ES2907180T3 - Procedimiento y dispositivo para la preparación de un implante procedente de un cultivo de células madre - Google Patents

Abstract

Procedimiento de preparación de un implante (70) que comprende un cultivo de células (73) sobre una membrana (34), comprendiendo el procedimiento unas etapas que consisten en: fijar la membrana sobre un soporte (30), disponer el soporte en un alojamiento (16) de una carcasa (10, 20) que habilita dos espacios (38, 39) que tienen unas alturas ajustadas, por encima y por debajo de la membrana, inyectar en los espacios un líquido adecuado para transformarse en gel a una temperatura de transporte inferior a una temperatura de inyección del líquido y llevar la carcasa a la temperatura de transporte, para formar un implante que comprende la membrana y dos capas de gel (71, 72) que tienen unos espesores ajustados, respectivamente sobre dos caras opuestas de la membrana.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento y dispositivo para la preparación de un implante procedente de un cultivo de células madre

La presente invención se refiere a la preparación de un injerto implantable, obtenido a partir de un cultivo de células madre, en concreto, unas células madre de mamíferos o de cualquier otro tipo que permita obtener unas células del ojo. La presente invención se aplica, en concreto, al tratamiento de enfermedades del epitelio pigmentario retiniano y de la retina neural.

La retina es la capa sensorial que reviste la cara posterior del ojo, recibe la imagen formada por la lente, traduce esta imagen en impulsos neurales que se transmiten al cerebro por el nervio óptico. La retina es un tejido neuronal que interactúa de forma crítica con el epitelio pigmentario retiniano que le es necesario para su supervivencia y su buen funcionamiento. La mácula que constituye la parte central de la retina, está enriquecida con fotorreceptores capaces de percibir los diferentes colores y los detalles visuales finos. Por lo tanto, la mácula es crucial, en concreto, para el reconocimiento facial y la lectura.

Unas numerosas enfermedades pueden afectar al epitelio pigmentario retiniano o la retina neural y arrastrar una alteración de la visión que puede conducir a la ceguera. De entre estas enfermedades, se pueden citar, en particular, las degeneraciones maculares hereditarias o relacionadas con la edad, las distrofias maculares y las retinitis pigmentarias. El epitelio retiniano o la retina neural puede presentar, igualmente, unas lesiones de origen traumático o infeccioso. Unas investigaciones recientes parecen demostrar que las lesiones de la retina se pueden retrasar, detener, incluso repararse por el trasplante de células de epitelio pigmentario retiniano o de células retinianas en el espacio subretiniano, lo que puede prevenir la reducción de las capacidades visuales provocada por estas enfermedades o mejorarlas en el caso de injertos de células de la retina neural.

Se han propuesto diversas formas de injertos o de técnicas de trasplante para intentar preservar la retina. Más recientemente, se han obtenido unos resultados prometedores trasplantando un cultivo de células de epitelio pigmentario retiniano obtenidas por diferenciación de células madre pluripotentes, cultivándose las células sobre una membrana. Por ejemplo, Nistor et al. (Journal of Neuroscience Methods, vol. 190, n.° 1, 30.06.2010) han descrito un procedimiento de preparación de un implante que comprende un cultivo de células sobre una membrana.

Para preparar un implante a partir de una membrana de este tipo, la membrana debe retirarse de un soporte de cultivo y recubrirse en los dos lados con una capa de gelatina. Para este propósito, la capa de gelatina se adelgaza e uniformiza previamente retirándole una capa superior con la ayuda de una máquina de recorte adaptada, llamada "vibratomo". La membrana se dispone, a continuación, sobre la capa de gelatina adelgazada. La capa de gelatina se adelgaza de nuevo al espesor deseado retirándole una capa inferior con la ayuda de la máquina de recorte. Finalmente, se vierte una gota de gelatina líquida (a 37 °C o - 10 °C) sobre las células cultivadas sobre la membrana, polimerizándose la gelatina en frío. La membrana que, de este modo, se dispone entre dos capas de gelatina polimerizada, se conserva y transporta, entonces, tal cual al sitio de utilización. En el momento del trasplante, la membrana se debe recortar manualmente a la forma deseada sustancialmente, de manera general al microscopio. El trasplante se efectúa, generalmente, con la ayuda de una jeringa con una aguja que tiene un diámetro inferior a las dimensiones del implante. De ello resulta que el implante atraviesa la aguja enrollado sobre sí mismo.

Se revela que este procedimiento de preparación presenta una gran complejidad, que necesita unas numerosas manipulaciones manuales ejercidas directamente sobre la membrana, sin que esta esté protegida. De ello resultan unos numerosos riesgos de alteración y de infección para el cultivo. Se revela, igualmente, que las capas de gelatina en cada lado de la membrana presentan unos espesores variables, que son, además, no uniformes. En efecto, la precisión de la máquina de recorte se revela insuficiente y el procedimiento empleado para formar la capa de gelatina superior conduce, generalmente, a la realización de una capa abombada. La máquina de recorte se revela, igualmente, de espacio necesario. Unas variaciones de espesor de este tipo arrastran unos riesgos de que el implante quede enrollado sobre sí mismo cuando sale de la aguja de inyección. En el caso de células de epitelio pigmentario retiniano, el implante se debe insertar debajo de la retina. Por lo tanto, hay que evitar que sea demasiado espeso durante su posicionamiento debajo de la retina. Por otro lado, como la membrana está separada de su soporte de cultivo, es difícil visualizar en qué lado de la membrana se encuentra el cultivo. De ello resultan unos riesgos importantes de que el implante se posicione en el lado malo al final de la operación de trasplante.

Por lo tanto, es deseable prever un procedimiento simplificado para realizar un implante de este tipo, eliminando los riesgos de alteración y de contaminación del cultivo. Es, igualmente, deseable que el implante presente un espesor controlado. Puede ser, igualmente, deseable que el implante presente unas dimensiones, igualmente, controladas, en particular, no relacionadas con unas operaciones manuales. Puede ser, igualmente, deseable eliminar los errores de posicionamiento del implante en el momento del trasplante.

Unos modos de realización se refieren a un procedimiento de preparación de un implante que comprende un cultivo de células sobre una membrana, comprendiendo el procedimiento unas etapas que consisten en: fijar la membrana sobre un soporte, disponer el soporte en un alojamiento de una carcasa que habilita dos espacios que tienen unas alturas ajustadas, por encima y por debajo de la membrana, inyectar en los espacios un líquido adecuado para transformarse en gel a una temperatura de transporte inferior a una temperatura de inyección del líquido y llevar la carcasa a la temperatura de transporte, para formar un implante que comprende la membrana y dos capas de gel que tienen unos espesores ajustados, respectivamente sobre dos caras opuestas de la membrana.

Según un modo de realización, el procedimiento comprende una etapa de recorte del implante en la membrana y las dos capas de gel, estando la membrana fijada al soporte y dispuesta en el alojamiento.

Según un modo de realización, el procedimiento comprende una etapa de cierre del alojamiento de la carcasa que recibe la membrana por una cubierta de extracción, estando la cubierta de extracción configurada para recibir y guiar una herramienta de recorte configurada para recortar el implante en la membrana y las dos capas de gel.

Según un modo de realización, el implante presenta una forma asimétrica.

Según un modo de realización, los espacios por encima y por debajo de la membrana están formados entre el fondo del alojamiento y una cubierta de preparación adaptada para volver a cerrar el alojamiento.

Según un modo de realización, el procedimiento comprende una etapa de sustitución de la cubierta de preparación por una cubierta de transporte que vuelve a cerrar el alojamiento de manera estanca, cuando el líquido inyectado en el alojamiento se ha polimerizado en gel.

Según un modo de realización, los líquidos inyectados en los espacios superior e inferior son diferentes, de manera que la capa de gel superior sea menos rígida que la capa de gel inferior.

Según un modo de realización, las células dispuestas sobre la membrana se derivan de células madre pluripotentes, de células madre adultas multipotentes o bien proceden de cultivos primarios o de líneas celulares o bien corresponden a un tipo celular de la zona de implantación o bien son unas células epiteliales simples o de diferentes subtipos, tales como unos fotorreceptores, unas células ganglionares, unas células bipolares, unas células amacrinas, unas células del epitelio pigmentario retiniano, unas células endoteliales. Las células madre pluripotentes humanas utilizadas para la implementación de la invención no necesitan la destrucción de embrión humano.

Unos modos de realización se pueden referir, igualmente, a un dispositivo de preparación de un implante a partir de un cultivo de células sobre una membrana, comprendiendo el dispositivo: un soporte que mantiene la membrana, una carcasa que incluye un alojamiento para recibir el soporte asociado a la membrana, habilitando el alojamiento dos espacios que tienen unas alturas ajustadas, por encima y por debajo de la membrana y un orificio de llenado para inyectar un líquido en los dos espacios, siendo el líquido adecuado para transformarse en gel a una temperatura de transporte inferior a una temperatura de inyección del líquido, estando el dispositivo configurado para implementar el procedimiento según la invención.

Según un modo de realización, el dispositivo comprende una cubierta de preparación configurada para volver a cerrar el alojamiento con el soporte, delimitando la cubierta de preparación con la membrana el espacio superior, estando el espacio inferior delimitado por el fondo del alojamiento y la membrana, comprendiendo la cubierta de preparación un orificio de llenado que desemboca en el espacio superior, comprendiendo la carcasa un orificio de llenado que desemboca en el espacio inferior.

Según un modo de realización, el dispositivo comprende una cubierta de transporte prevista para volver a cerrar el alojamiento de manera estanca.

Según un modo de realización, el dispositivo comprende una cubierta de extracción prevista para volver a cerrar el alojamiento y que incluye un conducto para el paso de una herramienta de recorte configurada para recortar un trozo de la membrana que consta de unas células cultivadas, formando el trozo de membrana recortado el implante.

Según un modo de realización, el dispositivo comprende al menos una de las siguientes características: los dos espacios presentan una altura comprendida entre 0,05 y 0,2 mm o bien entre 0,13 y 0,17 mm, el implante presenta una superficie comprendida entre 10 y 20 mm2, la membrana es una membrana amniótica o una membrana de Bruch o una membrana basal o una matriz de fibras proteicas, tales como unas fibras de colágeno y/o de fibrina o una membrana de un material sintético biocompatible, biodegradable o no, el líquido que se transforma en gel es un hidrogel natural o sintético biocompatible, que es líquido a la temperatura interior del cuerpo humano, el soporte de membrana presenta una forma troncocónica que incluye una abertura grande y una abertura pequeña, estando la membrana fijada sobre el soporte para obturar la abertura pequeña, realizándose el cultivo de células sobre una cara de la membrana dispuesta en el interior del soporte, la herramienta de recorte está configurada para recortar un trozo de membrana de forma asimétrica.

Unos modos de realización se pueden referir, igualmente, a una utilización del dispositivo anteriormente definido, para realizar un implante de células cultivadas sobre una membrana.

En lo que sigue, se describirán unos ejemplos de realización de la invención, a título no limitativo en relación con las figuras adjuntas, de entre las que:

las figuras 1 y 2 son unas vistas en perspectiva y en vista axial despiezada de un dispositivo de soporte de cultivo de células, según un modo de realización,

las figuras 3 a 5 son, respectivamente una vista desde arriba, una vista de perfil y una vista desde abajo de un dispositivo de manipulación de un cultivo de células, según un modo de realización,

las figuras 6 y 7 son, respectivamente una vista desde arriba, una vista de perfil de una cubierta de preparación de un implante, adaptada para fijarse sobre el dispositivo de manipulación, según un modo de realización,

la figura 8 es una vista de perfil de la cubierta de preparación, en corte según un plano BB mostrado en la figura 6,

las figuras 9 y 10 son unas vistas de perfil, respectivamente despiezada y no despiezada, del dispositivo de manipulación mostrado en corte según el plano AA indicado en la figura 3, asociado a la cubierta de preparación mostrada en corte según el plano CC indicado en la figura 6,

la figura 10A es una vista de perfil en corte detallada de una parte del dispositivo de manipulación provisto de la cubierta de preparación,

la figura 11 es una vista desde arriba de una cubierta de transporte, adaptada para fijarse sobre el dispositivo de manipulación, según un modo de realización,

la figura 12 es una vista de perfil de la cubierta de transporte, en corte según el plano DD mostrado en la figura 11,

la figura 13 es una vista del dispositivo de manipulación en corte según el plano AA mostrado en la figura 3, asociado a la cubierta de transporte en corte según el plano DD mostrado en la figura 11,

la figura 14 es una vista desde arriba de una cubierta de extracción del implante, según un modo de realización,

las figuras 15 y 16 son unas vistas de perfil en corte, respectivamente despiezada y no despiezada, del dispositivo de manipulación provisto de la cubierta de extracción y de un dispositivo de recorte, según un modo de realización, figurando la cubierta de extracción en corte según el plano EE mostrado en la figura 14, figurando el dispositivo de preparación en corte según el plano AA mostrado en la figura 3 y figurando el dispositivo de recorte en corte según el plano FF mostrado en la figura 17,

la figura 17 es una vista axial detallada desde abajo del extremo inferior del dispositivo de recorte y de una parte de la cubierta de extracción,

la figura 18 es una vista esquemática en corte de un implante obtenido por el procedimiento según un modo de realización.

Las figuras 1 y 2 representan un dispositivo que soporta 30 un cultivo de células, según un modo de realización. El dispositivo de soporte 30 comprende un elemento tubular, de forma troncocónica, 31, por ejemplo, de sección circular, sobre el que llega a encajarse una corona 32. El elemento tubular 31 presenta, de este modo, respectivamente en sus dos extremos, dos aberturas que tienen unos diámetros o anchuras diferentes, estando la abertura de menor anchura presentada hacia la parte de abajo en las figuras 1 y 2.

La corona 32 presenta, igualmente, una forma troncocónica cuya sección presenta una forma idéntica a la del elemento tubular 31. El borde de la abertura de mayor anchura de la corona 32 puede comprender unos tetones 33 que se extienden axialmente. Los tetones permiten distinguir más fácilmente las aberturas de la corona 32 para encajar esta sobre el elemento tubular 31 en el sentido correcto.

La anchura de la corona 32 es tal que esta última solamente puede deslizarse a lo largo de una parte del elemento tubular 31, a partir de la abertura de menor anchura del elemento tubular 31. Las células se cultivan sobre una membrana 34 que está fijada al dispositivo de soporte 30, estando atrapada entre el elemento tubular 31 y la corona 32. Las celdas sobre la membrana 34 se encuentran, de este modo, en el elemento tubular 31, estando la abertura de menor anchura del elemento tubular cerrada por la membrana 34. El cultivo de células se puede realizar como continuación de la fijación de la membrana 34 al extremo del elemento tubular 31.

Si en el ejemplo de las figuras 1 y 2, el dispositivo de soporte presenta una sección de forma circular, se puede considerar cualquier otra forma de sección, como una forma cuadrada, poligonal, rectangular, etc.

La membrana 34 puede presentar un espesor comprendido entre 50 y 100 gm y estar realizada de un material natural o sintético. De este modo, la membrana puede estar realizada a partir de una membrana amniótica, de una membrana de Bruch, de una membrana basal o de una matriz de fibras proteicas, tales como unas fibras de colágeno y/o de fibrina. Puede estar realizada, igualmente, de un material sintético biocompatible, tal como un polímero biodegradable. Es importante que las células del cultivo se adhieran a la membrana elegida.

Según un ejemplo de realización, las células del cultivo son unas células de epitelio pigmentario retiniano obtenidas a partir de células madre pluripotentes humanas dispuestas sobre una membrana amniótica desnuda, luego, cultivadas durante cuatro semanas.

Las figuras 3 a 5 representan un dispositivo de manipulación 10 de un cultivo de células, según un modo de realización.

El dispositivo de manipulación 10 comprende un alojamiento 16 previsto para recibir el dispositivo de soporte 30 y la membrana 34 y unos medios de cierre 15 y de fijación 13 de una cubierta que permite volver a cerrar el alojamiento 16, en concreto, cuando este último contiene el dispositivo de soporte 30. El dispositivo de manipulación 10 incluye, igualmente, un orificio de llenado 18 realizado en el fondo del alojamiento 16. El fondo del alojamiento 16 presenta, igualmente, un reborde anular 17.

En el ejemplo de las figuras 3 a 5, el dispositivo de manipulación 10 comprende una placa 11 solidaria con el alojamiento 16. El alojamiento 16 presenta una forma cilíndrica que incluye un borde externo de forma tubular 12, un borde superior plano, de forma anular, 12a, paralelo a la placa 11 y una nervadura anular 14 que prolonga axialmente el borde superior plano 12a. El alojamiento 16 incluye, igualmente, una ranura anular 15 en el interior de la nervadura 14, rodeando la ranura anular el alojamiento 16.

En el ejemplo de las figuras 3 a 5, los medios de fijación 13 incluyen unas aberturas 13 que tienen la forma de arcos anulares, realizadas en el borde superior plano 12a y que incluyen cada una dos partes de anchuras diferentes.

Las figuras 6 a 8 representan una cubierta de preparación 20 de un implante, adaptada para fijarse sobre el dispositivo de manipulación 10, según un modo de realización. La cubierta de preparación 20 comprende una placa superior de forma anular 22, prolongada en el exterior por una corona exterior 21 y en el interior, por una extensión tubular 26, que se extiende coaxialmente en el lado de la cara inferior de la placa superior 22. La cubierta de preparación 20 comprende, igualmente, unos medios de fijación 23 que se extienden en el lado inferior de la cubierta y conformados para cooperar con los medios de fijación 13 del dispositivo de manipulación 10. La extensión tubular 26 incluye un fondo 27 provisto de un orificio de llenado 28, que se extiende paralelamente a la placa superior 22. La cubierta de preparación 20 comprende, igualmente, una nervadura anular 29 que se extiende en el lado inferior de la cubierta y prevista para cooperar con la ranura anular 15 formada en el dispositivo de manipulación 10.

En el ejemplo de las figuras 6 a 8, los medios de fijación 23 presentan la forma de ganchos previstos para encajarse simultáneamente en la parte más ancha de las aberturas 13. Los ganchos 23 incluyen una parte axial prolongada por una parte radial prevista para bloquearse en la parte más estrecha de las aberturas 13 por un movimiento de rotación de la cubierta de preparación 20 alrededor de su eje con respecto al dispositivo de manipulación 10. La figura 5 muestra los ganchos 23 en trazos continuos encajados en la parte más ancha de las aberturas 13 y en trazos discontinuos en posición de enclavamiento, encajados en la parte más estrecha de las aberturas 13. Para facilitar el arrastre en rotación con la mano de la cubierta 20, la corona exterior 21 puede estar provista de muescas 25. Unas aberturas 24 pueden estar formadas en la placa superior 22, a plomo con las partes radiales de los ganchos 23 por unas razones de fabricación. El orificio 28 puede estar prolongado en el interior de la extensión tubular 26 por una conducción 28a en forma de embudo.

Las figuras 9 y 10 representan el conjunto del dispositivo de manipulación 10 asociado a la cubierta de preparación 20 y que encierra el dispositivo de soporte 30. En estas figuras se pone de manifiesto que cuando la cubierta 20 está enclavada sobre el dispositivo de manipulación 10, el conjunto del dispositivo de soporte 30 puede estar encerrado en el alojamiento 16. La estanqueidad del cierre del alojamiento 16 está asegurada gracias a una junta tórica 35 dispuesta en la ranura anular 15, estando la junta 35 comprimida por la nervadura anular 29 formada debajo de la cubierta 20.

La figura 10A muestra en detalle el fondo del alojamiento 16, con el extremo inferior 27 de la extensión tubular 26, el extremo inferior del dispositivo de soporte 30 y la membrana 34 que soporta el cultivo de células. En la figura 10A se pone de manifiesto que el reborde anular 17 formado en el fondo del alojamiento 16 permite mantener el dispositivo de soporte 30 y, por lo tanto, la membrana 34, a distancia del fondo del alojamiento 16, que delimita, de este modo, entre el fondo del alojamiento 16 y la membrana un espacio vacío en forma de disco 39 en el que desemboca el orificio de llenado 18.

Por otro lado, la extensión tubular 26 presenta una longitud tal que cuando la cubierta 20 está enclavada sobre el dispositivo de manipulación 10, el extremo inferior 27 de la extensión tubular 26 entra en contacto con la cara superior de la membrana 34. El extremo inferior 27 de la extensión tubular 26 incluye un reborde anular 27a, que habilita entre el extremo inferior 27 de la extensión tubular 26 y la membrana 34 un espacio vacío en forma de disco 38 en el que desemboca el orificio de llenado 28.

Según un modo de realización, los espacios vacíos 38, 39 que presentan una altura predefinida, están llenos de una sustancia, tal como un hidrogel natural o sintético biocompatible, que presenta un estado líquido a la temperatura del interior del cuerpo humano, esto es, 37 °C y que se polimeriza en gel a una temperatura inferior.

Según un ejemplo de realización, uno de los espacios 38, 39, está lleno con la sustancia en forma líquida. A continuación, el dispositivo de manipulación 10 se enfría para que el líquido se polimerice en gel. El otro espacio 38, 39 está lleno con la sustancia en forma líquida y el dispositivo de manipulación 10 se enfría de nuevo. Durante el llenado del espacio inferior 39, por ejemplo, con la ayuda de una micropipeta, por el orificio 18, el aire presente, inicialmente, en este espacio se evacua por unas entalladuras 17a formadas en el reborde anular 17 (figura 3). Durante el llenado del espacio superior 38 por el orificio 28, el aire presente en este espacio se evacua por el espacio entre el dispositivo de soporte 30 y la extensión tubular 26.

De este modo, el dispositivo de manipulación 10 combinado con la cubierta de preparación 20 permite preparar un implante que comprende la membrana 34 que soporta las células a trasplantar y cubierta en cada lado con una capa de gel. Esta operación no necesita separar la membrana 34 de su soporte 30. Los espesores de gel en cada lado de la membrana son fijos y definidos, de manera que el implante pueda enrollarse sobre sí mismo y, de este modo, pasar por la aguja de una jeringa utilizada para el trasplante y que presenta en la salida un diámetro de 1,8 a 2,2 mm. Los espesores de gel en cada lado de la membrana 34 se eligen, igualmente, para que el implante vuelva a encontrar una forma sustancialmente plana, naturalmente sin manipulación, a la salida de la aguja de la jeringa. Al final del trasplante, la sustancia en el estado de gel antes y durante el trasplante, pasa progresivamente al estado líquido y se mezcla con los fluidos corporales.

Según un modo de realización, el espacio inferior 39 está lleno con la sustancia en primer lugar, luego, el espacio superior 38 está lleno antes de que la sustancia inyectada en el espacio inferior 39 se polimerice totalmente. La cantidad de la sustancia inyectada por los dos orificios 18, 28 se puede ajustar para evitar que la membrana 34 se abombe. La concentración de la sustancia inyectada en el espacio superior 38 puede ser menor que la inyectada en el espacio inferior 39, con el fin de que el implante sea menos rígido y, por lo tanto, pueda curvarse más fácilmente hacia el lado de la membrana 34 que soporta el cultivo que hacia el otro lado.

Según un ejemplo de realización, la sustancia utilizada para llenar los espacios 38, 39, es la gelatina que está en el estado de gel a una temperatura inferior a 7 °C y en el estado líquido a 37 °C. La altura de los espacios 38, 39, es decir, el espesor de la capa de gel en cada lado de la membrana 34 está comprendido entre 0,05 y 0,2 mm y preferentemente comprendido entre 0,13 y 0,17 mm. El diámetro de los orificios 18, 28 puede ser de 1 mm (con o -20% de aproximación). La gelatina inyectada en el espacio inferior 39 se diluye a una concentración del 8% (+ o -2%) en suero fisiológico y se deja polimerizar durante 3 minutos a una temperatura de 4 °C (+ o -3 °C), obteniéndose la polimerización completa al cabo de 5 minutos a estas temperaturas. La gelatina inyectada en el espacio superior 38 se diluye a una concentración del 5% (+ o -2%) en suero fisiológico. El conjunto del dispositivo de manipulación 10 y de la cubierta 20, que consta del cultivo se mantiene, a continuación, a una temperatura inferior a 7 °C durante más de 5 minutos.

Las figuras 11 y 12 representan una cubierta de transporte 40, adaptada para fijarse sobre el dispositivo de manipulación 10, según un modo de realización. La figura 13 muestra la cubierta de transporte 40 fijada sobre el dispositivo de manipulación 10. Una vez que la sustancia requerida se ha inyectado en los espacios 38, 39 y se ha polimerizado en gel por refrigeración, la cubierta de preparación 20 se retira y sustituye por la cubierta de transporte 40. La cubierta de transporte 40 asociada al soporte 30 y al dispositivo de manipulación 10 asegura el mantenimiento del implante durante el transporte, con el fin de prevenir cualquier disociación de las capas de gelatina, en concreto, bajo el efecto de vibraciones.

Se puede utilizar previamente un líquido adaptado para llenar el volumen por encima de la capa de gel en el elemento tubular 31 del soporte 30, en concreto, con el fin de mantener la capa de gel en ambiente húmedo. Este líquido puede ser, por ejemplo, un líquido utilizado para el transporte de córnea humana, tal como el STEM ALPHA. 1 comercializado por la empresa STEM ALPHA. De este modo, el dispositivo de manipulación 10 asociado a la cubierta de transporte permite transportar el implante hasta el sitio donde se debe trasplantar y conservarlo en frío (a una temperatura inferior a 10 °C) hasta el momento del trasplante.

La cubierta de transporte 40 presenta una forma similar a la de la cubierta de preparación 20, pero sin extensión tubular 26. De este modo, la cubierta 40 comprende una placa superior en forma de disco 42, prolongada en el exterior por una corona exterior 41. La cubierta de transporte 40 comprende, igualmente, unos medios de fijación 43 que se extienden en el lado inferior de la cubierta y conformados para cooperar con los medios de fijación 13 del dispositivo de manipulación 10. La cubierta de transporte 40 comprende, igualmente, una nervadura anular 47 que se extiende en el lado inferior de la cubierta y prevista para cooperar con la junta tórica 35 dispuesta en la ranura anular 15 formada en el dispositivo de manipulación 10, para asegurar la estanqueidad del cierre del alojamiento 16. De este modo, el alojamiento 16 está cerrado de manera estanca, estando el orificio de llenado 18 obturado por el gel.

En el ejemplo de las figuras 11 a 13, los medios de fijación 43 presentan la forma de ganchos previstos para encajarse simultáneamente en la parte más ancha de las aberturas 13. Los ganchos 43 incluyen una parte axial prolongada por una parte radial prevista para bloquearse en la parte más estrecha de las aberturas 13 por un movimiento de rotación de la cubierta de transporte 40 alrededor de su eje con respecto al dispositivo de manipulación 10. Para facilitar el arrastre en rotación con la mano de la cubierta 40, la corona exterior 41 puede estar provista de muescas 45. Unas aberturas 44 pueden estar formadas en la placa superior 42, a plomo con las partes radiales de los ganchos 43 por unas razones de fabricación. La placa 42 puede comprender una ranura anular 48 que forma en el lado interior de la cubierta un reborde anular que asegura el mantenimiento de la parte superior del soporte 30.

La figura 14 representa una cubierta de extracción 50 del implante, según un modo de realización. Las figuras 15 y 16 representan el dispositivo de manipulación 10 provisto de la cubierta de extracción 50 y de un dispositivo de recorte 60, según un modo de realización. Una vez llegada al sitio de trasplante, la cubierta de transporte 40 se retira y sustituye por la cubierta de extracción 50. El dispositivo de recorte 60 se inserta en la cubierta de extracción 50 para tomar el implante recortando un trozo de la membrana que soporta el cultivo de células a implantar y recubierta en los dos lados con la capa de gel.

La cubierta de extracción 50 presenta una forma similar a la de la cubierta de preparación 20, en la que la extensión tubular inferior 26 se sustituye por una extensión tubular superior 56 que forma un conducto tubular que atraviesa la cubierta 50, que permite el paso del dispositivo de recorte 60. De este modo, la cubierta de extracción 50 comprende una placa superior de forma anular 52, prolongada en el exterior por una corona exterior 51. La cubierta de extracción 50 comprende, igualmente, unos medios de fijación 53 que se extienden en el lado inferior de la cubierta y conformados para cooperar con los medios de fijación 13 del dispositivo de manipulación 10. La cubierta de extracción 50 comprende, igualmente, una nervadura anular 57 que se extiende en el lado inferior de la cubierta y prevista para cooperar con la junta tórica 35 dispuesta en la ranura anular 15 formada en el dispositivo de manipulación 10, para asegurar la estanqueidad del cierre del alojamiento 16. La nervadura anular 57 delimita un alojamiento 58 para recibir la parte superior del dispositivo de soporte 30.

En el ejemplo de las figuras 14 a 16, los medios de fijación 53 presentan la forma de ganchos previstos para encajarse simultáneamente en la parte más ancha de las aberturas 13. Los ganchos 53 incluyen una parte axial prolongada por una parte radial prevista para bloquearse en la parte más estrecha de las aberturas 13 por un movimiento de rotación de la cubierta de extracción 50 alrededor de su eje con respecto al dispositivo de manipulación 10. Para facilitar el arrastre en rotación con la mano de la cubierta 50, la corona exterior 51 puede estar provista de muescas 55. Unas aberturas 54 pueden estar formadas en la placa superior 52, a plomo con las partes radiales de los ganchos 53 por unas razones de fabricación.

La extensión tubular superior 56 está prevista para recibir el dispositivo de recorte 60. El dispositivo de recorte 60 comprende una placa superior en forma de disco 61 cuya cara inferior está prolongada axialmente por una extensión tubular 62 provista de un conducto central axial pasante 63 que incluye un resalte 64 contra el que entra en apoyo una herramienta de recorte 65 encajada por la abertura inferior del conducto axial 63.

En el ejemplo de la figura 15, la extensión tubular superior 56 comprende una nervadura axial 69 prevista para cooperar con un surco formado en la pared interna del conducto axial 63, para forzar la orientación angular del dispositivo de recorte 60 con respecto a la cubierta 50 según un ángulo preciso. La extensión tubular 62 puede comprender una orejeta 67 formada en la vecindad del extremo libre de una lengüeta axial 66. La orejeta 67 está prevista para que al final de recorrido del dispositivo de recorte 60 en la cubierta 50, la orejeta 67 se borre ejerciendo una fricción sobre la extensión tubular superior 56. De este modo, el operador está obligado a apoyar sobre la placa 61 hasta que esté en tope contra el borde superior de la extensión tubular superior 56, lo que permite asegurar que la herramienta de recorte 65 ha atravesado bien la membrana 34 y sus dos capas de gel. En efecto, como se pone de manifiesto esto en la figura 16, la herramienta de recorte 65 entra en contacto con el fondo del alojamiento 16 cuando la placa 61 entra en tope contra el borde superior de la extensión tubular superior 56.

La figura 17 representa más en detalle el extremo inferior del dispositivo de recorte 60 y, en particular, la nervadura radial 69 que coopera con el surco radial 59 de la cubierta 50 y la forma de la herramienta de recorte 65. La herramienta de recorte 65 presenta la forma de un sacabocados de forma tubular, con un borde inferior afilado para recortar un trozo de la membrana 35 que soporta el cultivo de células a implantar recubierta en los dos lados con una capa de gel. La herramienta de recorte 65 permite recortar un trozo de membrana que tiene una forma no simétrica, para poder determinar sobre qué cara del implante se encuentra el cultivo de célula. Esta disposición permite disponer el implante correctamente en el cuerpo del paciente, en particular, si se debe colocar sobre una superficie. La cubierta de extracción 50 asegura, de este modo, unas funciones de guía y de orientación de la herramienta de recorte 65.

En el ejemplo de la figura 17, la herramienta de recorte 65 permite recortar un trozo de implante sustancialmente en forma de rectángulo cuya una esquina se ha retirado para darle una forma no simétrica. La orientación de la herramienta de recorte 65 obtenida gracias a la nervadura radial 69 que coopera con el surco radial 59 de la cubierta 50, se puede definir de manera que la cuchilla de la herramienta de recorte esté a distancia del orificio de llenado 18.

La figura 18 representa el implante 70 extraído de la membrana, obtenido después de la operación de recorte con la ayuda del dispositivo de recorte 60. El implante 70 comprende las dos capas de gel 71,72 que cubren, en un lado, la membrana 34 y, en el otro, el cultivo de células 73 formado sobre la membrana 34.

Cuando se retira la herramienta de recorte 60 de la cubierta de extracción 50, puede ocurrir que el implante 70 recortado, de este modo, quede en la herramienta de recorte 50. Como el dispositivo de recorte 60 y la herramienta de recorte 65 presentan una forma tubular, es posible introducir una varilla por la abertura superior del conducto axial 63 a través de la placa 61, para empujar el implante 70 fuera de la herramienta de recorte 65, presentando la varilla un diámetro inferior al del resalte 64. Si el implante 70 queda en el alojamiento 16, se puede extraer de este último con la ayuda de una espátula.

Para un implante de células de epitelio pigmentario de retina humana, la herramienta de recorte 65 permite recortar un trozo de membrana 34 de 2 a 6 mm por 1,2 a 4 mm, por ejemplo, de 5 por 3 mm o de 2,5 por 1,5 mm, esto es, una superficie comprendida entre 10 y 20 mm2, por ejemplo, 15 mm2 (pudiendo estos valores variar en unas proporciones del 20%). Estas dimensiones permiten extraer de la membrana 34 un implante que incluye algunos cientos de miles de células.

El implante 70 obtenido, de este modo, presenta un espesor y unas dimensiones perfectamente controlados. Se puede observar que durante toda la preparación y el transporte del implante 70, hasta su extracción en el momento de realizar el trasplante, la membrana 34 queda fijada a su soporte 30. De este modo, se evita cualquier riesgo de deterioro del cultivo de células. Los periodos donde la carcasa que encierra la membrana asociada a su soporte está abierta se limitan a las etapas de cambio de cubierta y a la etapa de recorte del implante. Por lo tanto, los riesgos de contaminación del implante quedan limitados. Además, el hecho de mantener la membrana 34 fijada a su soporte 30 hasta el recorte del implante 70 y de prever una forma asimétrica para el implante, permite conservar la memoria de la cara de la membrana que soporta el cultivo de células hasta la operación de trasplante. Por otro lado, las únicas herramientas que pueden ser necesarias a parte de los elementos anteriormente descritos se limitan a una varilla de empuje para, llegado el caso, hacer salir el implante de la herramienta de recorte 65, la jeringa de trasplante y una espátula para atrapar y disponer el implante en la jeringa.

Para el experto en la técnica se pondrá de manifiesto claramente que la presente invención es susceptible de diversas variantes de realización y diversas aplicaciones. En particular, la invención no se limita a una carcasa en la que se definen las capas de gel entre un alojamiento y una cubierta. En efecto, se puede prever utilizar una carcasa provista de una hendidura en la que se inserta la membrana separada de su soporte, presentando la hendidura una anchura calibrada.

Tampoco es necesario disponer de una cubierta de transporte. En efecto, se puede prever disponer la carcasa utilizada para el moldeo de las capas de gel (dispositivo de manipulación 10 la cubierta de preparación 20) en una bolsa estanca, no pudiendo las capas de gel fluir por los orificios 18, 28 en tanto en cuanto que la carcasa se mantiene a una temperatura suficientemente escasa. Se puede considerar, igualmente, cerrar de manera estanca los orificios 18, 28.

Tampoco es necesario disponer de una cubierta de extracción. En efecto, el trozo de membrana a implantar se puede recortar y extraer directamente del alojamiento 16 con la ayuda de un sacabocados. Se puede recortar, igualmente, por ejemplo, por medio de un escalpelo o de tijeras.

Tampoco es necesario que el implante presente una forma asimétrica. Se pueden concebir sencillamente otros medios para localizar la cara de la membrana que soporta el cultivo de células. De este modo, por ejemplo, la capa de gel formada sobre una de las dos caras de la membrana se puede colorear por medio de un colorante mezclado con el líquido inyectado por uno de los dos orificios 18, 28.

Se debe señalar, igualmente, que la preparación del implante con la ayuda de la cubierta de preparación 20 y la utilización del implante después de recorte de la membrana se pueden efectuar en unos sitios alejados geográficamente. Por consiguiente, no se puede efectuar la etapa de extracción del implante por recorte de la membrana.

Se puede prever, igualmente, llenar simultáneamente los espacios superior 38 e inferior 39 en cada lado de la membrana 34, por ejemplo, previendo unos pasos laterales en el reborde 27a (o suprimiendo este reborde) y en el elemento tubular 31 del soporte 30. En este caso, es necesario uno solo de los dos orificios 18, 28.

Por otro lado, se puede considerar cualquier otro medio de fijación de las cubiertas 20, 40, 50 sobre el dispositivo de preparación 10 que no sea el descrito. De este modo, las cubiertas 20, 40, 50 se pueden atornillar, igualmente, sobre el dispositivo de preparación 10 o fijarse a este último por sujeción a presión.

La invención se puede aplicar a otros implantes que no sean unos implantes de células de epitelio pigmentario retiniano. En efecto, la invención se puede aplicar al trasplante de células de la retina de subtipos variados y utilizados solos o en asociación (por ejemplo, para la retina: unos fotorreceptores, unas células ganglionares, unas células bipolares, unas células amacrinas, unas células del epitelio pigmentario retiniano, unas células endoteliales). Estas células se pueden asociar en monocapas o en capas pluriestratificadas para reconstruir una retina artificial. Puede tratarse, igualmente, en concreto, de células de la córnea o de cualquier otro tipo de células epiteliales. Más generalmente, la invención puede aplicarse a cualquier tipo de epitelio o de cultivo de células en monocapa sobre una membrana biológica o sintética.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de preparación de un implante (70) que comprende un cultivo de células (73) sobre una membrana (34), comprendiendo el procedimiento unas etapas que consisten en:

fijar la membrana sobre un soporte (30),

disponer el soporte en un alojamiento (16) de una carcasa (10, 20) que habilita dos espacios (38, 39) que tienen unas alturas ajustadas, por encima y por debajo de la membrana,

inyectar en los espacios un líquido adecuado para transformarse en gel a una temperatura de transporte inferior a una temperatura de inyección del líquido y

llevar la carcasa a la temperatura de transporte, para formar un implante que comprende la membrana y dos capas de gel (71, 72) que tienen unos espesores ajustados, respectivamente sobre dos caras opuestas de la membrana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende una etapa de recorte del implante (70) en la membrana (34) y las dos capas de gel (71,72), estando la membrana fijada al soporte (30) y dispuesta en el alojamiento (16).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende una etapa de cierre del alojamiento (16) de la carcasa (10) que recibe la membrana por una cubierta de extracción (50), estando la cubierta de extracción configurada para recibir y guiar una herramienta de recorte (60) configurada para recortar el implante (70) en la membrana (34) y las dos capas de gel (71,72).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el implante (70) presenta una forma asimétrica.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los espacios (38, 39) por encima y por debajo de la membrana (34) están formados entre el fondo del alojamiento (16) y una cubierta de preparación (20) adaptada para volver a cerrar el alojamiento.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una etapa de sustitución de la cubierta de preparación (20) por una cubierta de transporte (40) que vuelve a cerrar el alojamiento (16) de manera estanca, cuando el líquido inyectado en el alojamiento se ha polimerizado en gel.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los líquidos inyectados en los espacios superior (38) e inferior (39) son diferentes, de manera que la capa de gel superior (71) sea menos rígida que la capa de gel inferior (72).

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células dispuestas sobre la membrana se derivan de células madre pluripotentes, de células madre adultas multipotentes o bien proceden de cultivos primarios o de líneas celulares o bien corresponden a un tipo celular de la zona de implantación o bien son unas células epiteliales simples o de diferentes subtipos, tales como unos fotorreceptores, unas células ganglionares, unas células bipolares, unas células amacrinas, unas células del epitelio pigmentario retiniano, unas células endoteliales.

9. Dispositivo de preparación de un implante a partir de un cultivo de células sobre una membrana, comprendiendo el dispositivo:

un soporte (30) que mantiene la membrana (34),

una carcasa (10, 20) que incluye un alojamiento (16) para recibir el soporte asociado a la membrana, habilitando el alojamiento dos espacios (38, 39) que tienen unas alturas ajustadas, por encima y por debajo de la membrana y

un orificio de llenado (18, 28) para inyectar un líquido en los dos espacios, siendo el líquido adecuado para transformarse en gel a una temperatura de transporte inferior a una temperatura de inyección del líquido, estando el dispositivo configurado para implementar el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Dispositivo según la reivindicación 9, que comprende una cubierta de preparación (20) configurada para volver a cerrar el alojamiento (16) con el soporte (30), delimitando la cubierta de preparación con la membrana (34) el espacio superior (38), estando el espacio inferior (39) delimitado por el fondo del alojamiento y la membrana, comprendiendo la cubierta de preparación un orificio de llenado (28) que desemboca en el espacio superior, comprendiendo la carcasa un orificio de llenado (18) que desemboca en el espacio inferior.

11. Dispositivo según la reivindicación 9 o 10, que comprende una cubierta de transporte (40) prevista para volver a cerrar el alojamiento (16) de manera estanca.

12. Dispositivo según una de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende una cubierta de extracción (50) prevista para volver a cerrar el alojamiento (16) y que incluye un conducto (56) para el paso de una herramienta de recorte (60) configurada para recortar un trozo de la membrana (34) que consta de unas células cultivadas, formando el trozo de membrana recortado el implante (70).

13. Dispositivo según una de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende al menos una de las siguientes características:

los dos espacios (38, 39) presentan una altura comprendida entre 0,05 y 0,2 mm o bien entre 0,13 y 0,17 mm, el implante (70) presenta una superficie comprendida entre 10 y 20 mm2.

la membrana (34) es una membrana amniótica o una membrana de Bruch o una membrana basal o una matriz de fibras proteicas, tales como unas fibras de colágeno y/o de fibrina o una membrana de un material sintético biocompatible, biodegradable o no,

el líquido que se transforma en gel es un hidrogel natural o sintético biocompatible, que es líquido a la temperatura interior del cuerpo humano,

el soporte (30) de membrana presenta una forma troncocónica que incluye una abertura grande y una abertura pequeña, estando la membrana fijada sobre el soporte para obturar la abertura pequeña, realizándose el cultivo de células sobre una cara de la membrana dispuesta en el interior del soporte,

la herramienta de recorte (60) está configurada para recortar un trozo de membrana de forma asimétrica.

14. Utilización del dispositivo según una de las reivindicaciones 9 a 13, para realizar un implante de células cultivadas sobre una membrana (34).