JP2018027960A - ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化剤及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下式IVの化合物。
[Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCH2;Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O);R1は、H、メチル等;R2は、H、メチル等;R3は、H、メチル、F、Cl、I、NO2、又はCN等]
【選択図】なし
Description
[0004]本発明は、米国神経障害及び発作研究所(National Institute of Neurological Disorder and Stroke)(NINDS)により授与されたR01−NS049442、米国国立衛生研究所(NIH)により授与されたPO1AG17490、NIHにより授与されたU01AG031294、及びNIHにより授与されたU01AG14351の支援下で行われた。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有している。
R1は、H、又はCF3であり;
R2は、H、Cl、又はCNであり;
R3は、H、O−メチル、O−エチル、S−エチル、O−シクロペンチル、OCH2CH2N(CH3)2、又はCH2CH2CH2N(CH3)2であり;
R4は、H;C(=O)NH−フェニルであり、ここにおいて、フェニルは一つ又はそれより多いハロ或いはCF3で置換されている;
R5は、H、C1−C5−アルキル、OH、OCH3、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2、CH2CH2CH2N(CH3)2、SCH2CH2N(CH3)2、又はOCH2C(=O)O−アルキルであり;
R6は、H、O−メチル、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2であり;そして
Xは、CONH、SONH、SO2NH、NHC(=O)NH、又はNHCOである。
R7は、H又はCF3であり;
R8は、O−エチル又はS−メチルであり;
R9は、ブチル又はOCH2CH2N(CH3)2であり;
Yは、C−Cl、C−CN、C−NO2、又はNであり;
Wは、CH又はNであり;そして
Zは、CH又はNである。
R10は、CF3であり;
R11は、CNであり;そして
R12は、O−エチルある。
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−、又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
AR1は、5員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
AR2は、5員の芳香族環、6員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
[0014]他の態様において、式(I)の化合物は、以下の式:
[0016]幾つかの態様において、式(II)の化合物は、以下の式:
[0017]幾つかの態様において、式(V)の化合物は、以下の式:
[0018]本発明の一つの側面は、蓄積したアミロイド−ベータペプチド沈着物に伴う症状を治療するための、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)の化合物を選別するための方法を提供する。この方法は、(a)式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)のHAT活性化剤化合物を、アミロイド−ベータペプチド沈着物の蓄積の動物モデルに投与し;そして(b)アミロイド−ベータペプチド沈着物蓄積の動物モデルにおけるHAT活性化剤化合物の投与後のヒストンのアセチル化を調節することができる式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)のHAT活性化剤化合物を選択すること、を含んでなる。
とを含んでなる。一つの態様において、患者は、異常に高いレベルのアミロイドベータタンパク質プラークを示す。もう一つの態様において、患者は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症に罹っている。更なる態様において、Aβタンパク質沈着物は、Aβ40異性体、Aβ42異性体、又は異性体の組合せを含んでなる。一つの態様において、化合物はYF2である。他の態様において、有効な量は、少なくとも約1mg/kg体重、少なくとも約2mg/kg体重、少なくとも約3mg/kg体重、少なくとも約4mg/kg体重、少なくとも約5mg/kg体重、少なくとも約6mg/kg体重、少なくとも約7mg/kg体重、少なくとも約8mg/kg体重、少なくとも約9mg/kg体重、少なくとも約10mg/kg体重、少なくとも約15mg/kg体重、少なくとも約20mg/kg体重、少なくとも約25mg/kg体重、少なくとも約30mg/kg体重、少なくとも約40mg/kg体重、少なくとも約50mg/kg体重、少なくとも約75mg/kg体重、又は少なくとも約100mg/kg体重である。幾つかの態様において、組成物は血液脳関門を通過する。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
g/kg体重、少なくとも約20mg/kg体重、少なくとも約25mg/kg体重、少なくとも約30mg/kg体重、少なくとも約40mg/kg体重、少なくとも約50mg/kg体重、少なくとも約75mg/kg体重、又は少なくとも約100mg/kg体重である。幾つかの態様において、組成物は血液脳関門を通過する。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
な量の組成物を患者に投与することを含んでなり、ここにおいて、組成物は、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)の化合物を含んでなる。一つの態様において、化合物はYF2である。他の態様において、有効な量は、少なくとも約1mg/kg体重、少なくとも約2mg/kg体重、少なくとも約3mg/kg体重、少なくとも約4mg/kg体重、少なくとも約5mg/kg体重、少なくとも約6mg/kg体重、少なくとも約7mg/kg体重、少なくとも約8mg/kg体重、少なくとも約9mg/kg体重、少なくとも約10mg/kg体重、少なくとも約15mg/kg体重、少なくとも約20mg/kg体重、少なくとも約25mg/kg体重、少なくとも約30mg/kg体重、少なくとも約40mg/kg体重、少なくとも約50mg/kg体重、少なくとも約75mg/kg体重、又は少なくとも約100mg/kg体重である。幾つかの態様において、組成物は血液脳関門を通過する。一つの態様において、神経変性疾患は、副腎白質萎縮症(ALD)、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ルーゲーリック病)、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(更にシュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても知られる)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、レビー小体性認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型)、多系統萎縮症、多発性硬化症、過眠症、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病sm進行性核上性麻痺、レット症候群、Tau陽性前頭側頭葉認知症、Tau陰性前頭側頭葉認知症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血の続発性亜急性脊髄複合変性症、シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病(更にバッテン病としても知られる)、脊髄小脳失調症(各種の特徴を伴う多発性型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆、又は中毒性脳症を含んでなる。もう一つの態様において、シナプス可塑性は、学習、記憶、又はこれらの組合せを含んでなる。幾つかの態様において、シナプス可塑性は、長期増強(LTP)を含んでなる。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
4、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、子宮頚部癌、消化器癌、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支原性肺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、肺癌、上皮癌、子宮頸癌、精巣癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、膀胱癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は髄様癌を含んでなる。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。
病としても知られる)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、レビー小体性認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型)、多系統萎縮症、多発性硬化症、過眠症、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病sm進行性核上性麻痺、レット症候群、Tau陽性前頭側頭葉認知症、Tau陰性前頭側頭葉認知症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血の続発性亜急性脊髄複合変性症、シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病(更にバッテン病としても知られる)、脊髄小脳失調症(各種の特徴を伴う多発性型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、又は中毒性脳症を含んでなる。もう一つの態様において、シナプス可塑性は、学習、記憶、又はこれらの組合せを含んでなる。幾つかの態様において、シナプス可塑性は、長期増強(LTP)を含んでなる。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
性亜急性脊髄複合変性症、シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病(更にバッテン病としても知られる)、脊髄小脳失調症(各種の特徴を伴う多発性型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、又は中毒性脳症を含んでなる。もう一つの態様において、シナプス可塑性は、学習、記憶、又はこれらの組合せを含んでなる。幾つかの態様において、シナプス可塑性は、長期増強(LTP)を含んでなる。幾つかの態様において、化合物は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、又は化合物19である。他の態様において、化合物はヒストンのアセチル化を増加する。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンH2B、H3、H4、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。更なる態様において、ヒストンのアセチル化は、ヒストンリシン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、又はこれらの組合せのアセチル化を含んでなる。
すると考えられる。この疾病において高い量で存在するペプチドであるβ−アミロイド(Aβ)は、記憶[P1,P2]及びその電気生理学的モデルで長期増強(LTP)[P3−P8]を阻害することが見いだされている。記憶は、遺伝子発現の制御によるエピジェネティクスによって調節されることが知られている。エピジェネティクスは、DNA又はその関連タンパク質を、DNAのメチル化及びヒストン(H)修飾のような方法で、DNA配列そのものを変化することなく[P9]‘マーキング’することによって遺伝子発現を変化する機構として定義される。例えばアセチル又はメチル官能基の付加或いは除去によるヒストンの修飾は、DNA中に含有される情報が、多かれ少なかれ転写因子に接近可能であるようにクロマチン構造が開くか又は閉じることを起こす。従って、後成的機構の一つの変性が記憶の破壊に導くことができることは驚くべきことではない。例えば、ヒストンのアセチル化の減少は、クロマチン構造が閉じることを起こし、従ってDNA中に含有される情報は、転写因子及び記憶の形成にとってより接近不可能であることができる[P9]。
、ヒストンからアセチル基を除去する酵素のヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害を含む。然しながら、非特異的HDAC阻害の多面的効果は、HDAC阻害剤の治療の可能性を妨害することができる[P10−P13]。
共有する。HATは、癌、喘息、神経変性疾患及びウイルス感染の病態に関係することができる。これは、特異的HAT活性化剤が、薬理学的探求のための潜在的な手段であり、
そして治療的適用を見出すことができることを示す。今のところただ一つの群がHAT活性化剤として報告されている。然しながら、これらの化合物は、可溶性でなく、更に膜浸透性でもなく、これが、これらを先に記載した疾病に対する治療のための良好な薬物候補でなくしている。
び血液脳関門(BBB)透過性を有し、従って神経変性疾患及び癌を持つ患者に最小量の副作用を伴う新しい医薬として使用することができる、HAT活性化剤の新しい群の合成に関する。
選択性、妥当な薬物動態及び血液脳関門(BBB)を通る良好な透過性を持つ化合物を提供する。これらの化合物は、AD及びアルツハイマー様病態の認知又は記憶を改良することのような、米国で三番目に最も経費のかかるAD患者の副作用を最小にするために、並びに他の神経変性疾患に罹った患者に対する副作用を最小にするために使用することができる。本発明の化合物は、更に抗癌薬物としても開発することができる。
ができ、従って患者の遺伝子発現を増加し、向上した記憶及び認知をもたらすHAT活性化剤を同定するための方法を提供する。
ていない被験者)における記憶向上剤としてのHATアゴニストの使用を提供する。更なる態様において、本発明は、加齢した被験者(例えば、>55歳の被験者)における記憶向上剤としてのHATアゴニストの使用を提供する。更なる態様において、本発明は、認知減少/障害に伴う他の症状のための記憶向上剤としてのHATアゴニストの使用を提供する。認知減少/障害に伴う他の症状の非制約的例は、精神遅滞に伴う各種の症候群及び学習障害に伴う各種の症候群、パーキンソン病、ピック病、レビー小体病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、多系統萎縮症、脳の鉄の蓄積を伴う神経変性I型(ハラーフォルデン・シュパッツ病)、純粋自律神経失調症、レム睡眠行動障害、軽度認知機能障害(MCI)、脳アミロイド血管症(CAA)、軽度認知障害、加齢、アルツハイマー病と混合された血管性認知症、異常なアミロイド沈積によって特徴づけられる神経変性疾患、及びいずれものこれらの組合せを含む。
動物モデル)のような神経変性疾患の動物モデル、又は例えば、ハンチントン病のマウスモデルにおいて試験されるHAT活性化剤化合物の候補の集団を縮小するために、HAT活性化剤は、最初、一つ又はそれより多い:約100nMより多くないEC50;in vitroのヒストンアセチル化活性;及びBBBを透過する能力を有するような、そのある種の特徴の保有に基づいて選別又は選択することができる。
す動物、例えばAβ蓄積動物モデル(例えば、ADの動物モデル)のような神経変性疾患の動物モデル、又は例えば、ハンチントン病のマウスモデルにおいて試験されるHAT活性化剤の候補の集団は、最初、“医化学”戦略に基づいて選別又は選択される。例えば、報告されたHAT活性化剤の構造分析に基づいて、一群の構造的に関連するが、しかしやはり式的に独立の骨格を、HAT活性化剤の候補とみなされるものとして発生することができる。これらの骨格から誘導される化合物は、先ずコンピューターモデル上で選別され、そして最適化される。最高の得点を持つ化合物が合成され、そして効力を試験されるものである。この段階で、合成の努力は、効力/選択性の試験結果に導かれるものである。
満足すべき効力及び選択性を持つ化合物(リード化合物)が、更にPK、生体利用率/脳透過性及び非特異的活性(安全性)に対して研究されるものである。選択された化合物は、制約されるものではないが、高いレベルの封入体を示す動物のような神経変性疾患の動物モデル、例えばAβ蓄積動物モデル(例えばADの動物モデル)、又はハンチントン病のマウスモデルで、これらが、患者の遺伝子発現を増加し、向上した記憶及び認知をもたらすか否かを決定するために試験することができる。本明細書中で使用する場合、HAT活性化剤化合物は、化合物が更に他のHATを阻害することが可能であることができる可能性を必ずしも妨げない。
[00119]真核生物のDNAは、高度に組織化され、そして核中に包装されている。組織
化及び包装は、DNAと一緒に複合構造のクロマチンを形成するコアヒストンH2A、H2B、H3及びH4を含むタンパク質の付加によって達成される(図28参照)。コアヒストンの修飾は、クロマチンの立体構造変化に対して基本的に重要である。アセチル化のレベルは、転写活性に関連し、そして次いでアセチル化は、開いたクロマチン構造を誘発し、これは、転写装置がプロモーターに接近することを可能にする。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)は、コアヒストンタンパク質のアミノ末端の近くに位置するリシンのε−アミノ基を選択的に脱アセチル化又はアセチル化することによって、転写に影響する酵素である。クロマチンのアセチル化は、転写活性(ユークロマチン)と相関し、一方脱アセチル化は、遺伝子発現抑制と相関する。興味あることに、海馬のCA1領域(長期の記憶において重要な役割を演じる脳の領域)中のH3のアセチル化の増加が、連合記憶後に起こることが示された。更に、HDACを阻害することによって、これらは、クロマチン中の変化を操作し、そして長期の記憶の形成を向上することが可能である。
ぞれの厳密な制御に対するこれらの寄与が、徐々に認識されている。従って、これらの機構の調節解除が、記憶に関連する遺伝子の発現の破壊に導き、精神遅滞に伴う多くの症候群をもたらすことができることは驚くべきことではない。
レオソームの単位を形成し、紐上のビーズの外観を与える[B31]。次に、これらのヌクレオソーム単位は、高次のクロマチン繊維に折畳まれる[B32]。それぞれのヒストンの八量体複合体は、ヒストン2A及び2Bの二つのコピーによって隣接するヒストンH3及びH4の二つのコピーを含有する[B32]。H1及びそのトリの変種H5は、リンカーヒストンであり、これは、ヌクレオソーム並びにDNAの入口及び出口部位の両方を結合し、従ってDNAをそこに固定し、そして高次構造の形成を可能にする。全てのヒストンは、球状の領域を有し、これは、ヒストン−ヒストンの相互作用、及びN−末端の‘尾部’の延長を仲介する。ヒストンのコア、そして特にその尾部は、アセチル化、ユビキチン化、SUMO化、リン酸化、シトルリン化、ADP−リボシル化、及びメチル化のような多くの共有修飾のための標的である[B33]。H3 Lys4メチル化及びH3 Lys56アセチル化のような活性遺伝子転写を伴うヒストン修飾は、遺伝子発現に導くことが見いだされた。他方、H3 Lys27メチル化及びH2A Lys119ユビキチン化のような遺伝子転写の不活性化に伴うヒストン修飾は、遺伝子発現抑制を起こすことが見いだされた。この適用に対して特に興味あることは、ヒストン2B、3及び4であり、これらが記憶過程に関係することが示されているためである[B19、B25]。
性を修飾すること、及び転写因子及び修飾酵素のためのドッキング部位として作用することによる遺伝子制御に関係することが提案されている[B34、B35]。最も研究され
たヒストン修飾の一つは、ヒストンのN−末端の進化的に保存されたリシン残基の、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)によるアセチル化である。対照的に、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)によって触媒されるヒストンの脱アセチル化は、DNAを更に凝縮した形態に包装し、転写因子の接近を制約し、そして従って遺伝子サイレンサーとして作用することが見いだされた[B36]。HATは、少なくとも三つの群の酵素を含む遺伝子発現の制御に関係していた[B37]。一般制御非脱抑制可能5(Gcn5)は、Gcn5のN−アセチルトランスフェラーゼ(GNAT)の創設メンバーである。GNATファミリーのメンバーは、Gcn5、PCAF、Elp3、HAT1m Hpa2及びNut1を含む。MYSTファミリーは、ファミリーの創設メンバー:Morf、Ybf2、Sas2及びTip60に従って命名された。更に、CBP/p300、Taf1及び多くの核受容体活性化補助因子を含む他のタンパク質は、固有のHAT活性を保有することが示されている。然しながら、これらのタンパク質は、コンセンサス領域を含有せず、そして従ってHAT酵素の‘孤児群’である[B37]。
する[B38]。哺乳動物のHDACは、古典的及び転写抑制因子(silent information regulator)2(Sir2)関連タンパク質(サーチュイン)ファミリーに分割される[B39]。ヒトにおいて、古典的ファミリーのメンバーは、もう一つの下位区分を有し、これは、クラスI、II及びIVを含み、これらは配列類似性を共有し、そしてデアセチラーゼ活性のためにZn+を必要とする。クラスIのHDAC(HDAC1−3、HDAC8)は、遺伝子リプレッサーRpd3p酵母に関連し、そして少なくとも二つの別個のコリプレッサー複合体、Sins3複合体及びNuRD複合体のサブユニットである。クラスIIのHDAC(HDAC4−7、9及び10)は、Hda1p HDAC酵母に類似であり、これらは、遺伝子リプレッサーとして作用し、そして細胞分化及び発育において各種の役割に関係している。クラスIVは、HDAC11を含んでなり、これは、クラスI及びIIのHDACの両方の幾つかの特徴を有する。サーチュインファミリーは、クラスIIIのHDAC(SIRT1−7)を含み、これは、Sir2酵母に類似である。クラスIIIのHDACは、生化学的に、そして構造的に古典的ファミリーとは異なり、そして補助因子としてNAD+を必要とする。HDACは、セントロメア及びテロメアにおける遺伝子発現抑制及びヘテロクロマチン形成に関係するように見受けられる(総括に対して[B40]を参照されたい)。
は、癌及び神経変性疾患における遺伝子発現の変化に寄与することができる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)によるヒストン上のアセチル基の付加は、遺伝子発現を向上し、一方ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)によるその除去は、遺伝子発現を減少する。ヒストンのアセチル化の減少は、腫瘍、気分障害、及び神経変性疾患のような各種の病気において見いだされている。HATの例は、制約されるものではないが、GCN5、GCN5L、PCAF、HAT1、ELP3、HPA2、ESA1、SAS2、SAS3、TIP60、HBO1、MOZ、MORF、MOF、SRC1、SRC3、TIF2、GRIP1、ATF−2[Lee and Workman(2007)Nat Rev Mol Cell Biol.,8(4):284−95,Marmorstein(2001)J Molec Biol.311:433−444;及びKimura et al.,(2005)J Biochem.138(6):647−662を参照されたく、これらはそれぞれ本明細書中に参考文献としてその全てが援用される]を含む。一つの態様において、本発明のHAT活性化剤化合物は、GCN5、GCN5L、HAT1、PCAF、又はこれらに組合せに関する。幾つかの態様において、本発明のHAT活性化剤化合物は、核受容体活性化補助因子(例えば、CBP/p300及びTaf1)のような固有のHAT活性を保有するタンパク質に関する。もう一つの態様において、H2、H3、及び/又はH4ヒストンのアセチル化は増加される。幾つかの態様におい
て、HAT活性化剤化合物は、図3に示されるYF2である。
多様な幅広い種類の疾病の結果を改良することを示している。幾つかのHDAC阻害剤の臨床試験は現時点で進行中であるが、ヒストンのアセチル化がHATの活性化によって増加されることによる別の戦略は、広範に探求されていない。例えば、米国特許出願公開US2009076155及びPCT出願公開WO2004053140中の化合物は、不良な溶解性及び膜透過性を有する。更に、この特許出願中で開示された化合物は、いずれかの疾病のためのいずれものデータも開示していない。
DAC阻害剤は、現時点で臨床試験中である。これらのHDAC阻害剤(HDACi)の幾つかは、前臨床試験において治療的効力を示している。理論によって束縛されるものではないが、HAT活性化剤は、HDACiと同様な役割を持つ有用な薬物候補であることができる。然しながら、従来使用可能であったHAT活性化剤は、僅かな溶解度及び膜透過性を有し、これらを薬物として不適当にしていた。
臨床段階である4SC−202(Nycomed,Germany);前臨床段階であるAR−42(Arno therapeutics,Parsippany,NJ);大II相臨床試験中であるBelinostat(TopoTarget,Rockaway,NJ);及び第II相臨床試験中であるEntinostat(Bayer Schering)である。例えば、Lane及びChabner(2009,J Clin Oncol.,27(32):5459−68;参考文献としてその全てが援用される)の表3中で、HDAC阻害剤の選択された臨床試験が考察され、これは、Vorinostat、Depsipeptide、及びMGCD0103を含む。Lane及びChabner(2009,J Clin Oncol.,27(32):5459−68;参考文献としてその全てが援用される)の表2中で、臨床使用又は開発中の選択されたHDAC阻害剤が考察され、これは、ヒドロキサム酸化合物(例えば、ボリノスタット、トリコスタチンA、LAQ824、Panobinostat、Belinostat、及びITF2357)、環式テトラペプチド化合物(例えば、デプシペプチド)、ベンズアミド化合物(例えば、Entinostat及びMGCD0103)、及び短鎖脂肪酸化合物(例えば、バルプロ酸、酪酸フェニル、及びpivanex)を含む。
Whitehouse Station,NJ)からのHDACi;及びハンチントン病の治療のために使用され、今や中止されたTopo Target(Rockaway,NJ)からのHDACi;双極性疾患、癲癇、及び片頭痛のために使用され、今や中止されたイソバレルアミドNPS−1776(NPS Pharmaceutical,Bedminster,New Jersey);及び前臨床段階で中止されたTopo Target A/S(Kobenhavn,Denmark)からの癌のためのヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤のような神経疾患のために開発されているか、又は開発された。
成が記載され、そして、in−vitro並びに動物モデルにおけるその効力が示される(実施例を参照されたい)。In vitroの及び行動学的データは、本発明のHAT活性化剤化合物のYF2が、脳中のヒストンH3をアセチル化し、そしてアルツハイマー病のマウスモデルにおける記憶欠損を回復することができることを示す。例えば、図3に示すHAT活性化剤は、幾つかの癌、精神及び神経変性疾患におけるアジュバント療法と
して使用することができ、そしてこれらの疾患のための治療の効力及び安全性を改良することができる。更に、HAT活性化剤化合物のYF2は、先に言及した特許出願中に記述されていない分子を有し、これは、溶解性並びに膜及び血液脳関門(BBB)透過性を有意に改良する。Abel and Zukin(2008)Current Opinion in Pharmacology 8:57−64;及びLee and Workman(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8:284−295を参照されたい。
る癌を治療するために使用することができる。癌の非制約的例は、B細胞リンパ腫、大腸癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、T細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、造血器腫瘍、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンスリンパ腫、ホジキンスリンパ腫、子宮癌、腎細胞癌、肝細胞腫、腺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、卵巣癌、原発性又は転移性黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、脳癌、血管肉腫(angiosarcoma)、血管肉腫(hemangiosarcoma)、骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、子宮頚部癌、消化器癌、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支原性肺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、肺癌、上皮癌、子宮頸癌、精巣癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、膀胱癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び髄様癌を含む。
る神経変性疾患を治療するために使用することができる。神経変性疾患の非制約的例は、副腎白質萎縮症(ALD)、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ルーゲーリック病)、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(更にシュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても知られる)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、レビー小体性認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型)、多系統萎縮症、多発性硬化症、過眠症、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病sm進行性核上性麻痺、レフサム病、レット症候群、Tau陽性前頭側頭葉認知症、Tau陰性前頭側頭葉認知症、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血の続発性亜急性脊髄複合変性症、シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病(更にバッテン病としても知られる)、脊髄小脳失調症(各種の特徴を伴う多発性型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、及び中毒性脳症を含む。
[00133]遺伝子転写及び記憶に関係する過程の略図を図23に示す。脳において、CR
EBのリン酸化は、CBPに結合し、そして記憶関連遺伝子発現を刺激するCREBの能力のために必要である。基底転写装置との相互作用を容易にする活性化補助因子としての、そしてそのHAT活性によるCBPの機能は、ヒストンのアセチル化を触媒し、染色体抑圧の減少を起こし、そして記憶関連遺伝子の転写を増加する。このスキームと一致して、HAT領域のCBPの変異は、LTMの機能障害を起こすことが見いだされた。例えば
、Korzus等は、CBPのHAT活性を持たない誘導型ドミナントネガティブCBPマウスが、正常な短期記憶を示し、一方LTMは機能障害されことを証明した[B8]。更に、機能障害されたLTMは、遺伝子導入発現の抑制及びHDAC阻害剤の投与によって救済された[B8]。
B26]からの研究によって強調されている。この研究において、海馬のCA1領域(LTMにおいて重要な役割を演じる脳の領域)におけるH3のアセチル化が、マウスが有害な刺激を伴う新規な状況に関係する連合記憶の形態の状況的恐怖条件づけに対する訓練後、増加することが見いだされた。然しながら、HDAC阻害は、LTMを向上した[B26]。この研究と一致して、HDAC阻害は、ハンチントン病、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、虚血及びルビンシュタイン・テイビ症候群のようなある種の神経変性疾患において有利であることができる[B19、B25、B41、B42]。興味あることに、HDAC阻害剤の効果は、HDAC2のニューロン特異的過剰発現が、しかしHDAC1のそれではなく、樹状突起スパイン密度、シナプスの数、シナプス可塑性及び記憶形成を減少するために、特異的HDACに依存する可能性がある[B43]。逆に、HDAC2の欠損は、マウスにおけるHDAC阻害剤による慢性治療と同様に、シナプスの数及び昂進された記憶を増加した[B43]。まとめれば、これらの発見は、HDAC阻害が、ADのような認知障害によって特徴づけられる神経変性疾患における記憶機能障害に対する治療手段を提供することができることを示す。
[00136]最近の研究は、CREB/CBP機能障害をADに結び付けた。APP(K6
70N:M671L)遺伝子導入動物は、α−7−ニコチン受容体(α7−nAChR)/ERK/MAPKカスケードの下流のレベルにおけるCREBのリン酸化の減少を示した[B44、B45]。オリゴマーのAβ42を含有する製剤による海馬切片の潅流は、LTPのAβ仲介の変化の根底にある機構に対する手がかりを提供する、CREBリン酸化の強縮誘導の増加の減少を明らかにした[B12]。これらの結果と一致して、Aβは、ラットの海馬培養物中のCREBリン酸化のグルタミン酸誘導の増加を遮断した[B11]。Gong等は、更に、cAMPレベルを、そして従ってCREBリン酸化を増加する選択的PDE IV阻害剤であるロリプラムが、APP/PS1二重遺伝子導入マウスにおけるLTP及び状況的学習の両方の欠損を回復することを見出した[B46]。この保護的効果は、恐らくCBP補充、そして従ってヒストンのアセチル化に導くことができるCREB活性化のためである。もう一つの研究は、PS1及び2において、コンディショナる二重ノックアウト(PScDKO)マウスが、年齢に伴って増幅される障害された記憶及びLTPを示すことを証明した。更に、PScDKOマウスは、その後の神経変性に寄与する可能性のある大脳皮質におけるCBPレベル及びCRE依存性遺伝子発現の減少を示した[B15]。更に、最近の研究は、野生型(WT)のPS1が、CBP及びp300の転写能力を刺激し、一方PS1のAD関連変異体(M146L)は、この効果を持たないことを証明している[B18、B47]。これらの実験において、WTのPS1に対する反応が、CBPアセチルトランスフェラーゼ領域を含有するCBPの721−1679領域を含有する構築物と共に観察された[B18]。更に、CBP減少及びヒストンの脱アセチル化がニューロン死中に起こり、これが一次皮質ニューロン中のAPP指向性抗体によって誘発されることが示された[B48]。
[00138]記憶機能障害に関する過程の新たな観点は、脳損傷のいずれもの他の臨床徴候
の非存在において起こる初期の健忘性症状の繊細さ及び変動性は、少なくとも部分的にAβによって産生された単一のシナプスの機能の個別の変化のためであることができることを示す[B11、B27−29]。
特徴づけられる初期の導入期の後の遺伝子発現に依存することを示している(総括に対して、[B30]を参照されたい)。更に最近になって、記憶関連遺伝子及び長期シナプス可塑性の微細な調節は、後成的因子に関係することが見いだされている[B6]。実際、DNAのメチル化及びヒストンの翻訳後修飾のような後成的修飾は、DNAの翻訳領域と相互作用するポリメラーゼの能力に、DNA配列自体を変化することなく深く影響する。従って、後成的機構の調節解除が、ADのような認知性疾患によって特徴づけられる疾病の病変形成に寄与する、記憶関連遺伝子の発現及びシナプス可塑性の破壊[B6]に導くことができることは驚くことではないものである。
]。長期記憶(LTM)の形成は、遺伝子転写[B3]、新しいタンパク質の合成[B4]及びシナプスの構造の変化[B5]に依存する。更に、LTMにおける遺伝子発現の適切な調節は、エピジェネティクスによって調節される[B6]。エピジェネティクスは、遺伝子発現を、DNA又はその関連タンパク質を、ヒストンの修飾及びDNAのメチル化のような過程によって、DNA配列自体を変化することなく‘マーキング’することによって変化する機構として定義される[B7]。ヒストンタンパク質のN末端尾部は、転写的に活性な又は転写的にサイレントなクロマチンの状態間の移行を指示することができる、ヒストンのアセチル化、ユビキチン化、SUMO化、リン酸化、シトルリン化、ADP−リボシル化、及びメチル化のような翻訳後修飾を受けることが知られている[B7]。従って、これらの機構の一つの調節解除が、記憶関連遺伝子発現の破壊及び認知障害に導くことができることは驚くことではない。
プラーク及び細胞内神経原線維タングルによって特徴づけられる。ADは、恐らく少なくとも部分的にAβによって産生されるシナプスの疾患として始まる(Selkoe,D.J.Alzheimer’s disease is a synaptic failure.Science(New York,N.7298,789−791(2002))。学習及び記憶、並びに記憶転写因子CREBのリン酸化の根底にあると考えられる、シナプス可塑性の生理学的相関である長期増強(LTP)におけるAβ誘導の減少は、酸化窒素(NO)ドナー及びcGMP類似体によって回復される(Puzzo,D.,et al.Amyloid−beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP−responsive element−binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity.J Neurosci 25,6887−6897(2005))。その逆に、NO−シンターゼ2(NOS2)は、変異されたアミロイド前駆体タンパク質(APP)を発現するマウス中のAD表現型の悪化をもたらすこともまた真である(Colton,C.A.,et al.NO synthase 2(NOS2)deletion promotes multiple pathologies in a mouse model of Alzheimer’s disease.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103,12867−12872(2006))。これらの発見は、NO経路の上方制御が、ADにおいて保護的であることができることを示す。
初期段階は、記憶障害に導くシナプスの機能障害につながると考えられる。これに関連して、β−アミロイド(Aβ)は、記憶[A1、A2]及びその細胞モデルの長期増強(L
PT)[A3−A8]を阻害することが見いだされている。Aβは、その変異体の形態が家族性AD(FAD)[A9]に関係することが見いだされているアミロイド前駆体タンパク質(APP)である大きい前駆体タンパク質のタンパク質分解産物である。その後、二つのAD関連遺伝子のプレセニリン1(PS1)及びプレセニリン2(PS2)[A10、A11]が、同様にFADに関係することが見いだされた[A12]。プレセニリンは、APPを開裂し、そしてAβ42ペプチドを産生することの原因であるγ−セクレターゼ複合体の一部である[A13]。
維タングル(NFT)によって神経病理学的に特徴づけられる。SPは、主としてAβ凝縮物を含んでなる。NFTの主要成分は、微小管結合タンパク質tauである。臨床的には、ADは、認知機能障害によって特徴づけられ、そして時間をかけて脳の大きい領域に漸進的に関係するシナプスの疾患として始まる[S1]。シナプスの機能障害に関係する過程の新しい観点は、脳損傷のいずれもの他の臨床徴候の非存在において起こる初期の健忘性症状の繊細さ及び変動性は、少なくとも部分的にAβによって産生された単一のシナプスの機能の個別の変化のためであることができることを示す[S5、S7、S10、S11]。
よって表される。シナプスの変化は、臨床的認知症の重篤度に高度に相関し[S1、S2]、一方、老年性プラーク及び神経原線維タングルのような他の重要な可変要素は、より少ない程度に関係する[S1]。ADにおけるシナプスの変化の重要性は、ADの遺伝子導入(Tg)マウスモデル[S3]、並びに切片及びin vivoの両方におけるアミロイド−β(Aβ)の適用後に障害された学習及び記憶(L&M)の広く研究された細胞モデル[S4]の長期増強(LTP)の研究によって確認されている[S3、S5−S12]。Aβは、LTPを顕著に阻害することが見いだされている。ヒトAβを産生するTgマウスを使用する電気生理学的研究は、海馬における基底シナプス伝達及び/又はLTPの有意な欠損をしばしば明らかにしている[S23−S30]。
れることが知られている。エピジェネティクスは、遺伝子発現を、DNA又はその関連タンパク質を、DNAのメチル化及びヒストンの修飾のような過程によって、DNA配列自体を変化することなく‘マーキング’することによって変化する機構として定義される[A14]。例えば、アセチル又はメチル官能基の付加或いは除去によるヒストンの修飾は、DNA中に含有される情報が、転写因子にとって多かれ少なかれ接近可能であるようにするために、クロマチン構造が開く又は閉じることを起こす。従って、後成的機構の一つの調節解除が、記憶関連遺伝子の発現の破壊に導くことができることは驚くことではない。ADにおけるシナプス及び記憶機能障害の根底にある機構の研究は、転写因子CREB(CRE結合タンパク質)及び活性化補助因子CREB結合タンパク質(CBP)の中心的役割りを示している。
いる二つの遺伝子である官能性プレセニリン1(PS1)及びプレセニリン2(PS2)を欠損するマウス[B15]において減少される[B16、B17]。更に、野生型(WT)PS1は、CBP転写能力を刺激し、一方、PS1(M146L)変異は、この効果を持たない[B18]。
て、CREBリン酸化を向上する薬物は、LTP及び記憶を回復することを示した[A5、A15−A17]。CBPのヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性の調節解除は、記憶関連遺伝子の発現を破壊する[A18]。更に、脳のCBPレベルは、官能性PS1及びPS2欠損マウスにおいて減少する[A19]。更に、野生型(WT)PS1は、CBP転写能力を刺激し、一方、PS1(M146L)変異は、この効果を持たない[A20]。
シナプス可塑性並びに学習及び記憶までの脳の生理の各種の段階における重要なメッセンジャー分子として確立されている。ADの研究において、NOは、神経系のAβ誘導の損傷に対する保護効果を有することが見いだされている[S38−S40]。交感神経ニューロン及び海馬ニューロンであるPC12細胞に対して行われた研究は、NO発生装置のS−ニトロソペニシラミンによる治療は、ニトロシル化によるアポトーシス促進因子カスパーゼ2の阻害のために、神経保護的効果を発揮し[S39]、一方、N−ニトロ−L−アルギニンメチルエステルによるNO合成の阻害は、Aβ誘導の神経毒性に対して保護しないことを示している。Aβは、NMDA受容体シグナル伝達を減少する[S38]か、NO−合成(NOS)に対するNADPHの使用可能性を差引く[S41]か、又はセリン−トレオニンキナーゼAktのリン酸化を阻害する[S42]ことによってNO発生を障害することが見いだされている。更に、i−NOSの削除は、APPマウスのAD病態を向上する[S43]。従って、NO−カスケードを向上する薬物は、ADに対して有益な効果を有する[S44]。
このガスは、これが大量に産生された場合、更に神経病理学及び細胞死の主要な薬剤ともみなされている。大量のNOは、Aβ誘導の細胞死における酸化及びニトロソ化のストレスの原因である有意な量の過酸化亜硝酸の発生に導く[S45−S51]。事実、ニューロン及び内皮のアイソフォームのn−NOS及びe−NOSの両方を含むNOSの恒常的形態による少量のNOの放出は、シナプス可塑性及び学習を促進し、一方、誘導型のNOS(i−NOS)による大量のガスの制御されない産生は、過酸化亜硝酸の産生による酸化及びニトロソ化のストレスを促進する[S45−S51]。従って、可塑性及び記憶を遮断するNOカスケードのAβ誘導の下方制御及び細胞死に導く過酸化亜硝酸の発生の両方は、ADにおいて役割を演じることができる。これらの発見を開発する薬物探求の現時点の状態は、NOカスケードを上方制御し、そして従って神経保護を発揮するための方法、並びに神経病理を制約するために過酸化亜硝酸の毒性効果を遮断するための方法を見出すことの両方に焦点が当てられている[S52]。
[00151]何れもの商業的に入手可能なHAT活性化剤は、CNSの慢性疾患、例えば神
経変性疾患(AD、パーキンソン病、ハンチントン病のような)において、或いは癌に対して投与のために必要な特徴を有するように開発されていない。従って、幾つかの態様において、本発明は、神経変性疾患(AD、ハンチントン病、パーキンソン病、他のAβの蓄積に関連する神経変性疾患又は高いレベルの封入体によって特徴づけられる疾病のような)の治療のための薬剤又は化合物を同定するための方法を提供し、これは、CNS疾患を治療するために最適化された薬剤又は化合物を、CNS疾患を治療するために最適化さ
れた化合物とする一つ又はそれより多い特徴を有することに基づき選択することを含んでなる。例えば、特徴は:約100nMより多くないEC50;in vitroのヒストンのアセチル化活性;BBBを透過する能力;又はこれらの組合せ含んでなることができる。一つの態様において、HAT活性化剤化合物は、図3に示すYF2である。
ないが、高い封入体に伴う症状の治療、(例えば、Aβ、アルファ−シヌクレイン、リポフスチン、開裂したTARDBP−TDP−43、及び/又はTauタンパク質蓄積に伴う症状)のための薬剤又は化合物を同定又は設計するための方法を提供し、ここで、先に記述した一つ又はそれより多い特徴を満足するために、及び/又は本明細書中に記載される各種の生物検定の強度に適合するために調節された薬剤又は化合物を同定及び/又は設計するために、コンピューター補助医薬品化学的方法が使用される。
きる化合物を同定するための方法を提供する。本発明は、異常に高いアミロイドベータプラーク、又は高いTauタンパク質レベル、又は高いアルファ−シヌクレインレベル、又は封入体、或いはリポフスチンレベル又は封入体、或いは開裂したTARDBP−TDP−43レベル又は封入体、或いは開裂したTARDBP−TDP−43封入体の蓄積を示す患者を治療するために使用することができる化合物を同定するための方法を提供する。更に、本発明は、アルツハイマー病、レビー小体認知症、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、ハンチントン病、パーキンソン病、及び癌の治療のために使用することができる化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、HATポリペプチド分子に結合する及び/又はHATポリペプチドの生物学的活性、或いはその発現を活性化又は向上することができる試験化合物又は薬剤(例えば、ペプチド(抗体又はその断片のような)、小分子、核酸(siRNA又はアンチセンスRNAのような)、又は他の薬剤)の同定を含んでなることができる。一つの態様において、化合物は、HAT活性化剤(例えば式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、又は(VI)を有するHAT活性化剤化合物である。もう一つの態様において、HAT活性化剤化合物は、図3に示すYF2である。
発現の変化を指す。例えば、調節は、セクレターゼタンパク質分子の、タンパク質の活性、結合特性、或いは他の生物学的、機能的、又は免疫学的特性の増加又は減少を起こすことができる。
ェラーゼタンパク質に結合するHATタンパク質のペプチド断片であることができる。例えば、HAT活性化剤分子は、配列番号:1、3、又は5の少なくとも約8個の連蔵したアミノ酸のいずれもの部分を包含することができる。断片は、少なくとも約10個のアミノ酸、少なくとも約20個のアミノ酸、少なくとも約30個のアミノ酸、少なくとも約40個のアミノ酸、少なくとも約50個のアミノ酸、少なくとも約60個のアミノ酸、又は少なくとも約75個の配列番号:1、3、又は5のアミノ酸を含んでなることができる。一つの態様において、ペプチド断片は、GCN5、GCN5L、HATl、又はPCAFのようなHATタンパク質に向けられる。
ヒトHAT1のヌクレオチド配列を配列番号:2に示す。HAT1に関する配列情報は、遺伝子銀行寄託番号NM_003642(mRNAに対して)及びNP_003633(タンパク質に対して)によって、公共のデータベース中で入手可能である。HAT1は、更にKAT1(K(リシン)アセチルトランスフェラーゼ1)としても知られる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、B型ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(H
AT)であり、これは、新しく合成される細胞質ヒストンの急速アセチル化に関係し、これは次に、新生DNA鎖上への新規な沈積のために核中に移入される。ヒストン、特にヒストンH4のアセチル化は、複製依存性クロマチンの構築において重要な役割を演じる。
するヒト野生型アミノ酸配列である:
応するヒト野生型ヌクレオチド配列であり、ここにおいて、下線を引いたATGは、翻訳領域の開始点を意味する:
。ヒトPCAFのヌクレオチド配列を、配列番号:4に示す。PCAFに関連する配列情報は、遺伝子銀行寄託番号NM_003884(mRNAに対して)及びNP_0038
75(タンパク質に対して)によって、公共のデータベース中で入手可能である。PCAFは、更にKAT2B(K(リシン)アセチルトランスフェラーゼ2B)としても知られる。CBP及びp300は、c−jun及びアデノウイルス癌腫瘍タンパク質E1Aを含む細胞増殖及び/又は分化に関係する多くの配列特異的因子に結合する大きい核タンパク質である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、p300/CBPに関係する。これは、CBP及びp300とのin vutro及びin vivo結合活性を有し、そしてp300/CBP中の結合部位に対してE1Aと競合する。これは、コアヒストン及びヌクレオソームコア粒子とのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し、このタンパク質が、転写調節において直接的役割りを演じることを示す。
するヒト野生型アミノ酸配列である:
応するヒト野生型ヌクレオチド配列であり、ここにおいて、下線の引かれたATGは、翻訳領域の開始点を意味する:
す。ヒトGCN5Lのヌクレオチド配列を、配列番号:6に示す。GNC5Lに関連する配列情報は、遺伝子銀行寄託番号NM_021078(mRNAに対して)及びNP_066564.2(タンパク質に対して)によって、公共のデータベース中で入手可能である。GCN5Lは、更にKAT2A(K(リシン)アセチルトランスフェラーゼ2A)としても知られる。KAT2A、又はGCN5は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)であり、これは、主として転写活性化剤として機能する。これは、更にHAT−非依存性な様式でNF−カッパ−BのサブユニットRELAのユビキチン化を促進することによって、NF−カッパ−Bのリプレッサーとして機能する(Mao et al.,Genes Dev.2009 Apr 1;23(7):849−61)。
応するヒト野生型アミノ酸配列である:
対応するヒト野生型ヌクレオチド配列である:
長さのアミノ酸、例えば、約10ないし100アミノ酸間の長さ、約15ないし100アミノ酸間の長さ、約20ないし100アミノ酸間の長さ、約35ないし100アミノ酸間の長さ、約40ないし100アミノ酸間の長さ、約50ないし100アミノ酸間の長さ、約70ないし100アミノ酸間の長さ、約75ないし100アミノ酸間の長さ、又は約80ないし100アミノ酸間の長さを含む。これらのペプチド断片は、商業的に入手可能であるか、或いは液相又は固相合成法によって合成される(Atherton et al,(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach.IRL Press,Oxford,England)。HATペプチド断片は、天然の供給源から単離されるか、遺伝子操作されるか、
又は化学的に調製することができる。これらの方法は、当技術において公知である。
1のようなヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素に向けられる、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、等)、又はその結合性断片のようなタンパク質であることができる。抗体の断片は、全長の形態以外の抗体の形態であることができ、そして操作された抗体断片に加えて、全長の抗体内に存在する部分又は成分を含む。抗体の断片は、制約されるものではないが、一本鎖Fv(scFv)、二重特異性抗体、Fv、及び(Fab’)2、三重特異性抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、四重特異性抗体、二感応性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域、等を含むことができる(Maynard et al.,(2000)Ann.
Rev.Biomed.Eng.2:339−76;Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9:395−402を参照されたい)。抗体は、商
業的に、注文産生、又は当技術において確立された方法による興味ある抗体を合成することにより得ることができる(Janeway et al,(2001)Immunobiology,5th ed.,Garland Publishing)。
HAT遺伝子(例えば、GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1)の発現を有効に調節することができる。阻害剤は:siRNA、干渉性RNA又はRNAi;dsRNA;RNAポリメラーゼIII転写DNA;リボソーム;及びRNA、DNA、又は人工核酸であることができるアンチセンス核酸からなる群から選択される。
リゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を、標的mRNAに結合することによって直接遮断し、そしてタンパク質の翻訳を防止するために作用する。例えば、少なくとも約15個の塩基の、そしてHATポリペプチドをコードするDNA配列の独特な領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、慣用的なリン酸ジエステル化技術によって合成することができる(Dallas et al,(2006)Med.Sci.Monit.12(4):RA67−74;Kalota et al.,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:173−96;Lutzelburger et al,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:243−59)。
基対を含有し、そして細胞内に発現した標的遺伝子又はRNAと同一の又は殆ど同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含んでなる。アンチセンスヌクレオチド配列は、制約されるものではないが:モルホリノ、2’−O−メチルポリヌクレオチド、DNA、RNA等を含む。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーターのようなプロモーターを含有する。これらのDNAは、siRNAとして機能することができる細胞中の小さいヘアピンRNA、又はアンチセンスRNAとして機能することができる直鎖RNAを産生するために転写することができる。HAT活性化剤化合物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又は標的RNA及び/又は遺伝子が阻害されるようないずれもの適した組合せを含有することができる。更に、これらの形態の核酸は、一本、二本、三本、又は四本鎖であることができる(例えば、Bass(2001)Nature,411,428 429;Elbashir et al,(2001)Nature,411,494 498;及びPCT出願公開WO00/44895、WO01/36646、WO99/32619、WO00/01846、WO01/29058、WO99/07409、WO00/44914を参照されたい)。
CAF、又はHAT1のようなヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素に結合し、そしてその機能を破壊する小分子であることができる。小分子は、一般的に低分子量を有する合成及び天然の物質の多様な群である。これらは、天然の供給源(例えば、植物、真菌、微生物等)から単離するか、商業的に入手するか、及び/又はライブラリー又はコレクションとして使用可能であるか、或いは合成することができる。HATタンパク質と相互作用する候補の小分子は、コンピュータースクリーニング又はコンビナトリアルライブラリーの高容量(HTP)スクリーニングによって同定することができる。アスピリン、ペニシリン、及び多くの化学療法剤のような最も慣用的な医薬品は、小分子であり、商業的に入社可能であり、化学的に合成することができ、又は以下に記載するような無作為又はコンビナトリアルライブラリーから得ることができる(Werner et al,(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic 5(l):32−6)。
ンアセチルトランスフェラーゼファミリー(GNATファミリー、MYSTファミリー又はGCN5ファミリーのような[Lee and Owrkman(2007)Nat Rev Mol Cell Biol,8(4):284−95,Marmorstein(2001)J Molec Biol.311:433−444;及びKimura
et al,(2005)J Biocehm.138(6):647−662を参照されたい])の他のタンパク質との配列の類似性は、興味あるタンパク質の阻害剤又はアンタゴニストに関する情報を提供することができる。アンタゴニストの同定及び選別は、タンパク質の構造的特徴を、例えば、X線結晶学、中性子回折法、核磁気共鳴分光法、及び構造決定のための他に技術を使用して決定することによって更に容易にすることができる。これらの技術は、タンパク質のアゴニストに加えて、アンタゴニストの合理的な設計又は同定を提供する。
するための方法を提供する。本発明は、例えば、異常に高いアミロイドベータプラーク、又は高いTauタンパク質レベル、又は高いアルファ−シヌクレインレベル、又は封入体、或いはリポフスチンレベル又は封入体、或いは開裂したTARDBP−TDP−43レベル又は封入体、或いは開裂したTARDBP/TDP−43封入体の蓄積、或いはこれらの組合せを示す患者を治療するために使用することができる化合物を同定するための方法を提供する。一つの態様において、この方法は、一つ又はそれより多い次の特徴:(a)化合物のEC50が約1000nMより多くないこと;(b)化合物が血液脳関門を透過すること;(c)化合物がヒストンのアセチル化を向上すること(例えばヒストンタンパク質H3又はH4をアセチル化すること)、又はこれらの組合せ、を含んでなるHAT活性化剤化合物を選択することを含んでなる。更なる態様において、化合物、例えばHAT活性化剤は、少なくとも約0.1nM、少なくとも約1nM、少なくとも約5nM、少なくとも約10nM、少なくとも約25nM、少なくとも約50nM、少なくとも約100nM、少なくとも約200nM、少なくとも約300nM、少なくとも約400nM、少なくとも約500nM、少なくとも約600nM、少なくとも約700nM、少なくとも約800nM、又は少なくとも約900nMのEC50を有する。幾つかの態様において、HAT活性化剤化合物は、血液脳関門を透過するために、約500Daより少ない分子質量を有することができる。他の態様において、HAT活性化剤化合物は、血液脳関門を透過するために、約90Å2より小さい極性表面積を有することができ、そして8個又はそれより少ない水素結合を有しなければならない。化合物の同定及び選別は、コンピュータースクリーニング、分子ドッキング、in vivoスクリーニング、in vitroスクリーニング、又はこれらの組合せを含んでなることができる。
ライブラリーから選別することができる(Wang et al,(2007)Curr
Med Chem,14(2):133−55;Mannhold(2006)Curr Top Med Chem,6(10):1031−47;及びHensen(2006)Curr Med Chem 13(4):361−76を参照されたい)。サッカリド、ペプチド、及び核酸ベース化合物の無作為及び指向性合成のために、多くの手段が現時点で使用されている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,N.J.)、Brandon Associates(Merrimack,N.H.)、及びMicrosource(New Milford,Conn.)から商業的に入手可能である。稀化合物ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee,Wis.)から入手可能である。別に、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーは、例えば、Pan Laboratories(Bothell,Wash.)又はMycoSearch(N.C.)から入手可能であるか、又は容易に製造可能である。更に、天然に及び合成的に製造されたライブラリー並びに化合物は、慣用的な化学的、物理的、及び生化学的手段によって容易に修飾される(Blondelle et al.,(1996)Tib Tech 14:60)。
して多くのライブラリーは、商業的に入手可能である。本発明において興味のあるライブラリーは、ペプチドライブラリー、無作為化オリゴヌクレオチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリー、等を含む。縮退ペプチドライブラリーは、溶液中で、細菌鞭毛ペプチドディスプレイライブラリーとして、又はファージディスプレイライブラリーとして不動化された形態で容易に調製することができる。ペプチドのリガンドは、少なくとも一つのアミノ酸を含有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択することができる。ライブラリーは、ペプトイド及び非ペプチド合成分子から合成することができる。このようなライブラリーは、更に天然に存在する対応物と比較して酵素的分解を受けにくい非ペプチド合成分子を含有して合成することができる。ライブラリーは、更に、制約されるものではないが、例えば、プラスミド上のペプチドライブラリー、ポリソームライブラリー、アプタマーライブラリー、合成ペプチドライブラリー、合成小分子ライブラリー、神経伝達物質ライブラリー、及び化合物ライブラリーを含むことを意味する。ライブラリーは、更に、本明細書中に記載される一つ又はそれより多い官能基で置換された環式炭素又は複素環式構造及び/又は芳香族又は多環芳香族構造を含んでなることができる。
ができる。小さい有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、一つ又はそれより多い多様性の点で互いに異なり、そして多工程法を使用する有機技術によって合成される、密接に関連する類似体の収集である。コンビナトリアルライブラリーは、莫大な数の小さい有機化合物を含む。コンビナトリアルライブラリーの一つの型は、化合物のアレイを製造するために並行合成法によって調製される。化合物のアレイは、デカルト座標の空間的住所によって同定可能であり、そしてそれぞれの化合物が共通の分子コア及び一つ又はそれより多い可変構造の多様性要素を有するように配列された化合物の収集であることができる。このような化合物アレイ中の化合物は、別個の反応容器中で並行して製造され、それぞれの化合物は、その空間住所によって同定及び追跡される。並行合成混合物の例及び並行合成の方法は、1994年1月5日に出願された米国特許出願08/177,497及びその対応する1995年7月13日に公開されたPCT特許出願公開WO95/18972、並びに1998年1月27日に付与された米国特許第5,712,171号及び死の対応するPCT特許出願公開WO96/22529中に提供され、これらは、本明細書中に参考文献として援用される。
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、PCT出願公開WO91/05058;及びMattheakis et al,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022−9026中に記載されているものを含む。
ドライブラリー(例えば、Bunin et al,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708−4712を参照されたい)は、選別することができる。Simon et al,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367−9371によって記載されているようなペプトイドライブラリーも、更に使用することができる。ペプチド中のアミド官能基が化学的に転換されたコンビナトリアルライブラリーを作成するために過メチル化されている、使用することができるライブラリーのもう一つの例は、Ostresh et al.(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11138−11142によって記載されている。
ような当技術において既知の方法によって決定することができ、これは、完全な分子構造を決定することができる。固相又は液相NMRを、ある種の分子間距離を決定するために使用することができる。構造決定のいずれもの他の実験方法を、部分的又は完全な幾何構造を得るために使用することができる。幾何構造は、天然及び人工の複合リガンドで測定することができ、これは、決定される活性部位構造の精度を増加することができる。一つの態様において、GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のようなHATタンパク質に結合する化合物は:(1)試験化合物の電子ライブラリーを準備し;(2)HAT
タンパク質のアセチルトランスフェラーゼ活性部位(HAT領域)に対する少なくとも20個のアミノ酸残基に対するPDBエントリー番号1YGH又は2RC4に記載された原子座標を準備し、ここにおいて、この座標は、コンピューターによって読取り可能なフォーマット中に、約2Åより大きくない少なくも50%のCα原子に対するその自乗平均平方根の偏差を有し;(3)原子座標をコンピューターのプロセッサーによって読取り可能な電気シグナルに転換して、HATタンパク質の三次元モデルを作成し;(4)データプロセシング法を行い、ここにおいて、ライブラリーからの電子試験化合物が、HATタンパク質に三次元モデルに結合することを確認し;そしてどの試験化合物がHATタンパク質の三次元モデルの活性部位に適合するかを決定し、これによってどの化合物がHATタンパク質に結合するものであるかを同定することができる。もう一つの態様において、この方法は、更に:HATタンパク質の活性部位に結合することが決定された化合物を合成又は入手し;HATタンパク質を化合物と結合のために適した条件下で接触させ;そして化合物がHATタンパク質の発現又はmRNAの発現を調節するか否か、或いはHATタンパク質活性を診断アッセイを使用して決定すること、を含んでなる。
方法は、当技術において既知であり、そして従って、当業者は既知の方法によってアンタゴニストとして機能する変種を設計することができる。このような方法の一つの例は、Dahiyat and Mayo in Science(1997)278:82 87によって記載され、これは、新規なタンパク質の設計を記載している。この方法は、ペプチド配列の一部のみを変更するために、既知のタンパク質に適用することができる。同様に、Blake(米国特許第5,565,325号)は、同様な又は修飾された機能を伴う変種を予測し、そして合成するための既知のリガンド構造の使用を教示している。
て既知である。例えば、分子インプリンティングは、分子に結合するペプチドのようなマクロ分子構造の新規な構築のために使用することができる。例えば、Kenneth J.Shea,Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites,TRIP Vol.2,No.5,May 1994;Mosbach,(1994)Trends in Biochem.Sci,19(9);及びWulff,G.,in Polymeric Reagents and Catalysts(Ford,W.T.,Ed.)ACS Symposium Series No.308,pp 186−230,American Chemical Society(1986)を参照されたい。HATタンパク質の模倣体を調製するための一つの方法は:(i)所望の活性を示す既知の基質(テンプレート)の周囲の反応性モノマーの重合;(ii)テンプレート分子の除去;そして次いで(iii)テンプレートによって残された空隙中のモノマーの第2群の重合の工程を含んで、テンプレートのそれと同様である一つ又はそれより多い所望の特性を示す新し分子を提供する。多糖、ヌクレオシド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、炭化水素、糖タンパク質、ステロイド、脂質、及び他の生物学的に活性な物質のような他の結合分子も、更に調製することができる。この方法は、これらが反応性モノマーのフリーラジカル重合によって調製され、非生分解性骨格を持つ化合物をもたらすために、その天然の対応物より安定である各種の生物学的模倣体を設計するために有用である。このような分子を設計するための他の方法は、例えば、多くの化合物の合成及び評価並びに分子のモデル化を必要とする、構造活性的関係に基づく薬物設計を含む。
vivo及びin vitroの方法を提供する。一つの態様において、この方法は:(
a)HATタンパク質(GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のような)を発現する組織及び/又は細胞を入手し;(b)組織及び/又は細胞をリガンド供給源と有効な時間接触させ;(c)二次メッセンジャー反応を測定し、ここにおいて、反応はHATタンパク質へのリガンド結合の表示であり;(d)リガンドをリガンド供給源から単離し;そして(e)HATタンパク質を結合するリガンドの構造を同定し、これによってどの化合物がHATタンパク質に結合するものであるか同定すること、を含んでなる。本明細書中で使用する場合、用語“リガンド供給源”は、本明細書中に記載したいずれもの化合物ライブラリー、又はHATタンパク質(GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のような)のアンタゴニストとして作用するものである化合物を選別するために使用することができる神経伝達物質のライブラリーであることができる。In vivoの動物研究及び機能アッセイと組合せた本明細書中に記載した化合物ライブラリー[更に本明細書中に参考文献としてその全てが援用される米国特許出願公開2005/0009163を参照されたい]を選別することは、ADのような異常なAβ沈積に罹った患者を治療するために、又は癌を治療するために使用することができるHAT活性化剤化合物を同定するために使用することができる。
T分子(例えば、GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1)の活性及び/又は発現を増加する化合物であることができる。HAT活性化剤化合物は、HATタンパク質の活性に対するその効果を、発現によって、転写後修飾によって、又は他の手段によって発揮する化合物であることができる。一つの態様において、HAT活性化剤化合物は、HATタンパク質又はmRNAの発現、或いはアセチルトランスフェラーゼ活性を、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約99%、又は100%増加することができる。
合する、及び/又はHAT分子の活性又は発現に対する刺激性効果を有する試験化合物又は薬剤は、各種のアッセイによって同定することができる。アッセイは、HATタンパク質の活性部位への試験化合物又は既知のHATリガンドの結合の直接的又は間接的測定を含んでなる結合アッセイであることができる。アッセイは、更に、HAT分子の活性の直接的及び間接的測定を含んでなる活性アッセイであることもできる。アッセイは、更に、HATのmRNA又はタンパク質の発現の直接的及び間接的測定を含んでなる発現アッセイであることもできる。各種の選別アッセイは、制約されるものではないが、AD又はハンチントン病のような神経変性疾患のための動物モデル中の認知及びシナプス機能に対する試験化合物の効果を測定することを含んでなるin vivoアッセイと組合せることができる。
を含むことができる。例えば、HAT分子の発現の阻害剤は、HAT陽性細胞又は組織を試験化合物と接触させ、そして細胞中のHATタンパク質又はHATのmRNAの発現を決定することによって同定することができる。試験化合物の存在中のHAT分子のタンパク質又はmRNA発現レベルは、試験化合物の非存在中のHATタンパク質のタンパク質又はmRNAの発現レベルと比較される。次いで、試験化合物を、この比較に基づいてHATタンパク質(GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のような)の発現の阻害剤として同定することができる。HAT分子の発現の活性化剤は、更に、HAT陽性細胞又は組織を試験化合物と接触させ、そして細胞中のHTAタンパク質又はHATのmRNAの発現を決定することによって同定することもできる。試験化合物の存在中のHAT分子のタンパク質又はmRNA発現レベルを、試験化合物の非存在中のHATタンパク質
のタンパク質又はmRNA発現レベルと比較する。次いで、試験化合物を、この比較に基づいて、HATタンパク質(GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のような)の発現の活性化剤として同定することができる。例えば、HATタンパク質又はmRNAの発現が、試験化合物の存在中で、その非存在中より統計的に又は有意に多い場合、化合物は、HATタンパク質又はmRNAの発現の活性化剤として同定される。言い換えれば、試験化合物は、更に、HAT活性化剤化合物(アゴニストのような)であると言うことができる。細胞中のHATタンパク質又はmRNAの発現レベルは、本明細書中に記載される方法によって決定することができる。
ルタイム二分子相互作用分析(BIA)[McConnell,(1992);Sjolander,(1991)]を使用して達成することができる。BIAは、相互作用物質(例えば、BIA−coreTM)のいずれかを標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である。光学的現象の表面プラズモン共鳴法(SPR)の変化を、生物学的分子間のリアルタイムの反応の表示として使用することができる。
[00189]本発明は、GCN5、GCN5L、PCAF、又はHAT1のようなHAT活
性化剤タンパク質に結合する化合物を提供する。これらの化合物は、本明細書中に記載される選別法及びアッセイによって同定することができ、そしてHAT活性化剤タンパク質の活性又は発現を向上する。一つの態様において、本発明は、以下の式(I):
R1は、H、又はCF3であり;
R2は、H、Cl、又はCNであり;
R3は、H、O−メチル、O−エチル、S−エチル、O−シクロペンチル、OCH2CH2N(CH3)2、又はCH2CH2CH2N(CH3)2であり;
R4は、H;C(=O)NH−フェニルであり、ここにおいて、フェニルは一つ又はそれより多いハロ或いはCF3で置換されている;
R5は、H、C1−C5−アルキル、OH、OCH3、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2、CH2CH2CH2N(CH3)2、SCH2CH2N(CH3)2、又はOCH2C(=O)O−アルキルであり;
R6は、H、O−メチル、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2であり;そして
Xは、CONH、SONH、SO2NH、NHC(=O)NH、又はNHCOである。
態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、H、Cl、又はCNであり;
R3は、H、O−(C1−C2)−アルキル、O−(C3−C6)−シクロアルキル、
O−(C1−C2)−アルキル−CO2−(C1−C2)−アルキル、又はS−(C1−C2)−アルキルであり;
R4は、Hであり;
R5は、H、(C1−C6)−アルキル、OH、OCH2CH2N(CH3)2、S−(C1−C2)−アルキル、又はSCH2CH2N(CH3)2であり;
R6は、H、又はOCH2CH2N(CH3)2であり;そして
X=SO2NH、CONH、NHCO、又はNHCONH、である。
[00192]幾つかの態様において、式(I)の化合物は、以下の式:
[00193]式(I)の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物のもう一つ
の態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、Clであり;
R3は、H、O−(C1−C2)−アルキル、O−(C3−C6)−シクロアルキル、又はO−(C1−C2)−アルキル−CO2−(C1−C2)−アルキルであり;
R4は、Hであり;
R5は、H、(C1−C6)−アルキル、OH、OCH2CH2N(CH3)2、S−(C1−C2)−アルキル、又はSCH2CH2N(CH3)2であり;
R6は、H、又はOCH2CH2N(CH3)2であり;そして
Xは、SO2NH、CONH、NHCO、又はNHCONHである。
[00195]幾つかの態様において、化合物は、以下の式:
[00196]式(I)の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物の更なる
態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、H、又はCNであり;
R3は、S−(C1−C2)−アルキル、又はOCH2CH2N(CH3)2であり;
R4は、Hであり;
R5は、H、又は(C1−C4)−アルキルであり;
R6は、Hであり;そして
Xは、CONHである。
[00198]式(I)の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物の幾つか
の態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、Clであり;
R3は、H、O−(C1−C2)−アルキル、OCH2CH2N(CH3)2、又はCH2CH2CH2N(CH3)2であり;
R4は、H;C(O)NH−(3−CF3,4−Cl−フェニル)であり;
R5は、H、O−(C1−C2)−アルキル、OCH2CH2N(CH3)2、又はCH2CH2CH2N(CH3)2であり;
R6は、H、又はO−(C1−C2)−アルキルであり;そして
X=CONHである。
[00200]式(I)の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物の一つの
態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、Clであり;
R3は、O−(C1−C2)−アルキルであり;
R4は、Hであり;
R5は、OCH2CH2N(CH3)2であり;そして
Xは、CONHである。
つの態様において、
R1は、CF3であり;
R2は、Clであり;
R3は、H、O−(C1−C2)−アルキルであり;
R4は、Hであり;
R5は、SCH2CH2N(CH3)2であり;
R6は、Hであり;そして
X=SO2NHである。
R7は、H又はCF3であり;
R8は、O−エチル又はS−メチルであり;
R9は、ブチル又はOCH2CH2N(CH3)2であり;
Yは、C−Cl、C−CN、C−NO2、又はNであり;
Wは、CH又はNであり;そして
Zは、CH又はNである。
[00204]一つの態様において、本発明は、ここにおいて以下の式(III):
R10は、CF3であり;
R11は、CNであり;そして
R12は、O−エチルある。
[00206]式中:
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−、又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
の態様において、XはSであり、一方Yは、N−C=Oである。
[00208]具体的な態様において、化合物は、以下の式:
[00209]一つの態様において、HAT活性化剤化合物のYF2は、図29に示すスキー
ムによって合成することができる。式Iを有するHAT活性化剤化合物の他の類似体は、同様に合成することができる。
によって合成することができる。
[00211]一つの態様において、HAT活性化剤化合物の11は、図39に示すスキーム
によって合成することができる。
によって合成することができる。
[00213]一つの態様において、HAT活性化剤化合物の13は、図42に示すスキーム
によって合成することができる。
によって合成することができる。
[00215]一つの態様において、HAT活性化剤化合物の15は、図43に示すスキーム
によって合成することができる。
によって合成することができる。
[00217]一つの態様において、HAT活性化剤化合物の17は、図45に示すスキーム
によって合成することができる。
によって合成することができる。
[00219]一つの態様において、HAT活性化剤化合物の19は、図51に示すスキーム
によって合成することができる。
によって合成することができる。
[00221]一つの態様において、本発明は、以下の式(V):
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
AR1は、5員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
AR2は、5員の芳香族環、6員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
の態様において、XはSであり、一方Yは、N−C=Oである。
[00223]特別な態様において、式(V)の化合物は、以下の式:
[00224]本発明の化合物は、一般的に、図29に示した図に基づくスキームによって合
成することができる。
“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.,66(1):1−19(Jan.1977)]中に記載されているものから選択することができる。一つの態様において、式(I)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(I)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。一つの態様において、式(II)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(II)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。一つの態様において、式(III)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(III)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。一つの態様において、式(IV)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(IV)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。一つの態様において、式(V)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(V)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。
を有するHAT活性化剤化合物のいずれか一つを投与することによる、神経変性疾患(例えばAD、ハンチントン病、又はパーキンソン病)に罹った患者における封入体(例えば、アミロイドベータ(Aβ)タンパク質沈着物、天然の及びリン酸化されたTauタンパク質、天然の及びリン酸化されたアルファ−シヌクレイン、リポフスチン、開裂されたTARDBP(TDB−43)、又はこれらの組合せ)を減少するための方法を提供する。本発明は、更に、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、又は式(V)を有するHAT活性化剤化合物のいずれか一つを投与することによる、患者の神経変性疾患を治療するための方法を提供する。本発明は、更に、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、又は式(V)を有するHAT活性化剤化合物のいずれか一つを投与することによる、患者の癌を治療するための方法を提供する。幾つかの態様において、患者に投与される化合物は、化合物1−9のいずれか一つである。具体的な態様において、HAT活性化剤化合物は、図3に示すYF2である。幾つかの態様において、投与される化合物は、以下の式(VI):
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は−C(O)R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、−NR5であり;
R5は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキル、C(O)R7であり;そして
R7は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
塩、例えば塩酸、硫酸、又はリン酸塩である。もう一つの態様において、式(VI)の化合物の医薬的に受容可能な塩は、塩基付加塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はアンモニウム塩である。もう一つの態様において、塩基付加塩は、テトラフルオロボロ塩である。
式(V)、又は式(VI)を有するHAT活性化剤化合物は、先ず次の特徴:約100nMより大きくないEC50;in vitroのヒストンアセチル化活性;BBBを透過する能力;又はこれらの組合せ、の一つ又はそれより多くを満足するその能力に対して選別される。
量の組成物を患者に投与することを含んでなる。もう一つの態様において、患者は、異常に高いアミロイドベータプラーク、又は高いTauタンパク質レベル、又はアルファ−シヌクレインの蓄積、又はリポフスチンの蓄積、又は開裂したTARDBP(TDP−43)レベルの蓄積、或いはこれらの組合せを示す。幾つかの態様において、Aβタンパク質沈着物は、Aβ40異性体、Aβ42異性体、又はこれらの組合せを含んでなる。更なる態様において、患者は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、封入体筋炎、ハンチントン病、パーキンソン病、又は脳アミロイド血管症に罹っている。更なる態様において、患者は、癌に罹っている。
ドベータ(Aβ)タンパク質沈着物、天然の及びリン酸化されたTauタンパク質、天然の及びリン酸化されたアルファ−シヌクレイン、リポフスチン、開裂されたTARDBP(TDB−43)、又はこれらの組合せ)を減少する、又は患者の記憶の損失を減少するような神経変性疾患の症状の回復をもたらすために十分な、組成物の治療的に有効な量で
あることができる。例えば、患者の封入体又は記憶の損失の少なくとも約25%の減少、少なくとも約30%の減少、少なくとも約40%の減少、少なくとも約50%の減少、少なくとも約60%の減少、少なくとも約70%の減少、少なくとも約80%の減少、少なくとも約85%の減少、少なくとも約90%の減少、少なくとも約95%の減少、少なくとも約97%の減少、少なくとも約98%の減少、又は100%の減少を観察することは、神経変性疾患(例えば、制約されるものではないが、AD、ハンチントン病、パーキンソン病を含む)の症状の回復の表示である。この封入体の出現を減少することにおける効力は、例えば神経変性疾患の症状を回復することの基準であることができる。
重、少なくとも約0.25mg/kg体重、少なくとも約0.5mg/kg体重、少なくとも約0.75mg/kg体重、少なくとも約1mg/kg体重、少なくとも約2mg/kg体重、少なくとも約3mg/kg体重、少なくとも約4mg/kg体重、少なくとも約5mg/kg体重、少なくとも約6mg/kg体重、少なくとも約7mg/kg体重、少なくとも約8mg/kg体重、少なくとも約9mg/kg体重、少なくとも約10mg/kg体重、少なくとも約15mg/kg体重、少なくとも約20mg/kg体重、少なくとも約25mg/kg体重、少なくとも約30mg/kg体重、少なくとも約40mg/kg体重、少なくとも約50mg/kg体重、少なくとも約75mg/kg体重、少なくとも約100mg/kg体重、少なくとも約200mg/kg体重、少なくとも約250mg/kg体重、少なくとも約300mg/kg体重、少なくとも約3500mg/kg体重、少なくとも約400mg/kg体重、少なくとも約450mg/kg体重、少なくとも約500mg/kg体重、少なくとも約550mg/kg体重、少なくとも約600mg/kg体重、少なくとも約650mg/kg体重、少なくとも約700mg/kg体重、少なくとも約750mg/kg体重、少なくとも約800mg/kg体重、少なくとも約900mg/kg体重、又は少なくとも約1000mg/kg体重である。
することができる。別の方法として、本発明のHAT活性化剤化合物は、それを必要とする患者に、毎日一回又は二回、約2ないし約28日間、又は約7ないし約10日間、或いは約7ないし約15日間投与することができる。これは、更に患者に毎日一回又は二回、1期間を毎年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12回、またはその組み合わせで投与することもできる。
;活性成分の投与の時間;受容者の年齢、性別、健康状態及び体重;症状の性質及び程度;同時治療の種類、治療の頻度及び所望の効果;並びに排出の速度のような既知の因子によって変化することができる。
例えばLD50(集団の50%に対して致死量である投与量)及びED50(集団の50%において治療的に有効である投与量)を決定する標準的な医薬的方法によって決定することができる。毒性及び治療効果間の投与量の比は、治療指数であり、そしてこれは、LD50/ED50比として表示することができる。大きい治療指数を示す治療剤は、有用である。ある程度の毒性側の効果を示す治療組成物を使用することができる。
の因子に依存することができる。HAT活性化剤化合物、例えば式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)の化合物の投与量(等)は、例えば、治療される患者又は試料の正体、大きさ、及び症状によって、更に、適用可能な場合、それによって組成物が投与される経路、及び医師が、HAT活性剤化合物がHATタン
パク質又はタンパク質に対して本質的なHAT活性を示すことを有することを所望する効果によって変化することができる。これらの量は、当業者によって容易に決定することができる。
ことができる。このような組成物は、HAT活性化剤化合物(例えば、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、又は式(VI)を有するHAT活性化剤化合物の化合物、或いは図3に示した化合物YF2)及び医薬的に受容可能な担体を含んでなることができる。組成物は、単独で、又は安定化化合物のような少なくとも一つの他の薬剤との組合せで投与することができ、これは、制約されるものではないが、生理食塩水、緩衝された生理食塩水、デキストロース、及び水を含むいずれもの滅菌の生体適合性医薬担体中で投与することができる。組成物は、単独で、或いは他の薬剤、薬物又はホルモンとの組み合わせで患者に投与することができる。
もの、そして全ての溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、等を含んでなることができる。医薬的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術において公知である。活性化合物と適合性であるいずれもの慣用的な媒体又は薬剤を、使用することができる。補充活性化合物も、更に組成物中に組入れることができる。
、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はヒトのような哺乳動物を含むこのような治療を必要とするいずれもの患者に適用することができる。
れる。投与の経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜、及び直腸投与を含む。非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、次の成分:注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような滅菌希釈剤;ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗細菌剤;アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウムのような抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤;酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストリンのような等張性の調節のための薬剤を含むことができる。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックのアンプル、使い捨てシリンジ又は多数回投与バイアル中に封入することができる。
分散物及び滅菌注射用溶液又は分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適した担体は、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EMTM(BASF,Parsippany,N.J.)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。全ての場合、組成物は、滅菌でなければならず、そして容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールのような医薬的に受容可能なポリオール、及びこれらの適した混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆の使用によって、分散物の場合、必要な粒子の大きさを維持することによって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメ
ロサールによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを、組成物中に含むことは有用であることができる。注射用組成物の延長吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによって行うことができる。
明細書中に列挙される成分の一つ又は組合せと共に、必要に応じて組入れ、続いて濾過によって滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散物は、活性化合物を基本的分散媒体、及び本明細書中に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ベヒクル中に組込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、有用な調製法の例は、活性成分プラスいずれもの更なる所望の成分の粉末を、事前に滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥及び冷凍乾燥である。
ンカプセル中に封入するか、又は錠剤に圧縮することができる。経口の治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と組合され、そして錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、更に口腔洗浄剤として使用するために流体の担体を使用して調製することもでき、ここにおいて、流体担体中の化合物は、経口的に適用適用され、そしてうがいをされ、そして吐き出すか又は飲み込まれる。
て含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、次の成分又は同様な性質の化合物:微結晶セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンのような結合剤;デンプン又はラクトースのような賦形剤、アルギニン酸、プリモゲル(Primogel)、又はコーンスターチのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウム又はsterotesのような潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤;スクロース又はサッカリンのような甘味剤;或いはペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ芳香剤のような芳香剤のいずれかを含有することができる。
経皮投与のために、透過される関門に対して適当な浸透剤を製剤中に使用することができる。このような浸透剤は、一般的に当技術において既知であり、そして例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔噴霧又は座薬の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、一般的に当技術において既知であるように、軟膏、蝋膏、ゲル、又はクリーム中に処方される。
下の実施例は、本発明を製造し、そして実施する例示的様式を例示する。然しながら、本発明の範囲は、これらの実施例中に開示される具体的な態様に制約されるものではなく、これらは、同様な結果を得るために別の方法を使用することができるため、例示のみの目的である。
[00247]本発明のヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性化剤であるYF
2(図3)は、神経変性疾患(即ち、アルツハイマー病及びハンチントン病)の記憶を回復する、そして各種の癌に対する治療のための良好な薬物候補である。YF2化合物がマウスに投与(i.p.)された場合、ウェスタンブロットは、これが、BBBを通過するだけでなく、更に海馬のヒストン3アセチル化レベルを増加すること(図1)を示した。行動実験において、表題化合物は、Aβ42注入マウスにおける状況的恐怖記憶欠損を回復する(図2)。Aβ42は、ADにおいて大量に生産されるタンパク質であり、そしてシナプス機能及び記憶の障害の原因である。
[00248]Mantelingu等からの化合物6Jを合成した(図4)。然しながら、
化合物6Jは、溶解性を持たず、そしてこれをH2Oに入れるとすぐに沈殿した。然しながら、薬物が(100%DMSOに溶解したとしても)、これが投与されるとすぐに沈殿するものである懸念が存在した。従って、可溶性であった新しい化合物、“MOM”を合成した。
MをWTマウスに25mg/kg投与(i.p.)した。マウスの肝臓及び海馬を治療の1時間後抽出した。肝臓は、AcH3の非常に僅かな増加を示し、薬物が、非常に僅かな効力を、又は非常に僅かな膜透過性を有するかのいずれかであることを示した(図6)。海馬は、AcH3レベルの増加はなく、薬物が、無効であるか、又は血液脳関門(BBB)を通過しないかのいずれかであることを示した(図6)。MOMは、海馬及び肝臓中のAcH3レベルを増加することに失敗したが、実験を新しい投与(強制飼養及びi.p.で25mg/kg)で繰返した。その後、マウスの恐怖条件づけ処置を行って、学習の導入後、薬物が活性であるか否かを見た。マウスの肝臓及び海馬に加えて、マウスの皮質を更に抽出した。海馬、皮質、及び肝臓の試料は、再びAcH3の増加を示さず、薬物が、無効であるか又はBBBを通過しないか或いは細胞膜を通過しないかのいずれかであることを示した(図7)。
DMSO及び10%Tween80)で実験を繰り返した。背部海馬に植込んだカニューレによってこれを与えることによって、BBBをバイパスした。海馬及び皮質の両方を治療後2時間及び4時間後に抽出した。ベヒクルと比較して、カニューレによってMOMを投与された(片側当たり100μg/μl)マウスは、AcH4の増加を示した(レーン1対レーン2、3)。薬物をi.p.で与えられたマウスは、AcH3の増加を示さなかった(図8)。このデータは、化合物MOMが、BBBを通過しないことを示す。
して二相:透明及び油状は、目に見えた。その後、YF2(50mg/kg、i.p.)を、マウスに投与した。その投与の2及び4時間後、マウスを犠牲にし、そして海馬を抽出した。興味あることに、YF2は、BBBを通過することが可能であり、細胞を透過し、そしてAcH3を増加した(レーン1対レーン9、10)(図8)。化合物は100%純粋ではなく、そして更なる精製/検証が必要であったが、本出願人等は、更にYF2を合成し、そしてそれを精製した。純度は、核磁気共鳴(NMR)によって検証した。マウスにYF2(i.p.生理食塩水中に溶解)を5、10、20mg/kgで投与した。海馬抽出物を、三つの異なった時点で(治療の0.5、1及び2時間後)製造した。次いで本出願人等は、AcH3に対してウェスタンブロットを行った。YF2の1時間−10mg/kg投与を除き、YF2は、AcH3レベルを劇的に増加し(図10)、YF2がBBB及び細胞膜を通過したことを示した。
[00252]状況的及び手懸り付き恐怖条件づけを、化合物がアミロイド−ベータ(Aβ)
誘導の記憶欠損を回復することが可能であるか否かを評価するために行った。Aβは、アルツハイマー病において上昇されるペプチドである。海馬は、状況的記憶及びアルツハイマー病において重要な役割を演じる。この種類の認知試験は、訓練及び試験に多くの日数を必要とする他の行動課題よりはるかに速い[Q1、Q2]。本出願人等の条件づけ部屋は、遮音箱中にあった。透明なプレキシガラスの窓が、実験者がマウスの行動を三脚上に置かれ、そしてFreezeframeソフトウェア(MED Ass.Inc.)に接続されたカメラで撮影することを可能にした。バックグラウンドのホワイトノイズ(72dB)を得るために、一台のコンピューターファンを遮音室の片側に設置した。条件づけ部屋は、36本の棒の絶縁されたショックグリッドの床を有していた。床は除去可能であり、そしてそれぞれの実験患者後、本出願人等は75%エタノールで、そして次いで水で洗浄した。一度に一匹のみのマウスが、実験部屋にいた。
0秒間2800Hz及び85dBで継続される音響)の開始の2分前に条件づけ部屋に入
れた。CSの最後の2秒に、マウスに0.8mAの2秒間の脚部ショック(US)を床の棒を通して与えた。CS/USの対の後、マウスを更に30秒間条件づけ部屋に残し、そして次いでそのホームケージに戻した。呼吸によって必要とされるものを除く全ての動きの非存在として定義される竦み行動を、Freezeviewソフトウェアを使用して採点した。
部屋で、訓練後5分間(連続的に)測定した。手懸り付き恐怖学習を評価するために、状況的試験に続いて、マウスを新規な状況(滑らかな平らな床を持つ三角のケージ)中に2分間入れ(前−CS試験)、その後、彼らを3分間CSに暴露し(CS試験)、そして竦みを測定した。ショックの知覚性認知を、閾値評価によって決定した。一連の一回の脚部ショックを、恐怖条件づけのために使用した同じ感電させるグリッド上に置かれたマウスに供給した。最初、0.1mVのショックを1秒間供給し、そしてマウスの行動を、尻込み、跳躍、及び発声に対して評価した。30秒間隔で、ショックの強度を0.1mVずつ0.7mV迄増加し、そして次いで0mVまで、0.1mV減分で30秒間隔で戻した。発声、尻込み、そして次いで跳躍に対する閾値を、それぞれにマウスに対して、それぞれのマウスの脚部ショックに対する行動反応を示すショック強度を平均することによって定量化した。
を電気ショックの2時間前に投与され、一方他の群は、5mg/kgを電気ショックの30分前に投与された)。両方の投与量のYF2は、化合物が、状況的記憶の障害を救済することを証明する竦み時間を劇的に増加することが可能であった。最高の濃度(20mg/kg)の単独の化合物は、状況的記憶に影響せず(図10)、化合物自体は記憶に関して毒性ではないことを示した。手懸り付きの記憶は、異なった群において変化せず、YF2が扁桃体機能に影響しないことを示した(図11)。最後に、本出願人等が、ベヒクル、単独のYF2、単独のAβ、又はYF2プラスAβの存在中の知覚性閾値を評価した実験の異なった組合せ中の異なったマウスの群間に差は観察されなかった(図12)。
点を検証するために、血液中のYF2の動態を決定することに決めた。この目的のために、本出願人等は、化合物(20mg/kg、i.p.)を投与し、そして次いで異なった時点で尾部から血液を試料採取した。YF2の動態は、概略注射の30分後にピークを示す(図13)。
[00258]課題は、モーリス水迷路(MWM)及び放射状アーム陸迷路の複合型である。
この課題は、Aβ注入マウスにおいて変更された。マウスに対する動機づけは水中の浸漬である。マウスは、中心部から放射状に広がる6個のアレイ(アーム)中を、部屋に置か
れた目に見える手懸りに基づいてアームの一つの末端の隠された(沈んだ)プラットフォームを見つけるまで泳ぐ必要があった。目的のアームは、学習基準が2日中に達成されるように、一連の試行に異なった出発アームを伴う全ての試行に対して一定に保たれた。プロトコルの最初の日は、訓練日であった。目的のアームを見える及び隠されたプラットフォーム間で変更することによって、プラットフォームの位置を同定するように、マウスを訓練した。1日目の最後の三回の試行及び二日目の全ての15回の試行は、目的のアームの位置を同定するために空間的手懸りを使用するようにマウスを強制するために隠れた逃避プラットフォームを使用した。
果であることができる疲労を回避するために、4匹のコホートのマウスを試験し、そして毎日の3時間の試験時間をかける15回の訓練の試行を通して異なったコホートに変更することによる間隔を置いた実行の訓練を確立した。一日目に、目に見えるプラットフォームを目的の位置に置いた。コホート1のマウス1を、一番目の出発アーム(採点表に規定された)の壁の周囲に近いプール中に静かに入れ、そしてプールの中心に向けた。不正なアームへの進入(プラットフォームのないアームへの進入)の回数を数えた。マウスが不正なアームに進入した場合、これは出発アームに静かに引き戻された。それぞれの試行は、1分まで継続した。15秒後のアームの選択の失敗を、誤りとして数え、そしてマウスを出発アームに戻した。1分後、プラットフォームを見つけられなかった場合、マウスを手をその後ろにおくことによって、これをプラットフォームに向けて水中を静かに案内した。マウスは、プラットフォーム上で15秒間休憩した。試行を完了した後、マウスをプールから出し、穏やかにタオルで拭き、そして加熱ランプ下のそのケージに戻した。目的のプラットフォームの位置は、それぞれのマウスに対して異なっていた。
行った後、プラットフォームを見えるものから隠されたものに取り換えた。コホート1からのそれぞれのマウスが、見える及び隠されたプラットフォームの6回の交互の試行を完了した後、マウスを加熱源下で休憩するままにし、そして第2のコホートのマウスを同じ方法で試験した。6回の交互の試行を完了した後、コホート2のマウスをそのケージに戻して、休憩させた。
位置を交互に使用して試行7−12を完了した。第1のコホートのマウスの休憩時間中に、第2のコホートのマウスが試行7−12を完了した。この時点で、全てのマウスが3回の隠されたプラットフォームの試行を行った。二日目、隠されたプラットフォームのみを使用する全ての15回の試行に対して、一日目と同じ方法を繰返した。データ解析のために、それぞれのマウスの平均を、3回の試行のブロックを使用して計算した。図14に示すように、ベヒクルで治療されたマウスは、二日目の終りに近い3回の試行にわたって約1回の誤りを示した。
積中の200nM;それぞれの試験日に対し二回:1回目試行の15分前(試験の1番目の群に対して)及び7回目試行の15分前(試験の2番目の群に対して)背部海馬中に]は、学習に失敗し、訓練期間中3−4回の誤りを起こし、試行を通して改善がなかった。YF2による治療[(i.p.、5mg/kg、1回目試行の30分前(試験の1番目の群に対して)及び7回目試行の30分前(試験の2番目の群に対して)]は、Aβ誘導の記憶障害を救済した。更に、YF2それ自体は、この種類の試験に伴うマウスの能力に影響しない。二日間のRAWMによる試験の結果に影響することができるマウスの知覚、運動及び動機的技能の制御は、マウスの四つの異なった群間の見えるプラットフォームに到達するために必要な時間及び泳ぐ速さに、何らの差も示さなかった(図15及び図16)
。
[00263]本出願人等は、最近、トリコスタチンA(TSA)によるヒストンの脱アセチ
ル化の阻害が、APP/PS1マウスと呼ばれる、PS1(M146L、ライン6.2)中の変異を伴うAPP(K670MN671L)中のスウェーデン変異を発現する遺伝子導入(Tg)マウスの、アミロイドを沈積する動物モデル中のLTP及び状況的恐怖条件づけ(FC)を回復することを示した[A21,A22]。更に、CBPのHAT活性は、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するために必須であり、そしてAPP/PS1マウスのCBPレベルは、WTマウスより有意に低かった。APP/PS1マウスからの海馬は、FC訓練後、記憶の形成に重要であることを示すアセチル化であるアセチル化ヒストン4レベルの概略50%の減少を示した[A23]。これらの発見に基づき、そして理論に束縛されることなく、ヒストンアセチル化を含む後成的変化は、ADに伴うシナプス機能及び記憶のAβ誘導の損傷において重要な役割を演じる。
そして記憶関連遺伝子の発現を刺激するために必要である。基底転写装置との相互作用をヒストンのアセチル化を触媒するアセチルトランスフェラーゼ(HAT)として働くことによって容易にする活性化補助因子としての、染色体抑圧の減少及び記憶関連遺伝子の転写における増加を起こすCBPは機能する。HATと異なり、HDACは、ヒストンからアセチル基を除去し、従ってDNAへの転写装置の接近を制限することが見いだされている。興味あることに、HDAC阻害剤は、LPT及びマウスが中性の刺激を有害なものと結合させなければならない連合記憶の形態である状況的恐怖記憶を向上することを示している[A25]。
Aによって逆転され、この群の薬物のルビンシュタイン・テイビ症候群(RTS)中の精神的遅滞に対する治療剤としての潜在的使用を支持する[A24]。HDAC III阻害剤であるニコチンアミドは、ADの三重Tgマウスモデルにおける認知を、Thr321−ホスホtauの減少を含む機構によって回復することが見いだされている[A26]。更に、HDAC阻害剤は、樹状突起の発芽、シナプスの数の増加、並びに復元された学習及びニューロン減少のCK−p25Tgマウスモデル中の長期の記憶への接近を誘導した[A23]。HDAC阻害剤は、後成的及び非後成的変化を含む各種の機構によってニューロン機能に影響することができた[A27]。Aβ上昇後の認知障害が、ヒストンアセチル化(クロマチン再構築によって)の後成的修飾によって誘導することができるか否かは、決定されていない。
変異体は、このような効果を産生せず[A20]、ADのCBP及びそのHAT活性が関係することができることを示した。更に、HAT活性を欠損するCBP変異体は、増加した転写活性化能力に関して、WT−PS1に反応することが可能ではない。従って、CBP及びそのHAT領域は、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するために必須であるように見受けられる。本発明人等は、APP/PS1マウスのヒストンのアセチル化レベルがWTマウスと異なり、従ってADが後成的病因の疾病として同定されることを見出した。
症に導く分子機構は、いまだに未知である。理論に束縛されるものでないが、エピジェネティックス及びヒストンアセチル化は、ADにおいて基本的役割を演じることができる。更に、HDACの阻害、又は逆にHATの活性化は、疾病の進行を効果的に対抗すること
がっできる。
て回復されるか否かを決定すること。
[00269]TASがAPP/PS1マウスのLPT及び状況的学習の減少を救済すること
を示すデータに基づいて、本出願人等は、阻害剤が、更にAβの効果を、APP及びPS1の過剰発現の他の影響から分離するために、Aβ暴露後のこれらの欠損を救済するか否かを決定するものである。
シナプスの疾患として開始すると考えられる[A28]。Aβ誘導のシナプス及び記憶機能障害におけるエピジェネティクスの関与に好ましい証拠を得るために、本出願人等は、HDAC阻害剤のTSAを、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスに対して使用する一連の実験を行った(これらのマウスの特徴を示す実験の詳細な説明については、本出願人等の原稿を参照されたい[A17,A29]。
る[A29]。基礎シナプス伝達(BST)は、APP/PS1及びWTマウス間で同様である。本出願人等は、以前にこの年齢のマウスにおいて示されたように二つの群間でBSTの差を見いだせなかった[A29]。次いで海馬の切片を、TSA(1.65μM)で30分間潅流してから、シャファー側枝経路の高頻度反復刺激によってLPTを誘導した。TSAで治療されたAPP/PS1切片の増強は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1切片におけるものよりはるかに大きかった(図17)。しかし、TSAは、WTマウスの海馬切片中のLPTの振幅を、ベヒクル単独で治療されたWT切片と比較して変化しなかった。更に、TSA潅流は、強縮を受けなかったAPP/PS1及びWT切片中の基線伝達に影響しなかった。
、TSAが、APP/PS1マウスの状況的FCの障害に対して有益であるか否かを決定した[A17]。生後4ヶ月のマウスを、四つの群:TSAを伴うAPP/PS1、ベヒクルを伴うAPP/PS1、TSAを伴うWT及びベヒクルを伴うWTに分けた。TSA及びベヒクル対照溶液を、i.p.で2μg/g体重の濃度で投与した。本出願人等は、各種のマウスの群中で同様なショックの閾値を見出した。次いでマウスを、中性の刺激を有害なものと結合するために訓練した。これらを新規な状況(FC箱)に置き、穏やかな脚部ショックと対になったホワイトノイズの合図に暴露し、そして訓練の2時間前にTSAを注射した。恐怖学習を、状況の提示に反応する竦み行動−呼吸のために必要なものを除くすべての動きの非存在−を測定することによって24時間後評価した。本出願人等は、FCの訓練中の四つの群のマウス間の竦み行動に差を見出さなかった。24時間後、竦み行動は、状況的学習の解析において、ベヒクルで治療されたWT同腹仔と比較して、ベヒクルで治療されたAPP/PS1マウスにおいて減少した(図18)。TSAは、Tgマウスの記憶を改善した。
学的及び行動的発見を、構造的に異なったヒストンデアセチラーゼの阻害剤である酪酸ナトリウム(NaB)を使用して同定するものである。TSA実験に関して、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスからの切片を、NaB(300μM)で30分間治療してから、シータバースト刺激を適用して、LPTを誘導するものである。対照は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1マウス及びNaB又はベヒクルで治療されたWT同腹仔マウスからの切片で行うものである。TSAと同様に、本出願人等は、更に、NaB(1.2g/Kg)が、APP/PS1マウスの正常な状況的恐怖記憶を再確立するか否かを検査する
ものである。
含む異なった機構によって[A30、A31]影響することができる。全長のAPP及びその開裂した産物の輸送及びシグナル伝達特性は、異なっている可能性があり、これらはシナプスの機能の側面に異なって影響することができる。Aβの影響をAPP及びPS1過剰発現の他の影響から分離するために、本出願人等は、Aβ自体が、Tgマウスにおける本出願人等の研究で観察された欠陥の原因であるか否かを決定するものである。ヒトAβの天然のオリゴマーが、モノマー及び原線維の非存在においてLTPをin vivoで顕著に阻害することが既に記載されているために、本出願人等は、200nMのオリゴマーのAβ42を、TSA(1.65μM)と同時に30分間WT切片に、LTPの誘導の前に適用するものである。更に、本出願人等は、状況的恐怖記憶を、FCに対する訓練の15分前の背部海馬への200nMのオリゴマーのAβ42の、TSA(2μgr/gr体重、訓練の2時間前、i.p.)と同時の両側注入によって障害するものである。理論に束縛されるものではないが、オリゴマーのAβ42は、LTP及び恐怖記憶を阻害し、そしてTSAが、Aβ42治療後の正常なLTP及び状況的恐怖記憶を再確立することを証明する筈である。単独のTSAは、何らの効果を持たない筈である。更なる実験において、本出願人等は、LTPを誘導するためのシータバースト刺激の適用の30分前に、NaB(300μM)プラス200nMのAβ42を使用するものである。対照は、ベヒクルで治療された切片で行うものである。TSAと同様に、本出願人等は、更に、NaB(1.2g/Kg)が、Aβ42注入マウスの正常な状況的恐怖記憶を再確立するか否かを検査するものである。総括すれば、これらの実験は、ヒストンアセチラーゼの阻害が、オリゴマーのAβの上昇によって起こされたシナプス及び記憶の機能障害に対して有益であることを証明するものである。
[00276]i)WT−PS1が、HAT活性を欠損するCBP構築物で形質転換されたF
11細胞の転写をもはや促進せず、そしてii)CBPレベルがAPP/PS1マウスにおいて減少するという観察の基づいて、本出願人等は、CBPのHAT活性及びレベルが、APP/PS1マウスにおいて、そしてAβ上昇後に影響されるか否かを決定するものである。
て何らかの役割を有するか否かを、全長のCBPが変異(WY−アミノ酸1503−1504がアラニン及びセリンで置換されている)を含有する構築物を使用することによって試験した。そのHAT活性を完全に無効にするこの変異は[A32]、Gal4のDNA結合領域に連結している(図19)。全長のWT−CBPの向上したプロモーター活性と対照的に、WY−CBPに伴う活性は観察されなかった(図20A)。WT及びWYのGal−CBP間の基礎活性に差はなかった(図20B)。従って、HAT活性を欠損するCBP変異体は、増加された転写活性化能力に関してWT−PS1に反応することが不可能である。従って、CBP及びそのHAT領域は、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するために必須であるように見受けられる。更に、本出願人等は、APP/PS1マウスの内因性CBPレベルを測定することを決定した。
WTの対照と比較して、CBPレベルの有意な減少を明らかにした(図21)。将来の実験において、本出願人等は、これらの結果を複製するものである。別の戦略は、CBP分布(細胞質対核)における変化が、PS1(M146L)の、WT−PS1と比較して過剰な発現後のF11細胞中で観察された与えられた核の画分からのCBPの測定を含むものである[A20]。本出願人等は、更にAPP/PS1マウスにおけるCBPのHAT
活性を基本的条件及び状況的学習のための訓練の1時間後の両方で、そのWT同腹仔と比較して直接測定するものである。対照は、CBPのHAT活性の変化が、新規な状況単独又はこれら間の結合の代わりの電気ショックのためであることを除外するための潜在阻害訓練パラダイムを使用して行われるものである[A25]。潜在阻害パラダイムにおいて、マウスが連合した状況的恐怖記憶の形成を遮断する空間的記憶を形成するものであるように、電気ショックを受ける前に新規な状況にマウスを予備暴露するものである。最後に、本出願人等は、HATアッセイのような実験パラダイムを使用する、海馬に対して新しい蛍光定量的アッセイを使用してHDAC活性を測定するものである。理論によって束縛されるものではないが、これらの実験は、CBP及び/又はHDACが、APP及びPS1導入遺伝子の過剰発現後に変化されるか否かを確立するものである。
、TSAの投与が、CBPレベル及びCBPのHAT活性の変化を救済するものであるか否かを求めるものである。本出願人等は、本明細書中に記載されたものと同じ実験を、APP/PS1マウスから海馬を回収する2時間前のTSA(2μg/g体重;i.p)による治療後に繰り返すものである。ベヒクル及びTSAで治療されたWT同腹仔が対照として役立つ。APP及びPS1過剰発現の影響を、Aβ自体の影響と区別するために、本明細書中に記載された実験(TSAを伴う又はベヒクルのみを伴うCBPレベル、CBP−HAT活性及び全HDAC活性を含む)を、ベヒクル注入マウスと比較するために、WTマウスの背部海馬に注入された200nMのAβ42の存在中で繰返すものである。理論によって束縛されるものではないが、これらに実験は、CBP及び/又はHDACが、Aβ上昇後に変化されるか否かを確立するものである。
[00281]データは、APP/PS1マウスの海馬中のアセチル化されたヒストン4レベ
ルの約50%の減少を示している。将来の実験において、本出願人等は、更に転写及び記憶において重要な役割を演じるヒストン2B及び3に対する本出願人等の調査を拡大するものである[A23−A25]。本出願人等は、最後に、Aβ上昇がヒストンアセチル化に影響するか否かを検査するものである。
腹仔と比較して、後成的影響か否かを試験するものである。ヒストン2B、3及び4のアセチル化は、転写及び記憶において重要な役割を演じることが示された[A23−A25]。WT及びAPP/PS1マウスからの海馬中のH4のアセチル化を測定した。ベヒクル対照溶液を、i.p.でFC訓練の2時間前に投与した。状況的FCの1時間後、APP/PS1及びWTマウスを安楽死させ、そして海馬を抽出した。ウェスタンブロット分析は、WTマウスと比較して、APP/PS1マウスがアセチル化されたヒストン4レベルの50%より多い全体的減少を有することを証明した(図22)。HDAC阻害が、APP/PS1マウスにおいて観察されたヒストン4のアセチルレベルの障害を救済することができるか否かも更に試験した。TSA(2μg/g体重;i.p)の状況的恐怖条件づけの2時間前の注射は、APP/PS1マウスのH4アセチル化を向上した(図22)。理論によって束縛されるものではないが、ADは、後成的モチーフを伴う疾病である可能性があり、そしてHDAC阻害剤は、ADマウスモデルのヒストン4の減少したレベルを上昇することができる。
びに制御を、本明細書中に記載される潜在阻害パラダイムを使用して測定するものである。更に、本出願人等は、本出願人等の研究を、生後4ヶ月のAPP/PS1及びWT同腹仔の海馬中のそのアセチル化を、基本条件及びFCのための訓練後の両方に、TSAを伴い又は伴わずヒストン4に対して測定することによって、ヒストン2B及び3に拡大する
ものである。対照は、更に本明細書中に記載される潜在阻害訓練パラダイムを使用して行われるものである。最後に、本出願人等は、これらの発見を、ヒストンデアセチラーゼの構造的に異なった阻害剤のNaBを使用して同定するものである。TSA実験に関して、本出願人等は、NaB(1.2g/Kg)が、APP/PS1マウスの正常なヒストン/類のアセチル化レベルを再確立するか否かを検査するものである。
異なったヒストンのアセチル化レベルの測定に関して本明細書中に記載された実験を、ベヒクル注入のマウスと比較するために、WTマウスの背部海馬に注入された200nMのオリゴマーのAβ42の存在中で繰返すものである。理論によって束縛されるものではないが、オリゴマーのAβ42は、ヒストン4のアセチル化レベルに影響するものである。残りのヒストンアセチル化レベルは、遺伝子導入(Tg)マウスからの発見と一致する筈である。更なる実験は、NaBで行われるものである。TSA実験に関して、本出願人等は、NaB(1.2g/Kg)が、APP/PS1マウスの正常なヒストン/類のアセチル化レベルを再確立するか否かを検査するものである。理論によって束縛されるものではないが、これらに実験は、減少したヒストンアセチル化のような後成的変化が、ADに伴うシナプス機能及び記憶のAβ誘導の損傷において重要な役割を演じることを証明するものである。
[00286]動物: 二重Tgマウスを、APP及びPS1マウスを交雑することによって
得るものである(PCRによって遺伝子型が同定された)[A29]。Aβ実験のために本出願人等は、C57B16マウスを使用するものである。
merican Peptides Co)から、記載されているように[A33,A34]調製されるものである。
れているように[A5]インターフェースチャンバー中に29℃で90分間維持するものである。簡単には、CA1のfEPSPは、CA1の放射状層に刺激及び記録電極を入れることによって記録されるものである。BST評価後、毎分最大誘発反応の約35%の反応を誘発する強度で、15分の基線が記録されるものである。LTPは、θ−バースト刺激(5Hzで繰返されるバーストを伴う100Hzの4回のパルス、及びそれぞれの強縮が15秒離れた3回の10回バーストの繋がりを含む)を使用して誘導されるものである。
CS)(30秒間、2800Hzで85dBの音響)の開始の2分前に、記載されているよう[A17]に入れられるものである。CSの最後の2秒に、マウスに2秒間、0.60mAの脚部ショック(US)を、床の棒によって与えるものである。CS/US対の後、マウスを30秒間条件づけ部屋に残すものであり、そして次いでそのホームケージに戻されるものである。竦み行動は、Freezeviewソフトウェア(MED Ass)を使用して採点されるものである。状況的恐怖学習を評価するために、竦みをマウスが24時間訓練されるものである部屋内で5分間訓練後測定するものである。手懸り付き恐怖学習を評価するために、状況的試験の24時間後、マウスを新規な状況中に2分間置き(前CS試験)、その後、マウスをCSに3分間暴露するものであり(CS試験)、そして竦みを測定するものである。
て決定するものである。
[00291]CBPレベルは、特異的CBP抗体を使用するウェスタンブロットで測定する
ものである。核画分は、7,700×gで1分間遠心された均質な組織から得られたペレット中に含有されるものである。
降によって測定されるものである。単離後、HAT活性は、アセチル残基を検出する間接的酵素結合免疫吸着測定法キットを、製造業者(Upstate)の説明書に従って使用して評価されるものである。
らの蛍光定量キットを、製造業者の説明書によって使用するものである。
[00294]ヒストンアセチル化アッセイのために、ウェスタンブロットを、液体窒素で瞬
間冷凍された海馬から行うものである。核タンパク質は、酸で抽出され、そして変性7%−12%アクリルアミドゲル上で、続いてニトロセルロース上のエレクトロブロッティングで分離されるものである。アセチル化されたヒストン(H3、H2A及びH2B)は、Upstateから購入した抗体及びAmershamのECFキットを、製造業者のプロトコルによって使用して検出するものである。
又は遺伝子型による事後補正を伴うANOVAにより解析されるものである。
[00296]参考文献
[00297]ADに対するCREB及びCBPのリンクに加えて、後成的変化も更にADの
発症に寄与することができる。記憶の形成において重要なアセチル化である[B19]アセチル化ヒストン4の海馬レベルは、恐怖条件づけ訓練後のアミロイドを沈着する動物モデルにおいて顕著に減少される。理論に束縛されるものではないが、ヒストンアセチル化の変化は、ADにおいて重要な役割を演じる。
ル化H4レベルは、野生型の同腹仔より劇的に低く、ヒストンアセチル化の変化が、ADにおける記憶減少に関係することを示した。この観察は、HDAC阻害が、樹状突起の発芽、シナプスの数の増加、及びニューロン減少を伴うCK−p25遺伝子導入マウスにおける復元された学習及びLTMへの接近を誘発するという発見と一致する[B19]。ヒストンアセチル化のレベルは調査されていないが、二つの更なる研究におけるHDAC阻害剤の使用は、勇気づけるものである。HDAC III阻害剤のニコチンアミドは、ADの三重遺伝子導入マウスモデルの認知を、細胞質Thr321−ホスホtauの減少に関係する非後成的機構によって回復することが見いだされた[B49]。然しながら、回答されるべき多くの質問:HDAC阻害剤による治療は、軽度のプラーク負荷を伴う遺伝子導入マウス及び更に深刻なアミロイド沈着を伴うそれの両方におけるヒストンアセチル化、シナプス可塑性、及び記憶の欠損を救済するか?HDAC阻害剤の有益な効果は、参照記憶のような恐怖記憶に加えて他の顕在記憶の他の形態に拡大することができるか?転写及び記憶において重要な役割を演じることが更に知られているヒストンH2B及び3のような他のヒストンは、ADにおける記憶過程中に異常にアセチル化されるか?実験が、Aβ上昇とは独立に、各種の影響を起こすことができる変異APP及びPS1導入遺伝子を過剰発現するマウスに対して行われた場合、ヒストンアセチル化は、Aβ上昇後に影響されるか?ヒストンアセチルトランスフェラーゼCBPは、APP/PS1マウスにおけるヒストンアセチル化の減少及びその後のAβ上昇において役割を演じるか?が残っている。
けるクロマチンの変化が、記憶過程中のAβの上昇後に起こるか否かを考察するものである。理論に束縛されるものではないが、得られた結果は、記憶及びシナプス機能のAβ誘導の障害に対する新しい種類の機構が提供するものである。
害剤の使用、又はNMDAアンタゴニストによるグルタミン酸神経毒性の遮断によるコリン作動性系の増強を含む。これらの薬剤は制約された効力を有する。主要な効果は、炎症及び酸化性損傷と戦う、そしてβ及びγセクレターゼを阻害する又はαセクレターゼを増加する薬剤の使用、或いはAβオリゴマー化を阻害する薬剤の使用、或いは脳からのAβの除去を増強するようなAβによる免疫化のような治療の使用のいずれかによって脳のAβ負荷を減少するタングル形成を阻害することが進行中である。然しながら、正常な生理学的機能におけるAPP、Aβ40及びセクレターゼの役割は、AD治療に対する有効なそして安全な方法を提供することにおける問題が存在することができる。転写装置及びヒストンアセチル化に干渉する薬物は、記憶が属すると考えられるそのシナプスの接触を伴う細胞を、Aβの影響に対して更に頑強で、そして抵抗性にするためのAD治療に対する新しい接近法を表すことができる。
する。 これらの研究を鼓舞する観察は、本出願員らが、HDAC阻害剤のTSAの簡単な適用が、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスからの切片によって示されるLTPの
欠損を救済することが可能であるか否かを試験した一連の実験の結果であった(これらのマウスの特徴を示す実験の詳細な記載に対しては[B50])。この年齢において、遺伝子導入マウスは、シナプス可塑性及び記憶障害を丁度示し始めた[B14,B50])。以前に示されたように[B50]、基礎シナプス伝達(BST)は、APP/PS1及びWTマウス間で同様であった。次いで海馬の切片を、TSA(1.65μM)で30分間潅流してから、シャファー側枝経路の強縮刺激によってLPTを誘導した。TSAで治療されたAPP/PS1切片の増強は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1切片におけるものよりはるかに大きかった(二変数ANOVA:F1,11=13.166、p=0.004;図17)。他方、TSAは、WTマウスからの海馬切片中のLPTの振幅を、ベヒクル単独で治療されたWT切片と比較して変化しなかった(F1,12=0.512、p=0.488、図17)。更に、TSA潅流は、強縮を受けなかったAPP/PS1及びWT切片中の基線伝達に影響しなかった(それぞれの群当たりn=3)。従って、HDAC阻害は、Aβ沈着のAPP/PS1マウスモデルにおけるLTPの欠損を救済することが可能である。
に影響されたヒトと同様に[B51]、APP/PS1マウスは、連合記憶の欠損を示す[B46]。齧歯動物において、連合学習は、状況的恐怖条件づけによって評価することができる。中性刺激の有害なものとの結合に基づくこの行動的課題は、海馬機能に依存する[B52]。従って、シナプス機能障害におけるTSAの急性効果に対する実験後、本出願人等は、TSAが、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスの状況的恐怖条件づけの障害に対して有益であるか否かを決定した[B14]。マウスを、四つの群:TSAを伴うAPP/PS1、ベヒクルを伴うAPP/PS1、TSAを伴うWT及びベヒクルを伴うWTに分けた。TSA及びベヒクル対照溶液を、i.p.で2μg/g体重の濃度で投与した。本出願人等は、各種のマウスの群間で同様なショックの閾値を見出した。次いでマウスを、中性の刺激を有害なものと結合するために訓練した。これらを、新規な状況(恐怖条件づけ箱)に置き、穏やかな脚部ショックと対になったホワイトノイズの合図に暴露し、そして訓練の2時間前にTSAを注射した。恐怖学習を、状況の提示に反応する竦み行動−呼吸によって必要とされるものを除く全ての動きの非存在−を測定することによって24時間後評価した。本出願人等は、恐怖条件づけの訓練中の四つの群のマウス間の竦み行動に差を見出さなかった(F3,47=0.02997、p=0.9929、n=12−13/群;図18)。24時間後、本出願人等は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1マウスにおいて、ベヒクルで治療されたWT同腹仔と比較して、状況的学習の解析において、減少した竦み行動を見出した(F3,47=0.0526、p=0.0280、n=12−13/群;図18)。
WTマウスのそれの約46%であった[ベヒクル治療APP/PS1マウス:14.88±2.97%対ベヒクル治療WT同腹仔:31.68±5.32%;それぞれn=13(メス11匹プラスオス2匹)及びn=13(メス12匹プラスオス2匹);t=2.76、p=0.0109;図18]。然しながら、竦み時間は、APP/PS1マウスにおいて、TSAの投与後、ベヒクルで治療したマウスの約236.27%に増加した[TSA治療APP/PS1マウス:35.15±6.99%、n=12(メス10匹プラスオス2匹);t=2.744、p=0.0116;図18]。統計的解析は、APP/PS1における竦みは、TSAで治療した(t=0.1902、p=0.8508)及びベヒクルで治療したWTマウス(t=0.3982、p=0.6941)の両方に関して有意に異ならないことを明らかにした。TSAで治療したWTマウスは、ベヒクルで治療したWTマウスと比較して竦みの僅かな非有意な増加を示した[TSA治療WTマウス:36.95±6.43%;n=13(メス11匹プラスオス2匹);t=0.6316、p=0.5336、図18]。本出願人等は、次に海馬非依存性課題である[B46]手懸り付
き恐怖条件づけを試験し、そして四つの群間で竦み行動の差を見出さなかった(両方の前CS群において、F3,25=0.8763、p=0.4666、及びCS群においてF3,24=0.6398、p=0.5968)。この結果は、主として手懸り付き条件づけに関係し、そしてAPP/PS1マウスにおいて正常であることが知られた扁桃体の機能が、以前に証明されたように[B53]、TSAによるHDACの阻害によって影響されないことを示す。まとめると、これらのデータは、ヒストンアセチル化の阻害が、APP/PS1マウスにおける正常な連合記憶を再確立することが可能であり、一方更に正常なシナプス可塑性を回復することを示す。
S1遺伝子導入は、Aβによる直接的影響を含む異なった機構[B23、B24]によってニューロン機能に影響することができる。全長のAPP及びその開裂産物は、H4アセチル化に異なって影響することができる。Aβの影響をAPP及びPS1の過剰発現の他の影響と分離するために、本出願人等は、次にAβ自体が、遺伝子導入マウスにおける本出願人等の研究において観察された、H4アセチル化の欠損の原因であるか否かを決定した。ヒトAβの天然のオリゴマーが、in vivoの記憶を顕著に阻害することが既に記載されているため[B54、B55]、本出願人等は、オリゴマーのAβ42含有する製剤(1μlの体積中の200nM、両側的に、1分かけてゆっくり)を、背部海馬に(図24A−B)、恐怖条件づけのための訓練の15分前にTSA又はベヒクルの注射(2mg/kg体重、訓練の2時間前、i.p.)と共に適用した。注入は、背部海馬へのカニューレの植込み後5−7日目に起こった。本出願人等は、恐怖条件づけの訓練期中のマウスの四つの群間で竦み行動の差を見出さなかった(F3,41=0.04188、p=0.9884、n=8−14/群;図24C)。24時間後、竦み行動は、状況的学習の解析において、ベヒクル注入マウスと比較して、Aβ注入マウスにおいて減少した(F3,41=0.04188、p=0.0209、n=8−14/群;図24C)。Aβ注入マウスにおける竦みは、ベヒクル注入マウスのそれの約25%であった[Aβ注入マウス:8.580±2.119%対ベヒクル注入マウス:31.46±5.373% それぞれn=12及びオス11;t=3.147、p=0.0049;図24C]。然しながら、竦み時間は、TSAの注射後のAβ注入マウスにおいて、Aβ注入マウス(TSA+Aβで治療されたマウス:26.17±4.747% n=14オス;t=3.066、p=0.0053;図24)の約300%に増加した。統計的解析は、TSAを注射されたAβ注入マウスにおける竦みが、TSAを注射された(t=0.1902、p=0.8508)及びベヒクルを注入され、ベヒクルを注射された(t=0.3982、p=0.6941)マウスの両方に関して有意に異ならないことを明らかにした。TSAで治療されたマウスは、ベヒクルで治療されたマウスと同様な竦みの量を示した[TSA治療マウス:27.01±7.246%;n=8オス;t=0.4335、p=0.6701、図24C]。本出願人等は、次に手懸り付き恐怖条件づけを試験し、そして四つの群間で竦み行動の差を見出さなかった(両方の、前−CS群において、F3,52=1.547、p=0.2135、及びCS群において、F3,52=0.4838、p=0.6950)。まとめると、これらのデータは、ヒストン脱アセチル化の阻害は、Aβ上昇後の正常な連合記憶を再確立することが可能であることを示す。
た内在性レベルを示す。 HDAC阻害剤が、ヒストン以外の他の分子をアセチル化すること[B49]が知られていることを考慮すると、本出願人等の次の目的は、APP/PS1マウスの恐怖記憶に欠損に対するTSAの影響が、少なくとも部分的に、ヒストンアセチル化のレベルにおけるクロマチンの変化に連結しているか否かを決定することであった。H4のアセチル化は、転写及び記憶において重要な役割を演じることが示された[B19]。従って、本出願人等は、APP/PS1マウスにおいて観察された記憶の欠損が、H4の変化されたアセチル化に伴われるか否かを求めた。本出願人等は、生後3−4ヶ
月の野生型(WT)及びAPP/PS1マウスからの、恐怖条件づけ後の海馬中のH4のアセチル化を測定した。ベヒクル対照溶液をi.p.で訓練の2時間前に投与し、そしてその1時間後にマウスを安楽死させ、そして海馬を抽出した。ウェスタンブロット分析は、WTマウスと比較して、APP/PS1マウスは、アセチル化H4レベルの50%より多い全体的減少を有していたことを示した(t=2.702、p=0.0355;図25A)。興味あることに、交互的実験において、クラスI/IIのHDAC阻害剤のTSAの注射(2mg/kg体重;i.p、恐怖条件づけのための訓練の2時間前)は、APP/PS1マウスのH4アセチル化を向上した(ベヒクルで治療したAPP/PS1同腹仔と比較してt=3.283、p=0.0168;図25A)。更に、TSAで治療されたAPP/PS1マウスからの海馬中のH4アセチル化レベルは、TSAで治療されたWT同腹仔のレベルと同様であった(t=0.2116、p=0.8385;図5A)。最後に、以前に証明されたように[B26]、TSAは、WTマウスのH4アセチル化レベルを、ベヒクルで治療されたWT同腹仔からの海馬と比較して、増加した;図25A)(t=7.659、p=0.0001)。
に、野生型マウスと比較して、何らかの変化があるか否かを決定することを望んだ。従って、本出願人等は、電気ショックを受けない状況に暴露された生後3−4ヶ月のWT及びAPP/PS1マウスからの海馬中のH4のアセチル化を測定した。本出願人等は、二つの実験群間に基礎アセチル化H4の差を見出さなかった(t=0.076、p=0.9427;図25B)。これは、i)変異されたAPP及びPS1導入遺伝子の過剰発現が、状況的恐怖学習後のH4アセチル化のレベルの後成的変化に影響すること;及びii)TSAが、ADのマウスモデルにおけるヒストン4の減少したレベルを上昇することが可能であることを示した。
根底にある機構の研究は、転写因子CREB及び活性化補助因子CBPによって仲介されるCRE依存性遺伝子発現に対する中心的役割を規定している。CBPは、CREB及び基底転写装置間に架橋を作り、そしてヒストンをアセチル化する。次に、ヒストンアセチル化は、染色体の変化を誘導し、染色体の阻止の減少をもたらす(図23参照)。これは、記憶の形成の根底にあるタンパク質の合成のために必要な根底にある遺伝子の好結果な転写を可能にする。本出願人等は、最近CBPのHAT活性が、WT−PS1の刺激効果において、全長のCBPが変異(WY−アミノ酸1503−1504がアラニン及びセリンによって置換されている)を含有する構築物を使用することによって何らかの役割を有するか否かを試験した。そのHAT活性を完全に無効にするこの変異は[B56]、Gal4のDNA結合領域に連結している(図19)。全長のWT−CBPの向上したプロモーター活性と対照的に、WY−CBPに伴う活性は観察されなかった(図20A)。WT及びWYのGal−CBP間の基礎活性に差はなかった(図20B)。従って、これらの発見は、HAT活性を欠損するCBP変異体が、増加された転写活性化能力に関してWT−PS1に反応することが不可能であることを示す。従って、CBP及びそのHAT領域は、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するために必須であるように見受けられる。
次に、APP/PS1マウスの内因性CBPレベルを測定することを決定した。生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスの海馬からのウェスタンブロット分析は、脳のCBPレベルが、感応性PSを欠損するマウスにおいて減少される観察[B15]と一致して、WT対照と比較したCBPレベルの有意な減少を明らかにした(図21)。将来の実験において、本出願人等は、変異されたAPP及びPS1導入遺伝子の過剰発現がCBPレベルに影響することを確実に確立する実験の数を増加するためにこれらの結果を複製するもので
ある。
[00310]1.ヒストン脱アセチル化の阻害が、Aβ上昇後のシナプス及び記憶障害を救
済するか否かを決定すること。
K670MN671L)中のスウェーデン変異を、PS1(M146L、ライン6.2)中の変異[B22]と一緒に発現する遺伝子導入マウスであるAPP/PS1マウスのLTP及び状況的恐怖記憶の欠損を救済する[B20,B21]。本出願人等は、構造的に異なったヒストン−デアセチラーゼの阻害剤の酪酸ナトリウム(NaB)が、シナプス及び記憶欠損を救済するか否かを今や試験するものである。これらの観察が、アミロイドプラークが丁度形成し始める生後4ヶ月のAPP/PS1マウスにおいて得られたことを考慮し、本出願人等は、これらを、更に深刻なAβ沈着物を有する生後7ヶ月の遺伝子導入マウスに拡大するものである。更に、APP及びPS1導入遺伝子がAβによる直接的影響を含む異なった機構によって[B23、B24]ニューロン機能に影響することができることを考慮し、本出願人等は、ヒストン脱アセチル化の阻害が、Aβ自体によって誘導されたLTP及び状況的恐怖記憶の欠損を救済するか否かを調査するものである。本出願人等は、更に、これらの発見を顕在学習のもう一つの形態である参照記憶に拡大するものである。
[00313]原理。 記憶分野の広く受け入れられた概念は、記憶が、シナプス強度の長持
ちする変化として脳中に保存されることである。この概念と一致して、ADは、漸進的により大きいニューロンの機能障害に導き、記憶の減少に導くシナプスの疾患として始まると考えられている[B57]。理論に束縛されるものではないが、HDAC阻害は、アミロイド上昇後のシナプス可塑性及び記憶の障害に対抗する。本出願人等は、TSAに加えて、付加的な、そして構造的に異なった阻害剤であるNaBでこれを試験するものである。次に、APP及びPS1導入遺伝子が、異なった機構によりニューロン機能に影響する[B23、B24]ことができることを考慮し、本出願人等は、Aβ自体が、遺伝子導入マウスに対する本出願人等の研究において観察されたヒストンアセチル化の欠損の原因であるか否かを決定するものである。更に、本出願人等は、本出願人等の発見を、彼らが重度のプラーク負荷を有する場合[B50]、年とったAPP/PS1マウスに拡大するものである。最後に、本出願人等は、本出願人等の発見を、恐怖記憶に加えて、顕在学習のもう一つの形態である参照記憶に拡大するものである。理論に束縛されるものではないが、ヒストン脱アセチル化の阻害は、オリゴマーのAβの上昇によって起こされるシナプス及び記憶の機能障害に対して有益である。
び行動的発見を、構造的に異なった阻害剤であるNaBを使用して確認するものである。TSA実験に関して、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスからの切片を、NaB(300μM)で30分間治療してから、LTPを誘導するためにシータバースト刺激を適用するものである。対照は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1マウス、及びNaB又はベヒクルで治療されたWT同腹仔マウスからの切片で行われるものである。TSAと同様に、本出願人等は、更にNaB(1.2g/Kg)が、APP/PS1マウスにおける正常な状況的恐怖記憶を再確立するか否かを点検するものである。これらの行動実験において、マウスを、四つの群:NaBを伴うAPP/PS1、ベヒクルを伴うAPP/PS1、NaBを伴うWT及びベヒクルを伴うWTに分けた。対照は、更にHDAC阻害剤が、新規な状況単独又はこれら間の結合の代わりの電気ショックの影響によって作用することを除外するための潜在阻害訓練パラダイムを使用して行われるものである[B26]。潜
在阻害パラダイムにおいて、マウスが連合性の状況的恐怖記憶の形成を遮断する空間的記憶を形成するものであるように、電気ショックを受ける前に新規な状況にマウスを予備暴露するものである[B26]。
するものである。本出願人等は、TSAが、オリゴマーのAβ42を含有する製剤によって誘導された状況的恐怖記憶の欠損を救済することを既に証明した(図24参照)。従って、本出願人等は、TSAが、200nMのオリゴマーのAβ42によって誘導されるLTPの欠損を救済するか否かを決定するものである。ヒトAβの天然のオリゴマーが、モノマー及び原線維の非存在において、LTPをin vivoで顕著に阻害することは既に記載されているため、本出願人等は、200nMのオリゴマーのAβ42を、TSA(1.65μM)と同時に30分間WT切片に適用してから、LTPを誘導するものである。交互的な対照実験において、本出願人等は、単独のオリゴマーのAβ42、又は単独のTSA、或いはベヒクルを適用するものである。
200nMのAβ42を30分間、LTPを誘導するためのシータ−バースト刺激を適用する前に使用して複製するものである。対照は、ベヒクルで治療された切片で行われるものである。TSAに関して、本出願人等は、更にNaB(1.2g/Kg)が、Aβ42注入マウスにおける状況的恐怖記憶の欠損を救済するか否かを点検するものである。これらの行動実験において、対照は、更にHDAC阻害剤が、新規な状況単独又はこれら間の結合の代わりの電気ショックの影響によって作用することを除外するための潜在阻害訓練パラダイムを使用して行われるものである[B26]。
ウスで、更に重度のプラーク負荷が存在する場合繰返すものであり、そしてシナプスの機能障害は、更にBSTを含む[B50]。
一つの形態の参照記憶に拡大するものである。本出願人等は、最近、非常に短時間を要する利益を有する方法を実行した[B58]。この方法は、モーリス水迷路及び放射状アーム陸迷路の複合型である。マウスに対する動機づけは水中の浸漬である。マウスは、中心部から放射状に広がる6個のアレイ(アーム)中を、アームの一つの末端の隠された(沈んだ)プラットフォームを見つけるまで泳ぐ必要があった。目的のアームは、学習基準が2日中に達成されるものであるように、一連の試行に異なった出発アームを伴う全ての試行に対して一定に保たれた。不正なアームへの進入の回数は、ものである。課題の終りに、マウスは、視覚、運動及び動機付けの欠損が実験の結果に影響する可能性を排除するために、見えるプラットフォームの試験を行うものである。これらの実験において、生後3−4及び7ヶ月のAPP/PS1並びにWT同腹仔に、TSA又はNaBを、課題を行う2時間前に投与するものである。ベヒクルを対照実験において使用するものである。参照記憶を評価する同様な実験を、更にAβ42注入マウスにおいて行った(これらの実験のために、マウスを次の群:Aβ42注入マウス+TSA又はNaB或いはベヒクル、ベヒクル注入マウス+TSA又はNaB或いはベヒクルに分けるものである)。
び記憶の欠損を救済することを示すものである。さもなければ、別の戦略として、本出願人等は、より高い濃度のHDAC阻害剤を、又は更に血液脳関門を通過することが示されている[B59]MS−275のような構造的に異なったHDAC阻害剤を試みるものである。次いで、齧歯類は、本明細書中に記載したような電気生理学的及び行動的試験を受けるものである。理論に束縛されるものではないが、オリゴマーのAβ42は、LTP及
び恐怖記憶を阻害し、そしてTSAが、Aβ42治療後のLTP及び状況的恐怖記憶を回復することを証明するするものである。単独のTSAは、何ら効果を有しない筈である。若いマウス又はAβ注入マウスからの発見は、生後7ヶ月の遺伝子導入において確認されるべきである。さもなければ、別の戦略として、本出願人等は、試験の1又は4週間前に始まるHDAC阻害剤によるより長い治療を試みるものである。最後に、理論に束縛されるものではないが、参照記憶課題による発見は、恐怖条件づけにより得られたものと一致する筈である。そうであれば、これらの結果は、ヒストン脱セチル化の阻害が、一般的にAD様の動物モデルにおいて認知減少に対して有益であることを証明する筈である。さもなければ、これは、これが異なった種類の記憶及びHDAC阻害剤の使用間の解離を証明するものであるために、同等に興味あることであるものである。
2時間前に起こる増強のために必要ないことを示す[B26]。然しながら、本出願人等は、LTPの導入の直後にTSAの効果を観察した(図17)。この発見は、Levenson等[B26]の結果と一致する。彼らが適用したLTP誘導パラダイムは、誘導又は発現のいずれかに対する転写に依存するLTPの形態を誘導する。これは、転写阻害剤である5,6−ジクロロベンゾイミダゾールリボシド(DRB)をWTマウスにおいて使用することによって証明された。DRBは、TSA誘導のLTP増加の初期及び後期の両方を遮断することが可能であり、TSAによるLTPの初期及び後期の向上の両方が転写調節に依存することを示した[B26]。
に、そして抵抗性にするように見受けられるADの治療の新しい方法である。HDAC阻害剤の使用に関して、HDACの阻害が、遺伝子発現を包括的に変更し、そして従って非特異的様式で記憶過程に影響することができることが批判されている。然しながら、Vecsey等[B53]は、TSAが遺伝子発現を包括的に変更せず、しかし代わりに、記憶固定中の特異的遺伝子の発現が増加することを示した。彼らは、TSAを含むHDAC阻害剤が、記憶及びシナプス可塑性を、主としてCREB転写活性化に依存性である重要な遺伝子の活性化によって向上することを示すことが可能であった[B53]。従って、TSAが、Aβ蓄積の存在中の記憶の低下を停止しすること、並びに生後3ヶ月のAPP/PS1マウスの事例のように、すでに劣化された脳の機能を改善することが可能であることができる可能性がある。興味あることに、HDAC阻害剤を使用する脳の‘再配線’及び記憶の回復は、最近、CK−p25遺伝子導入マウスにおいて報告された[B19]。従って、HDAC阻害剤が、ADの脳にニューロンのネットワークを再確立することが可能であることができることは可能である。これは、AD患者中のHDACを標的とする小分子の使用が、長期の記憶に接近することを容易にすることができることを示す。最小化された副作用を持つHDAC阻害剤は、医薬工業界によって現時点で開発されつつある。これらの新しい阻害剤が、容易に脳に進入することができ、そしてこれらがTSAと同様に有効であるか否かを見ることが残されている。
ロンの機能に影響することができる[B19、B60]。従って、HDACのクラスI/IIのブロックは、非ヒストン基質のアセチル化を増加することができ、これは次に、記憶に伴う細胞の過程の増幅に寄与することができる。Green等[B49]は、クラスIIIのNAD+依存性HDACのビタミンB3を使用する阻害が、三重遺伝子導入マウスの認知欠損を、細胞質中のThr231−ホスホtauの減少に関係する機構によって回復することを示した。
決定すること。
[00324]生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウスからの海馬は、恐怖条件づけ訓練後、
記憶の形成において重要であることが示されているアセチル化である、アセチル化されたヒストン4(H4)レベルの概略50%の減少を示した[B19]。将来の実験において、本出願人等は、これらが更に転写及び記憶において重要な役割を演じる[B19、B25、B26]ために、本出願人等の調査をヒストン2B及び3に拡大するものである。更に、本出願人等は、更に重度のプラーク負荷を持つ年取った遺伝子導入マウスを試験するものである(生後7ヶ月)。最後に、Aβの影響をAPP及びPS1の過剰発現の他の影響から分離するために、本出願人等は、海馬へのAβ注入が、ヒストン2B、3及び4のアセチル化に影響するか否かを検討するものである。
[00326]原理。 変異されたAPP及びPS1導入遺伝子の過剰発現は、状況的恐怖学
習中に起こったH4アセチル化の変化に影響する(図25参照)。更に、TSAによるHDAC阻害は、ADマウスモデルにおけるH4の減少したレベルを、上昇することが可能である。理論に束縛されるものではないが、ヒストンアセチル化のレベルにおける後成的機構は、ADにおける学習及び記憶を障害することができる。学習及び記憶中のアセチル化の変化を受ける更なるヒストンは、H2B及びH3である[B19、B25]。従って、将来の実験において、本出願人等は、これらのヒストンに対する本出願人等の研究を拡大するものである。更に、本出願人等は、構造的に異なったヒストン−デアセチラーゼの阻害剤のNaBを試験するものである。次に、APP及びPS1導入遺伝子がニューロンの機能に異なった機構によって影響することができる[B23、B24]ことを考慮し、本出願人等は、Aβ自体が、本出願人等の遺伝子導入マウスに対する研究において観察されたヒストンアセチル化の欠損の原因であるか否かを決定するものである。最後に、本出願人等は、本出願人等の発見を、年とったAPP/PS1マウスに、これらが重度のプラーク負荷を有する場合、拡大するものである[B50]。
海馬中のH2B及びH3のアセチル化を、基礎条件及び恐怖条件づけのための訓練後の両方で、TSA(2mg/kg体重;i.p、恐怖条件づけのための訓練の2時間前)又はベヒクルを伴ってH4に関して測定するものである。対照は、ヒストン修飾が、新規な状況単独又はこれら間の結合の代わりの電気ショックのためであることを除外するために、潜在阻害訓練パラダイムを使用して行うものである[B26]。犠牲の直後に、脳組織を解剖し、そしてそれぞれのマウスからの二つの海馬を集め、そして後刻の均一化及び分析のために瞬間冷凍するものである。更なる対照は、小脳を使用するものである。
記載されるTSA実験と同じ実験パラダイム及び対照におけるH2B、3及び4のアセチル化を回復することが可能であるか否かを試験するものである。
Aβ42の存在中のH4、2A及び3のアセチル化を、ベヒクル注入マウスと比較して測定するために、本明細書中の実施例6に記載される実験の全てを繰返すものである。対照は、潜在阻害訓練パラダイムを使用して、そして更に小脳を使用して行うものである。
TSA実験に関して、本出願人等は、NaB(1.2g/Kg)が、Aβ42注入マウスの正常なヒストンアセチル化レベルを再確立するか否かを検査するものである。更に、これらの実験のために、対照は、ベヒクル注入マウスで、そして潜在阻害訓練パラダイム、並びに小脳を使用して行うものである。
ンアセチル化のレベルを回復することができるか否かを、更に調査するものである。ADの病態の進行した段階においてHDAC阻害剤を使用する治療的可能性に直接関係するこの問題に対処するために、本出願人等は、本明細書中に記載される実験を、年とったAPP/PS1マウス(7ヶ月)に対して繰返すものである。
レベルに影響するものであり、そしてオリゴマーのAβ42は、ヒストン2B及び3のアセチル化レベルに対して遺伝子導入マウスと同じ効果を生じるものである。さもなければ、本出願人等は、Alzet浸透圧ミニポンプによる、200nMのオリゴマーのAβ42の更に延長した適用(1日、1週間、1ヶ月)を試みるものである。Aβ42を含有する合成製剤の使用に関する問題は、天然の形態のAβを産生する遺伝子導入マウスに使用によって大きく緩和される。H2B及び3に対する研究は、ヒストンアセチル化のレベルにおいて起こる後成的変化の種類の更に完全な概念を提供するものである。最後に、年とったマウスにおける研究は、HDAC阻害剤が、古い疾病の段階において使用することができるか否かを理解することを援助するものである。まとめれば、本明細書中に記載される研究は、Aβ上昇後に起こる事象としての後成的変化を確立することを援助するものである。
チル化のような他のヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、転写を制御することが示された[B7]。例えば、H3 Lys4メチル化及びH3 Lys56アセチル化のような活性遺伝子転写に伴うヒストン修飾は、遺伝子発現に導くことが見いだされた。然し、H3
Lys27メチル化及びH2A Lys119ユビキチン化のような遺伝子転写の不活性化に伴うヒストン修飾は、遺伝子発現抑制を起こすことが見いだされた。マウスにおいてAβ42のオリゴマーの形態への慢性的ニューロンの暴露の結果としてPTMが修飾される。記載される(図24参照)ように、200nMのオリゴマーのAβ42が、WTマウスの背部海馬に注入されるものである。Aβ42注入マウスの海馬を取出し、そしてベヒクル注入マウスのそれと比較されるものである。本出願人等は、質量分光法を、免疫沈降された海馬のH2B、3及び4を使用して実行し、そしてAβ注入マウス及びベヒクル注入マウス間の異なったヒストンPTMを探求するものである。非特異的効果を制御するために、本出願人等は、ADに直接関係しない十分に研究された神経毒のガンマアセチレン性GABAを、本出願人等が注入した三番目の群のマウスを有するものである。次いで本出願人等は、本出願人等のAPP/PS1マウスモデルにおいて幾つかの最も興味あるヒストンのPTMを試験するものである。これらのマウスは、このヒストンのPTMが起こった場合、生後1ヶ月(プラーク形成の前)、2ヶ月(プラークが形成し始める時)、3−4ヶ月(プラーク形成の初期)、及び7ヶ月(プラーク形成の後期)に犠牲にされるものである。理論に束縛されるものではないが、減少したヒストンアセチル化のような後成的変化は、ADに伴うシナプス機能及び記憶のAβ誘導の損傷において重要な役割を演じる可能性がある。
、Aβ上昇後改変されるか否かを決定すること。
[00335]CBPのHAT活性は、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するた
めに必須である。更に、生後3−4ヶ月のAPP/PS1マウス中のCBPレベルは、WTマウスより低いことが見いだされた。将来の実験において、本出願人等は、この観察を、年とった遺伝子導入マウスに対して、そして海馬のAβ注入後に拡大するものである。更に、本出願人等は、CBPのHAT活性が、若い及び年とったの両方のAPP/PS1マウスににおいて、並びにAβ注入後に影響されるか否かを決定するものである。最後に、本出願人等は、最近合成されたHATアゴニストのMOMによるHAT活性の刺激が、
Aβ上昇後のLTP、記憶、及びヒストンアセチル化の欠損を救済するか否かを決定するものである。
[00337]理論。 内因性CBPレベルは、APP/PS1マウスにおいて減少される(
図21参照)。これらのデータは、脳のCBPレベルが機能性PSを欠損するマウスにおいて減少するという観察と一致する[B15]。更に、CBP及びそのHAT領域が、PS1刺激後のin vitroの転写を向上するために必須であるように見受けられることを考慮し(図20参照)、本出願人等は、APP/PS1マウスの基礎条件及び状況的学習のための訓練の1時間後の両方におけるCBPのHAT活性を、WT同腹仔と比較して直接測定するものである。本出願人等が、CBPレベル及び/又はHAT活性の両方の減少を見出した場合、本出願人等は、更にHATアゴニスト[B61]の使用が、状況的恐怖記憶及びヒストンアセチル化の欠損を救済するか否かを検査するものである。次に、APP及びPS1導入遺伝子が、異なった機構によって[B23、B24]ニューロンの機能に影響することができることを考慮し、本出願人等は、Aβ自体が、遺伝子導入マウスにおいて観察されたCBPレベル及び/又は活性の欠損の原因であるか否かを決定するものである。最後に、本出願人等は、本出願人等の発見を年とったAPP/PS1マウスに、これらが重度のプラーク負荷を有した場合、拡大するものである[B50]。まとめれば、CBPレベル及び/又は活性が、Aβ上昇後に変化するか否かに加えて、CBPレベル及び/又は活性が、APP及びPS1導入遺伝子の過剰発現後に変化されるか否かを評価するものである。研究者は、HATアゴニストが、シナプス及び記憶機能、並びにヒストンアセチル化の欠損を救済するか否かを試験するものである。
海馬中のCBPレベルを測定するものである。犠牲の直後に、脳組織を解剖し、そしてそれぞれのマウスからの二つの海馬を集め、そしてその後の均質化及び分析のために瞬間冷凍するものである。更なる対照は、小脳を使用するものである。
の1時間後の両方におけるCBPのHAT活性を、そのWT同腹仔と比較して直接測定するものである。対照は、CBPのHAT活性の変化が、新規な状況単独又はこれら間の結合の代わりの電気ショックのためであることを除外するために、潜在阻害訓練パラダイムを使用して行うものである[B26]。更なる対照は、小脳を使用するものである。
ンズアミド(CTB又は更に化合物6Jとも呼ばれる)[B61]のようなHATアゴニストを合成した。もう一つのベンズアミドHATアゴニストのMOMは、HAT活性の上方制御が、APP/PS1マウスのLTP、状況的恐怖記憶及びヒストンアセチル化の欠損を救済するか否かを検査するために合成された。本出願人等は、化合物を合成し(図26A)、そしてこれがヒストンアセチル化を誘導することを示した(図26B)。本出願人等は、MOMが、本明細書中に記載されたものと同じ実験パラダイムに従って、APP/PS1マウスからの海馬切片中のLTP欠損を救済するか否かを試験するものである。MOM(10μM)又はベヒクルを、θ−バーストによりLTPを誘導する30分前に適用するものである。MOM又はベヒクルで治療されたWT同腹仔の切片を、対照として使用するものである。次に、本出願人等は、アゴニストが、本明細書中に記載したものと同じ実験パラダイムに従ってAPP/PS1マウスの状況的恐怖記憶の欠損を救済するか否かを検査するものである。本出願人等は、更にMOMが、正常な参照記憶を再確立するか否かを検査するものである。
るために、カニューレをAPP/PS1マウス及びWT同腹仔の背部海馬に植込むものである。本出願人等は、1μl中の100μgをゆっくりと1分かけて注入するものである。注入は、恐怖条件づけのための脚部ショックを適用する2時間前に起こるものである。本明細書中に記載される実験のように、本出願人等は、24時間における竦みの量を状況的恐怖記憶を、続いて48時間における手懸り付き恐怖記憶を評価するために測定するものである。次に、水迷路実験のために、本出願人等は、不正なアームへの進入の回数を測定するものである。最後に、実験の別の組において、海馬及び小脳を、恐怖条件づけのための訓練の1時間後に取出すものであり、そしてヒストンアセチル化のレベルを測定するものである。本出願人等が、MOMが、APP/PS1マウスのLTP及び記憶の欠損、並びに海馬のヒストンアセチル化を救済することを見出した場合、本出願人等は、HATアゴニストが、APP及びPS1導入遺伝子の過剰発現後のLTP、記憶及びヒストンアセチル化を回復することができると結論するものである。プロトコルは、更にHAT活性化剤のCTBの効果を試験するためにも行われるものである。
に記載される実験の全ては、WTマウスの背部海馬に注入された200nMのオリゴマーのAβ42の存在中で、ベヒクル注入マウスと比較して繰返されるものである。
BPレベル及び/又はHAT活性の欠損を回復することができるか否かを調査するものである。この問題に対処するために、本出願人等は、本明細書中の実施例6に記載される実験を年とったAPP/PS1マウス(7ヶ月)において繰返すものである。
する遺伝子導入マウスの使用によって大いに緩和される。CBPレベルを検査する実験が行われるものである。然しながら、CBPレベルが影響しない場合、本出願人等は、核画分からのCBPを測定することによる別の戦術を使用するものである。CBP分布の変化は、F11細胞において観察されている。CBPは、殆どWT−PS1を過剰発現している細胞の核中に見出され、一方、PS1の変異体型を過剰発現している細胞は、細胞質及び核の両方においてCBPを示す[B18]。従って、本出願人等は、CBP局在化の変化が、ADの発症において役割を演じることができるか否かを決定することが可能である筈である。
BPのHAT活性の変化が、恐怖条件づけのための訓練後の規定された時間に起こる可能性を除外することはできない。従って、本出願人等は、電気ショック後の異なった時点(1分、5分、20分及び2時間)における海馬のHAT活性を更に測定するものである(本明細書中に記載される実験と同様な対照と共に)。従って、Aβ上昇後の転写装置のレベルにおいて起こる変化の概念を得ることが可能な筈である。
び1時間後)のような実験パラダイムを使用して、海馬に対する新しい蛍光定量アッセイによって海馬のHDAC活性を測定するものである。更なる別の可能性は、他のHATが、ヒストンアセチル化の減少に関係することである。これらは、GNATファミリー、MYSTファミリー、p300、及びACTR/SRC−1を含む。本出願人等は、これらのHATのレベル及び活性を測定するものである。
におけるLTP、記憶及びヒストンアセチル化の欠損を救済しない可能性を排除することはできない。そうであれば、別の戦略として、本出願人等は、試験の1週間前、又はプラ
ーク出現前の生後6週間に始まる、HATアゴニストによるより長期の治療を、二重遺伝子導入マウスにおける実験のために試みるものである。
[00349]動物。 二重遺伝子導入マウスを、APP及びPS1マウスを交雑することに
よって得るものである(PCRによって遺伝子型を同定)[B20、B21、B50]。Aβ実験のために、本出願人等は、繁殖コロニーから得られるものであるC57B16マウスを使用するものである。全てのマウスを、温度及び湿度を調節された部屋内で、12時間の明/暗サイクル(午前6:00に点灯)に維持するものである。食糧及び水は、自由に使用可能であるものである。
馬切片を切断し、そしてこれらを、以前に報告されているように[B11]記録前に、インターフェースチャンバー中で29℃で90分間維持するものである。浴溶液は、124.0mMのNaCl、4.4mMのKCl、1.0mMのNa2HPO4、25.0mMのNaHCO3、2.0mMのCaCl2、2.0mMのMgSO4、及び10.0mMのグルコースからなり、95%O2及び5%CO2で連続して泡立てられるものである。刺激電極として、本出願人等は、シャファー側枝繊維のレベルに置かれた双極のタングステン電極を使用するものである。記録電極として、本出願人等は、浴溶液で満たされ、そしてCA1の放線状層のレベルに置かれたガラスピペットを使用するものである。本出願人等は、最初fEPSPの傾斜に対する刺激電圧をプロットするために、基礎シナプス伝達(BST)を評価し、そして本出願人等のLTP実験の刺激の強度を決定するものである(これは最大誘発反応の約35%の反応を誘発する筈である)。LTPに対する基線は、15分間、毎分記録されるものである。LTPは、θ−バースト刺激を使用して誘発されるものである(5Hzで繰返されるバーストを伴う100Hzの4回のパルス、及びそれぞれの強縮が15秒離れた3回の10回バーストの繋がりを含む)。
4、B21]評価されるものである。マウスは、音(CS)(30秒間、2800Hzで85dBの音響)の開始の2分前に、条件づけ部屋に入れられるものである。CSの最後の2秒において、マウスは、2秒間、0.45mAの脚部ショック(US)を、床の棒を通して与えられるものである。次いで、マウスは、更に30秒間条件づけ部屋に放置されるものである。呼吸のために必要あるためを除く動きの非存在として定義される竦み行動は、Freezeviewソフトウェアを使用して採点されるものである。海馬機能が不可欠である記憶の種類である状況的恐怖学習は、訓練の24時間後、マウスが訓練されるものである部屋中の5分間の竦みを測定することによって評価されるものである。扁桃体機能に依存する記憶の種類である手懸り付き恐怖学習は、状況的試験の24時間後に、マウスを新規な状況に2分間置き(前−CS試験)、その後、彼らをCSに3分間暴露するものであり(CS試験)、そして竦みが測定されるものであることによって評価されるものである。
電流(1秒間0.1mA)が、30秒間隔で0.1mAずつ0.7mAまで増加されるものである。尻込み(ショックに対する最初の可視反応)、跳躍(最初の極端な運動反応)、及び叫び(最初の音声化苦痛)に対する閾値を、脚部ショックに対して、それぞれのマウスがその種類の行動的反応を顕在化するショック強度を平均することによって、それぞれのマウスに対して定量化するものである。知覚閾値評価における差は、実験方法がマウスの知覚閾値に影響しない場合、恐怖条件づけが試験された実験におけるマウスの異なった群間で観察されない筈である。
る。オープンフィールドは、72×72×33cmの内部寸法を持つ白色アクリルで製造された競技場であるものである(オープンフィールドの中心の36×36cmの寸法の部分は‘中心ゾーン’と定義されるものである)。マウスは、標準オープンフィールドの中心に置かれ、そしてその行動は、1時間モニターされ、そして中心区画対周辺中の時間の部分、及び中心区画への進入の回数を採点されるものである。マウスは、24時間後の第2の時間ブロックのために戻されるものである。中心区域で過ごした時間の同様なパーセントで示されるような探索的行動、及び中心区域への進入の回数の差は、処置がマウスの探索能力に影響しない場合、観察されない筈である。
プラットフォームの位置を目的のアームの見える及び隠されたプラットフォームの両方間で変更することによって同定することを訓練されるものである。一日目の最後の3回の試行及び二日目の全ての15回の試行は、目的のアームの位置を同定するために空間的手懸りを使用するようにマウスを強制するために、隠された逃避プラットフォームを使用するものである。消耗する実行によって課される学習の制約を回避し、そして連続した試行の結果であることができる疲労を回避するために、4匹のコホートのマウスを試験し、そして毎日の3時間の試験時間をかける15回の訓練の試行を通して異なったコホートに変更することによる間隔を置いた実行の訓練を確立するものである。一日目に、目に見えるプラットフォームを目的の位置に置くものである。コホート1のマウス1を、一番目の出発アーム(採点表に規定された)の壁の周囲に近いプール中に静かに入れ、そしてプールの中心に向けるものである。不正なアームへの進入(プラットフォームのないアームへの進入)の回数を数えるものである。マウスが不正なアームに進入した場合、これは出発アームに静かに引き戻される。それぞれの試行は、1分まで継続するものである。15秒後のアームの選択の失敗は、誤りとして数えられるものであり、そしてマウスは出発アームに戻されるものである。1分後、プラットフォームを見つけられなかった場合、マウスを、手をその後ろにおくことによって、これをプラットフォームに向けて水中を静かに案内するものである。マウスは、プラットフォーム上で15秒間休憩するものである。試行を完了した後、マウスをプールから出し、穏やかにタオルで拭き、そして加熱ランプ下のそのケージに戻すものである。目的のプラットフォームの位置は、それぞれのマウスに対して異なっているものである。第一のコホートの全てのマウスが、見えるプラットフォームを見つける試行を行った後、プラットフォームを見えるものから隠されたものに取り換えるものである。コホート1からのそれぞれのマウスが、見える及び隠されたプラットフォーム間の6回の交互の試行を完了した後、マウスを加熱源下で休憩するままにするものであり、そして第2のコホートのマウスを同じ方法で試験するものである。6回の交互の試行を完了した後、コホート2のマウスをそのケージに戻して、休憩させるものである。次に、第1のコホートのマウスは、再び交互の見える−隠されたプラットフォームの位置を使用して試行7−12を完了するものである。第1のコホートのマウスの休憩時間中に、第2のコホートのマウスが試行7−12を完了するものである。この時点で、全てのマウスが3回の隠されたプラットフォームの試行を行わなければならないものである。二日目、隠されたプラットフォームのみを使用する全ての15回の試行に対して、一日目と同じ方法を繰返すものである。データ解析のために、誤りの回数を統計的ソフトウェア(SAS,Chicago,ILによるStatview)にインプットするものであり、そしてそれぞれのマウスの平均を、3回の試行のブロックを使用して計算するものである。記載[B58]されるように、本出願人等は、マウスが、二日目の終りに近い3回の試行にわたって1回又はそれより少ない誤りを示すものであることを予測する。学習に失敗したマウスは、訓練セッションを通して3−5回の誤りを犯し、試行による改善がないものである。
プラットフォーム訓練が使用されるものである。プラットフォームに到達する時間及び泳ぐ速度の両方が記録され、そしてビデオ追跡装置(HVS 2020,HVS Image,UK)で分析されるものである。
26番ゲージのガイドカニューレを植込むものである(座標:P=2.46mm、L=1.50mm、深さ1.30mm)[B62]。カニューレは、アクリルの歯科用セメント(Paladur)で頭蓋骨に固定されるものである。6−8日後、本出願人等は、200pMのAβ42、又はベヒクルを、1μlの最終体積で1分かけて、ポリエチレン管によってマイクロシリンジに接続されるものである注入カニューレを通して両側的に注射するものである。モーリス水迷路のために、マウスにそれぞれのセッション及び探索試行を行う20分前に注射するものであり、一方恐怖条件づけのために、マウスは、訓練の20分前に一回の注射を受けるものである。マウスは、行動実験の前の3日間、一日一回処理されるものである。注入中、マウスは、ストレスを最小にするために静かに処理されるものである。注入後、針は、拡散を可能にするために更に1分その位置に残されるものである。行動試験後、4%のメチレンブルーの溶液がカニューレに注入されるものである。マウスは犠牲にされ、そしてその脳が取出され、冷凍され、そして次いで注入カニューレの組織学的所在のためにクライオスタットにより−20℃で切断されるものである。
ように、商業的に入手可能な合成ペプチド(American Peptides Co)から調製されるものである。簡単には、凍結乾燥されたペプチドを、冷1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP,Sigma)中に再懸濁し、そしてポリプロピレンバイアル中にアリコート化するものである。24時間後、HFIP溶液を、ペプチドの薄いフィルムがバイアルの底に形成されるまでドラフト中で蒸発させるものである。ペプチドのフィルムを、穏やかな真空中で乾燥し、そして密封したバイアル中で−20℃で保存するものである。使用前に、無水のDMSO(Sigma)を加えて、純粋なAβ/DMSO溶液を得るものであり、これを10分間超音波処理するものである[B63]。オリゴマーのAβ42は、滅菌のPBS中のモノマーのAβ/DMSO溶液のアリコートを4℃で一晩インキュベートすることによって得られるものである。これらのAβ製剤の量は、ウェスタンブロット分析を使用して日常的に制御されるものであり、ここにおいて、Aβ試料は、トリス−トリシンPAGEによって、非変性/非還元性条件下で溶解され、そして次いでニトロセルロース膜に移されるものである。その後のウェスタンブロットは、抗ヒトAβモノクローナル抗体6E10(Signet Lab)との膜のインキュベーション後に行われるものである。免疫染色は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ化学発光によって明らかにされるものである。
凍された海馬及び小脳から行われるものである。組織は、溶解緩衝液(pH6.8の62.5mMのトリス−HCl、3%のSDS、1mMのDTT)中で均質化され、そして4℃で10分間インキュベートされ、次いで超音波処理されてから、2,000rpmで5分間遠心されるものである。全細胞抽出物を、10−20%の勾配のPAGEゲル(Invitrogen)上で電気泳動し、そして次いで免疫ブロットするものである。抗体は、免疫ブロットのために1:1,000の濃度で使用されるものである。全ての抗ヒストン抗体は、Milliporeから購入されるものである。β−III−チューブリン抗体は、Promegaから購入されるものである。免疫ブロットのデータは、バンド強度を、画像化ソフトウェア(NIH ImageJ)を使用して測定することによって定量化されるものである。定量的免疫ブロット分析のために、等量のタンパク質がそれぞれのレーンに付加されるものである。等しい付加を確認するために、ブロットは、対応するpan−抗体又はβ−III−チューブリンのようなハウスキーピング抗体と共に再検出さ
れるものである。定量化のために、本出願人等は、常に直線範囲のシグナルを使用する。
て行われるものである。免疫沈降されたヒストンは、PSR中の逆相HPLC又はSDS−PAGEによって精製され、次いで酵素的消化にかけられるものである。得られたペプチドは、Dionex nanflow LCを備えたWaters Qtof質量分析器のLC−MS/MSによって分析されるものである。トリプシンを使用する標準的な消化プロトコルは、分析するために小さすぎるペプチドをもたらすヒストンのN末端部分のLys残基の数のために、実行可能ではない。これは、更に修飾に最も富んだ領域であるために、LC−MS/MSによる分析のために最適な大きさ(800−2000Da)のペプチドをもたらす消化プロトコルを使用しなければならない。本出願人等は、Lys残基をプロピオン酸無水物で誘導し、従ってトリプシン消化をArgのみに制約するものである。本出願人等は、既にこの誘導及び消化方法を組換えヒストンH3.1の商業的製剤に対して成功裏に行い、そして質量分析によって容易に分析されるN末端領域からのトリプシンペプチドを得ている。ヒストン修飾の相対定量化のために、本出願人等は、安定な同位体標識法[B65]を使用して、トリプシンペプチドのカルボン酸基を修飾し、続いて質量分光分析を行うものである。
るものである。核画分は、7,700×gで1分間遠心された、均質化された組織から得られたペレット中に含有されるものである。
降によって測定されるものである。単離後、HAT活性は、アセチル残基を検出するための間接的酵素結合免疫吸着測定アッセイキットを、製造業者(Upstate)の説明書により使用して評価されるものである。
の説明書によって使用して測定されるものである。
[00363]統計的解析。 実験は、盲検で行われるものである。結果は、平均値の標準誤
差(SEM)として表示されるものである。有意性のレベルは、p<0.05に設定されるものである。結果は、スチューデントt検定(対比較)又は繰返し測定に対してANOVA(多重比較)によって主作用として処理条件を伴って解析されるものである。計画的比較が事後分析のために使用されるものである。行動のために、実験は、均衡がとれた様式で設計されるものであり、そしてマウスは、三つ又は四つの別個の実験の異なった条件のそれぞれで訓練及び試験されるものである。実験は、ANOVAで、主作用としての処理を伴って解析されるものである。
CRF−CEMに対する細胞生存率アッセイ
[00365]アッセイパラメーター
読取り:Cell−TiterGlo及びCyquantによる細胞増殖、
化合物数:1(YF2)
濃度:10種(0.03、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、15、40及び80μM)
参照化合物:ビンブラスチン(VBL)
濃度:10種
(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及び10μM)
薬物治療時間:72時間
複製:3
溶媒:水性媒体。
[00367]細胞及び培養培地: 全ての細胞系を、ATCCから購入し、そして拡大され
、そして低継代アリコートとしてCDASにおいて液体窒素下で保存された。細胞を維持し、そして推奨されそして最適な培養培地(ACHN:EMEM、2mMのL−Gln、10%のFBS;A549:Ham’s F12、10%のFBS;U251:RPMI
1640、2mMのL−Gln、10%のFBS;Hs578T:DMEM、4mMのL−Gln、1U/mLのウシインスリン、10%のFBS;CCRF−CEM:ATCC RPMI、2mMのL−Gln、10%のFBS;NCI−ADR−RES:RPMI 1640、2mMのL−Gln、10%のFBS)中で継代した。全ての実験を、20継代より少なく継代された細胞で行った。最適な播種密度を全ての細胞系に対して決定した。全ての細胞を、ウェル当たり6000細胞でプレートに入れたCCRF−CEMを除き、ウェル当たり1500細胞でプレートに入れた。
ンブラスチンを、Sigma(カタログ番号V−1377)から購入し、そして100%のDMSO中に1×10−2Mで再懸濁した。両方の薬物の全ての希釈は、最終溶媒濃度が、0.1%を決して超えないように0.2%DMSOを含有する培養培地中で行った。
、1、2.5、5、15、40及び80μM)で三重のウェルで試験した。ビンブラスチンを、参照対照として使用し、そして反対数系列の10種の濃度(0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、及び10μM)で試験した。細胞を、適当な濃度で培地中に再懸濁し、そして180μl(1500又は6000細胞)を、それぞれのウェルに加え、それに続いて20μlの薬物を最終濃度の10倍で加えて、所望の濃度をことごとくのウェルで得た。薬物治療プレートを37℃で72時間インキュベーとし、それに続いて細胞の生存率を、以下に記載するようなCell Titer
Glo又はCyquantによって分析した。
セイプレートを遠心し、そして100μlの培地を吸引し、そして100J.1LのCell Titer Glo試薬(Promega)と、製造業者の推奨するプロトコルによって置換えた。試薬を細胞と混合し、そして蛍光をPerkin Elmer Envision装置を使用して測定した。アッセイ期間の全長の間インキュベートされた非治療の細胞を含有するウェルから得た平均の蛍光シグナルを、100%生存率の値を設定するために使用した。増殖のパーセントを、(試験シグナル)/(平均プレートバックグラウンドシグナル)×100として計算した。生存率の%を、薬物濃度に対してグラフ化し
て、それぞれの薬物に対するIC50を計算した。
遠心し、培地を廃棄し、そして一晩冷凍した。プレートをCyquantTM試薬(Invitrogen)を、製造業者の推奨するプロトコルによって使用して分析した。アッセイ期間の全長の間インキュベートされた非治療の細胞を含有するウェルから得た平均の蛍光シグナルを、100%増殖の値を設定するために使用した。増殖のパーセントを、(試験シグナル)/(平均プレートバックグラウンドシグナル)×100として計算した。増殖の%を、薬物濃度に対してグラフ化して、それぞれの薬物に対するIC50を計算した。
[00372]HDAC阻害は、ヒストンアセチル化の増加を起こす。本発明人等は、ヒスト
ンアセチル化がHDAC阻害によって起こるか否かを試験した。
[00374]表1.HDAC活性に対する化合物の阻害効果
研究は、YF2がHDAC阻害特性を持たないことを示す。YF2は、HDACを阻害しない。
[00377]物質:
HDACアッセイ緩衝液(BPSカタログ番号50031)
HDACアッセイ展開液(BPSカタログ番号50030)
HDAC基質1(BPS番号50032)
HDAC基質3(BPS番号50037)
HDACクラス2a基質1(BPS番号50040)
SAHA(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI,カタログ番
号10009929)。
**SAHA及びHDACiは、HDACに対する正の対照である。
[00379]実験条件
[00380]表3.酵素及び基質
MSO中で調製し、そして全ての反応においてDMSOの最終濃度が1%であるように、5μlの希釈物を、50μlの反応物に加えた。全ての酵素反応は、HDAC11の室温で3時間を除き、二重で37℃で30分間行った。50μlの反応混合物は、HDACアッセイ緩衝液、5μgのBSA、HDAC基質、HDAC酵素及び試験化合物を含有している。酵素反応後、50μlのHDAC展開液をそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを室温で更に20分間インキュベートした。蛍光強度を、360nmの励起及び460nmの発光で、Tecan Infinite M1000マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
光強度のデータをコンピューターソフトウェア、Graphpad Prismを使用して解析した。化合物の非存在において、それぞれのデータの組における蛍光強度(Ft)を、100%活性と定義した。HDACの非存在において、それぞれのデータの組の蛍光強度(Fb)を、0%活性として定義した。化合物OA2は、アッセイ条件で蛍光を有し
ている;従って、OA2の異なった濃度における蛍光強度を、バックグラウンド(Fb)として定義した。それぞれの化合物の存在中の活性のパーセントは、次の等式:活性%=(F−Fb)/(Ft−Fb)によって計算し、ここで、F=化合物の存在中の蛍光強度である。
+10((LogEC50−X)xHill Slop)で発生されたシグモイド曲線の用量−反応曲線の非線形回帰分析を使用してプロットし、ここで、Y=活性のパーセント、B=最低活性パーセント、T=最大活性パーセント、X=化合物の対数及びHill Slope=傾斜係数又はヒル係数である。IC50値は、最大の半分の活性を起こす濃度によって決定された。
[00385]表4.HDAC1アッセイ−HDAC1活性に対するOA2の影響に対するデ
ータ
[00387]表5.HDAC3/NCOR2アッセイ−HDAC3/NCOR2活性に対す
るOA2の効果に対するデータ
[00389]表6.HDAC5FLアッセイ−HDAC5FL活性に対するOA2の効果に
対するデータ
[00391]表7.HDAC7アッセイ−HDAC7活性に対するOA2の効果に対するデ
ータ
[00393]表8.HDAC8アッセイ−HDAC8活性に対するOA2の効果に対するデ
ータ
[00395]表9.HDAC10アッセイ−HDAC10活性に対するOA2の効果に対す
るデータ
[00397]表10.HDAC11アッセイ−HDAC11活性に対するOA2の効果に対
するデータ
[00399]表11.サーチュイン1アッセイ−サーチュイン1活性に対するOA2の効果
に対するデータ
[00401]表12.サーチュイン2アッセイ−サーチュイン2活性に対するOA2の効果
に対するデータ
[00403]表13.HDAC6アッセイ−HDAC6活性に対するOA2の効果に対する
データ
[00405]HDAC阻害に対するSAHAの効果の結果
[00406]SAHAは、HDAC阻害剤(HDACi)である。これは、HDACに対す
る正の対照として役立つ。図61−63は、HDACのHDACl、HDAC3/NCOR2、及びHDACに対するSAHAの阻害効果を示す。SAHAは、更にHDAC5FL、HDAC7、HDAC8、HDAC10、サーチュイン1及びサーチュイン2を阻害した(表1を参照)。
[00407]アルツハイマー病(AD)における初期の健忘性の変化は、シナプスの機能障
害に関連すると考えられる。これに関して、この疾病において高い量で産生されるペプチドであるβ−アミロイド(Aβ)は、記憶[1,2]及びその電気生理学的モデルの長期増強(LTP)[3−8]を阻害することが見いだされている。記憶は、遺伝子発現の制御によるエピジェネティクスによって調節されているため、ヒストン(H)アセチル化のような後成的機構の一つの調節解除は、記憶の破壊に導くことができる。ヒストンアセチル化の減少は、クロマチン構造が閉じることを起こし、従って、DNA中に含有される情報は、転写因子及び記憶の形成にとって少なく受け入れられることができる[9]。
DAC阻害剤に関係する。然しながら、非特異的HDAC阻害の多面的効果は、その治療的潜在性を妨害することができる[10−13]。本出願人等は、二つのHATであるCBP及びPCAFの海馬レベルが、Aβ上昇後減少されることを示した。従って、本出願人等は、更にヒストンアセチル化を上方制御するもう一つの標的であるHATに焦点を当てている。この目的のために、本出願人等は、HAT活性化剤のYF2を合成している。本出願人等は、Aβの下流であるCBP及びPCAFを特異的に標的とする選択的なHAT活性化剤を設計することに関係する一連の調査を提案する。本出願人等の提案の目的は:
1)ADのために最適化された新しいHAT活性化剤を設計及び合成すること;
2)特異的にCBP及びPCAFを標的とする選択的HAT活性化剤に対する高い親和性及び良好な選択性を伴う化合物を同定すること;
3)新しいHAT活性化剤が、良好な薬物動態学的(PK)特性を有し、そして安全であるか否かを決定すること;
4)APP/PS1マウスにおけるシナプスの機能障害を救済するHAT活性化剤を選
択すること;
5)更に、これらが、APP/PS1マウスの認知異常に対して有益であるか否かを決定するためにHAT活性化剤を選別すること;
である。
の二つの群であるHAT及びHDACの競合活性によって支配される。HDAC阻害剤は、LTP及び動物が中性の刺激を有害なものと結合しなければならない連合記憶の形成である状況的恐怖記憶を向上することが示されている[P17]。更に、CBP+/−マウスの記憶及びLTP欠損は、HDAC阻害によって逆転された[P15]。神経変性疾患と対抗するHDACを阻害する潜在性は、広く探索されている[14]。例えば、一組の実験において、Tsai等は、HDAC阻害剤が、神経変性のCK−p25Tgマウスモデルにおける樹状突起の発芽を誘導し、シナプスの数を増加し、そして学習及び長期記憶への接近を復元することを報告している[15,16]。更に、最近の研究において、本出願人等は、HDAC阻害剤のTSAが、アミロイド沈着の二重TgのAPP(K670M:N671L)/PS1(M146L,ライン6.2)(APP/PS1)マウスモデルにおけるLTP及び状況的恐怖条件づけ(FC)を回復することを示している。参考文献であるBolden等(2006, Nature Reviews Drug Discovery,5:769−84)は、ヒストンデアセチラーゼファミリーを記載し、これは本明細書中に参考文献としてその全てが援用される。然しながら、HATは、より少ない程度にしか研究されていない。
[18]。核A型HATは、HAT領域の配列保存に基づいて少なくとも四つの異なったファミリー:Gcn5及びp300/CBP関連因子(PCAF)、MYST(MOZ、Ybf2/Sas3、Sas2及びTip60)、p300及びCBP(二つのヒトパラログp300及びCBPのために命名)並びにRttl09に分類することができる。Gcn5/PCAF及びMYSTファミリーは、酵母からヒトへの同族体を有するが、p300/CBPは、後生動物特異的であり、そしてRttl09は、真菌特異的である。HAT1のような細胞質B型HATは、ヒストン沈着に関係する[P22]。参考文献であるMarmorstein及びRoth(2001,Curr Opin in Genet and Develop.,11:155−161)は、その表1にHATファミリー及びその転写関連機能を列挙し、これは、本明細書中にその全てが参考文献として援用される。
Kのような他の核HATファミリーが記載されているが、これらのHAT活性は、主要なHAT群のようには徹底的に調査されていない[18]。これらの四つのファミリーは、ファミリー内で高い配列同一性を示すが、しかしファミリー間では配列同一性は、不良ないし無いことを示す。更に、異なったファミリーのHAT領域の大きさは、異なる[P22]。興味あることに、HATは、哺乳動物中で高度に保存されている[P22]。全てのこれらのHATの中で、三つ:CBP、p300[19,20]、及びPCAF[21]が記憶に関係することが示された。興味あることに、CBP及びPCAFレベルの両方は、Aβの上昇によって減少される。
る。HAT活性化剤のための二つの足場が確認されている。一番目のものはCTPB及びその誘導体CTBを含む[22,23]。二番目のものは、ただ一つの化合物、ネモロソンを含む[24]。CTBP/CTBは、不溶性で、そして膜不透過性であることが見いだされている[22,23]。更に、CTBPは、CNS疾病において使用されるために
好ましくない特徴を有し(MWは553.29であり、clogPは12.70である)、そしてCTBのclogPは5.13である。ネモロソンは、502のMW及び8.42のclogPを有する。要約として、ADを含むCNS疾患の治療におけるHAT活性化剤のための有望な治療的役割を支持する多くの証拠が存在する。本出願人等は、特異的にCBP及びPCAFを標的とする新しい化学的成分を開発することによって、この可能性を開拓するものである。
[00414]1)ADのために最適化された、新しいHAT活性化剤を設計及び合成するこ
と。 本出願人等は、CTPB/CTB足場のSAR研究に基づき、YF2と命名された新しい化合物を設計した。YF2(MW430.13、clogP5.15、clogBB0.17)は、増加した溶解性、膜透過性及び血液脳関門透過性を有し、急性毒性試験において安全である。YF2は、Aβ上昇後のH3アセチル化の海馬レベルの減少を救済し、PCAF、CBP及びGcn5、並びにp300の酵素活性を向上し、HDACに対するよりPCAF、CBP及びGcn5に対する優れた選択性を有し、そしてAβ暴露によって誘導された恐怖及び参照記憶に欠損を救済することが可能であった。本出願人等は、その新薬の開発につながる可能性(druggability)を、良好なPK及びADMET特性を持つ薬物様リード化合物の合成に焦点を当てた、医薬化学(医化学)的方法を使用して改良している。本出願人等は、YF2の二つの芳香族環の一つの異なった位置に異なった分子を保有するHAT活性化剤を設計及び合成するものである。特に、本出願人等は、ミクロソームによってアルキル化され、そして芳香族環を酸化性反応から保護する可能性があるジメチルアミノ基を置換するものである。更に、本出願人等は、HAT結合部位を、i)二つの芳香族環間のアミト゛基の重要性を評価すること、ii)分子構造を制約すること、iii)現在YF2を形成する二つの芳香族環間の距離を改変すること、iv)二つの芳香族環の一つを複素環によって置換すること、そしてv)二つの芳香族環の一つの置換基の障害を増加することによって、探索するものである。本出願人等は、a)HAT特異性及び効力、b)大きいCNS透過、並びにc)安全性を持つHAT活性化剤を見出すものである。
高い親和性及び良好な選択性を持つ化合物の同定。 HAT活性化剤の効力(EC50)の評価後、本出願人等は、CBP及びPCAFに関する選択性を検査するものである。良好な効力(<100nM)、選択性(p300、Gcn5、MYSTファミリー及びHDACに対して少なくとも50倍)及び溶解性を示すことが見いだされたHAT活性化剤に対して、本出願人等は、これらが、成獣のマウスにおいて海馬のH3及びH4アセチル化を増加するか否かを決定するための機能アッセイを使用するものである。
て安全であるか否かを決定すること。 選択されたHAT活性化剤を、生体利用率、脳取込み、及びBBB透過を含む好ましくないPK特性に対して選別されるものである。これらの試験を通過した化合物は、急性及び慢性毒性の試験を含む基本的なADMET特徴を評価されるものである。
ること。 本出願人等は、選択されたHAT活性化剤が、APP/PS1切片のLTP欠損を回復するか否かを、電気生理学的技術を使用して決定するものである[25]。
HAT活性化剤を更に選別する。 本出願人等は、切片で選別されたHAT活性化剤が、行動アッセイを使用する状況及び参照記憶の障害に対してAPP/PS1マウスを保護す
ることができるか否かを決定するものである[25]。次に、本出願人等は、HAT以外の標的に対するその更に包括的な選択性に対して、本出願人等の化合物を特徴づけするものである。本出願人等は、更に多くの薬物の市場からの撤退をもたらした、二つの領域:薬物−薬物相互作用(肝臓代謝)、hERGチャンネル遮断(心機能不全)に焦点を当てた一連のアッセイによりこれらを選別するものである。
D治療は、制約された効力を有する。タングル形成を阻害し、炎症及び酸化性損傷と戦い、そして脳のAβ負荷を減少するための主要な努力が行われている[26−28]。然しながら、正常な生理学的機能におけるAPP、Aβ、及びセクレターゼの役割[29−31]は、AD治療に対する有効な、そして安全な方法を提供することに問題を与えることができる。ニューロンの機能障害に導くAβ標的と相互作用する薬剤を開発することは、多くの研究所によって現時点で試験されているもう一つの方法である。理論に束縛されるものではないが、HAT活性化剤は、疾病の進行に有効に対抗することができる化合物の新しい群である。
[00421]本出願人等は、CREB結合タンパク質(CBP)及びp300/CBP関連
因子(PCAF)の海馬レベルが、ヒストンアセチル化を触媒し、そして記憶の形成に関連する二つのアセチルトランスフェラーゼ(HAT)が、Aβ上昇後、減少されることを証明している[P14−16]。
(図29)。YF2は、2−(ジメチルアミノ)エタノール並びに酸2及び4−クロロ−3−(トリフルオロメチル)アニリンのEDCの存在中の反応によって得られた3間の光
延反応によって調製された。酸は、1のエステル加水分解によって合成された。最後に、YF2は、水溶性化合物を得るためにHCl/Et2Oで処理された。In vitroアッセイにおいて、YF2は、CBP、PCAF、及びGCN5に対する活性を有する。CBP、PCAF、及び、GCN5に対するYF2のEC50は、それぞれ2.75μM、29.04μM及び49.31μMである。更に、YF2は、p300及びHDAC活性(HDAC1、3、5、6、7、8、10、11、及びsirt1−2)に干渉しなかった。YF2は、更に図72に示すようにp300活性を増加する。
)及び血液脳関門(BBB)透過能力を調査した。BALB/cマウスに対する20mg/kgのi.p.及びi.v.投与後、血漿及び脳濃度をLCMS/MSによって決定した。表14のデータは、YF2が脳に急速に吸収されることを示す(15分におけるTmax)。
CBP、PCAF及びGCN5に対するYF2のEC50は:それぞれ2.75μM、29.04μM及び49.31μMである。
10.8のAUC0−t比で血漿中のそれより高かった。脳及び血漿中のYF2の排出半減期は、約40分であった。脳及び血漿中のTmax値は、同様であり、脳に対するYF2の分布も、更に急速であることを示した。更に、急性の毒性実験において、YF2は、300mg/kg(i.p.)迄何らの不都合な影響を誘導しなかった。
を増加するか否かを試験した。化合物を、20mg/kgでi.p.投与し、30分後マウスを犠牲にし、そして海馬を取出し、そしてWB分析のために急速冷凍した。図64に示すように、YF2は、記憶の形成に関係することが示されているヒストンリジンのアセチル化を増加した(H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16、及びH2B)[P15,P33]。
めることができるか否かを検討した。YF2は、海馬へのAβ注入後のH3アセチル化レベルの欠損を救済した(図65)。次に、本出願人等は、LTP又は状況的恐怖記憶、並びに参照記憶を、オリゴマーのAβ42、又はベヒクルの存在中で誘導した。LTP実験において、200nMのAβ42又はベヒクルを、浴溶液を通してθ−バーストの適用の20分前に潅流した。行動実験において、200nMのAβ42(1μlの最終体積で1分かけて)又はベヒクルを、脚部ショックの15分前、又は1回目試行の15分前(参照記憶を評価する2日間の放射状アーム水迷路(RAWM)試験中の試験の第1群に対して[P34])及び7回目試行の15分前(RAWMの試験の第2群に対して)に、前の週にカニューレを前もって植込まれたマウスの背部海馬に両側的に注入した。Aβは、LTP並びに参照及び状況的恐怖記憶の両方を減少した(図66)。然しながら、YF2(1μM、LTP実験においてθ−バーストの30分前;5又は20mg/kg、i.p.、行動実験におけるAβ投与の15分前)は、電気生理学的及び行動的欠損を回復した(図16)。
られたことを考慮すれば、これが、ADの脳でシナプスの機能障害を起こすAβと同じであるか否かを知ることは困難である。従って、本出願人等は、これらの実験を、Aβを沈積したマウスモデルのAPP/PS1マウスにおいて検証した[P35]。これらのマウスは、ADの病態に関して、十分に特徴づけされている[P34−38]。これらは、生後3ヶ月のように早くからシナプス及び記憶障害を示し始める[P34]。二重変異APP(K670M:N671L)/PS1(M146L)(ライン6.2)を持つ遺伝子導入マウスは、生後8−10週目に皮質及び海馬に大きいプラークを発生し始める。これらは、生後3ヶ月までに、状況的恐怖記憶及び空間作業記憶の障害と一緒にLTPの減少を有する。
の試行にわたって<2回の誤りを示した。次に、APP/PS1マウスは、学習に失敗し、そして訓練セッションを通して>3回の誤りをおかした。然しながら、YF2(20mg/Kg、i.p.FCのための訓練の30分前、又はRAWMに対する試験の一番目及び二番目の群の前に)による治療は、WTマウスの記憶に影響することなく、二重Tgの記憶の欠損を救済した。本出願人等は、二重Tgマウスが、条件的恐怖記憶を評価するためのFCを行った場合、同様な結果を得た(図67)。
レベル(CBP及びPCAF)は、Aβ42上昇後減少する。HDAC阻害は、Aβ42上昇後のシナプス機能及び記憶の損傷に対して有益である。HAT活性化は、Aβ42上昇後の記憶減少に対して有益である。本出願人等は、ヒストン3アセチル化の均衡を変化し、そしてAβ上昇後の正常な記憶を復元する、HAT活性化剤のYF2を設計及び合成した。
[00431]化合物は、Active Motif(USA,CA)からのHATアッセイ
キットを使用して、先ずHAT活性化剤活性に対して試験されるものである。このアッセイのために、本出願人等は、ヒトCBP、PCAF、p300及びGCN5(Enzo Life Sci.,USA)の触媒領域を使用するものである。残りのHATの触媒領域は、New England Biolabs K.lactisタンパク質発現キットを使用して製造されるものである。CBP及び/又はPCAFの強力な活性化剤(EC50<100nM)であることに加えて、候補化合物は、更に選択的でなければならない
。全ての他のHATに対して分析された場合、これらは、CBP及び/又はPCAFに対して少なくとも50倍大きい効力を示さなければならない。最後に、実施例13及び14に概略記載したシナプス及び記憶の機能障害の試験において効力を示す最も強力/選択的化合物に対して、本出願人等は、HDACに対する選択性を検討するものである。これらの試験を行う一方、本出願人等は、更に溶解性を評価するものである(中性水性緩衝液>10μg/ml)。
タを確認することであるものである。特に、本出願人等は、新しいHAT活性化剤を、一次培養物及び成獣のマウス中で試験するものである。本出願人等は、最初、化合物が、生後10日目の培養された海馬ニューロン(記載されている[P47]ように調製)の特異的ヒストンアセチル化を増加することができるか否かを決定するものである。培地を吸引し、そしてHAT活性化剤を含有する0.5mLのPBSで置換えるものである。37℃で30分後、細胞を取出し、そしてWB分析のために溶解するものである。海馬培養物中の試験を通過した化合物は、次に急性毒性の評価後、マウスに投与される化合物の投与量を決定するために、成獣のマウスにおいて試験されるものである(以下の“毒性試験”を参照されたい)。成獣のマウスにおける試験は、細胞培養物が、複雑な細胞−細胞相互作用及びin vivoの薬物PK、BBB透過、等(更に以下の実施例12を参照されたい)を伴う全身を再現しないために、必須である。マウスは、HAT活性化剤で治療されるものであり、海馬をi.p.注射の30分後に回収し、そしてWB分析のために溶解するものである。全ての実験は、三重で行われるものである。本出願人等が、特異的ヒストンアセチル化の増加を見出した場合、候補化合物は、活性と見做されるものである。
スポーターとの相互作用を、実施例12において考察されるADMET/Tox研究に加えて、NIMH PDSPプログラム(CNS標的の列挙に対してhttp://pdsp.cwru.eduを参照されたい)を使用して試験するものである。
[00434]本出願人等は、新規なHAT活性化剤の基本的なPK特性及び毒性に対処する
データを作成するものである。必要な場合、PK及び毒性研究によって得られた情報を、改良された生体利用率、脳取込み、及び安全性の最終目的を持つ新しい分子の更なる化学的修飾に導くために使用するものである。行われる必要がある薬物動力学的アッセイは、a)生体利用率及びb)脳取込みの測定を含むものである。マウスに、活性化剤をi.p.注射するものである(最終薬物候補に対して更に、p.o.及びi.v.の投与経路を使用して、PK試験も行われるものである)。5−6匹のマウス/性別を、それぞれの時点に対して使用するものである。生体利用率(投与後の時間の関数としての血液中の化合物の濃度)の評価のために、血液試料を一回の急性投与後に試験動物から得るものである(5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、及び24時間目に収集)。血液は、後眼窩穿刺によって回収され、ヘパリン処置した試験管中に収集し、そして血漿を遠心によって得るものである。試料を、LC−MSによって分析して、候補化合物及び可能性のある代謝物の量を測定するものである。脳取込み及びBBB透過の指標は、脳からの候補化合物の組織抽出によって得るものである。簡単には、脳ホモジネートを11,000rpmで10分間遠心するものである。試料のアリコートを、アセトニトリルに加え、次いで分析のためにLC−MS/MSに注射するものである。脳及び血漿濃度の同様なパターンは、脳取込みが血液中の濃度を反映するという事実の表示であるものである。>1のピーク脳/血液濃度比は、本出願人等の化合物に対する脳取込みが、臨床使用中の既知のCNS薬物のそれに匹敵することを示すものである。例えば、6−フェニルアミノピリダジンCNS薬物であるミナプリンに対する脳/血液比は、>2である[P48]。
始の時間、期間、毒性の可逆性及び死亡率を、記録するものである。動物は、最初の24時間中定期的に観察され、最初の4時間は連続して、次いで少なくとも一日一回で14日間、又は彼らが死ぬまで、食物及び液体取込み、体重、並びに自発運動及び探索行動を検査するためにモニターされるものである。本出願人等は、更に最大許容投与量(MTD)及び慢性毒性を評価するものである。MTDは、怠惰感又は死に関していずれもの毒性効果を生じない最大の投与される投与量として計算されるものである(体重は時間をかけてモニターされる)。慢性毒性は、MTDで評価されるものである。全ての臨床的徴候、開始の時間、期間、毒性の可逆性及び死亡率が記録されるものである。可能性のある慢性毒性の徴候の発生は、治療の終りの少なくとも1ヶ月後評価されるものである。
していると推定されている[P49]。従って、経費のかかる動物の毒物学的作業及びその後の効力評価の過程の取り組む前に(実施例13及び14を参照されたい)、本出願人等は、本出願人等の三つの最良の化合物を迅速な、経費のかからない一連のアッセイにより選別するために、in vitroのADMET試験の最近の進歩を利用するものである。本出願人等は、多くの薬物の市場からの撤退をもたらした二つの分野:薬物−薬物相互作用(肝臓代謝)、hERGチャンネル遮断(心臓機能不全)に焦点を当てるものである。肝毒性に関連する薬物−薬物相互作用を試験するために、本出願人等は、シトクロムP450阻害アッセイ(SRI internationalによって行われる)を使用するものである。hERGチャンネル遮断アッセイを、NIMH PDSPプログラムを使用して行うものである。
[00437]シナプスの機能障害は、ADの主要な特徴である[P50]。本出願人等の薬
物選別プロトコルの定量的側面は、新しく合成された化合物のシナプス機能に対する効果の測定を含むものである。APP/PS1マウスは、生後3ヶ月目までにLTPの障害を提示し[P34]、そして従って、マウスの加齢を長時間待つことなくシナプス機能の比較的迅速な評価を可能にする。本出願人等は、LTPを、これが学習及び記憶の根底にあると考えられるシナプス可塑性の種類であるために試験するものである。YF2が、LTPのAβ誘導の減少を救済するという発見に基づいて、本出願人等は、正常なLTPを再確立することができるものを選択するための本出願人等の医化学的研究によって示される化合物を選別するものである。化合物を、図66Aのような同じ実験プロトコルを使用して30分間適用されるものである。対照は、ベヒクルで治療されたAPP/PS1マウス、及び化合物又はベヒクルで治療されたWTマウスからの切片で行われるものである。化合物が、APP/PS1切片中の正常なLTPを再確立した場合、本出願人等は、化合物が、APP/PS1マウスのシナプス可塑性の障害を救済することができると結論するものである。本出願人等は、更にもう一つの疾病の重要な側面である認知障害を調査するものである(実施例14を参照されたい)。
L)(ライン6.2)マウスと交雑することによって得るものである。遺伝子型は、尾部試料のPCRによって同定するものである[P41−P53]。
]を参照されたい)。
[00440]統計的解析:実施例14を参照されたい。
きるか否かを試験するためのHAT活性化剤を更に選別すること
[00441]理論に束縛されるものではないが、実施例13によって示された新規なHAT
活性化剤による治療は、生後3及び6ヶ月目のAPP/PS1マウスにおける認知欠損を救済することができる。行動課題に関して、本出願人等は、AD患者において影響される異なった種類の記憶(参照及び連合)を評価する試験の二つの種類である、RAWM及び状況的FCを使用するものである。治療は、同じタイミングで行われるものである(即ち、恐怖条件づけのための訓練の30分前、又はRAWMのための試験の一回目及び二回目の群の前)。試験される条件は:HAT活性化剤で治療されたAPP/PS1及びWT、ベヒクルで治療されたAPP/PS1及びWTを含む。行動試験後、マウスを犠牲にし、そのその血液及び脳を、Aβレベル、Tauタンパク質、TARDBP及びTDBレベル、並びにアルファ−シヌクレイン測定のために使用するものである。HAT活性化の有効性の対照として、本出願人等は、海馬のアセチル−H4レベルを、恐怖条件づけのための訓練の30分前の化合物の投与後、及び電気ショックの1時間後の海馬の除去後に測定するものである(APP/PS1マウスは、電気ショック後、アセチル化H4の減少を有することが示されている[P21])。最後に、本出願人等は、市場からの多くの薬物の撤退をもたらした二つの分野:薬物−薬物相互作用、hERGチャンネル遮断に焦点を当てた一連のアッセイによりこれらを選別するものである(実施例12を参照されたい)。
[00443]行動研究: 実験は、可変性を減少するために、オスの動物のみの盲検で行う
ものである。A)空間的記憶。この種類の参照記憶は、記載されている[P56]ように二日間のRAWMで研究することができる;更に図66Bを参照されたい)。課題は、モーリス水迷路(MWM)及び放射状アーム陸迷路の複合型である。これらの実験のために、記載されている[P34]ように、視覚、運動及び動機付けの欠損がマウスの能力に影響することを除外するために、可視プラットフォーム試験を行うものである。B)状況的及び手懸り付き学習の両方を試験するための恐怖条件づけは、記載されている[P57]ように評価されるものである。これらの実験のために、マウスの異なった群の電気ショックを受けた脚部の知覚性認知を検査するために、閾値評価試験を行うものである[P57]。更に、記載されている[P58,P59]ように、探索を評価するために、オープンフィールド試験を行うものである。
された海馬から行うものである。組織を、RIPA緩衝液中で均質化し、次いで超音波処理してから、10,000rpmで5分間遠心するものである。全細胞の抽出物を、10−20%勾配のPAGEゲル(Invitrogen)上で電気泳動し、そして次いで免疫ブロットするものである。免疫ブロットのために、抗体を1:1,000の濃度で使用するものである。全ての抗ヒストン抗体は、Milliporeから購入されるものである。免疫ブロットデータは、バンド強度を測定することによって、画像ソフトウェア(NIH ImageJ)を使用して定量化されるものである。
球及び血漿のホモジネートで行われるものである。
[00446]アルファ−シヌクレインレベルの決定は、α−シヌクレインELISAキット
(カタログ番号NS400;Millipore,Billerica,MA)を使用し、製造業者の説明書によって、冷凍された脳半球のホモジネートに対して行われるものである。
ク質43、TARDBP/TDP−43のELISAキット(カタログ番号E1951h;Wuhan EIAab Science Co,Wuhan,China)を使用し
て、製造業者の説明書によって、冷凍された脳半球のホモジネートに対して行われるものである。
oScale Discovery(Gaithersburg,MD)(http://www.mesoscale.com/catalogsystemweb/webroot/products/assays/alzheimers.aspxを参照されたい)から入手可能なアッセイ及びキットを、製造業者の説明書によって使用して、冷凍された脳半球のホモジネート及び血漿に対して行われるものである。
差(SEM)として表示されるものである。有意性のレベルは、p<0.05に設定されるものである。結果は、主効果として薬物及び遺伝子型による事後補正を伴うANOVAにより解析されるものである。
[00451]本出願人等は、実施例13によって示されたHAT活性化剤化合物による治療
が、ハンチントン病のマウスモデル(例えば、FVB−Tg(YAC128)53Hay/J及びFVB/NJ−Tg(YAC72)251 lHay/Jマウス、Jackson Laboratory,Bar Harbor MEから入手可能)の認知欠損を救済することができるか否かを試験するものである。行動課題に関して、本出願人等は、記憶の異なった種類(参照及び連合)を評価する二種類の試験である、RAWM及び状況的FCを使用するものである。治療は、同じタイミングで行われるものである(即ち、恐怖条件づけのための訓練の30分前、又はRAWMのための試験の一回目及び二回目の群の前)。試験される条件は:HAT活性化剤で治療されたハンチントン病のマウス及びWT、ベヒクルで治療されたハンチントン病のマウス及びWTを含む。行動試験後、マウスを犠牲にし、そしてその血液及び脳をハンチンチンタンパク質レベルの測定のために使用するものである。HAT活性化の有効性に対する対照として、本出願人等は、恐怖条件づけのための訓練の30分前の化合物の投与及び電気ショックの1時間後の海馬の除去後の海馬のアセチル−H4レベルを測定するものである。最後に、本出願人等は、市場からの多くの薬物の撤退をもたらした二つの分野:薬物−薬物相互作用、hERGチャンネル遮断に焦点を当てた一連のアッセイによりこれらを選別するものである(実施例12を参照されたい)。
8)53Hay/J[ストック番号004938]及びFVB/NJ−Tg(YAC72)251 1Hay/Jマウス[ストック番号003640])は、Jackson Laboratory(Bar Harbor ME)から得られるものである。更に、Hodgson et al,(May 1999)Neuron,Vol.23,181−192を参照されたい。
れるものである。A)空間的記憶。この種類の参照記憶は、記載されている[P56]ように二日間のRAWM試験で研究することができる。課題は、モーリス水迷路(MWM)及び放射状アーム陸迷路の複合型である。これらの実験のために、記載されている[P34]ように、視覚、運動及び動機付けの欠損がマウスの能力に影響することを除外するために、可視プラットフォーム試験を行うものである。B)状況的及び手懸り付き学習の両方を試験するための恐怖条件づけは、記載されている[P57]ように評価されるものである。これらの実験のために、マウスの異なった群の電気ショックを受けた脚部の知覚性認知を検査するために、閾値評価試験を行うものである[P57]。更に、記載されている[P58,P59]ように、探索を評価するために、オープンフィールド試験を行うものである。
された海馬から行うものである。組織を、RIPA緩衝液中で均質化し、次いで超音波処理してから、10,000rpmで5分間遠心するものである。全細胞の抽出物を、10−20%勾配のPAGEゲル(Invitrogen)上で電気泳動し、そして次いで免疫ブロットするものである。免疫ブロットのために、抗体を1:1,000の濃度で使用するものである。全ての抗ヒストン抗体は、Milliporeから購入されるものである。免疫ブロットデータは、バンド強度を測定することによって、画像ソフトウェア(NIH ImageJ)を使用して定量化されるものである。
タログ番号ABIN423526;Antibodies−online,Atlanta,GA)を使用し、製造業者の説明書によって、冷凍された脳半球のホモジネート及び血漿に対して行われるものである。
差(SEM)として表示されるものである。有意性のレベルは、p<0.05に設定されるものである。結果は、主効果として薬物及び遺伝子型による事後補正を伴うANOVAにより解析されるものである。
[00457]PDは、黒質核中のドーパミンニューロンの75−95%迄のニューロンの死
を伴う変性疾患である。本出願人等は、実施例13によって示されたHAT活性化剤化合物による治療が、パーキンソン病(PD)のマウスモデルの異常な運動動作を救済するか否かを試験するものである(例えば、Jackson Laboratory,Bar Harbor MEからhttp://jaxmice.jax.org/list/ ral594.htmlで入手可能なパーキンソン病のマウスモデルを参照されたい; 更にEmborg,Journal of Neuroscience Methods
139(2004)121−143;Lane Psychopharmacology(2008)199:303−312;及びMeredith et al,Acta
Neuropathol(2008)115:385−398を参照されたい)。行動課題に関して、本出願人等は、例えば、運動障害、動作緩慢、振戦、及び/又は握力を、PDの各種の段階における化合物の効力の評価のために試験するものである。試験される条件は:HAT活性化剤で治療されたPDマウス及びWT、ベヒクルで治療されたPDマウス及びWTを含む。行動の評価後、マウスを犠牲にし、そしてその脳を凝集したアルファ−シヌクレインタンパク質の測定のために使用するものである。HAT活性化の有効性の対照として、本出願人等は、海馬のアセチル−H4レベルを測定するものである。
ory(Bar Harbor ME)から得られるものである。更に、Meredith et al.,Acta Neuropathol(2008)115:385−398を参照されたい。
Fleming et al.,((2004)The Journal of Neuroscience,24(42):9434−9440)及びHwang et al,((2005)The Journal of Neuroscience,25(8):2132−2137)によって記載されている方法によて行われるものである。
された海馬から行うものである。組織を、RIPA緩衝液中で均質化し、次いで超音波処理してから、10,000rpmで5分間遠心するものである。全細胞の抽出物を、10−20%勾配のPAGEゲル(Invitrogen)上で電気泳動し、そして次いで免疫ブロットするものである。免疫ブロットのために、抗体を1:1,000の濃度で使用するものである。全ての抗ヒストン抗体は、Milliporeから購入されるものである。免疫ブロットデータは、バンド強度を測定することによって、画像ソフトウェア(NIH ImageJ)を使用して定量化されるものである。
(カタログ番号NS400;Millipore,Billerica,MA)を使用し、製造業者の説明書によって、又は標準的な神経病理学的方法(脳組織学)によって、冷凍された脳半球のホモジネートに対して行われるものである。
差(SEM)として表示されるものである。有意性のレベルは、p<0.05に設定されるものである。結果は、主効果として薬物及び遺伝子型による事後補正を伴うANOVAにより解析されるものである。
[00463]当業者は、日常的実験より多くを使用せず、本明細書中に記載される特定の物
質及び方法に対する多くの均等物を認識するか、又は確認することが可能であるものである。このような均等物は、本発明の範囲内であり、そして以下の特許請求の範囲によって包含されると考えられるものである。
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、CI 3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−、又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
AR1は、5員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
AR2は、5員の芳香族環、6員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、CI 3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
[00206]式中:
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、CI 3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−、又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
AR1は、5員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
AR2は、5員の芳香族環、6員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、CI 3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は−C(O)R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、CI 3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、−NR5であり;
R5は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキル、C(O)R7であり;そして
R7は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである。
Claims (43)
- 以下の式(I):
R1は、H、又はCF3であり;
R2は、H、Cl、又はCNであり;
R3は、H、O−メチル、O−エチル、S−エチル、O−シクロペンチル、OCH2CH2N(CH3)2、又はCH2CH2CH2N(CH3)2であり;
R4は、H;C(=O)NH−フェニルであり、ここにおいて、フェニルは一つ又はそれより多いハロ或いはCF3で置換されている;
R5は、H、C1−C5−アルキル、OH、OCH3、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2、CH2CH2CH2N(CH3)2、SCH2CH2N(CH3)2、又はOCH2C(=O)O−アルキルであり;
R6は、H、O−メチル、O−エチル、OCH2CH2N(CH3)2であり;そして
Xは、CONH、SONH、SO2NH、NHC(=O)NH、又はNHCOである]の化合物、或いは医薬的に受容可能なその塩又は水和物。 - 以下の式II:
R7は、H又はCF3であり;
R8は、O−エチル又はS−メチルであり;
R9は、ブチル又はOCH2CH2N(CH3)2であり;
Yは、C−Cl、C−CN、C−NO2、又はNであり;
Wは、CH又はNであり;そして
Zは、CH又はNである]
の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物。 - 以下の式III:
R10は、CF3であり;
R11は、CNであり;そして
R12は、O−エチルある]
の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物。 - 以下の式V:
Xは、S、S(O)2、NH、O、又はCであり;
Yは、−C(O)、S(O)2、又はNH−C(O)であり;
AR1は、5員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
AR2は、5員の芳香族環、6員の芳香族環又は1−2個の窒素を含有する6員の芳香族環であり;
R1は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、C8H18、C15H26、C15H28、C15H30、C15H32、SR4、又はOR4であり;
R2は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、又は(C1−C6アルキル)−CO2R6であり;
R3は、H、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、CF3、CCl3、Cl3、F、Cl、I、NO2、又はCNであり;
R4は、(C1−C6アルキル)−N(R5)2−又はC1−C6アルキルであり;
R5は、独立に水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルであり;そして
R6は、水素、C1−C6アルキル、又はC3−C8シクロアルキルである]
の化合物、或いはその医薬的に受容可能なその塩又は水和物。 - 前記化合物が、以下の式:
- 前記化合物が、以下の式:
- 前記化合物が、以下の式:
- 蓄積したアミロイド−ベータペプチドの沈着物に伴う症状を治療するための式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を選別するための方法であって:
a)式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のHAT活性化剤化合物を、アミロイドベータ沈着物蓄積の動物モデルに投与し;そして
b)アミロイドベータ沈着物蓄積の動物モデル中のHAT活性化剤化合物の投与後に、ヒストンアセチル化を調節することができる式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のHAT活性化剤化合物を選択すること;
を含んでなる、前記方法。 - 蓄積したアミロイド−ベータペプチド沈着物に伴う症状を治療するための式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性化剤化合物を同定するための方法であって、以下の特徴:
a)前記化合物のEC50は、約1000nMより多くない;
b)in vitroの前記ヒストンアセチル化活性は、ヒストンタンパク質H2、H3、及び/又はH4を標的とする;及び
c)前記化合物は、血液脳関門を透過する;又はこれらの組合せ;
の一つ又はそれより多くを有する式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のHAT活性化剤化合物を選択すること含んでなる、前記方法。 - 前記化合物が、血液脳関門を透過するために、約500Daより小さい分子質量を有するか、約90Å2より少ない極性表面積を有するか、8個より少ない水素結合、又はこれらの組合せを有する、請求項9に記載の方法。
- 患者のアミロイドベータ(Aβ)タンパク質沈着物を減少するための方法であって:
a)式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のHAT活性化剤化合物を含んでなる有効な量の組成物を患者に投与し、
これによって、患者のAβタンパク質沈着物を減少すること;
を含んでなる、前記方法。 - 前記患者が、アミロイドベータプラークの異常に高いレベルを示す、請求項11に記載の方法。
- 前記患者が、アルツハイマー病、レビー小体性認知症、封入体筋炎、又は脳アミロイド血管症に罹っている、請求項11に記載の方法。
- 前記Aβタンパク質沈着物が、Aβ40異性体、Aβ42異性体、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項11に記載の方法。
- 患者のアルツハイマー病を治療するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- アルツハイマー病を治療するための方法であって、患者に、HAT活性化剤化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- 神経変性疾患に罹った患者の記憶保持を増加するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- 神経変性疾患に罹った患者のシナプス可塑性を増加するための方法であって、患者に、患者のヒストンアセチル化を増加する治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなり、ここにおいて、前記組成物は、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる、前記方法。
- 患者の神経変性疾患を治療するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与し、これによって患者の神経変性疾患を治療することを含んでなる、前記方法。
- 神経変性疾患に罹った患者の封入体を減少するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)のHAT活性化剤化合物を含んでなる有効な量の組成物を投与し、これによって患者の封入体を減少することを含んでなる、前記方法。
- 患者の癌を治療するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- 患者のパーキンソン病の症状を回復するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- パーキンソン病の症状を回復するための方法であって、患者に、HAT活性化剤化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- 患者のハンチントン病を治療するための方法であって、患者に、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)の化合物を含んでなる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
- ハンチントン病を治療するための方法であって、患者に、HAT活性化剤化合物を含んで
なる治療的な量の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。 - 前記HAT活性化剤化合物が、式(I)、式(II)、式(III)、又は式(V)を含んでなる、請求項16、23、又は25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、YF2である、請求項11、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有効な量が、少なくとも約1mg/kg体重、少なくとも約2mg/kg体重、少なくとも約3mg/kg体重、少なくとも約4mg/kg体重、少なくとも約5mg/kg体重、少なくとも約6mg/kg体重、少なくとも約7mg/kg体重、少なくとも約8mg/kg体重、少なくとも約9mg/kg体重、少なくとも約10mg/kg体重、少なくとも約15mg/kg体重、少なくとも約20mg/kg体重、少なくとも約25mg/kg体重、少なくとも約30mg/kg体重、少なくとも約40mg/kg体重、少なくとも約50mg/kg体重、少なくとも約75mg/kg体重、少なくとも約100mg/kg体重である、請求項11、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、血液脳関門を通過する、請求項11、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、副腎白質萎縮症(ALD)、アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ルーゲーリック病)、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(更にシュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても知られる)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、レビー小体性認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型)、多系統萎縮症、多発性硬化症、過眠症、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レット症候群、Tau陽性前頭側頭葉認知症、Tau陰性前頭側頭葉認知症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血の続発性亜急性脊髄複合変性症、シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆、又は中毒性脳症を含んでなる、請求項17、18、19、又は20のいずれか1項に記載の方法。
- シナプス可塑性が、学習、記憶、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項18に記載の方法。
- シナプス可塑性が、長期増強(LTP)を含んでなる、請求項18に記載の方法。
- 前記癌が、B細胞リンパ腫、大腸癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、T細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、造血器腫瘍、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンスリンパ腫、ホジキンスリンパ腫、子宮癌、腎細胞癌、肝細胞腫、腺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、卵巣癌、原発性又は転移性黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、脳癌、血管肉腫(angiosarcoma)、血管肉腫(hemangiosarcoma)、骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、子宮頚部癌、消化器癌、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大
腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支原性肺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、肺癌、上皮癌、子宮頸癌、精巣癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、膀胱癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は髄様癌を含んでなる、請求項21に記載の方法。 - 前記化合物が、以下の式:
- 前記化合物が、以下の式:
- 前記化合物が、以下の式:
- 前記化合物が、ヒストンアセチル化を増加する、請求項11、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25のいずれか1項に記載の方法。
- ヒストンアセチル化が、ヒストンH2B、H3、H4のアセチル化、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項37に記載の方法。
- ヒストンアセチル化が、ヒストンリジン残基H3K4、H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16のアセチル化、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項37に記載の方法。
- 前記封入体が、ベータ−アミロイドペプチド、天然の及びリン酸化されたTauタンパク質、天然の及びリン酸化されたアルファ−シヌクレイン、リポフスチン、開裂されたTARDBP(TDB−43)、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項20に記載の方法。
- 前記パーキンソン病の症状が、振戦、動作緩慢、運動障害、硬直、姿勢不安定性、筋緊張症、正座不能、認知症、全体的運動協調性障害、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項22又は23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記姿勢不安定性が、不均衡障害、協調性障害、又はこれらの組合せを含んでなる、請求項41に記載の方法。
- 前記化合物が、以下の式:
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