ES2905163T3

ES2905163T3 - Marcadores de ARNm basados en sangre entera para predecir el cáncer de próstata y métodos para detectar los mismos

Info

Publication number: ES2905163T3
Application number: ES16713202T
Authority: ES
Inventors: Deborah Ricci; Michael Gormley; Shibu Thomas; Yashoda Rajpurohit; Michael Schaffer
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2022-04-07
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: PT3268493T; HRP20220128T1; KR20170136525A; WO2016145308A2; RS62972B1; CY1125020T1; EP3268493B1; MA45480A; PL3268493T3; US20160304962A1; DK3268493T3; SI3268493T1; CN107567502A; WO2016145308A3; IL254119A0; HUE058025T2; CA2979226A1; JP2018507702A; EP3268493A2; LT3268493T

Abstract

Un método para detectar biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente que comprende: aislar el ARN de la muestra de sangre entera; sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; y medir un nivel de expresión de KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, y SLCO1B3.

Description

DESCRIPCIÓN

Marcadores de ARNm basados en sangre entera para predecir el cáncer de próstata y métodos para detectar los mismos

CAMPO TÉCNICO

[0001] En el presente documento se describen biomarcadores de ARNm basados en sangre entera para predecir el cáncer de próstata y métodos para detectarlos. En particular, los marcadores y métodos de ARNm divulgados permiten la detección de biomarcadores de ARNm específicos del cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente, la identificación de un paciente con cáncer de próstata, la identificación de un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo y el tratamiento de un paciente con cáncer de próstata.

ANTECEDENTES

[0002] El cáncer de próstata es el segundo cáncer más común entre los hombres en los Estados Unidos. También es una de las principales causas de muerte por cáncer entre hombres de todas las razas y poblaciones de origen hispano. En 2010, 196.038 hombres en los Estados Unidos fueron diagnosticados con cáncer de próstata, mientras que 28.560 hombres en los Estados Unidos murieron de cáncer de próstata. (U.S. Cancer Statistics Working Group. United States Cancer Statistics: 1999-2010 Incidence and Mortality Web-based Report. Atlanta (GA): Departamento de Salud y Servicios Humanos, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades e Instituto Nacional del Cáncer; 2013).

[0003] Uno de los principales desafíos en el tratamiento del cáncer de próstata es la falta de pruebas para distinguir entre aquellos pacientes que deben ser tratados adecuadamente para detener la forma agresiva de la enfermedad y aquellos que deben evitar el sobretratamiento de la forma indolente. La heterogeneidad molecular del cáncer de próstata y la dificultad para adquirir tejido tumoral de los pacientes dificulta el manejo individualizado del cáncer de próstata.

[0004] El documento WO 2014/028925 se refiere a perfiles de expresión génica asociados con el cáncer de próstata.

[0005] Ross et al. La reunión anual de ASCO de 2009, el 1 de enero de 2009, se relaciona con una prueba de diagnóstico basada en transcritos de ARN de sangre entera para el diagnóstico de cáncer de próstata.

[0006] Olmos et al. (2012) Lancet Oncology, 12:11 página 1114 se relaciona con el valor pronóstico de las firmas de expresión de ARNm en sangre en el cáncer de próstata resistente a la castración.

RESUMEN

[0007] En el presente documento se proporciona un método para detectar biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente que comprende:

aislar el ARN de la muestra de sangre entera;

sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; y

medir un nivel de expresión de KLK3, Ac A d L, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, y SLCO1B3.

[0008] En algunas formas de realización del método de la invención, el ADNc se preamplifica después de la etapa de síntesis.

[0009] En un aspecto adicional del método de la invención, el ADNc se preamplifica durante 14 ciclos; y/o el ADNc se preamplifica mediante qRT-PCR.

[0010] En algunas formas de realización del método de la invención, el método comprende además identificar cáncer de próstata de alto riesgo si un nivel de expresión aumentado de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos.

[0011] En algunas formas de realización del método de la invención, el aumento de expresión de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1 y HOXB13 indica cáncer de próstata de alto riesgo.

[0012] En algunas formas de realización del método de la invención, el método comprende además comparar el nivel de expresión de ARV7 de la muestra de sangre entera del paciente con un nivel de referencia de expresión de ARV7, donde opcionalmente el nivel de referencia de ARV7 es un nivel de expresión de ARV7 en una muestra de sangre entera de un individuo sin cáncer de próstata; y/o determinar si el nivel de expresión de ARV7 de la muestra de sangre entera del paciente aumenta o disminuye en relación con el nivel de referencia de expresión de ARV7.

[0013] En algunas formas de realización del método de la invención la muestra de sangre se recoge en un tubo de recogida de sangre.

[0014] También se proporciona aquí el uso de un chip genético que comprende pares de cebadores y un panel de sondas configurado para amplificar y detectar KLK3, PGR, KCNN2, m Yb PC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PiTX2, ACADL, SFRP4, Ag R2, HNF1A, Gr Hl2, o cualquier combinación de los mismos, para el método de la invención.

[0015] En algunas formas de realización de la utilización de la invención, el chip de genes comprende pares de cebadores y un panel de sondas configurado para amplificar y detectar KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1 A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8 y SLCO1B3.

[0016] También se proporciona en este documento un método para identificar a un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo que comprende:

obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente;

poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un conjunto de pares de cebadores y un panel de sondas específicas para biomarcadores de ARNm indicativos de cáncer de próstata de alto riesgo, en el que los biomarcadores de ARNm se seleccionan del grupo que consiste en KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A y GRHL2;

y medir los niveles de expresión de todos los biomarcadores de ARNm; y

donde se mide un aumento en el nivel de expresión de al menos ocho de los biomarcadores de ARNm en comparación con un nivel de referencia de al menos ocho biomarcadores de ARNm.

[0017] En el presente documento se describen métodos para detectar biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente. Los métodos comprenden, consisten en y/o consisten esencialmente en: aislar ARN de la muestra de sangre entera; sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; y medir un nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm, donde el al menos un biomarcador de ARNm es o se selecciona del grupo que consiste esencialmente en KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARv7(ARV3.7), ARV567... FOLH1... KLK2... HSD3B2... AGR2... AZGP1... STEAP2... KCNN2... GPX8... SLCO1B3... TMEFF2... SPINK1... SFRP4... NROB1... FAM13C... HNF1A... CDH12... PGR... PITX2... MYBPC1... FOXA1... SRD5A2... COL1A1... NPY... UGT2B17 CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 y/o cualquier combinación de los mismos.

[0018] También se describen métodos para la detección de ARv7 (ARV3.7) en una muestra de sangre entera de un paciente. Los métodos comprenden, consisten y/o consisten esencialmente en aislar ARN de la muestra de sangre entera, sintetizar ADNc a partir del ARN aislado y medir un nivel de expresión de ARv7 (ARV3.7).

[0019] También se describen métodos de identificación de un paciente con cáncer de próstata que comprende, que consiste en y/o consiste esencialmente en la obtención de ADNc a partir de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1; medir un nivel de expresión de COL1A1; y comparar el nivel de expresión de COL1A1 con un nivel de referencia de COL1A1, en el que un aumento en el nivel de expresión de COL1A1 en la muestra de sangre entera en comparación con el nivel de referencia es indicativo de cáncer de próstata.

[0020] También se describen métodos de identificación de un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo. Los métodos comprenden, consisten en y/o consisten esencialmente en obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm indicativo de cáncer de próstata de alto riesgo, en el que al menos un biomarcador de ARNm comprende, consiste en y/o consiste esencialmente en un miembro seleccionado del grupo que consiste en KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 y/o cualquier combinación de los mismos; medir un nivel de expresión del al menos un biomarcador de ARNm; y comparar el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm con un nivel de referencia de al menos un biomarcador de ARNm, en el que un aumento en el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm en comparación con el nivel de referencia indica cáncer de próstata de alto riesgo. Además, los biomarcadores de ARNm se pueden combinar en un panel de biomarcadores que incluye múltiples biomarcadores de ARNm. Un sujeto se denominaría biomarcador positivo si se detectara un valor mayor o igual a un valor predeterminado, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9. El estado positivo del biomarcador indica cáncer de próstata de alto riesgo.

[0021] Además, se describen métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata que comprenden, consisten o y/o consisten esencialmente en obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1; medir un nivel de expresión de COL1A1; comparar el nivel de expresión de COL1A1 con un nivel de referencia de COL1A1; y tratar al paciente de cáncer de próstata si el nivel de expresión de COL1A1 aumenta en comparación con el nivel de referencia de COL1A1. Este ejemplo no pretende ser limitativo, por ejemplo, la expresión de biomarcadores de ARNm o el estado positivo de biomarcador descrito en este documento también se puede usar para seleccionar pacientes para tratamiento.

[0022] También se describen chips de genes para detectar transcritos de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente, que comprenden, consisten en y/o consisten esencialmente en un par de cebadores y una sonda configurada para amplificar y detectar un miembro seleccionado del grupo formado por KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 y/o cualquier combinación de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023] El resumen, así como la siguiente descripción detallada, se entiende aún más cuando se lea conjuntamente con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar los métodos y chips genéticos descritos, en los dibujos se muestran formas de realización ejemplares de los métodos y chips genéticos; sin embargo, los métodos y los chips genéticos no se limitan a las formas de realización específicas descritas. En los dibujos:

FIG. 1 representa una curva ROC de ejemplo para COL1A1 que muestra el compromiso entre sensibilidad y especificidad en todos los niveles de expresión del marcador. El punto indica el punto de corte óptimo que maximiza la sensibilidad y la especificidad.

FIG. 2 representa una curva de Kaplan-Meier ejemplar para un biomarcador o panel de biomarcadores que muestra la proporción de sujetos que no han experimentado un evento como la recurrencia de la enfermedad o la muerte por enfermedad en un tiempo específico representado en el eje x. Los sujetos biomarcadores positivos y biomarcadores negativos están representados por las líneas rojas y negras respectivamente. Los sujetos positivos para biomarcadores tienen una probabilidad significativamente mayor de experimentar un evento antes que los sujetos negativos para biomarcadores, es decir, los sujetos positivos para biomarcadores tienen un peor pronóstico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN ILUSTRATIVAS

[0024] Los métodos y chips genéticos descritos pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las Figuras adjuntas, que forman parte de esta descripción. Debe entenderse que los métodos y chips de genes divulgados no se limitan a los métodos y chips de genes específicos descritos y/o mostrados en este documento, y que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir formas de realización particulares solo a modo de ejemplo y no pretende ser limitante de los métodos y chips genéticos reivindicados.

[0025] A menos que se indique específicamente lo contrario, cualquier descripción de un posible mecanismo o modo de acción o motivo de mejora pretende ser solo ilustrativa, y los métodos divulgados no deben estar limitados por la corrección o incorrección de dicho mecanismo sugerido o modo de acción o motivo de mejora.

[0026] La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cuando se expresa un rango de valores, otra forma de realización incluye desde un valor particular y/o hasta otro valor particular. Además, la referencia a valores establecidos en rangos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese rango. Todos los rangos son inclusivos y combinables.

[0027] Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "sobre", se entenderá que el valor particular forma otra forma de realización.

[0028] Debe apreciarse que ciertas características de los métodos divulgados y los chips genéticos que, para mayor claridad, se describen aquí en el contexto de formas de realización separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola forma de realización. Por el contrario, diversas características de los métodos y chips genéticos descritos que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola forma de realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación.

[0029] Como se usa en este documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y "ella" incluyen el plural.

[0030] Como se usa en el presente documento, el término "paciente" se refiere a cualquier mamífero cuyas muestras de sangre entera se pueden analizar con los métodos descritos. Por lo tanto, los métodos descritos son aplicables a sujetos humanos y no humanos, aunque se usa más preferiblemente para humanos. En algunas formas de realización, la muestra del paciente es una muestra humana. En otras formas de realización, la muestra del paciente es una muestra no humana. "Paciente" y "sujeto" pueden usarse indistintamente en este documento.

[0031] Tal como se utiliza aquí, la expresión "poner en contacto ADNc con un chip de genes" se refiere a un procedimiento por el ADNc obtenido de una muestra de sangre entera del paciente se incuba con, o se añade a un chip de gen a fin de evaluar la expresión génica.

[0032] La frase "aumento en el nivel de expresión" abarca tanto la presencia del biomarcador de ARNm como un nivel elevado del biomarcador de ARNm en relación con una muestra de referencia. Por ejemplo, uno o más de los biomarcadores de ARNm divulgados pueden estar ausentes de una muestra de referencia. Para tales biomarcadores de ARNm, el término "aumento en el nivel de expresión" se refiere a la presencia del biomarcador de ARNm en la muestra de sangre entera del paciente. Por el contrario, uno o más de los biomarcadores de ARNm divulgados pueden estar presentes en algún nivel en una muestra de referencia. Para tales biomarcadores de ARNm, el término "aumento en el nivel de expresión" se refiere a un nivel elevado del biomarcador de ARNm en la muestra de sangre entera del paciente en comparación con la muestra de referencia.

[0033] Como se usa en el presente documento, "muestra de referencia" se refiere a una muestra de sangre entera de un individuo o población de individuos que no tiene, y no ha tenido en el pasado, cáncer de próstata. En consecuencia, "nivel de referencia de" se refiere al nivel de expresión de uno o más biomarcadores revelados en una muestra de sangre entera de un individuo o población de individuos que no tiene, y no ha tenido en el pasado, cáncer de próstata.

[0034] Como se usa en este documento, "un par de cebadores" se refiere a un cebador directo y un cebador inverso para amplificar el ADNc del biomarcador de ARNm de interés.

Detección de biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata

[0035] En el presente documento se divulgan procedimientos de detección de biomarcadores específicos de cáncer de próstata de ARNm en una muestra de sangre entera de un paciente. Los métodos comprenden: aislar el ARN de la muestra de sangre entera; sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; opcionalmente, preamplificar el ADNc y medir un nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm, en el que al menos un biomarcador de ARNm es KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7(ARV3.7) (también conocido como ARV7), ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos.

[0036] Los métodos descritos permiten la detección de biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera. La detección de estos marcadores se puede usar para identificar/diagnosticar un paciente con cáncer de próstata, identificar a un paciente con/predecir cáncer de próstata de alto riesgo y tratar a un paciente con cáncer de próstata.

[0037] Como se usa en este documento, la frase "biomarcador de ARNm específico del cáncer de próstata" se refiere a biomarcadores de ARNm individuales o grupos de biomarcadores de ARNm (es decir, dos o biomarcadores más asociados) que se pueden usar para detectar el cáncer de próstata a partir de una muestra de sangre entera. Los biomarcadores de ARNm de ejemplo se enumeran en la Tabla 1 e incluyen, entre otros, KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 y CYP3A5.

Tabla 1 - Biomarcadores de ARNm ejemplares

(Continuación)

[0038] Biomarcadores de ARNm adecuados pueden ser funcionalmente clasificados como grupo de andrógenos controlado, grupo de resistencia de abiraterona, el grupo de derivación neuroendocrino, u otra vía de bypass. Por tanto, en algunos casos, el al menos un biomarcador de ARNm puede ser un miembro del grupo controlado por andrógenos, grupo de resistencia a abiraterona, grupo de derivación neuroendocrina, otra vía de derivación o cualquier combinación de los mismos.

[0039] El perfil de expresión de sangre entera ofrece varias ventajas prácticas sobre el tejido tumoral, incluida la naturaleza mínimamente invasiva de la adquisición de muestras, la relativa facilidad de estandarización de los protocolos de muestreo y la capacidad de obtener muestras repetidas a lo largo del tiempo, ya que no se toman tejidos tumorales. como parte del estándar de atención. Puede obtenerse una muestra de sangre entera de un paciente mediante una serie de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a punción venosa. La muestra de sangre entera se puede recolectar en un tubo de recolección de sangre. En algunas formas de realización, el tubo de recogida de sangre puede ser un tubo de la marca PAXgene® Blood RNA.

[0040] Las técnicas para aislar ARN a partir de una muestra de sangre entera se conocen en la técnica. Los kits adecuados disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, el kit QIAGEN PAXgene Blood RNA, cuyo procedimiento se describe en la sección de ejemplos.

[0041] Las técnicas para la síntesis de ADNc a partir de ARN aislado se conocen en la técnica, incluyendo, pero no se limitan a la transcripción inversa del ARN.

[0042] En algunas formas de realización, el ADNc puede ser pre-amplificado después de la etapa de síntesis. El paso de preamplificación se puede realizar para cualquier número adecuado de ciclos. El número de ciclos depende, en parte, de la cantidad de ADNc inicial y/o la cantidad de ADNc requerida para realizar la etapa de amplificación. Los números adecuados de ciclos de preamplificación incluyen, pero no se limitan a 1 a 20 ciclos. En consecuencia, el paso de preamplificación se puede realizar para cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ciclos. En algunos aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 2 ciclos. En otros aspectos, la etapa de preamplificación se puede realizar durante 14 ciclos. En otros aspectos más, la etapa de preamplificación se puede realizar durante más de 20 ciclos.

[0043] La medición del nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm comprende amplificar el ADNc y detectar el ADNc amplificado usando un chip de gen, en el que el chip de gen comprende un par de cebadores y una sonda para KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP..ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CD1PCIT1, PGR, PGR, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, el chip génico puede comprender un par de cebadores y una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar. En otros aspectos, el chip génico puede comprender más de un par de cebadores y más de una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar.

[0044] Sin pretender imponer ninguna teoría, el ADNc preamplificado añadido al chip génico se unirá y amplificará mediante el par de cebadores específico para una región dentro del biomarcador de ARNm de interés. A medida que se amplifica el ADNc, el ADNc amplificado se unirá a una sonda específica para una región dentro del biomarcador de ARNm de interés. La unión de la sonda al ADNc amplificado permitirá la detección del ADNc amplificado a medida que se produce el proceso de amplificación. Por tanto, los métodos descritos permiten la detección de un nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm en una etapa temprana en el proceso de amplificación, lo que permite una mayor sensibilidad y precisión.

[0045] La etapa de medición se puede realizar en ADNc preamplificado o no preamplificado. La amplificación del ADNc se puede realizar, por ejemplo, mediante qRT-PCR. Los expertos en la técnica conocen los reactivos y las condiciones adecuadas. qRT-PCR se puede realizar en varias plataformas adecuadas. En algunos aspectos, por ejemplo, la qRT-PCR se puede realizar utilizando Fluidigm™. En consecuencia, en algunas formas de realización, el paso de medición puede comprender la amplificación de ADNc por qRT-PCR utilizando el chip de expresión génica Fluidigm™ en una plataforma Fluidigm™, en el que el chip de expresión génica comprende al menos un biomarcador de ARNm como se discutió anteriormente.

[0046] También se describen métodos para detectar ARV7 (ARV3.7) en una muestra de sangre entera de un paciente. Los métodos descritos comprenden aislar el ARN de la muestra de sangre entera, sintetizar el ADNc del ARN aislado y medir el nivel de expresión de ARV3.7.

[0047] En algunas formas de realización, el ADNc se puede preamplificar después del paso de síntesis. Los números adecuados de ciclos de preamplificación incluyen, pero no se limitan a de 1 a 20 ciclos. En consecuencia, el paso de preamplificación se puede realizar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ciclos. En algunos aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 2 ciclos.

[0048] La muestra de sangre entera se puede recoger en un tubo de recogida de sangre, tal como un tubo PAXgene® Blood RNA.

[0049] El paso de medición se puede realizar utilizando cualquiera de los chips de genes descritos que comprenden un cebador y una sonda para ARV3.7. En algunos casos, el paso de medición se puede realizar utilizando un chip genético que comprende un cebador directo de SEQ ID NO:2 y un cebador inverso de SEQ ID NO:3. En algunos aspectos, el chip genético puede comprender además una sonda de SEQ ID NO:1.

[0050] Los métodos de detección de expresión de ARV7 (ARV3.7) puede comprender además comparar el nivel de expresión de ARV7 (ARV3.7) a partir de muestra de sangre entera del paciente a un nivel de referencia de expresión de ARV7 (ARV3.7). Los niveles de referencia adecuados de expresión de ARV7 (ARV3.7) incluyen, por ejemplo, el nivel de referencia de ARV7 (ARV3.7) en una muestra de sangre entera de un individuo sin cáncer de próstata. El paso de comparación se puede utilizar para determinar si el nivel de expresión de ARV7 (ARV3.7) de la muestra de sangre entera del paciente aumenta o disminuye en relación con el nivel de referencia de expresión de ARV7 (ARV3.7).

Métodos para identificar a un paciente con cáncer de próstata

[0051] También se describen en este documento métodos para identificar a un paciente con cáncer de próstata. Los métodos descritos comprenden: obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1; medir un nivel de expresión de COL1A1; y comparar el nivel de expresión de COL1A1 con un nivel de referencia de COL1A1, en el que un aumento en el nivel de expresión de COL1A1 en la muestra de sangre entera en comparación con el nivel de referencia es indicativo de cáncer de próstata.

[0052] El ADNc se puede obtener a partir de una muestra de sangre entera aislando el ARN de la muestra de sangre entera y sintetizando el ADNc del ARN aislado. Las técnicas adecuadas para aislar ARN y sintetizar ADNc incluyen las descritas anteriormente y las descritas adicionalmente en la sección de ejemplos. En algunas formas de realización, el ADNc se puede preamplificar después del paso de síntesis. El paso de preamplificación se puede realizar para cualquier número adecuado de ciclos que incluyen, pero no se limitan a 1 a 20 ciclos. En consecuencia, el paso de preamplificación se puede realizar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ciclos. En algunos aspectos, el paso de preamplificación puede realizarse durante 14 ciclos.

[0053] En algunos casos, el chip genético comprende además un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, en el que al menos un biomarcador de ARNm adicional es KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3 7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos. En los casos en los que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, los métodos comprenden además: medir un nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm adicional; y comparar el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm adicional con un nivel de referencia de al menos un biomarcador de ARNm adicional, en el que un aumento en el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm adicional en comparación con el nivel de referencia indica cáncer de próstata.

[0054] En algunos aspectos, el chip genético puede comprender un par de cebadores y una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar. En otros aspectos, el chip genético puede comprender más de un par de cebadores y más de una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar.

[0055] En los casos en los que el chip genético comprende además un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, los métodos comprenden medir un nivel de expresión de COL1A1 y el al menos un biomarcador de ARNm adicional, y comparar el nivel de expresión de COL1A1 y el al menos un biomarcador de ARNm adicional a un nivel de referencia de COL1A1 y el al menos un biomarcador de ARNm adicional. Por ejemplo, y sin pretender limitarlos, en algunos casos los métodos pueden comprender poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1 y un par de cebadores y una sonda para MYBPC1, midiendo un nivel de expresión de COLIA1 y MYBPC1, y comparar el nivel de expresión de COLIA1 y MYBPC1 con un nivel de referencia de COLIA1 y MYBPC1, en el que un aumento en el nivel de expresión de COL1A1 y MYBPC1 en la muestra de sangre entera en comparación con el nivel de referencia es indicativo de próstata cáncer.

[0056] Medir un nivel de expresión de COL1A1 solo o en combinación con al menos un biomarcador de ARNm adicional comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores para COL1A1 solo o en combinación con un cebador para al menos un biomarcador de ARNm adicional y detección del ADNc amplificado con una sonda para COL1A1 sola o en combinación con una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional. El paso de medición se puede realizar en ADNc preamplificado o no preamplificado. La amplificación de ADNc se puede realizar, por ejemplo, mediante qRT-PCR. Los reactivos y condiciones adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. qRT-PCR se puede realizar en varias plataformas adecuadas. En algunos aspectos, por ejemplo, la qRT-PCR se puede realizar utilizando Fluidigm™. En consecuencia, en algunas formas de realización, el paso de medición puede comprender la amplificación de ADNc por qRT-PCR usando el chip de expresión génica Fluidigm™ en una plataforma Fluidigm™, donde el chip de expresión génica comprende un cebador para COL1A1 solo o en combinación con un cebador para al menos un biomarcador de ARNm adicional como se discutió anteriormente.

[0057] La muestra de sangre entera se puede recoger en un tubo de recogida de sangre que incluye, pero no se limita a un tubo de ARN del gen PAX.

[0058] Los métodos para identificar a un paciente con cáncer de próstata pueden comprender además confirmar el nivel de expresión del al menos un biomarcador de ARNm mediante PCR en tiempo real.

[0059] En algunas formas de realización, los métodos pueden comprender además la asignación de un factor de riesgo al cáncer de próstata, en el que un nivel de expresión aumentado de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13 o cualquier combinación de los mismos indica cáncer de próstata de alto riesgo.

Métodos de identificación de un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo

[0060] También se describen métodos de identificación de un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo. Los métodos comprenden: obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y un panel de biomarcadores de ARNm indicativos de cáncer de próstata de alto riesgo, en el que el panel comprende KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos; medir un nivel de expresión del al menos un biomarcador de ARNm; y comparar el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm con un nivel de referencia de al menos un biomarcador de ARNm, en el que un aumento en el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm en comparación con el nivel de referencia indica cáncer de próstata de alto riesgo.

[0061] Los métodos divulgados permiten la predicción de cáncer de próstata de alto riesgo basado en la detección de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos a partir de una muestra de sangre entera.

[0062] El ADNc se puede obtener a partir de una muestra de sangre entera aislando el ARN de la muestra de sangre entera y sintetizando el ADNc del ARN aislado. Las técnicas adecuadas para aislar ARN y sintetizar ADNc incluyen las descritas anteriormente y las descritas adicionalmente en la sección de ejemplos. En algunas formas de realización, el ADNc se puede preamplificar después del paso de síntesis. El paso de preamplificación se puede realizar para cualquier número adecuado de ciclos. El número de ciclos depende, en parte, de la cantidad de ADNc inicial y/o la cantidad de ADNc requerida para realizar el paso de amplificación. Los números adecuados de ciclos de preamplificación incluyen, pero no se limitan a de 1 a 20 ciclos. En consecuencia, el paso de preamplificación se puede realizar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ciclos. En algunos aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 2 ciclos. En otros aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 14 ciclos. En otros aspectos más, el paso de preamplificación se puede realizar durante más de 20 ciclos.

[0063] Medir un nivel de expresión de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores para KLK3, PGR, KCNN2, m Yb PC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos, y detectar el amplificado ADNc con sonda para KLK3, pGr , KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos. El paso de medición se puede realizar en ADNc preamplificado o no preamplificado. La amplificación de ADNc se puede realizar, por ejemplo, mediante qRT-PCR. Los reactivos y condiciones adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. qRT-PCR se puede realizar en varias plataformas adecuadas. En algunos aspectos, por ejemplo, la qRT-PCR se puede realizar utilizando Fluidigm™. En consecuencia, en algunas formas de realización, el paso de medición puede comprender la amplificación del ADNc por qRT-PCR utilizando el chip de expresión génica Fluidigm™ en una plataforma Fluidigm™, en el que el chip de expresión génica comprende un cebador para KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos, como se mencionó anteriormente.

[0064] En algunos aspectos, el chip genético puede comprender un par de cebadores y una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar. En otros aspectos, el chip genético puede comprender más de un par de cebadores y más de una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar.

[0065] La muestra de sangre entera se puede recoger en un tubo de recogida de sangre que incluye, pero no se limita a un tubo de ARN del gen PAX.

[0066] Los métodos para identificar a un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo pueden comprender además confirmar el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm mediante PCR en tiempo real.

[0067] En algunas formas de realización, el método puede implicar medir el nivel de expresión de más de un biomarcador de ARNm mediante PCR en tiempo real y detectar más de un número umbral de marcadores con expresión positiva. En estas formas de realización, los pacientes con más de un número umbral de marcadores con expresión positiva se consideran biomarcadores positivos. El estado de biomarcador positivo se asocia con una mayor probabilidad de enfermedad de alto riesgo.

Métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata

[0068] En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata que comprenden: obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente; poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1; medir un nivel de expresión de COL1A1; comparar el nivel de expresión de COL1A1 con un nivel de referencia de COL1A1; y tratar al paciente si el nivel de expresión de COL1A1 aumenta en comparación con el nivel de referencia de COL1A1.

[0069] En algunos casos, el chip genético comprende además un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, en el que al menos un biomarcador de ARNm adicional es KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3 7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos. En los casos en los que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, los métodos comprenden además: medir un nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm adicional; comparar el nivel de expresión del al menos un biomarcador de ARNm adicional con un nivel de referencia del al menos un biomarcador de ARNm adicional; y tratar al paciente si el nivel de expresión de al menos un biomarcador de ARNm adicional aumenta en comparación con la referencia de al menos un biomarcador de ARNm adicional.

[0070] En otros casos, el chip de genes comprende además un par de cebadores y sonda para múltiples biomarcadores de ARNm.

[0071] En algunos aspectos, el chip genético puede comprender un par de cebadores y una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar. En otros aspectos, el chip genético puede comprender más de un par de cebadores y más de una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar.

[0072] En los casos en los que el chip genético comprende además un par de cebadores y una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional, los métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata comprenden medir un nivel de expresión de COL1A1 y al menos un biomarcador de ARNm adicional, comparar el nivel de expresión de COL1A1 y al menos un biomarcador de ARNm adicional con un nivel de referencia de COL1A1 y al menos un biomarcador de ARNm adicional, y tratar al paciente si el nivel de expresión de COL1A1 y al menos un biomarcador de ARNm adicional aumenta en comparación al nivel de referencia de COL1A1 y al menos un biomarcador de ARNm adicional. Por ejemplo, y sin pretender limitarlos, en algunos casos los métodos pueden comprender poner en contacto el ADNc con un chip genético, en el que el chip genético comprende un par de cebadores y una sonda para COL1A1 y un par de cebadores y una sonda ^{para MYBPC1, midiendo un nivel de expresión de COL}1^A1 ^{y MYBPC1, comparar el nivel de expresión de COL1A1 y}MYBPC1 con un nivel de referencia de COL1A1 y MYBPC1, y tratar al paciente si el nivel de expresión de COL1A1 y MYBPC1 aumenta en comparación con el nivel de referencia de COL1A1 y MYBPC1.

[0073] En los casos en los que el chip genético comprende además un cebador y una sonda para múltiples biomarcadores de ARNm, los métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata comprenden medir un nivel de expresión de múltiples biomarcadores de ARNm, comparando el nivel de expresión de biomarcadores de ARNm con una referencia el nivel de expresión de cada biomarcador de ARNm, y tratar al paciente si se detecta un número superior al umbral de biomarcadores de ARNm con un nivel de expresión superior al nivel de referencia.

[0074] El ADNc se puede obtener a partir de una muestra de sangre entera aislando el ARN de la muestra de sangre entera y sintetizando el ADNc del ARN aislado. Las técnicas adecuadas para aislar ARN y sintetizar ADNc incluyen las descritas anteriormente y las descritas adicionalmente en la sección de ejemplos. En algunas formas de realización, el ADNc se puede preamplificar después del paso de síntesis. El paso de preamplificación se puede realizar para cualquier número adecuado de ciclos. El número de ciclos depende, en parte, de la cantidad de ADNc inicial y/o la cantidad de ADNc requerida para realizar el paso de amplificación. Los números adecuados de ciclos de preamplificación incluyen, pero no se limitan a de 1 a 20 ciclos. En consecuencia, el paso de preamplificación se puede realizar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ciclos. En algunos aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 2 ciclos. En otros aspectos, el paso de preamplificación se puede realizar durante 14 ciclos. En otros aspectos más, el paso de preamplificación se puede realizar durante más de 20 ciclos.

[0075] Medir un nivel de expresión de COL1A1 solo o en combinación con al menos un biomarcador de ARNm adicional comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores para COL1A1 solo o en combinación con un par de cebadores para al menos un biomarcador de ARNm adicional, y detectar el ADNc amplificado con una sonda para COL1A1 sola o en combinación con una sonda para al menos un biomarcador de ARNm adicional. El paso de medición se puede realizar en ADNc preamplificado o no preamplificado. La amplificación de ADNc se puede realizar, por ejemplo, mediante qRT-PCR. Reactivos y condiciones adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. qRT-PCR se puede realizar en varias plataformas adecuadas. En algunos aspectos, por ejemplo, la qRT-PCR se puede realizar utilizando Fluidigm™. En consecuencia, en algunas formas de realización, el paso de medición puede comprender la amplificación de ADNc por qRT-PCR usando el chip de expresión génica Fluidigm™ en una plataforma Fluidigm™, donde el chip de expresión génica comprende un cebador para COL1A1 solo o en combinación con un cebador para al menos un biomarcador de ARNm adicional como se discutió anteriormente.

[0076] La muestra de sangre entera se puede recoger en un tubo de recogida de sangre que incluye, pero no se limita a un tubo de ARN del gen PAX.

[0077] Los métodos para tratar a un paciente con cáncer de próstata pueden comprender además la confirmación del nivel de expresión del al menos un biomarcador de ARNm mediante PCR en tiempo real.

[0078] Los compuestos adecuados para tratar a un paciente que tiene un nivel de expresión aumentado de COL1A1 o COL1A1 y el al menos un biomarcador de ARNm adicional incluyen, pero no se limitan a:

Chips de genes

[0079] En el presente documento se describen chips de genes para detectar transcritos de ARNm específicos del cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente. En algunos casos, los chips de genes pueden comprender un par de cebadores y una sonda configurada para amplificar y detectar KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos.

[0080] En algunos casos, los chips de genes pueden comprender una pluralidad de pares de cebadores y una pluralidad de sondas configuradas para amplificar y detectar KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FL, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3. SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, y no a modo de limitación, en algunos aspectos el chip genético puede comprender un par de cebadores y una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar. En otros aspectos, el chip genético puede comprender más de un par de cebadores y más de una sonda para cada biomarcador de ARNm a analizar.

[0081] Las sondas adecuadas incluyen, pero no se limitan a los que se enumeran en la Tabla 2.

Tabla 2 - sondas ejemplares para los chips de genes descritos

(Continuación)

[0082] Los cebadores adecuados y sondas para TMP: ERG y ARV7 (ARV3.7) incluyen, pero no se limitan a los enumerados en la Tabla 3.

EJEMPLOS

MÉTODOS

Procedimiento de extracción manual de PAXgene® Blood RNA

[0083] El ARN se extrajo usando el kit de PAXgene® Blood RNA de QIAGEN como se describe en el Manual de Kit PAXgene Blood RNA (PreAnalytiX GmbH; marzo de 2009), que se describe brevemente a continuación.

[0084] El tubo de PAXgene® RNA Blood se centrifugó durante 10 min a 3000-5000 x g usando un rotor basculante. El sobrenadante se eliminó por decantación o pipeteo. Se añadieron 4 ml de agua libre de ARNasa al sedimento y el tubo se cerró usando un cierre secundario BD Hemogard nuevo. El tubo se agitó hasta que el sedimento se disolvió visiblemente y se centrifugó durante 10 min a 3000-5000 x g. Se eliminó y descartó todo el sobrenadante.

[0085] Se añadió 350 gl de Tampón BR1 y se agitó hasta que se disolvió el sedimento visiblemente. La muestra se pipeteó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron 300 gl de tampón BR2 y 40 gl de proteinasa K. La muestra se mezcló mediante agitación vorticial durante 5 segundos y se incubó durante 10 minutos a 55°C utilizando un agitadorincubador a 400-1400 rpm.

[0086] El lisado se pipeteó directamente en una columna de centrifugación PAXgene® Shredder (lila) colocada en un tubo de análisis 2 ml, y se centrifugó durante 3 minutos a velocidad máxima (pero que no exceda 20.000 x g). Todo el sobrenadante de la fracción de flujo continuo se transfirió con cuidado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo sin perturbar el sedimento en el tubo de procesamiento. Se agregaron 350 gl de etanol (96-100%), se mezcló con vórtex y se centrifugó brevemente para eliminar las gotas del interior de la tapa del tubo.

[0087] 700 gl de muestra se pipeteó en la columna de centrifugación PAXgene® RNA (rojo) colocada en un tubo de análisis 2 ml, y se centrifugó durante 1 min a 8000-20.000 x g. La columna de centrifugación se colocó en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml. La muestra restante se pipeteó en la columna de centrifugación PAXgene® RNA y se centrifugó durante 1 min a 8000-20000 x g. La columna de centrifugación se colocó en un tubo de procesamiento nuevo de 2 ml y se descartó el tubo de procesamiento antiguo que contenía flujo continuo.

[0088] 350 gl de Tampón BR3 se pipeteó en la columna de centrifugación PAXgene® RNA y se centrifugó durante 1 min a 8000-20.000 x g. La columna de centrifugación se colocó en un tubo de procesamiento nuevo de 2 ml y se descartó el tubo de procesamiento antiguo que contenía flujo continuo.

[0089] 10 gl de solución madre de DNasa I se añadió a 70 gl de tampón RDD en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se mezcló suavemente. La mezcla de incubación de ADNasa I (80 ml) se pipeteó directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación de ARN PAXgene® y se colocó en la mesa de trabajo (20 - 30°C) durante 15 min. Se pipetearon 350 ml de tampón BR3 en la columna de centrifugación PAXgene® RNA y se centrifugaron durante 1 minuto a 8.000 - 20.000 x g. La columna de centrifugación se colocó en un tubo de procesamiento nuevo de 2 ml y se descartó el tubo de procesamiento antiguo que contenía flujo continuo.

[0090] Se añadieron otros 500 gl de tampón BR4 a la columna de centrifugación de ARN PAXgene y se centrifugaron durante 3 minutos a 8000 - 20000 x g. El tubo que contenía el flujo continuo se descartó y la columna de centrifugación de ARN PAXgene® se colocó en un nuevo tubo de procesamiento de 2 ml y se centrifugó durante 1 minuto a 8000 - 20 000 x g.

[0091] El tubo que contiene el flujo se descartó. La columna de centrifugación PAXgene® RNA se colocó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se pipetearon 40 gl de tampón BR5 directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación PAXgene® RNA. La columna se centrifugó durante 1 minuto a 8000-20 000 x g para eluir el ARN. Este paso se repitió usando 40 ml de Buffer BR5 y el mismo tubo de microcentrífuga.

[0092] El material eluido se incubó durante 5 min a 65°C en el agitador-incubador sin agitación. Después de la incubación, el tubo se enfrió inmediatamente en hielo. Si las muestras de ARN no se usaron inmediatamente, se almacenaron a -20°C o -70°C.

Síntesis de ADNc

[0093] Preparación de la Master Mix de transcripción inversa 2x: la Master Mix (2x) se preparó en hielo como se muestra en la Tabla 4 para el número apropiado de reacciones (N° reacciones 10%, por 20 gl de reacción). Nota: Se agregaron 10 gl de ARN de muestra a la Master Mix para tener un volumen de reacción final de 20 gl.

a a

[0094] La Master Mix se agitó con vórtex varias veces (de 5 a 10) para mezclar, y brevemente se centrifugó (1.500 x g, 5 a 10 seg). Se añadieron 10 gl de mezcla de reacción a cada pocilio apropiado de una placa de 96 pocilios.

[0095] Adición de ARN de la muestra a Master Mix: 10 gL de cada muestra de ARN se añadió al pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos, incluyendo el control negativo de agua, para tener un volumen final de reacción de 20 gL. Las soluciones se mezclaron suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces. La placa de reacción de 96 pocillos se selló con un sello de placa y se centrifugó brevemente (1.500 x g durante 60 segundos).

[0096] Configuración ABI 9700: El ABI 9700 fue establecido como sigue:

Paso 1: 25°C durante 10 min

Paso 2: 37°C durante 120 min

Paso 3: 85°C durante 5 seg

Paso 4: 4°C retención infinita

El volumen de reacción de se fijó en 20 gL.

Preamplificación de ADNc

[0097] Preparación de la mezcla de ensayo de sonda de cebador para preamplificación y PCR en tiempo real: se prepararon 100 gl de mezcla de cebador-sonda 20X para PCR en tiempo real.

[0098] Preparación de 0,2X reserva de ensayo preamplificador: la reserva de ensayo 0,2X preamplificador se preparó como se muestra en la Tabla 5. Nota: Los siguientes volúmenes son para la preparación de 400 gl de reserva de ensayo 0,2X preamplificador. Los volúmenes se pueden ajustar en consecuencia dependiendo de la cantidad de muestras/ensayos Taqman que se estén probando.

Tabla 5

[0099] Muestra y preparación de 2x Master Mix: La placa de reacción de ADNc sintetizado y 0,2X de reserva de mezcla de ensayo se colocaron en hielo. 2X preamplificador Master Mix se preparó como se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6

[0100] 11,25 gL de Master Mix se dividió en alícuotas en los pocillos apropiados de una placa de reacción de 96 pocillos. Se transfirieron 3,75 ml de cada muestra de ADNc, incluidos los controles positivos y negativos, a los pocillos apropiados de la placa de reacción de la Master Mix, se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces y se centrifugaron brevemente.

[0101] Configuración de ABI 9700: El ABI 9700 se configuró de la siguiente manera:

Paso 1: 95°C durante 10 minutos

Paso 2: 95°C durante 15 segundos

Paso 3: 60°C durante 4 min

Paso 4: Configure el Paso 2-3 para 14 ciclos

Paso 5: 4°C retención infinita

Se configuró el volumen de reacción 15 pL

[0102] Dilución del producto Preamp: Brevemente la placa de reacción PreAmp se centrifugó (1.500 x g durante 60 segundos) después de que se completó la preamplificación. Se añadieron 135 pl de IDTE a cada pocillo de reacción (dilución 1:10), se mezcló bien pipeteando arriba y abajo 3 veces y se centrifugó brevemente (1.500 x g durante 5 a 10 segundos). El producto PreAmp se almacenó a -20°C hasta su uso posterior.

Fluidigm™ 96,96 PCR en tiempo real

[0103] Preparación de ensayos 10X: Se prepararon alícuotas de ensayos 10X usando los volúmenes de la Tabla 7. Los volúmenes se pueden escalar adecuadamente para múltiples ejecuciones.

Tabla 7

[0104] Preparación de la pre-mezcla de la muestra y muestras: Los componentes de la Tabla 8 se combinaron para hacer la muestra Pre-Mix y mezcla de la muestra final. Los volúmenes se pueden escalar adecuadamente para múltiples ejecuciones.

Tabla 8

[0105] Carga del chip: Una vez completado el script Prime (136x), el chip preparado se eliminó del controlador IFC HX. Se pipetearon 5 pl de cada ensayo y cada muestra en sus respectivas entradas en el chip. El chip se devolvió al IFC Controller HX. Con el software IFC Controller HX, se ejecutó el script Load Mix (136x) para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando se completó el script Load Mix (136x), el chip cargado se eliminó del controlador IFC.

[0106] Uso de la colección de software de datos: El chip se cargó en BioMark y fueron seguidas las instrucciones/ejecución de 96,96 protocolos específicos para el ensayo de la expresión génica.

[0107] Análisis: Se seleccionó el detector automático para el análisis de datos. CT <35 y presente incluso en una de las 4 réplicas: la muestra se consideró positiva para la amplificación.

Metodología de desarrollo del ensayo de biopsia líquida de eje AR

[0108] Validación del cebador: Se solicitaron diseños personalizados y ensayos de expresión génica Taqman revalidados a ABI (se proporcionan una lista detallada de marcadores y los correspondientes ID de genes en las Tablas 2 y 3). Para la validación del ensayo y del cebador se utilizó un panel de 4 líneas celulares de cáncer de próstata (VCaP, LNCaP, 22RV1 y PC-3) que demostraron expresar la mayoría de estos genes.

[0109] Validación en ARN derivado de FFPET (tejido embebido de parafina de formalina fijada): Para probar si estos marcadores representan verdaderos tumores agresivos, los ensayos se ensayaron en un conjunto de cáncer de próstata 40 FFPE y muestras de ARN derivadas de tejido normal adyacente. El ARN de los bloques de FFPET se extrajo utilizando el kit All Prep DNA/RNA FFPET de Qiagen. La concentración de ARN se comprobó en Agilent BioAnalyzer. Se sometieron a transcripción inversa 350-500 ng de ARN total en un volumen de 12 gl utilizando el kit y el protocolo de transcripción inversa Quantitect™ de Qiagen. Aproximadamente 1/3 del ADNc se preamplificó en un volumen de reacción de 25 gl con 48 marcadores durante 14 ciclos usando TaqMan PreAmp Master Mix/protocolo. El ADNc preamplificado se diluyó en una proporción 1:20 con tampón TE 1x. El producto de preamplificador diluido se cargó en el chip de expresión génica 96.96 y se ejecutó en Biomark siguiendo la guía del usuario. Se utilizaron ACTB y GAPDH como controles endógenos. Las muestras se analizaron por cuadruplicado (descrito anteriormente: extracción de ARN con el kit FFPET DNA-RNA de Qiagen).

[0110] Líneas celulares se dispararon en PAXgene® Blood: Para probar si los marcadores se expresan diferencialmente en un fondo de células de sangre entera (GB), las líneas celulares VCAP se enriquecieron en diluciones en serie (10, 50, 100 y 500 células) en muestras de sangre de PAXgene® (Quiagen, Valencia, CA) de donantes normales. El ARN total se extrajo utilizando PAXgene de Qiagen® protocolo RNA Blood (descrito anteriormente). La concentración de ARN se midió en el sistema Agilent Bioanalyzer. Se utilizaron 10 gl de ARN para la preparación de ADNc usando el kit/protocolo de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems. Aproximadamente 1/3 del ADNc fue preamplificado en un volumen de reacción de 15 gl con 48 marcadores genéticos durante 14 ciclos usando TaqMan PreAmp Master Mix/protocolo (Applied Biosystems). El ADNc preamplificado se diluyó adicionalmente a una proporción de 1:10 con tampón 1xTE. Siguiendo la guía del usuario de BioMark de Fluidigm, el producto de preamplificador diluido se cargó en el chip de expresión génica 96,96 y se ejecutó en Biomark. Cada muestra y marcador se analizó por duplicado, lo que resultó en 4 valores para cada gen/muestra. ACTB, GAPDH y RPL19 se utilizaron como controles endógenos y BST1 y PTPRC se utilizaron como controles de WBC.

[0111] Prueba de PAXgene® derivada de ARN de pacientes con cáncer de próstata: Aproximadamente 170 marcadores fueron probados en muestras de PAXgene® RNA derivadas de 143 pacientes de cáncer de próstata y 20 sujetos varones normales (muestras de cáncer adquiridas desde Capital Biosciences, Cureline, y Conversant Bio). Se seleccionaron los marcadores que se detectaron diferencialmente entre donantes agresivos versus indolentes o normales.

[0112] Ensayo de RT-PCR en el instrumento ViiA 7™ para confirmar los resultados de BioMark: los marcadores que demostraron ser detectados en la plataforma Biomark™ (Fluidigm, San Franciso, CA) se probaron en ViiA7™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) para validar/confirmar los resultados. Todos los marcadores que se validen posteriormente en ViiA7 serán preseleccionados para hacer el panel de biopsia líquida.

[0113] Fluidigm® BioMark™ HD System: Este ensayo de alto rendimiento-PCR en tiempo real se realizó utilizando el Fluidigm® BioMark™ System HD, que permite la detección simultánea de 96 analitos en 96 muestras con creación de 9.216 puntos de datos a partir de una única prueba. La plataforma BioMark™ HD utiliza una distribución de microfluidos de muestras y ensayos que requieren solo reacciones de 7 nL y se completa en menos de 3 horas.

[0114] Metodología: ARN de FFPET, y muestras PAXgene® RNA fueron transcritas a la inversa usando el kit Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse T ranscription seguido de la preamplificación de ADNc para 10/14 ciclos usando Applied Biosystems Taqman Pre-Amp Master Mix. El ADNc amplificado se diluyó y ensayó en VIIA7™ de Applied Biosystems o plataforma Fluidigm® Biomark™ para la expresión génica.

Detección de marcadores de ARNm detectados específicamente a partir de sangre entera de pacientes con cáncer de próstata

[0115] Se usaron datos que consisten en niveles de expresión de marcadores de ARNm de sangre entera recolectada de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos para derivar los parámetros del ensayo. Para permitir la validación independiente de los ensayos, los datos se dividieron en conjuntos de entrenamiento y validación en una proporción del 70%: 30%. Los valores de umbral de Ct se derivaron en función del análisis de las características operativas del receptor (ROC) en los datos de entrenamiento y las características de diagnóstico de los ensayos se evaluaron utilizando la sensibilidad, la especificidad y el área bajo la curva ROC (AUC). Los ensayos se evaluaron de forma independiente sobre la base de los datos de validación, utilizando los valores umbral obtenidos de los datos de entrenamiento para predecir qué pacientes tienen cáncer de próstata y evaluar los ensayos con sensibilidad y especificidad. Los valores de umbral Ct determinados para cada marcador se enumeran en la Tabla 9. Las curvas ROC individuales para los marcadores representativos se ilustran en la FIG. 1.

Tabla 9: Información de diagnóstico para un conjunto seleccionado de marcadores

(Continuación)

Los marcadores están representados por el símbolo del gen. El punto de corte indica el valor umbral Ct de detección para cada marcador. La sensibilidad (Sens) es igual a la probabilidad de que el marcador sea detectado en un paciente con cáncer de próstata. La especificidad es igual a la probabilidad de que el marcador no se detecte en un paciente sin cáncer de próstata. El área bajo la curva ROC (AUC) es la probabilidad de que el marcador se exprese a un nivel más alto en pacientes con cáncer de próstata en relación con los controles sanos.

Predicción de cáncer de próstata de alto riesgo basada en la detección de marcadores de ARNm de sangre entera

[0116] El poder pronóstico de marcadores seleccionados se evaluó en un conjunto de datos que consiste en niveles de expresión de marcadores de ARNm en sangre entera recolectada de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos. Los valores de umbral se derivaron utilizando el análisis ROC descrito anteriormente para discriminar entre el cáncer de próstata y los controles sanos normales en los datos de entrenamiento. La asociación con factores de riesgo clínico se evaluó mediante la prueba Fisher Exact. Los marcadores seleccionados que están significativamente asociados con los factores de riesgo clínicos se enumeran en las Tablas 10 - 12.

Tabla 10 - Asociación de presencia/ausencia de marcadores de ARNm con puntuación de Gleason

La expresión del marcador se dicotomizó utilizando umbrales derivados para la detección óptima de tumores de próstata frente a controles sanos normales. Los pacientes se dividieron en subgrupos de riesgo bajo (Gleason <= 6) y alto (Gleason >= 8) utilizando las puntuaciones de Gleason desde el diagnóstico. La tabla muestra el número total de tumores con/sin expresión de cada marcador (N) y la tabulación de la detección de marcadores en los grupos de riesgo Gleason Low y Gleason High. La asociación significativa se determina mediante la prueba exacta de Fisher (p.val).

Tabla 11 - Asociación de presencia/ausencia de marcadores de ARNm con niveles de PSA medidos en el momento del diagnóstico

La expresión del marcador se dicotomizó usando umbrales derivados para la detección óptima de tumores de próstata frente a controles sanos normales. Los pacientes se dividieron en subgrupos de riesgo bajo (PSA < 20 ng/mL) y alto (PSA >= 20 ng/mL). La tabla muestra el número total de tumores con/sin expresión de cada marcador (N) y la tabulación de la detección de marcadores en los grupos de riesgo de PSA bajo y alto. La asociación significativa se determina mediante la prueba exacta de Fisher (p.val).

Tabla 12 - Asociación de presencia/ausencia de marcadores de ARNm con metástasis

La expresión del marcador se dicotomizó utilizando umbrales derivados para la detección óptima de tumores de próstata frente a controles sanos normales. La tabla muestra el número total de tumores con/sin expresión de cada marcador (N) y la tabulación de la detección de marcadores en tumores con/sin recurrencia metastásica. La asociación significativa se determina mediante la prueba exacta de Fisher (p.val).

Identificación de un panel de biomarcadores multivariable indicativo de cáncer de próstata de alto riesgo

[0117] Se identificó un panel de biomarcadores que incluía múltiples biomarcadores de ARNm en un conjunto de datos que consistía en niveles de expresión de marcadores de ARNm en sangre entera recogida de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos. 16 genes (ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, KLK3, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, s Lc O1B3, TMEFF2) se identificaron con una expresión significativamente mayor en muestras de cáncer de próstata en relación con voluntarios sanos. Estos 16 genes se combinaron en un panel de biomarcadores multivariable como se describe a continuación. Los valores de umbral se derivaron usando análisis ROC como se describe anteriormente. Se seleccionaron umbrales para identificar pacientes con cáncer de próstata con una especificidad del 90 %, es decir, el 90 % o más de los voluntarios sanos se identificarían correctamente como voluntarios sanos. Se utilizó un proceso de aprendizaje automático para definir la cantidad de biomarcadores positivos detectados en los que un paciente debe considerarse de alto riesgo. Para protegerse contra el sobreajuste, los datos se dividieron en conjuntos de entrenamiento y validación como se describe anteriormente. El conjunto de entrenamiento se utiliza para definir la regla de clasificación, incluido el número óptimo de marcadores positivos. Específicamente, las muestras de arranque se generaron seleccionando aleatoriamente 100 muestras de los datos de entrenamiento. Las reglas de clasificación se crearon evaluando la correlación del estado del biomarcador predicho con el tiempo hasta la recurrencia bioquímica. La correlación se midió utilizando el índice de concordancia, que mide la probabilidad de que un sujeto con un estado de biomarcador positivo experimente una recurrencia bioquímica antes que un sujeto con un estado de biomarcador negativo. Se identificaron ocho marcadores como el número óptimo de características para la regla de clasificación, es decir, los sujetos con más de 8 marcadores positivos se considerarían biomarcadores positivos y se pronosticaría que tendrían un tiempo más corto hasta la recurrencia bioquímica. La asociación entre la regla de clasificación y el tiempo hasta la recurrencia bioquímica se validó utilizando el conjunto de muestras de validación independiente utilizando el análisis de regresión de Cox. El panel multivariable de biomarcadores identificó un subconjunto de sujetos con un tiempo significativamente más corto hasta la recurrencia bioquímica en comparación con la población con biomarcadores negativos (HR = 7,94, valor de p = 0,024).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar biomarcadores de ARNm específicos de cáncer de próstata en una muestra de sangre entera de un paciente que comprende:

aislar el ARN de la muestra de sangre entera;

sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; y

2. El método de la reivindicación 1, en el que el ADNc se preamplifica después del paso de síntesis.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el ADNc se preamplifica durante 14 ciclos; y/o en el que el ADNc está preamplificado por qRT-PCR.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende además identificar cáncer de próstata de alto riesgo si un nivel de expresión aumentado de Kl K3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, Se detecta TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 o cualquier combinación de los mismos.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el aumento de la expresión de KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1 y HOXB13 indica cáncer de próstata de alto riesgo.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende además

comparar el nivel de expresión de ARV7 de la muestra de sangre entera del paciente con un nivel de referencia de expresión de ARV7, opcionalmente en el que el nivel de referencia de ARV7 es un nivel de expresión de ARV7 en una muestra de sangre entera de un individuo sin cáncer de próstata; y/o

determinar si el nivel de expresión de ARV7 de la muestra de sangre entera del paciente aumenta o disminuye en relación con el nivel de referencia de expresión de ARV7.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de sangre entera se recoge en un tubo de recogida de sangre.

8. Uso de un chip genético compuesto por pares de cebadores y un panel de sondas configurado para amplificar y detectar KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2, o cualquier combinación de los mismos, para el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que el chip genético comprende pares de cebadores y un panel de sondas configuradas para amplificar y detectar k Lk 3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1 A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3,1, LGR5, TRPM8 y SLCO1B3.

10. Un método para identificar a un paciente con cáncer de próstata de alto riesgo que comprende:

obtener ADNc de una muestra de sangre entera del paciente;

y medir los niveles de expresión de todos los biomarcadores de ARNm; y donde se mide un aumento en el nivel de expresión de al menos ocho de los biomarcadores de ARNm en comparación con un nivel de referencia de al menos ocho biomarcadores de ARNm.