ES2909895T3 - Procedimiento in vitro para la identificación de adenomas colorrectales o de cáncer colorrectal - Google Patents

Procedimiento in vitro para la identificación de adenomas colorrectales o de cáncer colorrectal Download PDF

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Abstract

Procedimiento in vitro para el diagnóstico de sujetos con riesgo de desarrollar adenomas colorrectales avanzados que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos humanos a ser diagnosticados seleccionados de la lista que consiste en: una muestra de plasma, muestra de sangre o muestra de suero; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a de los sujetos humanos a ser diagnosticados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos miR-15b y miR-29a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento in vitro para la identificación de adenomas colorrectales o de cáncer colorrectal
Campo de la invención
La presente invención puede ser incluida dentro del campo de la medicina personalizada, en la que se utilizan biomarcadores específicos para identificar una determinada enfermedad o trastorno. Específicamente, algunos microARN (también denominados miARN o miR-) se usan en la presente invención para identificar sujetos humanos con riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CRC) y/o adenomas colorrectales (CA), preferentemente adenomas colorrectales avanzados (AA).
Estado de la técnica
El cáncer colorrectal (también conocido como cáncer de colon, cáncer rectal o cáncer de intestino) es el desarrollo de cáncer en el colon o en el recto (partes del intestino grueso). La gran mayoría de los cánceres colorrectales son adenocarcinomas. Esto se debe a que el colon tiene numerosas glándulas dentro del tejido. Cuando estas glándulas experimentan una serie de cambios a nivel genético, proceden de manera predecible a medida que pasan de un cáncer de colon benigno a uno invasivo y maligno. Los adenomas de colon, también llamados pólipos adenomatosos, son una versión benigna de los adenocarcinomas malignos, pero que aún conservan un potencial maligno si no son extirpados a tiempo (estos son usualmente extirpados debido a su tendencia a volverse malignos y provocar cáncer de colon).
El cribado es una forma eficaz de prevenir y disminuir las muertes por cáncer colorrectal y se recomienda a partir de los 50 a los 75 años. La prueba de cribado más conocida y utilizada para el cáncer colorrectal se denomina Prueba Inmunoquímica Fecal (FIT). La FIT detecta sangre en las muestras de heces que pueden ser un signo de precáncer o cáncer. Si se obtienen resultados anormales, generalmente se recomienda realizar una colonoscopia que le permite al médico observar el interior del colon y el recto para hacer un diagnóstico. Durante la colonoscopia, se pueden extirpar pequeños pólipos si es que se encuentran. Si se encuentra un pólipo grande 0 un tumor, se puede realizar una biopsia para verificar si este es canceroso. El gastroenterólogo utiliza una colonoscopia para encontrar y extirpar estos adenomas y pólipos para evitar que continúen adquiriendo cambios genéticos que conducirán a un adenocarcinoma invasivo.
Aunque, como se ha explicado anteriormente, la FIT se utiliza actualmente para el cribado del cáncer colorrectal, es importante señalar que la FIT ofrece una baja sensibilidad para los adenomas (alrededor del 20-30% dependiendo de la literatura) lo que significa que la mayoría de este tipo de pacientes puede clasificarse erróneamente como si no tuviesen la enfermedad. Por consiguiente, la FIT no es capaz de identificar adenomas debido a su baja sensibilidad.
Además, dado que la FIT utiliza muestras de heces, ofrece un bajo cumplimiento (menos del 50%). Por otro lado, la colonoscopia es una técnica invasiva en la que la complicación más grave suele ser la perforación gastrointestinal (1% de los casos). Además, la colonoscopia es hoy en día un procedimiento que implica anestesia, y los laxantes que se suelen administrar durante la preparación del intestino para la colonoscopia se asocian a varios problemas digestivos. ADAM E. FRAMPTON Et Al , ANNALS OF SUrGe RY. vol. 262, núm. 2, 1 de agosto de 2015 (2015-08-01), páginas e61-e62, se refiere a miR-15b y miR-17 como microARN de plasma derivados de tumores desregulados en Neoplasia Colorrectal.
La presente invención ofrece una clara solución a los problemas citados anteriormente porque se centra en un procedimiento in vitro para identificar o cribar sujetos humanos con riesgo de padecer cáncer colorrectal o adenomas colorrectales (preferentemente adenomas colorrectales avanzados), partiendo del nivel de expresión de microARN aislados de muestras mínimamente invasivas como sangre, suero o plasma. Además, el procedimiento de la invención ofrece alta sensibilidad y especificidad (véanse los Ejemplos mostrados a continuación), lo que significa que es un procedimiento sólido y rentable para la detección tanto de cáncer colorrectal como de adenomas colorrectales (preferentemente adenomas colorrectales avanzados).
Es importante señalar que los procedimientos utilizados hoy en día para el cribado de la población general en riesgo de padecer CRC o AA están asociados con una alta tasa de falsos positivos. Por consiguiente, hoy en día se realiza una gran cantidad de colonoscopias de seguimiento innecesarias. Sin embargo, dado que el procedimiento de la invención tiene mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el procedimiento utilizado hoy en día para el cribado de población general con riesgo de padecer c Rc o AA, se asocia a un menor porcentaje de falsos positivos. Por consiguiente, el procedimiento descrito en la presente invención ayuda claramente a reducir el número de colonoscopias de seguimiento, mejorando así la forma en que los pacientes son cribados o diagnosticados en la actualidad. Una vez realizado el procedimiento de la invención, si se observa que los miARN están sobreexpresados, se debe confirmar el resultado mediante colonoscopia. Sin embargo, si se obtiene un resultado negativo porque los miARN están regulados a la baja, no es necesario realizar una colonoscopia y los pacientes se pueden ir a su casa.
Breve descripción de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención ofrece una solución clara para el cribado y diagnóstico preciso de sujetos con riesgo de padecer cáncer colorrectal y/o adenomas colorrectales, mediante un procedimiento mínimamente invasivo capaz de detectar no solo pacientes con riesgo de padecer cáncer colorrectal sino también pacientes que pudiera padecer adenomas colorrectales, preferentemente adenomas colorrectales avanzados. En particular, la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado de sujetos con riesgo promedio de desarrollar adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal midiendo el patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b en muestras de plasma.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-15b en cáncer colorrectal. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,833. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 2. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-15b en adenoma colorrectal avanzado. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,798. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 3. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+miR-15b en cáncer colorrectal. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,878. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 4. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+miR-15b en adenoma colorrectal avanzado. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,811. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 5. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-18a en cáncer colorrectal. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,880. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 6. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-18a en adenoma colorrectal avanzado. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,812. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 7. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-19b en cáncer colorrectal. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,876. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 8. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-19b en adenoma colorrectal avanzado. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,813. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 9. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-19a en cáncer colorrectal. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,880. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
La Figura 10. Curva de la Características Operativas del Receptor (ROC) para miR-29a+ miR-15b+ miR-19a en adenoma colorrectal avanzado. Área Bajo la Curva (AUC) = 0,808. El eje X representa la Especificidad. El eje Y representa la Sensibilidad.
Descripción detallada de la invención
Descripción de la invención
La presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado o la identificación de sujetos con riesgo de padecer cáncer colorrectal y/o adenomas colorrectales, preferentemente adenomas colorrectales avanzados, basado en la medición del perfil de expresión o nivel de algunos miARN que se encuentran regulados al alza o sobreexpresados en pacientes que padecen dichas enfermedades. La presente divulgación también se refiere a un procedimiento in vitro para obtener datos útiles para el diagnóstico de cáncer colorrectal y/o adenomas colorrectales, preferentemente adenomas colorrectales avanzados, en un sujeto, preferentemente en un sujeto humano.
En particular, la presente invención se basa en el descubrimiento de que se confirma que miR-15b está significativamente regulado al alza en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal. Además, notablemente como se muestra en las Tablas 6, 7 y 8, los resultados proporcionados en la presente memoria también muestran que los altos niveles circulantes de miR-15b en plasma están significativamente asociados con la presencia de adenoma colorrectal avanzado, en los que miR-15b ofrece los mejores resultados en comparación con el resto de los miARN probados en la presente memoria. De hecho, los resultados obtenidos con miR-15b por sí solo son incluso mejores que los mostrados por miR-29a por sí solo para el cribado de la presencia de adenoma colorrectal avanzado o para la obtención de datos útiles para el diagnóstico de adenoma colorrectal avanzado en un sujeto, preferentemente en un sujeto humano.
Además, como se muestra en la Tabla 8, ciertas combinaciones específicas de biomarcadores que parten de miR-15b, como la combinación de al menos (miR-15b y miR-29a), están significativamente reguladas al alza en muestras de plasma de sujetos que sufren de cáncer colorrectal y adenomas avanzados. En este sentido, como se muestra en la Tabla 8, la combinación de al menos miR-15b y miR-29a proporciona resultados significativamente mejores en términos de valores de AUC, sensibilidad y especificidad tanto para detectar la presencia de adenoma colorrectal avanzado como para detectar la presencia de cáncer colorrectal en comparación con el uso de miR-15b o miR-29a por sí mismos.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado de sujetos, preferentemente sujetos humanos, en riesgo de desarrollar adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos a partir de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos humanos a cribar y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos humanos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un segundo aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para el diagnóstico de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal en un sujeto, preferentemente en un sujeto humano, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o al menos (miR-15b y miR-29a) o al menos (miR-15b y miR-18a), o al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, sospechosos de padecer adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal, (b) comparar el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, sospechosos de padecer adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal con el patrón o nivel de expresión de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal, y en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal, y opcionalmente (c) confirmar el diagnóstico mediante el examen del intestino por cualquier medio, preferentemente mediante colonoscopia. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un tercer aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para obtener datos útiles para el diagnóstico de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal en sujetos, preferentemente sujetos humanos, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos a partir de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, sospechosos de padecer cáncer colorrectal y/o adenoma colorrectal y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, sospechosos de padecer cáncer colorrectal y/o adenoma colorrectal con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y /o cáncer colorrectal. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un cuarto aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a), en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos ( miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal, para diagnosticar in vitro el riesgo de adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un quinto aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para clasificar sujetos, preferentemente sujetos humanos, como sujetos sanos o sujetos que padecen adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos a partir de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser clasificados y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser clasificados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un sexto aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para detectar cualquier combinación posible de al menos dos, tres, cuatro o cinco biomarcadores de los siguientes miARN: miR-29a, miR-15b, miR-18a, miR-19a o miR-19b. En una realización preferente los biomarcadores detectados en la presente invención son: al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a).
Un séptimo aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar sujetos, preferentemente sujetos humanos, que padecen adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal que comprende: (a) medir in vitro el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser tratados, (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser tratados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos ( miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal y (c) tratar al paciente diagnosticado con adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente. En una realización preferente el procedimiento comprende confirmar el diagnóstico mediante el examen del intestino por cualquier medio, preferentemente mediante colonoscopia. Dado que el adenoma colorrectal puede ser visto como un precursor del cáncer colorrectal, debido a la reconocida secuencia adenoma-carcinoma y la noción de que los adenomas colorrectales avanzados tienen más probabilidades de convertirse en cáncer, está bien establecido que los adenomas colorrectales, y preferentemente los adenomas colorrectales avanzados, debe tratarse, preferentemente, mediante extirpación mediante colonoscopia (se podría llevar a cabo una vigilancia posterior). El tratamiento del cáncer colorrectal depende de la etapa en la que se descubrió el cáncer. El cáncer colorrectal en etapa temprana se trata mejor con cirugía. Aproximadamente el 95% de los cánceres colorrectales en etapa I y entre el 65 y el 80% de los cánceres colorrectales en etapa II se pueden curar con cirugía. Sin embargo, el cáncer de recto puede requerir radioterapia adicional para minimizar el riesgo de recurrencia. El tratamiento en etapa avanzada (etapa III y etapa IV) a menudo comprende una combinación de terapias, que incluyen: cirugía, quimioterapia, tratamiento con anticuerpos, terapias anti-VEGF/R y radiación.
Un octavo aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para evaluar o monitorizar la respuesta a una terapia en un sujeto que padece adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o al menos (miR-15b y miR-29a) o al menos (miR-15b y miR-18a), o al menos (miR-15b y miR-19b), o al menos (miR-15b y miR-19a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser monitorizados y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser monitoreados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y d miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal. Una disminución significativa o falta de cambio en los niveles de miARN después de la administración de dicha terapia en comparación con el nivel de los miARN antes de la administración de la terapia en la muestra del sujeto es indicativo de que la terapia administrada al sujeto es eficaz. Un aumento significativo en los niveles de miARN después de la administración de dicha terapia en comparación con el nivel de expresión de cada uno de los miARN antes de la administración de la terapia en la muestra del sujeto es indicativo de que la terapia administrada al sujeto es ineficaz. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un noveno aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para monitorizar la progresión del adenoma colorrectal y/o cáncer colorrectal en un sujeto que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19b) miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos ( miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser monitorizados y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) de los sujetos, preferentemente sujetos humanos, a ser monitorizados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos (miR-15b) o de al menos (miR-15b y miR-29a) o de al menos (miR-15b y miR-18a), o de al menos (miR-15b y miR-19b), o de al menos (miR-15b y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-19b y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-18a), o de al menos (miR-15b, miR-29a y miR-19a), o de al menos (miR-15b, miR-19a y miR-19b), o de al menos (miR-15b, miR-29a, miR-19a, miR-19b y miR-18a) es indicativo de adenomas colorrectales y/o cáncer colorrectal. Una disminución significativa o la falta de cambio en los niveles de miARN en comparación con el nivel de expresión de dichos miARN en el punto de tiempo anterior es indicativo de que el adenoma colorrectal y/o el cáncer colorrectal muestran una buena progresión. Un aumento significativo en los niveles de miARN en comparación con el nivel de expresión de dichos miARN en el punto de tiempo anterior es indicativo de que el adenoma colorrectal y/o el cáncer colorrectal muestran una mala progresión. En una realización preferente, la muestra biológica mínimamente invasiva obtenida en la etapa (a) comprende: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero. En una realización preferente, el adenoma colorrectal es un adenoma colorrectal avanzado. En una realización preferente, la etapa (a) que comprende medir el patrón o nivel de expresión de un microARN, se lleva a cabo utilizando una sonda marcada detectable que se hibrida con al menos uno de los miARN descritos anteriormente.
Un décimo aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en: miR-15b; miR-15b y miR-29a; miR-15b y miR-29a y miR-18a; miR-15b y miR-29a y miR-19a; miR-15b y miR-29a y miR-19b; miR-15b y miR-29a y miR-18a y miR-19a y miR-19b. Tenga en cuenta que esta realización específica de la invención se refiere a un clausus numeroso de miARN. Además, preferentemente, el kit mencionado anteriormente comprende reactivos seleccionados del grupo que consiste en todos o al menos uno de los siguientes: i) cebadores específicos para el miARN o combinaciones de miARN como se define en la reivindicación 13 capaces de producir secuencias de miARN ligadas con cebador; ii) medios de transcripción inversa para producir ADNc a partir de las secuencias de miARN ligadas con cebador de i); iii) medios tales como cebadores capaces de amplificar los ADNc derivados de las secuencias de miARN ligadas con cebador como se define en i); iv) medios para transcribir los ADNc amplificados para producir ARN diana sentido; y v) una población de sondas antisentido de miARN capaces de detectar los ARN diana sentido de iv).
Un undécimo aspecto de la presente divulgación se refiere al uso del kit de la décima realización de la invención, para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos miR-15b, en el que la sobreexpresión de al menos miR-15b es indicativa de adenomas colorrectales o cáncer colorrectal, para cribado u obtención de datos útiles para el diagnóstico in vitro del riesgo de adenomas colorrectales, preferentemente adenoma colorrectal avanzado, y/o cáncer colorrectal.
Por otro lado, cabe mencionar que la presente invención se lleva a cabo en muestras de plasma o suero obtenidas de los pacientes, y que es bien conocido en el estado de la técnica que el hecho de que un determinado biomarcador sea adecuado para el diagnóstico de una determinada enfermedad a partir de muestras de tejido, no significa directamente que se vaya a reproducir el mismo resultado positivo cuando la muestra utilizada para la aplicación del procedimiento sea suero o plasma. Por otra parte, es importante destacar que la obtención de preparaciones de suero o plasma a partir de la sangre comprende varias etapas realizadas por técnicos: en el caso del suero, permitir la coagulación de la sangre dejándola inalterada a temperatura ambiente, eliminar el coágulo mediante centrifugación y aislar el sobrenadante que está diseñado como suero. En el caso del plasma, también es necesaria la centrifugación. Además, después del proceso de centrifugado, es importante transferir inmediatamente el componente líquido (suero o plasma) a un tubo limpio. Las muestras son mantenidas a 2-8 °C mientras son manipuladas. Si el suero o el plasma no se analiza inmediatamente, se debe repartir en alícuotas, almacenar y transportar a -80 °C o menos. Es importante evitar los ciclos de congelación y descongelación porque esto es perjudicial para muchos componentes del suero. Las muestras hemolizadas, ictéricas o lipémicas pueden invalidar ciertas pruebas.
A los efectos de la presente invención, se incluyen a continuación las siguientes definiciones:
• El término "cribado" se entiende como el examen o prueba de un grupo de individuos pertenecientes a la población general, en riesgo de padecer cáncer colorrectal o adenoma colorrectal, con el objetivo de discriminar a los individuos sanos de aquellos que padecen de un cáncer colorrectal o adenoma colorrectal no diagnosticado que tengan un alto riesgo de padecer dichas indicaciones.
• El término "cáncer colorrectal' es una condición médica caracterizada por el cáncer de las células del tracto intestinal debajo del intestino delgado (es decir, el intestino grueso (colon), incluyendo el ciego, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide y recto).
• La expresión "adenoma colorrectal' se refiere a los adenomas del colon, también llamados pólipos adenomatosos, que es una etapa benigna y precancerosa del cáncer colorrectal, pero aún con alto riesgo de progresión a cáncer colorrectal.
• La expresión "adenoma colorrectal avanzado" se refiere a adenomas que tienen un tamaño de al menos 10 mm o que histológicamente tienen un alto grado de displasia o un componente velloso superior al 20%. • La expresión "muestra biológica mínimamente invasiva" se refiere a cualquier muestra que se extraiga del cuerpo del paciente sin necesidad de utilizar instrumentos nocivos, distintos de las finas agujas utilizadas para extraer la sangre del paciente y, por lo tanto, sin ser perjudicial para el paciente. Específicamente, muestra biológica mínimamente invasiva se refiere en la presente invención a: muestras de sangre, suero o plasma.
• El término "regulado al alza" o "sobreexpresado" de cualquiera de los micro-ARN o combinaciones de los mismos descritos en la presente invención, se refiere a un aumento en su nivel de expresión con respecto a un "valor umbral" o "valor de corte" dado de al menos 5%, de al menos 10%, de al menos 15%, de al menos 20%, de al menos 25%, de al menos 30%, de al menos 35%, de al menos 40%, de al menos 45%, de al menos 50%, de al menos 55%, de al menos 60%>, de al menos 65%>, de al menos 70%, de al menos 75%, de al menos 80%, de al menos 85%, de al menos 90%, de al menos 95%, de al menos 100%, de al menos 110%, de al menos 120%, de al menos 130%, de al menos 140%, de al menos 150%, o más.
• El término "valor umbral" o "valor de corte", cuando se refiere a los niveles de expresión de los miARN descritos en la presente invención, se refiere a un nivel de expresión de referencia indicativo de que es probable que un sujeto padezca cáncer colorrectal o adenoma colorrectal con una determinada sensibilidad y especificidad si los niveles de expresión del paciente están por encima de dicho umbral o corte o niveles de referencia.
• El término "que comprende" se entiende que incluye, pero no se limita a, todo lo que sigue a la palabra "comprende". Por lo tanto, el uso del término "que comprende" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes.
• Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en".
Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes.
• También se observa que el término "kit" tal como se usa en la presente memoria no se limita a ningún dispositivo específico e incluye cualquier dispositivo adecuado para hacer funcionar la invención como, entre otros, micromatrices, biomatrices, biochips o matrices de biochips.
En la técnica anterior se conocen una variedad de procedimientos estadísticos y matemáticos para establecer el umbral o nivel de corte de expresión. Se puede seleccionar un nivel de expresión de umbral o de corte para un biomarcador particular, por ejemplo, basándose en datos de gráficos de Características Operativas del Receptor (ROC), como se describe en los ejemplos y figuras de la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que estos niveles de expresión de umbral o de corte se pueden variar, por ejemplo, moviéndose a lo largo del gráfico ROC para un biomarcador particular o combinaciones de los mismos, para obtener diferentes valores de sensibilidad o especificidad, lo que afecta el rendimiento general del ensayo. Por ejemplo, si el objetivo es tener un procedimiento diagnóstico robusto desde el punto de vista clínico, debemos tratar de tener una alta sensibilidad. Sin embargo, si el objetivo es tener un procedimiento rentable, debemos tratar de obtener una alta especificidad. El mejor punto de corte se refiere al valor obtenido del gráfico ROC para un biomarcador en particular que produce la mejor sensibilidad y especificidad. Los valores de sensibilidad y especificidad se calculan sobre el intervalo de umbrales (puntos de corte). Por lo tanto, los valores de umbral o de corte se pueden seleccionar de modo que la sensibilidad y/o la especificidad sean al menos de aproximadamente 70%, y pueden ser, por ejemplo, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% en al menos 60% de la población de pacientes analizada, o en al menos 65%, 70%, 75% u 80% de la población de pacientes analizada.
Por consiguiente, cada una de las realizaciones citadas anteriormente de la presente invención se lleva a cabo preferentemente mediante la determinación de los niveles de expresión de al menos los micro-ARN anteriormente citados en una muestra mínimamente invasiva aislada del sujeto a ser diagnosticado o cribado, y comparar los niveles de expresión de dichos micro-ARN con valores de umbral o de corte predeterminados, en el que dichos valores de umbral o de corte predeterminados corresponden al nivel de expresión de dichos micro-ARN que se correlaciona con la especificidad más alta a una sensibilidad deseada en una curva ROC calculada en base a los niveles de expresión de los micro-ARN determinados en una población de pacientes con riesgo de padecer cáncer colorrectal o adenoma colorrectal, en el que la sobreexpresión de al menos uno de dichos micro-ARN con respecto a dicho valor de corte predeterminado es indicativo de que el sujeto sufre de cáncer colorrectal o adenoma colorrectal con dicha sensibilidad deseada.
Las invenciones ilustrativamente descritas en la presente memoria pueden llevarse a la práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se describan específicamente en la presente memoria. De este modo, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. deben leerse de forma amplia y sin limitación.
En la presente memoria, la invención ha sido descrita de forma amplia y genérica. Cada una de las especies más estrechas y los grupos subgenéricos que caen dentro de la divulgación genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una salvedad o una limitación negativa que elimine cualquier materia objeto del género, independientemente de si el material extirpado está citado específicamente o no en la presente memoria.
Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones y ejemplos no limitativos. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Población de estudio
De manera prospectiva, se incluyó un total de 300 sujetos de ocho hospitales españoles (Hospital Clínico de Barcelona, Hospital de Burgos, Hospital de Vigo, Hospital de Tenerife, Hospital de Alicante, Hospital de Donostia, Hospital de Ourense y Hospital de Zaragoza) en este estudio: 193 pacientes recién diagnosticados de neoplasia colorrectal esporádica (92 con CRC y 101 con AA) y 100 individuos sanos sin antecedentes personales de ningún tipo de cáncer y con una colonoscopia reciente que confirme la ausencia de lesiones neoplásicas colorrectales. Los pacientes con AA eran aquellos con adenomas de al menos 10 mm de tamaño o histológicamente con displasia de alto grado o > 20% de componente velloso. Las características de los participantes se muestran en la Tabla 1. Se recogieron muestras de sangre antes de la endoscopia o cirugía en todos los individuos.
El estudio fue aprobado por el Comité Ético Institucional del Hospital Clínico de Barcelona (fecha de aprobación: 03/11/2014), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
Tabla 1
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Ejemplo 2. Extracción de ARN
Se recogieron 10 ml de sangre entera de cada participante en tubos que contenían EDTA K3. Las muestras de sangre se colocaron a 4 °C hasta la separación del plasma. Las muestras se centrifugaron a 1600 x g durante 10 minutos a 4 °C para reducir las células sanguíneas y el plasma se transfirió a tubos nuevos, seguido de una centrifugación adicional a 16000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar por completo los componentes celulares. A continuación, el plasma se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. El aislamiento de miARN se realizó utilizando el kit mirVana™ PARIS™ (Ambion por Life Technologies).
Los miARN se extrajeron de todas las muestras de plasma, se retrotranscribieron, preamplificaron y analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Para cada muestra de ARN, 3 miARN de control (cel-miR-39-3p como "spike-in" y hsa-miR-1228-3p) y 5 miARN candidatos (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-29a-3p, hsamiR-19a-3p y hsa-miR-19b-3p) se analizaron por separado y en combinación. Cada miARN en cada muestra se evaluó por triplicado y los valores medios de Ct se normalizaron para obtener valores de -deltaCT (DCt).
El protocolo de Retrotranscripción (RT) singleplex de miARN se realizó utilizando cebadores RT de Ensayos de MicroARN TaqMan®. (P/N: 4427975. ID del Ensayo: específico para cada miARN-Life Technologies y usando el Kit de Transcripción Inversa de MicroARN TaqMan®. Life Technologies): Cel-miR-39-3p (ID del Ensayo: 000200 control Exógeno), Hsa-miR-1228-3p (ID del Ensayo: 002919 control Endógeno), Hsa-miR-15b-5p (ID del Ensayo: 000390), Hsa-miR-18a-5p (ID del Ensayo: 002422), Hsa-miR-29a-3p (ID del Ensayo: 002112), Hsa-miR-19a-3p (ID del Ensayo: 000395) y Hsa-miR-19b-3p (ID del Ensayo: 000396).
El protocolo de RT se llevó a cabo en un Termociclador de 96 pocillos Veriti® P/N (número de producto): 4375786 (Life Technologies). El protocolo de Preamplificación singleplex de miARN (Preamp) se realizó para todos los miARN analizados. Se utilizaron cebadores en tiempo real de Ensayos de MicroARN TaqMan® (P/N ID del Ensayo: específico para cada miARN. Life Technologies como se describió anteriormente). Se usó TaqMan® Preamp Master Mix (Life Technologies). Los análisis de preamplificación se realizaron en el Termociclador Veriti® de 96 pocillos P/N: 4375786 (Life Technologies). El protocolo de PCR en tiempo real para el análisis de expresión de miARN se realizó con el cebador en tiempo real 20X de Ensayos de MicroARN TaqMan® (P/N ID del Ensayo: específico para cada miARN-Life Technologies como se describió anteriormente). Los análisis de expresión se realizaron en un Sistema de PCR en Tiempo Real ViiA<™> 7 (P/N: 4375786-Life technologies). Los valores de Ct se calcularon a partir del umbral automático. Los controles sin plantilla no mostraron amplificación. Se incluyeron tres réplicas técnicas para cada punto de qPCR. Los niveles de expresión relativos de los miARN seleccionados se calcularon para cada muestra como valores de DCt [DCt = Ct de miARN diana - Ct de miARN de control interno].
Ejemplo 3. Análisis estadístico
Se exploraron las diferencias en los niveles de expresión de miARN (valores -DCt) entre diferentes grupos de pacientes usando análisis de regresión logística multivariable ajustada por edad, género y sitio calculando la oportunidad relativa e intervalos y sus valores p correspondientes. Los gráficos de análisis ROC y los puntos de corte derivados, así como los parámetros generales de precisión discriminativa, se calcularon utilizando el paquete R de DiagnosisMed considerando cada expresión de miARN como una variable continua. Se calculó la Sensibilidad (Sn) y la Especificidad (Sp) para varios puntos de corte (el punto de corte óptimo asociado con la distancia mínima entre la curva ROC y la esquina superior izquierda, el punto de corte asociado con 80% Sn, con 85% Sn y con 90% Sn) (véase Tabla 2 para cáncer colorrectal y Tabla 3 para adenoma colorrectal avanzado).
Tabla 2
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Tabla 3
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Con todos los valores de Ct de todas las muestras obtenidas de la PCR en tiempo real, hemos utilizado diferentes transformaciones de normalización con el fin de obtener -DCt. También hemos seleccionado la normalización por múltiples miARN domésticos (cel-miR-39, hsa-miR-1228) en lugar de uno. El factor de normalización basado en los niveles de expresión de los miARN domésticos se calculó utilizando la media geométrica (http://genomebiology.com/2002/3/7/research/0034) de las diferentes combinaciones domésticas. Los 3 miARN domésticos (cel-miR-39, hsa-miR-1228) mostraron buenos niveles de Ct en todas las muestras y mostraron una alta estabilidad entre muestras, sin diferencias en su expresión entre grupos.
Inicialmente usamos diferentes esquemas de normalización (normalización usando cel-miR-39; normalización usando hsa-miR-1228, normalización usando media geométrica de cel-mir-39 y hsa-miR-1228, normalización usando media geométrica de cel-miR-39, y normalización usando la media geométrica de cel-miR-39 y hsa-miR-1228).
Aunque los seis procedimientos de normalización dieron resultados muy similares, el más preciso fue la normalización usando la media geométrica de cel-miR-39 y hsa-miR-1228.
Ejemplo 4. Comparación de pacientes con cáncer colorrectal versus individuos control
Antes de analizar los resultados, hemos excluido algunos valores de Ct del análisis por estar por encima del valor máximo de Ct del intervalo de linealidad (obtenido de nuestra validación analítica anterior).
También se llevó a cabo la comparación de pacientes con cáncer colorrectal frente a los individuos de control. Resultados de la regresión logística: se muestra la oportunidad relativa (OR), el intervalo de confianza (IC) del 95% y el valor p correspondiente de la regresión logística para cada miARN individual en el modelo ajustado por edad y sexo. La "n" significa el número de muestras que finalmente se han analizado para cada miARN (véase Tabla 4).
Tabla 4
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Con el fin de corregir cualquier posible influencia del origen de la muestra, también se ha ajustado la regresión logística por hospital de origen. En este análisis se han incluido únicamente los hospitales que disponían de muestras en los diferentes grupos (véase Tabla 5). Por esta razón, la "n" es diferente de la tabla que se muestra arriba (Tabla 4).
Tabla 5
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Curiosamente, se confirmó que miR-18a y miR-15b estaban significativamente regulados al alza en pacientes con cáncer colorrectal.
Ejemplo 5. Comparación de pacientes con adenoma colorrectal avanzado versus individuos control También se llevó a cabo la comparación de pacientes con adenoma colorrectal avanzado frente a los individuos de control. Resultados de la regresión logística: la oportunidad relativa (OR), el intervalo de confianza (IC) del 95% y el valor p correspondiente de la regresión logística se muestran en la Tabla 6 para cada miARN en el modelo ajustado por edad y sexo. La "n" significa el número de muestras que se han analizado para cada miARN.
Tabla 6
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Con el fin de corregir cualquier posible influencia del origen de la muestra, también se ha ajustado la regresión logística por hospital de origen. En este análisis se han incluido únicamente los hospitales que disponían de muestras en los diferentes grupos (véase Tabla 7). Por esta razón, la "n" es diferente de la Tabla 6 que se muestra arriba.
Tabla 7
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Los resultados muestran que los altos niveles circulantes de miR-15b y miR-18a están significativamente asociados con la presencia de adenoma colorrectal avanzado, pero miR-15b ofrece los mejores resultados. Ejemplo 6. Firmas de miARN para detección de cáncer colorrectal y adenoma colorrectal avanzado frente a la población de control
El siguiente paso fue analizar cualquier combinación posible de al menos dos de los cinco miARN para probar la mejor firma para discriminar entre cáncer colorrectal y/o adenoma colorrectal avanzado frente a los individuos de control.
Se han evaluado todas las combinaciones posibles entre miR-19a, miR-19b, miR-29a, miR-15b y miR-18a y se han seleccionado aquellos modelos que muestran el AUC más alto (= o > 0,88) para el cáncer colorrectal frente a los Controles y el AUC más alto (> 0,80) para adenoma colorrectal avanzado frente a Controles cuando se ajustan por edad, sexo y hospital. Vale la pena señalar que todas las mejores firmas para el diagnóstico de cáncer colorrectal y/o adenoma colorrectal avanzado comprenden al menos miR-15b. Por consiguiente, probamos las diferencias entre el AUC, la Sensibilidad (Sn) y la Especificidad (Sp) comparando la siguiente firma: miR-15b vs miR-29a vs miR-15b+miR-29a vs miR-15b+miR-29a+miR-18a frente a miR-15b+miR-29a+miR-19a frente a miR-15b+miR-29a+miR-19b. Los resultados se muestran en la Tabla 8 a continuación (*Distancia Roc.Min **Índice de Youden.Max).
Tabla 8
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Los parámetros de la curva ROC para la firma que comprende miR-15b+miR-29a (área bajo la curva (AUC) y el intervalo de confianza (IC) del 95% se muestran para todos los casos de CRC, así como para diferentes etapas tumorales (I/II y III/IV) y localizaciones (derecha e izquierda, respecto al ángulo esplénico). Además, hemos analizado el AA teniendo en cuenta AA > 10 mm vs AA < 10 mm (véase Tabla 9 para CRC y Tabla 10 para AA). (*Distancia Roc.Min **Índice de Youden.Max).
Tabla 9
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Tabla 10
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro para el diagnóstico de sujetos con riesgo de desarrollar adenomas colorrectales avanzados que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a obtenidos de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos humanos a ser diagnosticados seleccionados de la lista que consiste en: una muestra de plasma, muestra de sangre o muestra de suero; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a de los sujetos humanos a ser diagnosticados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos miR-15b y miR-29a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados.
2. Procedimiento in vitro para el diagnóstico de sujetos con riesgo de desarrollar adenomas colorrectales avanzados, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19b, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a y miR-19a y miR-19b, obtenidos a partir de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos humanos a ser diagnosticados seleccionados del grupo que consiste en: muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos miR-15b y miR-29a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19b, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a y miR-19a y miR-19b, de los sujetos a ser diagnosticados con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos miR-15b y miR-29a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19b, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a y miR-19a y miR-19b es indicativo de adenomas colorrectales avanzados.
3. Procedimiento in vitro para el diagnóstico de un sujeto con riesgo de desarrollar adenoma colorrectal avanzado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, y (c) confirmar la presencia de adenomas colorrectales avanzados mediante el examen del intestino por cualquier medio, preferentemente mediante colonoscopia.
4. Uso de un kit que comprende reactivos para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos miR-15b y miR-29a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a, o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19a o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-19b o de al menos miR-15b y miR-29a y miR-18a y miR-19a y miR-19b para el diagnóstico in vitro del riesgo para adenomas colorrectales avanzados, en una muestra de plasma, sangre o suero.
5. Un kit que consiste en reactivos de detección para determinar el nivel de expresión de miR-15b y miR-29a en una muestra biológica de los sujetos humanos seleccionados de la lista que consiste en: una muestra de plasma, muestra de sangre o muestra de suero, en el que dichos reactivos son seleccionados de cebadores específicos para miR-15b y miR-29a y sondas marcadas detectables que hibridan con miR-15b y miR-29a.
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