ES2899733T3 - Anticuerpos anti-CD277 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-CD277 para su uso en terapia, en donde dicho anticuerpo comprende las 6 CDR del anticuerpo mAb20.1 o mAb7.2 que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de CNCM 1-4401 o 1- 4402, respectivamente, y en donde dicho anticuerpo anti-CD277 activa la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vγ9/Vδ2.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CD277 y usos de los mismos

Sector de la técnica

La invención se refiere a anticuerpos anti-CD277 y usos de los mismos.

Estado de la técnica

Los glóbulos blancos son células del sistema inmunitario implicadas en la defensa del cuerpo contra los patógenos. Entre estas células, se pueden citar los linfocitos, los monocitos y las células dendríticas. Los monocitos pueden migrar del torrente sanguíneo a otros tejidos y diferenciarse en macrófagos o células dendríticas residentes en el tejido. Las células dendríticas desempeñan una función como células presentadoras de antígenos (APC) que activan los linfocitos. Entre los linfocitos, los linfocitos T se pueden dividir en linfocitos T y§ y linfocitos T ap.

Los linfocitos T Vy9/V82 son efectores importantes de la defensa inmunitaria. Lisan directamente células anómalas o infectadas con patógenos. Además, regulan las respuestas inmunitarias al inducir la maduración de las células dendríticas (CD), así como el cambio isotípico y la producción de inmunoglobulinas. Esta importante plataforma celular del sistema inmunitario está estrictamente regulada por receptores de superficie, quimiocinas y citocinas.

La sensibilización de los linfocitos T está modulada por la participación de células especializadas y la secreción de citocinas quimiotácticas. Actualmente, se sabe que la activación de los linfocitos T es el resultado de dos acontecimientos sinérgicos. El primero es la interacción entre el receptor de linfocitos T (TCR) y el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) conjugado con antígeno procesado en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). El segundo acontecimiento es una señal coestimulante independiente del antígeno que implica moléculas B7. La falta de señal coestimulante induce anergia, es decir, la inhibición de la proliferación de linfocitos T, secreción de citocinas y actividades citotóxicas. El estudio de estas vías puede proporcionar información acerca del desencadenamiento de acontecimientos patológicos, tales como trastornos autoinmunitarios o linfoproliferativos.

La familia B7 es un grupo amplio de moléculas coestimulantes (Coyle et al., 2001). A la familia B7 pertenecen los ligandos B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86): sus receptores son CD28, que conduce a la activación de linfocitos T (Linsley y Ledbetter, 1993, June, et al., 1994, Lenschow et al., 1996) y CTLA-4 (CD152), que compite con CD28 y transduce una señal inhibidora (Waterhouse et al., 1996). La función fundamental de CD152 como regulador negativo de la activación de linfocitos T se demuestra por la aparición de trastornos linfoproliferativos en ratones deficientes en CTLA-4 (Waterhouse et al., 1995). La mayoría de los datos sobre la función inhibidora ejercida por CD152 se recopilan de estudios de proliferación o producción de citocinas por linfocitos T vírgenes durante la sensibilización de linfocitos T (Linsley et al., 1992, Walunas et al., 1995, Walunas y Bluestone, 1998). En particular, CD152 se expresa después de la activación de los linfocitos T e inhibe las funciones citolíticas de los clones de CTL obtenidos después de la estimulación con PHA o la selección de Ag (Saverino et al., 1998).

B7-H1 (PD-L1, CD274) y B7-DC (PD-L2, CD273), cuyo receptor es PD-1 (CD279), demostraron inhibir la proliferación de linfocitos T y la secreción de citocinas (Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001). Por otra parte, diferentes estudios han mostrado que la interacción de PD-L1 y PD-L2 aumenta la proliferación de linfocitos T y la producción de IL-10 o IFN-y (Dong et al., 1999, Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001, Chapoval et al., 2001, Tseng et al., 2001). Otras moléculas relacionadas con la familia B7 expresadas en la superficie de los linfocitos T son B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4 cuyas funciones no se comprenden completamente (Hutloff et al., 1999, Sun et al., 2002).

Henry et al. (1999) encontraron que la región que codifica la butirofilina (BT) está ubicada en una posición telomérica de la región del MHC de clase I en el cromosoma 6 humano. En particular, describieron dos genes Bt2 y Bt3, que codifican un nuevo grupo de moléculas coestimulantes (BT2.1, BT2.2, BT2.3, BT3.1, BT3.2 y BT3.3) pertenecientes a la superfamilia Ig (IgSF) (Williams y Barclay, 1988) y relacionadas con la familia B7 mediante análisis de similitud de secuencia: en particular, muestra similitud con el dominio extracelular de tipo Ig-V de CD80 y CD86 (Linsley et al., 1992).

Los miembros de la familia BT3 aparecen en la bibliografía con diferentes nombres: BT3.1 también se denomina BTF5 (Rhodes et al., 2001) o BTN3A1 (Ruddy et al., 1997) o, más recientemente, CD277 (Bensussan y Olive, 2005); BT3.2 también se denomina BTF4 (Rhodes et al., 2001) o BTN3A2 (Ruddy et al., 1997); y, finalmente, bT3.3 aparece también como BTF3 (Rhodes et al., 2001) o BTN3A3 (Ruddy et al., 1997). Bt 3 tiene dos dominios extracelulares de tipo Ig que caracterizan el IgSF.

Se ha propuesto que los genes b7 y los genes del MHC de clase I y II pueden tener un gen ancestral común y podrían codificar proteínas implicadas en una función similar, tal como la activación de linfocitos T (Rhodes et al., 2001). Se han encontrado moléculas BT3 en células inmunitarias, tales como linfocitos T, B y NK, monocitos y células dendríticas, así como precursores hematopoyéticos y algunas líneas celulares neoplásicas (Compte et al., 2004). En cuanto a otras moléculas coestimulantes, su estructura se caracteriza por tres dominios: un dominio extracelular para unirse al ligando, un dominio transmembrana y un dominio intracelular denominado B30.2 que supuestamente participa en la regulación de las concentraciones intracelulares de superóxido (Henry et al., 1998). Hasta ahora, todavía se desconocen el o los ligandos de CD277.

Hasta la fecha, no se ha demostrado ningún enfoque satisfactorio que induzca respuestas inmunitarias potentes contra las vacunas, especialmente en pacientes con cáncer. Aún no se han ideado métodos para superar los mecanismos inmunosupresores observados en pacientes con cáncer y durante infecciones crónicas.

Objeto de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-CD277, que activa la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vy9/V82. La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277, que coestimula los linfocitos T junto con CD3-TCR y/o coestimula los linfocitos T además de la coestimulación de CD28-B7. La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277, lo que aumenta la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas.

Preferentemente, el anticuerpo según la divulgación es un anticuerpo anti-CD277, que:

- activa la función citolítica de linfocitos T Vy9/V82, y

- coestimula los linfocitos T junto con CD3-TCR, y

- coestimula los linfocitos T además de la coestimulación de CD28-B7, y

- aumenta la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas.

En particular, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo anti-CD277 (elegido entre mAb 20.1,7.2) que se puede obtener a partir de uno de los hibridomas accesibles con el número de depósito de CNCM I-4401 e I-4402.

La divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277 que comprende las CDR del mAb 20.1. La divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277 que comprende las CDR del mAb 7.2. La divulgación también se refiere a uno de los mAb 20.1, 7.2, o un derivado de los mismos, para el uso en terapia.

La divulgación se refiere a uno de los mAb 20.1 y 7.2, o un derivado de los mismos, para su uso para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica.

La divulgación se refiere a una vacuna para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica que comprende uno de los mAb 20.1 y 7.2, o un derivado de los mismos. La divulgación se refiere a un equipo para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica que comprende:

a) mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos; y

b) una vacuna para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica.

La divulgación se refiere a un anticuerpo anti-CD277 como se ha definido anteriormente para el uso en terapia.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Según la presente divulgación, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado y se usarán igualmente en la presente divulgación. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno. De este modo, el término anticuerpo abarca no solo moléculas de anticuerpo completas, sino también fragmentos o derivados de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)² y diacuerpos. En los anticuerpos naturales, las dos cadenas pesadas están ligadas entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada está ligada a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (K). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos.

La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados conjuntamente CH). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de la unión al antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión al complemento y unión a los receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consta de las partes variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están compuestos por restos que provienen principalmente de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) o hipervariables.

Ocasionalmente, los restos de las regiones marco (FR) o no hipervariables influyen en la estructura general del dominio y, por tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR procedente de cada región V de cadena pesada y ligera. Las regiones marco (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos intercaladas entre las CDR. La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a una fusión modificada por ingeniería genética de partes de un anticuerpo animal, normalmente un anticuerpo de ratón, con partes de un anticuerpo humano. En general, los anticuerpos quiméricos contienen aproximadamente un 33 % de proteína de ratón y un 67 % de proteína humana. Desarrollados para reducir la respuesta de anticuerpos humanos antianimales inducida por anticuerpos animales, combinan la especificidad del anticuerpo animal con la interacción eficiente del sistema inmunitario humano de un anticuerpo humano.

Según la divulgación, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene un marco de región variable y regiones constantes de un anticuerpo humano pero que conserva las CDR del anticuerpo animal.

El término "Fab" indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y toda la cadena L, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, se unen entre sí a través de un enlace disulfuro.

El término "F(ab')²" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región de bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, pepsina.

El término "Fab'" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región de bisagra del F(ab')2.

Un polipéptido Fv monocatenario ("scFv") es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que se expresa habitualmente a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL unidos por un conector que codifica un péptido.

"dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes mediante un conector peptídico, tal como sc(Fv)² divalente.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un conector que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Por "purificado" y "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido (es decir, un anticuerpo según la divulgación) o a una secuencia de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo.

El término "purificado", como se usa en el presente documento, significa preferentemente que están presentes al menos 75 % en peso, más preferentemente al menos 85 % en peso, aún más preferentemente al menos 95 % en peso y lo más preferentemente al menos 98 % en peso de macromoléculas biológicas del mismo tipo.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente exenta de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afecten de forma perjudicial a las características básicas de la composición.

En el contexto de la divulgación, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende como una cantidad mínima de agente activo que es necesaria para transmitir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un mamífero es una cantidad tal que induce, mitiga o causa de otro modo una mejora en los síntomas patológicos, progresión de la enfermedad o condiciones fisiológicas asociadas con o resistencia a sucumbir a un trastorno.

Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a prevenir la aparición de la enfermedad o afección en un sujeto en el que aún no se ha diagnosticado. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente, un sujeto según la divulgación es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, los términos "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplásico" se refieren a células que tienen la capacidad de crecer de manera autónoma, es decir, un estado anómalo o afección caracterizado por un crecimiento celular de rápida proliferación. Los estados patológicos hiperproliferativos y neoplásicos pueden clasificarse como patológicos, es decir, que caracterizan o constituyen una patología, o pueden clasificarse como no patológicos, es decir, una desviación con respecto a la normalidad, pero no asociada a una patología. Se entiende que el término incluye todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos con transformación maligna, independientemente del tipo histopatológico o del estadio de invasividad.

Los términos "cáncer" o "neoplasias" incluyen neoplasias malignas de diversos sistemas orgánicos, tales como las que afectan al pulmón, mama, tiroides, linfoides, gastrointestinales y de las vías genitourinarias, así como adenocarcinomas que incluyen neoplasias malignas tales como la mayor parte de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago.

Los inventores han depositado un hibridoma productor de anticuerpos murinos anti-CD277 (mAb 20.1) en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia), de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, el 24 de noviembre de 2010.

El hibridoma depositado para mAb 20.1 tiene el número de depósito de la CNCM I-4402.

"mAb 20.1" se refiere a un anticuerpo anti-CD277 aislado que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-4402. La expresión "un derivado del mAb 20.1" se refiere a un anticuerpo anti-CD277 que comprende las 6 CDR del mAb 20.1.

Los inventores han depositado un hibridoma productor de anticuerpos murinos anti-CD277 (mAb 7.2) en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia), de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, el 24 de noviembre de 2010.

El hibridoma depositado para mAb 7.2 tiene el número de depósito de la CNCM I-4401.

"mAb 7.2" se refiere a un anticuerpo anti-CD277 aislado que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-4401. La expresión "un derivado del mAb 7.2" se refiere a un anticuerpo anti-CD277 que comprende las 6 CDR del mAb 7.2.

Anticuerpos de la divulgación y ácidos nucleicos que los codifican

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo anti-CD277 aislado, que activa la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vy9/V52.

Por activación de la función citolítica de linfocitos T Vy9/V52, se entiende que se observa un aumento significativo de la citotoxicidad de los linfocitos T Vy9/V52, es decir, un aumento significativo de la lisis específica de las células diana por los linfocitos T Vy9/V52.

Por aumento de la producción de citocinas por los linfocitos T Vy9/V52, se entiende que se observa un aumento significativo de la producción de citocinas por los linfocitos T Vy9/V52, en comparación con los linfocitos T de control Vy9/V52 (es decir, sin estimular y sin tratar).

Por aumento de la proliferación de los linfocitos T Vy9/V52, se entiende que se observa un aumento significativo de la proliferación de linfocitos T Vy9/V52, en comparación con los linfocitos T de control Vy9/V52 (es decir, sin estimular y sin tratar).

Normalmente, la activación de la función citolítica de los linfocitos T Vy9/V52 se puede medir según el método descrito en el ejemplo 3 (es decir, "Análisis de las respuestas de linfocitos T Vy9V52 por ensayo de citotoxicidad directa" y, por ejemplo, los resultados "CD277 potencian la citólisis antitumoral mediada por linfocitos T Vy9V52"). Son ejemplos de anticuerpos anti-CD277 aislados, que activan la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vy9/V52, los mAb 20.1 o 7.2, o derivados de los mismos.

La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277, que coestimula los linfocitos T junto con CD3-TCR. Por coestimulación de los linfocitos T junto con CD3-TCR, se entiende que se activa la cascada de reacción que sigue a la unión de CD3 con TCR. Normalmente, la coestimulación de linfocitos T junto con CD3-TCR puede medirse según el método descrito en el ejemplo 2 (en particular "CD277 coestimula señales de CD3"). Son ejemplos de anticuerpos anti-CD277 aislados, que coestimulan los linfocitos T junto con CD3-TCR, los mAb 20.1 o 7.2, o derivados de los mismos.

La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277, que coestimula los linfocitos T además de la coestimulación de CD28-B7. Por coestimulación de los linfocitos T junto con CD28-B7, se entiende que se activa la cascada de reacción que sigue a la unión de CD28 con B7. Normalmente, la coestimulación de linfocitos T junto con CD28-B7 puede medirse según el método descrito en el ejemplo 2 (en particular "CD277 coestimula señales de CD3"). Son ejemplos de anticuerpos anti-CD277 aislados, que coestimulan los linfocitos T junto con CD28-B7, los mAb 20.1 o 7.2, o derivados de los mismos.

La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277, lo que aumenta la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas. Por aumento de la actividad de los monocitos y las células dendríticas, se entiende que dicho anticuerpo anti-CD277 aumenta la expresión de moléculas coestimulantes (como CD86, CD80 y HLA-DR) en la superficie de monocitos y células dendríticas, y aumenta las respuestas proinflamatorias inducidas por ligandos de TLR en estas células. Normalmente, el aumento de la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas se puede medir según el método descrito en el ejemplo 1 (en particular "Detección de apoptosis" y "Producción de citocinas"). Son ejemplos de anticuerpos anti-CD277 aislados, que aumentan la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas, el mAb 20.1, o derivados del mismo.

La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277 aislado (mAb 20.1) que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-4402.

La presente divulgación se refiere al hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-4402.

La divulgación se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR del mAb 20.1.

En otra realización, la divulgación se refiere a un derivado del mAb 20.1 que comprende las cadenas VL y las cadenas VH del mAb 20.1.

En otra realización, la divulgación se refiere a un derivado del mAb 20.1 que es un anticuerpo quimérico, que comprende los dominios variables del mAb 20.1.

La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-CD277 aislado (mAb 7.2) que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCm I-4401.

La presente divulgación se refiere al hibridoma accesible con el número de depósito de la CNCM I-4401.

La divulgación se refiere a un anticuerpo que comprende las 6 CDR del mAb 7.2.

En otra realización, la divulgación se refiere a un derivado del mAb 7.2 que comprende las cadenas VL y las cadenas VH del mAb 7.2.

En otra realización, la divulgación se refiere a un derivado del mAb 7.2 que es un anticuerpo quimérico, que comprende los dominios variables del mAb 7.2.

En una realización, un anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo monoclonal.

En una realización, un anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo quimérico.

En una realización, el anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo humanizado.

Una realización adicional de la divulgación se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la divulgación.

En una realización particular, la divulgación se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH o el dominio VL de un anticuerpo de la divulgación. Normalmente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que puede incluirse en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector vírico.

Las expresiones "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen exógeno) en una célula hospedadora, para transformar el hospedador y promover la expresión (p. ej., transcripción y traducción) de la secuencia introducida. De este modo, un objeto adicional de la divulgación se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la divulgación.

Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para causar o dirigir la expresión de dicho anticuerpo tras su administración a un sujeto. Los ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para células animales incluyen promotor temprano y potenciador de SV40, promotor y potenciador de LTR del virus de la leucemia murina de Moloney, promotor y potenciador de la cadena H de inmunoglobulina y similares.

Se puede usar cualquier vector de expresión para células animales, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifique la región C del anticuerpo humano. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSGI beta d2-4- y similares.

Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación o plásmidos integradores, tales como, por ejemplo, pUC, pcDNA, pBR y similares. Otros ejemplos de vector vírico incluyen vectores adenovíricos, retrovíricos, de virus del herpes y de VAA. Dichos virus recombinantes pueden producirse mediante técnicas conocidas en este campo, tal como por transfección de células de empaquetamiento o por transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares. Los ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes de replicación defectuosa, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5882 877, US 6013 516, US 4861 719, US 5278 056 y WO 94/19478.

Un objeto adicional de la presente divulgación se refiere a una célula que ha sido transfectada, infectada o transformada por un ácido nucleico y/o un vector según la divulgación. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "exógeno" (es decir, extrínseco o extracelular) a una célula hospedadora, de modo que la célula hospedadora exprese el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, normalmente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. Una célula hospedadora que recibe y expresa el ADN o ARN introducido se ha "transformado". Los ácidos nucleicos de la divulgación se pueden usar para producir un anticuerpo de la divulgación en un sistema de expresión adecuado. La expresión "sistema de expresión" significa una célula hospedadora y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por ADN exógeno transportado por el vector e introducido en la célula hospedadora. Los sistemas de expresión habituales incluyen células hospedadoras de E. coli y vectores plasmídicos, células hospedadoras de insectos y vectores de baculovirus, y células hospedadoras y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células huésped incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamíferos (p. ej., células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos primarios o establecidos de células de mamíferos (p. ej., producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen la célula de ratón SP2/0-Agl4 (ATCC CRL1581), la célula de ratón P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), la célula CHO en la que un gen de la dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo en el presente documento denominado "gen DHFR") es defectuoso, la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O de rata (ATCC CRL1662, en lo sucesivo en el presente documento denominada "célula YB2/0") y similares.

La presente divulgación también se refiere a un método para producir una célula hospedadora recombinante que expresa un anticuerpo según la divulgación, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) introducir un ácido nucleico recombinante in vitro o ex vivo o un vector como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora competente,

(ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedadora recombinante obtenida, y

(iii) opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho anticuerpo. Dichas células hospedadoras recombinantes pueden usarse para la producción de anticuerpos de la divulgación.

Métodos de producción de anticuerpos de la divulgación

Los anticuerpos de la divulgación pueden producirse por cualquier técnica conocida en este campo, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.

Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la materia puede producir fácilmente dichos anticuerpos, mediante técnicas convencionales para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando un método de fase sólida bien conocido, preferentemente usando un aparato de síntesis de péptidos disponible en el mercado (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Como alternativa, los anticuerpos de la divulgación se pueden sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en este campo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican los anticuerpos en los vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedadores eucariotas o procariotas adecuados que expresarán los anticuerpos deseados, de los que pueden aislarse posteriormente usando técnicas bien conocidas.

En particular, la divulgación se refiere además a un método de producción de un anticuerpo de la divulgación, método que comprende las etapas que consisten en:

(i) cultivar una célula hospedadora transformada según la divulgación en condiciones adecuadas para permitir la expresión de dicho anticuerpo; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

En otra realización particular, el método comprende las etapas de:

(i) cultivar el hibridoma depositado como CNCM I-4401, CNCM I-4402 en condiciones adecuadas para permitir la expresión del anticuerpo; y

(ii) recuperar el anticuerpo expresado.

Los anticuerpos de la divulgación se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En una realización particular, el anticuerpo quimérico humano de la presente divulgación se puede producir obteniendo secuencias nucleicas que codifican los dominios VL y VH como se ha descrito anteriormente, construyendo un vector de expresión de anticuerpos quiméricos humanos insertándolos en un vector de expresión para una célula animal que tiene genes que codifican el CH del anticuerpo humano y el CL del anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante mediante la introducción del vector de expresión en una célula animal. Como dominio CH de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a la inmunoglobulina humana, pero los de la clase IgG son adecuados y también se puede usar una cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, como CL de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a Ig y se pueden usar los de clase kappa o lambda. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican ADN recombinante convencional y se conocen bien en este campo técnicas de transfección génica (véanse los documentos de patente US5202 238; y US5204 244).

El anticuerpo humanizado de la presente divulgación puede producirse obteniendo secuencias de ácido nucleico que codifican dominios CDR, como se ha descrito anteriormente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo humanizado mediante su inserción en un vector de expresión para una célula animal que tiene genes que codifican (i) una región constante de cadena pesada idéntica a la de un anticuerpo humano y (ii) una región constante de cadena ligera idéntica a la de un anticuerpo humano y expresando los genes mediante la introducción del vector de expresión en una célula animal.

El vector de expresión de anticuerpo humanizado puede ser de un tipo en el que existe un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (de tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpo humanizado, facilidad de introducción en células animales y equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L de anticuerpos en células animales, se prefiere el vector de expresión de anticuerpo humanizado del tipo tándem. Los ejemplos de vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 y similares.

Se conocen bien en este campo métodos para producir anticuerpos humanizados basados en el ADN recombinante convencional y técnicas de transfección génica. Los anticuerpos pueden humanizarse usando diversas técnicas conocidas en este campo, incluyendo, por ejemplo, el injerto de CDR (documento EP 239400; publicación PCT WO91/09967; patentes de los Estados Unidos n.° 5 225 539; 5 530 101; y 5 585 089), remodelación o acondicionamiento de superficie (documentos EP 592 106; EP 519 596) y barajado de cadenas (patente de los Estados Unidos n.° 5565 332). También se conoce la tecnología de ADN recombinante general para la preparación de dichos anticuerpos (véanse la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

El Fab de la presente divulgación se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CD277 con una proteasa, papaína. Además, el Fab puede producirse insertando ADN que codifica Fab del anticuerpo en un vector para el sistema de expresión procariota, o para el sistema de expresión eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (según sea adecuado) para expresar el Fab.

El F(ab')2 de la presente divulgación se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CD277 con una proteasa, pepsina.

Además, el F(ab')2 puede producirse uniendo el Fab' descrito a continuación mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.

El Fab' de la presente divulgación se puede obtener tratando F(ab')2 que reacciona específicamente con CD277 humano con un agente reductor, ditiotreitol. Además, el Fab' se puede producir insertando ADN que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresión para procariota, o un vector de expresión para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota (según corresponda) para realizar su expresión.

El scFv de la presente divulgación se puede producir obteniendo ADNc que codifica los dominios VH y VL como se ha descrito anteriormente, construyendo ADN que codifica scFv, insertando ADN en un vector de expresión para procariota, o un vector de expresión para eucariota, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota (según corresponda) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, se puede usar una tecnología bien conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un fragmento scFv donante e injertarlas en un marco de fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (véanse, p. ej., los documentos WO98/45322; WO 87/02671; US5859 205; US5 585 089; US4816 567; EP0173494).

Se contemplan la modificación o modificaciones de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado simplemente injertando solo CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR del VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión a antígeno se reduce en comparación con la del anticuerpo original procedente de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoácidos del VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en CDR sino también en FR, están asociados directa o indirectamente con la actividad de unión a antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos restos de aminoácidos por diferentes restos de aminoácidos procedentes de las FR del VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión.

Para resolver el problema, en anticuerpos injertados con CDR humana, se deben hacer intentos de identificar, entre las secuencias de aminoácidos del FR del VH y VL de anticuerpos humanos, un resto de aminoácido que está directamente asociado con la unión al anticuerpo, o que interactúa con un resto de aminoácido de CDR o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociado con la unión al antígeno. La actividad de unión a antígeno reducida podría incrementarse reemplazando los aminoácidos identificados con restos de aminoácidos del anticuerpo original procedente de un animal no humano.

Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente divulgación y en las secuencias de ADN que los codifican, y aun así obtener una molécula funcional que codifica un anticuerpo con características deseables. Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. Se entiende en general en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga, que son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Una realización adicional de la presente divulgación también abarca variantes de función conservadora de los anticuerpos de la presente divulgación.

Son "variantes conservadoras de función" aquellas en las que un resto de aminoácido dado en una proteína o enzima ha cambiado sin alterar la conformación y función generales del polipéptido, incluyendo, pero sin limitación, remplazo de un aminoácido por uno que tenga propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, ácido, básico, hidrófobo, aromático y similares).

Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína de modo que puede variar el porcentaje de similitud de secuencia proteica o de aminoácidos entre dos proteínas cualesquiera de función similar y puede ser, por ejemplo, de un 70 % a un 99 %, determinado según un esquema de alineación tal como por el método de agrupación, en donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN.

Una "variante conservadora de función" también incluye un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad de aminoácidos según lo determinado por los algoritmos BLASt o FASTA, preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 85 %, aún preferentemente al menos un 90 % e incluso más preferentemente al menos un 95 %, y que tiene propiedades o funciones iguales o sustancialmente similares a las de la proteína nativa u original con la que se compara. Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más del 80 %, preferentemente más del 85 %, preferentemente más del 90 % de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente el 90 %, preferentemente más del 95 %, son similares (funcionalmente idénticos) en toda la longitud de la secuencia más corta. Preferentemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineamiento usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, manual del programa para el paquete de GCG, versión 7, Madison, Wisconsin) o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencia, tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de actividad. Ya que la capacidad de interacción y la naturaleza de una proteína definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN, obteniendo al mismo tiempo, no obstante, una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se puedan realizar diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la divulgación, o en las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos anticuerpos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.

Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o una puntuación hidropática similar y aún dar lugar a una proteína con actividad biológica similar, es decir, obtener aún una proteína biológica funcionalmente equivalente. Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, por lo tanto, en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares.

Los expertos en la materia conocen bien sustituciones ilustrativas que toman en consideración varias de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la divulgación puede ser útil para alterar el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por "alteración" se entiende la supresión de uno o más restos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glucosilación de anticuerpos está normalmente ligada a N. "Ligada a N" se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparaginas-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Se realiza convenientemente adición de sitios de glucosilación al anticuerpo alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación ligados a N). Otro tipo de modificación covalente implica acoplar química o enzimáticamente glucósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedadora que tenga capacidades de glucosilación para la glucosilación ligada a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar o los azúcares pueden estar unidos a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina, orhidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Por ejemplo, dichos métodos se describen en el documento WO87/05330.

La eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en el anticuerpo se puede realizar química o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da lugar a la escisión de la mayoría o la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando al mismo tiempo el anticuerpo intacto. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en anticuerpos se puede lograr mediante el uso de diversas endo y exoglucosidasas.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de diversos polímeros no proteicos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes de los Estados Unidos n.° 4640 835; 4496 689; 4301 144; 4670 417; 4791 192 o 4 179337. Puede ser también deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, p. ej., con el fin de potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Como alternativa, o adicionalmente, pueden introducirse uno o más restos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción celular mediada por complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Caron PC. et al. J Exp Med. 1 de octubre de 1992; 176 (4): 1191-5 y Shopes B. J Immunol. 1 de mayo de 1992; 148 (9): 2918-22).

Usos terapéuticos de los anticuerpos de la invención

Los inventores han demostrado que algunos anticuerpos, como los mAb 20.1 y 7.2, activan la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vy9/V82 y, de este modo, pueden usarse para superar los mecanismos inmunosupresores observados en pacientes con cáncer y durante infecciones crónicas. Algunos anticuerpos coestimulan los linfocitos T junto con CD3-TCR o coestimulan los linfocitos T además de la coestimulación de CD28-B7; dichos anticuerpos pueden usarse en las mismas aplicaciones terapéuticas. Algunos anticuerpos aumentan la supervivencia de monocitos y células dendríticas; dichos anticuerpos pueden usarse en las mismas aplicaciones terapéuticas.

La divulgación se refiere a los mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos para su uso en terapia. La divulgación se refiere a los mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos para su uso en el tratamiento de un cáncer o una infección crónica.

La divulgación también se refiere a un método para tratar un cáncer o una infección crónica, en donde dicho método comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de los mAb 20.1 o 7.2 o de un derivado de los mismos.

Los ejemplos de cánceres incluyen, pero sin limitación, neoplasias malignas hematológicas tales como la neoplasia linfoide de linfocitos B, neoplasia linfoide de linfocitos T, linfoma no hodgkiniano (LNH), B-NHL, T-NHL, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma linfocítico pequeño (LLP), linfoma de células del manto (LCM), neoplasia linfoide de linfocitos NK y neoplasia de linaje de células mieloides.

Los ejemplos de cánceres no hematológicos incluyen, pero sin limitación, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer de hueso, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de testículo y cáncer de piel.

Los ejemplos de infecciones crónicas incluyen, pero sin limitación, infecciones víricas, bacterianas, parasitarias o fúngicas tales como hepatitis crónica, infecciones pulmonares, infecciones de las vías respiratorias inferiores, bronquitis, gripe, neumonía y enfermedades de transmisión sexual. Los ejemplos de infecciones víricas incluyen, pero sin limitación, hepatitis (VHA, VHB, VHC), herpes simple (VHS), herpes zóster, VPH, influenza (gripe), SIDA y complejo asociado al SlDA, varicela, resfriado común, infección por citomegalovirus (CMV), viruela (variola), fiebre por garrapatas de Colorado, dengue, fiebre hemorrágica del Ébola, fiebre aftosa, fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), rabia, rubéola, SRAG, encefalitis vírica, gastroenteritis vírica, meningitis vírica, neumonía vírica, enfermedad del Nilo Occidental y fiebre amarilla. Los ejemplos de infecciones bacterianas incluyen, pero sin limitación, neumonía, meningitis bacteriana, cólera, difteria, tuberculosis, carbunco, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, tifus, gonorrea, listeriosis, enfermedad de Lyme, fiebre reumática, pertusis (tosferina), peste, salmonelosis, escarlatina, shigelosis, sífilis, tétanos, tracoma, tularemia, fiebre tifoidea e infecciones del tracto urinario.

Los ejemplos de infecciones parasitarias incluyen, pero sin limitación, paludismo, leishmaniosis, tripanosomiasis, enfermedad de Chagas, criptosporidiosis, fascioliasis, filariasis, infecciones amebianas, giardiasis, infección por oxiuros, esquistosomiasis, teniasis, toxoplasmosis, triquinosis y tripanosomiasis. Los ejemplos de infecciones fúngicas incluyen, pero sin limitación, candidiasis, aspergilosis, coccidioidomicosis, criptococosis, histoplasmosis y tiña del pie.

Los mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos pueden usarse como adyuvante de vacuna para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica.

La divulgación se refiere a una vacuna para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica que comprende los mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos.

La divulgación se refiere a un equipo para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica que comprende:

a) mAb 20.1 o 7.2 o un derivado de los mismos; y

b) una vacuna para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica.

Los dos elementos del kit se pueden administrar de forma simultánea o secuencial a lo largo del tiempo.

Los ejemplos de vacunas para el tratamiento de un cáncer o una infección crónica incluyen, pero sin limitación, vacunas contra infecciones víricas, bacterianas, parasitarias o fúngicas tales como VIH y VHB y vacunas contra cánceres asociados a virus (por ejemplo, VPH o VHB) o vacunas antineoplásicas, por ejemplo, usadas para tratar a pacientes con melanoma, leucemia, cánceres de mama, cánceres de pulmón.

La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención.

Por lo tanto, un anticuerpo de la divulgación puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas. "Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea adecuado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, diluyente, material encapsulante o adyuvante de formulación de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosificación y la pauta naturalmente dependerán de la afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de las soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros y, en particular, en función del modo de administración usado, de la patología pertinente o, como alternativa, de la duración deseada del tratamiento. Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del anticuerpo en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; incluyendo las formulaciones aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la divulgación puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio.

Puede lograrse absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

También se contempla la preparación de soluciones más, o muy, concentradas para inyección directa, donde se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar lugar a una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los principios activos en un área tumoral pequeña.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa.

Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035­ 1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto al que se trate. La persona responsable de la administración determinará, en todo caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.

Los anticuerpos de la divulgación pueden formularse en una mezcla terapéutica para que comprendan de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o similares. También pueden administrarse múltiples dosis. Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de anticuerpos en las células hospedadoras. La formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos por los expertos en la materia.

Las nanocápsulas pueden en general inmovilizar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 pm) se diseñan en general usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan para el uso en la presente divulgación nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que cumplen con estos requisitos, y tales partículas pueden fabricarse fácilmente.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilaminares (denominadas también vesículas multilaminares (VML)). Las VML tienen en general diámetros desde 25 nm a 4 pm. El sometimiento a ultrasonidos de las VML da lugar a la formación de vesículas unilaminares pequeñas (VUP) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

La divulgación se ilustrará además en vista de las siguientes figuras y ejemplos.

Figuras

Figura 1:

A: Los receptores BT3 se expresan de forma constitutiva en la superficie de los monocitos y las CDi. Se muestra la expresión en monocitos recién aislados y CDi usando ambos mAb anti-BT3 del clon 20.1. El experimento que se muestra es representativo de cinco donantes estudiados (la intensidad de la variación de fluorescencia entre los cinco experimentos fue <2 %).

B: El ligamiento de BT3 proporciona una señal de supervivencia para monocitos y CDi. Se estimularon monocitos recién aislados (fila superior) y CDi (fila inferior) con mAb recubierto de plástico (anti-CD19 y anti-BT3) o GM-CSF 20 ng/ml según se indica. Después de la estimulación durante 72 horas, las células se recogieron y se analizaron para determinar la unión de la anexina V, como marcador de células apoptóticas. Los números en las esquinas corresponden al porcentaje de células positivas para anexina V. Los datos mostrados son representativos de cinco experimentos independientes.

C: La interacción de BT3 aumenta la expresión de moléculas coestimulantes en la superficie de los monocitos. D: La interacción de BT3 aumenta la expresión de moléculas coestimulantes en la superficie de las CDi.

Figura 2: Regulación de la fosforilación de AK Ty fosforilación de ERK en linfocitos T CD4+ activados por CD277. Linfocitos T CD4+ purificados de PBMC descongeladas de 4 donantes sanos estimulados o no con dynabeads epoxi recubiertas con anticuerpos (1 pg/ml de anti-CD3 más diversas concentraciones de clon 20.1 anti-CD277 o IgG1 (control de isotipo). Cada 2, 5, 1o y 30 minutos, la fosforilación intracelular de AKT y B, ERK en linfocitos T CD4+ se mide mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de cuatro estudios independientes. Los resultados se representan como IFM (expresión de intensidad de fluorescencia media) en linfocitos T CD4+ en diferentes puntos temporales después de los tratamientos durante 2-30 minutos.

Figura 3: CD277 es una molécula coestimulante de linfocitos T CD4+

Los linfocitos T CD4+ se purificaron a partir de PBMC de 4 donantes sanos. Los linfocitos T CD4+ purificados se estimularon con dynabeads epoxi recubiertas con anticuerpos (1 pg/ml de anti-CD3 y 2 pg/ml de anti-CD28 más diversas concentraciones de anti-CD277 (20.1) o IgG1 (control de isotipo). Los sobrenadantes se recogieron el día 2 de cultivo para ensayo de citocinas mediante ELISA. Ensayo de producción de INFg, IL-2 e IL-10.

Figura 4: Expresión de CD277 en los ganglios linfáticos

Perfiles de expresión de CD277 y PD1 en órganos linfoides. Los linfocitos T vivos del tejido linfoide se distinguen por la tinción anti-CD14 (células negativas para CD14) y de forma vivida. Los linfocitos T auxiliares foliculares se seleccionaron adicionalmente usando tinción con mAb CD4, ICOS y CXCR5. Los resultados se presentan por IFM (intensidad de fluorescencia media). Los datos son representativos de 7 estudios independientes. Los valores de p se calcularon usando la prueba emparejada de Mann-Witney para comparar las diferencias entre las expresiones de CD277 o PD1 en subconjuntos de linfocitos T.

* p < 0,05; ** 0,001 < p < 0,01; *** p < 0,001. p > 0,05 no se muestra.

Figura 5: El mAb 20.1 anti-CD277 estimula la expansión de los linfocitos T Vy9V52

A: expansión ex vivo (15 días+IL-2): Las PBMC se estimularon con mAb 20.1 e IL-2 y los linfocitos T Vy9V52 se supervisaron mediante tinción con mAb específico de linfocitos T Vy9V52.

B: Ensayo CFSE (4 días+IL-2): Las PBMC se estimularon mediante mAb 20.1 e IL-2 y se supervisó la proliferación de linfocitos T Vy9V52 mediante análisis de CFSE.

Figura 6: Los mAb CD277 activador (20.1) e inhibidor (103.2) que regulan los linfocitos T Vy9V52 se supervisaron mediante tinción con mAb específico de las células Vy9V52.

A: El mAb CD77 antagonista 103.2 inhibe la activación mediada por fosfoantígeno de Vy9V52

B: El mAb CD77 antagonista 103.2 no inhibe la activación de mediada por CD3 de Vy9V52 C: El mAb BTN3 103.2 inhibe la activación inducida por fosfoantígeno de linfocitos T Jurkat TCR Vy9/V52 según se determina mediante la expresión de CD69.

Figura 7: CD277 potencia la citólisis antitumoral mediada por linfocitos T Vy9V52 Las líneas de células tumorales se incubaron con Vy9V52 con o sin mAb agonista de 20.1. La activación de Vy9V52 se evaluó mediante desgranulación de CD107a/b.

EJEMPLO 1

Materiales y métodos

Cultivos celulares

Se obtuvieron muestras de sangre de 5 voluntarios sanos inscritos entre los miembros del personal, después del consentimiento informado. Los monocitos se separaron de las células mononucleares de sangre periférica y se aislaron usando el equipo de aislamiento de CD14 MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, Estados Unidos). Los monocitos se cultivaron durante 5 días con 200 ng/ml de GM-CSF humano recombinante y 10 ng/ml de IL-4 humana recombinante (Schering-Plough Research Institute). Estas células se denominaron células dendríticas inmaduras (CDi). Para lograr la estimulación, se cultivaron monocitos y CDi con 10 ng/ml de LPS, ligando para TLR4, 30 pg/ml de R848 (Sigma-Aldrich, Milán, Italia), ligando para TLR7/8 y con 2,5 mg/ml de poli (I:C) (Sigma-Aldrich), ligando para TLR3, y se recogieron después de 48 h. Las células se cultivaron en RPMI 1640 complementado con FCS termoinactivado al 10 %, L-glutamina 5 mM y 50 Ul/ml de penicilina-estreptomicina (de aquí en adelante denominado medio completo).

Citometría de flujo y anticuerpos

Los monocitos y las CDi antes y después de la estimulación se analizaron mediante citometría de flujo de inmunofluorescencia (FAC-Scalibur Becton Dickinson, Milán, Italia) para verificar su estado de activación. Para este fin, se seleccionaron previamente mAb específico para CD80, CD86, HLA-DR, CD1a, CD14 (BD Becton Dickinson), BT3 (clon 20.1, IgG1) y Fab² BT3, se purificaron y se caracterizaron (Bensussan y Olive, 2005, Compte et al., 2004) o se usaron moléculas irrelevantes (anti-CD19, Becton Dickinson, y clon Moon-1, anti-CD31, proporcionado por F. Malavasi, ambos IgG1). Todos los mAb anti-BT3 disponibles son incapaces de diferenciar entre los tres miembros de esta familia (BT3.1, BT3.2 o BT3.3), probablemente debido a su alta homología de secuencia (Compte et al., 2004, Bensussan y Olive, 2005). Como control adicional, para bloquear el posible efecto de trazas de endotoxina, se añadió polimixina B (10 pg/ml, Sigma-Aldrich) al mAb 20.1 anti-BT3 antes de añadir las células.

Como control de carga para análisis de transferencia de Western, se usó mAb anti-tubulina (clon: 6-11B-1, IgG1, Invitrogen, Milán, Italia).

Detección de apoptosis

Se cultivaron monocitos y CDi en plástico recubierto con mAb anti-BT3 (clon 20.1) o con mAb irrelevante de isotipo coincidente. Como control, las células se estimularon con GM-CSF humano recombinante 20 ng/ml (Schering-Plough Research Institute). Después de tres días, las células se recogieron, se tiñeron con anexina V-FITC (Bender MedSystems, Viena, Austria) y se analizaron mediante citometría de flujo.

RT-PCR cuantitativa

Se realizó análisis de qRT-PCR con el sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT de Applied Biosystems usando detección Taqman. En resumen, el ARN total se aisló de células THP-1 usando el protocolo de reactivo de TRIzol convencional (Invitrogen Life Technologies). Se sometieron a transcripción inversa 2 pg del ARN obtenido usando oligo(dT). Cada ensayo de PCR se realizó en una reacción de 25 pl que contenía reactivo de mezcla universal TaqMan 2x (Applied Biosystems), cebadores 20X y 2 pl de ADNc (equivalente a 40 ng de ARN total). Las condiciones de termociclado fueron 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s (40 ciclos). La captura de fluorescencia se registró en el explorador ABI Prism 7900HT y se calculó el Ct (ciclo umbral) para cada ensayo (programa del sistema de detección de secuencias 2.3, Applied Biosystems). Los datos se normalizan usando GAPDh como control endógeno (ACt = Ctgen diana - CtGAPDH). Un ACt mayor corresponde a una menor expresión del gen analizado. BT3.1, BT3.2, BT3.3 y los ensayos de expresión génica de GAPDH TaqMan se adquirieron de Applied Biosystems.

Análisis estadísticos

El análisis estadístico se realizó con el programa informático GraphPad Prism4 4.0 (GraphPad Software Inc., CA, Estados Unidos) usando la prueba de la t de Student. Para la evaluación de la producción de citocinas, los datos se analizaron con análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Para la evaluación de la inducción de la apoptosis, los datos se analizaron con una prueba no paramétrica. El nivel de significación se estableció a P < 0,05.

Resultados

Los receptores BT3 se expresan de forma constitutiva en la superficie de los monocitos y las CDi.

Para investigar la expresión de BT3, se eligió un panel de donantes sanos para obtener monocitos y CDi. La expresión de BT3 se evaluó en monocitos recién aislados y CDi usando mAb anti-BT3 del clon 20.1 (figura 1A). La figura 1A muestra la expresión de BT3 en monocitos recién aislados y CDi usando mAb anti-BT3 del clon 20.1. La diferenciación de monocitos en CD se verificó mediante la expresión de marcadores de superficie celular: CD14 se reguló negativamente y permaneció bajo en CD tanto inmaduras como maduras, mientras que CD1a y HLA-DR se regularon positivamente (datos no mostrados). El experimento mostrado es representativo de cinco en donantes diferentes. El nivel de expresión de BT3 fue ligeramente superior en los monocitos. Además, se analizó la expresión de BT3 tras la estimulación de estas células con LPS, poli (I:C) y R848, ligandos para TLR4, TLR3 y TLR7/8, respectivamente. La activación a través de TLR (receptores de tipo Toll) no alteró significativamente la expresión de BT3 en la superficie celular (datos no mostrados). Se puede deducir que los receptores BT3 se expresan de forma constitutiva en la superficie de los monocitos y CDi, independientemente de su estado de activación.

Finalmente, el análisis de qRT-PCR confirmó los resultados inmunofenotípicos que muestran que los tres receptores de la familia BT3 son expresados por células THP-1. De manera detallada, se encontró que BT3.2 era el más representado (diez veces más BT3.2 que BT3.1 y BT3.3) (datos no mostrados).

El ligamiento de BT3 proporciona una señal de supervivencia para monocitos y CDi en cultivo.

Ya que BT3 es una familia de receptores expresados de forma estable, se investigó la capacidad de la interacción de BT3 para modificar la vida útil de monocitos y CDi ex vivo cultivados en ausencia de factores de supervivencia (es decir, medio completo con suero) durante 72 horas. Se utilizó estimulación celular mediante mAb recubierto de plástico para activar BT3 en la superficie de monocitos y CDi. Aproximadamente el 77,98 % de los monocitos tratados con el mAb específico para BT3 sobrevivieron en ausencia de factores de supervivencia endógenos durante 3 días (intervalo 51,13-77,98 %, p = 0,0040) (figura 1B, fila superior, muestra un experimento representativo de cinco). Este efecto fue ligeramente inferior al obtenido mediante el tratamiento con GM-CSF (81,22 %, intervalo 60,41-83 %, p = 0,0278). En cultivos de control, es decir, en presencia de mAb irrelevante recubierto de plástico (mAb anti-CD19), el efecto de supervivencia fue mínimo y se observó una proporción muy alta de monocitos apoptóticos (células positivas para Anexina V) (aproximadamente el 95,48 % de las células apoptóticas se midió en medio solo y aproximadamente el 88,79 % en estado de mAb irrelevante recubierto de plástico, intervalo de supervivencia 0,8-11,74 % y 1,08-11,21 % respectivamente, p N.S.). Se obtuvieron resultados similares al analizar el efecto sobre la supervivencia de CDi (figura 1B, fila inferior, muestra un experimento representativo de cinco). La activación de CDi a través de BT3 pudo inhibir parcialmente la apoptosis de CDi durante un periodo de cultivo de 72 h (56,75 % de células vitales sanas frente a 85,97 % en el tratamiento de supervivencia con GM-CSF, intervalo 53,13-60,71 %, p = 0,00044 y 71,01-85,97 %, p = 0,0040, respectivamente). El mAb de isotipo coincidente irrelevante no alteró la apoptosis de origen natural de CD (si se compara el medio solo y el estado del mAb anti-CD19 de un experimento representativo de cinco, intervalo 0,8­ 24,12 % y 0,9-26,97 % de células supervivientes respectivamente, p = 0,3452). En conjunto, estos resultados sugieren que los receptores BT3 pueden promover la supervivencia de los monocitos y las CDi y extender la duración de las respuestas de las células atenuando la apoptosis. Para ambos tipos celulares, las diferencias de supervivencia después de mAb anti-BT3 frente a mAb de isotipo coincidente de control fueron estadísticamente significativas (como para el tratamiento con GM-CSF). Además, resulta evidente un efecto de respuesta a la dosis del mAb anti-BT3 sobre la supervivencia tanto de monocitos como de CDi (datos no mostrados). La dilución más baja de mAb anti-BT3 capaz de promover una buena capacidad de supervivencia fue de 10 pg/ml.

La interacción de BT3 aumenta la expresión de moléculas coestimulantes en la superficie de los monocitos y las CDi.

Para investigar la función de BT3 en las respuestas inflamatorias primarias, los monocitos de sangre recién aislados y células dendríticas procedentes de monocitos se estimularon mediante mAb, aplicados sobre placas de cultivo tisular, o mediante ligandos de TLR que se sabe que estimulan los monocitos y las células dendríticas (LPS). Después de 24 horas de estimulación, el mAb anti-BT3 aplicado fue capaz de desencadenar la activación de monocitos, como se muestra por la regulación positiva de la molécula coestimulante de la superficie celular CD86 (figura 1C). El mAb de control de isotipo coincidente (cuyo antígeno no se expresa en estas células), no tuvo ningún efecto significativo. Por tanto, la activación observada usando mAb anti-BT3.1 fue específica y no se debió a la interacción de FcR. Fue necesaria reticulación para la activación celular, debido a que no se observó ningún efecto con mAb anti-BT3 no recubierto (soluble) (datos no mostrados). Además, el efecto activador del mAb anti-BT3 se mantuvo en presencia de polimixina B, excluyendo de este modo la función de las trazas de endotoxinas.

Resulta interesante que la regulación positiva de CD86 tras la estimulación de BT3 fue similar a la observada con el ligando de TLR LPS. La estimulación de BT3 también desencadenó una regulación positiva en la superficie de los monocitos de las moléculas CD80 y HLA-DR (figura 1C). Consecuentemente, se encontró mayor expresión de CD80, CD86 y HLA-DR en CDi (figura 1D). Además, se obtuvieron resultados similares usando mAb Fab anti-BT3 (como se puede representar en las figuras 1C y 1D en monocitos y CD respectivamente). Estos resultados permiten descartar que una señal a través de FcR no pueda ser responsable de la activación de las células. El mAb irrelevante (anti-CD19) fue un control negativo, mientras que la estimulación a través del ligando de TLR4 para LPS fue un control positivo.

EJEMPLO 2

Materiales y métodos

Preparación de las células

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes voluntarios sanos proporcionados por el "Etablissement Frangais du Sang" (EFS-Marsella-Francia) y se aislaron por fraccionamiento sobre un gradiente de densidad de Lymphoprep© (Abcys). Se seleccionaron de forma negativa linfocitos T CD4+ de PBMC aisladas mediante el agotamiento de linfocitos T distintos de CD4+ con perlas magnéticas usando el equipo de aislamiento de linfocitos T II de Miltenyi Biotec®. Se usaron células CD4 aisladas para experimentos adicionales cuando la pureza era superior al 90 %.

Generación de anticuerpos monoclonales (mAb)

El mAB de ratón anti-muerte programada-1 (PD-1) humana y tres clones diferentes del de ratón anti-CD277 humano se purificaron a partir de ascitis en el laboratorio de los inventores: anti-PD-1 (clon PD1 3.1 con isotipo IgG1) (ghiotto et al. Int Immunol., 2010), anti-CD277 (clon 103.2 con isotipo IgG2a, clones 20.1 y 7.2 ambos con isotipo IgG1) (compte et al.). El mAb anti-CD277 (clon 20.1) se marcó con Alexa Fluor 647 usando un equipo comercial (Invitrogen, Eugene, OR).

Perfil de expresión de CD277 en subpoblaciones de linfocitos T

Las PBMC humanas descongeladas de cuatro donantes sanos se tiñeron con 5 pl de los siguientes anticuerpos monoclonales de ratón antihumanos por millón de células: anti-CD3 conjugado con ECD, anti-CD14 conjugado con PC5, anti-CD19 conjugado con PC5 (para seleccionar células CD3+CD14' CD19') (todos de Beckman Coulter, Marsella, Francia), anti-CD4 conjugado con Pacific Blue, anti-CD8 conjugado con Alexa700 (todos de BD Pharmingen (San Diego, Estados Unidos)), anti-CD27 conjugado con APC-Alexa750 (de Caltag, Invitrogen, Estados Unidos), anti-CD45RA conjugado con PC7 (de BD Biosciences), anti-CD277 conjugado con Alexa647 (clon 20.1, elaboración propia). Se usó IgG1 conjugada con APC (Beckman Coulter) como control y se usó el equipo de tinción de células muertas fijables LIVE/DEAd para la viabilidad. Las células se incubaron durante 20 minutos a 4 °C, después se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Lonza) fijada con paraformaldehído al 2 % y se analizaron en un citómetro de flujo FACSAria (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (TreeStar, Ashland, OR).

Cinética del perfil de expresión de CD277 en linfocitos T CD4+ vírgenes

Se cultivaron linfocitos T CD4+ purificados (200 X 103 células/pocillo) de PBMC humanas descongeladas durante 96 h en RPMI 1640 FBS al 10 % en placas de 96 pocillos de fondo plano (Microtest™ 96, Becton Dickinson) con anti-CD3/CD28 humano de ratón previamente inmovilizado en placa o no (sin estimular). Se usaron anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon CD28.2, elaboración propia) a 0,3 pg/ml y 10 pg/ml respectivamente. Las células se colocaron en una atmósfera de CO² al 5 % a 37 °C en una estufa humidificada. Cada 24 h las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo cónico (Nunc™, Dinamarca) y se tiñeron con los siguientes mAb durante 30 minutos a 4 °C: 3 pl de anti-PD-1 purificado (clon PD-1 3.1, elaboración propia) (giotto et al., int immunol. 2010), lavado 3 veces en PBS-FBS 0,2 %-azida 0,02 %, después teñido con anti-ratón de cabra conjugado con PE (1/80, Beckman Coulter), lavado y teñido con 3 pl de cada uno de los siguientes mAb durante 30 minutos a 4 °C: anti-CD4 conjugado con PC7, anti-CD3 conjugado con FITC (todo de BD Biosciences) anti-CD277 conjugado con Alexa647 y 6 pl de 7-AAD (BD Biosciences) para viabilidad. Como controles se usaron IgG1 purificada o IgG1 conjugada con APC. Las muestras de células inmunoteñidas fijadas con paraformaldehído al 2 % se analizaron en un BD FACS Canto (BD Bioscience). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (TreeStar, Ashland, OR).

Expresión de CD277 en los ganglios linfáticos

Se recolectaron células extraídas de los ganglios linfáticos de 7 pacientes que habían dado su consentimiento informado. Se obtuvieron células mononucleares triturando muestras de tejido fresco en RPMI 1640 FBS al 10 %. Se realizó detección de linfocitos T auxiliares foliculares (TFh) mediante incubación durante 20 minutos a 4 °C con anti­ ICOS conjugado con PE, anti-CXCR5 biotinilado (todos de BD Biosciences), anti-CD14 conjugado con PC5, anti-CD4 conjugado con Pacífico blue (todos de Beckman Coulter) y LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit©. A continuación, las células se lavaron en PBS y se incubaron con anti-biotina-aloficocianina-Alexa Fluor 750 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 20 minutos a 4 °C. Después de teñir, cada preparación celular se lavó dos veces en PBS, se fijó con paraformaldehído al 2 % y se analizó en un citómetro de flujo FACSAria (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (TreeStar, Ashland, OR).

Perfil de expresión de CD277 en linfocitos NK

Se seleccionaron linfocitos NK vivos descongelados (células Live Dead© negativas) en función de la expresión de CD56+CD3- de PBMC humanas sanas después de 20 minutos de incubación a 4 °C con el anti-CD277-Alexa647 (clon 20.1). Las células se lavaron adicionalmente dos veces en PBS (PBS, Lonza), después se fijaron con formaldehído al 2 % y se analizaron en un citómetro de flujo FACSAria© (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (TreeStar, Ashland).

Ensayos funcionales en linfocitos T CD4+ usando mAb inmovilizados en placas

Se cultivaron linfocitos T CD4+ (200 X 103 células/pocillo) de PBMC humanas descongeladas en RPMI 1640 FBS al 10 % en placas de 96 pocillos de fondo plano (Microtest™ 96, BD) con anti-CD3 humano de ratón previamente inmovilizado en placa (clon OKT3)/CD28 (clon CD28.2) o anti-CD3/anti-CD277 (clon 20.1) o anti-CD3/control isotípico (IgG1). Se usó anti-CD3 purificado a 0,3 |jg/ml. Se usaron anti-CD28, anti-CD277 y control isotípico a 10 |jg/ml. Las células se colocaron en una atmósfera de CO² al 5 % a 37 °C en una estufa humidificada. Después de 2 días de cultivo, se midió la producción de citocinas (interleucina-2, IL-2 e interferón gamma, IFN-y) mediante ensayo ELISA según el protocolo del fabricante (OptEIA, IFN-y humano o conjunto de IL-2, BD Pharmingen). Después de 5 días, las células se tiñeron con 3 j l de anti-CD25 conjugado con PE (BD Biosciences) y 5 j l de 7-AAD durante 30 minutos a 4 °C, después se lavaron dos veces en PBS, se fijaron con paraformaldehído al 2 % y se analizaron en un BD FACS Canto (BD Bioscience). Los datos se analizaron usando el programa informático FlowJo (TreeStar, Ashland, OR).

Ensayo funcional en linfocitos T CD4+ con aAPC y mareaje de diéster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)

Los linfocitos T CD4+ humanos se purificaron mediante selección negativa de PBMC usando perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) según el protocolo del fabricante. Los linfocitos T CD4+ tenían habitualmente una pureza superior al 97 %.

Los linfocitos T CD4+ se marcaron con CFSE 0,5 jM (Invitrogen) durante 10 min a 37 °C, se lavaron y se estimularon (1,5 x 105 células/pocillo) con aAPC en una relación de 1:1 (células con respecto a perlas) compuesto por perlas magnéticas por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Falcon; BD Biosciences). Los cultivos se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 5 días y después se midió la proliferación de linfocitos T CD4+ marcados con CFSE mediante citometría de flujo (FACS Canto, Beckman Coulter).

Ensayo funcional en linfocitos NK, actividad citolítica.

Los linfocitos NK nuevos se clasificaron con el equipo de selección negativa Easy Sep® y se incubaron durante una noche en un medio completado con concentraciones subóptimas de IL-2 (100 U/ml) e IL-15 (10 ng/ml). Las funciones de los receptores de linfocitos NK se probaron en experimentos citolíticos redirigidos contra la línea celular murina de mastocitoma P815 positiva para FcyR. En resumen, las células efectoras se incubaron con células P815 previamente recubiertas durante 30 minutos con el mAb de interés (IgG1 de ratón irrelevante: 11 jg/ml, anti-NKp46: 1 jg/ml, anti-DNAM: 5 jg/ml, anti-CD277 20.1: 10 jg/m l) según una relación efector:diana (E/T) de 1:1. Se realizaron pruebas citotóxicas en ensayos de 4 horas en presencia de GolgiStop® y CD107 (a y b)-FITC soluble (ambos de BD Biosciences), posteriormente, se tiñeron los marcadores de superficie de las células (CD56-PeCy7 (Beckman Coulter, Immunotech), estas se fijaron y se permeabilizaron (Cytofix/Cytoperm®) y después se tiñeron con mAb intracelular (IFN-y (Beckman Coulter, Immunotech)). Las células finalmente se resuspendieron en PBS paraformaldehído al 2 % y se analizaron extemporáneamente en un BD FACS Canto® (BD Biosciences, San José, CA). El grado de activación de los linfocitos NK se midió en función del porcentaje de células positivas para CD107a y CD107b (desgranulación) y/o la producción de citocina inflamatoria (IFN-y).

APC artificial (aAPC)

Se recubrieron perlas magnéticas (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech) con los siguientes mAb como se describe en Serriari et al. (serriari, ji 2010): anti-CD3 (OKT3), anti-CD28 humano (CD28.2) y/o diversas concentraciones de anti-CD277 humano (CD277, 20.1) o IgG1 o anti-MHC de clase I (MHC I) (YJ4) o IgG1. Estas aAPC se recubrieron con Ab anti-CD3 subóptimo (5 %), niveles subóptimos de Ab anti-CD28 (10 %) y Ab IgG1 (CD3/CD28/IgG1), Ab anti-CD277 (CD3/CD28/CD277 IgG1) o anti-MHC de clase I (CD3/28/anti-MHC de clase I IgG1), que constituyen el 85 % restante de proteína añadida a la perla. La cantidad de proteína se mantuvo constante a 20 mg/ml mediante la adición de IgG1 de control.

ELISA para análisis de citocinas

Para determinar la producción de citocinas, se recogieron sobrenadantes sin células a las 48 h y se analizaron para determinar IL-2, IL-10 e IFN-y mediante ELISA usando equipos OptEIA (BD Pharmingen) según las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoquímica

Se realizaron inmunotinciones de CD277 en secciones congeladas totales de ganglios linfáticos reactivos como se ha descrito anteriormente (25). La dilución final para mAb CD277.20.1 fue 1/800. Se prepararon muestras de control negativo omitiendo el mAb primario.

Cribado de los diferentes transcritos de isoformas de bnt3a en PBMC de sujetos sanos

Se recogieron conjuntos de datos públicos y personales de Affymetrix U133+2 de CD8, CD4, GD y linfocitos NK purificados. Se recuperaron datos de CD8 y CD4 de los conjuntos de datos públicos de GEO (Sharp et al.) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds), mientras que los conjuntos NK y gamma delta eran personales. Se usó el promedio robusto de múltiples placas (RMA) con el algoritmo de cuantiles no paramétricos como parámetro de normalización. Se aplicó RMA a los datos brutos recopilados de las diversas series. Se realizaron normalización de cuantiles y corrección de Loess en R usando Bioconductor y paquetes asociados. El conjunto de sondas correspondiente a las tres isotermas de BTN3A se recuperó de los conjuntos de datos normalizados y los valores log correspondientes se linealizaron para la representación gráfica. Se usaron los respectivos conjuntos de sondas Affymetrix correspondientes a las isotermas de BTN3A1, BTN3A2 y BTN3A3: 201623_s_at, 213282_at, 204171_at

Estimulación, fosfoflujo y tinción con FACS

Los linfocitos T CD4+ humanos se purificaron mediante selección negativa de PBMC usando perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) según el protocolo del fabricante. Los linfocitos T CD4 tenían habitualmente una pureza superior al 97 %. Las células se incubaron durante 24 horas en RPMI 1640 FBS al 10 % a 37 °C.

Los linfocitos T CD4+ se lavaron y estimularon en diferentes momentos (2, 5, 10 y 30 minutos) con aAPC en una relación de 1:3 (células con respecto a perlas) compuesta por perlas magnéticas (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech) y se recubrieron con los siguientes mAb: anti-CD3 (OKT3), anti-CD28 humano (CD28.2) y/o diversas concentraciones de anti-CD277 humano (CD277. clon 20.1) o IgG1 de control de isotipo. Estas aAPC se recubrieron con Ab anti-CD3 subóptimo (5 %), niveles subóptimos de Ab anti-CD28 (10 %) y Ab IgG1 (CD3/CD28/IgG1), Ab anti-CD277.20.1 (CD3/CD28/CD277.20.1 IgG1), que constituyen el 85 % restante de la proteína añadida a la perla. La cantidad de proteína se mantuvo constante a 20 mg/ml mediante la adición de IgG1 de control.

Se examinó el efecto de la interacción de los clones de mAb CD277 en la fosforilación de AKT y ERK en linfocitos T CD4+ por método proteómico de fosfoflujo [27], que usa anticuerpos específicos del estado para detectar fosfoproteínas diana mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Se evaluó la actividad de las rutas de señalización después de la exposición de las células a estimulaciones de perlas. Se aplicó un método de marcaje de tipo sándwich, que implica la aplicación de un anticuerpo secundario conjugado con biotina seguido de detección con estreptavidina conjugada con fluorescencia. Se demostró la actividad de la ruta de PI3K midiendo la fosforilación de AKT en SER 473 y ERK en p44/42 MAPK T (202/y204) después de la estimulación con perlas con diferentes dosis del mAb CD277 y en cuatro momentos diferentes (2, 5, 10 y 30 minutos). Las células se permeabilizaron, se fijaron y se analizaron después de la tinción intracelular de las fosfoproteínas diana (AKT y ERK) mediante el uso de equipo de cytofix/cytoperm y tampón de perm/wash (BD Biosciences).

Se adquirieron datos de FACS en un citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences) usando el programa informático Diva. Los datos de FACS se analizaron usando el programa informático Flowjo (TreeStar, Ashland, OR).

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron usando GraphPad Prism versión 5.00 para (GraphPad, San Diego, CA) y microsoft excel (microsoft office). Se usó la prueba no paramétrica emparejada de Mann-Whitney para examinar: las variaciones de la expresión de CD277 y PD-1 del tejido linfoide en subconjuntos de linfocitos T vivos (en la figura 3), la variación de la fosforilación de AKT y ERK en linfocitos T estimulados con CD277 (en la figura 4-5) y la diferencia de secreción de citocinas en linfocitos T (en la figura 6). Las comparaciones se realizaron entre diferentes condiciones de estimulación. Se usó la prueba emparejada de Wilcoxon para comparar entre diferentes condiciones de estimulación en linfocitos NK (en la figura 7). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

Resultados

Perfil de expresión de CD277 en subpoblaciones de linfocitos T y linfocitos NK

Anteriormente los inventores habían informado de que CD277 se expresaba en linfocitos T y NK (compte et al.). Decidieron investigar su expresión en subpoblaciones conocidas de linfocitos periféricos de donantes sanos (n = 4). Usando citometría de flujo multiparamétrica, se analizaron de este modo las subpoblaciones CD3+CD4+ y CD3+CD8+ (datos no mostrados). La tinción con el anti-CD277 monoclonal (datos no mostrados) reveló una fuerte expresión de CD277 en linfocitos T CD4+ auxiliares y linfocitos T citotóxicos CD8+ (datos no mostrados). También se analizó la expresión de CD277 en las poblaciones de memoria y vírgenes de linfocitos T en función de la expresión diferencial de la expresión de CD27 y CD45RA (datos no mostrados). En este caso, de nuevo, no se detectó ninguna diferencia significativa entre los subconjuntos (datos no mostrados).

En paralelo, se supervisó la expresión de CD277 en otra población de linfocitos pertenecientes al sistema inmunitario innato, los NK (datos no mostrados). Se descubrió que el 100 % de los linfocitos NK también expresaban un nivel alto de CD277, independientemente de su fenotipo CD56Brillante (auxiliar) o CD56Oscura (citotóxico), lo que muestra que las moléculas relacionadas con la familia B7/CD28 se encuentran de manera similar en los dos subconjuntos principales de linfocitos NK.

Modulación de CD277 en linfocitos T activados y linfocitos NK

Como la expresión de moléculas de señalización conjunta de algunos linfocitos T podría regularse después de la activación del receptor de linfocitos T (TCR), como la inducción de PD1, una molécula correguladora, los inventores se preguntaron si CD277 también podría modularse con activación. Para probar esta hipótesis, se comparó el perfil de expresión de CD277 y PD1 bajo la activación de CD3/CD28 de linfocitos T CD4+.

Los linfocitos T CD4+ purificados de cuatro donantes sanos se incubaron, por tanto, de 24 a 96 horas con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD3 y CD28 o con los respectivos isotipos de control. Como se esperaba, el tratamiento con CD3/CD28 da lugar a un aumento de siete veces en la expresión de PD1 después de 72 horas de cultivo, mientras que la expresión de CD277 no se modificó en ningún momento (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares con linfocitos T CD8 (datos no mostrados).

En paralelo, los inventores se preguntaron si la expresión de CD277 podría modularse en linfocitos NK. Por tanto, estimularon los linfocitos NK con citocinas estimulantes de linfocitos NK habituales (IL-2 e IL-15). Se comparó el perfil de expresión de CD277 y HVEM. HVEM se expresa en gran medida en linfocitos NK y disminuye con la estimulación de linfocitos NK. El resultado de los inventores mostró que la expresión de CD277 no se moduló después de la activación de linfocitos NK, contrariamente a su control positivo HVEm (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados demostraron que los linfocitos T y linfocitos NK expresan de forma constitutiva CD277, pero su expresión no está modulada in vitro después de la coestimulación de linfocitos T o NK.

Perfil de expresión de CD277 en linfocitos T ^f H CD4 en los ganglios linfáticos

Se encuentran múltiples poblaciones de linfocitos T inmunitarios en los órganos linfoides donde desempeñan funciones especializadas. Entre ellos, están presentes linfocitos T auxiliares foliculares (T^fH) en los centros germinales donde desempeñan una función importante en la diferenciación de linfocitos B. Estas células expresan el receptor de quimiocinas CXCR5 y altos niveles de las moléculas de señalización conjunta ICSO, pero también PD-1 y bTlA. La expresión de CD277 podría regularse diferencialmente en los ganglios linfáticos. (Figura 4)

Las secciones congeladas totales de los ganglios linfáticos reactivos también se tiñeron inmunitariamente para CD277. Los resultados del análisis inmunohistoquímico mostraron una fuerte positividad tanto en el área de linfocitos T interfoliculares como en linfocitos B de la zona del manto, lo que indica que eran positivas en linfocitos T así como en linfocitos B. Sorprendentemente, el patrón de tinción fue totalmente diferente en el centro germinal. La mayoría de los CG fueron negativos, lo que indica que los linfocitos B perdieron la expresión de CD277 durante el proceso de diferenciación. Sin embargo, pocas células dispersas se tiñeron de forma similar a la tinción de T^fH. Los inventores confirmaron esto después de realizar un análisis de citometría de flujo. Los linfocitos T^fH (CXCR5+ICOS+ PD-1+) fueron positivos para CD277. Además, CD277 estaba igualmente presente en los linfocitos T convencionales para CXCR5, mientras que no hay tinción significativa en linfocitos B o células del Centro Germinal (CG) (datos no mostrados).

La conclusión de esta primera parte del estudio es que el CD277 se expresa en todos los subtipos de linfocitos T en la sangre periférica, así como en los ganglios linfáticos y los linfocitos NK, pero su expresión no se modula con estimulación como suele ser el caso de las moléculas de la familia B7/CD28, o cualquier otra molécula implicada en la regulación de los linfocitos.

La fosforilación de AKT y ERK aumenta después de la interacción de CD277 en linfocitos T CD4+

Para investigar la función coestimulante de CD277 en la función de los linfocitos, se buscó si la activación de CD277 era capaz de inducir la fosforilación de las dos cinasas más importantes de la ruta de señalización de los linfocitos: ERK de la proteína cinasa activada por mitógenos y la serina treonina cinasa AKT. Se sabe que la señalización de Akt y ERK desempeña una función central en las funciones de los linfocitos T, incluyendo la proliferación, síntesis de proteínas y regulación de la apoptosis.

En primer lugar, se mostró que la activación de CD277 20.1 indujo la fosforilación de AKT y ERK (figura 2), lo que demuestra que la estimulación de CD277 está implicada en la regulación de la activación de linfocitos T (los linfocitos T CD4+ purificados se estimularon con dynabeads de epoxi recubiertas con anticuerpos con mAb anti-CD3 más mAb anti-CD277.20.1)

En segundo lugar, con el fin de aclarar la implicación de CD277 como comodulador de la ruta de señalización de TCR, se estimularon linfocitos T CD4+ purificados con diversas concentraciones de mAb para el clon CD277.20.1 o control de isotipo IgG1, junto con anti-CD3 más anti-CD28 en diferentes momentos (2, 5, 10 y 30 minutos). Se observó que la reticulación de CD277 con el clon de mAb CD277.20.1 regulaba de forma fuertemente positiva la fosforilación de AKT y ERK inducida por la estimulación de CD3 CD28. Este efecto fue dependiente de la dosis y el tiempo (datos no mostrados).

En esta parte del artículo, se demostró de este modo que la activación de CD277 potencia la señal de TCR. A continuación, se decidió investigar las consecuencias funcionales de la activación de esta ruta de señalización.

CD277 coestimula señales CD3

A continuación, se investigó el efecto de la interacción de CD277 en la producción de citocinas y la regulación de los marcadores de activación mediada por señales mediadas por CD3. Se cultivaron linfocitos T CD4+ de al menos 4 donantes sanos durante 24 a 72 horas con anti-CD3/anti-CD28 o anti-CD3/anti-CD277 (clon 20.1) o anti-CD3/IgG1 (condición de control). Después de 24 horas de cultivo, la producción de IL-2 e IFN-y por linfocitos T CD4+ se midió mediante ELISA. Como se esperaba, estas dos citocinas se produjeron en gran cantidad después de la estimulación de CD3/CD28 en comparación con la condición de control (p = 0,0079, p = 0,0317, datos no mostrados). Aunque el nivel de IL-2 producido por linfocitos T CD4+ CD3/CD277 coactivados fue menor que el obtenido con la coestimulación de CD3/CD28, la cantidad de IL-2 inducida por la coactivación de CD3/CD277 fue, no obstante, significativamente mayor que la del control de IgG (p = 0,0159, datos no mostrados). Por otra parte, la secreción de IFN-y fue fuertemente mejorada por la coactivación de CD3/CD277 en comparación con la situación de control y, sorprendentemente, la producción fue incluso mayor que la obtenida después de la coactivación de CD3/CD28 (datos no mostrados). Asimismo, después de 3 días de cultivo, se obtuvo un efecto similar con respecto al perfil de expresión del marcador de activación CD25 después de la coestimulación de CD3/CD277. Esta coestimulación de linfocitos T CD4+ indujo un aumento significativo al 45 % de las células positivas activadas por CD25, mientras que la coactivación de CD3/CD28 solo indujo un aumento al 25 % de células positivas para CD25 activadas en comparación con la condición controlada (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que CD277 es una molécula coestimulante de la señal de activación de los linfocitos T.

CD277 mejora adicionalmente la coestimulación de CD3-CD28 y puede actuar como una tercera señal para mejorar la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas

A continuación, se investigaron las consecuencias de las señales conjuntas de CD277 sobre la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas inducida por señales de CD3+CD28. Se estimularon linfocitos T CD4+ purificados con diversas concentraciones de mAb para CD277, junto con anti-CD3 más anti-CD28. Se mantuvo constante la cantidad de anticuerpo en las perlas añadiendo IgG1 de control de isotipo y anti-MHC de clase I (MHC I). Se demostró que la reticulación de CD277 en linfocitos T CD4+ activó fuertemente la proliferación de linfocitos T CD4+ mediada por anti-CD3 más anti-CD28 de forma dependiente de la dosis. De hecho, se midió la proliferación de células CD4 midiendo la dilución del colorante citosólico CFSE (datos no mostrados). Se descubrió que el 60 % de las células estimuladas con anti-CD3 más anti-CD28 e IgG1 entraban en división el día 5. La reticulación de CD277 (a 17 |jg/ml) mejoró fuertemente la división de linfocitos T CD4+ ya inducida por anti-CD3 más anti-CD28 de una manera dependiente de la dosis, tal como el 90 % de las células entraron en división (datos no mostrados).

En paralelo, los resultados de los inventores también mostraron que la interacción de CD277 aumentó la proliferación (datos no mostrados) y la secreción de citocinas inducidas por la estimulación de anti-CD3 y anti-CD28 de una manera dependiente de la dosis (figura 3).

En conjunto, estos datos apoyan una función de la molécula coestimulante para CD277 incluso después de la coestimulación óptima proporcionada por CD28.

¿Es CD277 también una molécula coestimulante de linfocitos NK?

En paralelo, se investigó si se obtuvo un efecto coestimulante similar en linfocitos NK. Se estimularon de este modo dos de los receptores más importantes de los linfocitos NK (anti-NKp46 o anti-CD16), en presencia de control isotípico o anticuerpo monoclonal CD277 (20.1) o anti-DNAM (control positivo de coestimulación de los receptores de activación) o anti-NKG2A (control positivo de la inhibición conjunta de los receptores de activación). En primer lugar, el CD277 solo no tuvo ningún efecto sobre la estimulación de linfocitos NK. En segundo lugar, el mAb monoclonal 20.1 dirigido contra las moléculas de CD277 no logró potenciar ningún efecto sobre la activación de linfocitos NK como lo hicieron DNAM o NKG2A. Tanto la citotoxicidad (datos no mostrados) como la secreción de IFN-y (datos no mostrados) no se vieron afectados, si la primoestimulación se realizó con NKp46 o CD16. Este resultado fue bastante sorprendente, pero obviamente CD277 no está implicado en la regulación de la activación de linfocitos NK, contrario a lo observado con los linfocitos T.

Isoformas de Btna expresadas por linfocitos

Considerando que CD277 tiene tres isoformas btn3a1, btn3a2y btn3a3, con (btn3a1 y btn3a3) o sin (btn3a2) el dominio B30.2, los inventores decidieron observar la expresión de ARNm de cada isoforma en los linfocitos T para determinar si cada isoforma tiene un patrón de expresión equimolar. Usando los datos disponibles del ómnibus de GEO que confirmaron adicionalmente mediante Q-PCR, se descubrió que btn3a1 es la forma principal expresada por los linfocitos T mientras que la forma de señuelo (btn3a2) se expresa principalmente en linfocitos n K (datos no mostrados). Este resultado fue validado por PCR cuantitativa en 4 donantes sanos. Por tanto, los inventores emitieron la hipótesis de que la ausencia de coestimulación en respuesta a la estimulación de CD277 de linfocitos NK podría atribuirse a esta forma de BTN3A.

EJEMPLO 3

Materiales y métodos

Anticuerpos y fragmentación de Fab

Anti-CD277: se generaron y validaron mAb anti-BT3-20.1 y 103.2 como se ha descrito anteriormente [10]. Los fragmentos Fab de anti-BT3-20.1 se generaron y purificaron con el equipo de preparación de Fab Immunopure siguiendo la recomendación del fabricante (Pierce). La pureza de la proteína se evaluó mediante SDS-PAGE no reductor.

Construcción de árboles filogenéticos

Los análisis filogenéticos se realizaron usando la plataforma de anotación genómica automática FIGENIX (plataforma de anotación FIGENIX: [http://figenix2.up.univmrs.fr/Figenix/index.jsp]) para recuperar secuencias y alineamientos y realizar la reconstrucción filogenética. El proceso usado aplicó tres métodos diferentes de reconstrucción de árboles filogenéticos, es decir, máxima parsimonia [38], máxima probabilidad [39] y unión de vecinos [40], y se construyó un árbol de consenso enraizado en el punto medio. Se llevó a cabo muestreo con reposición con 1000 repeticiones. Se indican los valores de muestreo con reposición para cada método (para obtener una descripción detallada de los procesos y los modelos usados, véase [41].

Líneas celulares y expansión de linfocitos T y5

Se cultivaron P815 (línea celular de mastocitoma de ratón), K562 (línea celular de leucemia mieloide crónica), Raji y Daudi (líneas celulares de linfoma de Burkitt) en medio RPMI 1640 (Invitrogen) y suero de ternero fetal al 10 % (FCS) (Eurobio). Las PBMC de donantes sanos se distribuyeron a 106/ml en placas de cultivo de 24 pocillos a 37 °C en CO2 al 5 % en medio RPMI 1640 y FCS al 10 %. Los linfocitos T policlonales Vy9V82 se expandieron específicamente con 3 pmol/l de Phosphostim (molécula de BrHPP, Innate Pharma, Marsella, Francia) y 100 U/ml de IL-2 (Chiron, Basilea, Suiza) durante 12 días. Se añadió Phosphostim una vez al inicio del cultivo. Cada 2 días, la mitad del volumen del medio de cultivo se reemplazó con medio nuevo que contenía 100 U/ml de IL-2.

El último día, se evaluó el porcentaje de linfocitos T y§ usando anti-Vd2 FITC y anti-CD3-Cy7. Solo se seleccionaron cultivos de células que alcanzaron más del 90 % de linfocitos T y§, para usar en pruebas funcionales.

Citometría de flujo

Se usaron para el marcaje de linfocitos T y§ en la prueba de pureza después de la expansión, mAb anti-CD3 PE-Cy7 y anti-V82 FITC (BD Pharmingen). Para la caracterización de CD277 en diferentes subconjuntos, se incubaron PBMC con los siguientes anticuerpos y moléculas: anti-CD3 PE-Cy5 (BD Pharmingen), anti-CD4 PB (BD Pharmingen), anti-CD8 PB (BD Pharmingen), anti-V82 FITC (BD Pharmingen), anti-CD27 APC-Alexa Fluor 750 (CALTAG Laboratory), anti-CCR7 PECy7 (BD Pharmingen), anti-CD28 PE (Beckman Coulter), anti-CD45RA ECD (Beckman Coulter), equipo de tinción de células muertas fijable LIVE/DEAD® (L34957, Invitrogen) y anti-CD277 marcado con Alexa Fluor 647 (equipo de marcaje de proteínas Alexa Fluor 647, Molecular Probes, Invitrogen). Para el análisis de la expresión de CD107a y CD107b, se incubaron conjuntamente linfocitos T y§ y células diana a 37 °C con FITC anti-CD107a y FITC anti-CD107b en presencia de monensina (10 pM, GoligiStop, b D Bioscience). Las células se recogieron y lavaron con PBS, 4 horas después de la incubación. Los linfocitos T y§ se marcaron con mAb anti-pan y§ TCR PE y anti-CD3 PECy7 (BD Pharmingen). Todas las muestras se midieron en citómetros de flujo FACSCanto o FACSAria (BD Biosciences) usando el programa informático FACSDiva. Los análisis se realizaron con el programa informático FlowJo (Tree Star).

Material complementario:

Se realizó tinción intracelular según lo recomendado por el equipo Fix and Perm BD Pharmingen (BD Biosciences). Se sembraron 100 pl de linfocitos T y§ a 2,106 células/ml en placas de 96 pocillos. Se incubaron en presencia o no de BrHPP a 3 pM y con anti-CD277 o isotipos de control a 10 pg/ml, durante 30 min a 4 °C. Las células se estimularon en diferentes momentos a 37 °C. La estimulación se detuvo añadiendo 100 pl de solución de Cytofix/Cytoper a 37 °C durante 10 min. Las proteínas fosforiladas intracelulares se tiñeron con anticuerpos de conejo monoclonales purificados: anti-pZap 70, anti-pAKT y anti-pErk de Cell Signaling Technology (Danvers, Estados Unidos); se marcaron con F(ab')2 de burro anti-Conejo conjugado con Biotina-SP (Jackson); y se revelaron con estreptavindina-PE (Beckman Coulter).

Ensayo de estimulación y expansión

Las PBMC se sembraron en placas y se estimularon como se describe en el párrafo: líneas celulares y expansión de linfocitos T y6, excepto que las células se estimularon con mAb anti-CD277 (10 pg/ml); o isotipos de control (10 pg/ml); y con o sin BrHPP a diferentes concentraciones. Los cultivos se detuvieron 9 días después. Los porcentajes de Vy9V82 se midieron el primer día y el último día de cultivo como se ha descrito anteriormente. Los efectores de linfocitos T y§ expandidos se estimularon con o sin diferentes dosis de BrHPP añadidas en mAb anti-CD277 a 10 pg/ml; o con OKT3 (4 ng/ml) asociado con mAb anti-BT3 19.5 en diferentes concentraciones. La activación de la desgranulación se midió mediante el ensayo de marcaje de CD107 como se ha descrito anteriormente.

Ensayo de activación redirigido

Se incubaron 2.105 células de mastocitoma de ratón P815 durante 30 min, con isotipos de control de ratón o mAb anti-CD277 (10 pg/ml) y/o con anti-CD3 (OKT3, 4 ng/ml). Después del lavado, se incubaron P815 durante 4 h a 37 °C, con linfocitos T efectores Vy9V52 expandidos a la misma concentración. Se realizó un ensayo de desgranulación de CD107a basado en flujo como se ha descrito anteriormente.

ELISA

Los sobrenadantes del ensayo de activación redirigida se recogieron después de un cultivo conjunto de 4 h. La liberación de IFNy, TNFa e IL-17 se probó mediante equipos de ELISA (equipos OptEIA de BD Pharmingen para IFNy y TNFa. Las citocinas se detectaron con el lector de placas Multiskan r C (Labsystems). Las concentraciones de citocinas se determinaron a partir de curvas patrón establecidas con patrones recombinantes.

Análisis de las respuestas de linfocitos T Vy9 V52 mediante un ensayo de citotoxicidad directa:

Las células diana se marcaron con 20 |jCi de 51Cr (PerkinElmer) durante 1 h a 37 °C. Después de lavar, las células diana se incubaron con linfocitos T efectores Vy9V52 durante 4 h a 37 °C en una relación diferente. Las incubaciones se realizaron en presencia de mAb o fragmentos Fab de control de isotipo o específicos. Se midió la radiactividad liberada por las células diana, 4 h más tarde, en el contador de placas beta. El porcentaje de lisis específica de 51Cr se calculó usando la siguiente ecuación:

porcentaje de lisis específica = 100 x [(liberación de prueba) - (liberación espontánea)]/[(liberación máxima) -(liberación espontánea)].

Análisis estadístico:

Programa informático StatXact (versión 8 PC) producido por Cytel, se usó para todos los análisis estadísticos. Los valores de significación para las comparaciones entre grupos se determinaron mediante el análisis no paramétrico de Mann y Whitney. Suponiendo una varianza desigual con niveles de confianza al 95 % y valores de p <0,05, se consideraron significativos.

Skint-1 y CD277 pertenecen a la misma superfamilia que B7

Usando la secuencia del dominio proteico de IgV Skint-1 en NCBI pBlast, se buscaron similitudes entre Skint-1 y otras proteínas humanas en bases de datos. Los alineamientos de secuencias obtenidos muestran que Skint-1 es relativamente similar a CD277 con un 38 % de identidad (datos no mostrados). Para aclarar las relaciones entre estas familias Skint y Btn, se realizó un análisis filogenético basado en sus secuencias de IgV, usando la plataforma de anotación genómica automática Figenix.

La filogenia muestra que Skint-1 y CD277 forman un grupo monofilogenético con genes o familia de genes implicados en la regulación de la respuesta inmunitaria: BTN 1 a 3, BTNL2 ERMAP; B-G y MOG (datos no mostrados). Este grupo también incluye CD80 y CD86 de la familia B7, igualmente conocido por su participación en la regulación de la respuesta inmunitaria. Cada grupo forma una subfamilia.

Cuando los inventores se centraron en la subfamilia Skint (datos no mostrados), el análisis filogenético basado en la secuencia completa de Skint-1 demuestra al menos ocho genes parálogos en roedores, incluyendo cinco en ratones, en marcado contraste con los primates donde solo hay una copia. Este resultado sugiere una función importante de la familia de skint en los roedores. Se realizó el mismo análisis usando la secuencia CD277 (datos no mostrados). Los inventores muestran que CD277 y su segunda isoforma: BTN3-A3, tienen un antecesor común en la ramificación entre el caballo y los primates. Curiosamente, estas dos isoformas están presentes en primates pero están ausentes en roedores.

El gen Skint-1 humano es un pseudogén probable, ya que hay dos codones de terminación dentro de su secuencia. El primer codón de terminación se ubica inmediatamente cadena abajo del péptido señal, al comienzo de la secuencia de IgV y el segundo cadena abajo del primer dominio transmembrana [7]. Es poco probable que se deba a errores de secuenciación porque se encontraron las mismas mutaciones en la secuencia de ADN de Pongo abelii. Estos datos indicaron que los genes Skint no eran necesarios para las especies de primates y sugirieron que su función podría ser realizada por otros genes.

De manera recíproca, el gen CD277 estaba ausente en Ratus norvegicus y en la secuencia de ADN de Mus musculus usando NCBI ntBlast. De hecho, dentro de las familias BTN, solo la secuencia de BTN2 estaba presente en estas dos especies. Estos resultados indicaron que el CD277 realmente desapareció en los roedores y, en consecuencia, no era necesario para la supervivencia de estas especies. Esto sugiere que otro gen u otros genes han asumido la función de CD277.

Tanto las redundancias funcionales en roedores como los antepasados comunes de primates podrían estar, por un lado, en el origen de la desaparición de CD277 en roedores y, por otro lado, de Skint-1 en primates.

En resumen, ambas moléculas tienen similitudes en su región extracelular dentro de los dominios tanto IgV como IgC, pero se diferencian por el número de dominios transmembrana y sobre todo por su región intracitoplasmática (datos no mostrados). De hecho, CD277 tiene solo un dominio transmembrana en lugar de tres para Skint-1. Asimismo, en su región intracitoplasmática, CD277 tiene un dominio B30.2. Este dominio está ausente en Skint-1.

CD277 se expresa en linfocitos T Vy9V52 y no se modula por su diferenciación

Anteriormente los inventores habían demostrado que CD277 se expresaba en linfocitos T convencionales, lo que sugiere una función de CD277 en la regulación de la respuesta de linfocitos T.

Probaron la expresión de CD277 en linfocitos T y§, así como sus subpoblaciones descritas correspondientes a sus diferentes etapas de diferenciación a partir del compartimento sin exposición previa. Por lo tanto, usando citometría de flujo de 8 colores, se determinaron 4 subpoblaciones principales: células vírgenes (CD45RA+/CD27+); células de memoria central (CD45RA-/CD27+); efectores de memoria (CD45RA-/CD27-/CCR7-) y efectores de memoria RA+ (CD45RA+/CD27-/CCR7-).

También se evaluó CD28 que diferenciaba dos subconjuntos entre N, CM, EM así como linfocitos T EMRA+ gd. Su función no está clara aunque en los linfocitos T ap se asocia a funciones CTL.

El 95 % de los linfocitos T Vy9V52 expresan CD277 con una intensidad de fluorescencia media mayor que los linfocitos T ap, lo que sugiere una función importante en la homeostasis de linfocitos T y§. Curiosamente, en toda la subpoblación Vy9V52, todas las células expresan CD277. Su nivel de expresión es aproximadamente el mismo en las subpoblaciones de linfocitos T y^ analizadas. El único aumento leve se encontró en la virgen CD45RA+/CD27+/CD28+/CCR7+, pero esta variación no fue significativa en la serie si se evaluó a voluntarios sanos.

Estos resultados indican que CD277 no está modulado en la diferenciación de linfocitos T Vy9V82 y sugieren una función potencial en las diferentes etapas de la activación de linfocitos T Vy9V82.

El mAb 20.1 anti-CD277 induce la proliferación de linfocitos T Vy9V52 mientras que 103.2 inhibe la estimulación mediada por la estimulación óptima de TCR por fosfoantígenos.

Para investigar la función de CD277 en linfocitos T y§, se usaron mAb dirigidos contra CD277. En un primer escenario, se probó si la activación de CD277 podría afectar a la estimulación de los linfocitos T y§ mediante dosis óptimas del fosfoantígeno BrHPP. Se cultivaron PBMC con IL-2 (100 U/ml) y BrHPP (3000 nM).

Después de 15 días de cultivo, los linfocitos T Vy9V82 se expandieron (figura 5A) tras la adición de mAb 20.1 anti-CD277. Este efecto se asoció con la proliferación de las células Vy9V82 como lo demuestra el análisis de células marcadas con CFSE (figura 5B). Este resultado sugiere una función estimulante de CD277 20.1 en la activación de linfocitos T Vy9V52.

A continuación se probó la función del mAb 103.2 de CD277 sobre la activación mediada por fosfoantígeno de las células Vy9V52. El mAb 103. inhibió completamente la activación de linfocitos T Vy9V82 mediada por fosfoantígenos sin CD3mAb (figura 6A y 6B). Se demostraron efectos similares en células Jurkat que expresaban Vy9V82TcR

CD277 modula la desgranulación en linfocitos T Vy9V52 mediada por el complejo TcR

Estos datos llevaron a los inventores a probar si la función de CD277 podría detectarse en otras funciones de los linfocitos T y6, tales como la producción de citocinas, citotoxicidad y desgranulación.

Estimularon los linfocitos T y§ mediante fosfoantígenos y probaron las funciones efectoras de las células expandidas. En primer lugar se usó la modulación de la expresión de CD107 como un indicador de la desgranulación. Esta prueba corresponde en parte a la capacidad de las células para inducir su función citolítica. En este experimento, se midió el efecto de la interacción de CD277 con dosis subóptimas (0,06 nM) u óptimas (4000 nM) del fosfoantígeno BrHPP. El aumento de dosis de BrHPP induce un aumento de la expresión de CD107 hasta en un 40 %. Usando una dosis baja de BrHPP incapaz de inducir la expresión de CD107, la adición de anti-CD277 aumentó la expresión de CD107 hasta (20 %). Sin embargo, con altas dosis de BrHPP, anti-CD277 inhibió la expresión de CD107 inducida por BrHPP que disminuyó del 40 % al 20 %. Se probó otro sistema de estimulación de linfocitos T y§ usando mAb inmovilizados anti-CD3 y anti-CD277. La estimulación de CD277 sola indujo la expresión de CD107 (30 %). El mAb CD3 indujo una expresión de CD107 dependiente de la dosis que alcanzó una meseta a 50 ng/ml en esta situación.

A continuación, se probó la expresión de CD107 usando una dosis constante de mAb CD277 con una concentración creciente de mAb CD3. La expresión de CD107 aumentó cuando se combinó CD277 con dosis crecientes de anti-CD3 hasta 10 ng/ml. Sin embargo, a dosis mayores de mAb CD3, la expresión de CD107 disminuyó de manera dependiente de la dosis.

En conjunto, estos datos demuestran que CD277 modula la capacidad de los linfocitos T y§ para expresar CD107 y, por lo tanto, para desgranular tras la estimulación con fosfoantígeno o anti-CD3. El efecto de CD277 es bifásico: potenciar a niveles bajos de estimulación y disminuir a niveles mayores de reticulación de TCR la actividad de desgranulación de linfocitos T y§.

La reticulación de CD277 desencadena la desgranulación junto con la liberación de INFy y TNFa.

A continuación, se realizó la estimulación redirigida de linfocitos T Vy9V52 expandidos usando mAb CD277. El anti-CD277 solo induce la expresión de CD107 después de 4 horas de estimulación de una manera dependiente de la dosis (10 % <30 %). La activación óptima se obtiene con una dosis de 10 pg/ml de anti-CD277 mientras que la DI50 del mAb para su diana es de 3 pg/ml (datos no mostrados).

Por otra parte, la interacción de CD227 indujo la liberación robusta de IFNy y TNFa que se detectó tan pronto como a las 4 horas de estimulación. De este modo, la desgranulación inducida por CD277 viene acompañada de citocinas Th1. Esta desgranulación y citocinas liberan resultados de inducción de la estimulación de CD277 por reticulación anti-CD277 sin la necesidad de interacción de TCR.

CD277 potencia la citólisis antitumoral mediada por linfocitos T Vy9V52.

Finalmente, se probó si CD277 podría estar implicado en la función antitumoral de la activación de linfocitos T Vy9V82. Para verificar esta hipótesis, se usó mAb anti-CD277 y fragmentos Fab anti-CD277 en un ensayo de citotoxicidad contra diversas líneas de células tumorales, incluyendo líneas celulares Daudi, K562 o Raji.

El Mab 20.1 potenció o reveló la función de los linfocitos T Vy9V82 contra las dianas según lo determinado por el ensayo de desgranulación de CD107a/b (figura 7). Por el contrario, el mAb 103.2 impidió la activación de linfocitos T Vy9V52 en el mismo entorno experimental (datos no mostrados).

Estos resultados muestran que los mAb CD277 potencian o inhiben la citólisis antitumoral mediada por linfocitos T Vy9V52 que responden.

REFERENCIAS

Arnett, H. A., Escobar, S. S., González-Suárez, E., Budelsky, A. L., Steffen, L. A., Boiani, N., Zhang, M., Siu, G., Brewer, A. W. y Viney, J. L. 2007. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J. Immunol. 178: 1523-1533.

Bensussan, A., Olive, D. 2005. T-cell: section report. Cellular Immunol. 236: 3-5.

Carreno, B. M. y Collins, M. 2002. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulation and inhibition of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 20: 29-53.

Chambers, C.A., Kuhns, M. S., Egen, J. G. y Allison, J.P. 2001. CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T cells responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy. Annu. Rev. Immunol. 19: 565-594.

Chapoval, A. I., Ni, J., Lau, J. S., Wilcox, R. A., Flies, D. B., Liu, D., Dong, H., Sica, G. L., Zhu, G., Tamada, K. y Chen, L. 2001. B7-H3: a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production. Nat. Immunol. 2: 269-274.

Compte, E., Pontarotti, P., Collette, Y., López, M. y Olive, D. 2004. Characterization of BT3 molecules belong to the B7 family espressed on immune cells. Eur. J. Immunol. 34: 2089-2099.

Coyle, A. J. y Gutiérrez-Ramos, J. C. 2001. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function. Nat. Immunol. 2: 203-209.

Dong, H., Zhu, G., Tamada, K. y Chen, L. 1999. B7-H1, a third member of B7 family, co-stimulates T cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5: 1365-1369.

Durum, S.K., Schmidt, J. A. y Oppenheim, J. J. 1985. Inteleukin 1: an immunological Perspective. Annu. Rev. Immunol. 3: 263-287.

Eisenberg, S.P., Evans, R. J., Arend, W. P., Verderber, E., Brewer, M. T., Hannun, C. H., Thompson, R.C. 1990. Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist. Nature. 343: 341-346.

Freeman, G. J., Long, A. J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L. J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne M. C., Horton, H.F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M., Collins, M., Wood, C.R. y Honjo, T. 2000. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med. 192: 1027-1034.

Fulton, S. A., Johnsen, J. M., Wolf, S. F., Sieburth, D. S. y Boom, W. H. 1996. Interleukin-12 production by human monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis: role of phagocytosis. Infect. Immun. 64: 2523-2531.

Grob, P. M., David, E., Warren, T. C., De León, R. P., Farina, P. R. y Homon, C. A. 1990. Characterization of a receptor for human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor/interleukin-8. J.Biol. Chem. 265: 8311-8316. Henry, J., Mather, I. H., McDermott, M. F. y Pontarotti, P. 1998. B30.2-like domain proteins: update and new insights into a rapidly expanding family of proteins. Mol. Biol. Evol.15:1696-1705.

Henry, J., Miller, M. y Pontarotti, P. 1999. Structure and evolution of the extended B7 family. Immunol. Today. 20: 285-288.

Hutloff, A., Dittrich, A. M., Beier, K. C., Eliaschewitsch, B., Kraft, R., Anagnostopoulos, I. y Kroczek, R. A. 1999. ICOS is an inducible T cell co-stimulator structurally and functionally related to c D28. Nature. 397: 263-266.

June, C. H., Bluestone, J. A., Nadler, L. M. y Thompson, C. B. 1994. The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today. 15: 321-331.

Kaufman, J. y Salomonsen, J. 1992. B-G: we know what it is, but what does it do? Immunol. Today. 13: 1-3. Latchman, Y., Wood, C. R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A. J., Brown, J. A. , Nunes R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A., Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N., Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H. y Freeman, G.J. 2001. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat. Immunol. 2: 261-274.

Ledbetter, J.A., Imboden, J. B., Schieven, G. L., Grosmaire, L. S., Rabinovitch, P. S., Lindsten, T., Thompson, C. B. y June, C. H. 1990. CD28 ligation in T-cell activation: evidence for two signal transduction pathways. Blood. 75: 1531-1539.

Lenschow, D. J., Walunas, T. L. y Bluestone, J. A. 1996. CD28/B7 of T cell costimulation. Annu. Rev. Immnuol. 14: 233-258.

Linsley, P. S., Greene, J. L., Tane, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J. A., Anasetti, C., y Damle, N. K. 1992. Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. J. Exp. Med. 176: 1595­ 15604.

Linsley, P. S. y Ledbetter, J. A. 1993. The role of the CD 28 receptor during T cell responses to antigen. Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212.

Liu, Y. y Linsley, P.S. 1992. Costimulation of T-cell growth. Curr. Opin. Immunol. 4: 265-270.

Ma, X., Chow, J. M., Gri, G., Carra, G., Gerosa, F., Wolf, S. F., Dzialo, R. y Trinchieri, G. 1996. The interleukin-12 p40 gene promoter is primed by interferon gamma in monocytic cells. J. Exp. Med. 183: 147-157.

Medzhitov, R. 2001. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1: 135-145.

Nurieva, R., Thomas, S., Nguyen, T., Martin-Orozco, N., Wang, Y., Kaja, M. K., Yu, X. Z. y Dong, C. 2006. T-cell tolerance or function is determined by combinatorial costimulatory signals. Embo J. 25: 2623-2633.

Price, P., Santoso, F., Mastaglia, M., Garlepp, C., Kok, C., Allcock, R. y Laing, N. 2004. Two major histocompatibility complex haplotypes influence susceptibility to sporadic inclusion body myositis: critical evaluation of an association with HLA-DR3. Tissue Antigens. 64: 575-580.

Rhodes, D. A., Stammers, M., Malcherek, G., Beck, S. y Trowsdale, J. 2001. The cluster of BTN genes in the extended major histocompatibility complex. Genomics. 71: 351-362.

Ruddy, D. A., Kronmal, G. S., Lee, V. K., Mintier, G. A., Quintana, L., Domingo, R. Jr., Meyer, N. C., Irrinki, A., McClelland, E. E., Fullan, A., Mapa, F.A., Moore, T., Thomas, W., Loeb, D.B., Harmon, C., Tsuchihashi, Z., Wolff, R.K., Schatzman, R.C., Feder, J.N. 1997. A 1.1-Mb transcript map of the hereditary hemochromatosis locus. Genome Res. 7: 441-456.

Rybicki, B. A., Walewski, J. L., Maliarik, M. J., Kian, H. y lannuzzi, M. C. 2005. The BTNL2 gene and sarcoidosis susceptibility in African Americans and Whites. Am. J. Hum. Genet. 77: 491-499.

Salmaso, C., Olive, D., Pesce, G. y Bagnasco, M. 2002. Costimulatory molecules and auoimmune thyroid diseases. Autoimmunity. 35: 159-167.

Saverino, D., Tenca, C., Zarcone, D., Merlo, A., Megiovanni, A. M., Valle, M. T., Manca, F., Grossi, C. E. y Ciccone, E. 1998. CTLA-4 (CD152) inhibits the specific lysis mediated by human cytolytic T lymphocytes in a clonally distributed fashion. J. Immunol. 162: 651-658.

Sun, M., Richards, S., Prasad, D. V., Mai, X. M., Rudensky, A. y Dong, C. 2002. Characterization of mouse and human B7-H3 genes. J. Immunol. 168: 6294-6297.

Takeda, K. y Akira, S. 2003. Toll receptors and pathogen resistance. Cell Microbiol. 5: 143-153.

Tseng, S. Y., Otsuji, M., Gorski, K., Huang, X., Slansky, J. E., Pai, S. I., Shalabi, A., Shin, T., Pardoll, D. M. y Tsuchiya, H. 2001. B7-DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells. J. Exp. Med. 193: 839-846.

Valentonyte, R., Hampe, J., Huse, K., Rosenstiel, P., Albrecht, M., Stenzel, A., Nagy, M., Gaede, K. I., Franke, A., Haesler, R., Koch, A., Lengauer, T., Seegert, D., Reiling, N., Ehlers, S., Schwinger, E., Platzer, M., Krawczak, M., Muller-Quernheim, J., Schurmann, M., Schreiber, S. 2005. Sarcoidosis is associated with a truncating splice site mutation in BTNL2. Nat. Genet. 37: 357-364-364.

Walunas, T. L., Lenschow, D. J., Bakker, C. Y., Linsley, P. S., Freeman, G. J., Green, J. M., Thompson, C. B. y Bluestone, J. A. 1994. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity. 1: 405-413. Walunas, T. L. y Bluestone, J. A. 1998. CTLA-4 regulates tolerance induction and T cell differentiation in vivo. J. Immunol. 160: 3855-3860.

Waterhouse, P., Penninger, J. M., Timms, E., Wakeham, A., Shahinian, A., Lee, K. P., Thompson, C. B., Griesser, H. y Mak, T. W. 1995. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270: 985-988.

Waterhouse, P., Marengere, L. E. M., Mittrucker, H.-W. y Mak, T. W. 1996. CTLA-4, a negative regulator of T-lymphocyte activation. Immnunol. Rev. 153: 183-207.

Williams, A. F. y Barclay, A. N. 1988. The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Annu. Rev. Immunol. 6: 381-405.

Wolf, S. F., Sieburth, D. y Sypek, J. 1994. Interleukin-12: a key modulator of immune function. Stem Cells Dayt. 12: 154-168.

Yi-qun, Z., Lorre, K., de Boer, M. y Ceuppens, J. L. 1997. B7-blocking agents, alone or in combination with cyclosporin A, induce antigen-specific anergy of human memory T cells. J. Immunol. 158: 4734-4740.

I. Sharpe, A.H. y G.J. Freeman, The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol, 2002. 2(2): págs. 116-26.

2. Greenwald, R.J., G.J. Freeman y A.H. Sharpe, The B7 family revisited. Annu Rev Immunol, 2005. 23: págs. 515­ 48.

3. Croft, M., Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol, 2003.

3(8): págs. 609-20.

4. Watts, T.H., TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev Immunol, 2005. 23: págs.

23-68.

5. Ishida, Y., et al., Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. Embo J, 1992. 11(11): págs. 3887-95.

6. Chambers, C.A. y J.P. Allison, Co-stimulation in T cell responses. Curr Opin Immunol, 1997. 9(3): págs. 396­ 404.

7. Lenschow, D.J., T.L. Walunas y J.A. Bluestone, CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol, 1996. 14: págs. 233-58.

8. June, C.H., et al., The B7 and CD28 receptor families. Immunol Today, 1994. 15(7): págs. 321-31.

9. Boise, L.H., et al., CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-XL. Immunity, 1995. 3(1): págs. 87-98.

10. Linsley, P.S., et al., CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med, 1991. 174(3): págs. 561-9.

11. Tazi-Ahnini, R., et al., Cloning, localization, and structure of new members of the butyrophilin gene family in the juxta-telomeric region of the major histocompatibility complex. Immunogenetics, 1997. 47(1): págs. 55-63.

12. Rhodes, D.A., et al., The cluster of BTN genes in the extended major histocompatibility complex. Genomics, 2001. 71(3): págs. 351-62.

13. Henry, J., et al., Cloning, structural analysis, and mapping of the B30 and B7 multigenic families to the major histocompatibility complex (MHC) and other chromosomal regions. Immunogenetics, 1997. 46(5): págs. 383-95.

14. Henry, J., et al., B30.2-like domain proteins: a growing family. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 235(1): págs. 162-5.

15. Ogg, S.L., et al., Expression of butyrophilin (Btn1a1) in lactating mammary gland is essential for the regulated secretion of milk-lipid droplets. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(27): págs. 10084-9.

16. Robenek, H., et al., Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(27): págs. 10385-90.

17. Ishii, T., et al., Carboxy-terminal cytoplasmic domain of mouse butyrophilin specifically associates with a 150-kDa protein of mammary epithelial cells and milk fat globule membrane. Biochim Biophys Acta, 1995. 1245(3): págs. 285-92.

18. Henry, J., et al., B30.2-like domain proteins: update and new insights into a rapidly expanding family of proteins. Mol Biol Evol, 1998. 15(12): págs. 1696-705.

19. Ruddy, D.A., et al., A 1.1-Mb transcript map of the hereditary hemochromatosis locus. Genome Res, 1997. 7(5): págs. 441-56.

20. Henry, J., M.M. Miller y P. Pontarotti, Structure and evolution of the extended B7 family. Immunol Today, 1999.

20(6): págs. 285-8.

21. Compte, E., et al., Frontline: Characterization of BT3 molecules belonging to the B7 family expressed on immune cells. Eur J Immunol, 2004. 34(8): págs. 2089-99.

22. Malcherek, G., L. Mayr, P. Roda-Navarro, D. Rhodes, N. Miller y J. Trowsdale. 2007. The B7 homolog butyrophilin BTN2A1 is a novel ligand for DC-SIGN.J. Immunol.179: 3804-3811.

23. Nguyen, T., X. K. Liu, Y. Zhang y C. Dong. 2006. BTNL2, a butyrophilin-like molecule that functions to inhibit T cell activation. J. Immunol. 176: 7354-736

24. Arnett, H. A., S. S. Escobar, E. González-Suárez, A. L. Budelsky, L. A. Steffen, N. Boiani, M. Zhang, G. Siu, A. W. Brewer y J. L. Viney. 2007. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J. Immunol. 178: 1523-1533.

25. Xerri L, Devilard E, Hassoun J, et al. In vivo expression of theCTLA4 inhibitory receptor in malignant and reactive cellsfrom human lymphomas. J Pathol. 1997; 183: 182-187.

26. Yamashiro H, Yoshizaki S, Tadaki T, Egawa K y Seo N.2010. Stimulation of human butyrophilin 3 molecules results in negative regulation of cellular immunity.

27. Firaguay G y Nunes JA. 2009. Analysis of signaling events by dynamic phosphoflow cytometry. Sience Signaling.

Las referencias citadas en el ejemplo 3 son las siguientes:

1. Tanaka, Y. et coll. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells. Nature 375, 155-8 (1995).

2. Halary, F. et coll. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma delta T cell receptors by natural killer inhibitory receptors. Eur J Immunol 27, 2812-21 (1997).

3. Das, H. et coll. MICA engagement by human Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their antigen-dependent effector function. Immunity 15, 83-93 (2001).

4. Deetz, C.O. et coll. Gamma interferon secretion by human Vgamma2Vdelta2 T cells after stimulation with antibody against the T-cell receptor plus the Toll-Like receptor 2 agonist Pam3Cys. Infect Immun 74, 4505-11 (2006).

5. Wesch, D. et coll. Direct costimulatory effect of TLR3 ligand poly(I:C) on human gamma delta T lymphocytes. J Immunol 176, 1348-54 (2006).

6. Rincon-Orozco, B. et coll. Activation of V gamma 9V delta 2 T cells by NKG2D. J Immunol 175, 2144-51 (2005).

7. Boyden, L.M. et coll. Skint1, the prototype of a newly identified immunoglobulin superfamily gene cluster, positively selects epidermal gammadelta T cells. Nat Genet 40, 656-62 (2008).

8. Stammers, M. et coll. BTL-II: a polymorphic locus with homology to the butyrophilin gene family, located at the border of the major histocompatibility complex class II and class III regions in human and mouse. Immunogenetics 51, 373-82 (2000).

9. Arnett, H.A. et coll. BTNL2, a butyrophilin/B7-like molecule, is a negative costimulatory molecule modulated in intestinal inflammation. J Immunol 178, 1523-33 (2007).

10. Compte, E. et coll. Frontline: Characterization of BT3 molecules belonging to the B7 family expressed on immune cells. Eur J Immunol 34, 2089-99 (2004).

11. Mann, M. et coll. Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. Trends Biotechnol 20, 261-8 (2002).

12. Cantin, G.T. et coll. Combining protein-based IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. J Proteome Res 7, 1346-51 (2008).

13. Villen, J. et coll. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1488-93 (2007).

14. Park, H. et coll. A point mutation in the murine Hem1 gene reveals an essential role for Hematopoietic protein 1 in lymphopoiesis and innate immunity. J Exp Med 205, 2899-913 (2008).

15. Wang, Y. et coll. Profiling signaling polarity in chemotactic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 8328-33 (2007).

16. Tzivion, G., Luo, Z. y Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature 394, 88-92 (1998).

17. Di Bartolo, V. et coll. A novel pathway down-modulating T cell activation involves HPK-1-dependent recruitment of 14-3-3 proteins on SLP-76. J Exp Med 204, 681-91 (2007).

18. Zhang, H. et coll. RIP1-mediated AIP1 phosphorylation at a 14-3-3-binding site is critical for tumor necrosis factor-induced ASK1-JNK/p38 activation. J Biol Chem 282, 14788-96 (2007).

19. Parker, F. et coll. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Mol Cell Biol 16, 2561-9 (1996).

20. Tourriere, H. et coll. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. J Cell Biol 160, 823-31 (2003).

21. Rahmouni, S. et coll. Removal of C-terminal SRC kinase from the immune synapse by a new binding protein. Mol Cell Biol 25, 2227-41 (2005).

22. Grewal, T. et coll. Annexin A6 stimulates the membrane recruitment of p120GAP to modulate Ras and Raf-1 activity. Oncogene 24, 5809-20 (2005).

23. Li, M., Makkinje, A. y Damuni, Z. The myeloid leukemia-associated protein SET is a potent inhibitor of protein phosphatase 2A. J Biol Chem 271, 11059-62 (1996).

24. Grantham, J. et coll. Eukaryotic chaperonin containing T-complex polypeptide 1 interacts with filamentous actin and reduces the initial rate of actin polymerization in vitro. Cell Stress Chaperones 7, 235-42 (2002).

25. Williams, J.C., Xie, H. y Hendrickson, W.A. Crystal structure of dynein light chain TcTex-1. J Biol Chem 280, 21981-6 (2005).

26. Sachdev, P. et coll. G protein beta gamma subunit interaction with the dynein lightchain component Tctex-1 regulates neurite outgrowth. EMBO J 26, 2621-32 (2007).

27. Schnapp, B.J. y Reese, T.S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1548-52 (1989).

28. Wang, Y. et coll. Rim is a putative Rab3 effector in regulating synaptic-vesicle fusion. Nature 388, 593-8 (1997).

29. Martin-Cofreces, N.B. et coll. MTOC translocation modulates IS formation and controls sustained T cell signaling. J Cell Biol 182, 951-62 (2008).

30. Stremlau, M. et coll. The cytoplasmic body component TRI M5alpha restricts HIV-1 infection in Old World monkeys. Nature 427, 848-53 (2004).

31. Jeru, I. et coll. Interaction of pyrin with 14.3.3 in an isoform-specific and phosphorylation-dependent manner regulates its translocation to the nucleus. Arthritis Rheum 52, 1848-57 (2005).

32. Mansfield, E. et coll. The familial Mediterranean fever protein, pyrin, associates with microtubules and colocalizes with actin filaments. Blood 98, 851-9 (2001).

33. Yu, J. et coll. Pyrin activates the ASC pyroptosome in response to engagement by autoinflammatory PSTPIP1 mutants. Mol Cell 28, 214-27 (2007).

34. Badour, K. et coll. The Wiskott-Aldrich syndrome protein acts downstream of CD2 and the CD2AP and PSTPIP1 adaptors to promote formation of the immunological synapse. Immunity 18, 141-54 (2003).

35. Cote, J. et coll. PSTPIP is a substrate of PTP-PEs T and serves as a scaffold guiding PTP-PEST toward a specific dephosphorylation of WASP. J Biol Chem 277, 2973-86 (2002).

36. Maeda, Y. et coll. Critical role of host gammadelta T cells in experimental acute graftversus-host disease. Blood 106, 749-55 (2005).

37. Pabst, C. et coll. The graft content of donor T cells expressing gamma delta TCR+ and CD4+foxp3+ predicts the risk of acute graft versus host disease after transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells from unrelated donors. Clin Cancer Res 13, 2916-22 (2007).

38. Fitch, W. Toward defining the courfe of evolution: minimum change for a specific tree topology. Systematic Zoology 406-416 (1971).

39. Felsenstein, J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J Mol Evol 17, 368­ 76 (1981).

40. Saitou, N. y Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4, 406-25 (1987).

41. Gouret, P. et coll. FIGENIX: Intelligent automation of genomic annotation: expertise integration in a new software platform. BMC Bioinformatics 6, 198 (2005).

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso en terapia, en donde dicho anticuerpo comprende las 6 CDR del anticuerpo mAb20.1 o mAb7.2 que se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de CNCM 1-4401 o 1­ 4402, respectivamente, y

en donde dicho anticuerpo anti-CD277 activa la función citolítica, producción de citocinas y proliferación de linfocitos T Vy9/V52.

2. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo anti-CD277

- coestimula los linfocitos T junto con CD3-TCR, y - coestimula los linfocitos T además de la coestimulación de CD28-B7, y

- aumenta la actividad y/o supervivencia de monocitos y células dendríticas.

3. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado.

4. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo anti-CD277 se puede obtener del hibridoma accesible con el número de depósito de CNCM 1-4401 o 1-4402.

5. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha terapia es de cáncer.

6. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según la reivindicación 5, en donde dicho cáncer es una neoplasia maligna hematológica.

7. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según la reivindicación 6, en donde la neoplasia maligna hematológica es una neoplasia de linaje celular mieloide.

8. Un anticuerpo anti-CD277 para su uso según la reivindicación 5, en donde dicho cáncer es un cáncer no hematológico seleccionado del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer de hueso, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de testículo y cáncer de piel.