JP2017061502A - 抗ｃｄ２７７抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化または阻害する抗ＣＤ２７７抗体の提供。
【解決手段】Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化もしくは阻害し、かつ／またはＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激し、かつ／またはＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激し、かつ／または単球および樹状細胞の活性および／もしくは生存を増加させる、抗ＣＤ２７７抗体。また、治療における前記抗体の使用。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、抗ＣＤ２７７抗体およびその使用に関する。

発明の背景
白血球は、病原体からの身体防御に関与する免疫系細胞である。これらの細胞の中から、リンパ球、単球、および樹状細胞を挙げることができる。単球は、血流から他の組織に移動して組織常在型マクロファージまたは樹状細胞に分化することができる。樹状細胞は、リンパ球を活性化する抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たす。リンパ球のうち、Ｔ細胞はγδＴ細胞およびαβＴ細胞に分類することができる。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は、免疫防御の重要なエフェクターである。それらは、病原体に感染した細胞または異常細胞を直接溶解する。加えて、それらは、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導することにより免疫応答をレギュレーションし、ならびにアイソタイプスイッチおよび免疫グロブリン産生をレギュレーションする。免疫系のこの重要な細胞プラットフォームは、表面レセプター、ケモカインおよびサイトカインにより厳密にレギュレーションされる。

Ｔ細胞のプライミングは、専門化された細胞の関与および走化性サイトカインの分泌によりモデュレーションされる。今日では、Ｔ細胞活性化が二つの相乗的事象の結果であることが分かっている。第一の事象は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）と、プロセシングされた抗原に抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面で結合した主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との相互作用である。第二の事象は、Ｂ７分子を含む共刺激性抗原非依存的シグナルである。共刺激性シグナルの欠如は、アネルギーを、すなわちＴ細胞増殖、サイトカイン分泌および細胞傷害活性の阻害を誘導する。これらの経路の研究は、自己免疫障害またはリンパ増殖性障害などの病的事象のトリガーについて洞察を与えることができる。

Ｂ７ファミリーは、共刺激分子の広大な一グループである（Coyle et al., 2001）。リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）は、Ｂ７ファミリーに属し、それらのレセプターは、Ｔ細胞活性化を導くＣＤ２８（Linsley and Ledbetter, 1993, June, et al., 1994, Lenschow et al., 1996）およびＣＤ２８と競合して阻害シグナルを伝達するＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）である（Waterhouse et al., 1996）。Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターとしてのＣＤ１５２の重大な役割は、ＣＴＬＡ−４欠損マウスにリンパ増殖性障害が発生することによって実証されている（Waterhouse et al., 1995）。ＣＤ１５２により発揮される阻害機能に関する大部分のデータは、Ｔ細胞プライミング時のナイーブＴリンパ球による増殖またはサイトカイン産生の研究から集められている（Linsley et al., 1992, Walunas et al., 1995, Walunas and Bluestone, 1998）。特にＣＤ１５２は、Ｔリンパ球活性化後に発現され、ＰＨＡ刺激またはＡｇ選択後に得られたＣＴＬクローンの細胞溶解機能を阻害する（Saverino et al., 1998）。

そのレセプターがＰＤ−１（ＣＤ２７９）であるＢ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）およびＢ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ２７３）は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌を阻害することが実証されている（Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001）。その他の場合、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合（engagement）がＴ細胞増殖およびＩＬ−１０またはＩＦＮ−γの産生を増加させることが種々の研究から示された（Dong et al., 1999, Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001, Chapoval et al., 2001, Tseng et al., 2001）。Ｔ細胞表面上に発現される他のファミリーＢ７関連分子は、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４であるが、それらの役割は完全には理解されていない（Hutloff et al., 1999, Sun et al., 2002）。

Henryら（1999）は、ブチロフィリン（ＢＴ）をコードする領域がヒト第６染色体上のＭＨＣクラスＩ領域由来のテロメア位置に局在することを見出した。特に彼らは、Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属する新規群の共刺激分子（ＢＴ２．１、ＢＴ２．２、ＢＴ２．３、ＢＴ３．１、ＢＴ３．２およびＢＴ３．３）をコードする二つの遺伝子Ｂｔ２およびＢｔ３について記載し（Williams and Barclay, 1988）、配列類似性解析によりＢ７ファミリーと関連づけた。特にそれは、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＩｇ−Ｖ様細胞外ドメインと類似性を示す（Linsley et al., 1992）。

ＢＴ３ファミリーのメンバーは、異なる名称で文献に登場する：ＢＴ３．１は、ＢＴＦ５（Rhodes et al., 2001）、またはＢＴＮ３Ａ１（Ruddy et al., 1997）、またはもっと最近にはＣＤ２７７（Bensussan and Olive, 2005）とも呼ばれ；ＢＴ３．２は、ＢＴＦ４（Rhodes et al., 2001）、またはＢＴＮ３Ａ２（Ruddy et al., 1997）とも呼ばれ；最後にＢＴ３．３は、ＢＴＦ３（Rhodes et al., 2001）またはＢＴＮ３Ａ３（Ruddy et al., 1997）としても出現する。ＢＴ３は、ＩｇＳＦの特徴となる２個のＩｇ様細胞外ドメインを有する。

ｂ７遺伝子ならびにＭＨＣクラスＩ遺伝子およびクラスＩＩ遺伝子は、共通の祖先遺伝子を有する可能性があり、Ｔ細胞活性化などの類似の機能に関与するタンパク質をコードしうると提案されている（Rhodes et al., 2001）。ＢＴ３分子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球および樹状細胞などの免疫細胞、ならびに造血前駆細胞およびいくつかの腫瘍細胞系上から見出された（Compte et al., 2004）。他の共刺激分子に関して、それらの構造は、三つのドメイン、すなわちリガンドと結合するための細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内スーパーオキシド濃度のレギュレーションに関与すると推定されるＢ３０．２という名称の細胞内ドメインによって特徴づけられる（Henry et al., 1998）。これまでのところ、ＣＤ２７７のリガンドはまだ分かっていない。

今日まで、特にガン患者において、ワクチンに対して強力な免疫応答を誘導する、満足のいくアプローチは実証されていない。ガン患者において観察される、および慢性感染時に観察される、免疫抑制メカニズムを克服する方法をなお考案しなければならない。

自己免疫病の処置および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）での移植拒絶反応の予防は、免疫抑制剤に依存しているが、免疫抑制剤は重篤な副作用を有するか、または必ずしも有効ではない。新規な免疫抑制剤が望まれている。

発明の概要
本発明は、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化または阻害する抗ＣＤ２７７抗体に関する。本発明は、また、ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激し、かつ／またはＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激する抗ＣＤ２７７抗体に関する。本発明は、また、単球および樹状細胞の活性および／または生存を増加させる抗ＣＤ２７７抗体に関する。

好ましくは、本発明の抗体は：
− Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化し、かつ
− ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激し、かつ
− ＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激し、かつ
− 単球および樹状細胞の活性および／または生存を増加させる
抗ＣＤ２７７抗体である。

特に本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１、Ｉ−４４０２およびＩ−４４０３として利用可能なハイブリドーマの一つから入手可能な抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ２０．１、７．２および１０３．２から選択される）に関する。

本発明は、また、ｍＡｂ２０．１のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体に関する。本発明は、また、ｍＡｂ７．２のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体に関する。本発明は、また、ｍＡｂ１０３．２のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体に関する。

本発明は、また、治療に使用するための、ｍＡｂ２０．１、７．２および１０３．２の一つまたはその誘導体に関する。

本発明は、ガンまたは慢性感染の処置に使用するための、ｍＡｂ２０．１および７．２の一つまたはその誘導体に関する。

本発明は、ｍＡｂ２０．１および７．２の一つまたはその誘導体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンに関する。本発明は：
ａ）ｍＡｂ２０．１もしくは７．２またはその誘導体；および
ｂ）ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン
を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキットに関する。

本発明は、治療に使用するための上記と同義の抗ＣＤ２７７抗体に関する。

本発明は、最終的に、特に自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病の処置に使用するための、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の機能を阻害する抗ＣＤ２７７抗体に関する。

発明の詳細な説明
定義
本発明によると、「抗体」または「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。本明細書に使用するような「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子の、免疫学的活性部分を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントまたは抗体誘導体も包含する。抗体フラグメントには、非限定的にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２および二重特異性抗体が含まれる。

天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合により相互に結合し、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に結合している。２種類の軽鎖、すなわちラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な５種類の重鎖クラス（またはアイソタイプ）、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。

軽鎖は、２個のドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４個のドメイン、すなわち１個の可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ぶ）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域（それぞれＶＬおよびＶＨ）は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖および重鎖の定常領域ドメイン（それぞれＣＬおよびＣＨ）は、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移動、補体結合およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であって、軽鎖１本および重鎖１本の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体側の結合部位と抗原決定基の間の構造相補性にある。抗体側の結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から構成される。場合によっては、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基は、ドメイン構造全体に、したがって結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域またはＣＤＲは、一緒になって、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの各軽鎖および重鎖は、それぞれＬ−ＣＤＲｌ、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲｌ、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と呼ばれる３個のＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挟まったアミノ酸配列を表す。

「キメラ抗体」という用語は、動物抗体、典型的にはマウス抗体の部分とヒト抗体の部分との遺伝子操作融合体を表す。一般にキメラ抗体は、約３３％のマウスタンパク質および６７％のヒトタンパク質を含有する。動物抗体により誘発されるヒト抗動物抗体応答を軽減するために開発されたので、キメラ抗体は、動物抗体の特異性と、ヒト抗体の効率的なヒト免疫系相互作用とを兼ね備える。

本発明によると、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来の可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが、動物抗体のＣＤＲを保持する抗体を表す。

「Ｆａｂ」という用語は、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼであるパパインでＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの間でＨ鎖Ｎ末端側の約半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合により一緒に結合しているフラグメントを意味する。

「Ｆ（ａｂ’）_２」という用語は、分子量約１００，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼであるペプシンでＩｇＧを処理することにより得られる、Ｆａｂよりもやや大きなフラグメントの間でヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合している抗体フラグメントを表す。

「Ｆａｂ’」という用語は、分子量約５０，０００および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを表す。

単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される共有結合型ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。

「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの結合によって自然に形成することができるか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）_２のように一価ｓｃＦｖをペプチドリンカーによりカップリングすることにより作製することができる。

「二重特異性抗体」という用語は、２個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合して同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）になったものを表す。同じ鎖上の２個のドメインの間で対形成できるには短すぎるリンカーを使用することで、それらのドメインはもう１本の鎖の相補性ドメインと対形成せざるを得ず、２個の抗原結合部位が生まれる。

ポリペプチド（すなわち本発明による抗体）またはヌクレオチド配列のことを言う場合、「精製」および「単離」は、表示された分子が、同種の他の生体高分子の実質的な不在下で存在することを意味する。

本明細書に使用するような「精製」という用語は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ種類の生体高分子が存在することを意味する。

特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、そのポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に有さない核酸分子を表すが；その分子は、組成物の基本的性質に有害に影響しないいくつかの追加的な塩基または部分を含みうる。

本発明に関連して、本明細書に使用するような「処置する」または「処置」という用語は、そのような用語が適用される障害もしくは状態の、またはそのような障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状の、進行を後退、緩和、阻害すること、またはそれを予防することを意味する。

「治療上有効な量」は、対象に治療効果を与えるために必要な最小量の活性薬剤のことである。例えば、哺乳類への「治療上有効な量」は、病状、疾患の進行、または障害に屈することに関連する生理的状態もしくはそれに対する抵抗性における向上を誘導、改善またはその他の点で引き起こす量である。

本明細書に使用するような「予防」という用語は、疾患または状態を有するとまだ診断されたことのない対象においてその疾患または状態が起こることを予防することを表す。本明細書に使用するような「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による対象はヒトである。

本明細書に使用するような「ガン」、「過剰増殖」および「腫瘍性」という用語は、自律成長する能力、すなわち急速増殖している細胞成長によって特徴づけられる異常状態または異常状況の能力を有する細胞を表す。過剰増殖疾患状態および腫瘍性疾患状態は、病的として、すなわち疾患状態を特徴とするもしくは構成するとして、または非病的として、すなわち正常から逸脱しているが疾患状態に関連しないとして分類することができる。この用語には、侵襲の病理組織学的タイプまたはステージとは無関係に、全ての種類のガン成長または発ガン過程、転移組織または悪性トランスフォーメーションされた細胞、組織、もしくは器官が含まれることを表すつもりである。

「ガン」または「新生物」という用語には、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、消化管および泌尿生殖器などの様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに大部分の結腸ガン、腎細胞ガン、前立腺ガンおよび／または精巣腫瘍、非小細胞肺ガン、小腸ガンおよび食道ガンなどの悪性腫瘍が含まれる腺癌が含まれる。

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、２０１０年１１月２４日にマウス抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ２０．１）産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）に寄託した。

寄託された、ｍＡｂ２０．１に関するハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０２を有する。

「ｍＡｂ２０．１」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０２として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗ＣＤ２７７抗体を表す。「ｍＡｂ２０．１の誘導体」という表現は、ｍＡｂ２０．１の６個のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体を表す。

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、２０１０年１１月２４日にマウス抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ７．２）産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）に寄託した。

寄託された、ｍＡｂ７．２に関するハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１を有する。

「ｍＡｂ７．２」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗ＣＤ２７７抗体を表す。「ｍＡｂ７．２の誘導体」という表現は、ｍＡｂ７．２の６個のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体を表す。

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、２０１０年１１月２４日にマウス抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ１０３．２）産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）に寄託した。

寄託された、ｍＡｂ１０３．２に関するハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０３を有する。

「ｍＡｂ１０３．２」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０３として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗ＣＤ２７７抗体を表す。「ｍＡｂ１０３．２の誘導体」という表現は、ｍＡｂ１０３．２の６個のＣＤＲを含む抗ＣＤ２７７抗体を表す。

本発明の抗体およびそれをコードする核酸
本発明は、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する、単離された抗ＣＤ２７７抗体に関する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化することは、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞傷害性の顕著な増加、すなわちＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるターゲット細胞の特異的溶解の顕著な増加が観察されることを意味する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増加させることは、対照のＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（すなわち無刺激および無処理）に比べてＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるサイトカイン産生の有意な増加が観察されることを意味する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を増加させることは、対照のＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（すなわち無刺激および無処理）に比べてＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の増殖の有意な増加が観察されることを意味する。

典型的には、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能の活性化は、実施例３に記載された方法（すなわち「直接細胞傷害性アッセイによるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞応答の分析」および例えば結果「ＣＤ２７７はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞により仲介される抗腫瘍細胞溶解作用を強化する」）により測定することができる。Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する、単離された抗ＣＤ２７７抗体の例は、ｍＡｂ２０．１もしくはｍＡｂ７．２、またはその誘導体である。

本発明は、また、ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激する抗ＣＤ２７７抗体に関する。ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激することは、ＣＤ３とＴＣＲとの結合後に反応カスケードが活性化されることを意味する。典型的には、ＣＤ３−ＴＣＲと一緒のＴ細胞の共刺激は、実施例２に記載された方法（特に、「ＣＤ２７７はＣＤ３シグナルを共刺激する」）により測定することができる。ＣＤ３−ＴＣＲと一緒にＴ細胞を共刺激する単離された抗ＣＤ２７７抗体の例は、ｍＡｂ２０．１もしくはｍＡｂ７．２、またはその誘導体である。

本発明は、また、ＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激する抗ＣＤ２７７抗体に関する。ＣＤ２８−Ｂ７と一緒になってＴ細胞を共刺激することは、ＣＤ２８とＢ７との結合後に反応カスケードが活性化することを意味する。典型的には、ＣＤ２８−Ｂ７と一緒になったＴ細胞の共刺激は、実施例２に記載された方法（特に、「ＣＤ２７７はＣＤ３シグナルを共刺激する」）により測定することができる。ＣＤ２８−Ｂ７と一緒になってＴ細胞を共刺激する、単離された抗ＣＤ２７７抗体の例は、ｍＡｂ２０．１もしくは７．２、またはその誘導体である。

本発明は、また、単球および樹状細胞の活性および／または生存を増加させる抗ＣＤ２７７抗体に関する。単球および樹状細胞の活性を増加させることは、前記抗ＣＤ２７７抗体が単球および樹状細胞の表面上での共刺激分子（ＣＤ８６ｍ、ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲなど）の発現を増加させ、これらの細胞においてＴＬＲリガンドにより誘導される炎症促進応答を増加させることを意味する。典型的には、単球および樹状細胞の活性および／または生存の増加は、実施例１に記載された方法（特に「アポトーシスの検出」および「サイトカイン産生」）により測定することができる。単球および樹状細胞の活性および／または生存を増大させる単離された抗ＣＤ２７７抗体の例は、ｍＡｂ２０．１またはその誘導体である。

本発明は、また、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０２として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ２０．１）に関する。

本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０２として利用可能なハイブリドーマに関する。

本発明は、ｍＡｂ２０．１の６個のＣＤＲを含む抗体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ２０．１のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含むｍＡｂ２０．１誘導体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ２０．１の可変ドメインを含むキメラ抗体であるｍＡｂ２０．１誘導体に関する。

本発明は、また、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ７．２）に関する。

本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１として利用可能なハイブリドーマに関する。

本発明は、ｍＡｂ７．２の６個のＣＤＲを含む抗体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ７．２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含むｍＡｂ７．２誘導体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ７．２の可変ドメインを含むキメラ抗体であるｍＡｂ７．２誘導体に関する。

本発明は、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、単離された抗ＣＤ２７７抗体に関する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能を阻害することは、対照Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（すなわち無刺激および無処理）に比べてＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞傷害作用の有意な減少、すなわちＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるターゲット細胞の特異的溶解の有意な減少が観察されることを意味する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるサイトカイン産生を阻害することは、対照Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（すなわち無刺激および無処理）に比べて、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞によるサイトカイン産生の有意な減少が観察されることを意味する。

Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を阻害することは、対照Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（すなわち無刺激および無処理）に比べて、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞による増殖の有意な減少が観察されることを意味する。

典型的には、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能の阻害は、実施例３に記載された方法（すなわち「直接細胞傷害性アッセイによるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞応答の分析」）により測定することができる。Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、単離された抗ＣＤ２７７抗体の一例は、ｍＡｂ１０３．２またはその誘導体である。

本発明は、また、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０３として利用可能なハイブリドーマから入手可能な単離された抗ＣＤ２７７抗体（ｍＡｂ１０３．２）に関する。

本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０３として利用可能なハイブリドーマに関する。

本発明は、ｍＡｂ１０３．２の６個のＣＤＲを含む抗体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ１０３．２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含むｍＡｂ１０３．２誘導体に関する。

別の態様では、本発明は、ｍＡｂ１０３．２の可変ドメインを含むキメラ抗体であるｍＡｂ１０３．２誘導体に関する。

一態様では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

一態様では、本発明の抗体はキメラ抗体である。

一態様では、本発明の抗体はヒト化抗体である。

本発明のさらなる一態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。

特定の一態様では、本発明は、本発明の抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。典型的には、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、それをプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクター中に組込むことができる。

「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ホストをトランスフォーメーションして導入配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）をホスト細胞に導入することができる媒体を意味する。したがって、本発明のさらなる目的は本発明の核酸を含むベクターに関する。

そのようなベクターは、対象に投与したときに前記抗体の発現を引き起こすまたは指令するために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含みうる。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例には、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターおよびエンハンサーなどが挙げられる。

ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入および発現できる限りは、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例には、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧｌβｄ２−４−などが挙げられる。

プラスミドの他の例には、複製起点を含む複製型プラスミド、または例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込み型プラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの他の例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。そのようなリコンビナントウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすることにより、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを一過性トランスフェクションすることなどにより、当技術分野において公知の技法により、生成させることができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。そのような複製欠損リコンビナントウイルスを生成させるための詳細なプロトコールは、例えば国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号および国際公開公報第９４／１９４７８号から見出すことができる。

本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによりトランスフェクション、感染またはトランスフォーメーションされた細胞に関する。「トランスフォーメーション」という用語は、ホスト細胞が導入遺伝子または導入配列を発現して所望の物質、典型的には導入遺伝子または導入配列によりコードされるタンパク質または酵素を産生させるように、「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をホスト細胞に導入することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受入れて発現するホスト細胞は、「トランスフォーメーション」されている。本発明の核酸は、適切な発現系で本発明の抗体を産生させるために使用することができる。「発現系」という用語は、例えばベクターによって担持され、ホスト細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための、適切な条件下のホスト細胞および適合性ベクターを意味する。

一般的な発現系には、E. coliホスト細胞とプラスミドベクター、昆虫ホスト細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳類ホスト細胞とベクターが挙げられる。ホスト細胞の他の例には、非限定的に、原核細胞(細菌など)および真核細胞(酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など)が挙げられる。具体例には、E. coli、KluyveromycesまたはSaccharomyces酵母、哺乳類細胞系（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）および哺乳類細胞の初代培養物または樹立培養物（例えばリンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成したもの）が挙げられる。例には、また、マウスＳＰ２／０−Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（本明細書下記においうて「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損しているＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２Ｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書下記において「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）などが挙げられる。

本発明は、また、本発明による抗体を発現しているリコンビナントホスト細胞を生成させる方法であって：
（ｉ）上記リコンビナント核酸またはベクターをコンピテントホスト細胞にin vitroまたはex vivo導入するステップ、
（ｉｉ）得られたリコンビナントホスト細胞をin vitroまたはex vivoで培養するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択するステップ
を含む方法に関する。そのようなリコンビナントホスト細胞は、本発明の抗体を製造するために使用することができる。

本発明の抗体の製造方法
本発明の抗体は、非限定的に、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技法などの当技術分野で公知の任意の技法を単独または組合せたものにより製造することができる。

所望の配列のアミノ酸配列が分かっている場合、当業者は、ポリペプチド製造のための標準技法により前記抗体を容易に製造することができる。例えば、周知の固相法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成装置（Applied Biosystems, Foster City, California製など）を使用して製造業者の説明書に従い、抗体を合成することができる。または、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントＤＮＡ技法により合成することができる。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組入れ、そのようなベクターを適切な真核または原核ホストに導入した後に（そのホストは所望の抗体を発現する）、ＤＮＡ発現産物として抗体を得ることができ、その後その産物から周知の技法を用いて抗体を単離することができる。

特に本発明は、さらに、本発明の抗体を製造する方法であって：
（ｉ）本発明によるトランスフォーメーションされたホスト細胞を、前記抗体を発現させるために適した条件で培養すること；および
（ｉｉ）発現された抗体を回収すること
から成るステップを含む方法に関する。

別の特定の態様では、その方法は：
（ｉ）抗体を発現させるために適した条件でＣＮＣＭ Ｉ−４４０１、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０２またはＣＮＣＭ Ｉ−４４０３として寄託されたハイブリドーマを培養するステップ；および
（ｉｉ）発現された抗体を回収するステップ
を含む。

本発明の抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。

特定の一態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、前記ＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得ること、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにそれを挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、ならびに動物細胞にその発現ベクターを導入することによりコード配列を発現させることによって製造することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってよいが、ＩｇＧクラスの領域が適切であり、ＣＨドメインとしてＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などの、ＩｇＧクラスに属するサブクラスの任意の一つも用いることができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬは、Ｉｇに属する任意の領域であってよく、ＣＬとしてκクラスまたはλクラスの領域を用いることができる。従来のリコンビナントＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法を伴う、キメラ抗体を製造するための方法は、当技術分野において周知である（特許文書である米国特許第５，２０２，２３８号；および米国特許第５，２０４，２４４号を参照されたい）。

本発明のヒト化抗体は、前記ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ること、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにその核酸配列を挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築すること、ならびにその発現ベクターを動物細胞に導入することにより遺伝子を発現させることによって製造することができる。

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデムタイプ）のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターを構築する容易さ、動物細胞に導入する容易さ、および動物細胞における抗体Ｈ鎖とＬ鎖の発現レベルの間のバランスに関して、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例には、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開公報第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。

従来のリコンビナントＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法に基づきヒト化抗体を製造するための方法は、当技術分野において周知である。抗体は、当技術分野で公知の多様な技法、例えば、ＣＤＲグラフティング（EP239,400；ＰＣＴ公報である国際公開公報第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（EP592,106；EP519,596）、および鎖シャフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）などを用いてヒト化することができる。そのような抗体を調製するための一般的なリコンビナントＤＮＡ技法も公知である（欧州特許出願EP125023および国際特許出願である国際公開公報第９６／０２５７６号を参照されたい）。

本発明のＦａｂは、ＣＤ２７７と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるパパインで処理することにより得ることができる。またＦａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核発現系用または真核発現系用のベクターに挿入すること、およびそのベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入してＦａｂを発現させることによって製造することができる。

本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＣＤ２７７と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することにより得ることができる。またＦ（ａｂ’）２は、下記Ｆａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合させることにより製造することができる。

本発明のＦａｂ’は、ヒトＣＤ２７７と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオトレイトールで処理することにより得ることができる。またＦａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入すること、およびそのベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入してその発現を行うことにより製造することができる。

本発明のｓｃＦｖは、前記ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得ること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターにＤＮＡを挿入すること、および次にその発現ベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入してｓｃＦｖを発現させることにより製造することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作製するために、ＣＤＲグラフティングと呼ばれる周知の技法を使用することができ、その技法は、ドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択すること、およびそれらを公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークにグラフトすることを伴う（例えば国際公開公報第９８／４５３２２号；国際公開公報第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。

本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変（一つまたは複数）が考慮されている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望しい場合がある。非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬ中のＣＤＲを、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単にグラフトすることだけによりヒト化抗体を製造する場合、非ヒト動物由来の本来の抗体に比べて抗原結合活性が低下することが知られている。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ中だけでなくＦＲ中のいくつかのアミノ酸残基も、抗原結合活性と直接的または間接的に関連していると見なされている。したがって、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ由来の異なるアミノ酸残基に置換すると、結合活性が低下するであろう。

この問題を解決するために、ヒトＣＤＲをグラフトされた抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸の配列の中で、抗体に対する結合に直接関連するアミノ酸残基、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、または抗体の三次元構造を維持するアミノ酸残基、および抗原への結合に直接関連するアミノ酸残基を同定することを試みなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を非ヒト動物由来の本来の抗体のアミノ酸残基と置換することにより増加させることができよう。

本発明の抗体の構造およびそれをコードするＤＮＡ配列に改変および変更を加え、それでも所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子を得ることができる。アミノ配列に変更を加える場合、アミノ酸の疎水性指標（hydropathic index）を考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することに果たす疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対疎水性が、結果として生じたタンパク質の二次構造に寄与し、それが今度はそのタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。

各アミノ酸には、それらの疎水性および電荷特性に基づき疎水性指標が割当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

本発明のさらなる一態様は、また、本発明の抗体の機能保存性変異体を考えている。

「機能保存性変異体」は、非限定的に類似の性質（例えば極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族アミノ酸など）を有するアミノ酸へのアミノ酸の交換などのように、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変えずにタンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が変更された変異体である。

保存されていると示されたアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なる場合が有り、その結果、機能が類似する任意の２種のタンパク質間のタンパク質類似率またはアミノ酸配列類似率が変動する場合があり、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくとき、クラスター法などのアライメントスキームにより決定された類似率は、７０％〜９９％でありうる。

「機能保存性変異体」には、また、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定したとき少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、なお好ましくは少なくとも９０％、そしていっそうより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、それが比較されるネイティブなタンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似の性質または機能を有するポリペプチドが挙げられる。短い方の配列の全長に関してアミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、または約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）の場合に、２種のアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似の配列または相同配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの任意の配列比較アルゴリズムを用いたアライメントにより同定される。

例えば、ある種のアミノ酸は、活性の認識可能な損失なしにタンパク質構造中の他のアミノ酸により置換することができる。タンパク質の相互作用能および性質がタンパク質の生物学的機能活性を規定するので、ある種のアミノ酸置換をタンパク質配列中に、およびもちろんそのＤＮＡ性コード配列中に加えることができ、それでもなお類似の性質を有するタンパク質を得ることができる。したがって、本発明の抗体の生物学的活性の認識可能な損失なしに、本発明の抗体配列、または前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変更を加えられることが考慮されている。

ある種のアミノ酸を、類似の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸により置換することができ、なお類似の生物学的活性を有するタンパク質が生じること、すなわち生物機能的に等価のタンパク質が得られることが当技術分野において知られている。したがって上に概要したように、アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。

いくつかの前記性質を考慮する例示的な置換が当業者に周知であり、それらには：アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。本発明の抗体の別のタイプのアミノ酸改変は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変えるために有用でありうる。

「変える」は、抗体中に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体に存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。

抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型である。「Ｎ結合型」は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分を結合させることを表す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に結合させるための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位が創出する。グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列が上記トリペプチドの一つまたは複数を含有するようにそのアミノ酸配列を変えることにより、好都合に達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。別のタイプの共有結合性改変は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングさせることを伴う。これらの手順は、ＮまたはＯ結合型グリコシル化についてのグリコシル化能を有するホスト細胞で抗体を産生させる必要がない点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖（一つまたは複数）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。例えば、そのような方法は、国際公開公報第８７／０５３３０号に記載されている。

抗体に存在する任意の糖質部分の除去は、化学的または酵素的に実施することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価の化合物に抗体を曝露する必要がある。この処理の結果、連結性の糖（linking sugar）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖が切断されるが、抗体はインタクトなまま残る。

抗体の糖質部分の酵素的切断は、多様なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。

抗体の別のタイプの共有結合性改変は、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンと、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に示される方法で連結することを含む。例えば抗体の抗原依存性細胞性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を高めるように、本発明の抗体をエフェクター機能に関して改変することも望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。またはもしくは追加的に、Ｆｃ領域にシステイン残基（一つまたは複数）を導入することによりこの領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成させてもよい。このように作製されたホモ二量体性抗体は、改善されたインターナリゼーション能および／または増加した補体介在性細胞殺滅作用および／または抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有しうる（Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5およびShopes B. J Immunol. 1992 May l;148(9):2918-22）。

本発明の抗体の治療用途
本発明者らは、ｍＡｂ２０．１および７．２のようないくつかの抗体がＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化することにより、ガン患者においておよび慢性感染時に観察される免疫抑制メカニズムを克服するために使用することができることを実証した。いくつかの抗体は、ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激するか、またはＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激し；前記抗体は、同じ治療応用に使用することができる。いくつかの抗体は、単球および樹状細胞の生存を増加させ；前記抗体は、同じ治療応用に使用することができる。

本発明は、治療に使用するためのｍＡｂ２０．１もしくは７．２またはその誘導体に関する。本発明は、ガンまたは慢性感染の処置に使用するためのｍＡｂ２０．１もしくは７．２、またはその誘導体に関する。

本発明は、また、ガンまたは慢性感染を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のｍＡｂ２０．１もしくは７．２またはその誘導体を投与するステップを含む方法に関する。

ガンの例には、非限定的に、Ｂ細胞リンパ系新生物、Ｔ細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ−ＮＨＬ、Ｔ−ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ細胞リンパ系新生物および骨髄性細胞系新生物などの血液系腫瘍が挙げられる。

非血液系ガンの例には、非限定的に、結腸ガン、乳ガン、肺ガン、脳ガン、前立腺ガン、頭頸部ガン、膵ガン、膀胱ガン、結腸直腸ガン、骨ガン、子宮頸ガン、肝ガン、口腔ガン、食道ガン、甲状腺ガン、腎ガン、胃ガン、精巣ガンおよび皮膚ガンが挙げられる。

慢性感染の例には、非限定的に、慢性肝炎、肺感染、下気道感染、気管支炎、インフルエンザ、肺炎および性行為感染症などのウイルス、細菌、寄生虫または真菌感染が挙げられる。

ウイルス感染の例には、非限定的に、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連症候群、水痘（varicella）、普通感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、天然痘（variola）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、口蹄疫、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、ムンプス、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル病および黄熱が挙げられる。

細菌感染の例には、非限定的に、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（Whooping Cough）、ペスト、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス、および尿路感染症が挙げられる。

寄生虫感染の例には、非限定的に、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャーガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、フィラリア症、アメーバ感染、ジアルジア症、蟯虫感染、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、およびトリパノソーマ症が挙げられる。真菌感染の例には、非限定的に、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症および足白癬が挙げられる。

ｍＡｂ２０．１もしくは７．２、またはその誘導体は、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンアジュバントとして使用することができる。

本発明は、ｍＡｂ２０．１もしくは７．２、またはその誘導体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンに関する。

本発明は、
ａ）ｍＡｂ２０．１もしくは７．２またはその誘導体；および
ｂ）ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン
を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキットに関する。

キットの２要素は、同時にまたは時間を連続して投与してもよい。

ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンの例には、非限定的に、ＨＩＶおよびＨＢＶなどのウイルス、細菌、寄生虫または真菌感染に対するワクチン、ならびにウイルス関連ガン（例えばＨＰＶもしくはＨＢＶ）に対するワクチン、または例えば黒色腫、白血病、乳ガン、肺ガン患者を処置するために使用される抗ガンワクチンが挙げられる。

さらに、本発明者らは、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗ＣＤ２７７抗体を作製した。これらの抗ＣＤ２７７抗体は、免疫抑制剤として使用することができる。

さらなる一態様では、本発明は、治療に使用するための、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗ＣＤ２７７抗体に関する。特に本発明は、自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病を処置するための、抗ＣＤ２７７抗体、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖に関する。

本発明は、また、自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する治療上有効な量の抗ＣＤ２７７抗体を投与するステップを含む方法に関する。

典型的には、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗ＣＤ２７７抗体は、ｍＡｂ１０３．２またはその誘導体でありうる。

処置されうる自己免疫病の例には、非限定的に、関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊症、混合性結合組織病、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ぶどう膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、スティフ・マン症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。

典型的には、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗ＣＤ２７７抗体は、非限定的に、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン、メトトレキサート、およびシクロホスファミドなどの他の免疫抑制剤および化学療法剤と組合せて使用することができる。

本発明は、また、本発明の抗体を含む薬学的組成物に関する。

したがって、本発明の抗体を、薬学的に許容されうる添加剤、および場合により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組合せて治療用組成物を形成させることができる。

「薬学的な」または「薬学的に許容されうる」は、必要に応じて哺乳類に、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を表す。薬学的に許容されうる担体または添加剤は、無毒の固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、封入物質または任意の種類の製剤佐剤を表す。

薬学的組成物の剤形、投与経路、投薬量および投与方式は、もちろん処置される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに依存する。

本発明の薬学的組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化することができる。

好ましくは、薬学的組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容されうるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌塩類溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化ナトリウムなど、またはそのような塩の混合物）、または場合により無菌水または生理塩類溶液を添加すると注射液の構成が可能になる、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。

投与のために使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に、用いられる投与方式の、関連病態の、またはその代わりに所望の処置期間の関数として、適合させることができる。薬学的組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容されうる担体または水性媒質中に溶解または分散させてもよい。注射用途に適した薬学的剤形には、無菌水剤または無菌水性分散剤；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または無菌注射用分散剤の即時調製用の無菌散剤が挙げられる。全ての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射器で取扱い可能な（syringability）ように液体でなければならない。その剤形は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

遊離塩基または薬理学的に許容されうる塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水に入れて調製することができる。分散液剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物に入れて、ならびに油に入れて調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための保存料を含有する。

本発明の抗体は、中性形態または塩形態で製剤化して組成物にすることができる。薬学的に許容されうる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）および例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。

担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。

妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合、必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。

微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤（isotonic agent）、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。

注射用組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物に入れて使用することによりもたらすことができる。

無菌注射用溶液は、適切な溶媒中に上に挙げた様々な他の成分と共に必要量の活性化合物を組入れ、続いて濾過滅菌することにより調製される。

一般に分散剤は、塩基性分散媒および上に挙げた成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに様々な無菌活性成分を混込むことにより調製される。無菌注射液調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め無菌濾過されたその溶液からもたらす減圧乾燥技法および凍結乾燥技法である。

溶媒としてのＤＭＳＯの使用が極めて迅速な透過を招き、小さな腫瘍領域に高濃度の活性薬剤を送達する、より大きく濃縮または高濃縮された直接注射液を調製することも考慮されている。

液剤は、製剤化されるとその投薬剤形に適合するように治療上有効な量で投与される。それらの製剤は、上記種類の注射液などの多様な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。

水溶液で非経口投与するために、例えば、その液剤は必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤を最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張にすべきである。

これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関連して、採用できる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下注入液１０００mlに加えるか、または提案された注入部位に注射することができよう（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, p.1035-1038およびp.1570-1580参照）。処置される対象の状態に応じて、投薬量のいくらかの変更が必然的に起こる。いずれにせよ投与の責任者が、個別の対象に適した用量を決定する。

本発明の抗体は、１回あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０もしくは約１０ミリグラム程度を含むように治療用混合物内に製剤化することができる。複数回投与することもできる。静脈内注射または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容されうる剤形には、例えば経口投与用の錠剤または他の固形剤；徐放カプセル（time release capsule）;および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。

ある態様では、ホスト細胞に抗体を導入するために、リポソームおよび／またはナノパーティクルの使用が考えられている。リポソームおよび／またはナノパーティクルの形成および使用は、当業者に公知である。

ナノカプセル剤は、一般に、安定で再現可能な方法で化合物を捕捉することができる。細胞内のポリマー過負荷による副作用を回避するために、そのような超微細粒子（粒子径約０．１μm）は、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの要件に合致する生分解性ポリアルキル−シアノアクリレート性ナノパーティクルが、本発明での使用のために考えられており、そのような粒子は容易に製造することができる。

水性媒質中に分散され、多重膜同心性二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然に形成するリン脂質から、リポソームは形成される。ＭＬＶは、一般に直径２５nm〜４μmを有する。ＭＬＶの超音波処理の結果、コアに水溶液を含有する直径２００〜５００Ａの範囲の小型単膜小胞（ＳＵＶ）が形成する。リポソームの物理的性質は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。

さらに、本発明を以下の図面および実施例の点から例示する。

ＢＴ３レセプターが単球およびｉＤＣ表面上に構成的に発現されることを示す図である。新たに単離された単球およびｉＤＣ上での発現を、どちらにもクローン２０．１抗ＢＴ３ｍＡｂを用いて示す。示した実験は、被験ドナー５人を代表するものである（５回の実験の間での蛍光変化の強度は＜２％であった）。 ＢＴ３の結合は、単球およびｉＤＣについて生存シグナルを与えることを示す図である。新鮮単離された単球（上の列）およびｉＤＣ（下の列）を、表示のようにプラスチックにコーティングされたｍＡｂ（抗ＣＤ１９および抗ＢＴ３）または２０ng/ml ＧＭ−ＣＳＦで刺激した。７２時間刺激後に、細胞を採集し、アポトーシス細胞のマーカーとしてのアネキシンＶの結合について分析した。隅の数字は、アネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージに対応する。示したデータは、５回の独立した実験を代表するものである。 ＢＴ３の結合は、単球表面上での共刺激分子の発現を増加させることを示す図である。 ＢＴ３の結合は、ｉＤＣ表面上での共刺激分子の発現を増加させることを示す図である。 ＣＤ２７７活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＡＫＴリン酸化およびＥＲＫリン酸化のレギュレーションを示す図である。健康なドナー４人からの解凍ＰＢＭＣから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗体をコーティングされたエポキシdynabeads（１μg/ml抗ＣＤ３および多様な濃度の抗ＣＤ２７７．２０．１クローンまたはＩｇＧ１（アイソタイプ対照））で刺激する、または刺激しない。２、５、１０および３０分毎に、ＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＡＫＴおよびＢ、ＥＲＫの細胞内リン酸化をフローサイトメトリーにより測定する。データは、４回の独立した試験を代表するものである。結果は、２〜３０分間処理後の異なる時点でのＣＤ４＋Ｔ細胞上のＭＦＩ（平均蛍光強度発現）として表す。 ＣＤ２７７がＣＤ４＋Ｔ細胞の共刺激分子であることを示す図である。健康なドナー４人からのＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗体をコーティングされたエポキシDynabeads（１μg/ml抗ＣＤ３および２μg/ml抗ＣＤ２８ならびに多様な濃度の抗ＣＤ２７７（２０．１）またはＩｇＧ１（アイソタイプ対照））で刺激した。培養２日目に上清を収集し、ＥＬＩＳＡによるサイトカインアッセイ、すなわちＩＮＦγ、ＩＬ−２およびＩＬ−１０産生アッセイに供した。 リンパ節におけるＣＤ２７７の発現を示す図である。リンパ器官でのＣＤ２７７およびＰＤ１の発現プロファイル。リンパ系組織からの生きたＴ細胞を、抗ＣＤ１４（ＣＤ１４陰性細胞）で鮮明に染色することにより識別する。濾胞性ヘルパーＴ細胞を、ｍＡｂ ＣＤ４、ｍＡｂ ＩＣＯＳおよびｍＡｂ ＣＸＣＲ５で染色することを用いて、さらにゲートを通す。結果をＭＦＩ（平均蛍光強度）により表現する。データは、７回の独立した研究を代表するものである。Ｔ細胞サブセット上でのＣＤ２７７またはＰＤ１の発現の間の差を比較するために、対応のあるMann-Witney検定を用いてｐ値を計算した。＊ｐ＜０．０５；＊＊０．００１＜ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ｐ＞０．０５は示さない。 抗ＣＤ２７７ｍＡｂ２０．１がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のエクスパンションを刺激することを示す図である。Ａ：ex vivoエクスパンション（１５日＋ＩＬ−２）：ＰＢＭＣを２０．１ｍＡｂおよびＩＬ−２で刺激し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞特異的ｍＡｂで染色することによりＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞をモニターした。 抗ＣＤ２７７ｍＡｂ２０．１がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のエクスパンションを刺激することを示す図である。Ｂ：ＣＦＳＥアッセイ（４日＋ＩＬ−２）：ＰＢＭＣを２０．１ｍＡｂおよびＩＬ−２で刺激し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ分析でモニターした。 Ｖγ９Ｖδ２細胞特異的ｍＡｂで染色することにより、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をレギュレーションする活性化ＣＤ２７７ｍＡｂ（２０．１）および阻害性（１０３．２）ＣＤ２７７ｍＡｂをモニターした図である。Ａ：アンタゴニストＣＤ７７ｍＡｂ１０３．２は、Ｖγ９Ｖδ２のホスホ抗原介在性活性化を阻害する。 Ｖγ９Ｖδ２細胞特異的ｍＡｂで染色することにより、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をレギュレーションする活性化ＣＤ２７７ｍＡｂ（２０．１）および阻害性（１０３．２）ＣＤ２７７ｍＡｂをモニターした図である。Ｂ：アンタゴニストＣＤ７７ｍＡｂ１０３．２は、Ｖγ９Ｖδ２のＣＤ３介在性活性化を阻害しない。 Ｖγ９Ｖδ２細胞特異的ｍＡｂで染色することにより、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をレギュレーションする活性化ＣＤ２７７ｍＡｂ（２０．１）および阻害性（１０３．２）ＣＤ２７７ｍＡｂをモニターした図である。Ｃ：ＣＤ６９の発現により判定されるように、１０３．２ＢＴＮ３ ｍＡｂは、Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞のホスホ抗原誘導性活性化を阻害する。 ＣＤ２７７が、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞により仲介される抗腫瘍細胞溶解作用を強化することを示す図である。腫瘍細胞系を２０．１アゴニストｍＡｂ存在下または不在下でＶγ９Ｖδ２と共にインキュベーションした。Ｖγ９Ｖδ２の活性化をＣＤ１０７ａ／ｂ脱顆粒により評価した。

実施例１
材料および方法
細胞培養
血液試料を、職員の中から登録された５人の健康志願者からインフォームドコンセント後に得た。単球を末梢血単核球から分離し、ＭＡＣＳ ＣＤ１４単離キット（Miltenyi Biotech, Auburn, CA USA）を使用して単離した。単球を２００ng/mlリコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦおよび１０ng/mlリコンビナントヒトＩＬ−４（Schering-Plough Research Institute）と共に５日間培養した。これらの細胞を未熟樹状細胞（ｉＤＣ）と名付けた。刺激を達成するために、単球およびｉＤをＴＬＲ４リガンドである１０ng/ml ＬＰＳ、ＴＬＲ７／８リガンドである３０μg/ml Ｒ８４８（Sigma-Aldrich, Milano, Italy）、およびＴＬＲ３リガンドである２．５mg/mlポリ（Ｉ：Ｃ）（Sigma-Aldrich）と共に培養し、４８時間後に採集した。１０％熱不活化ＦＣＳ、５mM Ｌ−グルタミンおよび５０IU/mlペニシリン−ストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ１６４０（以降は完全培地と呼ぶ）中で細胞を培養した。

フローサイトメトリーおよび抗体
刺激前後の単球およびｉＤＣを免疫蛍光フローサイトメトリー（FACScalibur Becton Dickinson, Milano, Italy）により分析して、その活性化状態を検証した。このために、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４（BD Becton Dickinson）、ＢＴ３に特異的なｍＡｂ（クローン２０．１、ＩｇＧ１）およびＢＴ３ Ｆａｂ２を予め選択し、精製し、特徴づけ（Bensussan and Olive, 2005, Compte et al., 2004）、または無関係の分子（抗ＣＤ１９（Becton Dickinson）およびF. Malavasiによって提供された抗ＣＤ３１、クローンＭｏｏｎ−１（両方ともＩｇＧ１））を使用した。全ての利用可能な抗ＢＴ３ ｍＡｂは、おそらくその高い配列相同性が原因で、このファミリーの３メンバー（ＢＴ３．１、ＢＴ３．２、またはＢＴ３．３）を識別することができない（Compte et al., 2004, BensussanおよびOlive, 2005）。痕跡量のエンドトキシンが作用する可能性を遮断するために、細胞を添加する前にさらなる対照としてポリミキシンＢ（１０μg/ml、Sigma-Aldrich）を抗ＢＴ３ ｍＡｂ２０．１に添加した。

ウエスタンブロット分析用のローディング対照として、抗チューブリンｍＡｂ（クローン：６−１１Ｂ−１、ＩｇＧ１（Invitrogen, Milano, Italy））を使用した。

アポトーシスの検出
単球およびｉＤＣを、抗ＢＴ３ ｍＡｂ（クローン２０．１）またはアイソタイプがマッチする無関係のｍＡｂをコーティングされたプラスチック上で培養した。対照として、２０ng/mlリコンビナントヒトＧＭ−ＣＳＦ（Schering-Plough Research Institute）で細胞を刺激した。３日後に、細胞を採集し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Bender MedSystems, Wien, Austria）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

定量ＲＴ−ＰＣＲ
Taqman検出を用いたApplied Biosystems 7900HT Fast Real-time ＰＣＲシステムでｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。簡潔には、標準TRIzol試薬プロトコール（Invitrogen Life Technologies）を使用して、ＴＨＰ−１細胞から総ＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡ ２μgを、オリゴ（ｄＴ）を用いて逆転写した。各ＰＣＲアッセイを、２×TaqManユニバーサルミックス（Applied Biosystems）試薬、２０×プライマーおよび２μl ｃＤＮＡ（総ＲＮＡ４０ngに相当）を含有する反応液２５μl中で行った。熱サイクル条件は、９５℃を１５秒、および６０℃を６０秒であった（４０サイクル）。蛍光の捕捉をABI Prism 7900HTスキャナーで記録し、Ｃｔ（閾値サイクル）を各アッセイについて計算した（Sequence Detection System Software 2.3, Applied Biosystems）。内部対照としてＧＡＰＤＨを使用してデータを基準化する（ΔＣｔ＝Ｃｔ（ターゲット遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ））。より高いΔＣｔは、被分析遺伝子のより低い発現に対応する。ＢＴ３．１、ＢＴ３．２、ＢＴ３．３およびGAPDH TaqMan Gene Expressionアッセイは、Applied Biosystemsから購入した。

統計解析
Studentのｔ検定を用いてGraphPad Prism4ソフトウェア４．０（GraphPad Software Inc., CA, USA）により統計解析を行った。サイトカイン産生を評価するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）でデータを解析した。アポトーシス誘導を評価するために、ノンパラメトリック検定でデータを解析した。有意水準をＰ＜０．０５に設定した。

結果
ＢＴ３レセプターは単球およびｉＤＣの表面上に構成性発現される。
ＢＴ３の発現を検討するために、本発明者らは、健康なドナーのパネルを選択して単球およびｉＤＣを得る。新鮮単離された単球およびｉＤＣ上のＢＴ３発現を、クローン２０．１抗ＢＴ３ ｍＡｂを用いて評価した（図１Ａ）。図１Ａに、新鮮単離された単球およびｉＤＣ上のＢＴ３発現を、クローン２０．１抗ＢＴ３ｍＡｂを用いて示す。単球からＤＣへの分化は、細胞表面マーカーの発現により検証した。未熟および成熟ＤＣの両方でＣＤ１４はダウンレギュレーションされ、低いままであり、一方でＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲはアップレギュレーションされた（データは示さず）。示した実験は、異なるドナーに関する５回を代表するものである。ＢＴ３の発現レベルは、単球の方がわずかに高かった。加えて本発明者らは、それぞれＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＴＬＲ７／８のリガンドであるＬＰＳ、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＲ８４８でこれらの細胞を刺激した後のＢＴ３の発現を分析した。ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）を介した活性化は、ＢＴ３の表面発現を有意には変えなかった（データは示さず）。本発明者らは、ＢＴ３レセプターが単球およびｉＤＣの活性化状態に依存せずにそれらの細胞の表面に構成性発現されると導き出すことができる。

最終的に、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＢＴ３ファミリーの三つのレセプター全てがＴＨＰ−１細胞により発現されることを示す免疫表現型の結果を確認した。詳細には、本発明者らは、最も代表的なＢＴ３としてＢＴ３．２を見出した（ＢＴ３．１およびＢＴ３．３の１０倍のＢＴ３．２）（データは示さず）。

ＢＴ３の結合は培養された単球およびｉＤＣに対する生存シグナルを与える。
ＢＴ３は安定発現されるレセプターファミリーであるので、本発明者らは、ＢＴ３の結合が、生存因子（すなわち血清を有する完全培地）の不在下で７２時間培養されたex vivo単球およびｉＤＣの寿命を改変する能力について検討した。ｍＡｂでコーティングされたプラスチックによる細胞刺激を用いて、単球およびｉＤＣの表面のＢＴ３を結合させた。ＢＴ３特異的ｍＡｂで処理された単球の約７７．９８％が内因性生存因子の不在下で３日間生存した（５１．１３〜７７．９８％の範囲、ｐ＝０．００４０）（図１Ｂ上列に、５回からの代表となる一実験を示す）。この作用は、ＧＭ−ＣＳＦ処理により得られた効果よりもやや低かった（８１．２２％、６０．４１〜８３％の範囲、ｐ＝０．０２７８）。対照培養では、すなわちプラスチックにコーティングされた無関係のｍＡｂ（抗ＣＤ１９ｍＡｂ）の存在下で、生存効果は最小限であり、非常に高い比率のアポトーシス単球（アネキシンＶ陽性細胞）が観察された（培地単独中に約９５．４８％、無関係のｍＡｂがコーティングされたプラスチック条件で約８８．７９％のアポトーシス細胞が測定され、生存範囲は、それぞれ０．８〜１１．７４％および１．０８〜１１．２１％であった。ｐは特定せず（Ｎ．Ｓ．））。ｉＤＣの生存に対する作用を分析することにより類似の結果を得た（図１Ｂ下列に、５回からの代表となる一実験を示す）。ＢＴ３によるｉＤＣの活性化は、７２時間の培養時間中にｉＤＣのアポトーシスを部分的に阻害することができた（健康な生きた細胞５６．７５％に対して生存ＧＭ−ＣＳＦ処理では８５．９７％、それぞれ範囲５３．１３〜６０．７１％、ｐ＝０．０００４４、および７１．０１〜８５．９７％、ｐ＝０．００４０）。無関係な、アイソタイプがマッチしたｍＡｂは、ＤＣの自然アポトーシスを変化させなかった（５回からの代表となる一実験の培地単独と抗ＣＤ１９ｍＡｂ条件を比較すると、生存細胞の範囲はそれぞれ０．８〜２４．１２％および０．９〜２６．９７％、ｐ＝０．３４５２）。全体として、これらの結果から、ＢＴ３レセプターが、アポトーシスを軽減することにより単球およびｉＤＣの生存を促進することができ、細胞応答の持続時間を延長することができることが示唆される。両方の細胞タイプについて、抗ＢＴ３ｍＡｂ後と、アイソタイプがマッチする対照ｍＡｂ後の生存の差は、統計的に有意であった（ＧＭ−ＣＳＦ処理と同様）。加えて、単球およびｉＤＣの両方の生存に対する抗ＢＴ３ ｍＡｂの用量反応作用が明らかである（データは示さず）。良好な生存能を促進できる最低濃度の抗ＢＴ ｍＡｂ希釈は１０μｇ／ｍｌであった。

ＢＴ３の結合は、単球およびｉＤＣの表面上の共刺激分子発現を増加させる。
一次炎症応答に果たすＢＴ３の役割を検討するために、新鮮単離された血液単球および単球由来樹状細胞を、組織培養プレート上にコーティングされたｍＡｂにより、または単球および樹状細胞を刺激することが知られているＴＬＲリガンド（ＬＰＳ）により刺激した。２４時間刺激後に、細胞表面共刺激分子ＣＤ８６のアップレギュレーションにより示されるように、コーティングされた抗ＢＴ３ｍＡｂは、単球の活性化をトリガーすることができた（図１Ｃ）。アイソタイプがマッチする対照ｍＡｂ（その抗原はこれらの細胞上には発現されない）は、有意な作用を有さなかった。したがって、抗ＢＴ３．１ｍＡｂを使用して観察された活性化は特異的であり、ＦｃＲの結合が原因ではなかった。未コーティングの（可溶性）抗ＢＴ３ｍＡｂでは作用が観察されなかったので、細胞活性化にクロスリンクが必要であった（データは示さず）。加えて、抗ＢＴ３ｍＡｂの活性化作用が、ポリミキシンＢ存在下で保たれたことから、痕跡レベルのエンドトキシンの役割は除外された。

興味深いことに、ＢＴ３刺激時のＣＤ８６のアップレギュレーションは、ＴＬＲリガンドであるＬＰＳを用いて観察されたものに類似していた。ＢＴ３の刺激は、単球表面でのＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ分子のアップレギュレーションもトリガーした（図１Ｃ）。これに一致して、本発明者らはｉＤＣ上でのＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現増加を見出した（図１Ｄ）。加えて、抗ＢＴ３Ｆａｂ ｍＡｂを用いて類似の結果が得られた（それぞれ単球およびＤＣに関する図１Ｃおよび１Ｄから示すことができる）。これらの結果から、本発明者らは、ＦｃＲを介したシグナルが細胞活性化の原因となり得ないということを除外することができる。無関係のｍＡｂ（抗ＣＤ１９）は陰性対照であり、一方でＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳを介した刺激は陽性対照であった。

実施例２
材料および方法
細胞の調製
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、「Etablissement Francais du Sang」(EFS-Marseille-France）により提供された健康志願者ドナーから得て、Lymphoprep（著作権）（Abcys）の密度勾配による分画により単離した。Miltenyi Biotec（登録商標）製のＴ細胞単離キットＩＩを使用して磁気ビーズで非ＣＤ４^＋Ｔ細胞を枯渇させることにより、単離されたＰＢＭＣからヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を負選択した。純度が９０％を上回った場合、単離されたＣＤ４細胞をさらなる実験に使用した。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製
マウス抗ヒトＰＤ−１（programmed death-1）ｍＡｂおよびマウス抗ヒトＣＤ２７７の三つの異なるクローンを本発明者らの研究室で腹水から精製した：抗ＰＤ−１（ＩｇＧ１アイソタイプのクローンＰＤ１ ３．１）（ghiotto et al. Int Immunol., 2010）、抗ＣＤ２７７（ＩｇＧ２ａアイソタイプのクローン１０３．２、共にＩｇＧ１アイソタイプのクローン２０．１および７．２）（compte et al.）。市販のキット（Invitrogen, Eugene, OR）を使用して、抗ＣＤ２７７（クローン２０．１）ｍＡｂをAlexa Fluor 647でラベル化した。

Ｔ細胞亜集団上のＣＤ２７７の発現プロファイル
４人の健康なドナーからの解凍ヒトＰＢＭＣを細胞百万個につき以下のマウス抗ヒトモノクローナル抗体５μlで染色した：ＥＣＤ結合型抗ＣＤ３、ＰＣ５結合型抗ＣＤ１４、ＰＣ５結合型ＣＤ１９（ＣＤ３^＋ＣＤ１４⁻ＣＤ１９⁻細胞を選択するため）（全てBeckman Coulter, Marseilles, France製）、パシフィックブルー結合型抗ＣＤ４、Ａｌｅｘａ７００結合型抗ＣＤ８（全てBD Pharmingen（San Diego, USA）製）、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ７５０結合型抗ＣＤ２７（Caltag, Invitrogen, USA製）、ＰＣ７結合型抗ＣＤ４５ＲＡ（BD Biosciences製）、Ａｌｅｘａ６４７結合型抗ＣＤ２７７（クローン２０．１、自家製）。ＡＰＣ結合型ＩｇＧ１（Beckman Coulter）を対照として使用し、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitを生存率のために使用した。細胞を４℃で２０分間インキュベーションし、次にリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ、Lonza）中で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を用いてデータを解析した。

ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞上でのＣＤ２７７の発現プロファイルの動態
予めマウス抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８がプレートに固定化されているか、または固定化されていない（未刺激）平底９６ウェルプレート（Microtest（商標）96, Becton Dickinson)に入れたＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ中で、解凍ヒトＰＢＭＣから精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞（細胞２００×１０^３個／ウェル）を９６時間培養した。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、自家製）をそれぞれ０．３μg/mlおよび１０μg/mlで使用した。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃にて５％ＣＯ_２雰囲気中に置いた。２４時間毎に細胞を円錐底９６ウェルプレート（Nunc（商標）, Denmark）に移し、以下のｍＡｂ、すなわち精製抗ＰＤ−１（クローンＰＤ−１ ３．１、自家製）（giotto et al, int immunol. 2010）３μlを用いて４℃で３０分間染色した。ＰＢＳ−０．２％ＦＢＳ−０．０２％アジド中で３回洗浄し、次にＰＥ結合型ヤギ抗マウス（１／８０、Beckman Coulter）で染色し、洗浄し、以下のｍＡｂ、すなわちＰＣ７結合型抗ＣＤ４、ＦＩＴＣ結合型抗ＣＤ３（全てBD Biosciences製）、Alexa647結合型抗ＣＤ２７７各３μlおよび７−ＡＡＤ（BD Biosciences）６μlで４℃にて３０分間染色した。精製ＩｇＧ１またはＡＰＣ結合型ＩｇＧ１を対照として使用した。免疫染色された細胞試料を２％パラホルムアルデヒドで固定したものをBD FACS Canto（BD Bioscience）で分析した。FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を使用してデータを解析した。

リンパ節でのＣＤ２７７発現
インフォームドコンセントを行った７人の患者から、リンパ節から掻き裂いた細胞を収集した。ＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ中で新鮮組織試料を押しつぶすことにより単核球を得た。濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦ_Ｈ）の検出は、ＰＥ結合型抗ＩＣＯＳ、ビオチン化抗ＣＸＣＲ５（全てBD Biosciences製）、ＰＣ５結合型抗ＣＤ１４、パシフィックブルー結合型抗ＣＤ４（全てBeckman Coulter製）およびLIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit（著作権）と共に４℃で２０分間インキュベーションすることにより行った。次に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、抗ビオチン−アロフィコシアニン−Alexa Fluor750（Invitrogen, Carlsbad, CA）と共に４℃で２０分間インキュベーションした。染色後、各細胞調製物をＰＢＳ中で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を使用してデータを解析した。

ＮＫ細胞上のＣＤ２７７の発現プロファイル
健康なヒトＰＢＭＣから解凍生存ＮＫ細胞（Live dead（著作権）陰性細胞）を、抗ＣＤ２７７−Alexa647（クローン２０．１）と共に４℃で２０分間インキュベーション後に、ＣＤ５６＋ＣＤ３−の発現に基づき選択した。さらに、細胞をＰＢＳ（ＰＢＳ、Lonza）中で２回洗浄し、次に２％ホルムアルデヒドで固定し、FACSAria（著作権）フローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland）を使用してデータを解析した。

プレートに固定化されたｍＡｂを用いたＣＤ４＋Ｔ細胞に関する機能アッセイ
解凍されたヒトＰＢＭＣから精製されたＣＤ４^＋Ｔ細胞（細胞２００×１０^３個／ウェル）を、予めプレートに固定化されたマウス抗ヒトＣＤ３（クローンＫＴ３）／ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２７７（クローン２０．１）または抗ＣＤ３／アイソタイプ対照（ＩｇＧ１）と共に、平底９６ウェルプレート（Microtest（商標）96, BD）に入れたＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ中で培養した。精製された抗ＣＤ３を０．３μg/mlで使用した。抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２７７およびアイソタイプ対照を１０μg/mlで使用した。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃にて５％ＣＯ_２雰囲気中に置いた。２日間培養後に、サイトカイン産生（インターロイキン−２、ＩＬ−２およびインターフェロンγ、ＩＦＮ−γ）を、製造業者のプロトコールに従いＥＬＩＳＡアッセイ（ＯｐｔＥＩＡ、ヒトＩＦＮ−γまたはＩＬ−２セット、BD Pharmingen）により測定した。５日後に、ＰＥ結合型抗ＣＤ２５（BD Biosciences）３μl、および７−ＡＡＤ ５μlを用いて細胞を４℃で３０分間染色し、次にＰＢＳ中で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、BD FACS Canto（BD Bioscience）で分析した。FlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を使用してデータを解析した。

ａＡＰＣおよびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルジエステル（ＣＦＳＥ）ラベル化を用いたＣＤ４＋Ｔ細胞に関する機能アッセイ
ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用してＰＢＭＣからの負選択により、製造業者のプロトコールに従って精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は日常的に９７％を超える純度であった。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞を０．５μM ＣＦＳＥ（Invitrogen）で３７℃にて１０分間ラベル化し、洗浄し、磁気ビーズから成るａＡＰＣで、１：１（細胞対ビーズ）の比で、９６ウェル丸底プレート（Falcon;BD Biosciences）中で三つ組にして刺激した（細胞１．５×１０^５個／ウェル）。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベーションし、次にＣＦＳＥラベル化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリー（FACS Canto, Beckman Coulter）により測定した。

ＮＫ細胞の細胞溶解活性に関する機能アッセイ
新鮮なＮＫをEasy Sep（登録商標）負選択キットで分取し、最適以下の濃度のＩＬ−２（１００U/ml）およびＩＬ−１５（１０ng/ml）を加えて完全培地中で一晩インキュベーションした。ＮＫ細胞レセプターの機能を、ＦｃγＲ陽性Ｐ８１５肥満細胞腫マウス細胞系での再方向付け（re-directed）細胞溶解実験で試験した。簡潔には、関心が持たれるｍＡｂ（無関係なマウスＩｇＧ１：１１μg/ml、抗ＮＫｐ４６：１μg/ml、抗ＤＮＡＭ：５μg/ml、抗ＣＤ２７７ ２０．１：１０μg/ml）を３０分間予備コーティングされたＰ８１５細胞と共にエフェクター細胞を１：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ／Ｔ）比でインキュベーションした。細胞毒性試験は、GolgiStop（登録商標）および可溶性ＣＤ１０７（ａおよびｂ）−ＦＩＴＣ（両方ともBD Biosciences製）の存在下の４時間アッセイで行った。その後、細胞を表面マーカー（ＣＤ５６−ＰｅＣｙ７（Beckman Coulter, Immunotech））について染色し、固定し、透過性にし（Cytofix/Cytoperm（登録商標））、次に細胞内ｍＡｂ（ＩＦＮ−γ（Beckman Coulter, Immunotech））で染色した。細胞を最終的にＰＢＳ−２％パラホルムアルデヒド中に再懸濁し、BD FACS Canto（登録商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）で即座に分析した。ＮＫ細胞の活性化度は、ＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂについて陽性の細胞（脱顆粒）のパーセンテージならびに／または炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ）の産生に基づき測定した。

人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）
Serriariら（serriari, ji 2010）に記載されたように、以下のｍＡｂを磁気ビーズ（Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech）にコーティングした：抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ヒトＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、および／または多様な濃度の抗ヒトＣＤ２７７（ＣＤ２７７、２０．１）もしくはＩｇＧ１もしくは抗ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）（ＹＪ４）もしくはＩｇＧ１。これらのａＡＰＣに、最適以下の抗ＣＤ３Ａｂ（５％）、最適以下のレベルの抗ＣＤ２８Ａｂ（１０％）と、ビーズに添加されたタンパク質の残りの８５％を構成するＩｇＧ１Ａｂ（ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩｇＧ１）、抗ＣＤ２７７Ａｂ（ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２７７＋ＩｇＧ１）または抗ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ３／２８／抗ＭＨＣクラスＩ＋ＩｇＧ１）のいずれかとをコーティングした。対照ＩｇＧ１の添加によりタンパク質の量を２０mg/mlに一定に保った。

サイトカイン分析用のＥＬＩＳＡ
サイトカインの産生を判定するために、無細胞上清を４８時間目に収集し、OptEIAキット（BD Pharmingen)を製造業者の説明書に従って使用するＥＬＩＳＡによりＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについてアッセイした。

免疫組織化学
ＣＤ２７７の免疫染色は、前記のように反応性リンパ節の全凍結切片に関して行った（２５）。ＣＤ２７７．２０．１ｍＡｂについての最終希釈は１／８００であった。陰性対照試料は、一次ｍＡｂを取り除くことにより調製した。

健康対象からのＰＢＭＣにおける異なるｂｎｔ３ａアイソフォーム転写物のスクリーニング
精製されたＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、γδ細胞およびＮＫ細胞の公的および私的Affymetrix U133+2データセットを収集した。ＣＤ８およびＣＤ４のデータを公的ＧＥＯデータセットから検索し（Sharp et al.）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）、ＮＫおよびγδセットは私的であった。本発明者らは、正規化パラメーターとしてノンパラメトリッククオンタイルアルゴリズムを備えるRobust Multichip Average（ＲＭＡ）を使用した。様々なシリーズから収集した生データにＲＭＡを適用した。Bioconductorおよび関連パッケージを使用して、クオンタイル正規化およびLoess補正をＲで行った。三つのアイソフォームのＢＴＮ３Ａに対応するプローブセットを正規化データセットから検索し、対応する対数値をグラフ表示用に線形化した。本発明者らは、ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２およびＢＴＮ３Ａ３アイソフォームに対応するそれぞれのAffymetrixプローブセット２０１６２３＿ｓ＿ａｔ、２１３２８２＿ａｔ、２０４１７１＿ａｔを使用した。

刺激、ホスホフロー（phosphoflow）およびＦＡＣＳ染色
ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を製造業者のプロトコールに従って使用してＰＢＭＣからの負選択により精製した。ＣＤ４ Ｔ細胞は日常的に９７％を超える純度であった。細胞をＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ中で３７℃にて２４時間インキュベーションした。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞を洗浄し、以下のｍＡｂで、すなわち抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ヒトＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、および／または様々な濃度の抗ヒトＣＤ２７７（ＣＤ２７７．２０．１クローン）またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１でコーティングされた磁気ビーズ（Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal Biotech）から構成されるａＡＰＣで、それらの細胞を異なる時点（２、５、１０および３０分）に１：３（細胞対ビーズ）の比で刺激した。これらのａＡＰＣには、最適以下の抗ＣＤ３Ａｂ（５％）、最適以下のレベルの抗ＣＤ２８Ａｂ（１０％）と、ビーズに加えられたタンパク質の残りの８５％を構成するＩｇＧ１Ａｂ（ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩｇＧ１）、抗ＣＤ２７７．２０．１Ａｂ（ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２７７．２０．１＋ＩｇＧ１）のいずれかとがコーティングされていた。タンパク質の量は、対照ＩｇＧ１の添加により２０mg/mlに一定に保った。

本発明者らは、状態特異的抗体を使用し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により標的リン酸化タンパク質を検出する。ホスホフロープロテオミック法［２７］によるＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対するｍＡｂ ＣＤ２７クローンの関与の効果を試験した。本発明者らは、細胞をビーズの刺激に曝露した後にシグナル伝達経路の活性を評定した。本発明者らは、ビオチン結合型二次抗体の適用に続いて蛍光結合型ストレプトアビジンを用いた検出を伴うサンドイッチラベル化法を適用する。本発明者らは、異なる用量のＣＤ２７７ｍＡｂを有するビーズを用いて異なる４時点（２、５、１０および３０分）に刺激後に、ＳＥＲ４７３でのＡＫＴおよびｐ４４／４２ ＭＡＰＫのＴ（２０２／ｙ２０４）でのＥＲＫのリン酸化を測定することにより、ＰＩ３Ｋ経路の活性を実証した。細胞を透過性にし、固定し、ターゲットリンタンパク質（ＡＫＴおよびＥＲＫ）の細胞内染色後に、cytofix/cytopermキットおよびperm/wash緩衝液（BD Biosciences）を使用して分析した。

ＦＡＣＳのデータは、Divaソフトウェアを用いてFACSCantoフローサイトメーター（BD Biosciences）で取得した。ＦＡＣＳのデータは、Flowjoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）を使用して分析した。

統計解析
全てのデータは、GraphPad Prismバージョン５．００（GraphPad, San Diego, CA）およびマイクロソフト社エクセル（microsoft office）を使用して解析した。Mann-Whitney検定マッチドノンパラメトリック検定を用いて、リンパ系組織由来の生存Ｔリンパ球サブセット上のＣＤ２７７およびＰＤ−１発現の変動（図３）、ＣＤ２７７を刺激されたＴリンパ細胞上のＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化の変動（図４〜５）、ならびにＴ細胞でのサイトカイン分泌の差（図６）を検討した。異なる刺激条件の間で比較を行った。対応のあるWilcoxon検定を用いて、ＮＫ細胞への異なる刺激条件の間で比較した（図７）。ｐ＜０．０５の場合に差を統計的に有意と見なした。

結果
Ｔ細胞亜集団およびＮＫ細胞上のＣＤ２７７の発現プロファイル
本発明者らは、以前に、ＣＤ２７７がＴ細胞およびＮＫ細胞上に発現されることを報告した（compte et al）。本発明者らは、健康なドナー（ｎ＝４）からの公知の末梢リンパ球亜集団上でのＣＤ２７７の発現を検討することを決意した。したがって、本発明者らは、多パラメーター−フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋亜集団およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋亜集団を分析した（データは示さず）。モノクローナル抗ＣＤ２７７を用いた染色（データは示さず）から、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞上および細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞上の両方でＣＤ２７７の強い発現が明らかとなった（データは示さず）。本発明者らは、ＣＤ２７およびＣＤ４５ＲＡの発現のディファレンシャルな発現に基づき、Ｔリンパ球のメモリー集団およびナイーブ集団上でのＣＤ２７７の発現も調べた（データは示さず）。ここでもまた、本発明者らは、サブセット間に有意差を全く検出しなかった（データは示さず）。

同時に本発明者らは、自然免疫系に属する別のリンパ球集団であるＮＫ上でのＣＤ２７７の発現をモニターした（データは示さず）。本発明者らは、ＮＫ細胞の１００％が、そのＣＤ５６^{Ｂｒｉｇｈｔ}（ヘルパー）表現型またはＣＤ５６^Ｄｉｍ（細胞傷害性）表現型とは無関係に高レベルのＣＤ２７７も発現したことを見出したが、これはＢ７／ＣＤ２８ファミリーに関連する分子がＮＫ細胞の二つの主要亜集団上に同様に見出されることを示している。

活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ２７７のモデュレーション
共レギュレーション分子であるＰＤ１の誘導のように、いくつかのＴ細胞共シグナル伝達分子の発現が、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化後にレギュレーションされうることから、本発明者らは、ＣＤ２７７も活性化条件下でモデュレーションされる可能性があるか疑問に思っていた。この仮説を検証するために、本発明者らは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８活性化条件下でＣＤ２７７およびＰＤ１の発現プロファイルを比較した。

したがって、４人の健康なドナー由来の精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体と共に、またはそれぞれの対照アイソタイプと共に２４〜９６時間インキュベーションした。予想通り、ＣＤ３／ＣＤ２８処理の結果、培養７２時間後にＰＤ１の発現が７倍に増加したが、ＣＤ２７７の発現はどの時点でも変化しなかった（データは示さず）。ＣＤ８ Ｔ細胞でも同様の結果を得た（データは示さず）。

同時に、本発明者らは、ＣＤ２７７の発現がＮＫ細胞上でモデュレーションされる可能性があるか疑問に思っていた。したがって、本発明者らは、通常のＮＫ細胞刺激サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５）でＮＫ細胞を刺激した。本発明者らは、ＣＤ２７７およびＨＶＥＭの発現プロファイルを比較した。ＨＶＥＭは、ＮＫ細胞上に高度に発現され、ＮＫ細胞を刺激すると減少した。本発明者らの結果から、陽性対照であるＨＶＥＭとは逆に、ＣＤ２７７の発現がＮＫ細胞活性化後にモデュレーションされなかったことが示された（データは示さず）。

まとめると、これらの結果から、Ｔ細胞およびＮＫ細胞がＣＤ２７７を構成性発現するが、その発現はＴ細胞またはＮＫ細胞の共刺激後にin vitroでモデュレーションされないことが実証された。

リンパ節におけるＣＤ４ Ｔ_ＦＨ細胞上のＣＤ２７７の発現プロファイル
複数の免疫Ｔ細胞集団がリンパ器官から見出され、それらは専門化された機能を果たす。それらのうち、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔ_ＦＨ）は胚中心に存在し、Ｂ細胞の分化に重要な役割を果たす。これらの細胞は、ケモカインレセプターＣＸＣＲ５および高レベルの共シグナル伝達分子ＩＣＳＯだけでなく、ＰＤ−１およびＢＴＬＡも発現する。ＣＤ２７７の発現は、リンパ節においてディファレンシャルにレギュレーションされている可能性がある（図４）。

反応性リンパ節の総凍結切片もＣＤ２７７について免疫染色した。免疫組織化学分析の結果から、濾胞内Ｔ細胞領域およびマントルゾーンＢ細胞の両方に強い陽性が示され、これはＴ細胞およびＢ細胞上で結果が陽性であったことを示している。驚くことに、染色パターンは胚中心で全く異なった。ＧＣの大部分は陰性であり、分化過程の間にＢ細胞がＣＤ２７７の発現を失ったことを示していた。しかし、少数の分散した細胞はＴ_ＦＨ染色に類似した染色性であった。本発明者らは、フローサイトメトリー分析を行った後にこのことを確認した。Ｔ_ＦＨ細胞（ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋ＰＤ−１＋）はＣＤ２７７について陽性であって、加えてＣＤ２７７は、ＣＸＣＲ５−従来型Ｔ細胞上に等しく存在したが、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞または細胞に有意な染色は存在しない（データは示さず）。

この研究第一部の結論は、ＣＤ２７７が末梢血およびリンパ節中のＴリンパ球の全てのサブタイプならびにＮＫ細胞上に発現しているが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーの分子、またはリンパ球のレギュレーションに関与する他の任意の分子の場合でしばしば見られるように、その発現は刺激条件下でモデュレーションされないということである。

ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上へのＣＤ２７７結合後に増強する
リンパ球の機能に及ぼすＣＤ２７７の共刺激的な役割を検討するために、本発明者らは、ＣＤ２７７のトリガリングが、リンパ球シグナル伝達経路の二つの最も重要なキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼＥＲＫおよびセリントレオニンキナーゼＡＫＴのリン酸化を誘導できるかどうかを調査した。ＡｋｔおよびＥＲＫのシグナル伝達が増殖、タンパク質合成およびアポトーシスのレギュレーションなどのＴ細胞機能に中心的な役割を果たすことが分かっている。

第一に、本発明者らは、ＣＤ２７７ ２０．１のトリガーがＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を誘導したことを示し（図２）、ＣＤ２７７の刺激がＴ細胞活性化のレギュレーションに関与することを実証した（精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｍＡｂ抗ＣＤ３およびｍＡｂ抗ＣＤ２７７．２０．１を用いる抗体コーティング済みエポキシdynabeadsで刺激した）。

第二に、ＴＣＲシグナル伝達経路の共モデュレーターとしてのＣＤ２７７の意味を明らかにするために、本発明者らは、異なる時点（２、５、１０および３０分）で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８と一緒に、様々な濃度のＣＤ２７７．２０．１クローンに対するｍＡｂまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ１で精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。本発明者らは、ＣＤ２７７とｍＡｂ ＣＤ２７７．２０．１クローンとのクロスリンクが、ＣＤ３＋ＣＤ２８の刺激により誘導されるＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を強力にアップレギュレーションしたことを観察した。この作用は、用量および時間に依存した（データは示さず）。

したがって、本発明者らは、本出願のこの部分においてＣＤ２７７のトリガーがＴＣＲシグナルを強化することを実証した。本発明者らは、次に、このシグナル伝達経路活性化の機能的帰結を検討することを決意した。

ＣＤ２７７はＣＤ３シグナルを共刺激する
本発明者らは、次に、ＣＤ２７７の結合がＣＤ３介在性シグナルにより仲介されるサイトカイン産生および活性化マーカーのレギュレーションに及ぼす作用を検討した。少なくとも４人の健康なドナー由来の精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２７７（クローン２０．１）または抗ＣＤ３／ＩｇＧ１（対照条件）と共に２４〜７２時間培養した。２４時間培養後に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより測定した。予想通り、これらの二つのサイトカインは、対照条件との比較によりＣＤ３／ＣＤ２８刺激後に大量に産生された（ｐ＝０．００７９、ｐ＝０．０３１７、データは示さず）。ＣＤ３／ＣＤ２７７で共活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞により産生されたＩＬ−２レベルは、ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激で得られたレベルよりも低かったが、それにもかかわらずＣＤ３／ＣＤ２７７共活性化により誘導されたＩＬ−２の量は、ＩｇＧ対照での量よりも有意に高かった（ｐ＝０．０１５９、データは示さず）。さらに、ＩＦＮ−γの分泌は、対照刺激よりもＣＤ３／ＣＤ２７７共活性化により強く高まり、驚くことにその産生は、ＣＤ３／ＣＤ２８共活性化後に得られた産生よりもなお大きかった（データは示さず）。さらに、３日間培養後に、ＣＤ３／ＣＤ２７７共刺激後の活性化マーカーＣＤ２５の発現プロファイルに関して類似の作用が得られた。このＣＤ４^＋Ｔ細胞の共刺激は、ＣＤ２５活性化陽性細胞が４５％に有意に増加することを誘導したが、ＣＤ３／ＣＤ２８の共活性化は、対照条件に比べて活性化ＣＤ２５陽性細胞が２５％に増加することを誘導しただけであった（データは示さず）。

全体的に、これらの結果は、ＣＤ２７７がＴリンパ球の活性化シグナルの共刺激分子であることを強く示唆している。

ＣＤ２７７は、さらにＣＤ３−ＣＤ２８共刺激を高め、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を高める第三のシグナルとして作用することができる
次に、本発明者らは、ＣＤ３＋ＣＤ２８シグナルにより誘導されるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生に与えるＣＤ２７７共シグナルの帰結を検討した。本発明者らは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８と一緒に、様々な濃度のＣＤ２７７に対するｍＡｂで精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激した。本発明者らは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１および抗ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）を添加することによりビーズ上の抗体量を一定に保った。本発明者らは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上へのＣＤ２７７のクロスリンクが、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により仲介されるＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に強く活性化したことを実証した。実際に本発明者らは、サイトソル色素ＣＦＳＥの希釈を測定することによりＣＤ４細胞の増殖を測定した（データは示さず）。本発明者らは、抗ＣＤ３に加えて抗ＣＤ２８およびＩｇＧ１で刺激された細胞の６０％が５日目までに分裂状態に入ったことを見出した。ＣＤ２７７（１７μg/ml）のクロスリンクは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によりすでに誘導されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の分裂を用量依存的に強く高め、例えば９０％の細胞が分裂状態に入った（データは示さず）。

同時に、本発明者らの結果から、ＣＤ２７７の結合が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の刺激により誘導される増殖（データは示さず）およびサイトカイン分泌を用量依存的に増加させたことも示された（図３）。

まとめるとこれらのデータは、ＣＤ２８により提供される最適な共刺激後であってもＣＤ２７７が共刺激分子の役割を果たすことを支持するものである。

ＣＤ２７７はＮＫ細胞の共刺激分子でもあるか？
同時に、本発明者らは、ＮＫ細胞において類似の共刺激作用が得られるかどうかを検討した。したがって本発明者らは、アイソタイプ対照またはＣＤ２７７モノクローナル抗体（２０．１）または抗ＤＮＡＭ（活性化レセプターの共刺激の陽性対照）または抗ＮＫＧ２Ａ（活性化レセプターの共阻害の陽性対照）の存在下で、最も重要なＮＫ細胞レセプターの二つを（抗ＮＫｐ４６または抗ＣＤ１６で）刺激した。第一に、ＣＤ２７７単独はＮＫ細胞の刺激に全く作用を及ぼさなかった。第二に、ＣＤ２７７分子に対するモノクローナルｍＡｂ２０．１は、ＤＮＡＭまたはＮＫＧ２ＡのようなＮＫ細胞活性化に対するどの作用も強化することができなかった。一次刺激（primo-stimulation）がＮＫｐ４６またはＣＤ１６を用いて行われようと、細胞傷害性（データは示さず）およびＩＦＮ−γ分泌（データは示さず）のどちらも影響されなかった。この結果は全く驚くことであったが、Ｔ細胞で観察されたものとは逆に、明らかにＣＤ２７７はＮＫ細胞活性化のレギュレーションに関与しない。

リンパ球により発現されるＢｔｎａアイソフォーム
ＣＤ２７７がＢ３０．２ドメインを有する（ｂｔｎ３ａ１およびｂｔｎ３ａ３）または有さない（ｂｔｎ３ａ２）三つのアイソフォームｂｔｎ３ａ１、ｂｔｎ３ａ２およびｂｔｎ３ａ３を有することを考慮して、本発明者らは、Ｔリンパ球上での各アイソフォームのｍＲＮＡ発現を調べて、各アイソフォームが等モルの発現パターンを有するかどうか決定しようと決意した。GEO omnibusから利用可能なデータを用い、それをさらにＱ−ＰＣＲにより確認して、本発明者らは、ｂｔｎ３ａ１がＴリンパ球により発現される主要形態であるが、デコイ形態（ｂｔｎ３ａ２）がＮＫ細胞上に最も多く発現されることを見出した（データは示さず）。この結果は、４人の健康なドナーに関する定量ＰＣＲで検証した。したがって本発明者らは、ＮＫ細胞のＣＤ２７７刺激に応答した共刺激が不在であることが、この形態のＢＴＮ３Ａに起因しうるという仮説を発表する。

実施例３
材料および方法
抗体およびＦａｂ断片化
抗ＣＤ２７７：抗ＢＴ３−２０．１および１０３．２ｍＡｂを、以前に記載されたように作製および検証した［１０］。抗ＢＴ３−２０．１のＦａｂフラグメントを作製し、Immunopure Fab Preparation Kit（Pierce）を用い製造業者の推奨に従って精製した。タンパク質の純度は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評定した。

系統樹の構築
配列およびアライメントを検索し、系統発生学的再構築を行うために自動ゲノムアノテーションプラットフォームFIGENIX（FIGENIX Annotation Platform: [http://figenix2.up.univmrs.fr/Figenix/index.jsp]）を使用して系統発生解析を行った。使用されたパイプラインに三つの異なる方法の系統樹再構築、すなわち最節約法［３８］、最尤法［３９］および近隣結合法［４０］を適用し、中点を根とする合意樹を構築した。１０００個の複製からブートストラップ法を実施した。各方法についてブートストラップ値を報告する（使用されたパイプラインおよびモデルの詳細な説明については［４１］を参照されたい）。

細胞系およびγδＴ細胞のエクスパンション
Ｐ８１５（マウス肥満細胞腫細胞系）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病細胞系)、ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫細胞系）をＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Eurobio）中で培養した。健康なドナーからのＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳに入れて、５％ＣＯ２中で３７℃にて２４ウェル培養プレート中に１０^６個/mlとなるように配分した。ポリクローナルＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を３μmol/l Phosphostim（ＢｒＨＰＰ分子、Innate Pharma, Marseille, France）および１００U/ml ＩＬ−２（Chiron, Basel, Switzerland）と共に１２日間特異的にエクスパンションさせた。Phosphostimは培養の開始時に１回添加した。２日毎に、培地体積の２分の１を、１００U/ml ＩＬ−２を含有する新鮮培地に交換した。

最終日に、γδＴ細胞のパーセンテージを、抗Ｖｄ２ ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３−Ｃｙ７を使用して評価した。γδＴ細胞が９０％超に達した細胞培養物だけを選択して機能試験に使用した。

フローサイトメトリー
エクスパンション後の純度試験におけるγδＴ細胞ラベル化のために、本発明者らは抗ＣＤ３ ＰＥ−Ｃｙ７および抗Ｖδ２ ＦＩＴＣｍＡｂ（BD Pharmingen）を使用した。異なるサブセットにおいてＣＤ２７７を特徴づけのために、ＰＢＭＣを以下の抗体および分子と共にインキュベーションした：抗ＣＤ３ ＰＥ−Ｃｙ５（BD Pharmingen）、抗ＣＤ４ ＰＢ（BD Pharmingen）、抗ＣＤ８ ＰＢ（BD Pharmingen）、抗Ｖδ２ ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）、抗ＣＤ２７ ＡＰＣ−Alexa Fluor750（CALTAG Laboratory）、抗ＣＣＲ７ ＰＥＣｙ７（BD Pharmingen）、抗ＣＤ２８ ＰＥ（Beckman Coulter）、抗ＣＤ４５ＲＡ ＥＣＤ（Beckman Coulter）、LIVE/DEAD（登録商標）Fixable Dead Cell Stain Kit（L34957、Invitrogen）およびAlexa Fluor647でラベル化された抗ＣＤ２７７（Protein labelling Kit Alexa Fluor 647、Molecular Probes, Invitrogen）。ＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂの発現を分析するために、γδＴ細胞およびターゲット細胞をモネンシン（１０μM, GoligiStop, BD Bioscience）存在下で抗ＣＤ１０７ａ ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１０７ｂ ＦＩＴＣと共に３７℃で共インキュベーションした。インキュベーションの４時間後に細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した。γδＴ細胞を抗汎γδＴＣＲ ＰＥ ｍＡｂおよび抗ＣＤ３ ＰＥＣｙ７ ｍＡｂ（BD Pharmingen)でラベル化した。FACSCantoまたはFACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences）でFACSDivaソフトウェアを使用して全試料を測定した。FlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて解析を行った。

補足的な材料：
細胞内染色は、BD Pharmingen Fix and Perm Kit（BD Biosciences）による推奨に従って行った。２×１０^６個/mlのγδＴ細胞１００μlを９６ウェルプレートに蒔いた。それらを３μM ＢｒＨＰＰの存在下または不在下で、１０μg/mlの抗ＣＤ２７７または対照アイソタイプと共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を異なる時点に３７℃で刺激した。Cytofix/Cytoper溶液１００μlを３７℃で１０分間添加することにより刺激を止めた。精製ウサギモノクローナル抗体（抗ｐＺａｐ７０、抗ｐＡＫＴおよび抗ｐＥｒｋ、Cell Signaling Technology（Danvers, USA）製）を用いて細胞内リン酸化タンパク質を染色し、ビオチン−ＳＰ結合型Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ウサギ抗体（Jackson）でラベル化し、ストレプトアビジン−ＰＥ（Beckman Coulter）を用いて顕示させた。

刺激およびエクスパンションアッセイ
ＰＢＭＣをプレートに蒔き、細胞系およびγδＴ細胞のエクスパンションの節に記載したように刺激したが、但し、抗ＣＤ２７７ｍＡｂ（１０μg/ml）または対照アイソタイプ（１０μg/ml）で、異なる濃度のＢｒＨＰＰの存在下または不在下で細胞を刺激した。９日後に培養を止めた。Ｖγ９Ｖδ２のパーセンテージを培養初日および最終日に上記のように測定した。エクスパンションしたγδＴ細胞エフェクターは、１０μg/ml抗ＣＤ２７７ｍＡｂ中に添加された異なる用量のＢｒＨＰＰの存在下もしくは不在下で、または異なる濃度の抗ＢＴ３ １９．５ｍＡｂと結合したＯＫＴ３（４ng/ml）存在下で刺激した。脱顆粒の活性化は、上記のようにＣＤ１０７ラベル化アッセイにより測定した。

再方向付けした活性化アッセイ
Ｐ８１５肥満細胞腫マウス細胞２×１０^５個を、マウス対照アイソタイプｍＡｂもしくは抗ＣＤ２７７ｍＡｂ（１０μg/ml）および／または抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、４ng/ml）と共に３０分間インキュベーションした。洗浄後、Ｐ８１５を同濃度のエクスパンションしたＶγ９Ｖδ２Ｔエフェクター細胞と共に３７℃で４時間インキュベーションした。フローベースのＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを上記のように行った。

ＥＬＩＳＡ
再方向付けした活性化アッセイからの上清を４時間の共培養後に収集した。ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７の放出をＥＬＩＳＡキットにより検査した（BD Pharmingen製ＩＦＮγおよびＴＮＦα用OptEIAキット）。サイトカインはプレートリーダーMultiskan RC（Labsystems）で検出した。リコンビナント標準を用いて確立した標準曲線からサイトカイン濃度を決定した。

直接細胞傷害性アッセイによるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞応答の分析：
ターゲット細胞を２０μCiの５１Ｃｒ（PerkinElmer）で３７℃にて１時間ラベル化した。ターゲット細胞を洗浄後に、エフェクターＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と共に異なる比率で３７℃にて４時間インキュベーションした。特異的またはアイソタイプ対照のｍＡｂまたはＦａｂフラグメントの存在下でインキュベーションを行った。４時間後にターゲット細胞により放出された放射能をβプレートカウンターで測定した。５１Ｃｒ比溶解パーセンテージは、以下の式を用いて計算した：
比溶解パーセント＝１００×［（検査での放出）−（自然放出）］／［（最大放出）−（自然放出）］

統計解析：
Cytelにより製造されたStatXactソフトウェア（バージョン８ ＰＣ）を全ての統計解析のために使用した。群間比較のための有意値は、ノンパラメトリックMann-Whitney解析により決定した。９５％信頼レベルで不等分散を仮定して、ｐ値＜０．０５を有意と見なした。

Ｓｋｉｎｔ−１およびＣＤ２７７はＢ７と同じスーパーファミリーに属する
NCBI pBlastにおけるＳｋｉｎｔ−１ ＩｇＶタンパク質ドメイン配列を使用して、本発明者らは、Ｓｋｉｎｔ−１とデータベース中の他のヒトタンパク質の間の類似性を検索した。得られた配列アライメントから、Ｓｋｉｎｔ−１が３８％の同一性でＣＤ２７７に相対的に類似していることが示される（データは示さず）。ＳｋｉｎｔファミリーとＢｔｎファミリーの間の関係を明らかにするために、本発明者らは、Figenix自動ゲノムアノテーションプラットフォームを使用してそれらのＩｇＶ配列に基づき系統発生解析を行った。

系統学から、Ｓｋｉｎｔ−１およびＣＤ２７７が免疫応答のレギュレーションに意味付けられる遺伝子または遺伝子ファミリーＢＴＮ１〜３、ＢＴＮＬ２ ＥＲＭＡＰ；Ｂ−ＧおよびＭＯＧと単系統群を形成することが示される（データは示さず）。この群には、同じく免疫応答のレギュレーションへの関与について公知であるＢ７ファミリーのＣＤ８０およびＣＤ８６も含まれる。各群はサブファミリーを形成する。

本発明者らがＳｋｉｎｔサブファミリーに焦点を合わせたとき（データは示さず）、Ｓｋｉｎｔ−１の完全配列に基づく系統発生解析から、マウスでの５遺伝子を含むげっ歯類での少なくとも８種のパラログ遺伝子が立証され、これは、１コピーだけがある霊長類と極めて対照的である。この結果は、げっ歯類に果たすｓｋｉｎｔファミリーの重要な役割を示唆している。本発明者らは、ＣＤ２７７配列を使用して同じ分析を行った（データは示さず）。本発明者らは、ＣＤ２７７およびその第二アイソフォームＢＴＮ３−Ａ３がウマと霊長類に分岐（embranchment）した共通な祖先を有することを示す。興味深いことに、これらの二つのアイソフォームは、霊長類に存在するが、げっ歯類には不在である。

二つの終止コドンがヒトＳｋｉｎｔ−１遺伝子配列内に存在するので、この遺伝子はおそらく偽遺伝子である。第一終止コドンは、シグナルペプチドのすぐ下流でＩｇＶ配列の開始部に位置し、第二終止コドンは、第一膜貫通ドメインの下流に位置する［７］。本発明者らは、Pongo abeliiのＤＮＡ配列からまさしく同じ突然変異を発見したので、これは配列決定エラーが原因ではなさそうである。これらのデータは、Ｓｋｉｎｔ遺伝子が霊長類種に必要ではないことを示し、それらの機能が他の遺伝子により行われうることを示唆した。

逆のやり方で、NCBI ntBlastを用いたところＣＤ２７７遺伝子はRatus norvegicusおよびMus musculusのＤＮＡ配列中に不在であった。実際、ＢＴＮファミリー内でＢＴＮ２配列だけがこれらの２種に存在した。これらの結果から、ＣＤ２７７がげっ歯類から実際に消失し、結果としてこれらの種の生存に必要ないことが示された。このことは、ＣＤ２７７の機能が他の遺伝子（一つまたは複数）により仮定されたことを示している。

げっ歯類および霊長類の共通祖先における両方の機能冗長性は、一方でげっ歯類におけるＣＤ２７７、他方で霊長類におけるＳｋｉｎｔ−１の消失の起源でありうる。

要約すると、両方の分子は、ＩｇＶドメイン内とＩｇＣドメイン内の両方の細胞外領域に類似性を有するが、膜貫通ドメインの数が、とりわけ細胞質内領域が異なる（データは示さず）。実際、Ｓｋｉｎｔ−１が膜貫通ドメインを３個有する代わりに、ＣＤ２７７は１個しか有さない。さらに、細胞質内領域においてＣＤ２７７はＢ３０．２ドメインを有する。このドメインはＳｋｉｎｔ−１に不在である。

ＣＤ２７７はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に発現され、その分化によりモデュレーションされない
本発明者らは、以前に、ＣＤ２７７が従来型Ｔリンパ球上に発現され、これがＴ細胞応答のレギュレーションに果たすＣＤ２７７の役割を示唆していることを示した。

本発明者らは、γδＴ細胞上およびナイーブ区画から始まる異なる分化段階に対応するそれらの記載された亜集団上でのＣＤ２７７の発現を試験した。したがって、８色フローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、以下の４個の主要亜集団を測定した：ナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋）；中枢性メモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋）；エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）およびエフェクターメモリーＲＡ＋（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）。

本発明者らは、ＣＤ２８も評価し、ＣＤ２８はＮ、ＣＭ、ＥＭおよびＥＭＲＡ＋γδＴ細胞の中で二つのサブセットを区別した。ＣＤ２８の機能は明らかでないものの、αβＴ細胞ではＣＴＬ機能に関連する。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の９５％は、αβＴ細胞よりも高い平均蛍光強度でＣＤ２７７を発現するが、このことは、γδＴ細胞のホメオスタシスに果たす重要な役割を示唆している。興味深いことに、Ｖγ９Ｖδ２亜集団の全てにおいて、各細胞はＣＤ２７７を発現する。その発現レベルは、分析されたγδＴ細胞亜集団においてほぼ同じである。ナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋／ＣＤ２８＋／ＣＣＲ７＋にほんのわずかな増加が見出されたが、この変化は健康な志願者が試験された系列では有意ではなかった。

これらの結果は、ＣＤ２７７がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の分化においてモデュレーションされないことを示し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化の異なる段階で推定上の役割を示唆している。

抗ＣＤ２７７ｍＡｂ２０．１はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を誘導し、一方で１０３．２はホスホ抗原による最適なＴＣＲ刺激により仲介される刺激を阻害する。
γδＴ細胞におけるＣＤ２７７の機能を検討するために、本発明者らは、ＣＤ２７７に対するｍＡｂを使用した。本発明者らは、最初の設定でＣＤ２７７のトリガーが最適用量のホスホ抗原ＢｒＨＰＰによるγδＴ細胞の刺激に影響しうるかどうかを試験した。本発明者らは、ＰＢＭＣをＩＬ−２（１００U/ml）およびＢｒＨＰＰ（３０００nM）と共に培養した。

培養１５日後に抗ＣＤ２７７ｍＡｂ２０．１を添加するとＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞はエクスパンションした（図５Ａ）。ＣＦＳＥラベル化細胞の分析によって実証されたように、この作用は、Ｖγ９Ｖδ２細胞の増殖と関連した（図５Ｂ）。

この結果は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化に及ぼすＣＤ２７７ ２０．１の刺激機能を示唆している。

次に本発明者らは、Ｖγ９Ｖδ２細胞のホスホ抗原介在性活性化に及ぼすＣＤ２７７ｍＡｂ１０３．２の機能を試験した。１０３．ｍＡｂは、ＣＤ３ｍＡｂではなくホスホ抗原により仲介されるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化を完全に阻害した（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｖγ９Ｖδ２ＴｃＲを発現しているＪｕｒｋａｔ細胞において類似の作用が実証された。

ＣＤ２７７は、ＴｃＲ複合体により仲介されるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞における脱顆粒をモデュレーションする
これらのデータは、ＣＤ２７７の機能をサイトカイン産生、細胞傷害性および脱顆粒のようなγδＴ細胞の別の機能の中から検出できるかどうか試験することを促した。

本発明者らは、ホスホ抗原によりγδＴ細胞を刺激し、エクスパンションした細胞をそのエフェクター機能について試験した。本発明者らは、まず、脱顆粒の指標としてＣＤ１０７発現のモデュレーションを採用した。この試験は、一部分において、細胞がその細胞溶解機能を誘発する能力に対応する。この実験で、本発明者らは、最適以下の用量（０．０６nM）または最適用量（４０００nM）のいずれかのホスホ抗原ＢｒＨＰＰとＣＤ２７７が結合する作用を測定した。

漸増する用量のＢｒＨＰＰは、４０％まで漸増するＣＤ１０７発現を誘導する。ＣＤ１０７の発現を誘導できない低用量のＢｒＨＰＰを使用すると、抗ＣＤ２７７の添加はＣＤ１０７の発現を最大２０％増加させた。しかし、高用量のＢｒＨＰＰがあると、抗ＣＤ２７７はＢｒＨＰＰにより誘導されるＣＤ１０７発現を阻害し、その発現は４０％から２０％に減少した。本発明者らは、抗ＣＤ３固定化ｍＡｂおよび抗ＣＤ２７７固定化ｍＡｂを使用した別のγδＴ細胞刺激系を試験した。ＣＤ２７７の刺激単独は、ＣＤ１０７の発現を誘導した（３０％）。ＣＤ３ｍＡｂは、ＣＤ１０７の用量依存的発現を誘導し、この設定の場合、それは５０ng/mlでプラトーに達した。

本発明者らは、次に、漸増する濃度のＣＤ３ｍＡｂと共に一定用量のＣＤ２７７ｍＡｂを使用してＣＤ１０７の発現を試験した。ＣＤ２７７を最大１０ng/mlまで漸増する用量の抗ＣＤ３と組合せた場合、ＣＤ１０７の発現は増加した。しかしながら、より高い用量のＣＤ３ｍＡｂでＣＤ１０７の発現は用量依存的に減少した。

まとめると、これらのデータは、γδＴ細胞がＣＤ１０７を発現し、それ故にホスホ抗原または抗ＣＤ３刺激後に脱顆粒する能力を、ＣＤ２７７がモデュレーションすることを実証している。ＣＤ２７７の作用は、低刺激レベルでγδＴ細胞の脱顆粒活性を増強し、より高いＴＣＲクロスリンクレベルでその活性を減少するという二相性である。

ＣＤ２７７のクロスリンクは、ＩＮＦγおよびＴＮＦαの放出と一緒に脱顆粒をトリガーする
本発明者らは、次に、ＣＤ２７７ｍＡｂを使用して、エクスパンションしたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の再方向付けした刺激を行った。抗ＣＤ２７７単独は、刺激の４時間後にＣＤ１０７の発現を用量依存的に誘導する（１０％＜３０％）。最適活性化は、１０μg/ml用量の抗ＣＤ２７７で得られ、一方でｍＡｂのそのターゲットに対するＩＤ５０は３ug/mlである（データは示さず）。

そのうえ、ＣＤ２２７の結合はＩＦＮγおよびＴＮＦαの強い放出を誘導し、その放出は４時間の刺激という早期に検出された。したがって、ＣＤ２７７により誘導される脱顆粒は、Ｔｈ１サイトカインと一緒に現れる。この脱顆粒およびサイトカイン放出の誘導は、ＴＣＲ結合の必要なしに抗ＣＤ２７７がクロスリンクすることによりＣＤ２７７が刺激されることに起因する。

ＣＤ２７７はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞により仲介される抗腫瘍性細胞溶解作用を強化する。
最後に、本発明者らは、ＣＤ２７７がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞活性化の抗腫瘍機能に関与しうるかどうかを試験した。この仮説を検証するために、本発明者らは、Ｄａｕｄｉ、Ｋ５６２またはＲａｊｉ細胞系を含む様々な腫瘍細胞系に対する細胞傷害性アッセイに抗ＣＤ２７７ｍＡｂおよび抗ＣＤ２７７Ｆａｂフラグメントを使用した。

ＣＤ１０７ａ／ｂ脱顆粒アッセイにより判定されたように、２０．１ｍＡｂはターゲットに対するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の機能を強化または顕在化させた（図７）。対照的に、同じ実験設定で１０３．２ｍＡｂはＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の活性化を阻止した（データは示さず）。

これらの結果は、ＣＤ２７７ｍＡｂが応答性Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞により仲介される抗腫瘍細胞溶解を強化または阻害することを示している。

参考文献
本出願にわたり、本発明が属する技術の現況を様々な参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、これをもって参照により本開示に組入られる。

実施例３に引用された参考文献は以下の通りである：

Claims (14)

1. − Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化し、かつ／または
   − ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激し、かつ／または
   − ＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激し、かつ／または
   − 単球および樹状細胞の活性および／または生存を増加させる、
   抗ＣＤ２７７抗体。
2. − Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化し、かつ
   − ＣＤ３−ＴＣＲと一緒になってＴ細胞を共刺激し、かつ
   − ＣＤ２８−Ｂ７共刺激に加えてＴ細胞を共刺激し、かつ
   − 単球および樹状細胞の活性および／または生存を増加させる、
   抗ＣＤ２７７抗体。
3. ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０１またはＩ−４４０２として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、抗ＣＤ２７７抗体。
4. 請求項３記載の抗ＣＤ２７７抗体のＣＤＲを含む、抗ＣＤ２７７抗体。
5. 治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか一項記載の抗ＣＤ２７７抗体。
6. ガンまたは慢性感染の処置に使用するための、請求項５記載の抗ＣＤ２７７抗体。
7. 請求項１〜４のいずれか一項記載の抗ＣＤ２７７抗体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン。
8. ａ）請求項１〜４のいずれか一項記載の抗ＣＤ２７７抗体；および
   ｂ）ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン
   を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキット。
9. ＣＮＣＭ Ｉ−４４０１、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０２およびＣＮＣＭ Ｉ−４４０３から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞系。
10. Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、抗ＣＤ２７７抗体。
11. ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４４０３として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、抗ＣＤ２７７抗体。
12. 請求項１１記載の抗ＣＤ２７７抗体のＣＤＲを含む、抗ＣＤ２７７抗体。
13. 治療に使用するための、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の抗ＣＤ２７７抗体。
14. 自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病の処置に使用するための、請求項１３記載の抗ＣＤ２７７抗体。