CN107338319A - 一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒，检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物，其包含HSD3B1‑For及HSD3B1‑Rev，HSD3B1‑For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1‑Rev的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述的核苷酸引物能够对HSD3B1基因上与生成双氢睾酮能力相关的单核苷酸多态性进行检测，并在此结果上预测哪些患者更适合雄激素剥夺疗法，哪些患者效果不好，应尽早采取进一步升级的治疗方法，具有准确性高、特异性好、假阳性假阴性率低、操作简单方便、仪器设备要求低、及适应性广等优点。

Description

一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检 测试剂盒
技术领域
本发明属于生物领域，尤其是涉及一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒。
背景技术
前列腺癌在西方国家男性肿瘤致死原因中排列第二，同时也是世界上排位第六的常见肿瘤致死原因。前列腺癌发病有明显的地区和种族差异，据统计我国及日本等为前列腺癌低发地区，但是无选择50岁以上男性尸检前列腺节段切片发现潜化癌病灶数接近欧美，因此有人认为东方人癌生长比西方人缓慢。前列腺癌在临床上包括局限性、转移性前列腺癌，其治疗包括前列腺癌根治术、放化疗、药物或外科去势术、免疫治疗及姑息治疗等。
大多数前列腺癌患者在去势术后于2年内最终转化为去势抵抗型前列腺癌(castrtion-resistant prosstate cancer，CRPC)。目前，临床医生仅根据前列腺癌的初始分期、分级以及患者的身体状况判断是否施用外科去势术。
HSD3B1(1245A>C)与去势抵抗型前列腺癌(castrtion-resistant prosstatecancer，CRPC)相关。HSD3B1能够调控脱氢表雄酮生成双氢睾酮过程，此位点的变异在很大程度上会大大提高转化生成双氢睾酮的能力，从而促进CRPC的发生发展。因此，HSD3B1基因可能成为一种重要的肿瘤标志物。本发明通过检测HSD3B1基因1245位的碱基多态性，旨在区分哪些患者更适合雄激素剥夺疗法，哪些患者效果不好，应尽早采取进一步升级的治疗方法。另外，本专利采用限制性内切酶的方法检测HSD3B1基因上的单核苷酸多态性，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。
目前，临床医生仅根据前列腺癌的初始分期、分级以及患者的身体状况判断是否施用外科去势术。大多数前列腺癌患者在去势术后于2年内最终转化为去势抵抗型前列腺癌，效果并不理想。
目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger测序等方法。PCR-RFLP操作复杂耗时，并且结果可信度差。PCR-RFLP扩增条件要求严格，操作繁琐。基因芯片快速高效，但其造价高。Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。而限制性内酶切的方法检测VDR基因准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。本专利引入最新研究成果，对HSD3B1基因的钙吸收相关单核苷酸多态性进行检测，该基因上的1245位核苷酸多态性与去势术后的生存期相关。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒，以解决目前检测单核苷酸多态性的常用方法操作复杂、耗时长、结果可信度差及造价高等问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物，其包含HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
相对于现有技术，本发明所述的检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物具有以下优势：
(1)本发明所述的核苷酸引物能够对HSD3B1基因上与生成双氢睾酮能力相关的单核苷酸多态性进行检测，并在此结果上预测哪些患者更适合雄激素剥夺疗法，哪些患者效果不好，应尽早采取进一步升级的治疗方法。
(2)本专利采用限制性内酶切的方法检测HSD3B1基因准确，具有准确性高、特异性好、假阳性假阴性率低、操作简单方便、仪器设备要求低、及适应性广等优点。
上述检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物在制备预测前列腺癌去势术预后的基因甲基化检测试剂盒中的用途。
一种预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒，含有HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ IDNO：2所示。
上述检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物具有益之处本预测前列腺癌去势术预后的基因甲基化检测试剂盒也一应具有，在此不一一赘述。
一种用于PCR扩增的方法，包含如下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以权利要求1的引物作为引物，步骤1)提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应。
进一步的，PCR体系如下：在10μL体系中，加入10×buffer 1.0μL，dNTPs 0.2μL，HSD3B1-For 0.4μL，HSD3B1-Rev 0.4μL，步骤1)提取的DNA sample1.5μL，然后加入ddH2O至10μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火40s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸8min。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，其中：HSD3B1-For及HSD3B1-Rev均由我公司设计并交由苏州金唯智生物科技有限公司采用现有方法合成。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物，其包含HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
HSD3B1-For:ACACCCTGAGCAAAGAGTT
HSD3B1-Rev:TGGAGATGGCAATACCTG
一种预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒，含有HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ IDNO：2所示。
一种用于PCR扩增的方法，包含如下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以权利要求1的引物作为引物，步骤1)提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应。
进一步的，PCR体系如下：在10μL体系中，加入10×buffer 1.0μL，dNTPs 0.2μL，HSD3B1-For 0.4μL，HSD3B1-Rev 0.4μL，步骤1)提取的DNA sample1.5μL，然后加入ddH2O至10μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火40s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸8min。
预测前列腺癌去势术预后的基因甲基化检测方法如下：
(1)基因组DNA提取：空腹釆血，取患者肘静脉血5ml，50μLEDTA抗凝，然后进行白细胞分离，从白细胞中提取基因组DNA，并定性定量，-20℃保存待用。
(2)PCR扩增：以HSD3B1-For及HSD3B1-Rev分别作为Primer forward及Primerreverse引物，步骤1)提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应。
PCR反应体系如表1所示：
表1
10×buffer 1.0μL
dNTPs 0.2ul(10pM each)
Primer forward 0.4μL(5pM)
Primer reverse 0.4μL(5pM)
DNA sample 1.5μL
DNA polymerase 0.3μL
ddH2O Up to 10μL
PCR扩增条件：
(3)限制性酶切：
将上一步即步骤(2)中PCR扩增所得产物进行内切酶酶切，按表2体系配置反应，在55℃恒温箱中反应8-10小时。用BsmA Ⅰ进行酶切(BsmA Ⅰ购自NEB公司)。
表2
缓冲液NEBuffer3 1.5μL
PCR pruduct 10μL
Enzyme(BsmA Ⅰ) 0.3μL
ddH2O Up to 15μL
(4)将上一步即步骤(3)所得的酶切产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
(5)结果判读
根据条带大小按照以下指标进行结果判读，显示为798bp的一条带，低风险；显示为798bp、516bp和282bp三条带，中风险；显示为516bp和282bp两条带，高风险。443例患者，野生型患者(AA)中位生存期6.5年，杂合突变患者(AC)中位生存期4.2年，纯合突变患者(CC)中位生存期2.3年。使用本发明提供的检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物能够对HSD3B1基因上与生成双氢睾酮能力相关的单核苷酸多态性进行检测，并在此结果上预测哪些患者更适合雄激素剥夺疗法，哪些患者效果不好，应尽早采取进一步升级的治疗方法，检测结果简单易识别，检测准确率达99％。
表3
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津艾至恩医疗科技有限公司
<120> 一种核苷酸引物及预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒
<130> AZEYL1701-1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaccctgag caaagagtt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggagatggc aatacctg 18

Claims (5)

1.一种检测HSD3B1基因单核苷酸多态性的引物，其包含HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的引物在制备预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒中的用途。
3.一种预测前列腺癌去势术预后的基因多态性检测试剂盒，含有HSD3B1-For及HSD3B1-Rev，HSD3B1-For的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，HSD3B1-Rev的碱基序列如SEQ IDNO：2所示。
4.一种用于PCR扩增的方法，其特征在于：包含如下步骤：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)以权利要求1的引物作为引物，步骤1)提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应。
5.根据权利要求1所述的用于PCR扩增的方法，其特征在于：
PCR体系如下：在10μL体系中，加入10×buffer 1.0μL，dNTPs 0.2μL，HSD3B1-For 0.4μL，HSD3B1-Rev 0.4μL，步骤1)提取的DNA sample 1.5μL，然后加入ddH2O至10μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火40s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸8min。
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