencia del compuesto de prueba se compara con el nivel de expresión de proteína o ARNm de una proteína HAT en ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede entonces identificarse como un inhibidor de la expresión de una proteína HAT (tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1) basándose en esta comparación. También pueden identificarse activadores de la expresión de una molécula de HAT por medio de la puesta en contacto de una célula o tejido positivo para HAT con un compuesto de prueba y la determinación de la expresión de una proteína HAT o ARNm de HAT en la célula. El nivel de expresión de proteína o ARNm de una molécula de HAT en presencia del compuesto de prueba se compara con el nivel de expresión de proteína o ARNm de una proteína HAT en ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede entonces identificarse como un activador de la expresión de una proteína HAT (tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1) basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm o proteína HAT es estadística o significativamentemayor en presencia del compuesto de prueba que en su ausencia, el compuesto se identifica como un activador de la expresión de un ARNm o proteína HAT. En otras palabras, puede decirse que el compuesto de prueba es un compuesto activador de HAT (tal como un agonista). El nivel de expresión de un ARNm o proteína HAT en células puede determinarse mediante métodos descritos en el presente documento.

La determinación de la capacidad de un compuesto de prueba para unirse a una molécula de HAT o una variante de la misma puede lograrse usando análisis de interacción bimolecular (BIA) en tiempo real [McConnell, (1992); Sjolander, (1991)]. BIA es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcaje de ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo, BIA-core™). Pueden usarse los cambios en el fenómeno óptico resonancia de plasmón superficial (SPR) como indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Compuestos activadores de HAT a modo de ejemplo optimizados para trastornos del SNC y cáncer

La invención proporciona compuestos que se unen a una proteína activadora de HAT, tal como GCN5, GCN5L, PCAF o HAT1. Estos compuestos pueden identificarse mediante los métodos y ensayos de examen descritos en el presente documento, y potencian la actividad o expresión de proteínas activadoras de HAT.

En una realización, el compuesto de referencia activador de HAT, YF2, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 29. Otros análogos de compuestos activadores de HAT que tienen la fórmula I pueden sintetizarse de manera similar. Sin embargo, solo compuestos con la fórmula 6-9 son según la invención. El resto de los compuestos mencionados en estas figuras son compuestos de referencia.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 10, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 37.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 11, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 39.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 12, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 40.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 13, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 42.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 14, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 41.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 15, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 43.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 16, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 44.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 17, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 45.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 18, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 46.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 19, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 51.

En una realización, el compuesto activador de HAT, 20, puede sintetizarse según el esquema representado en la figura 38.

Los compuestos de la presente solicitud son los siguientes:

Los compuestos de la invención pueden sintetizarse generalmente según el esquema basado en el diagrama representado en la figura 29.

Se conocen en la técnica sales farmacéuticamente aceptables, y pueden seleccionarse de las enumeradas en Berge, et al. [“Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 66(1): 1-19 (enero de 1977)]. En una realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) es una sal de adición de ácido, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato. En otra realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) es una sal de adición de base, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o amonio. En otra realización, la sal de adición de base es una sal de tetrafluoroboro. En una realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (II) es una sal de adición de ácido, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato. En otra realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (II) es una sal de adición de base, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o amonio. En otra realización, la sal de adición de base es una sal de tetrafluoroboro. En una realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (III) es una sal de adición de ácido, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato. En otra realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (III) es una sal de adición de base, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o amonio. En otra realización, la sal de adición de base es una sal de tetrafluoroboro. En una realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (IV) es una sal de adición de ácido, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato. En otra realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (IV) es una sal de adición de base, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o amonio. En otra realización, la sal de adición de base es una sal de tetrafluoroboro. En una realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (V) es una sal de adición de ácido, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato. En otra realización, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (V) es una sal de adición de base, por ejemplo, una sal de sodio, potasio, calcio o amonio. En otra realización, la sal de adición de base es una sal de tetrafluoroboro.

La invención proporciona el uso de los compuestos 6-9 en métodos para reducir los cuerpos de inclusión (por ejemplo, depósitos de proteína amiloide beta (Ap), proteínas Tau nativas y fosforiladas, alfasinucleína nativa y fosforilada, lipofuscina, TARDBP escindida (TDB-43), o una combinación de los mismos) en un sujeto aquejado de una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, una AD, enfermedad de Huntington o enfermedad de Parkinson) mediante la administración de uno cualquiera de los compuestos 6-9 activadores de HAT. La invención también proporciona el uso de los compuestos 6-9 en métodos para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto mediante la administración de uno cualquiera de los compuestos 6-9 activadores de HAT. La invención proporciona además el uso de los compuestos 6-9 en métodos para tratar el cáncer en un sujeto mediante la administración de uno cualquiera de los compuestos 6-9 activadores de HAT. Los compuestos activadores de HAT son los compuestos 6-9.

En algunas realizaciones, en primer lugar se examinan compuestos activadores de HAT seleccionados de los compuestos 6-9 para determinar su capacidad para satisfacer una o más de las siguientes características: una CE⁵⁰no mayor de aproximadamente 100 nM; una actividad de acetilación de histonas in vitro; la capacidad de penetrar la BHE; o una combinación de las mismas.

En una realización, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto activador de HAT. En otra realización, el sujeto presenta placas de amiloide beta anómalamente elevadas, o niveles de proteína Tau elevados o acumulaciones de alfa-sinucleína, o acumulaciones de lipofuscina, o acumulación de niveles de TARDBP escindida (TDB-43), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el depósito de proteína Ap comprende un isómero AP40, un isómero AP42, o una combinación de los mismos. En una realización adicional, el sujeto está aquejado de enfermedad de Alzheimer, demencia por cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson o angiopatía amiloide cerebral. En realizaciones adicionales, el sujeto está aquejado de cáncer.

La dosificación administrada puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición suficiente para dar como resultado la mejora de síntomas de una enfermedad neurogenerativa tal como, pero sin limitarse a para reducir los cuerpos de inclusión (por ejemplo, depósitos de proteína amiloide beta (Ap), proteínas Tau nativas y fosforiladas, alfa-sinucleína nativa y fosforilada, lipofuscina, TARDBP escindida (TDB-43), o una combinación de los mismos), o reducir la pérdida de memoria en un sujeto. Por ejemplo, observar al menos aproximadamente una reducción del 25%, al menos aproximadamente una reducción del 30%, al menos aproximadamente una reducción del 40%, al menos aproximadamente una reducción del 50%, al menos aproximadamente una reducción del 60%, al menos aproximadamente una reducción del 70%, al menos aproximadamente una reducción del 80%, al menos aproximadamente una reducción del 85%, al menos aproximadamente una reducción del 90%, al menos aproximadamente una reducción del 95%, al menos aproximadamente una reducción del 97%, al menos aproximadamente una reducción del 98% o una reducción del 100% en los cuerpos de inclusión o la pérdida de memoria en un sujeto es indicativa de una mejora de los síntomas de una enfermedad neurogenerativa (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, AD, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson). Esta eficacia en la reducción de la aparición de inclusiones puede ser, por ejemplo, una medida de la mejora de los síntomas de una enfermedad neurogenerativa.

En una realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es de al menos aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,75 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3500 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 450 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 550 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 600 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 650 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 700 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 800 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 900 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal.

Un compuesto activador de HAT puede administrarse al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Alternativamente, un compuesto activador de HAT de la invención puede administrarse una vez o dos veces al día a un sujeto que lo necesita durante un periodo de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 28 días, o desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 10 días, o desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 15 días. También puede administrarse una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 veces al año, o una combinación de las mismas.

La dosificación administrada puede variar dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del principio activo y su modo y vía de administración; tiempo de administración del principio activo; edad, sexo, salud y peso del receptor; naturaleza y extensión de los síntomas; tipo de tratamiento concurrente, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado; y tasa de excreción.

La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL⁵⁰(la dosis letal para el 50% de la población) y la DE⁵⁰(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL⁵⁰/DE⁵⁰. Son útiles agentes terapéuticos que presentan grandes índices terapéuticos. Pueden usarse composiciones terapéuticas que presentan algunos efectos secundarios tóxicos.

Una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto activador de HAT puede depender de varios factores conocidos por los expertos en la técnica. La(s) dosis de un compuesto activador de HAT, por ejemplo, un compuesto seleccionado de los compuestos 6-9, pueden variar, por ejemplo, dependiendo de la identidad, el tamaño y el estado del sujeto o la muestra que está tratándose, dependiendo además de la vía por la que va a administrarse la composición, si es aplicable, y el efecto que el profesional sanitario desea que tenga el compuesto activador de HAT sobre una proteína HAT o una proteína que presenta actividad de HAT intrínseca. Estas cantidades puede determinarlas fácilmente un experto en la técnica.

Los compuestos activadores de HAT de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones pueden comprender un compuesto activador de HAT (por ejemplo, un compuesto de compuestos activadores de HAT seleccionado de los compuestos 6-9) y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier portador farmacéutico biocompatible estéril incluyendo, pero sin limitarse a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse a un paciente solo o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Según la invención, un portador farmacéuticamente aceptable puede comprender todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Puede usarse cualquier medio o agente convencional que sea compatible con el compuesto activo. También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Cualquiera de las aplicaciones terapéuticas descritas en el presente documento puede aplicarse a cualquier sujeto que necesite tal terapia, incluyendo, por ejemplo, un mamífero tal como un perro, un gato, una vaca, un caballo, un conejo, un mono, un cerdo, una oveja, una cabra o un ser humano.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EM™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un poliol farmacéuticamente aceptable como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal. En muchos casos, puede ser útil incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activador de HAT en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados en el presente documento. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, ejemplos de métodos de preparación útiles son secado a vacío y secado por congelación que produce un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. También pueden prepararse composiciones orales usando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, en el que el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga.

Pueden incluirse agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse en la formulación. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse a través del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan para dar pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica.

Bibliografía

51. Masliah, E., Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histo1Histopathol, 1995. 10(2): p. 509 19.

52. Selkoe, D.J., Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science, 2002. 298(5594): p. 789-91.

53. Sant'Angelo, A., F. Trinchese, y O. Arancio, Usefulness of behavioral and electrophysiological studies in transgenic models of Alzheimer's disease. Neurochem Res, 2003. 28(7): p. 1009-15.

54. Bliss, T.V. y G.L. Collingridge, A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature, 1993. 361(6407): p. 31-9.

55. Cullen, W.K., et al., Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport, 1997. 8(15): p. 3213-7.

56. Freir, D.B., C. Holscher, y C.E. Herrón, Blockade of long-term potentiation by beta-amyloid peptides in the CA1 región of the rat hippocampus in vivo. J Neurophysiol, 2001. 85(2): p. 708-13.

57. Itoh, A., et al., Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol, 1999. 382(3): p. 167-75.

58. Kim, J.H., et al., Use-dependent effects of amyloidogenic fragments of (beta)-amyloid precursor protein on synaptic plasticity in rat hippocampus in vivo. J Neurosci, 2001. 21(4): p. 1327-33.

59. Stephan, A., S. Laroche, y S. Davis, Generation of aggregated beta-amyloid in the rat hippocampus impairs synaptic transmission and plasticity and causes memory deficits. J Neurosci, 2001. 21(15): p. 5703-14.

510. Vitolo, O.V., et al., Amyloid beta-peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(20): p. 13217-21.

511. Walsh, D.M., et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 2002. 416(6880): p. 535-9.

512. Puzzo, D., et al., Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive elementbinding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity. J Neurosci, 2005. 25(29): p. 6887-97.

513. Selig, D.K., et al., Examination of the role of cGMP in long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus. Learn Mem, 1996. 3(1): p. 42-8.

514. Prickaerts, J., et al., cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur J Pharmacol, 2002. 436(1-2): p. 83-7.

515. Paakkari, I. y P. Lindsberg, Nitric oxide in the central nervous system. Ann Med, 1995. 27(3): p. 369-77.

516. Baratti, C.M. y M.M. Boccia, Effects of sildenafil on long-term retention of an inhibitory avoidance response in mice. Behav Pharmacol, 1999. 10(8): p. 731-7.

517. van Staveren, W.C., et al., Species differences in the localization of cGMP-producing and NO-responsive elements in the mouse and rat hippocampus using cGMP immunocytochemistry. Eur J Neurosci, 2004. 19(8): p. 2155 68.

518. Van Staveren, W.C., et al., mRNA expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2, 5, and 9 during development of the rat brain. J Comp Neurol, 2003. 467(4): p. 566-80.

519. Schultheiss, D., et al., Central effects of sildenafil (Viagra) on auditory selective attention and verbal recognition memory in humans: a study with event-related brain potentials. World J Urol, 2001. 19(1): p. 46-50.

520. Kemenes, I., et al., Critical time-window for NO-cGMP-dependent long-term memory formation after one-trial appetitive conditioning. J Neurosci, 2002. 22(4): p. 1414-25.

521. Baltrons, M.A., et al., Regulation of NO-dependent cyclic GMP formation by inflammatory agents in neural cells. Toxicol Lett, 2003. 139(2-3): p. 191-8.

522. Bon, C.L. y J. Garthwaite, On the role of nitric oxide in hippocampal long-term potentiation. J Neurosci, 2003.

23(5): p. 1941-8.

523. Trinchese, F., et al., Progressive age-related development of Alzheimer-like pathology in APP/PS1 mice. Ann Neurol, 2004. 55(6): p. 801-14.

524. Chapman, P.F., et al., Impaired synaptic plasticity and learning in aged amyloid precursor protein transgenic mice. Nat Neurosci, 1999. 2(3): p. 271-6.

525. Fitzjohn, S.M., et al., Age-related impairment of synaptic transmission but normal long-term potentiation in transgenic mice that overexpress the human APP695SWE mutant form of amyloid precursor protein. J Neurosci, 2001.

21(13): p. 4691-8.

526. Hsia, A.Y., et al., Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer's disease mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(6): p. 3228-33.

527. Jolas, T., et al., Long-term potentiation is increased in the CA1 area of the hippocampus of APP(swe/ind) CRND8 mice. Neurobiol Dis, 2002. 11(3): p. 394-409.

528. Larson, J., et al., Alterations in synaptic transmission and long-term potentiation in hippocampal slices from young and aged PDAPP mice. Brain Res, 1999. 840(1-2): p. 23-35.

529. Moechars, D., et al., Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem, 1999. 274(10): p. 6483-92.

530. Nalbantoglu, J., et al., Impaired learning and LTP in mice expressing the carboxy terminus of the Alzheimer amyloid precursor protein. Nature, 1997. 387(6632): p. 500-5.

531. Dineley, K.T., et al., Beta-amyloid activates the mitogen-activated protein kinase cascade via hippocampal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: In vitro and in vivo mechanisms related to Alzheimer's disease. J Neurosci, 2001.

21(12): p. 4125-33.

532. Dineley, K.T., et al., Accelerated plaque accumulation, associative learning deficits, and up-regulation of alpha 7 nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressing mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol Chem, 2002. 277(25): p. 22768-80.

533. Gong, B., et al., Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model following rolipram treatment. J. Clin. Invest., 2004. 114: p. 1624-1634.

534. Yin, J.C., et al., Induction of a dominant negative CREB transgene specifically blocks long-term memory in Drosophila. Cell, 1994. 79(1): p. 49-58.

535. Bourtchuladze, R., et al., Deficient long-term memory in mice with a targeted mutation of the cAMP-responsive element-binding protein. Cell, 1994. 79(1): p. 59-68.

536. Bach, M.E., et al., Age-related defects in spatial memory are correlated with defects in the late phase of hippocampal long-term potentiation in vitro and are attenuated by drugs that enhance the cAMP signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(9): p. 5280-5.

537. Lu, Y.F., E.R. Kandel, y R.D. Hawkins, Nitric oxide signaling contributes to late-phase LTP and CREB phosphorylation in the hippocampus. J Neurosci, 1999. 19(23): p. 10250-61.

538. McCarty, M.F., Vascular nitric oxide may lessen Alzheimer's risk. Med Hypotheses, 1998. 51(6): p. 465-76. 539. Troy, C.M., et al., Caspase-2 mediates neuronal cell death induced by beta-amyloid. J Neurosci, 2000. 20(4): p.

1386-92.

540. Wirtz-Brugger, F. y A. Giovanni, Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate mediated inhibition of cell death induced by nerve growth factor withdrawal and beta-amyloid: protective effects of propentofylline. Neuroscience, 2000. 99(4): p. 737-50.

541. Venturini, G., et al., Beta-amyloid inhibits NOS activity by subtracting NADPH availability. Faseb J, 2002. 16(14): p. 1970-2.

542. Suhara, T., et al., Abeta42 generation is toxic to endothelial cells and inhibits eNOS function through an Akt/GSK-3beta signaling-dependent mechanism. Neurobiol Aging, 2003. 24(3): p. 437-51.

543. Colton, C.A., et al., NO synthase 2 (NOS2) deletion promotes multiple pathologies in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(34): p. 12867-72.

544. Thatcher, G.R., B.M. Bennett, y J.N. Reynolds, Nitric oxide mimetic molecules as therapeutic agents in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res, 2005. 2(2): p. 171-82.

545. Haas, J., et al., Inducible nitric oxide synthase and argininosuccinate synthetase: co-induction in brain tissue of patients with Alzheimer's dementia and following stimulation with beta-amyloid 1-42 in vitro. Neurosci Lett, 2002.

322(2): p. 121-5.

546. Tran, M.H., et al., Amyloid beta-peptide induces nitric oxide production in rat hippocampus: association with cholinergic dysfunction and amelioration by inducible nitric oxide synthase inhibitors. Faseb J, 2001. 15(8): p. 1407-9.

547. McCann, S.M., The nitric oxide hypothesis of brain aging. Exp Gerontol, 1997. 32(4-5): p. 431-40.

548. Xie, Z., et al., Peroxynitrite mediates neurotoxicity of amyloid beta-peptide1-42- and lipopolysaccharide-activated microglia. J Neurosci, 2002. 22(9): p. 3484-92.

549. Wong, A., et al., Advanced glycation end products co-localize with inducible nitric oxide synthase in Alzheimer's disease. Brain Res, 2001. 920(1-2): p. 32-40.

550. Wang, Q., M.J. Rowan, y R. Anwyl, Beta-amyloid-mediated inhibition of NMDA receptor-dependent long-term potentiation induction involves activation of microglia and stimulation of inducible nitric oxide synthase and superoxide. J Neurosci, 2004. 24(27): p. 6049-56.

551. Monsonego, A., et al., Microglia-mediated nitric oxide cytotoxicity of T cells following amyloid beta-peptide presentation to Th1 cells. J Immunol, 2003. 171(5): p. 2216-24.

552. Contestabile, A., et al., Brain nitric oxide and its dual role in neurodegeneration/neuroprotection: understanding molecular mechanisms to devise drug approaches. Curr Med Chem, 2003. 10(20): p. 2147-74.

Ejemplos

A continuación se proporcionan ejemplos para facilitar una comprensión más completa de la invención. Los siguientes ejemplos ilustran los modos a modo de ejemplo de preparación y puesta en práctica de la invención. Sin embargo, el alcance de la invención no se limita a las realizaciones específicas dadas a conocer en estos ejemplos, que son para propósitos de ilustración solo, ya que pueden utilizarse métodos alternativos para obtener resultados similares.

Ejemplo 1 - Un compuesto activador de HAT.

El compuesto de referencia YF2, un activador de histona acetiltransferasa (HAT) de la invención (figura 3), es un buen candidato a fármaco para mejorar la memoria en enfermedades neurodegenerativas (es decir, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington) y el tratamiento de una variedad de cánceres. Cuando se administró el compuesto YF2 a ratones (por vía i.p.), la inmunotransferencia de tipo Western mostró que no solo cruza la BHE, sino que también aumenta los niveles de acetilación de histona 3 del hipocampo (figura 1). En los experimentos de comportamiento, el compuesto del título mejora el déficit de memoria por miedo contextual en ratones infundidos con AP42 (figura 2). AP42 es una proteína que se produce en alta cantidad en AD y es responsable de la alteración de las funciones sinápticas y la memoria.

Ejemplo 2 - Características de compuestos activadores de HAT

Se sintetizó el compuesto 6J, de Mantelingu et al (figura 4). Sin embargo, el compuesto 6J no tenía solubilidad y precipitó tan pronto como se puso en H2O. Sin embargo, existía la preocupación de que el fármaco (incluso si se disolviera en el 100% de DMSO) precipitara tan pronto como se administrara. Por tanto, se sintetizó un nuevo fármaco que era soluble, “MOM” (figura 5).

MOM tiene una solubilidad media (DMSO al 10% en H2O). Se administró MOM 25 mg/kg a ratones WT (por vía i.p.). Se extrajo el hígado e hipocampo de los ratones 1 h después del tratamiento. El hígado mostró un aumento muy ligero de AcH3, indicando que el fármaco tiene o bien muy poca eficacia o bien muy poca permeabilidad por la membrana (figura 6 ). El hipocampo no tenía aumento en los niveles de AcH3, indicando que el fármaco o bien es ineficaz o bien no cruza la barrera hematoencefálica (BHE) (figura 6 ). Aunque MOM no pudo aumentar los niveles de AcH3 en el hipocampo e hígado, se repitió el experimento con una nueva administración (sonda nasogástrica y por vía i.p. 25 mg/kg). Posteriormente se llevó a cabo el tratamiento de acondicionamiento por miedo de los ratones para observar si el fármaco es activo tras la inducción de aprendizaje. Además del hígado e hipocampo de los ratones, también se extrajo córtexel córtex de los ratones. Las muestras de hipocampo, córtex e hígado no mostraron de nuevo ningún aumento de los niveles de AcH3, indicando que el fármaco o bien es ineficaz o bien no cruza la BHE o bien no cruza la membrana celular (figura 7).

Aunque MOM no pudo aumentar los niveles de AcH3, se repitió el experimento con un vehículo químico diferente (DMSO al 10% y Tween 80 al 10%). Se sorteó la BHE administrándolo a través de cánulas implantadas sobre el hipocampo dorsal. Tanto el hipocampo como el córtex se extrajeron a las 2 h o 4 h después del tratamiento. En comparación con el vehículo, los ratones a los que se les administró MOM por medio de una cánula (100 |ig/|il por lado) mostraron un aumento de AcH4 (carril 1 frente a los carriles 2, 3). Los ratones a los que se les administró el fármaco por vía i.p. no mostraron aumento de AcH3 (figura 8 ). Estos datos indican que el compuesto MOM no cruza la BHE.

Se sintetizó un compuesto de referencia YF2 (figura 3). La preparación de YF2 fue sin una columna y eran visibles 2 fases: transparente y oleosa. Posteriormente se administró y F2 (50 mg/kg, por vía i.p.) a los ratones. Dos y cuatro horas después de su administración, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los hipocampos. De manera interesante, YF2 fue capaz de cruzar la BHE, penetrar en las células y aumentar AcH3 (carril 1 frente a los carriles 9, 10) (figura 8 ). Dado que el compuesto no estaba limpio al 100% y era necesario purificarlo/verificarlo adicionalmente, se sintetizó más YF2 y se purificó. Se verificó la pureza a través de resonancia magnética nuclear (RMN). Se les administró a los ratones YF2 (por vía i.p. disuelto en solución salina) a 5, 10, 20 mg/kg. La extracción del hipocampo se realizó en 3 puntos de tiempo diferentes (0,5, 1 y 2 horas tras el tratamiento). Entonces se ejecutó una inmunotransferencia de tipo Western para AcH3. Excepto para la administración de 1 h-10 mg/kg de YF2, y F2 aumentó drásticamente los niveles de AcH3 (figura 10), indicando que YF2 cruza la BHE y la membrana celular.

Ejemplo 3 - Experimentos de acondicionamiento por miedo señalado y contextual

Se realizó un condicionamiento por miedo contextual y señalado para evaluar si el compuesto es capaz de mejorar el defecto de la memoria inducido por amiloide-beta (Ap). Ap es un péptido que está elevado en la enfermedad de Alzheimer. El hipocampo desempeña un papel clave en la memoria contextual y en la enfermedad de Alzheimer. Este tipo de prueba cognitiva es mucho más rápida que otras tareas de comportamiento que requieren múltiples días de entrenamiento y pruebas [Q1, Q2]. La cámara de acondicionamiento estaba en una caja de atenuación de sonidos. Una ventana de plexiglás transparente permitió al experimentador filmar el rendimiento del ratón con una cámara colocada en un trípode y conectada al software Freezeframe (MED Ass. Inc.). Para proporcionar ruido de fondo blanco (72 dB), se instaló un único ventilador de ordenador en uno de los lados de la cámara de atenuación de sonidos. La cámara de acondicionamiento tenía un piso de rejilla de descarga aislada de 36 barras. El piso era retirable, y después de cada sujeto experimental, se limpió con etanol al 75% y luego con agua. Solo un animal a la vez estaba presente en la sala de experimentación.

Para los experimentos de condicionamiento señalado y contextual, se colocaron los ratones en la cámara de acondicionamiento durante 2 minutos antes del inicio de un tono diferenciado (CS) (un sonido que duró 30 segundos a 2800 Hz y 85 dB). En los últimos 2 segundos del CS, los ratones recibieron una descarga en el pie (US) de 0,8 mA durante 2 segundos a través de las barras del piso. Después del emparejamiento de CS/US, los ratones se dejaron en la cámara de acondicionamiento durante otros 30 segundos y luego volvieron a colocarse en sus jaulas domésticas. El comportamiento de congelación, definido como la ausencia de todo movimiento, excepto el necesario para respirar, se puntuó usando el software Freezeview.

Para evaluar el aprendizaje por miedo contextual, se midió la congelación durante 5 minutos (consecutivamente) en la cámara en la que se entrenó a los ratones 24 horas después del entrenamiento. Para evaluar el aprendizaje por miedo señalado, después de las pruebas contextuales, los ratones se colocaron en un nuevo contexto (jaula triangular con piso plano y liso) durante 2 minutos (prueba previa al CS), después de lo cual se expusieron al CS durante 3 minutos (prueba de CS), y se midió la congelación. La percepción sensorial de la descarga se determinó a través de la evaluación del umbral. Se suministró una secuencia de descargas en un solo pie a los animales colocados en la misma rejilla electrificada usada para el acondicionamiento por miedo. Inicialmente, se suministró una descarga de 0,1 mV durante 1 segundo, y se evaluó el comportamiento del animal en cuanto a retroceso, saltos y vocalización. A intervalos de 30 segundos, la intensidad de la descarga se aumentó en de 0,1 mV a 0,7 mV y luego volvió a 0 mV en incrementos de 0,1 mV a intervalos de 30 segundos. El umbral de vocalización, retroceso y luego salto se cuantificó para cada animal calculando el promedio de la intensidad de la descarga a la que cada animal manifiesta una respuesta de comportamiento a la descarga en el pie.

Se administró YF2 por vía i.p. a ratones (a un grupo de ratones se les administraron 20 mg/kg, 2 horas antes de la descarga eléctrica, mientras que a otro grupo se les administraron 5 mg/kg, 30 minutos antes de la descarga eléctrica). YF2 a ambas dosis fue capaz de aumentar drásticamente el tiempo de congelación demostrando que el compuesto rescata el defecto en la memoria contextual. El compuesto solo a la concentración más alta (20 mg/kg) no afectó a la memoria contextual (figura 10) indicando que el compuesto per se no es tóxico con respecto a la memoria. La memoria señalada no cambió en los diferentes grupos indicando que YF2 no afecta a la función de la amígdala (figura 11) Finalmente, no se observaron diferencias entre los diferentes grupos de ratones en diferentes conjuntos de experimentos en los que se evaluó el umbral sensorial en presencia de vehículo, YF2 solo, Ap solo o YF2 más Ap (figura 12 ).

Basándose en los resultados obtenidos durante las pruebas de acondicionamiento por miedo, se decidió determinar la cinética de YF2 en la sangre para verificar el mejor punto de tiempo para el tratamiento. Para este fin, se administró el compuesto (20 mg/kg. por vía i.p.) y luego se tomaron muestras de sangre de las colas a diferentes puntos de tiempo. La cinética de YF2 muestra un pico alrededor de 30 minutos después de la inyección (figura 13).

Bibliografía

Q1. Gong, B., et al., Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model after rolipram treatment. J Clin Invest, 2004. 114(11): p. 1624-34.

Q2. Gong, B., et al., Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model following rolipram treatment. J. Clin. Invest., 2004. 114: p. 1624-1634.

Ejemplo 4 - Laberinto de agua de brazos radiales (RAWM) de dos días

La tarea es un híbrido del laberinto de agua de Morris (MWM) y el laberinto de tierra de brazos radiales. Esta tarea está alterada en ratones infundidos con Ap. La motivación para los animales es la inmersión en el agua. El ratón necesitaba nadar en 6 callejones (brazos) que irradiaban desde un área central hasta que encontraba una plataforma oculta (sumergida) al final de uno de los brazos, basándose en señales visuales colocadas en la sala. El brazo objetivo se mantuvo constante para todos los ensayos, con un brazo de inicio diferente en ensayos sucesivos, de manera que el criterio de aprendizaje se alcanzó en 2 días. El primer día del protocolo fue un día de entrenamiento. Los ratones se entrenaron para identificar la ubicación de la plataforma alternando entre una plataforma visible y una oculta en un brazo objetivo. Los 3 ensayos finales el día 1 y los 15 ensayos el día 2 usaron una plataforma de escape oculta para obligar a los ratones a usar señales espaciales para identificar la ubicación del brazo objetivo.

Para evitarlas limitaciones de aprendizaje impuestas por la práctica agotadora y para evitar la fatiga que puede resultar de ensayos consecutivos, se estableció un entrenamiento de práctica espaciada ejecutando los ratones en cohortes de 4 y alternando diferentes cohortes a través de los 15 ensayos de entrenamiento a lo largo de periodos de prueba de 3 horas cada día. El día 1, se colocó una plataforma visible en una ubicación objetivo. El ratón 1 de la cohorte 1 se colocó suavemente en la piscina cerca del perímetro de la pared del primer brazo de inicio (especificado en una hoja de puntuación) y orientado hacia al centro de la piscina. Se contó el número de entradas en el brazo incorrecto (entradas en brazos sin plataforma). Si el animal entró en el brazo incorrecto, se retiró suavemente hacia el brazo inicial. Cada ensayo duró hasta 1 minuto. El fallo en la selección de un brazo después de 15 segundos se contó como un error y el ratón se devolvió al brazo de inicio. Después de 1 minuto, si la plataforma no se había localizado, se guio al ratón suavemente a través del agua colocando una mano detrás de él para dirigirlo hacia la plataforma. El ratón descansó en la plataforma durante 15 segundos. Después de completar el ensayo, se retiró el ratón de la piscina, se secó suavemente con una toalla y volvió a colocarse en su jaula bajo una lámpara de calor. La ubicación de la plataforma objetivo era diferente para cada ratón.

Después de que todos los ratones de la primera cohorte hayan tenido un ensayo para localizar una plataforma visible, se cambió la plataforma de visible a oculta. Después de que cada ratón de la cohorte 1 completara seis ensayos alternos entre plataformas visibles y ocultas, se dejó descansar a los ratones bajo una fuente de calentamiento, y los ratones de la segunda cohorte se sometieron a prueba de la misma manera. Después de completar los seis ensayos alternos, los ratones de la cohorte 2 regresaron a sus jaulas para descansar.

A continuación, los ratones de la primera cohorte completaron los ensayos 7-12 nuevamente usando la ubicación alterna de la plataforma visible-oculta. Durante el tiempo de descanso para los ratones de la primera cohorte, los ratones de la segunda cohorte completaron los ensayos 7-12. En este punto, todos los ratones habían realizado 3 pruebas de plataforma oculta. El día 2, se repitió el mismo procedimiento que en el día 1 para los 15 ensayos usando solo la plataforma oculta. Para el análisis de datos, se calcularon los promedios para cada ratón usando bloques de 3 ensayos. Tal como se muestra en la figura 14, los ratones tratados con vehículo presentaban ~1 error a lo largo de tres ensayos cerca del final del segundo día.

En cambio, los ratones infundidos con Ap [inyecciones bilaterales de AP42; 200 nM en un volumen final de 1 |il a lo largo de 1 min; dos veces en cada día de prueba: 15 minutos antes del 1° ensayo (para el 1° grupo de pruebas) y 15 min antes del 7° ensayo (para el 2° grupo de pruebas) en hipocampos dorsales], no pudieron aprender, cometiendo 3-4 errores a lo largo de la sesión de entrenamiento, sin mejoría a lo largo de los ensayos. El tratamiento con YF2 [(por vía i.p., 5 mg/kg, 30 min antes del 1° ensayo (para el 1° grupo de pruebas) y 30 min antes del 7° ensayo (para el 2° grupo de pruebas)] rescató la alteración de la memoria inducida por Ap. Además, YF2 por sí solo no afectó al rendimiento de los animales con este tipo de prueba. Los controles de las habilidades sensoriales, motoras y motivacionales de los ratones que podrían haber influido en el desenlace de la prueba con el RAWM de 2 días no mostraron ninguna diferencia en el tiempo necesario para alcanzar la plataforma visible y en la velocidad de natación entre los cuatro grupos diferentes de ratones (figura y figura 16).

Ejemplo 5 - Desregulación de la acetilación de histonas en enfermedad de Alzheimer

Se ha mostrado recientemente que la inhibición de la desacetilación de histonas a través de tricostatina A (TSA) mejora LTP y el acondicionamiento por miedo contextual (FC) en un modelo animal de deposición de amiloide, el ratón transgénico (Tg) que expresa la mutación sueca en APP(K670M:N671L) junto con la mutación en PS1(M146L, línea 6.2), denominado ratón APP/PS1[A21, A22]. Además, la actividad de HAT de CBP era esencial para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1 y los niveles de CBP en ratones APP/PS1 eran significativamente inferiores que en ratones WT. Los hipocampos de los ratones APP/PS1 presentaban, tras el entrenamiento de FC, una reducción de aproximadamente el 50% en los niveles de histona 4 acetilada, una acetilación que se mostró que era importante en la formación de la memoria[A23]. Basándose en estos hallazgos y sin querer restringirse a la teoría, los cambios epigenéticos, incluyendo la acetilación de histonas, desempeñan un papel importante en el daño inducido por Ap de la función sináptica y la memoria asociado con AD.

En el cerebro se requiere la fosforilación de CREB para la capacidad de CREB de unirse a CBP y estimular la expresión génica asociada a la memoria. CBP funciona como un coactivador que facilita las interacciones con la maquinaria de transcripción basal funcionando como una acetiltransferasa (HAT) que cataliza la acetilación de las histonas, provocando una pérdida de represión cromosómica y un aumento en la transcripción de genes asociados a memoria. A diferencia de las HAT, se encontró que las HDAC eliminaban un grupo acetilo de las histonas, restringiendo por tanto el acceso de la maquinaria de transcripción al ADN. De manera interesante, se ha encontrado que los inhibidores de HDAC potencian LTP y la memoria por miedo contextual, una forma de memoria asociativa en la que los animales deben asociar un estímulo neutro con uno aversivo[A25].

Además, los déficits de memoria y LTP de ratones CBP+/- se revirtieron mediante el inhibidor de HDAC, SAHA, apoyando el posible uso de esta clase de fármacos como agentes terapéuticos contra el retraso mental en el síndrome de Rubinstein-Taybi (RTS) [A24]. Se encontró que la nicotinamida, un inhibidor de HDAC III, restauraba la cognición en el modelo de ratón Tg triple de AD por medio de un mecanismo que implica la reducción de ThR231-fosfotau [A26]. Además, los inhibidores de HDAC indujeron el brote de dendritas, un número aumentado de sinapsis y reestablecieron el aprendizaje y el acceso a las memorias a largo plazo en el modelo de ratón CK-p25 Tg de pérdida neuronal [A23]. Los inhibidores de HDAC podrían afectar a la función neuronal a través de una variedad de mecanismos incluyendo cambios epigenéticos y no epigenéticos [A27]. No se ha determinado si los déficits cognitivos que siguen a la elevación de Ap pueden estar inducidos por la modificación epigenética de la acetilación de histonas (por medio de remodelación de la cromatina).

WT-PS1 estimula la capacidad de actividad transcripcional de CBP mientras que su mutante AD M146L no producía tal efecto [A20], indicando que pueden estar implicados CBP y su actividad de HAT en AD. Además, un mutante de CBP que carece de actividad de HAT no es capaz de responder a WT-PS1 en cuanto a aumento de la capacidad de activación de la transcripción. Por tanto, CBP y su región de HAT parecen ser esenciales para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1. Los inventores encuentran que el nivel de acetilación de histonas de ratones APP/PS1 es diferente que en ratones WT, identificando por tanto la A d como una enfermedad de etiología epigenética.

Significación. Aunque la AD se describió hace casi un siglo, los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la patología neuronal se desconocen todavía. Sin querer restringirse a la teoría, la epigenética y acetilación de histonas podrían desempeñar un papel fundamental en la AD. Además, la inhibición de HDAC o, a la inversa, la activación de una HAT, puede contrarrestar eficazmente la progresión de la enfermedad.

Determinación de si las disfunciones de la memoria y sinápticas inducidas por Ap mejoran mediante la inhibición de la desacetilación de histonas.

Basándose en datos que muestran que TSA rescata la reducción de LTP y el aprendizaje contextual en ratones APP/PS1, se determinará si el inhibidor también rescata estos déficits tras la exposición a Ap con el fin de separar los efectos de Ap de otros efectos de la sobreexpresión de APP y PS1.

Se cree que la AD comienza como un trastorno sináptico que conduce progresivamente a una mayor disfunción neuronal, conduciendo a pérdida de memoria [A28]. Para obtener pruebas en favor de la implicación de la epigenética en la disfunción de la memoria y sináptica inducida por Ap, se realizó una serie de experimentos usando el inhibidor de HDAC TSA sobre ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad (para una descripción detallada de los experimentos que muestran la caracterización de estos ratones véanse los manuscritos [A17, A29].

A esta edad, los ratones Tg comienzan a mostrar la plasticidad sináptica y las alteraciones de la memoria [A29]. La transmisión sináptica basal (BST) era similar entre ratones APP/PS1 y WT. No se encontraron diferencias en BST entre los 2 grupos tal como se mostró previamente en ratones de esta edad [A29]. Se perfundieron entonces cortes de hipocampo con TSA (1,65 |iM) durante 30 min antes de inducir LTP a través de estimulación tetánica de la ruta colateral de Schaeffer. La potenciación en cortes de APP/PS1 tratados con TSA era mucho mayor que en cortes de APP/PS1 tratados con vehículo (figura 17). Pero TSA no cambió la amplitud de LTP en cortes de hipocampo de ratones WT en comparación con cortes WT tratados con vehículo solo. Además, la perfusión de TSA no afecto a la transmisión de nivel inicial en cortes de APP/PS1 y WT que no recibieron tétanos.

Tras los experimentos sobre el efecto agudo de TSA en la disfunción sináptica, se determinó si TSA es beneficioso contra el deterioro de FC contextual en ratones APP/PS1[A17]. Se dividieron ratones de 4 meses de edad en 4 grupos: APP/PS1 con TSA, APP/PS1 con vehículo, WT con Ts A y W t con vehículo. Se administraron TSA y disolución de control de vehículo por vía i.p. a una concentración de 2 |ig/g de peso corporal. Se encontró un umbral de descarga similar entre los diversos grupos de ratones. Entonces, se entrenó a los ratones para asociar estímulos neutros con uno aversivo. Se colocaron en un contexto novedoso (caja de FC), se expusieron a una señal de ruido blanco emparejada con una descarga leve en el pie y se les inyectó TSA 2 h antes del entrenamiento. Se evaluó el aprendizaje por miedo 24 h después midiendo el comportamiento de congelación, la ausencia de todo movimiento excepto el necesario para respirar, en respuesta a la representación del contexto. No se encontraron diferencias en el comportamiento de congelación entre los 4 grupos de ratones durante la fase de entrenamiento del FC. 24 h después, el comportamiento de congelación disminuyó en ratones APP/PS1 tratados con vehículo en comparación con compañeros de camada WT tratados con vehículo en el análisis del aprendizaje contextual (figura 18). TSA mejoró la memoria en ratones Tg.

En experimentos futuros, se confirmarán los hallazgos electrofisiológicos y de comportamiento descritos en la figura 17 y la figura 18 usando un inhibidor estructuralmente distinto de histona-desacetilasas, butirato de sodio (NaB). Como para los experimentos con TSA, se tratarán cortes de ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad con NaB (300 |iM) durante 30 min antes de aplicar una estimulación de ráfaga theta para inducir LTP. Se realizarán controles sobre los cortes a partir de ratones APP/PS1 tratados con vehículo, y ratones compañeros de camada WT tratados con NaB o vehículo. De manera similar a TSA, se comprobará también si NaB (1,2 g/kg) reestablece la memoria por miedo contextual normal en ratones APP/PS1.

Los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal a través de diferentes mecanismos [A30, A31], incluyendo efectos directos mediante Ap. Las propiedades de tráfico y señalización de APP de longitud completa y sus productos de escisión son probablemente diferentes, lo que podría tener un impacto sobre aspectos de la función sináptica de manera diferente. Para separar los efectos de Ap de otros efectos de la sobreexpresión de APP y PS1, se determinará si Ap per se es responsable de los déficits observados en los estudios sobre ratones Tg. Puesto que ya se ha descrito que oligómeros naturales de Ap humano, en ausencia de monómeros y fibrillas, inhiben notablemente LTP in vivo [A6 ], se aplicará AP42 oligomérico 200 nM simultáneamente con TSA (1,65 |iM) durante 30 minutos a cortes WT antes de inducir LTP. Además, se alterará la memoria por miedo contextual a través de la infusión bilateral de AP42 oligomérico 200 nM sobre hipocampos dorsales 15 min antes del entrenamiento para FC, simultáneamente con TSA (2 |ig/g de peso corporal, 2 h antes del entrenamiento, por vía i.p.). Sin querer restringirse a la teoría, AP42 oligomérico debe inhibir LTP y la memoria por miedo, y demostrar que TSA reestablece LTP normal y la memoria por miedo contextual tras el tratamiento con AP42. TSA solo no debe tener ningún efecto. En experimentos adicionales se usará NaB (300 |iM) más AP42200 nM durante 30 min antes de aplicar una estimulación de ráfaga theta para inducir LTP. Se realizarán controles sobre cortes tratados con vehículo. De manera similar a TSA, se comprobará también si NaB (1,2 g/kg) reestablece la memoria por miedo contextual normal en ratones infundidos con AP42. Conjuntamente, estos experimentos demostrarán que la inhibición de histona desacetilasa es beneficiosa frente a la disfunción de la memoria y sináptica provocada por la elevación de Ap oligomérico.

Caracterización de la implicación de CBP tras la elevación de Ap.

Basándose en las observaciones de que i) WT-PS1 ya no promueve la transcripción en células F11 transfectadas con un constructo de CBP que carece de actividad de HAT, y que ii) los niveles de CBP están reducidos en ratones APP/PS1, se determinará si la actividad y los niveles de CBP HAT están afectados en ratones APP/PS1 y tras la elevación de Ap.

Se ha examinado recientemente si la actividad de HAT de CBP tiene algún papel en el efecto de estímulo de WT-PS1 usando un constructo en el que CBP de longitud completa contiene una mutación (WY - aminoácidos 1503-1504 reemplazados por alanina y serina). Esta mutación, que suprime completamente su actividad de HAT [A32], se vinculó al dominio de unión al ADN de Gal4 (figura 19). En contraposición a la actividad de promotor potenciada de WT-CBP de longitud completa, no se observó actividad con WY-CBP (figura 20A). No hubo diferencias en la actividad basal entre WT y WY Gal-CBP (figura 20B). Por tanto, un mutante de CBP que carece de actividad de HAT no es capaz de responder a WT-PS1 en cuanto a capacidad de activación de la transcripción aumentada. Por tanto, CBP y su región de HAT parecen ser esenciales para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1. Adicionalmente, se decidió medir los niveles de CBP endógenos en ratones APP/PS1.

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western del hipocampo de ratones APP/PS1 de 4 meses de edad reveló una disminución significativa en los niveles de CBP en comparación con controles WT (figura 21). En experimentos futuros, se replicarán estos resultados. Las estrategias alternativas incluirán la medición de CBP a partir de la fracción nuclear dado que se han observado cambios en la distribución de CBP (citoplasma frente a núcleo) en células F11 tras la sobreexpresión de PS1(M146L) en comparación con WT-PS1 [A20]. También se medirá directamente la actividad de HAT de CBP en ratones APP/PS1 tanto en la condición basal como 1 h después del entrenamiento para aprendizaje contextual en comparación con sus compañeros de camada WT. Los controles se realizarán usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente para excluir que los cambios en la actividad de HAT de CBP se deban al contexto novedoso solo o a la descarga eléctrica en lugar de a la asociación entre ellos [A25]. En el paradigma de inhibición latente, los animales se expondrán previamente a un contexto novedoso antes de recibir la descarga eléctrica de modo que el animal formará una memoria espacial que bloquea la formación de una memoria por miedo contextual asociativa. Finalmente, se medirá la actividad de HDAC usando un nuevo ensayo fluorimétrico sobre hipocampos usando el paradigma experimental como en el ensayo de HAT. Sin querer restringirse a la teoría, estos experimentos establecerán si CBP y/o HDAC están alteradas tras la sobreexpresión de los transgenes de APP y PS1.

Similar a los experimentos electrofisiológicos y de comportamiento descritos en el presente documento, se planteará si la administración de TSA rescatará los cambios en los niveles de CBP y la actividad de HAT de CBP. Se repetirán los mismos experimentos que se describieron en el presente documento tras el tratamiento con TSA (2 |ig/g de peso corporal; por vía i.p.), 2 h antes de la recogida de los hipocampos de ratones APP/PS1. Los compañeros de camada WT tratados con vehículo y TSA servirán como controles. Para separar los efectos de la sobreexpresión de APP y PS1 de los efectos de Ap per se, se repetirán los experimentos descritos en el presente documento (incluyendo los niveles de CBP, actividad de CBP-HAT y actividad de HDAC total con TSA o con vehículo solo) en presencia de Ap42 oligomérico 200 nM infundido sobre hipocampos dorsales de ratones WT en comparación con ratones infundidos con vehículo. Sin querer restringirse a la teoría, estos experimentos establecerán si CBP y/o HDAC están alteradas tras la elevación de Ap.

Determinación de qué niveles de acetilación de histonas cambian tras la elevación de Ap.

Los datos han mostrado una reducción de ~50% en los niveles de histona 4 acetilada en hipocampos de ratones APP/PS1. En experimentos futuros, se extenderá la investigación a histonas 2B y 3 que también desempeñan un papel clave en la transcripción y la memoria [A23-A25]. Finalmente se comprobará si la elevación de Ap afecta a la acetilación de histonas.

Se comprobará también si los defectos observados en ratones APP/PS1, en comparación con los compañeros de camada WT, se deben a efectos epigenéticos. Se mostró que la acetilación de histonas 2B, 3 y 4 desempeña un papel clave en la transcripción y la memoria [A23-A25]. Se midió la acetilación de H4 en el hipocampo de animales WT y APP/PS1. Se administró disolución de control de vehículo por vía i.p. 2 h antes del entrenamiento de FC. 1 h después del FC contextual, se sacrificaron los ratones APP/PS1 y WT y se extrajeron los hipocampos. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western demostró que, en comparación con ratones WT, los animales APP/PS1 tenían una reducción global de más del 50% en los niveles de histona 4 acetilada (figura 22). También se sometió a prueba si la inhibición de HDAC podría rescatar el defecto de los niveles de acetilación de histona 4 observado en ratones APP/PS1. La inyección de TSA (2 |ig/g de peso corporal; por vía i.p.) 2 horas antes del acondicionamiento por miedo contextual potenció la acetilación de H4 de ratones APP/PS1 (figura 22). Sin querer restringirse a la teoría, es probable que la AD sea una enfermedad con un motivo epigenético y que los inhibidores de HDAC puedan elevar los niveles disminuidos de histona 4 en un modelo de ratón de AD.

En experimentos futuros, se medirán los niveles de acetilación basales de histona 4, así como controles usando el paradigma de inhibición latente descrito en el presente documento. Además, se extenderán los estudios a histonas 2B y 3 midiendo su acetilación en el hipocampo de compañeros de camada WT y APP/PS1 de 4 meses de edad tanto en condiciones basales como tras el entrenamiento para FC, con y sin TSA como para la histona 4. Los controles se realizarán también usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente tal como se describe en el presente documento. Finalmente, se confirmarán estos hallazgos usando un inhibidor estructuralmente diferente de histona desacetilasas, NaB. Como para los experimentos con TSA, se comprobará si NaB (1,2 g/kg) reestablece los niveles de acetilación de histonas normales en ratones APP/PS1.

Para separar los efectos de la sobreexpresión de APP y PS1 de los efectos de Ap per se, los experimentos descritos en el presente documento relacionados con las mediciones de diferentes niveles de acetilación de histonas se repetirán en presencia de AP42 oligomérico 200 nM infundido sobre hipocampos dorsales de ratones WT en comparación con ratones infundidos con vehículo. Sin querer restringirse a la teoría, AP42 oligomérico afectará a los niveles de acetilación de histona 4. Los niveles de acetilación de las histonas restantes deben ser consecuentes con los hallazgos de ratones transgénicos (Tg). Se realizarán experimentos adicionales con NaB. Como para los experimentos con TSA, se comprobará si NaB (1,2 g/kg) reestablece los niveles de acetilación de histonas normales en ratones infundidos con AP42. Sin querer restringirse a la teoría, estos experimentos demostrarán que los cambios epigenéticos, tales como acetilación de histonas reducida, desempeñan un papel importante en el daño inducido por Ap de la función sináptica y la memoria asociado con AD.

Métodos

Anim ales: Se obtendrán ratones Tg dobles cruzando animales APP y PS1 (genotipados mediante PCR)[A29]. Para experimentos con Ap, se usarán ratones C57Bl6.

Preparación de Ap: Se preparará AP42 oligomérico a partir de péptidos sintéticos disponibles comercialmente (American Peptides Co), tal como se describe[A33, A34].

Para la electrofisiología, se cortarán cortes de 400 |im y se mantendrán en una cámara de superficie de contacto a 29°C durante 90 min antes del registro, tal como se notifica[A5]. En resumen, se registrarán fEPSP de CA1 colocando los electrodos de estimulación y registro en el stratum radiatum de CA1. Tras la evaluación de BST, se registrará un nivel inicial de 15 min cada min a una intensidad que provoca una respuesta ~35% de la respuesta provocada máxima. Se inducirá LTP usando una estimulación de ráfaga 0 (4 pulsos a 100 Hz, con las ráfagas repetidas a 5 Hz e incluyendo cada tétanos 3 trenes de diez ráfagas separados por 15 s).

Para el acondicionam iento contextual y señalado, se colocarán los ratones en la cámara de acondicionamiento durante 2 min antes del inicio de un tono diferenciado (CS) (un sonido de 30 s, 85 dB a 2800 Hz) tal como se describe[A17]. En los últimos 2 segundos del CS, los ratones recibirán una descarga en el pie (US) de 2 s, 0,60 mA a través de las barras del piso. Después del emparejamiento de CS/US, los ratones se dejarán en la cámara de acondicionamiento durante 30 s y luego volverán a colocarse en sus jaulas domésticas. El comportamiento de congelación se puntuará usando el software Freezeview (MED Ass). Para evaluar el aprendizaje por miedo contextual, se medirá la congelación durante 5 min en la cámara en la que se entrenarán los ratones 24 h después del entrenamiento. Para evaluar el aprendizaje por miedo señalado, 24 h después de las pruebas contextuales, se colocarán los ratones en un contexto novedoso durante 2 min (prueba previa al CS), tras lo cual se expondrán al CS durante 3 min (prueba de CS), y se medirá la congelación.

La percepción sensorial de la descarg a se determinará a través de la evaluación del umbral, tal como se describe[A17].

Los niveles de CBP se medirán con inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos frente a CBP específicos. La fracción nuclear estará contenida en el sedimento obtenido a partir de tejido homogeneizado, centrifugado a 7.700xg durante 1 min.

La actividad de HAT de CBP se medirá mediante inmunoprecipitación a partir de la lisis de extractos de hipocampo usando anticuerpos frente a CBP. Tras el aislamiento, la actividad de HAT se evaluará usando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas indirecto para detectar residuos acetilo según las instrucciones del fabricante (Upstate).

Para el ensayo de actividad de HDAC , se usará un kit fluorimétrico de Biovision (CA), según las instrucciones del fabricante.

Para el ensayo de acetilación de histonas , se realizará inmunotransferencia de tipo Western a partir de hipocampos congelados instantáneamente en nitrógeno líquido. Las proteínas nucleares se extraerán con ácido y se separarán sobre un gel de acrilamida al 7%-12% desnaturalizante seguido por electrotransferencia sobre nitrocelulosa. Se detectarán las histonas acetiladas (H3, H2A y H2B) usando anticuerpos adquiridos de Upstate y el kit de ECF de Amersham según el protocolo del fabricante.

Análisis estadísticos : Los experimentos se realizarán de manera ciega. Los resultados se analizarán con ANOVA con corrección a posteriori con el fármaco o genotipo como efecto principal.

Bibliografía

A1. Malm et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103:8852-7.

A2. Cleary et al, Nat Neurosci, 2005. 8:7984.

A3. Cullen et al, Neuroreport, 1997. 8:3213-7.

A4. Itoh et al, Eur J Pharmacol, 1999. 382:167-75.

A5. Vitolo, et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99:13217-21.

A6. Walsh et al, Nature, 2002. 416:535-9.

A7. Chen et al, J Neurosci Res, 2000. 60:65-72.

A8. Lambert et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95:6448-53.

A9. Kang et al, Nature, 1987. 325:733-6.

A10. Sherrington et al, Nature, 1995. 375:754-60.

A11. Levy-Lahad et al, Science, 1995. 269:970-3.

A12. Czech et al, Prog Neurobiol, 2000. 60:363-84.

A13. Takahashi et al, Neurosci Lett, 1999. 260:121-4.

A14. Rakyan et al, Biochem J, 2001. 356:1-10.

A15. Puzzo et al, J Neurosci, 2005. 25:6887-97.

A16. Puzzo et al, in Soc Neurosci. Abstr. 2006. Atlanta.

A17. Gong et al, J. Clin. Invest., 2004. 114:1624-1634.

A18. Korzus et al, Neuron, 2004. 42:961-72.

A19. Saura et al, Neuron, 2004. 42:23-36.

A20. Francis et al, Neuroreport, 2006. 17:917-21.

A21. Holcomb et al, Nat Med, 1998. 4:97-100.

A22. Gong et al, Cell, 2006. 126:775-88.

A23. Fischer et al, Nature, 2007. 447:178-82.

A24. Alarcon et al, Neuron, 2004. 42:947-59.

A25. Levenson et al, J Biol Chem, 2004. 279:40545-59.

A26. Green et al, J Neurosci, 2008. 28:11500-10.

A27. Kazantsev et al, Nat Rev Drug Discov.2008. 7:854-68.

A28. Masliah, E., Histol Histopathol, 1995. 10:509-19.

A29. Trinchese et al, Ann Neurol, 2004. 55:801-14.

A30. Kamal et al, Nature, 2001. 414:643-8.

A31. Cao et al, Science, 2001. 293:115-20.

A32. Bordoli et al, Nucleic Acids Res, 2001.29:589-97.

A33. Stine et al, J Biol Chem, 2003. 278: 11612-22.

A34. Puzzo et al, J. Neurosci., 2008. 28:14537-14545.

Ejemplo 6 - Alteración de la remodelación de la cromatina tras la elevación del amiloide

Además del vínculo de CREB y CBP con la AD, los cambios epigenéticos también podrían contribuir al desarrollo de AD. Los niveles en el hipocampo de histona 4 acetilada, una acetilación importante en la formación de la memoria [B19], estaban notablemente reducidos en un modelo animal de deposición de amiloide después del entrenamiento de acondicionamiento por miedo. Sin querer restringirse a la teoría, los cambios en la acetilación de histonas desempeñan un papel importante en la AD.

Además, después del entrenamiento para acondicionamiento por miedo, los niveles de H4 acetilada en el hipocampo en ratones APP/PS1 eran drásticamente inferiores que en compañeros de camada silvestres, indicando que los cambios en la acetilación de histonas están implicados en la pérdida de memoria en AD. Esta observación es consecuente con el hallazgo de que la inhibición de HDAC inducía el brote de dendritas, un número aumentado de sinapsis y reestablecía el aprendizaje y el acceso a LTM en el ratón transgénico CK-p25 con pérdida neuronal [B19]. Aunque no se investigaron los niveles de acetilación de histonas, el uso de inhibidores de HDAC en dos estudios adicionales es alentador. Se encontró que la nicotinamida, un inhibidor de HDAC III, restauraba la cognición en el modelo de ratón transgénico triple de a D por medio de un mecanismo no epigenético que implicaba la reducción de ThR231-fosfotau citosólica [B49]. Sin embargo, quedan por responder muchas preguntas: ¿un tratamiento con inhibidores de HDAC rescata los defectos en la acetilación de histonas, la plasticidad sináptica y la memoria tanto en ratones transgénicos con una carga de placas leve como en aquellos con una deposición de amiloide más profunda? ¿puede extenderse el efecto beneficioso de inhibidores de HDAC a otras formas de memoria explícita además de la memoria por miedo, tal como la memoria de referencia? ¿están otras histonas, tales como histonas H2B y 3 que también se sabe que desempeñan un papel clave en la transcripción y la memoria [B19, B25, B26], anómalamente acetiladas durante los procesos de la memoria en AD? Dado que se realizaron experimentos en ratones que sobreexpresaban transgenes de APP y PS1 mutados que podrían provocar una variedad de efectos independientes de la elevación de Ap, ¿se ve afectada la acetilación de histonas tras la elevación de Ap? ¿desempeña la histona acetiltransferasa CBP un papel en la reducción de la acetilación de histonas en ratones APP/PS1 y tras la elevación de Ap?

Los inventores también comentan en este ejemplo si se producen cambios en la cromatina al nivel de la acetilación de histonas tras la elevación de Ap durante procesos de la memoria. Sin querer restringirse a la teoría, los resultados obtenidos proporcionarán un nuevo tipo de mecanismo para la alteración inducida por Ap de la memoria y la función sináptica.

Las terapias para la AD que están actualmente en uso incluyen el aumento del sistema colinérgico mediante el uso de inhibidores de acetilcolinesterasa, o el bloqueo de la neurotoxicidad del glutamato a través de antagonistas de NMDA. Estos agentes tienen una eficacia limitada. Están en marcha esfuerzos importantes para inhibir la formación de ovillos, combatir la inflamación y el daño oxidativo y disminuir la carga de Ap en el cerebro o bien mediante el uso de agentes que inhiben p y y secretasas o aumentan a secretasa, mediante el uso de fármacos que inhiben la oligomerización de Ap, o mediante el uso de tratamientos tales como inmunización con Ap que parecen aumentar la eliminación de Ap del cerebro. Sin embargo, el papel de APP, Ap40 y las secretasas en la función fisiológica normal podrían presentar un problema para proporcionar enfoques eficaces y seguros para la terapia de AD. Los fármacos que interfieren con la maquinaria de transcripción y la acetilación de histonas podrían representar un nuevo enfoque para el tratamiento de AD para hacer que la célula con sus contactos sinápticos en los que se cree que residen los recuerdos, sean más robustos y resistentes a los efectos de Ap.

La inhibición de HDAC mejora los déficits en la potenciación a largo plazo del hipocampo en ratones APP/PS1. La observación que inspiró estos estudios era el resultado de una serie de experimentos en los que se sometió a prueba si una breve aplicación del inhibidor de HDAC TSA era capaz de rescatar el defecto en LTP mostrado por cortes de ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad (para una descripción detallada de los experimentos que muestran la caracterización de estos ratones [B50]). A esta edad los ratones transgénicos comienzan a mostrar la plasticidad sináptica y alteraciones de la memoria [Bl4, B50]). Tal como se demostró anteriormente [B50], la transmisión sináptica basal (BST) era similar entre ratones APP/PS1 y WT. Entonces se perfundieron cortes de hipocampo con TSA (1,65 |iM) durante 30 min antes de inducir LTP a través de estimulación tetánica de la ruta colateral de Schaeffer. La potenciación en cortes de APP/PS1 tratados con TSA era mucho mayor que en cortes de APP/PS1 tratados con vehículo (ANOVA de dos vías: Fi,ii=13,166, p=0,004; figura 17). Por otro lado, TSA no cambió la amplitud de LTP en cortes de hipocampo de ratones WT en comparación con cortes WT tratados con vehículo solo (Fii2=0,512, p=0,488, figura 17). Además, la perfusión de TSA no afectó a la transmisión de nivel inicial en cortes de APP/PS1 y WT que no recibieron tétanos (n=3 por cada grupo). Por tanto, la inhibición de HDAC es capaz de rescatar el defecto en LTP en el modelo animal de APP/PS1 de deposición de Ap.

La inhibición de HDAC rescata el defecto en la memoria asociativa en ratones APP/PS1. Similares a seres humanos afectados por AD [B51], los ratones APP/PS1 presentan un déficit en la memoria asociativa [B46]. En roedores, el aprendizaje asociativo puede evaluarse mediante acondicionamiento por miedo contextual. Esta tarea de comportamiento, que se basa en la asociación de un estímulo neutro con uno aversivo, depende de la función del hipocampo [B52]. Por tanto, tras experimentos sobre el efecto agudo de TSA en la disfunción sináptica, se determinó si TSA es beneficioso frente a la alteración del acondicionamiento por miedo contextual en ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad [B14]. Se dividieron los animales en 4 grupos: APP/PS1 con TSA, APP/PS1 con vehículo, WT con TSA y WT con vehículo. Se administraron disolución de control de vehículo y TSA por vía i.p. a una concentración de 2 mg/kg de peso corporal. Se encontró un umbral de descarga similar entre los diversos grupos de ratones. Entonces, se entrenó a los ratones para asociar estímulos neutros con uno aversivo. Se colocaron en un contexto novedoso (caja de acondicionamiento por miedo), se expusieron a una señal de ruido blanco emparejada con una descarga leve en el pie y se les inyectó TSA 2 h antes del entrenamiento. Se evaluó el aprendizaje por miedo 24 h después midiendo el comportamiento de congelación, la ausencia de todo movimiento excepto el necesario para respirar, en respuesta a la representación del contexto. No se encontraron diferencias en el comportamiento de congelación entre los 4 grupos de ratones durante la fase de entrenamiento del acondicionamiento por miedo (F3,47=0,02997, p=0,9929, n=12-13/grupo; figura 18). Veinticuatro horas después, se encontró una disminución en el comportamiento de congelación en ratones APP/PS1 tratados con vehículo en comparación con compañeros de camada WT tratados con vehículo en el análisis del aprendizaje contextual (F3,47=0,0526, p=0,0280, n=12-13/grupo; figura 18).

La congelación en ratones APP/PS1 tratados con vehículo era aproximadamente el 46% que la de ratones WT tratados con vehículo [ratones APP/PS1 tratados con vehículo: 14,88 ±2,97% frente a compañeros de camada WT tratados con vehículo: 31,68 ±5,32%; n=13 (11 hembras más 2 machos) y n=13 (11 hembras más 2 machos), respectivamente; t=2,76, p=0,0109; figura 18]. Sin embargo, el tiempo de congelación aumentó en ratones APP/PS1 tras la inyección de TSA hasta aproximadamente el 236,27% de ratones APP/PS1 tratados con vehículo [ratones APP/PS1 tratados con TSA: 35,15 ±6,99%, n=12 (10 hembras más 2 machos); t=2,744, p=0,0116; figura 18]. El análisis estadístico reveló que la congelación en ratones APP/PS1 no era significativamente diferente con respecto a tanto ratones WT tratados con TSA (t=0,1902, p=0,8508) como tratados con vehículo (t=0,3982, p=0,6941). Los ratones WT tratados con TSA mostraron un aumento ligero no significativo en la congelación en comparación con ratones WT tratados con vehículo [ratones WT tratados con TSA: 36,95 ±6,43%; n=13 (11 hembras más 2 machos); t=0,6316, p=0,5336, figura 18]. Se sometió a prueba a continuación el acondicionamiento por miedo señalado, una tarea independiente del hipocampo [B46], y no se encontró una diferencia en el comportamiento de congelación entre los 4 grupos (tanto en el grupo previo al CS, F3,25=0,8763, p=0,4666, como en el grupo de CS, F3,24=0,6398, p=0,5968). Este resultado indica que la función de la amígdala, que está implicada principalmente en el acondicionamiento señalado y se sabe que es normal en ratones APP/PS1, no se ve afectada por la inhibición de HDAC por TSA, tal como se demostró anteriormente [B53]. Tomados conjuntamente, estos datos muestran que la inhibición de la desacetilación de histonas es capaz de reestablecer la memoria asociativa normal en el ratón APP/PS1 mientras que también se restaura la plasticidad sináptica normal.

La inhibición de HDAC rescata el defecto en la memoria asociativa por la elevación de Ap. Los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal a través de diferentes mecanismos [B23, B24], incluyendo efectos directos por Ap. APP de longitud completa y sus productos de escisión podrían tener un impacto diferente sobre la acetilación de H4. Para separar los efectos de Ap de otros efectos de la sobreexpresión de APP y PS1, a continuación se determinó si Ap per se es responsable del déficit en la acetilación de H4 observado en los estudios en ratones transgénicos. Puesto que ya se ha descrito que oligómeros naturales de Ap humano inhiben notablemente la memoria in vivo [B54, B55], se aplicó una preparación que contenía AP42 oligomérico (200 nM en un volumen de 1 |il, bilateralmente, de manera lenta a lo largo de 1 min) en hipocampos dorsales (figura 24A-B), 15 min antes del entrenamiento para acondicionamiento por miedo, con inyección de TSA o vehículo (2 mg/kg de peso corporal, 2 h antes del entrenamiento, por vía i.p.). La infusión se produjo 5-7 días tras implantar cánulas sobre los hipocampos dorsales. No se encontraron diferencias en el comportamiento de congelación entre los 4 grupos de ratones durante la fase de entrenamiento del acondicionamiento por miedo (F3,41=0,04188, p=0,9884, n=8-14/grupo; figura 24C). Veinticuatro horas después, el comportamiento de congelación disminuyó en ratones infundidos con Ap en comparación con ratones infundidos con vehículo en el análisis del aprendizaje contextual (F3,41=3,619, p=0,0209, n=8-14/grupo; figura 24C). La congelación en ratones infundidos con Apera aproximadamente el 25% que la de ratones infundidos con vehículo [ratones infundidos con Ap: 8,580 ±2,119% frente a ratones infundidos con vehículo: 31,46 ±5,373% n=12 y 11 machos, respectivamente; t=3,147, p=0,0049; figura 24C]. Sin embargo, el tiempo de congelación aumentó en ratones infundidos con Ap tras la inyección de TSA hasta aproximadamente el 300% de los ratones infundidos con Ap (ratones tratados con TSA Ap: 26,17 ±4,747% n=14 machos; t=3,066, p=0,0053; figura 24). El análisis estadístico reveló que la congelación en ratones infundidos con Ap a los que se les inyectó TSA no era significativamente diferente con respecto a tanto ratones a los que se les inyectó TSA (t=0,1902, p=0,8508) como vehículo (t=0,3982, p=0,6941) que se infundieron con vehículo. Los ratones tratados con TSA mostraron cantidades similares de congelación que los ratones tratados con vehículo [ratones tratados con TSA: 27,01 ±7,246%; n=8 machos; t=0,4335, p=0,6701, figura 24C]. A continuación se sometió a prueba el acondicionamiento por miedo señalado, y no se encontró una diferencia en el comportamiento de congelación entre los 4 grupos (tanto en el grupo previo al CS, F3,52=1,547 , p=0,2135, como en el grupo de CS, F3,52=0,4838, p=0,6950). Tomados conjuntamente, estos datos muestran que la inhibición de la desacetilación de histonas es capaz de reestablecer la memoria asociativa normal tras la elevación de Ap.

Los ratones APP/PS1 presentan un nivel endógeno reducido de acetilación de histona 4 en respuesta a una tarea de aprendizaje. Dado que se sabe que los inhibidores de HDAC acetilan otras moléculas además de las histonas [B49], el siguiente objetivo era determinar si el efecto de TSA sobre el defecto en la memoria por miedo de ratones APP/PS1 estaba vinculado, al menos en parte, a cambios en la cromatina al nivel de la acetilación de histonas. Se mostró que la acetilación de H4 desempeña un papel clave en la transcripción y la memoria [B19]. Por tanto, se planteó si el déficit de memoria observado en ratones APP/PS1 estaba asociado con una acetilación de H4 alterada. Se midió la acetilación de H4 en el hipocampo de animales silvestres (WT) y APP/PS1 de 3 a 4 meses de edad, tras el entrenamiento para acondicionamiento por miedo. Se administró disolución de control de vehículo por vía i.p. 2 h antes del entrenamiento y 1 hora después de que se sacrificaran los ratones y se extrajeran los hipocampos. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western demostró que, en comparación con ratones WT, los animales APP/PS1 tenían una reducción global de más del 50% en los niveles de h 4 acetilada (t=2,702, p=0,0355; figura 25A). De manera interesante, en experimentos intercalados, la inyección del inhibidor de HDAC de clase I/II, TSA (2 mg/kg de peso corporal; por vía i.p, 2 horas antes del entrenamiento para acondicionamiento por miedo) potenció la acetilación de H4 de ratones APP/PS1 (t=3,283, p=0,0168 en comparación con compañeros de camada APP/PS1 tratados con vehículo; figura 25A). Además, los niveles de acetilación de H4 en hipocampos de ratones APP/PS1 tratados con TSA eran similares a los niveles en compañeros de camada WT tratados con TSA (t=0,2116, p=0,8385; figura 5A). Finalmente, tal como se demostró anteriormente [B26], TSA aumentó los niveles de acetilación de H4 en ratones WT (t=7,659, p=0,0001) en comparación con hipocampos de compañeros de camada WT tratados con vehículo; figura 25A).

A continuación se quiso determinar si había algún cambio en los niveles de acetilación basales de H4 en ratones APP/PS1, en comparación con ratones silvestres. Por tanto se midió la acetilación de H4 en hipocampos de animales WT y APP/PS1 de 3 a 4 meses de edad que se expusieron al contexto sin recibir una descarga eléctrica. No se encontraron diferencias entre los dos grupos experimentales en H4 acetilada basal (t=0,076, p=0,9427; figura 25B). Esto demuestra que i) la sobreexpresión de transgenes de APP y PS1 mutados afecta a los cambios epigenéticos al nivel de acetilación de H4 tras el aprendizaje por miedo contextual; y ii) TSA es capaz de elevar niveles disminuidos de histona 4 en un modelo de ratón de AD.

El papel de CBP y su región de HAT en la transcripción tras la estimulación con PS1. Los estudios de los mecanismos que subyacen a la formación de la memoria han definido papeles centrales de la expresión génica dependiente de CRE, que está mediada por el factor de transcripción CREB y el coactivador CBP. CBP crea un puente entre CREB y la maquinaria de transcripción basal y acetila histonas. La acetilación de histonas, a su vez, induce cambios cromosómicos que dan como resultado la pérdida de la represión cromosómica (véase la figura 23). Esto permite la transcripción satisfactoria de los genes subyacentes necesarios para la síntesis de proteínas que subyacen a la formación de la memoria. Se ha examinado recientemente si la actividad de HAT de CBP tiene algún papel en el efecto de estímulo de WT-PS1 usando un constructo en el que CBP de longitud completa contiene una mutación (WY - aminoácidos 1503-1504 reemplazados por alanina y serina). Esta mutación, que suprime completamente su actividad de HAT [B56], se vinculó al dominio de unión al ADN de Gal4 (figura 19). En contraposición a la actividad promotora potenciada de WT-CBP de longitud completa, no se observó actividad con WY-CBP (figura 20A). No hubo diferencias en la actividad basal entreWT yWY Gal-CBP (figura 20B). Por tanto, estos hallazgos indican que un mutante de CBP que carece de actividad de HAT no es capaz de responder a WT-PS1 en cuanto a capacidad de activación de la transcripción aumentada. Por tanto, parece que CBP y su región de HAT son esenciales para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1.

Los ratones APP/PS1 presentan niveles de CBP reducidos. A continuación se decidió medir los niveles de CBP endógenos en ratones APP/PS1. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western del hipocampo de ratones APP/PS1 de 4 meses de edad reveló una disminución significativa en los niveles de CBP en comparación con controles WT (figura 21) consecuente con la observación de que los niveles de CBP cerebrales se reducen en ratones que carecen de PS funcionales [B15]. En experimentos futuros, se replicarán estos resultados para aumentar el número de experimentos para establecer firmemente que la sobreexpresión de transgenes de APP y PS1 mutados afecta a los niveles de CBP.

Objetivos

1. Determinar si la inhibición de la desacetilación de histonas rescata los defectos sinápticos y de la memoria tras la elevación de Ap.

La inhibición de la desacetilación de histonas a través de tricostatina A (TSA) rescata los déficits en LTP y memoria por miedo contextual en ratones APP/PS1 [B20, B21], un animal transgénico que expresa la mutación sueca en APP(K670M:N671L) junto con la mutación en PS1(M146l , línea 6.2) [B22]. Se someterá a prueba ahora si el inhibidor estructuralmente distinto de histona desacetilasas, butirato de sodio (NaB), rescata los déficits sinápticos y de la memoria. Dado que estas observaciones se obtuvieron en ratones APP/PS1 de 4 meses de edad cuando las placas de amiloides están justo comenzándose a formar, se extenderán a animales transgénicos de 7 meses de edad que tienen una deposición de Ap más profunda. Además, dado que los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal por medio de diferentes mecanismos [B23, B24], incluyendo efectos directos mediante Ap, se investigará si la inhibición de la desacetilación de histonas rescata los defectos de LTP y memoria por miedo contextual inducidos por Ap per se. Se extenderán también estos hallazgos a otra forma de aprendizaje explícito, la memoria de referencia.

Diseño de la investigación y métodos.

Fundamento . Un concepto ampliamente aceptado en el campo de la memoria es que los recuerdos se almacenan en los cerebros como cambios duraderos en la fuerza sináptica. Consecuente con este concepto, se cree que la AD comienza como un trastorno sináptico que conduce progresivamente a mayor disfunción neuronal, conduciendo a pérdida de memoria [B57]. Sin querer restringirse a la teoría, la inhibición de HDAC contrarresta la alteración de la plasticidad sináptica y la memoria tras la elevación del amiloide. Se someterá a prueba esto con un inhibidor adicional y estructuralmente distinto, NaB, además de TSA. A continuación, dado que los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal a través de diferentes mecanismos [B23, B24], se determinará si Ap per se es responsable del déficit en la acetilación de histonas observado en los estudios en ratones transgénicos. Además, se extenderán los hallazgos a ratones APP/PS1 de más edad cuando tienen una carga de placas grave [B50]. Finalmente, se extenderán los hallazgos a otra forma de memoria explícita además de memoria por miedo, la memoria de referencia. Sin querer restringirse a la teoría, la inhibición de la histona desacetilasa es beneficiosa frente a la disfunción sináptica y de la memoria provocada por la elevación de Ap oligomérico.

Diseño experimental . Se confirmarán los hallazgos electrofisiológicos y de comportamiento descritos en la figura 17 y la figura 18 usando el inhibidor estructuralmente distinto NaB. Como para los experimentos con TSA, se tratarán cortes de ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad con NaB (300 |iM) durante 30 min antes de aplicar una estimulación de ráfaga theta para inducir LTP. Se realizarán controles sobre cortes de ratones APP/PS1 tratados con vehículo, y ratones compañeros de camada WT tratados con NaB o vehículo. De manera similar a TSA, se comprobará también si NaB (1,2 g/kg) reestablece la memoria por miedo contextual normal en ratones APP/PS1. En estos experimentos de comportamiento, se dividieron los animales en 4 grupos: APP/PS1 con NaB, APP/PS1 con vehículo, Wt con NaB yWT con vehículo. También se realizarán controles usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente para excluir que los inhibidores de HDAC actúen a través de un efecto sobre el contexto novedoso solo o la descarga eléctrica en lugar de la asociación de los mismos [B26]. En el paradigma de inhibición latente los animales se expondrán previamente a un contexto novedoso antes de recibir la descarga eléctrica de modo que el animal formará una memoria espacial que bloquea la formación de una memoria por miedo contextual asociativa [B26].

Se separarán los efectos de la sobreexpresión de APP y PS1 de los efectos de Ap per se. Se ha demostrado ya que TSA rescata el defecto de la memoria por miedo contextual inducido por una preparación que contiene Ap42 oligomérico (véase la figura 24). Por tanto, se determinará si TSA rescata el defecto en LTP inducido por Ap42 oligomérico 200 nM. Puesto que ya se ha descrito que los oligómeros naturales de Ap humano, en ausencia de monómeros y fibrillas, inhiben notablemente LTP in vivo [B29], se aplicará Ap42 oligomérico 200 nM simultáneamente con TSA (1,65 |iM) durante 30 minutos a cortes WT antes de inducir LTP. En experimentos de control intercalados, se aplicará Ap42 oligomérico solo, o TSA solo, o vehículo.

Se replicarán los hallazgos descritos en el presente documento usando NaB (300 |iM) más AP42200 nM durante 30 min antes de aplicar una estimulación de ráfaga theta para inducir LTP. Se realizarán controles sobre cortes tratados con vehículo. Como para TSA, también se comprobará si NaB (1,2 g/kg) rescata el defecto en la memoria por miedo contextual en ratones infundidos con AP42. En estos experimentos de comportamiento, también se realizarán controles usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente para excluir que los inhibidores de HDAC actúen a través de un efecto sobre el contexto novedoso solo o la descarga eléctrica en lugar de la asociación entre ellos [B26].

Se repetirán todos los experimentos descritos en el presente documento con ratones de más edad (7 meses), cuando existe una carga de placas más grave y la disfunción sináptica incluye también BST [B50].

Se extenderán los hallazgos sobre la memoria por miedo contextual a otra forma de memoria explícita, la memoria de referencia. Se ha implementado recientemente un método que tiene la ventaja de llevar un tiempo muy corto [B58]. El método es un híbrido del laberinto de agua de Morris y el laberinto de tierra de brazos radiales. La motivación para los animales es la inmersión en el agua. El ratón necesitaba nadar en 6 callejones (brazos) que irradian desde un área central hasta que encuentra una plataforma oculta (sumergida) al final de uno de los brazos. El brazo objetivo se mantuvo constante para todos los ensayos, con un brazo de inicio diferente en ensayos sucesivos, de manera que el criterio de aprendizaje se alcanzó en 2 días. El número de entradas en el brazo incorrecto será. Al final de la tarea, los ratones realizarán pruebas en una plataforma visible para excluir la posibilidad de que los déficits visuales, motores y motivacionales afecten al desenlace de los experimentos. En estos experimentos se les inyectará a compañeros de camada WT y APP/PS1 de 3-4 y 7 meses de edad TSA o NaB, 2 h antes de realizar la tarea. Se usará vehículo en experimentos de control. También se realizarán experimentos similares que evalúan la memoria de referencia en ratones infundidos con AP42 (para estos experimentos, se dividirán los ratones en los siguientes grupos: animales infundidos con AP42 TSA o NaB o vehículo, animales infundidos con vehículo TSA o NaB o vehículo).

Sin querer restringirse a la teoría, se mostrará que la inhibición de HDAC rescata los déficits de LTP y la memoria. Si no, como estrategia alternativa, se intentarán concentraciones superiores de los inhibidores de HDAC, o un inhibidor de HDAC estructuralmente distinto tal como MS-275 que también se ha mostrado que cruza la barrera hematoencefálica [B59]. Entonces, el roedor se someterá a pruebas electrofisiológicas y de comportamiento tal como se describe en el presente documento. Sin querer restringirse a la teoría, AP42 oligomérico inhibirá LTP y la memoria por miedo, y demostrará que TSA mejora LTP y la memoria por miedo contextual tras el tratamiento con AP42. TSA sola no debe tener ningún efecto. Los hallazgos de ratones jóvenes o animales infundidos con Ap deben confirmarse en ratones transgénicos de 7 meses de edad. Si no, como estrategia alternativa, se intentarán tratamientos más prolongados con los inhibidores de HDAC, comenzando 1 o 4 semanas antes de las pruebas. Finalmente, sin querer restringirse a la teoría, los hallazgos con la tarea de memoria de referencia deben de estar de acuerdo con los obtenidos con el acondicionamiento por miedo. Si es así, estos resultados deben demostrar que la inhibición de histona desacetilasa es beneficiosa frente a la pérdida cognitiva en general en modelos animales de tipo AD. Si no, esto será igualmente interesante ya que demostrará una disociación entre diferentes tipos de memoria y el uso de inhibidores de HDAC.

Estudios que investigan los mecanismos que subyacen a LTP en cortes de hipocampo agudos indican que no es necesaria transcripción para la potenciación que se produce antes de 2 horas [B26]. Sin embargo, se observó un efecto de TSA inmediatamente después de la inducción de LTP (figura 17). Este hallazgo es consecuente con el resultado de Levenson et al. [B26]. El paradigma de inducción de LTP que aplicaron induce una forma de LTP que depende de la transcripción para o bien la inducción o bien la expresión. Esto se demostró usando 5,6-diclorobencimidazol ribósido (DRB), un inhibidor de la transcripción, en ratones WT. DRB era capaz de bloquear tanto la fase temprana como la tardía de un aumento de LTP inducido por TSA, indicando que tanto la potenciación temprana como la tardía de LTP por TSA son dependientes de la modulación transcripcional [B26].

TSA y otros inhibidores de HDAC representan un nuevo enfoque para el tratamiento de AD para hacer que la sinapsis sea más robusta y resistente a los efectos de Ap. Con respecto al uso de inhibidores de HDAC, se ha criticado que la inhibición de HDAc podría alterar la expresión génica globalmente y por tanto afectar a procesos de la memoria de una manera no específica. Sin embargo, Vecsey et al [B53] mostraron que TSA no altera globalmente la expresión génica sino que en su lugar aumenta la expresión de genes específicos durante la consolidación de la memoria. Fueron capaces de mostrar que los inhibidores de HDAC, incluyendo TSA, potencian la memoria y la plasticidad sináptica principalmente mediante la activación de genes clave que son dependientes de la activación transcripcional de CREB [B53]. Por tanto, es probable que TSA pueda ser capaz de detener la degradación de la memoria en presencia de acumulación de Ap así como mejorar funciones cerebrales que ya se han deteriorado, como en el caso del ratón APP/PS1 de 3 meses de edad. De manera interesante, el “recableado” del cerebro y la recuperación de la memoria usando inhibidores de HDAC se notificó recientemente en ratones transgénicos CK-p25 [Bl9]. Por tanto, es posible que los inhibidores de HDAC pudieran ser capaces de reestablecer redes neurales en el cerebro con AD. Esto indica que el uso de moléculas pequeñas para seleccionar como diana HDAC en pacientes con AD podría facilitar el acceso a recuerdos a largo plazo. Están desarrollándose actualmente inhibidores de HDAC con efectos secundarios minimizados por la industria farmacéutica. Queda por determinar si estos inhibidores más nuevos pueden entrar fácilmente en el cerebro y si son tan eficaces como TSA.

Los inhibidores de HDAC podrían afectar a la función neuronal a través de una variedad de mecanismos incluyendo cambios epigenéticos y no epigenéticos [B19, B60]. Por tanto, el bloqueo de HDAC de clase I/II puede aumentar la acetilación de sustratos distintos de histonas que, a su vez, pueden contribuir a la amplificación de procesos celulares asociados con la memoria. Green et al. [B49] mostraron que la inhibición de HDAC dependientes de NAD+ de clase III que usan vitamina B3 restauró los déficits cognitivos en los ratones con AD transgénicos triples, por medio de un mecanismo que implica la reducción de ThR231-fosfotau en el citoplasma.

2. Determinación de si las histonas 2B, 3 y 4 está anómalamente acetiladas tras la elevación de Ap.

Los hipocampos de ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad presentan, tras el entrenamiento de acondicionamiento por miedo, una reducción de aproximadamente el 50% en los niveles de histona 4 acetilada (H4), una acetilación que se mostró que es importante en la formación de la memoria [B19]. En experimentos futuros, se extenderá esta investigación a las histonas 2B y 3 porque también desempeñan un papel clave en la transcripción y la memoria [B19, B25, B26]. Además, se examinarán ratones transgénicos de más edad con una carga de placas más grave (7 meses). Finalmente, para separar los efectos de Ap de otros efectos de la sobreexpresión de APP y PS1, se comprobará si la infusión de Ap en los hipocampos afecta a la acetilación de histonas 2B, 3 y 4.

Diseño de la investigación y métodos.

Fundamento. La sobreexpresión de los transgenes de APP y PS1 mutados afecta a los cambios en la acetilación de H4 que se producen durante el aprendizaje por miedo contextual (véase la figura 25). Además, la inhibición de HDAC a través de TSA es capaz de elevar los niveles disminuidos de H4 en un modelo de ratón con AD. Sin querer restringirse a la teoría, mecanismos epigenéticos al nivel de la acetilación de histonas pueden alterarse durante el aprendizaje y la memoria en AD. Histonas adicionales que experimentan cambios en la acetilación durante el aprendizaje y la memoria son H2B y H3 [B19, B25]. Por tanto, en experimentos futuros se extenderán estos estudios a estas histonas. Además, se someterá a prueba el inhibidor estructuralmente distinto de histona desacetilasas, NaB. A continuación, dado que los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal a través de diferentes mecanismos [B23, B24], se determinará si Ap per se es responsable del déficit en la acetilación de histonas observado en los estudios en ratones transgénicos. Finalmente, se extenderán estos hallazgos a ratones APP/PS1 de más edad cuando tienen una carga de placas grave [B50].

Diseño experim ental. Se medirá la acetilación de H2B y H3 en el hipocampo de compañeros de camada WT y APP/PS1 de 4 meses de edad, tanto en condiciones basales como tras el entrenamiento para acondicionamiento por miedo, con TSA (2 mg/kg de peso corporal; por vía i.p, 2 horas antes del entrenamiento para acondicionamiento por miedo) o vehículo como para H4. Se realizarán controles usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente para excluir que las modificaciones de histonas se deban al contexto novedoso solo o la descarga eléctrica en lugar de la asociación entre ellos [B26]. Inmediatamente después del sacrificio, se diseccionará el tejido cerebral y los dos hipocampos de cada ratón se agruparán y congelarán inmediatamente para su homogeneización y análisis posteriores. Controles adicionales usarán el cerebelo.

Se someterá a prueba si NaB (1,2 g/kg) es también capaz de mejorar la acetilación de H2B, 3 y 4 en el mismo paradigma experimental y controles que en los experimentos con TSA descritos en el presente documento en el ejemplo 6.

Se repetirán todos los experimentos descritos en el presente documento en el ejemplo 6 para medir la acetilación de H4, 2A y 3 en presencia de AP42 oligomérico 200 nM infundido en los hipocampos dorsales de ratones WT en comparación con ratones infundidos con vehículo. Se realizarán controles usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente y también usando el cerebelo.

Los hallazgos en el ejemplo 6 se confirmarán con el NaB estructuralmente distinto. Como para los experimentos con TSA, se comprobará si NaB (1,2 g/kg) reestablece los niveles de acetilación de histonas normales en ratones infundidos con AP42. También para estos experimentos, se realizarán controles sobre ratones infundidos con vehículo y usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente, así como el cerebelo.

Se investigará también si pueden mejorarse los niveles de acetilación de histonas cuando se produce una carga de amiloide profunda. Para abordar esta cuestión que está directamente relacionada con la posibilidad terapéutica de uso de inhibidores de HDAC en estadios avanzados de la patología de AD, se repetirán los experimentos tal como se describe en el presente documento en ratones APP/PS1 de más edad (7 meses).

Sin querer restringirse a la teoría, AP42 oligomérico afectará a los niveles de acetilación de H4 y AP42 oligomérico producirá los mismos efectos sobre los niveles de acetilación de histonas 2B y 3 que en ratones transgénicos. Si no, se intentarán aplicaciones más prolongadas de AP42 oligomérico 200 nM a través de minibombas osmóticas Alzet (1 día, 1 semana, 1 mes). Los problemas relacionados con el uso de una preparación sintética que contiene AP42 se alivian enormemente mediante el uso de animales transgénicos que producen formas naturales de Ap. Estudios sobre H2B y 3 proporcionarán un cuadro más completo del tipo de cambios epigenéticos que se producen al nivel de la acetilación de histonas. Finalmente, la investigación en ratones de más edad ayudará a comprender si podrían usarse inhibidores de HDAC en estadios patológicos de más edad. Tomados todos conjuntamente, los estudios descritos en el presente documento ayudarán a establecer los cambios epigenéticos como acontecimientos que se producen tras la elevación de Ap.

Además de la acetilación de histonas, se mostró que otras modificaciones postraduccionales de histonas (PTM) tales como fosforilación, sumoilación, ubiquitinación y metilación regulan la transcripción [B7]. Por ejemplo, se encontró que modificaciones de histonas asociadas con transcripción génica activa, tales como metilación de Lys4 de h 3 y acetilación de Lys56 de H3, conducen a expresión génica. Pero se encontró que modificaciones de histonas asociadas con la inactivación de la transcripción génica, tales como metilación de Lys27 de H3 y ubiquitinación de Lys119 de H2A provocan silenciamiento génico. Las PTM que se modifican como consecuencia de exposición neuronal crónica a formas oligoméricas de AP42 en ratones. Tal como se describió (véase la figura 24), se infundirá AP42 oligomérico 200 nM en los hipocampos dorsales de ratones WT. Los hipocampos de ratones infundidos con AP42 se extraerán y se compararán con los de ratones infundidos con vehículo. Se llevará a cabo espectrometría de masas, usando H2B, 3 y 4 inmunoprecipitadas, en hipocampos e investigación para las diferentes PTM de histonas entre ratones infundidos con AP42 y animales infundidos con vehículo. Para controlar los efectos no específicos, se tendrá un 3° grupo de ratones en los que se infunde una neurotoxina bien estudiada, GABA gamma-acetilénico, que no está directamente relacionado con AD. Se someterán a prueba entonces varias de las PTM de histonas más interesantes en el modelo de ratón APP/PS1. Estos ratones se sacrificarán a 1 mes (antes de la formación de placas), 2 meses (cuando comienzan a formarse placas), 3-4 meses (en estadios tempranos de la formación de placas) y 7 meses (en estadios tardíos de la formación de placas) de edad para someter a prueba cuándo se producen estas PTM de histonas. Sin querer restringirse a la teoría, es probable que cambios epigenéticos, tales como acetilación de histonas reducida, desempeñen un papel importante en el daño inducido por Ap de la función sináptica y la memoria asociado con AD.

3. Determinación de si los niveles y/o la actividad de la histona acetil-transferasa CBP están modificados tras la elevación de Ap.

La actividad de HAT de CBP es esencial para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1. Además, se encontró que los niveles de CBP en ratones APP/PS1 de 3-4 meses de edad era menores que en ratones WT. En experimentos futuros, se extenderá esta observación a ratones transgénicos de más edad y tras la infusión de Ap en el hipocampo. Además, se determinará si la actividad de HAT de CBP está afectada tanto en ratones APP/PS1 jóvenes como de más edad así como tras la infusión de Ap. Finalmente, se determinará si la estimulación de la actividad de HAT a través del agonista de HAT recientemente sintetizado, MOM, rescata los déficits en LTP, memoria y acetilación de histonas tras la elevación de Ap.

Diseño de la investigación y métodos.

Fundamento. Los niveles de CBP endógenos están reducidos en ratones APP/PS1 (véase la figura 21). Estos datos concuerdan con la observación de que los niveles de CBP cerebrales están reducidos en ratones que carecen de PS funcionales [B15]. Además, dado que CBP y su región de HAT parecen ser esenciales para potenciar la transcripción in vitro tras la estimulación con PS1 (véase la figura 20), se medirá directamente la actividad de HAT de CBP en ratones APP/PS1 tanto en condición basal como 1 h después del entrenamiento para aprendizaje contextual en comparación con sus compañeros de camada WT. Si se encuentra una reducción tanto en los niveles de CBP como/o la actividad de HAT, se comprobará también si el uso de un agonista de HAT [B61] rescata el defecto en la memoria por miedo contextual y la acetilación de histonas. A continuación, dado que los transgenes de APP y PS1 podrían afectar a la función neuronal a través de diferentes mecanismos [B23, B24], se determinará si Ap per se es responsable del déficit en los niveles y/o la actividad de CBP observados en ratones transgénicos. Finalmente, se extenderán estos hallazgos a ratones a Pp /PSI de más edad cuando tienen una carga de placas más grave [B50]. Tomados conjuntamente, se evaluará si los niveles y/o la actividad de CBP están alterados tras la sobreexpresión de los transgenes de APP y PS1, además de si los niveles y/o la actividad de CBP están alterados tras la elevación de Ap. Los investigadores examinarán si los agonistas de hAt rescatan los defectos en la función sináptica y de la memoria, así como la acetilación de histonas.

Diseño experim ental. Se medirán los niveles de CBP en el hipocampo de compañeros de camada WT y APP/PS1 de 4 meses de edad. Inmediatamente después del sacrificio, se diseccionará el tejido cerebral y los dos hipocampos de cada ratón se agruparán y congelarán inmediatamente para su posterior homogeneización y análisis. Controles adicionales usarán el cerebelo.

Se medirá directamente la actividad de HAT de CBP en ratones APP/PS1 tanto en condición basal como 1 h después del entrenamiento para aprendizaje contextual en comparación con sus compañeros de camada WT. Se realizarán controles usando un paradigma de entrenamiento de inhibición latente para excluir que los cambios en la actividad de HAT de CBP se deban a un contexto novedoso solo o la descarga eléctrica en lugar de la asociación entre ellos [B26].

Controles adicionales usarán el cerebelo. Se sintetizó un agonista de HAT, tal como N-(4-cloro-3-trifluorometil-fenil)-2-etoxi-benzamida (CTB o también denominado compuesto 6J) [B61]. Se sintetizó otro agonista de HAT de benzamida, MOM, para comprobar si la regulación por incremento de la actividad de HAT rescata el defecto en LTP, memoria por miedo contextual y acetilación de histonas de ratones APP/PS1. Se ha sintetizado el compuesto (figura 26A) y se ha mostrado que induce acetilación de histonas (figura 26B). Se someterá a prueba si m Om rescata el defecto de LTP en cortes de hipocampo de ratones APP/PS1 siguiendo el mismo paradigma experimental descrito en el presente documento. Se aplicará MOM (10 |iM) o vehículo durante 30 min antes de inducir LTP con la ráfaga 0. Se usarán como controles cortes de compañeros de camada WT tratados con MOM o vehículo. A continuación, se comprobará si el agonista rescata el defecto en la memoria por miedo contextual en animales APP/PS1 siguiendo el mismo paradigma experimental descrito en el presente documento. Se comprobará también si MOM reestablece la memoria de referencia normal.

Dado que MOM no cruza la barrera hematoencefálica, se implantarán cánulas en los hipocampos dorsales de ratones APP/PS1 y compañeros de camada WT para suministrarlo directamente en los hipocampos. Si infundirán 100 |ig en 1 |il, lentamente a lo largo de 1 min. La infusión se producirá 2 h antes de aplicar la descarga en el pie para el acondicionamiento por miedo. Como en los experimentos descritos en el presente documento, se medirá la cantidad de congelación a las 24 h para evaluar la memoria por miedo contextual seguido por la memoria por miedo señalado a las 48 h. Para los experimentos en el laberinto de agua, a su vez, se medirán el número de entradas en el brazo incorrecto. Finalmente, en un conjunto separado de experimentos, se extraerán los hipocampos y los cerebelos 1 h después del entrenamiento para acondicionamiento por miedo y se medirán los niveles de acetilación de histonas. Si se encuentra que MOM rescata los defectos de LTP y la memoria, así como la acetilación de histonas en el hipocampo de ratones APP/PS1, se concluirá que los agonistas de HAT podrían mejorar el defecto en LTP, memoria y acetilación de histonas tras la sobreexpresión de los transgenes de APP y PS1. El protocolo también se llevará a cabo para someter a prueba el efecto del activador de HAT, CTB.

Todos los experimentos descritos en el presente documento, incluyendo los niveles de CBP, la actividad de HAT y el uso de MOM y CTB, se repetirán en presencia de AP42 oligomérico 200 nM infundido en los hipocampos dorsales de ratones WT en comparación con ratones infundidos con vehículo.

Se investigará también si puede mejorarse el defecto en los niveles de CBP y/o la actividad de HAT cuando se produce una carga de amiloide profunda. Para abordar esta cuestión, se repetirán los experimentos descritos en el presente documento en el ejemplo 6 en ratones APP/PS1 de más edad (7 meses).

Los problemas relacionados con el uso de una preparación sintética que contiene AP42 se alivian enormemente mediante el uso de animales transgénicos que producen formas naturales de Ap. Se realizarán experimentos que examinan los niveles de CBP. Sin embargo, si los niveles de CBP no se ven afectados, se empleará una estrategia alternativa midiendo CBP a partir de la fracción nuclear. Se han observado cambios en la distribución de CBP en células F11. CBP se encuentra principalmente en el núcleo de células que sobreexpresan WT-PS1, mientras que células que sobreexpresan la forma mutante de PS1 muestran CBP tanto en el citoplasma como en el núcleo [B18]. Por tanto, se debe ser capaz de determinar si los cambios en la localización de CBP podrían desempeñar un papel en el desarrollo de AD.

Es difícil predecir si la actividad de HAT de CBP cambia. Además, no puede excluirse la posibilidad de que los cambios en la actividad de HAT de CBP se produzcan a un tiempo definido tras el entrenamiento para acondicionamiento por miedo. Por tanto, se medirá también la actividad de HAT en el hipocampo a diferentes puntos de tiempo (1 min, 5 min, 20 min y 2 h) tras la descarga eléctrica (con controles similares a los experimentos descritos en el presente documento). Por tanto, se debe ser capaz de obtener un cuadro de los cambios que se producen al nivel de la maquinaria de transcripción tras la elevación de Ap.

Se medirá la actividad de HDAC a través de un nuevo ensayo fluorimétrico sobre los hipocampos usando el paradigma experimental como en el ensayo de HAT (basal, 1 min, 5 min, 20 min y 1 hora después de la descarga en el pie). Una posibilidad alternativa adicional es que otras HAT estén implicadas en la reducción de la acetilación de histonas. Estas incluyen la familia de GNAT, la familia de MYST, p300 y ACTR/SRC-1. Se medirán los niveles y la actividad de estas HAT.

Finalmente, no puede excluirse la posibilidad de que MOM o CTB no rescaten el defecto en LTP, memoria y acetilación de histonas en ratones APP/PS1 así como ratones infundidos con Ap. Si es así, como estrategia alternativa, se intentarán tratamientos más prolongados con el agonista de HAT, comenzando una semana antes de las pruebas o a las 6 semanas de edad antes de la aparición de placas para los experimentos en animales transgénicos dobles.

Métodos generales del ejemplo

Animales. Se obtendrán ratones transgénicos dobles cruzando animales APP y PS1 (genotipados mediante PCR) [B20, B21, B50]. Para los experimentos de Ap, se usarán ratones C57Bl6 que se obtendrán de una colonia de cría. Todos los ratones se mantendrán en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (con las luces encendidas a las 6:00 A.M.) en salas de temperatura y humedad controladas. Estarán disponibles alimento y agua a voluntad.

Estudios electrofisiológicos. Se cortarán cortes de hipocampo de 400 |im de ratones C57BI6 y se mantendrán en una cámara de superficie de contacto a 29°C durante 9o min antes del registro, tal como se notificó anteriormente [B11]. La disolución de baño consistirá en NaCl 124,0 mM, KCl 4,4 mM, Na2HPO4 1,0 mM, NaHCO325,0 mM, CaCl2 2,0 mM, MgSO42,0 mM y glucosa 10,0 mM, con burbujeo continuo con el 95% de O2 y el 5% de CO2. Como electrodo de estimulación, se usará un electrodo de tungsteno bipolar, colocado al nivel de las fibras colaterales de Schaeffer. Como electrodo de registro, se usará una pipeta de vidrio llena de disolución de baño y colocada al nivel del stratum radiatum de CA1. Se evaluará en primer lugar la transmisión sináptica basal (BST) para representar gráficamente los voltajes del estímulo frente a las pendientes de fEPSP y determinar la intensidad de la estimulación de los experimentos de LTP (debe provocarse una respuesta ~35% de la respuesta provocada máxima). El nivel inicial para LTP se registrará durante 15 min, cada min. Se inducirá LTP usando una estimulación de ráfaga 0 (4 pulsos a 100 Hz, con las ráfagas repetidas a Hz e incluyendo cada tétanos 3 trenes de diez ráfagas separados por 15 s).

Acondicionam iento por miedo. Se evaluará el acondicionamiento por miedo contextual tal como se describió anteriormente [B14, B21]. Se colocarán los ratones en una cámara de acondicionamiento durante 2 min antes del comienzo de un tono (CS) (un sonido de 30 s, de 85 dB a 2800 Hz). En los últimos 2 s del CS, a los ratones se les administrará una descarga en el pie de 2 s, de 0,45 mA (US) a través de las barras del piso. Entonces, se dejará a los ratones en la cámara de acondicionamiento durante otros 30 s. El comportamiento de congelación, definido como la ausencia de movimiento excepto del necesario para respirar, se puntuará usando el software Freezeview. El aprendizaje por miedo contextual, un tipo de memoria para la que la función del hipocampo es indispensable, se evaluará 24 h después del entrenamiento midiendo la congelación durante 5 min en la cámara en la que se entrenarán los ratones. El aprendizaje por miedo señalado, un tipo de memoria que depende de la función de la amígdala, se evaluará 24 h después de las pruebas contextuales colocando los ratones en un contexto novedoso durante 2 min (prueba previa al CS), tras lo cual se expondrán al CS durante 3 min (prueba de CS), y se medirá la congelación.

La percepción sensorial de la descarga se determinará a través de la evaluación del umbral. En resumen, la corriente eléctrica (0,1 mA durante 1 s) se aumentará a intervalos de 30 s en 0,1 mA hasta 0,7 mA. Se cuantificará el umbral para el retroceso (primera respuesta visible a la descarga), el salto (primera respuesta motora extrema) y los chillidos (primera molestia vocalizada) para cada animal calculando al promedio de la intensidad de la descarga a la que cada animal manifiesta una respuesta de comportamiento de ese tipo a la descarga en el pie. No deben observarse diferencias en la evaluación del umbral sensorial entre diferentes grupos de ratones en experimentos en los que se somete a prueba el acondicionamiento por miedo si el procedimiento experimental no afecta al umbral sensorial de los animales.

Además, se comprobarán diferentes grupos de ratones con la prueba de campo abierto. El campo abierto será un espacio hecho de material acrílico blanco con dimensiones internas de 72 X 72 X 33 cm (un área que mide 36 X 36 cm en el centro del campo se definirá como la 'zona central'). Los ratones se colocarán en el centro de un campo abierto convencional y se monitorizará su comportamiento durante 1 h y se puntuará para la proporción de tiempo en el compartimento central frente a la periferia, y el número de entradas en el compartimento central. Los ratones se devolverán para un segundo bloque de una hora tras 24 h. No deben observarse diferencias en el comportamiento exploratorio tal como se demuestra mediante un porcentaje de tiempo similar pasado en el compartimento central y el número de entradas en el compartimento central si la manipulación no afecta a las capacidades exploratorias de los ratones.

Memoria de referencia. El primer día del protocolo será un día de entrenamiento. Se entrenará a los ratones para identificar la ubicación de la plataforma alternando entre una plataforma visible y una oculta en un brazo objetivo. Los 3 ensayos finales el día 1 y los 15 ensayos el día 2 usarán una plataforma de escape oculta para forzar a los ratones a usar señales espaciales para identificar la ubicación del brazo objetivo. Para evitar las limitaciones de aprendizaje impuestas por la práctica agotadora y para evitar la fatiga que puede resultar de ensayos consecutivos, se estableció un entrenamiento de práctica espaciada ejecutando los ratones en cohortes de 4 y alternando diferentes cohortes a través de los 15 ensayos de entrenamiento a lo largo de periodos de prueba de 3 horas cada día. El día 1, se colocará una plataforma visible en una ubicación objetivo. El ratón 1 de la cohorte 1 se colocará suavemente en la piscina cerca del perímetro de la pared del primer brazo de inicio (especificado en una hoja de puntuación) y orientado hacia al centro de la piscina. Se contó el número de entradas en el brazo incorrecto (entradas en brazos sin plataforma). Si el animal entra en el brazo incorrecto, se le retira suavemente hacia el brazo inicial. Cada ensayo durará hasta 1 minuto. El fallo en la selección de un brazo después de 15 segundos se contará como un error y el ratón se devolverá al brazo de inicio. Después de 1 minuto, si la plataforma no se ha localizado, se guiará al ratón suavemente a través del agua colocando una mano detrás de él para dirigirlo hacia la plataforma. El ratón descansará en la plataforma durante 15 segundos. Después de completar el ensayo, se retirará el ratón de la piscina, se secará suavemente con una toalla y volverá a colocarse en su jaula bajo una lámpara de calor. La ubicación de la plataforma objetivo será diferente para cada ratón. Después de que todos los ratones de la primera cohorte hayan tenido un ensayo para localizar una plataforma visible, se cambiará la plataforma de visible a oculta. Después de que cada ratón de la cohorte 1 complete seis ensayos alternos entre plataformas visibles y ocultas, se dejará descansar a los ratones bajo una fuente de calentamiento, y los ratones de la segunda cohorte se someterán a prueba de la misma manera. Después de completar los seis ensayos alternos, los ratones de la cohorte 2 regresarán a sus jaulas para descansar. A continuación, los ratones de la primera cohorte completarán los ensayos 7-12 nuevamente usando la ubicación alterna de la plataforma visible-oculta. Durante el tiempo de descanso para los ratones de la primera cohorte, los ratones de la segunda cohorte completarán los ensayos 7-12. En este punto, todos los ratones tendrán que realizar 3 pruebas de plataforma oculta. El día 2, se repitió el mismo procedimiento que en el día 1 para los 15 ensayos usando solo la plataforma oculta. Para el análisis de datos, se introducirá el número de errores en software estadístico (Statview de SAS, Chicago, IL), y se calcularán los promedios para cada ratón usando bloques de 3 ensayos. Tal como se describió [B58], se espera que los ratones presenten 1 o menos errores a lo largo de tres ensayos cerca del final del segundo día. Los ratones que no aprenden cometerán 3-5 errores a lo largo de toda la sesión de entrenamiento, sin mejora a lo largo de los ensayos.

Al final de la tarea, se usará un entrenamiento con plataforma visible para someter a prueba las habilidades visuales, motoras y motivacionales de los ratones. Tanto el tiempo hasta alcanzar la plataforma como la velocidad de natación se registrarán y analizarán con un sistema de seguimiento por vídeo (HVS 2020, HVS Image, RU).

Técnica de infusión. Tras la anestesia con Avertin 20 mg/kg, se les implantará a los ratones una cánula de guía de calibre 26 en la parte dorsal de los hipocampos (coordenadas: P=2,46 mm, L=1,50 mm hasta una profundidad de 1,30 mm) [B62]. Las cánulas se fijarán a la calavera con un cemento dental acrílico (Paladur). Tras 6-8 días, se les inyectará bilateralmente AP42200 pM o vehículo en un volumen final de 1 |il a lo largo de 1 min a través de las cánulas de infusión que se conectarán a una microjeringa mediante un tubo de polietileno. Para el laberinto de agua de Morris, se les inyectará a los ratones 20 min antes de realizar cada sesión y el ensayo con sonda, mientras que para acondicionamiento por miedo los ratones recibirán una única inyección 20 min antes del entrenamiento. Los ratones se manipularán una vez al día durante 3 días antes de los experimentos de comportamiento. Durante la infusión, los animales se manipularán suavemente para minimizar el estrés. Después de la infusión, la aguja se dejará en su sitio durante otro minuto para permitir la difusión. Tras las pruebas de comportamiento, se infundirá una disolución de azul de metileno al 4% en las cánulas. Se sacrificarán los animales y se extraerán sus cerebros, se congelarán y luego se cortarán a -20°C con un criostato para la localización histológica de las cánulas de infusión.

Preparación de AB. Se preparará AP42 oligomérico a partir de péptidos sintéticos disponibles comercialmente (American Peptides Co), tal como se describe [B63, B64]. En resumen, el péptido liofilizado se resuspenderá en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol frío (HFIP, Sigma) y se tomarán alícuotas en viales de polipropileno. Después de 24 h, se permitirá que la disolución de HFIP se evapore en una campana extractora hasta que se forme una película delgada de péptido en el fondo de los viales. Las películas de péptido se secarán a vacío suave y se almacenarán en viales sellados a -20°C. Antes de su uso, se añadirá DMSo anhidro (Sigma) para obtener una disolución de DMSO/Ap monomérico puro que se sonicará durante 10 min [B63]. Se obtendrá AP42 oligomérico incubando una alícuota de disolución de DMSO/Ap monomérico en PBS estéril a 4°C durante la noche. La calidad de estas preparaciones de Ap se controlará rutinariamente usando análisis de inmunotransferencia de tipo Western en el que se resolverán muestras de Ap mediante PAGE de Tris-Tricina en condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, y luego se transferirán sobre una membrana de nitrocelulosa. La inmunotransferencia de tipo Western posterior se llevará a cabo después de la incubación de la membrana con el anticuerpo monoclonal anti-Ap humano 6E10 (Signet Lab). La inmunotinción se revelará mediante la quimioluminiscencia de la peroxidasa del rábano.

Ensayo de acetilación de histonas. Se realizará inmunotransferencia de tipo Western a partir de hipocampos y cerebelos congelados instantáneamente en nitrógeno líquido. Se homogeneizará el tejido en tampón de lisis (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, SDS al 3%, DTT 1 mM) y se incubará a 4°C durante 10 min, luego se sonicará antes de la centrifugación at 2.000 rpm durante 5 min. Extractos de células completas se someterán a electroforesis sobre gel de PAGE en gradiente del 10-20% (Invitrogen) y luego se someterán a inmunotransferencia. Se usarán anticuerpos a una concentración 1:1.000 para la inmunotransferencia. Todos los anticuerpos anti-histona se adquirirán de Millipore. El anticuerpo frente a p-III-tubulina se adquirirá de Promega. Los datos de la inmunotransferencia se cuantificarán midiendo la intensidad de las bandas usando software de obtención de imágenes (NIH ImageJ). Para análisis de inmunotransferencias cuantitativas, se cargarán cantidades iguales de proteínas en cada carril. Para confirmar una carga igual, volverán a estudiarse con sonda las transferencias con los correspondientes pan-anticuerpos o anticuerpos para proteínas de mantenimiento tales como p-III-tubulina. Para la cuantificación, se usará siempre una señal en el intervalo lineal.

Espectrometría de masas. La caracterización de las modificaciones en histonas inmunoprecipitadas se llevará a cabo mediante espectrometría de masas. Las histonas inmunoprecipitadas se purificarán mediante HPLC de fase inversa en el PSR o mediante SDS-PAGE, luego se someterán a digestión enzimática. Los péptidos resultantes se analizarán mediante CL-EM/EM en un espectrómetro de masas Waters Qtof equipado con una Cl Dionex nanflow. El protocolo de digestión convencional que usa tripsina no es viable debido al número de residuos de Lys en la porción de histonas N-terminal, que da como resultado péptidos demasiado pequeños como para analizarse. Puesto que esta es también la región más rica en modificaciones, debe usarse un protocolo de digestión que dé como resultado péptidos de tamaño óptimo (800-2000 Da) para el análisis mediante CL-EM/EM. Se derivatizarán los residuos de Lys con anhídrido propiónico limitando así la digestión tríptica a Arg solo. Ya se ha llevado a cabo satisfactoriamente este procedimiento de derivatización y digestión en una preparación comercial de histona H3.1 recombinante y se han obtenido péptidos trípticos de la región N-terminal que se analizan fácilmente mediante espectrometría de masas. Para la cuantificación relativa de las modificaciones de histonas, se usará un procedimiento de marcaje isotópico estable [B65] para modificar grupos ácido carboxílico en los péptidos trípticos seguido por análisis de espectrometría de masas.

Se medirán los niveles de CBP con inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos frente a CBP específicos. La fracción nuclear estará contenida en el sedimento obtenido a partir del tejido homogeneizado, centrifugado a 7.700xg durante 1min.

La actividad de HAT de CBP se medirá mediante inmunoprecipitación a partir de la lisis de extractos de hipocampo usando anticuerpos frente a CBP. Tras el aislamiento, la actividad de HAT se evaluará usando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas indirecto para detectar residuos acetilo según las instrucciones del fabricante (Upstate).

La actividad de HDAC se medirá usando un kit fluorimétrico de Biovision (CA), según las instrucciones del fabricante.

Análisis estadísticos. Se realizarán los experimentos de manera ciega. Los resultados se expresarán como error estándar de la media (EEM). El nivel de significación se fijará para p<0,05. Los resultados se analizarán mediante la prueba de la t de Student (comparaciones por parejas) o ANOVA para medidas repetidas (comparaciones múltiples) con la condición de tratamiento como efecto principal. Se usarán las comparaciones planeadas para el análisis a posteriori. Para el comportamiento, se diseñarán experimentos de un modo equilibrado, y se entrenará a los ratones y se someterán a prueba a cada una de las diferentes condiciones en tres o cuatro experimentos separados. Los experimentos se analizarán con ANOVA con el tratamiento como efecto principal.

Bibliografía

B1. Lodish H., B.A., Zipursky LS., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., Molecular Cell Biology. 4 ed. 2000, Nueva York: W. H. Freeman and Company.

B2. Kandel, E.R., The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Biosci Rep, 2001.

21(5): p. 565-611.

B3. Dash, P.K., B. Hochner, y E.R. Kandel, Injection of the cAMP-responsive element into the nucleus of Aplysia sensory neurons blocks long-term facilitation. Nature, 1990. 345(6277): p. 718-21.

B4. Montarolo, P.G., P. Goelet, V.F. Castellucci, J. Morgan, E.R. Kandel, y S. Schacher, A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science, 1986. 234(4781): p. 1249-54.

B5. Bailey, C.H. y M. Chen, Morphological basis of long-term habituation and sensitization in Aplysia. Science, 1983.

220(4592): p. 91-3.

B6. Levenson, J.M. y J.D. Sweatt, Epigenetic mechanisms in memory formation. Nat Rev Neurosci, 2005. 6(2): p. 108 18.

B7. Peterson, C.L. y M.A. Laniel, Histones and histone modifications. Curr Biol, 2004. 14(14): p. R546-51.

B8. Korzus, E., M.G. Rosenfeld, y M. Mayford, CBP histone acetyltransferase activity is a critical component of memory consolidation. Neuron, 2004. 42(6): p. 961-72.

B9. Bourtchuladze, R., B. Frenguelli, J. Blendy, D. Cioffi, G. Schutz, y A.J. Silva, Deficient long-term memory in mice with a targeted mutation of the cAMP-responsive element-binding protein. Cell, 1994. 79(1): p. 59-68.

B10. Yin, J.C., J.S. Wallach, M. Del Vecchio, E.L. Wilder, H. Zhou, W.G. Quinn, y T. Tully, Induction of a dominant negative CREB transgene specifically blocks long-term memory in Drosophila. Cell, 1994. 79(1): p. 49-58.

B11. Vitolo, O.V., A. Sant'Angelo, V. Costanzo, F. Battaglia, O. Arancio, y M. Shelanski, Amyloid beta - peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(20): p. 13217-21.

B12. Puzzo, D., O. Vitolo, F. Trinchese, J.P. Jacob, A. Palmeri, y O. Arancio, Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity. J Neurosci, 2005. 25(29): p. 6887-97.

B13. Puzzo, D., A. Staniszewski, S. Deng, S. Liu, A. Palmeri, D.W. Landry, y O. Arancio. Sildenafil rescues synaptic and cognitive impairment in a mouse model of Alzheimer's disease. in Soc Neurosci. Abstr. 2006. Atlanta.

B14. Gong, B., O.V. Vitolo, F. Trinchese, S. Liu, M. Shelanski, y O. Arancio, Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model following rolipram treatment. J. Clin. Invest., 2004. 114: p. 1624 1634.

B15. Saura, C.A., S.Y. Choi, V. Beglopoulos, S. Malkani, D. Zhang, B.S. Shankaranarayana Rao, S. Chattarji, R.J.

Kelleher, 3rd, E.R. Kandel, K. Duff, A. Kirkwood, y J. Shen, Loss of presenilin function causes impairments of memory and synaptic plasticity followed by age-dependent neurodegeneration. Neuron, 2004. 42(1): p. 23-36.

B16. Sherrington, R., E.I. Rogaev, Y. Liang, E.A. Rogaeva, G. Levesque, M. Ikeda, H. Chi, C. Lin, G. Li, K. Holman, y et al., Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 1995.

375(6534): p. 754-60.

B17. Levy-Lahad, E., E.M. Wijsman, E. Nemens, L. Anderson, K.A. Goddard, J.L. Weber, T.D. Bird, y G.D. Schellenberg, A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science, 1995. 269(5226): p. 970-3.

B18. Francis, Y.I., A. Stephanou, y D.S. Latchman, CREB-binding protein activation by presenilin 1 but not by its M146L mutant. Neuroreport, 2006. 17(9): p. 917-21.

B19. Fischer, A., F. et al., Recovery of learning and memory is associated with chromatin remodelling. Nature, 2007.

447(7141): p. 178-82.

B20. Holcomb, L., et al., Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med, 1998. 4(1): p. 97-100.

B21. Gong, B., et al., Ubiquitin Hydrolase Uch-L1 Rescues beta-Amyloid-Induced Decreases in Synaptic Function and Contextual Memory. Cell, 2006. 126(4): p. 775-88.

B22. Francis, I.Y., M. Fa', H. Ashraf, H. Zhang, A. Staniszewski, D. Latchman, y O. Arancio, Dysregulation of histone acetylation in the APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 2009. En prensa.

B23. Kamal, A., A. Almenar-Queralt, J.F. LeBlanc, E.A. Roberts, y L.S. Goldstein, Kinesin-mediated axonal transport of a membrane compartment containing beta-secretase and presenilin-1 requires APP. Nature, 2001. 414(6864): p.

643-8.

B24. Cao, X. y T.C. Sudhof, A transcriptionally [correction of transcriptively] active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60. Science, 2001. 293(5527): p. 115-20.

B25. Alarcon, J.M., G. Malleret, K. Touzani, S. Vronskaya, S. Ishii, E.R. Kandel, y A. Barco, Chromatin acetylation, memory, and LTP are impaired in CBP+/- mice: a model for the cognitive deficit in Rubinstein-Taybi syndrome and its amelioration. Neuron, 2004. 42(6): p. 947-59.

B26. Levenson, J.M., et al., Regulation of histone acetylation during memory formation in the hippocampus. J Biol Chem, 2004. 279(39): p. 40545-59.

B27. Cullen, W.K., Y.H. Suh, R. Anwyl, y M.J. Rowan, Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport, 1997. 8(15): p. 3213-7.

B28. Itoh, A., T. Akaike, M. Sokabe, A. Nitta, R. Iida, A. Olariu, K. Yamada, y T. Nabeshima, Impairments of longterm potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol, 1999. 382(3): p. 167-75.

B29. Walsh, D.M., I. Klyubin, J.V. Fadeeva, W.K. Cullen, R. Anwyl, M.S. Wolfe, M.J. Rowan, y D.J. Selkoe, Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 2002.

416(6880): p. 535-9.

B30. Pittenger, C. y E.R. Kandel, In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2003. 358(1432): p. 757-63.

B31. Lander, et al., Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001. 409(6822): p. 860-921. B32. Kornberg, R.D. y Y. Lorch, Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell, 1999. 98(3): p. 285-94.

B33. Biel, M., V. Wascholowski, y A. Giannis, Epigenetics--an epicenter of gene regulation: histones and histonemodifying enzymes. Angew Chem Int Ed Engl, 2005. 44(21): p. 3186-216.

B34. de la Cruz, X., S. Lois, S. Sanchez-Molina, y M.A. Martinez-Balbas, Do protein motifs read the histone code? Bioessays, 2005. 27(2): p. 164-75.

B35. Strahl, B.D. y C.D. Allis, The language of covalent histone modifications. Nature, 2000. 403(6765): p. 41-5. B36. Ng, H.H. y A. Bird, Histone deacetylases: silencers for hire. Trends Biochem Sci, 2000. 25(3): p. 121-6.

B37. Kimura, A., K. Matsubara, y M. Horikoshi, A decade of histone acetylation: marking eukaryotic chromosomes with specific codes. J Biochem, 2005. 138(6): p. 647-62.

B38. de Ruijter, A.J., A.H. van Gennip, H.N. Caron, S. Kemp, y A.B. van Kuilenburg, Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDa C family. Biochem J, 2003. 370(Pt 3): p. 737-49.

B39. Yang, X.J. y E. Seto, HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention. Oncogene, 2007. 26(37): p. 5310-8.

B40. Gregoretti, I.V., Y.M. Lee, y H.V. Goodson, Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol, 2004. 338(1): p. 17-31.

B41. Langley, B., etal., Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005. 4(1): p.

41-50.

B42. Hockly, E., V.M. Richon, B. Woodman, D.L. Smith, X. Zhou, E. Rosa, K. Sathasivam, S. Ghazi-Noori, A. Mahal, P.A. Lowden, J.S. Steffan, J.L. Marsh, L.M. Thompson, C.M. Lewis, P.A. Marks, y G.P. Bates, Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(4): p. 2041-6.

B43. Guan, J.S., S.J. Haggarty, E. Giacometti, J.H. Dannenberg, N. Joseph, J. Gao, T.J. Nieland, Y. Zhou, X. Wang, R. Mazitschek, J.E. Bradner, R.A. DePinho, R. Jaenisch, y L.H. Tsai, HDAC2 negatively regulates memory formation and synaptic plasticity. Nature, 2009. 459(7243): p. 55-60.

B44. Dineley, K.T., M. Westerman, D. Bui, K. Bell, K.H. Ashe, y J.D. Sweatt, Beta-amyloid activates the mitogenactivated protein kinase cascade via hippocampal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: In vitro and in vivo mechanisms related to Alzheimer's disease. J Neurosci, 2001. 21(12): p. 4125-33.

B45. Dineley, K.T., X. Xia, D. Bui, J.D. Sweatt, y H. Zheng, Accelerated plaque accumulation, associative learning deficits, and up-regulation of alpha 7 nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressing mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol Chem, 2002. 277(25): p. 22768-80.

B46. Gong, B., O.V. Vitolo, F. Trinchese, S. Liu, M. Shelanski, y O. Arancio, Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model after rolipram treatment. J Clin Invest, 2004. 114(11): p. 1624-34. B47. Francis, Y.I., J.K. Diss, M. Kariti, A. Stephanou, y D.S. Latchman, p300 activation by Presenilin 1 but not by its M146L mutant. Neurosci Lett, 2007. 413(2): p. 137-40.

B48. Rouaux, C., N. Jokic, C. Mbebi, S. Boutillier, J.P. Loeffler, y A.L. Boutillier, Critical loss of CBP/p300 histone acetylase activity by caspase-6 during neurodegeneration. Embo J, 2003. 22(24): p. 6537-49.

B49. Green, K.N., et al., Nicotinamide restores cognition in Alzheimer's disease transgenic mice via a mechanism involving sirtuin inhibition and selective reduction of ThR231-phosphotau. J Neurosci, 2008. 28(45): p. 11500-10. B50. Trinchese, F., et al., Progressive age-related development of Alzheimer-like pathology in APP/PS1 mice. Ann Neurol, 2004. 55(6): p. 801-14.

B51. Sperling, R.A., et al., fMRI studies of associative encoding in young and elderly controls and mild Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2003. 74(1): p. 44-50.

B52. Phillips, R.G. y J.E. LeDoux, Differential contribution of amygdala and hippocampus to cued and contextual fear conditioning. Behav Neurosci, 1992. 106(2): p. 274-85.

B53. Vecsey, C.G., et al., Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBPdependent transcriptional activation. J Neurosci, 2007. 27(23): p. 6128-40.

B54. Malm, T., et al., beta-Amyloid infusion results in delayed and age-dependent learning deficits without role of inflammation or beta-amyloid deposits. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(23): p. 8852-7.

B55. Cleary, J.P., et al., Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat Neurosci, 2005. 8(1): p. 79-84.

B56. Bordoli, L., et al., Plant orthologs of p300/CBP: conservation of a core domain in metazoan p300/CBP acetyltransferase- related proteins. Nucleic Acids Res, 2001. 29(3): p. 589-97.

B57. Masliah, E., Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histo1Histopathol, 1995. 10(2): p. 509 19.

B58. Alamed, J., D.M. Wilcock, D.M. Diamond, M.N. Gordon, and D. Morgan, Two-day radial-arm water maze learning and memory task; robust resolution of amyloid-related memory deficits in transgenic mice. Nat Protoc, 2006. 1(4): p.

1671-9.

B59. Eyupoglu, I.Y., et al., Experimental therapy of malignant gliomas using the inhibitor of histone deacetylase MS-275. Mol Cancer Ther, 2006. 5(5): p. 1248-55.

B60. Kim, D., et al., SIRT1 deacetylase protects against neurodegeneration in models for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. EMb O J, 2007. 26(13): p. 3169-79.

B61. Mantelingu, K., et al., Activation ofp300 histone acetyltransferase by small molecules altering enzyme structure: probed by surface-enhanced Raman spectroscopy. J Phys Chem B, 2007. 111(17): p. 4527-34.

B62. Paxinos, G., Mouse brain in stereotaxic coordinates. 2a ed. 1998, Nueva York: Academic Press.

B63. Stine, W.B., et al., In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem, 2003. 278(13): p. 11612-22.

B64. Puzzo, D., et al., Picomolar Amyloid-{beta} Positively Modulates Synaptic Plasticity and Memory in Hippocampus. J. Neurosci., 2008. 28(53): p. 14537-14545.

B65. Garcia, B.A., et al., Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc, 2007. 2(4): p. 933-8.

Ejemplo 7: Ensayos de viabilidad celular para ACHN, U251, NCI-ADR-RES, A549, Hs578T, CCRF-CEM Parámetros de los ensayos

Lectura: Proliferación celular mediante Cell-TiterGlo y Cyquant,

Número de compuestos: 1 (YF2)

Concentraciones: 10 (0,03, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 15, 40 y 80 |iM)

Compuesto de referencia: Vinblastina (VBL)

Concentraciones: 10

(0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 y 10 |iM)

Tiempo de tratamiento con el fármaco: 72 horas

Réplicas: 3

Disolvente: Medio acuoso

Materiales y métodos

Células y medio de cultivo: Todas las líneas celulares se adquirieron de la ATCC y se expandieron y archivaron bajo nitrógeno líquido en CDAS como alícuotas de bajo número de pases. Se mantuvieron las células y se realizaron pases en medio de cultivo óptimo y recomendado (ACHN: EMEM, L-Gln 2 mM, FBS al 10%; A549: F12 de Ham, FBS al 10%; U251: RPMI 1640, L-Gln 2 mM, FBS al 10%; Hs578T: DMEM, L-Gln 4 mM, 1 U/ml de insulina bovina, FBS al 10%; CCRF-CEM: ATCC RPMI, L-Gln 2 mM, FBS al 10%; NCI-ADR-RES: RPMI 1640, L-Gln 2 mM, FBS al 10%). Todos los experimentos se llevaron a cabo con células que se habían sometido a menos de 20 pases. Se determinaron las densidades de siembra óptimas para todas las líneas celulares. Todas las células se sembraron en placa a 1500 células por pocillo excepto c Cr F-CEm que se sembró en placa a 6000 células por pocillo.

Fármacos: Se suministró YF2 como una disolución madre 80 mM en el 100% de DMSO. Se adquirió vinblastina de Sigma (número de catálogo V-1377) y se resuspendió a 1 X 10‘2 M en el 100% de DMSO. Todas las diluciones para ambos fármacos se llevaron a cabo en medio de cultivo que contenía el 0,2% de DMSO de manera que la concentración de disolvente final nunca excedió el 0,1%.

Tratamiento con el fármaco: Se sometió a prueba YF2 a concentraciones (0,03, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 15, 40 y 80 uM) en pocillos por triplicado. Se usó vinblastina como control de referencia y se sometió a prueba a concentraciones en una serie semilogarítmica (0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,3 y 10 uM). Se resuspendieron las células en medio a la concentración apropiada y se añadieron 180 ul (1500 o 6000 células) a cada pocillo tras lo cual se añadieron 20 |il del fármaco a 10x de la concentración final para lograr la concentración de fármaco deseada en cada pocillo. Las placas de tratamiento con el fármaco se incubaron a 37°C durante 72 horas, tras lo cual se sometió a ensayo la viabilidad celular mediante el método de Cell Titer Glo o Cyquant tal como se describe a continuación.

Ensayo de Cell Titer Glo: Tras el periodo de tratamiento con el fármaco de 72 horas, se centrifugaron las placas de ensayo y se aspiraron 100 ul del medio y se reemplazaron por 100 J.lL de reactivo Cell Titer Glo (Promega) según el protocolo recomendado por el fabricante. Se mezcló el reactivo con las células y se midió la luminiscencia usando un instrumento Perkin Elmer Envision. La señal de luminiscencia promedio obtenida a partir de pocillos que contienen células sin tratar que se habían incubado durante toda la duración del periodo de ensayo se usó para fijar el valor de viabilidad del 100%. Se calculó la proliferación en porcentaje como (señal de prueba)/(señal de fondo de la placa promedio) x 100. Se representó gráficamente el % de viabilidad frente a la concentración de fármaco para calcular una CI50 para cada fármaco.

Ensayo de Cyquant: Tras el periodo de tratamiento con el fármaco de 72 horas, se centrifugaron las placas de ensayo, se desechó el medio y se congelaron durante la noche. Se sometieron a ensayo las placas usando el reactivo Cyquant™ (Invitrogen) según el protocolo recomendado por el fabricante. La señal de fluorescencia promedio obtenida a partir de pocillos que contienen células sin tratar que se habían incubado durante toda la duración del periodo de ensayo se usó para fijar el valor de proliferación del 100%. La proliferación en porcentaje se calculó como (señal de prueba)/(señal de fondo de la placa promedio) x 100. Se representó gráficamente el % de proliferación frente a la concentración de fármaco para calcular una CI50 para cada fármaco.

Ejemplo 8: YF2 aumenta la acetilación de histonas mediante la activación de HAT, no mediante la inhibición de HDAC La inhibición de HDAC provoca un aumento en la acetilación de histonas. Los inventores examinaron si la acetilación de histonas se producía por medio de la inhibición de HDAC.

El resumen de los resultados se presenta en la tabla 1. Los valores de CI50 medios de los compuestos se resumen en la tabla 1.

Tabla 1. Efectos inhibidores de los compuestos sobre las actividades de HDAC

Los experimentos se realizaron de manera ciega, donde el compuesto YF2 de la invención corresponde a OA2. Los estudios muestran que YF2 no produce inhibición de las propiedades de HDAC. YF2 no inhibe HDAc .

Materiales y métodos

Materiales:

Tampón de ensayo de HDAC (número de catálogo de BPS 50031)

Revelador de ensayo de HDAC (número de catálogo de BPS 50030)

Sustrato 1 de HDAC (número de BPS 50032)

Sustrato 3 de HDAC (número de BPS 50037)

Sustrato 1 de HDAC de clase 2a (número de BPS 50040)

SAHA (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, número de catálogo 10009929)

Tabla 2. Compuestos usados en los estudios

*El compuesto OA2 está turbio a 2mM en DMSO al 10% (el punto de prueba más alto).

**SAHA, y HDACi, es un control positivo para HDAC.

Condiciones experimentales

Tabla 3. Enzimas y sustratos

Condiciones de ensayo. Se preparó una serie de dilución de los compuestos de prueba con DMSO al 10% en tampón de ensayo y se añadieron 5 |il de la dilución a una reacción de 50 |il de modo que la concentración final de DMSO es del 1% en todas las reacciones. Todas las reacciones enzimáticas se realizaron por duplicado a 37°C durante 30 minutos excepto la de HDAC11 a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción de 50 |il contiene tampón de ensayo de HDAC, 5 |ig de BSA, un sustrato de HDAC, una enzima HDAC y un compuesto de prueba. Tras las reacciones enzimáticas, se añadieron 50 |il de revelador de HDAC a cada pocillo y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos adicionales. Se midió la intensidad de fluorescencia a una excitación de 360 nm y una emisión de 460 nm usando un lector de microplacas Tecan Infinite M1000.

Análisis de datos. Se realizaron los ensayos de actividad de HDAC por duplicado a cada concentración. Los datos de intensidad de fluorescencia se analizaron usando el software informático Graphpad Prism. En ausencia del compuesto, la intensidad fluorescente (Ft) en cada conjunto de datos se definió como el 100% de actividad. En ausencia de HDAC, la intensidad fluorescente (Fb) en cada conjunto de datos se definió como el 0% de actividad. El compuesto OA2 tiene una fluorescencia en la condición de ensayo; por tanto la intensidad fluorescente a una concentración deOA2 diferente se definió como fondo (Fb). El porcentaje de actividad en presencia de cada compuesto se calculó según la siguiente ecuación: % de actividad = (F-Fb)/(Ft-Fb), donde F= la intensidad fluorescente en presencia del compuesto.

Los valores de % de actividad frente a una serie de concentraciones de compuesto se representaron entonces gráficamente usando análisis de regresión no lineal de la curva de respuesta a la dosis sigmoidea generada con la ecuación Y=B+(T-B)/1 10((L°gCE50'X)Xpendiente de Hill), donde Y=porcentaje de actividad, B=porcentaje de actividad mínima, T=porcentaje de actividad máxima, X= logaritmo del compuesto y pendiente de Hill = factor de pendiente o coeficiente de Hill. El valor de CI50 se determinó mediante la concentración que provoca la mitad del porcentaje de actividad máxima.

Resultados del efecto de OA2 (compuesto YF2) sobre la inhibición de HDAC

Tabla 4. Ensayo de HDAC1 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC1

La figura 52 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 4.

Tabla 5. Ensayo de HDAC3/NCOR2 - Datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC3/NCOR2

La figura 53 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 5.

Tabla 6. Ensayo de HDAC5FL - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC5FL

La figura 54 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 6.

Tabla 7. Ensayo de HDAC7 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC7

La figura 55 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 7.

Tabla 8. Ensayo de HDAC8 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC8

La figura 56 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 8.

Tabla 9. Ensayo de HDAC10 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC10

La figura 57 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 9.

Tabla 10. Ensayo de HDAC 11 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC 11

La figura 58 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 10.

Tabla 11. Ensayo de sirtuina 1 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de sirtuina 1

La figura 59 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 11.

Tabla 12. Ensayo de sirtuina 2 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de sirtuina 2

La figura 60 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 12.

Tabla 13. Ensayo de HDAC6 - datos para el efecto de OA2 sobre la actividad de HDAC6

La figura 74 corresponde a los resultados mostrados en la tabla 13.

Resultados del efecto de SAHA sobre la inhibición de HDAC

SAHA es un inhibidor de HDAC (HDACi). Sirve como control positivo para HDAC. Las figuras 61-63 muestran el efecto inhibidor de SAHA sobre las HDAC HDAC1, HDAC3/NCOR2 y HDAC6. SAHA también inhibía HDAC5FL, HDAC7, HDAC8, HDAC10, sirtuina 1 y sirtuina 2 (véase la tabla 1).

Ejemplo 9: Diseño de activadores de HAT selectivos

Los cambios amnésicos tempranos en la enfermedad de Alzheimer (AD) se cree que están vinculados a la disfunción sináptica. En este sentido, p-amiloide (Ap), un péptido que se produce en cantidades elevadas en la enfermedad, se ha encontrado que inhibe la memoria[12] y su modelo electrofisiológico, la potenciación a largo plazo (LTP)[3'8]. Puesto que la memoria se modula mediante la epigenética a través de la regulación de la expresión génica, la desregulación de uno de los mecanismos epigenéticos tales como la acetilación de histonas (H) podría conducir a alteración de la memoria. La reducción de la acetilación de histonas provoca que la estructura de la cromatina se cierre, de modo que la información contenida dentro del ADN podría ser menos propensa a factores de transcripción y formación de memoria[9].

La principal estrategia que se usa actualmente para regular por incremento la acetilación de histonas implica inhibidores de HDAC. Sin embargo, el efecto pleiotrópico de la inhibición de HDAC no específica puede dificultar su potencial terapéutico [10-13]. Se ha demostrado que los niveles en el hipocampo de dos HAT, CBP y PCAF, se reducen tras la elevación de Ap. Los inventores se han centrado por tanto en otra diana que también regula por incremento la acetilación de histonas, las HAT. Para este fin, se ha sintetizado un activador de HAT, YF2. Se propone una línea de investigación que implica el diseño de activadores de HAT selectivos que seleccionan como diana específicamente CBP y PCAF aguas abajo de Ap. Los objetivos de la propuesta son:

1) diseñar y sintetizar nuevos activadores de HAT que están optimizados para AD;

2) identificar compuestos con alta afinidad y buena selectividad para activadores de HAT selectivos que seleccionan como diana específicamente CBP y PCAF;

3) determinar si los nuevos activadores de HAT tienen un buen perfil farmacocinético (PK) y son seguros;

4) seleccionar activadores de HAT que rescatan la disfunción sináptica en ratones APP/PS1;

5) examinar adicionalmente activadores de HAT para determinar si son beneficiosos frente a anomalías cognitivas en ratones APP/PS 1.

ANTECEDENTES Y SIGNIFICACIÓN: El estado de acetilación postraduccional de la cromatina está regido por las actividades de competición de dos clases de enzimas, HAT y HDAC. Se ha mostrado que los inhibidores de HDAC potencian la LTP y memoria por miedo contextual, una forma de memoria asociativa en la que los animales deben asociar un estímulo neutro con uno aversivo[P17]. Además, los déficits de memoria y LTP de ratones CBP+/_ se revirtieron mediante la inhibición de HDAC[P15]. El potencial de la inhibición de HDAC para contrarrestar trastornos neurodegenerativos se ha explorado ampliamente[14]. Por ejemplo, en un conjunto de experimentos, Tsai et al. han notificado que los inhibidores de HDAC inducen el brote de dendritas, un número aumentado de sinapsis y reestablecen el aprendizaje y el acceso a recuerdos a largo plazo en el modelo de ratón Tg CK-p25 de neurodegeneración[1516]. Además, en estudios recientes se ha mostrado que el inhibidor de HDAC TSA mejora LTP y acondicionamiento por miedo contextual (FC) en el modelo de ratón A p P(K670M:N671L)/PS1(M146L, línea 6.2) (APP/PS1) Tg doble de deposición de amiloide[17]. Bolden et al., (2006, Nature Reviews Drug Discovery, 5:769-84) describen la familia de histona desacetilasas, cuya referencia se incorpora como referencia en su totalidad. Las HAT, sin embargo, se han investigado en un menor grado.

Las HAT pueden dividirse en dos grupos principales, las HAT nucleares y HAT citoplasmáticas[18]. Las HAT nucleares de tipo A pueden agruparse en al menos 4 familias diferentes basándose en la conservación de la secuencia dentro del dominio de HAT: Gcn5 y factor asociado a p300/CBP (PCAF), MYST (MOZ, Ybf2/ Sas3, Sas2 y Tip60), p300 y CBP (nombrado para los dos parálogos humanos p300 y CBP) y Rtt109. Mientras que las familias de Gcn5/PCAF y MYST tienen homólogos desde la levadura hasta el hombre, p300/CBP es específica de metazoos, y Rtt109 es específica de hongos. Las HAT citoplasmáticas de tipo B, tales como HAT1, están implicadas en la deposición de histonas[P22]. Marmorstein y Roth (2001, Curr Opin in Genet and Develop., 11:155-161) enumeran en la tabla 1 las familias de HAT y sus funciones relacionadas con la transcripción, referencia que se incorpora como referencia en su totalidad.

Aunque se han descrito otras familias de HAT nucleares, tales como los coactivadores de receptores de esteroides, TAF250, ATF-2 y CLOCK, sus actividades de HAT no se han investigado tan extensamente como las clases de HAT principales[18]. Estas 4 familias muestran una alta similitud de secuencia dentro de las familias pero similitud de secuencia de escasa a ausente entre las familias. Además, el tamaño del dominio de HAT de las diferentes familias es diferente[P22]. De manera interesante, las HAT están altamente conservadas en mamíferos[P22]. De todas estas HAT, se mostró que tres estaban implicadas en la memoria: CBP, p300[19, 20] y PCAF[21]. De manera interesante, tanto los niveles de CBP como los de PCAF se reducen mediante la elevación de Ap.

Los activadores de HAT son un enfoque viable para potenciar la acetilación de histonas. Se han identificado dos armazones para activadores de HAT. El primero incluye CTPB y su derivado CTB[22, 23]. El segundo incluye sólo un compuesto, nemorosona[24]. Se encontró que CTPB/CTB son insolubles e impermeables por la membrana[22, 23]. Además, CTPB tiene características desfavorables para usarse en enfermedades del SNC (PM igual a 553,29, clogP igual a 12,70) y el clogP de CTB es de 5,13. La nemorosona tiene un PM de 502 y un clogP de 8,42. En resumen, existen amplias evidencias que apoyan un papel terapéutico prometedor para los activadores de HAT en el tratamiento de trastornos del SNC incluyendo AD. Se aprovechará esta posibilidad desarrollando nuevas entidades químicas que seleccionan como diana específicamente CBP y PCAF.

Diseño de la investigación y métodos:

1) Diseño y síntesis de nuevos activadores de HAT que están optim izados para AD. Se ha diseñado un nuevo compuesto basándose en estudios de SAR del armazón de CTPB/CTB, denominado YF2. YF2 (PM de 430,13, clogP de 5,15, clogBB de 0,17) tiene una solubilidad aumentada, permeabilidad por la membrana y permeabilidad por la barrera hematoencefálica, es seguro en pruebas de toxicidad aguda. YF2 rescató la reducción en los niveles en el hipocampo de la acetilación de H3 tras la elevación de Ap, potenció la actividad enzimática de PCAF, CBP y Gcn5 así como p300, tenía excelente selectividad por PCAF, CBP y Gcn5 con respecto a HDAC y era capaz de rescatar los déficits en la memoria por miedo y de referencia inducidos por la exposición de Ap. Se está refinando su capacidad farmacológica usando un enfoque de química médica (med-chem) que se centra en la síntesis de compuestos principales de tipo fármaco con buena PK y perfil de ADMET. Se diseñarán y se sintetizarán activadores de HAT que llevan diferentes restos en diferentes posiciones de uno de los dos anillos aromáticos de YF2. En particular, se sustituirá un grupo dimetilamino que es probable que se alquile por microsomas y se protegerá un grupo aromático de reacciones oxidativas. Adicionalmente, se explorará el sitio de unión de HAT i) evaluando la importancia del grupo amida entre los dos anillos aromáticos, ii) restringiendo la estructura molecular, iii) modificando la distancia entre dos anillos aromáticos que forman actualmente YF2, iv) reemplazando uno de los dos anillos aromáticos por un anillo 76 heterocíclico y v) aumentando el impedimento de los sustituyentes de uno de los dos anillos aromáticos. Se encontrarán activadores de HAT con a) potencia y especificidad de HAT, b) gran penetración en el SNC y c) seguridad.

2) Identificación de compuestos con alta afinidad y buena selectividad para activadores de HAT selectivos que seleccionan como diana específicamente CBP y PCAF. Tras la evaluación de la potencia de activadores de HAT (CE50), se comprobará la selectividad con respecto a CBP y PCAF. Para activadores de HAT que se encuentra que muestran buena potencia (< 100 nM), selectividad (al menos 50 veces frente a las familias de p300, Gcn5, MYST y HDAC) y solubilidad, se usará un ensayo funcional para determinar si aumentan la acetilación de H3 y H4 en el hipocampo en ratones adultos.

3) Determinación de si los nuevos activadores de HAT tienen buen perfil farmacocinético (PK) y son seguros. Los activadores de HAT seleccionados se examinarán frente a las propiedades PK desfavorables incluyendo la biodisponibilidad, captación cerebral y penetración en la BHE. Los compuestos que pasan estas pruebas se evaluarán para determinar las características de ADMET rudimentarias incluyendo pruebas de toxicidad aguda y crónica.

4) Selección de activadores de HAT que rescatan LTP en ratones APP/PS1. Se determinará si los activadores de HAT seleccionados mejoran el defecto de LTP en cortes de APP/PS 1 usando técnicas electrofisiológicas[25].

5) Examen adicional de activadores de HAT para examinar si mejoran las anomalías cognitivas en ratones APP/PS1. Se determinará si los activadores de HAT examinados en cortes pueden proteger a los ratones APP/PS1 frente a las alteraciones de la memoria de referencia y contextual usando ensayos de comportamiento[25]. A continuación, se caracterizarán los compuestos para determinar su selectividad más global frente a dianas distintas de HAT. Se examinarán también con una batería de ensayos que se centran en dos áreas que han dado como resultado la retirada de muchos fármacos del mercado: interacciones fármaco-fármaco (metabolismo hepático), bloqueo de los canales de hERG (disfunción cardiaca).

YF2, enfermedad de Alzheimer e investigación de descubrim iento de fármacos:

Las terapias de la AD actualmente usadas tienen una eficacia limitada. Están en marcha esfuerzos importantes para inhibir la formación de ovillos, para combatir la inflamación y el daño oxidativo, y para disminuir la carga de Ap en el cerebro[26-28]. Sin embargo, el papel de APP, Ap y las secretasas en la función fisiológica normal[29-31] podría presentar un problema para proporcionar enfoques eficaces y seguros para la terapia de la AD. Agentes en desarrollo que interaccionan con las dianas de Ap que conducen a disfunción neuronal es otro enfoque que está sometiéndose a prueba actualmente por muchos laboratorios. Sin querer restringirse a la teoría, los activadores de HAT representan una nueva clase de compuestos que podrían contrarrestar eficazmente la progresión de la enfermedad.

Bibliografía

1. Malm, T., et al., beta-Amyloid infusión results in delayed and age-dependent learning déficits without role of inflammation or beta-amyloid deposits. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(23): p. 8852-7.

2. Cleary, J.P., et al., Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat Neurosci, 2005. 8(1): p. 79-84.

3. Cullen, W.K., et al., Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport, 1997. 8(15): p. 3213-7.

4. Itoh, A., et al., Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol, 1999. 382(3):p. 167-75.

5. Vitolo, O.V., et al., Amyloid beta-peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(20): p. 13217-21.

6. Walsh, D.M., et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 2002. 416(6880): p. 535-9.

7. Chen, Q.S., et al., Impairment of hippocampal long-term potentiation by Alzheimer amyloid beta-peptides. J Neurosci Res, 2000. 60(1):p. 65-72.

8. Lambert, M.P., et al., Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(11): p. 6448-53.

9. Rakyan, V.K., et al., The marks, mechanisms and memory of epigenetic states in mammals. Biochem J, 2001. 356(Pt 1): p. 1-10.

10. Gwack, Y., et al., CREB-binding protein and histone deacetylase regulate the transcriptional activity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus open reading frame 50. J Virol, 2001. 75(4): p. 1909-17.

11. Lu, F., et al., Chromatin remodeling of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF50 promoter correlates with reactivation from latency. J Virol, 2003. 77(21): p. 11425-35.

12. Knutson, S.K., In vivo characterization of the role of histone deacetylase 3 in metabolic and transcriptional regulation, in Biochemistry. 2008, Vanderbilt: Nashville. p. 167.

13. Rajan, I., et al., Loss of the putative catalytic domain of HDAC4 leads to reduced thermal nociception and seizures while allowing normal bone development. PLoS One, 2009. 4(8): p. e6612.

14. Langley, B., et al., Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005. 4(1): p.

41-50.

15. Fischer, A., et al., Recovery of learning and memory is associated with chromatin remodelling. Nature, 2007.

447(7141): p. 178-82.

16. Kim, D., et al., SIRT1 deacetylase protects against neurodegeneration in models for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. EMBO J, 2007. 26(13): p. 3169-79.

17. Francis, Y.I., et al., Dysregulation of histone acetylation in the APPIPS1 mouse model of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 2009. 18(1): p. 131-9.

18. Marmorstein, R. y R.C. Trievel, Histone modifying enzymes: structures, mechanisms, and specificities. Biochim Biophys Acta, 2009. 1789(1): p. 58-68.

19. Roelfsema, J.H. y D.J. Peters, Rubinstein-Taybi syndrome: clinical and molecular overview. Expert Rev Mol Med, 2007. 9(23): p. 1-16.

20. Alarcon, J.M., et al., Chromatin acetylation, memory, and LTP are impaired in CBP+/- mice: a model for the cognitive deficit in Rubinstein-Taybi syndrome and its amelioration. Neuron, 2004. 42(6): p. 947-59.

21. Maurice, T., et al., Altered memory capacities and response to stress in p300/CBP-associated factor (PCAF) histone acetylase knockout mice. Neuropsychopharmacology, 2008. 33(7): p. 1584-602.

22. Mantelingu, K., et al., Activation of p300 histone acetyltransferase by small molecules altering enzyme structure: probed by surface-enhanced Raman spectroscopy. J Phys Chem B, 2007. 111(17): p. 4527-34.

23. Balasubramanyam, K., et al., Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. J Biol Chem, 2003.

278(21): p. 19134-40.

24. Dal Piaz, F., et al., The identification of a novel natural activator of p300 histone acetyltranferase provides new insights into the modulation mechanism of this enzyme. Chembiochem. 11(6): p. 818-27.

25. Trinchese, F., et al., Progressive age-related development of Alzheimer-like pathology in APP/PS1 mice. Ann Neurol, 2004. 55(6): p. 801-14.

26. Nakagami, Y., et al., A novel beta-sheet breaker, RS-0406, reverses amyloid beta-induced cytotoxicity and impairment of long-term potentiation in vitro. Br J Pharmacol, 2002. 137(5): p. 676-82.

27. Walsh, D.M., et al., Certain inhibitors of synthetic amyloid beta-peptide (Abeta) fibrillogenesis block oligomerization of natural Abeta and thereby rescue long-term potentiation. J Neurosci, 2005. 25(10): p. 2455-62.

28. Schenk, D., et al., Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999. 400(6740): p. 173-7.

29. Wu, J., R. Anwyl, y M.J. Rowan, beta-Amyloid-(1-40) increases long-term potentiation in rat hippocampus in vitro.

Eur J Pharmacol, 1995. 284(3): p. R1-3.

30. Kowalska, M.A. y K. Badellino, beta-Amyloid protein induces platelet aggregation and supports platelet adhesion. Biochem Biophys Res Commun, 1994. 205(3): p. 1829-35.

31. Mattson, M.P., Z.H. Guo, y J.D. Geiger, Secreted form of amyloid precursor protein enhances basal glucose and glutamate transport and protects against oxidative impairment of glucose and glutamate transport in synaptosomes by a cyclic GMP-mediated mechanism. J Neurochem, 1999. 73(2): p. 532-7.

Ejemplo 10: Agonistas de HAT para el tratamiento de AD

Se ha demostrado que los niveles en el hipocampo de proteína de unión a CREB (CBP) y factor asociado a p300/CBP (PCAF), dos histona acetiltransferasas (HAT) que catalizan la acetilación de histonas y son relevantes para la formación de la memoria[P14'P16], se reducen tras la elevación de Ap.

Se ha diseñado y sintetizado un compuesto activador de HAT, YF2 (figura 29). YF2 se preparó mediante reacción de Mitsunobu entre 2-(dimetilamino)etanol y 3, que se obtuvo a través de la reacción del ácido 2 y 4-cloro-3-(trifluorometil)anilina, en presencia de EDC. El ácido se sintetizó mediante hidrólisis de éster de 1. Finalmente, se trató YF2 con HCl/Et2O con el fin de obtener un compuesto soluble en agua. En ensayos in vitro, YF2 tiene actividad frente a CBP, PCAF y GCN5. Las CE50 de YF2 para CBP, PCAF y GCN5 son 2,75 |iM, 29,04 |iM y 49,31 |iM, respectivamente. De manera adicional, YF2 no interfería con la actividad de p300 y HDAC (HDAC 1, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y sirt1-2). YF2 también aumenta la actividad de p300 tal como se muestra en la figura 72.

Con la estimulación de estos resultados, se investigó entonces la farmacocinética (PK) de YF2 y la capacidad de penetración por la barrera hematoencefálica (BHE). Tras la administración i.p. e i.v. a 20 mg/kg a ratones BALB/c, se determinaron las concentraciones plasmáticas y cerebrales mediante CL-EM/EM. Los datos en la tabla 14 indican que YF2 se absorbe rápidamente en el cerebro (Tmáx a los 15 min).

Tabla 14. Parámetros farmacocinéticos de YF2.

Administración i.p. Administración i.v.

Parámetros

Plasma Cerebro Razón* Plasma Cerebro Razón* Tmáx (h) 0,25 0,25 - 0,125 0,125 -Cmáx (ng/ml o

_ng/g)843 4878 5,8 2132 27892 13,1 AUC0-t (ng' hh/m' ° 806 6493_ngh/g)8,1 1967 22222 11,3 AUC0-- (ng' hh/m l° 813 6564_ngh/g)8,1 2020 22581 11,2 t1/2 (h) 0,60 0,63 - 0,70 0,63 -MRT (h) 0,85 1,03 - 0,84 0,74 -

F (%) 41,0 29,2 - - - -

*Razón = cerebro/plasma

Las CE50 de YF2 para CBP, PCAF y GCN5 son: 2,75 |iM, 29,04 |iM y 49,31 |iM, respectivamente

La cantidad de YF2 en el cerebro era mayor que en el plasma con una razón de AUCo-t de 8,2 y 10,8 para la administración i.p. e i.v., respectivamente. Las semividas de eliminación de YF2 en el cerebro y el plasma fueron de ~40 min. Los valores de Tmáx en el cerebro y el plasma fueron similares, indicando que la distribución de YF2 en el cerebro es también rápida. Adicionalmente, en experimentos de toxicidad aguda, YF2 no indujo ningún efecto adverso hasta 300 mg/kg (i.p.).

Entonces se sometió a prueba si YF2 aumenta la acetilación de histonas en hipocampo de ratón. El compuesto se administró por vía i.p. a 20 mg/kg, se sacrificaron los ratones 30 min después y se extrajeron los hipocampos y se congelaron rápidamente para su análisis por WB. Tal como se muestra en la figura 64, YF2 aumentó la acetilación de lisinas de histonas que se mostró que estaban implicadas en la formación de la memoria (H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16 y H2B)[P15P33].

A continuación, se comprobó si YF2 podría atenuar la disfunción cognitiva y sináptica tras la elevación de Ap. YF2 rescató el defecto en los niveles de acetilación de H3 tras la infusión de Ap sobre el hipocampo (figura 65). A continuación, se indujo LTP o memoria por miedo contextual así como memoria de referencia en presencia de AP42 oligomérico, o vehículo. En los experimentos de LTP, se perfundieron AP42200 nM o vehículo a través de la disolución de baño durante 20 min antes de la aplicación de la ráfaga 0. En los experimentos de comportamiento, se infundieron bilateralmente AP42200 nM (en un volumen final de 1 |il a lo largo de 1 min) o vehículo 15 min antes de la descarga en el pie o 15 min antes del 1er ensayo (para el 1er grupo de pruebas en una prueba de laberinto de agua de brazos radiales (RAWM) de 2 días que evalúa la memoria de referencia[P34]) y 15 min antes del 7° ensayo (para el 2° grupo de pruebas del RAWM) en el hipocampo dorsal del animal en el que se había implantado previamente una cánula la semana anterior. Ap redujo LTP y la memoria por miedo tanto de referencia como contextual (figura 66). Sin embargo, YF2 (1 |iM, durante 30 min antes de la ráfaga 0 en los experimentos de LTP; 5 o 20 mg/kg, por vía i.p., 15 min antes de la administración de Ap en los experimentos de comportamiento) mejoró los déficits electrofisiológicos y del comportamiento (figura 66).

Sin querer restringirse a la teoría, dado que estos experimentos se obtuvieron con una preparación sintética de AP42, es difícil saber si esto es lo mismo que Ap que provoca disfunción sináptica en cerebros con AD. Por tanto, se validaron estos experimentos en un modelo de ratón de deposición de Ap, el ratón APP/PS1[P35]. Estos ratones se han caracterizado bien con respecto a la patología de AD[P34-31]. Comenzaron a mostrar alteración sináptica y de la memoria tan pronto como a los 3 meses de edad[P34]. Los ratones transgénicos con una doble mutación de APP (K670M:N671L)/PS1(M146L) (línea 6.2) comienzan a desarrollar placas grandes en el córtex y el hipocampo a la edad de 8-10 semanas. Tienen una reducción en LTP a los 3 meses de edad junto con una alteración de la memoria por miedo contextual y la memoria de trabajo espacial.

Tal como se muestra en la figura 67, los ratones WT presentaron <2 errores a lo largo de dos ensayos cerca del final del segundo día con la tarea de RAWM. APP/PS1 a su vez no pudieron aprender y cometieron >3 errores a lo largo de toda la sesión de entrenamiento. El tratamiento con YF2 (20 mg/kg, por vía i.p. 30 min antes del entrenamiento para FC o antes del 1er y 2° grupo de pruebas para el RAWM), sin embargo, rescató el defecto de la memoria en ratones Tg dobles sin afectar a la memoria en ratones WT. Se obtuvieron resultados similares cuando ratones Tg dobles realizaron FC para evaluar la memoria por miedo contextual (figura 67).

En resumen, la acetilación de las histonas 3 y 4 disminuye tras la elevación de Ap42. Los niveles de HAT (CBP y PCAF) se reducen tras la elevación de Ap42. La inhibición de HDAC es beneficiosa frente al daño de la función sináptica y la memoria tras la elevación de Ap42. La activación de HAT es beneficiosa frente a la pérdida de memoria tras la elevación de Ap42. Se ha diseñado y sintetizado un activador de HAT, YF2, que desplaza el equilibrio de la acetilación de la histona 3 y reestablece la memoria normal tras la elevación de Ap.

Ejemplo 11: Activadores de HAT con alta afinidad y buena selectividad por CBP y/o PCAF y/o P300

Se someterán a prueba compuestos para determinar su actividad de activador de HAT en primer lugar, usando el kit de ensayo de hAt de Active Motif (Ee .UU., CA). Para este ensayo, se usará el dominio catalítico de CBP, PCAF, p300 y GCN5 humanas (Enzo Life Sci., EE.UU.). Los dominios catalíticos de las HAT restantes se producirán usando los kits de expresión de proteínas en K. lactis de New England Biolabs. Además de ser potentes activadores de CBP y/o PCAF (CE50<100 nM), los compuestos candidatos deben ser también selectivos. Cuando se someten a ensayo frente a todas las demás HAT, deben mostrar al menos una potencia mayor de veces hacia CBP y/o PCAF. Finalmente, en los compuestos más potentes/selectivos que muestran eficacia en pruebas de disfunción sináptica y de la memoria explicados resumidamente en los ejemplos 13 y 14, se comprobará la selectividad contra HDAC. Mientras se realizan estas pruebas, se evaluará también la solubilidad (tampón acuoso neutro > 10 |ig/ml).

El siguiente objetivo será confirmar los datos in vitro, usando una preparación neuronal. En particular, se someterán a prueba nuevos activadores de HAT en cultivos primarios y ratones adultos. Se determinará en primer lugar si los compuestos pueden aumentar la acetilación de histonas específica en neuronas del hipocampo cultivadas de 10 días de edad (preparadas tal como se describe[P47]). Se aspirarán los medios y se reemplazarán por 0,5 ml de PBS que contiene el activador de HAT. Después de 30 min a 37°C, se retirarán las células y se lisarán para el análisis por WB. Los compuestos que pasan la prueba en cultivos del hipocampo se someterán a prueba a continuación en ratones adultos, siguiendo una evaluación de la toxicidad aguda para determinar la dosis de compuesto que va a administrarse al animal (véanse las “pruebas de toxicidad” a continuación). Las pruebas en ratones adultos son esenciales ya que los cultivos celulares no recapitulan el organismo completo con las interacciones célula-célula complejas y la PK del fármaco in vivo, la penetración en la BHE, etc. (véase también el ejemplo 12 a continuación). Los animales se tratarán con el activador de HAT, se recogerán los hipocampos 30 min después de la inyección i.p. y se lisarán para el análisis por WB. Todos los experimentos se realizarán por triplicado. Si se encuentra un aumento en la acetilación de histonas específica, el compuesto candidato se considerará activo.

En compuestos seleccionados, también se examinarán interacciones con canales, receptores, transportadores usando el programa de NIMH PDSP (véase http://pdsp.cwru.edu para una lista de dianas del SNC), además de los estudios de ADMET/Tox comentados en el ejemplo 12.

Ejemplo 12: Determinación de si los nuevos activadores tienen un buen perfil farmacocinético (PK) y son seguros

Se generarán datos que abordan la toxicidad y propiedades PK rudimentarias de los activadores de HAT novedosos. Si es necesario, la información obtenida a través del uso de estudios de toxicidad y PK se usará para guiar modificaciones químicas adicionales de las nuevas moléculas con el objetivo último de mejorar la biodisponibilidad, captación cerebral y seguridad. Los ensayos farmacocinéticos que es necesario realizar incluirán la medición de a) la biodisponibilidad y b) la captación cerebral. A los ratones se les inyectará por vía i.p. el activador (para candidatos a fármacos finales también se realizarán pruebas PK usando las vías de administración p.o. e i.v.). Se usarán 5-6 ratones/sexo para cada punto de tiempo. Para la evaluación de la biodisponibilidad (concentración de compuesto en la sangre en función del tiempo tras la administración), se obtendrán muestras de sangre de animales de prueba tras una única administración aguda (recogidas a los 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h y 24 h). La sangre se extraerá mediante punción retroorbital, se recogerá en tubos heparanizados y se obtendrá plasma mediante centrifugación. Las muestras se analizarán mediante CL-EM para medir las cantidades del compuesto candidato y los posibles metabolitos. Se obtendrá una indicación de la captación cerebral y la penetración en la BHE mediante extracción tisular del compuesto candidato a partir del cerebro. En resumen, se centrifugarán homogeneizados de cerebro a 11.000 rpm durante 10 min. Se añadirá una alícuota de la muestra a acetonitrilo, luego se inyectará sobre CLEM/EM para su análisis. Patrones similares de concentraciones en cerebro y plasma serán indicativas del hecho de que la captación cerebral refleja la concentración de la sangre. Una razón de concentración en cerebro/plasma pico >1 será indicativa de que la captación cerebral del compuesto es comparable a la de fármacos para el SNC conocidos en uso clínico. Por ejemplo, la razón de cerebro/sangre para minaprina, un fármaco para el SNC de 6-fenilaminopiridazina, es >2[P48].

A continuación, se evaluará la toxicidad aguda. Se registrarán todos los signos clínicos, tiempo de comienzo, duración, reversibilidad de la toxicidad y mortalidades. Los animales se observarán periódicamente durante las primeras 24 h con monitorización continua administrada las primeras 4 h, luego al menos una vez al día durante 14 días o hasta que mueren para comprobar la ingesta de líquido y alimento, el peso, así como la locomoción y el comportamiento exploratorio. Se evaluará también la dosis tolerada máxima (m Td ) y la toxicidad crónica. La MTD se calculará como la dosis administrada máxima que no produce ningún efecto de toxicidad en cuanto a malestar o muerte (el peso corporal se monitorizará a lo largo del tiempo). La toxicidad crónica se evaluará a la MTD. Se registrarán todos los signos clínicos, tiempo de aparición, duración, reversibilidad de la toxicidad y las mortalidades. La aparición de posibles signos de toxicidad crónica se evaluará durante al menos 1 mes después del final del tratamiento.

Se ha estimado que más de la mitad de todos los fármacos no consiguen alcanzar el mercado debido a problemas de ADMET[P49]. Por tanto, antes de embarcarse en una línea de trabajo toxicológico animal costoso y tras la evaluación de la eficacia (véanse los ejemplos 13 y 14), se aprovecharán los recientes avances en pruebas de AD MET in vitro para examinar los mejores tres compuestos con una batería rápida y económica de ensayos. Se pondrá el foco en dos áreas que han dado como resultado la retirada de muchos fármacos del mercado: interacciones fármaco-fármaco (metabolismo hepático), bloqueo de canales de hERG (disfunción cardiaca). Para someter a prueba las interacciones fármaco-fármaco relacionadas con la hepatotoxicidad, se usará el ensayo de inhibición de citocromo P450 (realizado por SRI International). El ensayo de bloqueo de canales de hERG se realizará usando el programa de NIMH PDSP.

Ejemplo 13: Selección de activadores de HAT que rescatan LTP en ratones APP/PS1

La disfunción sináptica es un rasgo distintivo principal de la AD[P50]. Un aspecto calificante del presente protocolo de examen de fármacos incluirá una medición del efecto de los compuestos recién sintetizados sobre la función sináptica. El ratón APP/PS1 presenta una alteración de LTP a la edad de 3 meses[P34] y por tanto permite una evaluación relativamente rápida de la función sináptica sin esperar un largo tiempo para el envejecimiento de los ratones. Se examinará LTP porque es un tipo de plasticidad sináptica que se cree que subyace al aprendizaje y la memoria. Basándose en los hallazgos de que YF2 rescata la reducción de LTP inducida por Ap, se examinarán los compuestos indicados por los estudios de MedChem para seleccionar los que pueden reestablecer una LTP normal. Los compuestos se aplicarán durante 30 min usando el mismo protocolo experimental que en la figura 66A. Se realizarán controles sobre cortes de ratones APP/PS1 tratados con vehículo, y ratones WT tratados con compuesto o vehículo.

Si los compuestos reestablecen una LTP normal en cortes de APP/PS1, se concluirá que los compuestos pueden rescatar la alteración de la plasticidad sináptica en ratones APP/PS1. Se investigará también otro aspecto importante de la enfermedad, la alteración cognitiva (véase el ejemplo 14).

Animales: Se obtendrán ratones Tg cruzando animales APP(K670M:N671L) con PS1(M146L) (línea 6.2). El genotipo se identificará mediante PCR en muestras de cola[P51-P53].

La electrofisiología se realizará en machos (véase la descripción en Gong et a/[P54]).

Análisis estadísticos: véase el ejemplo 14.

Ejemplo 14: Examen adicional de activadores de HAT para examinar si mejoran las anomalías cognitivas en ratones APP/PS1

Sin querer restringirse a la teoría, el tratamiento con un activador de HAT novedoso indicado mediante el ejemplo 13 puede rescatar los déficits cognitivos en ratones APP/PS1 de 3 y 6 meses de edad. Como tareas de comportamiento se usarán el RAWM y FC contextual, dos tipos de pruebas que evalúan diferentes tipos de memoria (de referencia y asociativa) que están afectadas en pacientes con AD. El tratamiento se realizará con la misma programación (es decir, 30 min antes del entrenamiento para el acondicionamiento por miedo o antes del 1er y 2° grupo de pruebas para el RAWM). Las condiciones que van a someterse a prueba incluyen: APP/PS1 y WT tratados con activadores de HAT, APP/PS1 y WT tratados con vehículo. Después de las pruebas de comportamiento, los ratones se sacrificarán y se usarán su sangre y cerebros para mediciones del nivel de Ap, proteína Tau, niveles de TARDBP y TDB, y alfasinucleína. Como control de la eficacia de la activación de HAT, se medirán los niveles de acetil-H4 en el hipocampo después de la administración de los compuestos 30 min antes del entrenamiento para acondicionamiento por miedo y la extracción de los hipocampos 1 h después de la descarga eléctrica (se ha mostrado que los ratones APP/PS1 tienen una reducción de H4 acetilada después de la descarga eléctrica[P21]). Finalmente, se examinarán con una batería de ensayos que se centran en dos áreas que han dado como resultado la retirada de muchos fármacos del mercado: interacciones fármaco-fármaco, bloqueo de canales de hERG (véase el ejemplo 12).

Animales: véase el ejemplo 13.

Estudios de comportamiento: Se realizarán los experimentos de manera ciega solo en animales macho para reducir la variabilidad. A) Memoria espacial. Este tipo de memoria de referencia puede estudiarse con la prueba de RAWM de dos días, tal como se describe[P56]; véase también la figura 66B). La tarea es un híbrido del laberinto de agua de Morris (MWM) y el laberinto de tierra de brazos radiales. Para estos experimentos, se realizarán pruebas en una plataforma visible para excluir que los déficits visuales, motores y de motivación afecten al rendimiento de los ratones, tal como se describe[P34]. B) El acondicionamiento por miedo para examinar tanto el aprendizaje contextual como señalado se evaluará tal como se describe[P57]. Para estos experimentos, se realizará una prueba de evaluación del umbral para comprobar la percepción sensorial del pie eléctrico en diferentes grupos de ratones[P57]. Además, se realizará la prueba en campo abierto para evaluar el comportamiento exploratorio tal como se describe[P58, P59].

Ensayo de acetilación de histonas: Se realizará inmunotransferencia de tipo Western a partir de hipocampos congelados instantáneamente en nitrógeno líquido. El tejido se homogeneizará en tampón RlPA, luego se sonicará antes de la centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. Extractos de células completas se someterán a electroforesis en gel de PAGE en gradiente del 10-20% (Invitrogen) y luego se someterán a inmunotransferencia. Se usarán anticuerpos a una concentración 1:1.000 para la inmunotransferencia. Todos los anticuerpos anti-histona se adquirirán de Millipore. Los datos de inmunotransferencias se cuantificarán midiendo la intensidad de las bandas usando software de obtención de imágenes (NIH ImageJ).

La determinación de los niveles de Ap se realizará en homogeneizados de hemicerebros congelados y plasma tal como se describió anteriormente[P34].

La determinación de los niveles de alfa-sinucleína se realizará en homogeneizados de hemicerebros congelados usando un kit de ELISA de a-sinucleína (n.° de catálogo NS400; Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante.

La determinación de los niveles de TARDBP/TDP-43 se realizará en homogeneizados de hemicerebros congelados usando un kit de ELISA de proteína 43 de unión a ADN de TAR humano, TARDBP/TDP-43 (n.° de catálogo E1951h; Wuhan EIAab Science Co, Wuhan, China) según las instrucciones del fabricante. La determinación de los niveles de Tau total y Tau fosforilada (Thr 231) se realizarán en homogeneizados de hemicerebros congelados y plasma usando un ensayo y kits según las instrucciones del fabricante disponibles de MesoScale Discovery (Gaithersburg, MD) (véase http://www.mesoscale.com/catalogsystemweb/webroot/products/assays/alzheimers. aspx).

Estadística: Los experimentos en ratones se realizarán de manera ciega. Los resultados se expresarán como error estándar de la media (EEM). El nivel de significación se fijará para p<0,05. Los resultados se analizarán con ANOVA con corrección a posteriori con el fármaco o el genotipo como efecto principal.

Bibliografía

P1. Malm, T., et al., beta-Amyloid infusión results in delayed and age-dependent learning déficits without role of inflammation or beta-amyloid deposits. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(23): p. 8852-7.

P2. Cleary, J.P., et al., Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat Neurosci, 2005. 8(1): p. 79-84.

P3. Cullen, W.K., et al., Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport, 1997. 8(15): p. 3213-7.

P4. Itoh, A., et al., Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol, 1999. 382(3): p. 167-75.

P5. Vitolo, O.V., et al., Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U SA, 2002. 99(20):p. 13217-21.

P6. Walsh, D.M., et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 2002. 416(6880):p. 535-9.

P7. Chen, Q.S., et al., Impairment of hippocampal long-term potentiation by Alzheimer amyloid beta-peptides. J Neurosci Res, 2000. 60(1):p. 65-72.

P8. Lambert, M.P., et al., Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(11):p. 6448-53.

P9. Rakyan, V.K., et al., The marks, mechanisms and memory of epigenetic states in mammals. Biochem J, 2001.

356(Pt 1):p. 1-10.

P10. Gwack, Y., et al., CREB-binding protein and histone deacetylase regulate the transcriptional activity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus open reading frame 50. J Virol, 2001. 75(4):p. 1909-17.

P11. Lu, F., et al., Chromatin remodeling of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF50 promoter correlates with reactivation from latency. J Virol, 2003. 77(21):p. 11425-35.

P12. Knutson, S.K., In vivo characterization of the role of histone deacetylase 3 in metabolic and transcriptional regulation, in Biochemistry. 2008, Vanderbilt: Nashville. p. 167.

P13. Rajan, I., et al., Loss of the putative catalytic domain of HDAC4 leads to reduced thermal nociception and seizures while allowing normal bone development. PLoS One, 2009. 4(8): p. e6612.

P14. Roelfsema, J.H. y D.J. Peters, Rubinstein-Taybi syndrome: clinical and molecular overview. Expert Rev Mol Med, 2007. 9(23): p. 1-16.

P15. Alarcon, J.M., et al., Chromatin acetylation, memory, and LTP are impaired in CBP+/- mice: a model for the cognitive deficit in Rubinstein-Taybi syndrome and its amelioration. Neuron, 2004. 42(6): p. 947-59.

P16. Maurice, T., et al., Altered memory capacities and response to stress in p300/CBP-associated factor (PCAF) histone acetylase knockout mice. Neuropsychopharmacology, 2008. 33(7): p. 1584-602.

P17. Levenson, J.M., et al., Regulation of histone acetylation during memory formation in the hippocampus. J Biol Chem, 2004. 279(39): p. 40545-59.

P18. Langley, B., et al., Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005. 4(1): p.

41-50.

P19. Fischer, A., et al., Recovery of learning and memory is associated with chromatin remodelling. Nature, 2007.

447(7141): p. 178-82.

P20. Kim, D., et al., SIRT1 deacetylase protects against neurodegeneration in models for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. EMb O J, 2007. 26(13):p. 3169-79.

P21. Francis, Y.I., et al., Dysregulation of histone acetylation in the APPIPS1 mouse model of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 2009. 18(1):p. 131-9.

P22. Marmorstein, R. y R.C. Trievel, Histone modifying enzymes: structures, mechanisms, and specificities. Biochim Biophys Acta, 2009. 1789(1):p. 58-68.

P23. Mantelingu, K., et al., Activation of p300 histone acetyltransferase by small molecules altering enzyme structure: probed by surface-enhanced Raman spectroscopy. J Phys Chem B, 2007. 111(17):p. 4527-34.

P24. Balasubramanyam, K., et al., Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. J Biol Chem, 2003.

278(21):p. 19134-40.

P25. Sbardella, G., et al., Identification of long chain alkylidenemalonates as novel small molecule modulators of histone acetyltransferases. Bioorg Med Chem Lett, 2008. 18(9):p. 2788-92.

P26. Dal Piaz, F., et al., The identification of a novel natural activator of p300 histone acetyltranferase provides new insights into the modulation mechanism of this enzyme. Chembiochem. 11(6):p. 818-27.

P27. Nakagami, Y., et al., A novel beta-sheet breaker, RS-0406, reverses amyloid beta-induced cytotoxicity and impairment of long-term potentiation in vitro. Br J Pharmacol, 2002. 137(5): p. 676-82.

P28. Walsh, D.M., et al., Certain inhibitors of synthetic amyloid beta-peptide (Abeta) fibrillogenesis block oligomerization of natural Abeta and thereby rescue long-term potentiation. J Neurosci, 2005. 25(10): p. 2455-62. P29. Schenk, D., et al., Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999. 400(6740): p. 173-7.

P30. Wu, J., R. Anwyl, y M.J. Rowan, beta-Amytoid-(1-40) increases long-term potentiation in rat hippocampus in vitro. Eur J Pharmacol, 1995. 284(3):p. R1-3.

P31. Kowalska, M.A. y K. Badellino, beta-Amyloid protein induces platelet aggregation and supports platelet adhesion. Biochem Biophys Res Commun, 1994. 205(3): p. 1829-35.

P32. Mattson, M.P., Z.H. Guo, y J.D. Geiger, Secreted form of amyloid precursor protein enhances basal glucose and glutamate transport and protects against oxidative impairment of glucose and glutamate transport in synaptosomes by a cyclic GMP-mediated mechanism. J Neurochem, 1999. 73(2): p. 532-7.

P33. Peleg, S., et al., Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. Science. 328(5979):p. 753-6.

P34. Trinchese, F., et al., Progressive age-related development of Alzheimer-like pathology in APP/PS1 mice. Ann Neurol, 2004. 55(6):p. 801-14.

P35. Holcomb, L., et al., Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med, 1998. 4(1):p. 97-100.

P36. Kurt, M.A., et al., Neurodegenerative changes associated with beta-amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes. Exp Neurol, 2001. 171(1): p. 59-71. P37. McGowan, E., et al., Amyloid phenotype characterization of transgenic mice overexpressing both mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin 1 transgenes. Neurobiol Dis, 1999. 6(4): p. 231-44.

P38. Sant'Angelo, A., F. Trinchese, y O. Arancio, Usefulness of behavioral and electrophysiological studies in transgenic models of Alzheimer's disease. Neurochem Res, 2003. 28(7):p. 1009-15.

P39. Coutts, R.T., P. Su, y G.B. Baker, Involvement of CYP2D6, CYP3A4, and other cytochrome P-450 isozymes in N-dealkylation reactions. J Pharmacol Toxicol Methods, 1994. 31(4): p. 177-86.

P40. Thompson, T.N., Optimization of metabolic stability as a goal of modern drug design. Med Res Rev, 2001. 21(5): p. 412-49.

P41. Chee, C.F., et al., An efficient synthesis of (6)-panduratin A and (6)-isopanduratin A, inhibitors of dengue-2 viral activity. Tetrahedron Letters, 2010. 51:p. 495-498.

P42. Kuehne, M.E. y P.J. Shannon, Reduction of Amides and Lactams to Amines by Reactions with Phosphorus Oxychloride and Sodium Borohydride. J. Org. Chem., 1977. 42:p. 2082-2087.

P43. Mondal, M., V.G. Puranik, y N.P. Argade, Facile Synthesis of 1,3,7-Trihydroxyxanthone and Its Regioselective Coupling Reactions with Prenal: Simple and Efficient Access to Osajaxanthone and Nigrolineaxanthone F. J. Org. Chem., 2006. 71: p. 4992-4995.

P44. Melgar-Fernández, R., et al., Synthesis of Novel Derivatives of (1S,4S)-2,5-Diazabicyclo[2.2.1]heptane and Their Evaluation as Potential Ligands in Asymmetric Catalysis. Eur. J. Org. Chem., 2008: p. 655-672.

P45. Mahmoud, M.R., et al., Synthesis of novel indeno[1,2-c]isoquinolines derivatives. Synthetic Communications, 2010. 40: p. 666-676.

P46. Tsuritani, T., et al., Efficient synthesis of 1,4-Diaryl-5-methyl-1,2,3-triazole, a potential mGluR1 antagonist, and the risk assessment study of arylazides. Organic Process Research & Development, 2009. 13:p. 1407-1412.

P47. Ninan, I. y O. Arancio, Presynaptic CaMKII Is Necessary for Synaptic Plasticity in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron, 2004. 42(1):p. 129-41.

P48. Caccia, S., T. Fossati, y A. Mancinelli, Disposition and metabolism of minaprine in the rat. Xenobiotica, 1985.

15(12):p. 1111-9.

P49. Hodgson, J., ADMET--turning chemicals into drugs. Nat Biotechnol, 2001. 19(8):p. 722-6.

P50. Masliah, E., Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histo1Histopathol, 1995. 10(2): p. 509 19.

P51. Duff, K., et al., Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature, 1996.

383(6602):p. 710-3.

P52. Hsiao, K., et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science, 1996. 274(5284): p. 99-102.

P53. Di Rosa, G., et al., Calpain inhibitors: a treatment for Alzheimer's disease. J Mol Neurosci, 2002. 19(1-2):p. 135 41.

P54. Gong, B., et al., Ubiquitin Hydrolase Uch-L1 Rescues beta-Amyloid-Induced Decreases in Synaptic Function and Contextual Memory. Cell, 2006. 126(4): p. 775-88.

P55. Bowers, E.M., et al., Virtual ligand screening of the p300/CBP histone acetyltransferase: identification of a selective small molecule inhibitor. Chem Biol. 17(5): p. 471-82.

P56. Alamed, J., et al., Two-day radial-arm water maze learning and memory task; robust resolution of amyloidrelated memory deficits in transgenic mice. Nat Protoc, 2006. 1(4): p. 1671-9.

P57. Gong, B., et al., Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model following rolipram treatment. J. Clin. Invest., 2004. 114: p. 1624-1634.

P58. Sipos, E., et al., Beta-amyloid pathology in the entorhinal cortex of rats induces memory deficits: implications for Alzheimer's disease. Neuroscience, 2007. 147(1): p. 28-36.

P59. Puzzo, D., et al., Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci, 2008. 28(53): p. 14537-45.

Ejemplo 15: Examen adicional de activadores de HAT para examinar si mejoran anomalías cognitivas en modelos de ratón de la enfermedad de Huntington

Se examinará si el tratamiento con un compuesto activador de HAT indicado por el ejemplo 13 puede rescatar los déficits cognitivos en un modelo de ratón de enfermedad de Huntington (por ejemplo, ratones FVB25 Tg(YAC128)53Hay/J y FVB/NJTg(YAC72)2511Hay/J, disponibles del Jackson Laboratory, Bar Harbor ME). Como tareas de comportamiento, se usarán el RAWM y FC contextual, dos tipos de pruebas que evalúan diferentes tipos de memoria (de referencia y asociativa). El tratamiento se realizará con la misma programación (es decir, 30 min antes del entrenamiento para el acondicionamiento por miedo o antes del 1er y 2° grupo de pruebas para el RAWM). Las condiciones que van a someterse a prueba incluyen: ratones con enfermedad de Huntington y WT tratados con activadores de HAT, ratones con enfermedad de Huntington y WT tratados con vehículo. Después de las pruebas de comportamiento, los ratones se sacrificarán y se usarán su sangre y cerebros para la medición del nivel de enfermedad de Huntington. Como control de la eficacia de la activación de HAT, se medirán los niveles de acetil-H4 en el hipocampo después de la administración de los compuestos 30 min antes del entrenamiento para acondicionamiento por miedo y la extracción de los hipocampos 1 h después de la descarga eléctrica. Finalmente, se examinarán con una batería de ensayos que se centran en dos áreas que han dado como resultado la retirada de muchos fármacos del mercado: interacciones fármaco-fármaco, bloqueo de canales de hERG (véase el ejemplo 12).

Animales: Se obtendrán modelos de ratón de enfermedad de Huntington (por ejemplo, ratones FVBTg( YAC128)53Hay/J [n.° de inventario 004938] y FVB/NJ-Tg(YAC72)2511Hay/J [n.° de inventario 003640]) del Jackson Laboratory (Bar Harbor ME). Véase también Hodgson et al., (mayo de 1999) Neuron, vol. 23, 181-192.

Estudios de comportamiento: Se realizarán los experimentos de manera ciega solo en animales macho para reducir la variabilidad. A) Memoria espacial. Este tipo de memoria de referencia puede estudiarse con la prueba de RAWM de dos días, tal como se describe[P56]). La tarea es un híbrido del laberinto de agua de Morris (MWM) y el laberinto de tierra de brazos radiales. Para estos experimentos, se realizarán pruebas en una plataforma visible para excluir que los déficits visuales, motores y de motivación afecten al rendimiento de los ratones, tal como se describe[P34]. B) El acondicionamiento por miedo para examinar tanto el aprendizaje contextual como señalado se evaluará tal como se describe[P57]. Para estos experimentos, se realizará una prueba de evaluación del umbral para comprobar la percepción sensorial del pie eléctrico en diferentes grupos de ratones[P57]. Además, se realizará la prueba en campo abierto para evaluar el comportamiento exploratorio tal como se describe[P58, P59].

Ensayo de acetilación de histonas: Se realizará inmunotransferencia de tipo Western a partir de hipocampos congelados instantáneamente en nitrógeno líquido. El tejido se homogeneizará en tampón RIPA, luego se sonicará antes de la centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. Extractos de células completas se someterán a electroforesis en gel de PAGE en gradiente del 10-20% (Invitrogen) y luego se someterán a inmunotransferencia. Se usarán anticuerpos a una concentración 1:1.000 para la inmunotransferencia. Todos los anticuerpos anti-histona se adquirirán de Millipore. Los datos de inmunotransferencias se cuantificarán midiendo la intensidad de las bandas usando software de obtención de imágenes (NIH ImageJ).

La determinación de los niveles de huntingtina se realizará en homogeneizados de hemicerebros congelados y plasma usando un kit de ELISA de huntingtina (Htt) (n.° de catálogo ABIN423526; Antibodies-online, Atlanta, GA) según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 16: Examen adicional de activadores de HAT para examinar si mejoran las anomalías de la actividad motora en modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson

La PD es una enfermedad degenerativa con una muerte neuronal de hasta el 75-95% de las neuronas dopaminérgicas en núcleos de la sustancia negra. Se examinará si el tratamiento con un compuesto activador de HAT indicado por el ejemplo 13 puede rescatar los movimientos motores anómalos en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson (PD) (por ejemplo, véanse los modelos de ratón de enfermedad de Parkinson disponibles del Jackson Laboratory, Bar Harbor ME en http://jaxmice.jax.org/list/ra1594.html; véase también Emborg, Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 121-143; Lane Psychopharmacology (2008) 199:303-312; y Meredith et al., Acta Neuropathol (2008) 115:385-398). Como tareas de comportamiento, se examinará, por ejemplo, la discinesia, bradicinesia, el temblor y/o la fuerza de agarre para la evaluación de la eficacia del compuesto en diversos estadios de PD. Las condiciones que van a someterse a prueba incluyen: ratones con PD y WT tratados con activadores de HAT, ratones con PD y WT tratados con vehículo. Después de la evaluación del comportamiento, los ratones se sacrificarán y sus cerebros se usarán para la medición de la proteína alfa-sinucleína agregada. Como control para la eficacia de la activación de HAT, se medirán los niveles de acetil-H4 en el hipocampo.

Animales: Se obtendrán modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson del Jackson Laboratory (Bar Harbor ME). Véase también, Meredith et al., Acta Neuropathol (2008) 115:385-398.

Estudios de comportamiento: Se realizarán los experimentos de manera ciega solamente en animales macho para reducir la variabilidad, según métodos descritos por Fleming et al., ((2004) The Journal of Neuroscience, 24(42):9434-9440) y Hwang et al., ((2005) The Journal of Neuroscience, 25(8):2132-2137).

La determinación de los niveles de alfa-sinucleína se realizará en homogeneizados de hemicerebros congelados usando un kit de ELISA de a-sinucleína (n.° de catálogo NS400; Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante o por medio de métodos neuropatológicos convencionales (histología de tejido cerebral).

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un compuesto, en el que el compuesto es:
2. Un método para examinar compuestos según la reivindicación 1 para tratar estados asociados con depósitos de péptido amiloide-beta acumulados, comprendiendo el método:

a) administrar un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1 a un modelo de animal de acumulación de depósitos de péptido amiloide-beta; y

b) seleccionar un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1 que puede modular la acetilación de histonas tras la administración del compuesto activador de HAT en un modelo de animal de acumulación de depósitos de péptido amiloide-beta.
3. Un método para identificar un compuesto activador de histona acetiltransferasa (HAT) según la reivindicación 1 para tratar estados asociados con depósitos de péptido amiloide-beta acumulados, en el que el método comprende seleccionar un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1 que tiene una o más de las siguientes características:

a. la CE50 del compuesto es de no más de aproximadamente 1000 nM;

b. la actividad de acetilación de histonas in vitro selecciona como diana la proteína histona H2, H3 y/o H4; y c. el compuesto penetra la barrera hematoencefálica; o una combinación de las mismas.
4. El método según la reivindicación 3, en el que el compuesto tiene una masa molecular menor de aproximadamente 500 Da, tiene un área de superficie polar menor de aproximadamente 90 A2, tiene menos de 8 enlaces de hidrógeno, o una combinación de los mismos, con el fin de penetrar la barrera hematoencefálica.
5. Un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la reducción de los depósitos de proteína amiloide beta (Ap) en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1, disminuyendo de ese modo los depósitos de proteína Ap en el sujeto.
6. El compuesto según la reivindicación 5 para su uso, en el que el sujeto presenta niveles anómalamente elevados de placas de amiloide beta o

en el que el sujeto está aquejado de enfermedad de Alzheimer, demencia por cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión o angiopatía amiloide cerebral, o

en el que el depósito de proteína Ap comprende un isómero AP40, un isómero AP42, o una combinación de los mismos.
7. Un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1, preferiblemente un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1.

Un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el aumento de la retención de memoria en un sujeto aquejado de una enfermedad neurodegenerativa administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la reivindicación 1, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el aumento de la plasticidad sináptica en un sujeto aquejado de una enfermedad neurodegenerativa administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición que aumenta la acetilación de histonas en el sujeto, en el que la composición comprende el compuesto según la reivindicación 1, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la reivindicación 1, tratando de ese modo la enfermedad neurodegenerativa en el sujeto, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la disminución de los cuerpos de inclusión en un sujeto aquejado de un trastorno neurodegenerativo administrando al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1, disminuyendo de ese modo los cuerpos de inclusión en el sujeto, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la reivindicación 1, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la mejora de los síntomas de enfermedad de Parkinson en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la reivindicación 1; o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la mejora de los síntomas de enfermedad de Parkinson, administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de enfermedad de Huntington en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1, o

un compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de enfermedad de Huntington administrando a un sujeto una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica que comprende un compuesto activador de HAT según la reivindicación 1.

El compuesto según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 5, 7 u 8,

en el que la cantidad eficaz es de al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o

en el que la composición cruza la barrera hematoencefálica, o

en el que la enfermedad neurodegenerativa comprende adrenoleucodistrofia (ALD), alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar mortal, degeneración del lóbulo frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, neuroborreliosis, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), atrofia sistémica múltiple, esclerosis múltiple, narcolepsia, enfermedad de Niemann Pick, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades priónicas, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Rett, demencia frontotemporal tau positiva, demencia frontotemporal tau negativa, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de la médula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, enfermedad de Batten, ataxia espinocerebelosa, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, tabes dorsal o encefalopatía tóxica, o

en el que la plasticidad sináptica comprende aprendizaje, memoria, o una combinación de los mismos, o

en el que la plasticidad sináptica comprende potenciación a largo plazo (LTP) o

en el que el cáncer comprende linfoma de células B, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de vejiga, linfoma de células T, mieloma, leucemia, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, neoplasias hematopoyéticas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, carcinoma de células renales, hepatoma, adenocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de próstata, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de tiroides, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de ovario, melanoma primario o metastásico, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, cáncer de cerebro, angiosarcoma, hemangiosarcoma, sarcoma óseo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer gastrointestinal, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, macroglobulinemia de Waldenstroom, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma de pulmón, carcinoma epitelial, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, retinoblastoma, leucemia, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, linfoma, mieloma múltiple y carcinoma medular.

El compuesto según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 5, 7 u 8, en el que el compuesto aumenta la acetilación de histonas.

El compuesto según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 10, en el que la acetilación de histonas comprende la acetilación de histonas H2B, H3, H4, o una combinación de las mismas, o

en el que la acetilación de histonas comprende la acetilación de los residuos de lisina de histonas H3K4, H3K9, H3K14, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, o una combinación de los mismos, o

en el que los cuerpos de inclusión comprenden péptidos beta-amiloide, proteínas Tau nativas y fosforiladas, alfa-sinucleína nativa y fosforilada, lipofuscina, TARDBP escindida (TDB-43), o una combinación de las mismas.

El compuesto según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 8, en el que los síntomas de enfermedad de Parkinson comprenden temblor, bradicinesia, discinesia, rigidez, inestabilidad postural, distonía, acatisia, demencia, coordinación motora macroscópica alterada, o una combinación de los mismos, opcionalmente

en el que la inestabilidad postural comprende desequilibrio alterado, coordinación alterada, o una combinación de los mismos.