ES2893297T3 - Panel de biomarcadores para la detección de cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar el cáncer de mama (BC) en un sujeto, que comprende a) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y b) determinar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b, en un sujeto, en el que el estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y la presencia de los miARN es indicativo del riesgo del sujeto de padecer BC.

Description

DESCRIPCIÓN

Panel de biomarcadores para la detección de cáncer

La presente invención se refiere a un método, un kit y un dispositivo para diagnosticar el cáncer de mama. El método comprende la determinación de paneles de marcadores de metilación y miARN.

Antecedentes

El cáncer es uno de los problemas médicos y de salud más importantes del mundo. Como la principal causa de muerte en todo el mundo, hubo 12,4 millones de nuevos casos de cáncery 7,6 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 2008. Se ha pronosticado que las muertes por cáncer en todo el mundo aumentan continuamente y 12 millones de muertes serían causadas por cáncer en el año de 2030. El cáncer de mama es el cáncer más común entre las mujeres. Aproximadamente una de cada nueve mujeres desarrollará cáncer de mama durante su vida (Feuer, E.J., et al., The lifetime risk of developing breast cancer. J Natl Cancer Inst 85, 892-897 (1993)). Aproximadamente 1,3 millones de mujeres en todo el mundo desarrollan cáncer de mama cada año. Las tasas de mortalidad han seguido disminuyendo a lo largo de los años debido a todos los esfuerzos y avances realizados en el diagnóstico y el tratamiento tempranos (Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69­ 90). Sin embargo, miles de mujeres mueren cada año a causa de esta enfermedad. En las mujeres estadounidenses, la supervivencia general a cinco años es del 98% cuando se diagnostica en una etapa temprana, en comparación con el 23% cuando la enfermedad ya se ha extendido a órganos distantes. Así, la detección precoz del cáncer de mama pertenece a uno de los mayores retos en la lucha contra esta enfermedad. El cribado mamográfico se aplica actualmente como estándar de diagnóstico. Sin embargo, tiene limitaciones debido a su uso de radiación ionizante y una tasa de falsos positivos del 8-10%, también dependiendo de la edad de los individuos a examinar (Taplin S, Abraham L, Barlow WE, Fenton JJ, Berns EA, Carney PA, CutterGR, Sickles EA, Carl D, Elmore JG. Mammography facility characteristics associated with interpretive accuracy of screening mammography. J Natl Cancer Inst 2008; 100: 876-87).

La mayoría de los cánceres de mama ocurren esporádicamente, mientras que el cáncer de mama familiar representa aproximadamente el 10% de todos los casos de cáncer de mama (Fackenthal, JD & Olopade, OI. Breast cancer risk associated with BRCA1 and BRCA2 in diverse populations. Nat Rev Cancer 7, 937-948 (2007)). Las mutaciones en los principales genes relacionados con el cáncer de mama, BRCA1 y BRCA2 representan el 25% y otros genes de penetrancia intermedia y baja aproximadamente el 5% de todos los casos familiares (Yang, R. & Burwinkel, B. (eds.). Familial risk in breast cancer, 251-256 (Springer, 2010)). Los estudios recientes de asociación de todo el genoma (GW AS) y los enfoques de un solo gen candidato han tenido bastante éxito en la detección de variantes genéticas de bajo riesgo para el cáncer de mama (Thomas, G., et al., A multistage genome-wide association study in breast cancer identifies two new risk alleles at 1 p 11.2 and 14q24.1 (RAD51 L1). Nat Genet 41, 579-584 (2009); Cox, A., et al., A common coding variant in CASP8 is associated with breast cancer risk. Nat Genet 39, 352-358 (2007); Stacey, SN, et al., Common variants on chromosome 5p12 confer susceptibility to estrogen receptor-positive breast cancer. Nat Genet 40, 703-706 (2008); Ahmed, S., et al. Newly discovered breast cancer susceptibility loci on 3p24 and 17q23.2. Nat Genet 41, 585-590 (2009); Easton, D.F., et al. Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature 447, 1087-1093 (2007); Milne, R.L., et al. Risk of estrogen receptor-positive and -negative breast cancer and single-nucleotide polymorphism 2q35-rs13387042. J Natl Cancer Inst 101, 1012-1018 (2009); Frank, B., et al. Association of a common AKAP9 variant with breast cancer risk: a collaborative analysis. J Natl Cancer Inst 100, 437-442 (2008)). Sin embargo, queda por explorar una gran cantidad de factores de riesgo de cáncer de mama.

En comparación con el BC, el cáncer de ovario (OvCa) tiene una aparición relativamente rara, pero es la principal causa de muerte por cánceres ginecológicos debido a su alta malignidad. En 2008, 225,000 mujeres fueron diagnosticadas con cáncer de ovario en todo el mundo y 140,000 de estas mujeres murieron a causa de la enfermedad. Por lo general, las mujeres con OvCa presentan pocos síntomas tempranos y, por lo tanto, casi tres cuartas partes de los casos de cáncer de ovario se presentan en una etapa avanzada, con la enfermedad diseminada mucho más allá de los ovarios. El cáncer de páncreas (PaCa) es el más agresivo de todos los cánceres epiteliales. Con 279,000 nuevos diagnósticos de PaCa en todo el mundo, la tasa de supervivencia general a 5 años de los pacientes con PaCa es inferior al 5%. Aunque los estudios recientes de asociación de todo el genoma (GWAS) han detectado con éxito varias variantes genéticas asociadas con el riesgo de BC, OvCa y PaCa, no se ha identificado ningún marcador valioso para la detección temprana de BC.

El cáncer de mama metastásico (MBC) es un problema de salud importante en todo el mundo. Las estrategias de tratamiento actuales se dirigen principalmente a los cuidados paliativos y se curan muy pocos casos. Un enfoque alternativo para abordar el MBC es el desarrollo de métodos de detección y la aplicación de biomarcadores para identificar grupos de alto riesgo y respuesta a la terapia. Esto podría facilitar la toma de decisiones a los médicos y ayudarlos a adoptar el régimen de tratamiento adecuado para los pacientes.

Se han propuesto células tumorales circulantes (CTC) como un marcador de pronóstico independiente aprobado por la FDA para metástasis, específicamente para supervivencia libre de progresión y supervivencia global. Un corte cardinal de más de 5 CTC por 7.5 ml de sangre se ha definido como positivo para c Tc (Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, et al; Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cáncer; N Engl J Med. 2004, 19 de agosto; 351 (8): 781-91). Sin embargo, es importante señalar que una fracción significativa de pacientes con metástasis a distancia manifiestas son negativas para CTC. Esto podría contribuir en parte al fenómeno de la transición epitelio-mesenquimal en las CTC, en cuyo caso pueden pasarse por alto mediante técnicas de enumeración que explotan la expresión de marcadores epiteliales como EpCAM o citoqueratina 8, citoqueratina 18 y citoqueratina 19.

Además de las CTC, también se utilizan ampliamente marcadores tumorales circulantes basados en proteínas como el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno carbohidrato 15-3 (CA 15-3) como marcadores de pronóstico, así como en el control del éxito y seguimiento del tratamiento del cáncer de mama (Uehara M, Kinoshita T, Hojo T, Akashi-Tanaka S, Iwamoto E, Fukutomi T. Long-term prognostic study of carcinoembryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen 15-3 (CA 15-3) in breast cancer. Int J Clin Oncol 2008; 13: 447-51; Harris L, Fritsche H, Mennel R, Norton L, Ravdin P, Taube S, Somerfield MR, Hayes DF, Bast RC, Jr. American Society of Clinical Oncology, 2007, actualización de recomendaciones para la uso de marcadores tumorales en el cáncer de mama. J Clin Oncol 2007; 25: 5287-312) Sin embargo, la sensibilidad de estos marcadores es baja. Por lo tanto, se necesitan nuevos marcadores sensibles y específicos, así como mínimamente invasivos.

Los cambios epigenéticos se definen como cambios en la expresión génica que no se deben a ninguna alteración en la secuencia del ADN genómico. Las firmas epigenéticas aberrantes se han considerado un sello distintivo del cáncer humano (Esteller, M. Cancer epigenomics: ADN methylomes and histone-modified maps. Nat Rev Genet 8, 286-298 (2007)). Una de las firmas epigenéticas más importantes, la metilación del ADN tiene funciones críticas en el control de las actividades de los genes y en la arquitectura del núcleo de la célula. Weber, M., et al., Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet 37, 853 - 862 (2005)). Además, a diferencia de los marcadores o variantes genéticos, la metilación del ADN es principalmente reversible. Por lo tanto, el perfil de metilación de genes específicos se consideran dianas terapéuticas (Mack, G.S. La terapia del cáncer epigenético avanza. J Natl Cancer Inst 98, 1443-1444 (2006)). Por lo tanto, debido al carácter variable, la metilación del ADN puede servir como vínculo entre los factores ambientales y el genoma. La metilación del ADN modulada por factores ambientales o el envejecimiento puede alterar la expresión de genes críticos de las células y, en consecuencia, inducir la transformación maligna de las células o incluso un cáncer (Widschwendter, M., et al., Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breast cancer risk: a proof of principle study. PLoS One 3, e2656 (2008)).

Como evento temprano en el desarrollo del cáncer, los cambios en la metilación del ADN son particularmente prometedores como marcadores para la detección temprana del cáncer. Estudios recientes han demostrado que el análisis de metilación del ADN de las células sanguíneas puede servir como un marcador confiable y robusto. Estudios intensivos han revelado firmas de metilación del ADN alteradas en el cáncer a nivel somático, mientras que solo unos pocos estudios con el enfoque de genes candidatos han analizado las firmas de metilación en el ADN de sangre periférica en el cáncer.

Estudios anteriores han explorado la hipermetilación en las regiones promotoras de genes supresores de tumores y la hipometilación en las regiones promotoras de oncogenes en cáncer de mama en comparación con sus tejidos adyacentes normales (Ito, Y., et al. Somatically acquired hypomethylation of IGF2 in breast and colorectal cancer. Hum Mol Genet 17, 2633-2643 (2008); Potapova, A., Hoffman, A.M., Godwin, A.K., Al-Saleem, T. & Cairns, P. Promoter hypermethylation of the PALB2 susceptibility gene in inherited and sporadic breast and ovarian cancer. Cancer Res 68, 998-1002 (2008); Radpour, R., et al. Methylation profiles of 22 candidate genes in breast cancer using highthroughput MALDI-TOF mass array. Oncogene 28, 2969-2978 (2009); Widschwendter, M. & Jones, P.A. DNA methylation and breast carcinogenesis. Oncogene 21, 5462-5482 (2002)). Muy pocos estudios se han centrado en las firmas de metilación en el ADN de sangre periférica y el riesgo de cáncer de mama. En estos estudios, solo genes específicos, como BRCA1 (Iwamoto, T., Yamamoto, N., Taguchi, T., Tamaki, Y. & Noguchi, S. BRCA1 promoter methylation in peripheral blood cells is associated with increased risk of breast cancer with BRCA1 promoter methylation. Breast Cancer Res Treat 129, 69-77 (2011)), ATM (Flanagan, JM, et al., Gene-body hypermethylation of ATM in peripheral blood DNA of bilateral breast cancer patients. Hum Mol Genet 18, 1332 -1342 (2009)), y se han investigado genes en vías específicas (Widschwendter et al., (2008), en lugar citado). Por tanto, existe una necesidad en la técnica para la identificación de marcadores epigenéticos adicionales de cáncer de mama y otros cánceres, permitiendo preferiblemente la identificación de sujetos afectados mediante la obtención de una muestra por un medio de baja invasividad, por ejemplo, tomando una muestra de sangre.

Los miARN son pequeños ARN no codificantes (-18-25 nucleótidos de longitud) que regulan la expresión génica en un nivel postranscripcional degradando las moléculas de ARNm o bloqueando su traducción (Bartel DP.: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116: 281-97). Por tanto, juegan un papel fundamental en la regulación de un gran número de procesos biológicos, entre ellos el cáncer (Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E, Aldler H, Rattan S, Keating M, Rai K, Rassenti L, Kipps T, et al., Frequent deletions and downregulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 15524-9). Bajo el sistema de nomenclatura estándar, los nombres se asignan a los miARN confirmados experimentalmente. El prefijo "mir" va seguido de un guión y un número. El "mir-" sin mayúsculas se refiere al premiARN, mientras que "miR-" con mayúscula se refiere a la forma madura. Los miARN con secuencias casi idénticas, excepto uno o dos nucleótidos, se anotan con una letra minúscula adicional. La especie de origen se designa con un prefijo de tres letras, por ejemplo, hsa para Homo sapiens (humano). Dos miARN maduros que se originan en brazos opuestos del mismo pre-miARN se indican con un sufijo -3p o -5p.

Los miARN circulantes se definen como miARN presentes en el componente libre de células de los fluidos corporales como plasma, suero y similares. Lawrie et al. (Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulford K, Banham AH, Pezzella F, Boultwood J, Wainscoat JS, Hatton CS, Harris AL. Detection of elevated levels of tumourassociated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol 2008; 141: 672-5) fueron de los primeros en demostrar la presencia de miARN en los fluidos corporales. Desde entonces, se ha informado que los miARN circulantes se expresan de manera aberrante en el plasma sanguíneo o el suero en diferentes tipos de cáncer, por ejemplo, carcinoma de próstata, colorrectal o esofágico (Brase JC, Johannes M, Schlomm T, Falth M, Haese A, Steuber T, Beissbarth T, Kuner R, Sultmann H. Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer. Int J Cancer2011; 128: 608-16; Huang Z, Huang D, Ni S, Peng Z, Sheng W, Du X. Plasma microRNAs are promising novel markers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer 2010; 127: 118-26; Zhang C, Wang C, Chen X, Yang C, Li K, Wang J, Dai J, Hu Z, Zhou X, Chen L, Zhang Y, Li Y, et al. Expression profile of microRNAs in serum: a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma. Clin Chem 2010; 56: 1871-9). Sus ventajas más importantes incluyen la posibilidad de ser medidos repetidamente de manera mínimamente invasiva, así como su notable estabilidad en plasma/suero, donde circulan principalmente fuera de los exosomas y son estables debido a su unión a proteínas Argonauta (Mitchell PS, Parkin Rk , Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, Peterson A, Noteboom J, O'Briant KC, Allen A, Lin DW, Urban N, et al., Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 10513-8; Turchinovich A, Weiz L, Langheinz A, Burwinkel B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res 2011; 39: 7223-33; Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, Ruf IK, Pritchard CC, Gibson DF, Mitchell PS, Bennett CF, Pogosova-Agadjanyan EL, Stirewalt DL, Tait JF, Tewari M. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108:5003-8).

El documento WO 2013/190091 A1 identifica miR-801, miR-148b, miR-376c, miR-376a, miR-652, miR-409 y miR-127 como marcadores de cáncer de mama. En el método descrito para diagnosticar y pronosticar el cáncer de mama, se mide la cantidad de marcadores individuales. No se describe la medición de todo el grupo de marcadores de microARN en combinación con el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, ni ningún efecto sinérgico de medir los miARN en combinación con al menos uno de los marcadores de metilación, que puede medirse en sujetos sanos y en pacientes con BC.

Por tanto, existe una necesidad urgente en la técnica de métodos mejorados para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de mama, en particular el cáncer de mama primario y el cáncer de mama metastatizante. Estos métodos también se usarían preferiblemente en el cribado preventivo de sujetos aparentemente sanos, se preferiría un grado bajo de invasividad.

Sumario de la invención

En un primero aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de cáncer de mama (BC) en un sujeto, que comprende (a) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y (b) determinar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b en un sujeto, en el que el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y la presencia de los miARN es indicativo del riesgo de que dicho sujeto padezca BC.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de BC, que comprende

a) uno o más medios para detectar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y

b) medios para detectar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo para identificar BC, que comprende: (a) una unidad de análisis que comprende (i) un agente de detección para determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y (ii) un agente de detección para determinar la presencia de: miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b en una muestra de un sujeto; y (b) una unidad de evaluación que comprende un procesador de datos que tiene incluido tangiblemente un algoritmo para realizar una comparación de la cantidad determinada por la unidad de análisis con una referencia y que es capaz de generar un archivo de salida que contiene un diagnóstico establecido con base en dicha comparación.

Listado de figuras

Fig. 1: Descripción de la muestra del panel de biomarcadores en sangre para la detección precoz del cáncer de mama Fig. 2: Diferencias de metilación de ocho genes en tres rondas de validación

Fig. 3: El poder discriminatorio de los conjuntos de marcadores de metilación del ADN para distinguir los casos de CM de los controles sanos en muestras de otros centros

Fig. 4: El poder discriminatorio de los conjuntos de marcadores de metilación del ADN y los conjuntos de marcadores de miARN para distinguir los casos de CM de los controles sanos en muestras de nuestro grupo

Fig. 5: El nivel de metilación de los ocho genes en pacientes con CM esporádicos con diferentes características clínicas (casos de la segunda ronda de validación)

Fig. 6: El nivel de metilación de los ocho genes en pacientes con CM esporádicos con diferentes características clínicas (casos de nuestro grupo)

Fig. 7: Descripción de la muestra del panel de biomarcadores en sangre para la detección precoz del cáncer de páncreas

Fig. 8: Diferencias de metilación en genes comparando casos y controles de PaCa

Fig. 9: Diferencias de metilación en genes comparando casos y controles de PaCa estratificados por género Fig. 10: El poder discriminatorio de la metilación en los genes para distinguir los casos de PaCa de los controles sanos Fig. 11: La metilación de genes en pacientes con PaCa con diferentes características clínicas

Fig. 12: Descripción de la muestra del panel de biomarcadores en sangre para la detección precoz del cáncer de ovario Fig. 13: Diferencias de metilación en genes comparando casos y controles de OvCa

Fig. 14: El poder discriminatorio de la metilación en los genes para distinguir los casos de OvCa de los controles sanos Fig. 15: La determinación de la orilla de la isla de CpG relacionada con el cáncer de mama en HYAL2

Fig. 16: La correlación inversa entre la metilación y la expresión de S100P, SLC22A18 y DYRK4 en leucocitos Fig. 17: Los niveles de metilación de los sitios CpG de HYAL2 por Illumina 450K

Fig. 18: Los niveles de metilación de los sitios CpG de S100P por Illumina 450K

Fig. 19: Los niveles de metilación de los sitios CpG de SLC22A18 por Illumina 450K

Fig. 20: Los niveles de metilación de los sitios CpG de DYRK4 por Illumina 450K

Fig. 21: Los niveles de metilación de los sitios CpG de FUT7 por Illumina 450K

Fig. 22: Los niveles de metilación de los sitios CpG de RAPSN por Illumina 450K

Fig. 23: Los niveles de metilación de los sitios CpG de RPTOR por Illumina 450K

Fig. 24: Los niveles de metilación de los sitios CpG de MGRN1 por Illumina 450K

Fig. 25: La correlación inversa entre la metilación y la expresión de HYAL2 en leucocitos, (a) Los diagramas de caja muestran los niveles de metilación de cg27091787 y sitios CpG adyacentes en el amplicón HYAL2-A en leucocitos de 36 casos esporádicos de BC y 40 controles sanos. El diagrama de caja de cg27091787 está enmarcado en un cuadro para enfatizarlo. (b) El diagrama de caja muestra el nivel de expresión de HYAL2 en leucocitos de casos esporádicos de BC y controles sanos. Los valores de p presentados se calcularon mediante la prueba U de Mann-Whitney. Los círculos indican valores atípicos. (c) La correlación inversa entre el nivel de metilación de cg27091787 y la expresión de HYAL2 en leucocitos.

Fig. 26: Los niveles de metilación de cuatro sitios CpG en el amplicón HYAL2-A en fracciones de leucocitos clasificados. Los niveles de metilación se midieron por triplicado en las muestras (ADN de sangre total y de fracciones de leucocitos clasificados) de siete casos esporádicos de BC y 14 controles sanos. La diferencia de metilación entre casos y controles se calculó mediante la prueba t. Los niveles de metilación de cg27091787 se presentan por diagrama de caja y bigotes. El círculo indica un valor atípico.

Listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 hsa-miR-652-3p (MIMAT0003322): aauggcgccacuaggguugug

SEQ ID NO: 2 hsa-miR-652-5p (MIMAT0022709): caacccuaggagagggugccauuca

SEQ ID NO: 3 miR-801 localizado en el cromosoma 1: 28847698 - 28847793: gauugcucugcgugcggaaucgac SEQ ID NO: 4 hsa-miR-376c-3p (MIMAT0000720): aacauagaggaaauuccacgu

SEQ ID NO: 5 hsa-miR-376c-5p (MIMAT0022861): gguggauauuccuucuauguu

SEQ ID NO: 6 hsa-miR-376a-3p (MIMAT0000729): aucauagaggaaaauccacgu

SEQ ID NO: 7 hsa-miR-376a-5p (MIMAT0003386): guagauucuccuucuaugagua

SEQ ID NO: 8 hsa-miR-127-3p (MIMAT0000446): ucggauccgucugagcuuggcu

SEQ ID NO: 9 hsa-miR-127-5p (MIMAT0004604): cugaagcucagagggcucugau

SEQ ID NO: 10 hsa-miR-409-3p (MIMAT0001639): gaauguugcucggugaaccccu

SEQ ID NO: 11 hsa-miR-409-5p (MIMAT0001638): agguuacccgagcaacuuugcau

SEQ ID NO: 12 hsa-miR-148b-3p (MIMAT0000759): ucagugcaucacagaacuuugu

SEQ ID NO: 13 hsa-miR-148b-5p (MIMAT0004699): aaguucuguuauacacucaggc

SEQ ID NO: 14 HYAL2 (NM_003773.4)

SEQ ID NO: 15 HYAL2 (NM_033158.4)

SEQ ID NO: 16 HYAL2 (NP_003764.3)

SEQ ID NO: 17 HYAL2 (NP_149348.2)

SEQ ID NO: 18 MGRN1 (NM_001142289.2)

SEQ ID NO: 19 MGRN1 (NM_001142290.2)

SEQ ID NO: 20 MGRN1 (NM_001142291.2)

SEQ ID NO: 21 MGRN1 (NM_015246.3)

SEQ ID NO 22 MGRN1 (NP_001135761.2)

SEQ ID NO 23 MGRN1 (NP_001135762.1)

SEQ ID NO 24 MGRN1 (NP_001135763.2)

SEQ ID NO 25 MGRN1 (NP_056061.1)

SEQ ID NO 26 RPTOR (NM_001163034.1)

SEQ ID NO 27 RPTOR (NM_020761.2)

SEQ ID NO 28 RPTOR (NP_001156506.1)

SEQ ID NO 29 RPTOR (NP_065812.1)

SEQ ID NO 30 SLC22A18 (NM_002555.5)

SEQ ID NO 31 SLC22A18 (NM_183233.2)

SEQ ID NO 32 SLC22A18 (NP_002546.3)

SEQ ID NO 33 SLC22A18 (NP_899056.2)

SEQ ID NO 34 FUT7 (NM_004479.3)

SEQ ID NO 35 FUT7 (NP_004470.1)

SEQ ID NO 36 RAPSN (NM_005055.4)

SEQ ID NO 37 RAPSN (NM_032645.4)

SEQ ID NO 38 RAPSN (NP_005046.2)

SEQ ID NO 39 RAPSN (NP_116034.2)

SEQ ID NO 40 S100P (NM_005980.2)

SEQ ID NO 41 S100P (NP_005971.1)

SEQ ID NO 42 DYRK4 (NM_001282285.1)

SEQ ID NO 43 DYRK4 (NM_001282286.1)

SEQ ID NO 44 DYRK4 (NM_003845.2)

SEQ ID NO 45 DYRK4 (NP_001269214.1)

SEQ ID NO 46 DYRK4 (NP_001269215.1)

SEQ ID NO 47 DYRK4 (NP_003836.1)

SEQ ID NO 33 secuencia sentido del cebador HYAL2

SEQ ID NO 34 secuencia antisentido del cebador HYAL2

SEQ ID NO 33 secuencia sentido del cebador HYAL2-es-310

SEQ ID NO 34 secuencia antisentido del cebador HYAL2-es-310

SEQ ID NO 33 secuencia sentido del cebador HYAL2-es-325

SEQ ID NO 34 secuencia antisentido del cebador HYAL2-es-325

SEQ ID NO 35 secuencia sentido del cebador MGRN1

SEQ ID NO 36 secuencia antisentido del cebador MGRN1

SEQ ID NO 37 secuencia sentido del cebador RPTOR

SEQ ID NO 38 secuencia antisentido del cebador RPTOR

SEQ ID NO 39 secuencia sentido del cebador SLC22A18

SEQ ID NO 40 secuencia antisentido del cebador SLC22A18

SEQ ID NO 41 secuencia sentido del cebador FUT7

SEQ ID NO 42 secuencia antisentido del cebador FUT7

SEQ ID NO 43 secuencia sentido del cebador RAPSN

SEQ ID NO 44 secuencia antisentido del cebador RAPSN

SEQ ID NO 45 secuencia sentido del cebador S100P

SEQ ID NO 46 secuencia antisentido del cebador S100P

SEQ ID NO 47 secuencia sentido del cebador DYRK4

SEQ ID NO 48 secuencia antisentido del cebador DYRK4

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder a dicha divulgación en virtud de la invención anterior. En el caso de un conflicto entre las definiciones o enseñanzas de tales referencias y definiciones o enseñanzas enumeradas en la presente memoria descriptiva, el texto de la presente memoria descriptiva tiene prioridad.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos y las realizaciones preferidas descritos de forma diversa no deben interpretarse como que limitan la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y engloba realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualesquiera permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse divulgadas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

El término "aproximadamente" cuando se usa en relación con un valor numérico pretende abarcar valores numéricos dentro de un intervalo que tiene un límite inferior que es un 5% más pequeño que el valor numérico indicado y que tiene un límite superior que es un 5% mayor que el valor numérico indicado.

Se entiende por "moléculas de ácido nucleico" una macromolécula polimérica u oligomérica preparada a partir de monómeros de nucleótidos. Los monómeros de nucleótidos se componen de una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (tal como, entre otros, ribosa o 2'-desoxirribosa) y de uno a tres grupos fosfato. Normalmente, un polinucleótido se forma a través de enlaces fosfodiéster entre los monómeros de nucleótidos individuales. En el contexto de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN) y mezclas de los mismos tales como por ejemplo, híbridos de ARN-ADN. Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento. Los ácidos nucleicos, por ejemplo, pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el método del fosfotriéster (véase, por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90. 543-584). Los aptámeros son ácidos nucleicos que se unen con alta afinidad a un polipéptido, en el presente documento mir146-a. Los aptámeros pueden aislarse mediante métodos de selección tales como SELEmir146-a (véase, por ejemplo, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug y Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20. 97-107; patente de los Estados Unidos No. 5.582.981) de un gran conjunto de diferentes moléculas de ARN monocatenario. Los aptámeros también se pueden sintetizar y seleccionar en su forma de imagen especular, por ejemplo, tal como el L-ribonucleótido (Nolte et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas que se han aislado de esta manera tienen la ventaja de que no son degradadas por las ribonucleasas naturales y, por lo tanto, poseen una mayor estabilidad. Los ácidos nucleicos pueden degradarse por endonucleasas o exonucleasas, en particular por DNasas y RNasas que se pueden encontrar en la célula. Por lo tanto, es ventajoso modificar los ácidos nucleicos para estabilizarlos contra la degradación, asegurando así que se mantenga una alta concentración del ácido nucleico en la célula durante un largo período de tiempo (Beigelman et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; documentos WO95/11910; WO98/37240; WO97/29116). Típicamente, dicha estabilización se puede obtener introduciendo uno o más grupos de fósforo internucleotídicos o introduciendo uno o más internucleótidos distintos del fósforo. Los internucleótidos modificados adecuados se compilan en Uhlmann y Peyman (1990), citado más arriba (véase también Beigelman et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23: 3989-94; documentos WO95/11910; WO98/37240; WO 97/29116). Los radicales fosfato internucleotídicos modificados y/o puentes no fosforados en un ácido nucleico que se pueden emplear en uno de los usos de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, metilfosfonato, fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato y/o ésteres de fosfato, mientras que no los análogos de internucleótidos de fósforo contienen, por ejemplo, puentes de siloxano, puentes de carbonato, ésteres de carboximetilo, puentes de acetamidato y/o puentes de tioéter. También se pretende que esta modificación mejore la durabilidad de una composición farmacéutica que pueda emplearse en uno de los usos de acuerdo con la invención. Los ácidos nucleicos pueden seleccionarse del grupo que consta de un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico de glicol (GNA), un ácido nucleico de treosa (TNA), un microARN (miARN) y un ARN de interferencia pequeño (ARNip), una sonda polinucleotídica, un cebador o cebadores (por ejemplo, un par de cebadores), en particular uno o más cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción de transcripción inversa (RT) o la secuenciación del ADN.

En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término ácido nucleico comprende ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARNc, ARNm, microARN (miARN) y ARN de interferencia pequeño (ARNip). Un ácido nucleico puede consistir en un gen completo o en una parte del mismo. El ácido nucleico también puede ser un ácido nucleico artificial. Los ácidos nucleicos artificiales incluyen poliamida o ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN de origen natural por cambios en la cadena principal de la molécula, como es bien conocido por el experto en la técnica.

Como se usa en este documento, el término "microARN" y variaciones tales como "miARN" y "miR" es entendido por el experto en la materia y se refiere a una molécula corta de ácido ribonucleico (ARN) que se encuentra en células eucariotas y en fluidos corporales de organismos metazoos. Los miARN incluyen miARN humanos, miARN monocatenarios maduros, miARN precursores (pre-miR) y variantes de los mismos, que pueden ser de origen natural. En algunos casos, el término "miARN" también incluye transcritos de miARN primarios (pri-miARN) y miARN dúplex. A menos que se indique lo contrario, cuando se usa en este documento, el nombre de un miARN específico se refiere al miARN maduro. El precursor de miARN puede constar de 25 a varios miles de nucleótidos, típicamente de 40 a 130, de 50 a 120 o de 60 a 110 nucleótidos. Normalmente, un miARN maduro consta de 5 a 100 nucleótidos, a menudo de 10 a 50, de 12 a 40 o de 18 a 26 nucleótidos. El término miARN también incluye la cadena "guía" que finalmente entra en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) así como en la cadena "pasajera" complementaria al mismo.

La secuencia de varios miARN se conoce en la técnica y el experto en la materia puede evaluarla fácilmente mediante bases de datos de secuencias bien conocidas, como por ejemplo, miRBase (http://www.mirbase.org/), (Griffiths-Jones S., NAR 2004 32 (publicación de la base de datos): D109-D111; Kozomara A, Griffiths-Jones S., NAR 2011 39 (publicación de la base de datos): D152-D157). Se entiende que los números de acceso a la base de datos indicados a continuación de los miARN individuales son los de miARN de origen humano. Sin embargo, estas entradas de la base de datos también proporcionan los números de acceso a la base de datos del respectivo miARN de diferente origen, como por ejemplo, mirNAs de cualquier mamífero, reptil o ave, como por ejemplo, los seleccionados del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga, carei, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos y miARN de gorilas. También se entiende que la referencia a un miARN específico por su número (por ejemplo, miR-652) se refiere igualmente a la secuencia -3p y -5p (miR-652-3p y miR-652-5p).

La secuencia de miR-652 está depositada en miRBase ID MI0003667 que comprende hsa-miR-652-3p (MIMAT0003322) y hsa-miR-652-5p (MIMAT0022709), que corresponde a la SEQ Id NO: 1 y 2, respectivamente, de la presente invención.

La secuencia de miR-801 se depositó en miRBase ID MI0005202: 5'-GAUUGCUCUGCGUGCGGAAUCGAC-3', sin embargo, ahora se considera como un fragmento de ARN espliceosomal U11 y, por tanto, se eliminó de la miRBase. El pre-miRNA-801 está localizado en crm1: 28847698 - 28847793. Su secuencia corresponde a la SEQ ID NO: 3 de la presente invención.

miR-376c, también denominado miR-368, está depositado en miRBase ID MI0000776, que comprende miR-376c-3p (MIMAT0000720) y hsa-miR-376c-5p (MIMAT0022861), que corresponde a la SEQ ID n O: 4 y 5, respectivamente, de la presente invención.

La secuencia de miR-376a está depositada en miRBase ID MI0000784, que comprende hsa-miR-376a-3p (MIMAT0000729) y hsa-miR-376a-5p (MIMAT0003386), que corresponde a la SEQ ID NO: 6 y 7, respectivamente, de la presente invención.

La secuencia de miR-127 está depositada en miRBase ID MI0000472, que comprende hsa-miR-127-3p (MIMAT0000446) y hsa-miR-127-5p (MIMAT0004604), que corresponde a la SEQ ID NO: 8 y 9, respectivamente, de la presente invención.

La secuencia de miR-409 está depositada en miRBase ID MI0001735, que comprende hsa-miR-409-3p (MIMAT0001639) y hsa-miR-409-5p (MIMAT0001638), que corresponde a la SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente, de la presente invención.

La secuencia de miR-148b está depositada en miRBase ID MI0000811, que comprende hsa-miR-148b-3p (MIMAT0000759) y hsa-miR-148b-5p (MIMAT0004699), que corresponde a la SeQ ID NO: 12 y 13, respectivamente, de la presente invención.

El término "combinación de miARN" se refiere a combinaciones de miARN de la presente invención. La cantidad de miARN se puede determinar en una muestra de un sujeto mediante técnicas bien conocidas en el arte. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, la cantidad puede determinarse mediante técnicas basadas en PCR para cuantificar la cantidad de un polinucleótido o mediante otros métodos como espectrometría de masas o secuenciación (de próxima generación) o uno de los métodos descritos en los ejemplos (Cissell KA, Deo SK. Trends in microRNA detection. Anal Bioanal Chem. 2009; 394 (4): 1109-1116 o de Planell-Saguer M, Rodicio MC. Analytical aspects of microRNA in diagnostics: a review. Anal Chim Acta, 2011, 12 de agosto; 699 (2): 134-52). El término "determinación de las cantidades de al menos los miARN de una combinación de miARN", como se usa en el presente documento, se refiere preferiblemente a determinar la cantidad de cada uno de los miARN de la combinación por separado para poder comparar la cantidad de cada miARN de la combinación con una referencia específica para dicho miARN.

El término "sonda", como se usa en este documento, se refiere a un oligonucleótido monocatenario que se usa típicamente para la detección de ARN diana y/o secuencias de ADN que son complementarias a la secuencia de la sonda. Una sonda se hibrida con un ácido nucleico monocatenario (ADN o ARN) cuya secuencia de nucleótidos permite el apareamiento de nucleótidos debido a la complementariedad entre la sonda y la secuencia diana. La longitud de una sonda depende del uso previsto, así como de la especificidad requerida de la sonda. Normalmente, una sonda es de 20-500 (es decir, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500) nucleótidos de longitud, preferiblemente de 20-100 nucleótidos, más preferiblemente de 20­ 50. Para la detección de microARN las sondas tienen entre 12 y 30 nucleótidos. Las sondas se utilizan en diversas configuraciones experimentales tales como, entre otras, transferencias Southern y Northern, para PCR en tiempo real e hibridación in situ (ISH), así como para experimentos de microarreglos. Una sonda puede no estar marcada, marcada directamente o marcada indirectamente, tal como con biotina a la que se puede unir más tarde un complejo de estreptavidina. Dicho marcador puede ser una molécula detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores adecuados incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y otras entidades que son o pueden hacerse detectables. Se puede incorporar un marcador en ácidos nucleicos en cualquier posición, por ejemplo, en el extremo 3', en el extremo 5' o internamente. El término "sonda" también abarca ácidos nucleicos que se diferencian en la composición de su estructura tal como, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA) y ácidos nucleicos de treosa (t Na ).

El término "cebador", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido monocatenario que normalmente sirve como punto de partida para las enzimas que replican el ADN. Un cebador se une o se hibrida con una plantilla de ADN y típicamente comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de ADN a la que se supone que se une. Un cebador también puede comprender secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias que sirven como sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, Bam HI, Hind III, etc.). La longitud de un cebador se elige en función del uso previsto. Por ejemplo, los cebadores utilizados para la amplificación de ADN en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) suelen tener una longitud de al menos 10 nucleótidos, preferiblemente entre 10 y 50 (es decir, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50) nucleótidos, más preferiblemente entre 15 y 30 nucleótidos. Se utilizan cebadores más cortos de al menos 5 nucleótidos para la secuenciación de plantillas de ADN. También se incluyen en el término "cebador" los "cebadores degenerados" que son una mezcla de cebadores similares, pero no idénticos. Un cebador se puede marcar o etiquetar con una molécula marcadora detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos.

El término "nivel de expresión" se refiere a la cantidad de producto génico presente en el cuerpo o una muestra en un determinado momento. El nivel de expresión puede, por ejemplo, ser medido/cuantificado/detectado por medio de la proteína o ARNm expresado a partir del gen. El nivel de expresión puede cuantificarse, por ejemplo, normalizando la cantidad de producto génico de interés presente en una muestra con la cantidad total de producto génico de la misma categoría (proteína total o ARNm) en la misma muestra o una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra tomada al mismo tiempo del mismo individuo o de una parte de idéntico tamaño (peso, volumen) de la misma muestra) o identificando la cantidad de producto génico de interés por tamaño de muestra definido (peso, volumen, etc.). El nivel de expresión puede medirse o detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, métodos para la detección y cuantificación directa del producto génico de interés (tal como la espectrometría de masas) o métodos para la detección y medición indirecta del producto génico de interés que normalmente funcionan mediante la unión del producto génico de interés con una o más moléculas diferentes o medios de detección (por ejemplo, cebador o cebadores, sondas, anticuerpos, armazones de proteínas) específicos para el producto génico de interés. La determinación del nivel de copias de genes que comprende también la determinación de la ausencia o presencia de uno o más fragmentos (por ejemplo, mediante sondas de ácido nucleico o cebadores, por ejemplo, PCR cuantitativa, PCR de amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA)) también se encuentra dentro del conocimiento del experto en la materia.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier cadena de aminoácidos unida a péptidos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional. Las proteínas utilizables en la presente invención (que incluyen derivados de proteínas, variantes de proteínas, fragmentos de proteínas, segmentos de proteínas, epítopos de proteínas y dominios de proteínas) pueden modificarse adicionalmente mediante modificación química. Esto significa que dicho polipéptido químicamente modificado comprende otros grupos químicos además de los 20 aminoácidos naturales. Los ejemplos de tales otros grupos químicos incluyen, sin limitación, aminoácidos glicosilados y aminoácidos fosforilados. Las modificaciones químicas de un polipéptido pueden proporcionar propiedades ventajosas en comparación con el polipéptido original, por ejemplo, uno o más de mejor estabilidad, mayor vida media biológica o mayor solubilidad en agua. Las modificaciones químicas aplicables a las variantes utilizables en la presente invención incluyen, sin limitación: PEGilación, glicosilación de polipéptidos originales no glicosilados o la modificación del patrón de glicosilación presente en el polipéptido original.

En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "péptido" se refiere a un polímero corto de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Tiene los mismos enlaces químicos (peptídicos) que las proteínas, pero por lo general es más corto. El péptido más corto es un dipéptido, que consta de dos aminoácidos unidos por un solo enlace peptídico. También puede haber un tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, etc. Preferiblemente, el péptido tiene una longitud de hasta 8, 10, 12, 15, 18 o 20 aminoácidos. Un péptido tiene un extremo amino y un extremo carboxilo, a menos que sea un péptido cíclico.

En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "polipéptido" se refiere a una única cadena lineal de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos y preferiblemente comprende al menos aproximadamente 21 aminoácidos. Un polipéptido puede ser una cadena de una proteína que está compuesta por más de una cadena o puede ser la proteína misma si la proteína está compuesta por una cadena.

En el contexto de los diferentes aspectos de la presente invención, el término "proteína" se refiere a una molécula que comprende uno o más polipéptidos que retoman una estructura secundaria y terciaria y adicionalmente se refiere a una proteína que se compone de varios polipéptidos, es decir varias subunidades, formando estructuras cuaternarias. La proteína a veces tiene grupos no peptídicos unidos, que pueden denominarse grupos prostéticos o cofactores. La estructura primaria de una proteína o polipéptido es la secuencia de aminoácidos en la cadena polipeptídica. La estructura secundaria de una proteína es la forma tridimensional general de los segmentos locales de la proteína. Sin embargo, no describe posiciones atómicas específicas en el espacio tridimensional, que se consideran estructura terciaria. En las proteínas, la estructura secundaria está definida por patrones de enlaces de hidrógeno entre los grupos amida y carboxilo de la cadena principal. La estructura terciaria de una proteína es la estructura tridimensional de la proteína determinada por las coordenadas atómicas. La estructura cuaternaria es la disposición de múltiples moléculas de proteínas o polipéptidos plegadas o enrolladas en un complejo de múltiples subunidades. Los términos "cadena de aminoácidos" y "cadena polipeptídica" se utilizan como sinónimos en el contexto de la presente invención. El término "postraduccional" usado en este documento se refiere a eventos que ocurren después de la traducción de un triplete de nucleótidos en un aminoácido y la formación de un enlace peptídico con el aminoácido anterior en la secuencia. Tales eventos postraduccionales pueden ocurrir después de que se formó todo el polipéptido o ya durante el proceso de traducción en aquellas partes del polipéptido que ya se han traducido. Los eventos postraduccionales típicamente alteran o modifican las propiedades químicas o estructurales del polipéptido resultante. Los ejemplos de eventos postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, eventos tales como glicosilación o fosforilación de aminoácidos, o escisión de la cadena peptídica, por ejemplo, por una endopeptidasa. El término "cotraduccional" usado en este documento se refiere a eventos que ocurren durante el proceso de traducción de un triplete de nucleótidos en una cadena de aminoácidos. Estos eventos típicamente alteran o modifican las propiedades químicas o estructurales de la cadena de aminoácidos resultante. Los ejemplos de eventos cotraduccionales incluyen, pero no se limitan a, eventos que pueden detener el proceso de traducción por completo o interrumpir la formación del enlace peptídico dando como resultado dos productos de traducción discretos.

El término "segmento" se refiere a cualquier parte de una macromolécula (por ejemplo, un polipéptido, proteína o poliproteína) en la que se puede dividir esta macromolécula. Una macromolécula puede constar de uno o más segmentos. Tal segmentación puede existir debido a propiedades funcionales (por ejemplo, que tiene características inmunorreactivas o funciones de unión a la membrana) o estructurales (por ejemplo, secuencia de nucleótidos o aminoácidos, o estructura secundaria o terciaria) de la macromolécula y/o del segmento individual. En el contexto de la presente invención, se prefiere que el término "segmento" se refiera a una parte de una proteína o poliproteína. Se prefiere particularmente que dicho segmento se pliegue y/o funcione independientemente del resto de la proteína o poliproteína.

Un "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es el segmento de una macromolécula que es reconocido por el sistema inmunológico, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Dicho epítopo es la parte o segmento de una macromolécula capaz de unirse a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En este contexto, el término "unión" se refiere preferiblemente a una unión específica. En el contexto de la presente invención se prefiere que el término "epítopo" se refiera al segmento de proteína o poliproteína que es reconocido por el sistema inmunológico. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

Como se usa en este documento, el término "dominio" se refiere al segmento de una secuencia o estructura de proteína o poliproteína (o secuencia de nucleótidos correspondiente) que puede evolucionar, funcionar y/o existir independientemente del resto de la cadena de proteína. Normalmente, una proteína consta de uno o varios dominios, siendo cada uno de ellos una estructura tridimensional que es estable y se pliega independientemente del resto de la cadena de la proteína. Dicho dominio típicamente forma una unidad funcional independiente dentro de la proteína (por ejemplo, dominios transmembrana, dominios similares a inmunoglobulinas o dominios de unión al ADN).

La secuencia de aminoácidos de varios péptidos y proteínas, así como las secuencias de nucleótidos que codifican los respectivos péptidos y proteínas son bien conocidas en la técnica y fácilmente evaluables por el experto a través de bases de datos de secuencias bien conocidas, como por ejemplo, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Se entiende que los números de acceso a la base de datos indicados a continuación de la secuencia individual son los de origen humano. Sin embargo, estas entradas de la base de datos también proporcionan los números de acceso a la base de datos de las respectivas secuencias de nucleótidos de diferente origen, como por ejemplo, secuencias de aminoácidos o nucleótidos de cualquier origen de mamífero, reptil o ave, como por ejemplo, los seleccionados del grupo que consta de secuencias de aminoácidos o nucleótidos de nucleótidos de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos y gorilas.

HYAL2:

GenBank acceso No.: NM_003773.4 (GI: 289802998) para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 14 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_033158.4 (GI: 289802999) para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 15 de la presente solicitud;

GenBank acceso No.: NP_003764.3 (GI: 15022801), para el polipéptido HYAL2 codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 16 de la presente invención, y

GenBank acceso No.: n P_149348.2 (GI: 34304377), para el polipéptido HYAL2 codificado por la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 17 de la presente invención;

MGRN1:

GenBank acceso No.: NM_001142289.2 para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 18 de la presente invención, y

GenBank acceso No.: NM_001142290.2 para la variante de transcripción 3, que corresponde a la SEQ ID NO: 19 de la presente invención, y

GenBank acceso No.: NM_001142291.2 para la variante de transcripción 4, que corresponde a la SEQ ID NO: 20 de la presente invención, y

GenBank acceso No.: NM_015246.3 para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 21 de la presente invención, y

GenBank acceso No.: NP_001135761.2 para el polipéptido MGRN1 codificado por la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 22 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_001135762.1 para el polipéptido MGRN1 codificado por la variante de transcripción 3, que corresponde a la SEQ ID NO: 23 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_001135763.2 para el polipéptido MGRN1 codificado por la variante de transcripción 4, que corresponde a la SEQ ID NO: 24 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_056061.1 para el polipéptido MGRN1 codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 25 de la presente invención;

RPTOR

GenBank acceso No.: NM_001163034.1 para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 26 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_020761.2 para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 27 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP 001156506.1 para el polipéptido RPTOR codificado por la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 28 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_065812.1 para el polipéptido RPTOR codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 29 de la presente invención;

SLC22A18

GenBank acceso No.: NM_002555.5 para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 30 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_183233.2 para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 31 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP_002546.3 para el polipéptido SLC22A18 codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 32 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_899056.2 para el polipéptido SLC22A18 codificado por la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 33 de la presente invención;

FUT7

GenBank acceso No.: NM_004479.3 para la transcripción, que corresponde a la SEQ ID NO: 34 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP_004470.1 para el polipéptido FUT7 codificado por la transcripción, que corresponde a la SEQ ID NO: 35 de la presente invención;

RAPSN

GenBank acceso No.: NM_005055.4 para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 36 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_032645.4 para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 37 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP_005046.2 para el polipéptido RAPSN codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 38 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_116034.2 para el polipéptido RAPSN codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 39 de la presente invención;

S100P

GenBank acceso No.: NM_005980.2 para la transcripción, que corresponde a la SEQ ID NO: 40 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP_005971.1 para el polipéptido S100P codificado por la transcripción, que corresponde a la SEQ ID NO: 41 de la presente invención;

DYRK4

GenBank acceso No.: NM_001282285.1 para la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 42 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_001282286.1 para la variante de transcripción 3, que corresponde a la SEQ ID NO: 43 de la presente invención

GenBank acceso No.: NM_003845.2 para la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 44 de la presente invención

GenBank acceso No.: NP_001269214.1 para el polipéptido DYRK4 codificado por la variante de transcripción 2, que corresponde a la SEQ ID NO: 45 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_001269215.1 para el polipéptido DYRK4 codificado por la variante de transcripción 3, que corresponde a la SEQ ID NO: 46 de la presente invención;

GenBank acceso No.: NP_003836.1 para el polipéptido DYRK4 codificado por la variante de transcripción 1, que corresponde a la SEQ ID NO: 47 de la presente invención.

Como se usa en este documento, el término "variante" debe entenderse como un polinucleótido o proteína que difiere en comparación con el polinucleótido o proteína del que se deriva por uno o más cambios en su longitud o secuencia. El polipéptido o polinucleótido del que se deriva una proteína o variante de ácido nucleico también se conoce como polipéptido o polinucleótido original. El término "variante" comprende "fragmentos" o "derivados" de la molécula original. Normalmente, los "fragmentos" son más pequeños en longitud o tamaño que la molécula original, mientras que los "derivados" exhiben una o más diferencias en su secuencia en comparación con la molécula original. También abarcó moléculas modificadas tales como, pero sin limitarse a, proteínas modificadas postraduccionalmente (por ejemplo, proteínas glicosiladas, biotiniladas, fosforiladas, ubiquitinadas, palmitoiladas o escindidas proteolíticamente) y ácidos nucleicos modificados tales como ADN metilado. También las mezclas de diferentes moléculas tales como, pero sin limitarse a, híbridos de ARN-ADN, están englobadas por el término "variante". Normalmente, una variante se construye artificialmente, preferiblemente por medios de tecnología genética, mientras que el polipéptido o polinucleótido original es una proteína o polinucleótido de tipo silvestre. Sin embargo, también debe entenderse que las variantes de origen natural están englobadas por el término "variante" como se usa en este documento. Además, las variantes utilizables en la presente invención también pueden derivarse de homólogos, ortólogos o parálogos de la molécula original o de una variante construida artificialmente, siempre que la variante exhiba al menos una actividad biológica de la molécula original, es decir, sea funcionalmente activa.

Una variante utilizable en la presente invención exhibe un número total de hasta 200 (hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200) cambios en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos (es decir, intercambios, inserciones, eliminaciones, truncamientos 5'-, 3'-, del terminal N y/o del terminal C). Los intercambios de aminoácidos pueden ser conservadores y/o no conservadores. Una variante utilizable en la presente invención se diferencia de la proteína o polinucleótido del que se deriva en hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 intercambios de aminoácidos o ácidos nucleicos. Alternativa o adicionalmente, una "variante" como se usa en el presente documento, puede caracterizarse por un cierto grado de identidad de secuencia con el polipéptido original o el polinucleótido original del que se deriva. Más precisamente, una variante de proteína en el contexto de la presente invención exhibe al menos un 80% de identidad de secuencia con su polipéptido original. Una variante de polinucleótido en el contexto de la presente invención exhibe al menos un 80% de identidad de secuencia con su polinucleótido original. Preferiblemente, la identidad de secuencia de las variantes de proteínas se encuentra en un tramo continuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90,100 o más aminoácidos. Preferiblemente, la identidad de secuencia de las variantes de polinucleótidos se encuentra en un tramo continuo de 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 o más nucleótidos.

El término "al menos 80% de identidad de secuencia" se usa en toda la memoria descriptiva con respecto a las comparaciones de secuencias de polipéptidos y polinucleótidos. Esta expresión se refiere preferiblemente a una identidad de secuencia de al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos al menos el 98%, o al menos el 99% con el polipéptido de referencia respectivo o con el polinucleótido de referencia respectivo. Preferiblemente, el polipéptido en cuestión y el polipéptido de referencia exhiben la identidad de secuencia indicada en un tramo continuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos o en toda la longitud del polipéptido de referencia. Preferiblemente, el polinucleótido en cuestión y el polinucleótido de referencia exhiben la identidad de secuencia indicada en un tramo continuo de 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 o más nucleótidos o en toda la longitud del polipéptido de referencia.

Los términos "variante de eliminación" y "fragmento" se usan indistintamente en el presente documento. Un fragmento puede ser de origen natural (por ejemplo, variantes de corte y empalme) o puede construirse artificialmente, preferiblemente por medios tecnológicos genéticos. Preferiblemente, un fragmento (o variante de eliminación) tiene una eliminación de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos o ácidos nucleicos en comparación con el polipéptido original. En caso de que se comparen dos secuencias y no se especifique la secuencia de referencia en comparación con la que se calculará el porcentaje de identidad de secuencia, la identidad de secuencia se calculará con referencia a la más larga de las dos secuencias a comparar, si no se indica específicamente de otra manera. Si se indica la secuencia de referencia, la identidad de secuencia se determina sobre la base de la longitud completa de la secuencia de referencia indicada por SEQ ID, si no se indica específicamente lo contrario.

La similitud de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, es decir, el porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar mediante alineamientos de secuencias. Tales alineamientos se pueden llevar a cabo con varios algoritmos conocidos en la técnica, preferiblemente con el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), con hmmalign (paquete HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) o con el algoritmo CLUSTAL (Thompson, JD, Higgins, DG & Gibson, TJ (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponible por ejemplo, en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o en http://npsapbil.ibcpor ejemplo,fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Los parámetros preferidos que se utilizan son los parámetros predeterminados, ya que se establecen en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. El grado de identidad de secuencia (coincidencia de secuencia) se puede calcular usando por ejemplo, BLAST, BLAT o BlastZ (o BlastX). Un algoritmo similar se incorpora a los programas BLASTN y b La St P de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de polinucleótidos BLAST se realizan con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de polinucleótidos homólogas.

La "hibridación" también se puede usar como una medida de identidad de secuencia u homología entre dos secuencias de ácido nucleico. Se puede usar una secuencia de ácido nucleico que codifica F, N o M2-1, o una porción de cualquiera de estos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar. La hibridación de una sonda F, N o M2-1 con ADN o ARN de una fuente de prueba es una indicación de la presencia de ADN o ARN F, ADN o ARN N, o ADN o ARN M2-1, respectivamente, en la fuente de prueba. Las condiciones de hibridación son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Las "condiciones de hibridación moderadas" se definen como equivalentes a la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 2X a 30 °C, seguido de un lavado en SSC 1X, s Ds al 0.1% a 50 °C. Las "condiciones muy rigurosas" se definen como equivalentes a la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a 45 °C, seguido de un lavado en SSC 0.2 X, Sd S al 0.1% a 65 °C.

Se prefieren las sustituciones de aminoácidos semiconservadoras y especialmente conservadoras, en las que un aminoácido está sustituido por un aminoácido relacionado químicamente. Las sustituciones típicas se encuentran entre los aminoácidos alifáticos, entre los aminoácidos que tienen una cadena lateral de hidroxilo alifático, entre los aminoácidos que tienen residuos ácidos, entre los derivados de amida, entre los aminoácidos con residuos básicos o los aminoácidos que tienen residuos aromáticos. Las sustituciones típicas semiconservadoras y conservadoras son:

Aminoácido Sustitución conservadora Sustitución semiconservadora

(continuación)

Aminoácido Sustitución conservadora Sustitución semiconservadora

R K; H N; Q; S; T; D; E; A

S A; T; G; N D; E; R; K

T A; S; G; N; V D; E; R; K; I

V A; L; I M; T; C; N

W F; Y; H L; M; I; V; C

Y F; W; H L; M; I; V; C

El cambio de A, F, H, I, L, M, P, V, W o Y por C es semiconservador si la nueva cisteína permanece como un tiol libre. Además, el experto en la materia apreciará que las glicinas en posiciones estéricamente exigentes no deben sustituirse y que P no debe introducirse en partes de la proteína que tienen una estructura de hélice alfa o de lámina beta.

El término "tejido", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de células del mismo origen que cumplen una función específica de manera concertada. Los ejemplos de un tejido incluyen, pero no se limitan a, tejido conectivo, tejido muscular, tejido nervioso y tejido epitelial. Múltiples tejidos juntos forman un "órgano" para llevar a cabo una función específica. Los ejemplos de un órgano incluyen, pero no se limitan a, glándulas, músculos, sangre, cerebro, corazón, hígado, riñón, estómago, esqueleto, articulaciones y piel.

El término "enfermedad" y "trastorno" se usan indistintamente en este documento, refiriéndose a una condición anormal, especialmente una condición médica anormal tal como una enfermedad o lesión, en la que un tejido, un órgano o un individuo ya no es capaz de cumplir de manera eficiente su función. Normalmente, pero no necesariamente, una enfermedad se asocia con síntomas o signos específicos que indican la presencia de dicha enfermedad. Por tanto, la presencia de tales síntomas o signos puede ser indicativa de un tejido, un órgano o un individuo que padece una enfermedad. Una alteración de estos síntomas o signos puede ser indicativa de la progresión de dicha enfermedad. La progresión de una enfermedad se caracteriza típicamente por un aumento o disminución de tales síntomas o signos que pueden indicar un "empeoramiento" o "mejora" de la enfermedad. El "empeoramiento" de una enfermedad se caracteriza por una disminución de la capacidad de un tejido, órgano u organismo para cumplir su función de manera eficiente, mientras que el "mejoramiento" de una enfermedad se caracteriza típicamente por un aumento en la capacidad de un tejido, un órgano o un individuo para cumplir con su función de manera eficiente. Un tejido, un órgano o un individuo que está en "riesgo de desarrollar" una enfermedad se encuentra en un estado saludable pero muestra la posibilidad de que surja una enfermedad. Por lo general, el riesgo de desarrollar una enfermedad está asociado con signos o síntomas tempranos o débiles de dicha enfermedad. En tal caso, el tratamiento aún puede prevenir la aparición de la enfermedad. Los ejemplos de una enfermedad incluyen, pero no se limitan a, enfermedades traumáticas, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas, afecciones cutáneas, enfermedades endocrinas, enfermedades intestinales, trastornos neurológicos, enfermedades de las articulaciones, trastornos genéticos, enfermedades autoinmunes y varios tipos de cáncer.

"Cáncer" se refiere a un trastorno proliferativo que implica un crecimiento celular anormal que puede invadir o diseminarse a otros tejidos u órganos de un sujeto. Los cánceres se clasifican de acuerdo con el tipo de célula a la que se asemejan las células tumorales y, por lo tanto, se presume que es el origen del tumor. Estos tipos incluyen, pero no se limitan a, carcinoma (cánceres derivados de células epiteliales), sarcoma (cánceres que surgen del tejido conectivo tal como, por ejemplo, hueso, cartílago, grasa, nervio), linfoma y leucemia (cáncer que surge de células hematopoyéticas que salen de la médula y tienden a madurar en los ganglios linfáticos y la sangre), tumor de células germinales (cánceres derivados de células pluripotentes) y blastoma (cánceres derivados de células "precursoras" inmaduras o tejido embrionario). En particular, el cáncer incluye, pero no se limita a, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, cáncer cerebeloso o cerebral infantil, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga extrahepático, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer de cerebro, tumor cerebral (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de vías visuales e hipotalámico), cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, cáncer de cuello uterino, bronquitis crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneal, extragonadal u ovárico), tumor trofoblástico gestacional, glioma del tallo cerebral, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, glioma hipotalámico y de las vías visuales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemia (linfoblástica aguda, mieloide aguda, linfocítica crónica, mielógena crónica), cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (células no pequeñas, células pequeñas), linfomas (relacionados con el SIDA, Burkitt, células T cutáneas, Hodgkin, sistema nervioso central primario), macroglobulinemia (Waldenstrom), cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, mieloma, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal y de seno paranasal, carcinoma del seno paranasal, cáncer oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinativas de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales, pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma (familia de tumores Ewing, Kaposi, tejido blando, útero), síndrome de Sezary, cáncer de piel (carcinoma, melanoma, no melanoma, células de Merkel), cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter, tumor trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer de útero (endometrio, sarcoma), cáncer de vagina, glioma de las vías visuales y del hipotálamo, cáncer de vulva, tumor de Wilms (cáncer de riñón).

Como se usa en este documento, el término "tumor de mama" se refiere a una hiperproliferación anormal de células de tejido de mama en un sujeto, que puede ser un tumor benigno (no canceroso) o un tumor maligno (canceroso). Los tumores de mama benignos, preferiblemente, incluyen fibroadenomas, tumores de células granulares, papilomas intraductales y tumores filoides. Un tumor maligno es un cáncer de mama (BC) como se especificó anteriormente en el presente documento.

Como se usa en este documento, el término "cáncer de mama metastásico" (MBC) se refiere a un cáncer de mama en el que las células cancerosas crecen como metástasis en al menos un sitio secundario, es decir, un órgano o parte del cuerpo no adyacente de un sujeto.

Como se usa en este documento, el término "tumor de ovario" se refiere a una hiperproliferación anormal de células de tejido de ovario en un sujeto, que puede ser un tumor benigno (no canceroso) o un tumor maligno (canceroso). Un tumor maligno es un cáncer de ovario (OvCa) como se especificó anteriormente en el presente documento.

Como se usa en este documento, el término "tumor pancreático" se refiere a una hiperproliferación anormal de células de tejido ovárico en un sujeto, que puede ser un tumor benigno (no canceroso) o un tumor maligno (canceroso). Un tumor maligno es un cáncer de páncreas (PaCa) como se especificó anteriormente en el presente documento.

El término "célula tumoral circulante" o "CTC" es entendido por el experto en la materia y se refiere a una célula tumoral separada del tumor primario o metastásico y que circula en el torrente sanguíneo. Debe entenderse que el número de CTC es un marcador de pronóstico para el resultado de la enfermedad y la terapia en el cáncer de mama, por ejemplo, para la supervivencia general. El término "estado de CTC" se refiere a la presencia o ausencia de más de una cantidad de referencia de CTC en una muestra. Preferiblemente, la cantidad de referencia de CTC es 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 o 7.5 CTC/7.5 ml de sangre, siendo más preferido 5 CTC/7.5 ml de sangre. En sujetos en los que una muestra de sangre comprende más de dicha cantidad de referencia de CTC, el estado de CTC es desfavorable, lo que indica una baja probabilidad de éxito del tratamiento y una baja probabilidad de supervivencia general y sin progresión. Por el contrario, en sujetos en los que una muestra de sangre comprende menos de dicha cantidad de referencia de CTC, el estado de CTC es favorable, lo que indica una alta probabilidad de tratamiento exitoso y una alta probabilidad de supervivencia general y sin progresión. Ventajosamente, se ha encontrado en la presente invención que las cantidades de los miARN usados para determinar el estado de CTC de un sujeto como se define a continuación en el presente documento son indicativas del estado de CTC de un sujeto. Por tanto, determinar el estado de CTC en un sujeto como se usa en este documento se relaciona con la determinación de la cantidad o cantidades de dicho miARN o dichos miARN y así obtener una indicación del estado de CTC del sujeto. Preferiblemente, el estado puede diagnosticarse como "favorable" o "desfavorable".

Los "síntomas" de una enfermedad son implicaciones de la enfermedad perceptibles por el tejido, órgano u organismo que tiene dicha enfermedad e incluyen, entre otros, dolor, debilidad, sensibilidad, tensión, rigidez y espasmo del tejido, un órgano o un individuo. Los "signos" o "señales" de una enfermedad incluyen, entre otros, el cambio o alteración, tal como la presencia, ausencia, aumento o elevación, disminución o descenso, de indicadores específicos tales como biomarcadores o marcadores moleculares, o el desarrollo, presencia, o empeoramiento de los síntomas.

El término "indicador" y "marcador" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un signo o señal para una condición o se usa para monitorear una condición. Tal "condición" se refiere al estado biológico de una célula, tejido u órgano o al estado de salud y/o enfermedad de un individuo. Un indicador puede ser la presencia o ausencia de una molécula, que incluye pero no se limita a péptido, proteína y ácido nucleico, o puede ser un cambio en el nivel de expresión o patrón de dicha molécula en una célula, tejido, órgano o individuo. Un indicador puede ser un signo del inicio, desarrollo o presencia de una enfermedad en un individuo o de la progresión adicional de dicha enfermedad. Un indicador también puede ser una señal del riesgo de desarrollar una enfermedad en un individuo.

Como se usa en este documento, el término "producto génico" se refiere a una entidad física, preferiblemente macromolecular, cuya presencia en una célula depende de la expresión de dicho gen en dicha célula. Los mecanismos de expresión génica son bien conocidos por los expertos en la técnica para incluir los mecanismos básicos de transcripción, es decir, formación de ARN correspondiente a dicho gen o partes del mismo, y traducción, es decir, producción de moléculas polipeptídicas que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por dicho ARN de acuerdo con el código genético; los expertos en la técnica conocen bien que otros procesos celulares también pueden estar implicados en la expresión génica, por ejemplo, procesamiento de ARN, edición de ARN, procesamiento proteolítico, edición de proteínas y similares. Por tanto, el término producto génico incluye ARN, preferiblemente ARNm, así como polipéptidos expresados a partir de dicho gen. De lo anterior queda claro que el término producto génico también incluye fragmentos de dicho o dichos ARN, preferiblemente con una longitud de al menos diez, al menos doce, al menos 20, al menos 50 o al menos 100 nucleótidos, y fragmentos (péptidos) de dichos polipéptidos, preferiblemente con una longitud de al menos ocho, al menos diez, al menos doce, al menos 15, al menos 20 aminoácidos.

"Determinar" la cantidad de un producto génico se refiere a medir la cantidad de dicho producto génico, preferiblemente de forma semicuantitativa o cuantitativa. La medición se puede realizar directa o indirectamente. Preferiblemente, la medición se realiza en una muestra procesada, comprendiendo dicho procesamiento la extracción de polinucleótidos o polipéptidos de la muestra. Sin embargo, también se prevé en la presente invención que el producto génico se determine in situ, por ejemplo, por inmunohistoquímica (IHC).

La cantidad de polinucleótidos de la presente invención se puede determinar con varios métodos bien conocidos en la técnica. La cuantificación preferiblemente es absoluta, es decir, se refiere a un número específico de polinucleótidos o, más preferiblemente, relativa, es decir, se mide en unidades normalizadas arbitrarias. Preferiblemente, se lleva a cabo una normalización calculando la proporción de varios polinucleótidos específicos y el número total de polinucleótidos o un producto de amplificación de referencia. Los métodos que permiten la cuantificación absoluta o relativa son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos de PCR cuantitativos son métodos de cuantificación relativa; si se incorpora una curva de calibración en tal ensayo, la cuantificación relativa se puede utilizar para obtener una cuantificación absoluta. Otros métodos conocidos son, por ejemplo, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) o el método de ensayo de amplificación de la señal de ADN ramificado en combinación con detección de transferencia de puntos o Luminex de polinucleótidos amplificados. Preferiblemente, las cantidades de polinucleótidos son cantidades de polinucleótidos normalizadas, es decir, las cantidades de polinucleótidos obtenidas se establecen en relación con al menos un producto de amplificación de referencia, por lo que, preferiblemente, se establecen las cantidades de polinucleótidos en relación con el número de células en la muestra y/o la eficiencia de amplificación de polinucleótidos. Por tanto, preferiblemente, el producto de amplificación de referencia es un producto obtenido a partir de un polinucleótido que se sabe que tiene una abundancia constante en cada célula, es decir, un polinucleótido comprendido en la mayoría, preferiblemente en todas, las células de una muestra en aproximadamente la misma cantidad. Más preferiblemente, el producto de amplificación de referencia se amplifica a partir de un gen cromosómico o mitocondrial o del ARNm de un gen de mantenimiento. La cantidad de polinucleótidos podría determinarse mediante secuenciación de escopeta, PCR puente, secuenciación de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación de próxima generación, secuenciación de una sola molécula en tiempo real, secuenciación de torrente de iones, secuenciación por síntesis, secuenciación por ligación, secuenciación de firmas masivamente paralelas, secuenciación Polony, secuenciación de nanoesferas de ADN, secuenciación de una sola molécula de helioscopio, secuenciación de una sola molécula en tiempo real (SMRT), secuenciación de ADN de nanoporo, secuenciación de ADN de corrientes de tunelización, secuenciación por hibridación, secuenciación con espectrometría de masas, secuenciación de microfluido de Sanger, secuenciación de ADN por microscopía electrónica de transmisión, secuenciación de ARN polimerasa, secuenciación de alto rendimiento de virus in vitro, aislamiento de cromatina mediante purificación de ARN (ChIRP-Seq), secuenciación global de ejecución (GRO-Seq), secuenciación de perfiles de ribosomas (Ribo-Seq)/ARTseq, secuenciación de inmunoprecipitación de ARN (RIP-Seq), secuenciación de alto rendimiento de la biblioteca de ADNc CLIP (HITS-CLIP), secuenciación de entrecruzamiento e inmunoprecipitación, ribonucleósido fotoactivable - entrecruzamiento e inmunoprecipitación mejoradas (PAR-CLIP), CLIP de resolución de nucleótidos individuales (iCLIP), secuenciación nativa de transcripción de alargamiento (NET-Seq), purificación dirigida de ARNm polisómico (TRAP-Seq), entrecruzamiento, ligadura y secuenciación de híbridos (CLASH-Seq), análisis paralelo de secuenciación de extremos de ARN (PARE-Seq), mapeo genómico de transcripciones no encapsuladas (GMUCT), secuenciación de isoformas de transcripción (TIF-Seq), análisis de extremos emparejados de TSS (PEAT), acilación selectiva de 2'-hidroxilo analizada por secuenciación de extensión de cebador (SHAPE-Seq), análisis paralelo de la estructura del ARN (PARS-Seq), secuenciación de fragmentación (FRAG-Seq), secuenciación de purificación por afinidad CXXC (CAP-Seq), secuenciación mediante fosfatasa alcalina de intestino de ternera - pirofosfatasa ácida de tabaco (CIP-TAP), secuenciación de borrado químico de inosina (ICE), secuenciación de inmunoprecipitación de ARN metilado específico de m6A (MeRIP-Seq), secuenciación digital de ARN, amplificación de transcripción completa para células individuales (Quartz-Seq), secuenciación de ARN basada en cebador diseñado (DP-Seq), mecanismo de conmutación en el extremo 5' de las plantillas de ARN (Smart-Seq), mecanismo de conmutación en el extremo 5' de las plantillas de ARN versión 2 (Smart-Seq2), identificadores moleculares únicos (UMI), expresión celular mediante secuenciación de amplificación lineal (CEL-Seq), secuenciación de transcripción inversa etiquetada de una sola célula (STRT-Seq), sondas de inversión molecular de una sola molécula (smMIP), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), ciclos de amplificación basados en hibridación y formación de bucles (MALBAC), secuenciación selectiva de oligonucleótidos (OS-Seq), secuenciación dúplex (Dúplex-Seq), secuenciación con bisulfito (BS-Seq), etiquetado con adaptador posterior a bisulfito (PBAT), secuenciación completa del genoma con bisulfito basada en fragmentación y etiquetado (T-WGBS), secuenciación oxidativa con bisulfito (oxBS-Seq), secuenciación con bisulfito asistida porTet (TAB-Seq), secuenciación por inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP-Seq), secuenciación por captura-metilación (MetilCap), secuenciación por captura de dominio de unión a metilo (MBDCap), secuenciación con bisulfito de representación reducida (RRBS-Seq), secuenciación de sitios hipersensibles a DNasa 1 (DNasa-Seq), aislamiento asistido por MNasa de secuenciación de nucleosomas (MAINE-Seq), secuenciación por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq), aislamiento de elementos reguladores asistido con formaldehído (FAIRE-Seq), ensayo para secuenciación de cromatina accesible portransposasa (ATAC-Seq), análisis de interacción de cromatina mediante secuenciación de etiquetas de extremos emparejados (ChIA-PET), captura de conformación de cromatina (Hi-C/3C-Seq), captura de conformación de cromatina circular (4-C o 4C-Seq), copia de carbón de captura de conformación de cromatina (5-C), secuenciación de captura de retrotransposón (RC-Seq), secuenciación de transposón (Tn-Seq) o secuenciación de inserción (INSeq), secuenciación de captura de translocación (TC-Seq), métodos basados en fluorescencia (tales como: microarreglos, PCR en tiempo real), métodos basados en masas (espectrometría de masas), métodos basados en enzimas de restricción, métodos basados en inmunoprecipitación de anticuerpos y PCR digital.

La cantidad de péptidos o polipéptidos de la presente invención se puede determinar de diversas formas. La medición directa se refiere a medir la cantidad del péptido o polipéptido con base en una señal que se obtiene del péptido o polipéptido en sí y cuya intensidad se correlaciona directamente con el número de moléculas del péptido presentes en la muestra. Tal señal, a veces denominada señal de intensidad, puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad física o química específica del péptido o polipéptido. La medición indirecta incluye la medición de una señal obtenida de un componente secundario (es decir, un componente que no es el péptido o polipéptido en sí) o un sistema de lectura biológica, por ejemplo, respuestas celulares medibles, ligandos, marcadores o productos de reacción enzimática.

La determinación de la cantidad de un péptido o polipéptido se puede lograr por todos los medios conocidos para determinar la cantidad de un péptido en una muestra. Dichos medios comprenden dispositivos y métodos de inmunoensayo y/o inmunohistoquímica que pueden utilizar moléculas marcadas en varios formatos de ensayo tipo sándwich, de competición u otros. Dichos ensayos desarrollarán una señal que es indicativa de la presencia o ausencia del péptido o polipéptido. Además, la intensidad de la señal puede, preferiblemente, correlacionarse directa o indirectamente (por ejemplo, inversamente proporcional) con la cantidad de polipéptido presente en una muestra. Otros métodos adecuados comprenden medir una propiedad física o química específica para el péptido o polipéptido, tal como su masa molecular precisa o espectro de RMN. Dichos métodos comprenden, preferiblemente, biosensores, dispositivos ópticos acoplados a inmunoensayos, biochips, dispositivos analíticos como espectrómetros de masas, analizadores de RMN o dispositivos de cromatografía. Además, los métodos incluyen métodos basados en ELISA en microplacas, inmunoensayos robóticos o totalmente automatizados, ensayos de unión de cobalto y ensayos de aglutinación de látex.

La determinación de la cantidad de un péptido o polipéptido comprende la etapa de medir una señal de intensidad específica obtenible del péptido o polipéptido en la muestra. Como se describió anteriormente, tal señal puede ser la intensidad de la señal observada a una m/z variable específica para el péptido o polipéptido observado en espectros de masas o un espectro de RMN específico para el péptido o polipéptido.

La determinación de la cantidad de un péptido o polipéptido puede comprender, preferiblemente, las etapas de (a) poner en contacto el péptido con un ligando específico, (b) (opcionalmente) eliminar el ligando no unido, (c) medir la cantidad de ligando unido. El ligando unido generará una señal de intensidad. La unión de acuerdo con la presente invención incluye unión covalente y no covalente. Un ligando de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto, por ejemplo, un péptido, polipéptido, ácido nucleico o molécula pequeña, que se une al péptido o polipéptido descrito en este documento. Los ligandos preferidos incluyen anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos tales como receptores o compañeros de unión para el péptido o polipéptido y fragmentos de los mismos que comprenden los dominios de unión para los péptidos y aptámeros, por ejemplo, aptámeros de ácido nucleico o péptido. Los métodos para preparar tales ligandos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los proveedores comerciales también ofrecen la identificación y producción de anticuerpos o aptámeros adecuados. El experto en la técnica está familiarizado con métodos para desarrollar derivados de tales ligandos con mayor afinidad o especificidad. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones aleatorias en los ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos. El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a inmunoglobulinas secretadas que carecen de la región transmembrana y, por lo tanto, pueden liberarse en el torrente sanguíneo y las cavidades corporales. Los anticuerpos están formados típicamente por cuatro cadenas polipeptídicas que comprenden dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están conectadas mediante enlaces disulfuro y se asemejan a una macromolécula en forma de "Y". La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados "fragmentos Fab" (también denominados "porción Fab" o "región Fab"), cada uno con un único sitio de unión al antígeno y un "fragmento Fc" residual (también denominado como "porción Fc" o "región Fc") cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. Se ha determinado la estructura cristalina de la región Fc de IgG humana (Deisenhofer(1981) Biochemistry 20: 2361-2370). En los isotipos IgG, IgAe IgD, la región Fcestá compuesta por dos fragmentos de proteína idénticos, derivados de los dominios CH2 y CH3 de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; en los isotipos IgM e IgE, las regiones Fc contienen tres dominios constantes de cadena pesada (CH2-4) en cada cadena polipeptídica. Además, las moléculas de inmunoglobulina más pequeñas existen de forma natural o se han construido artificialmente. El término "fragmento Fab'" se refiere a un fragmento Fab que comprende adicionalmente la región bisagra de una molécula de Ig mientras que se entiende que "fragmentos F(a')2" comprenden dos fragmentos Fab que están unidos químicamente o conectados mediante un enlace disulfuro. Mientras que los "anticuerpos de dominio único (sdAb)" (Desmyter et al., (1996) Nat. Structure Biol. 3: 803-811) y los "nanocuerpos" solo comprenden un dominio VH único, los fragmentos "Fv de cadena sencilla (scFv)" comprenden el dominio variable de cadena pesada unido mediante un péptido enlazador corto al dominio variable de cadena ligera (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883). Los fragmentos variables divalentes de cadena sencilla (di-scFv) se pueden diseñar mediante la unión de dos scFv (scFvA-scFvB). Esto se puede hacer produciendo una única cadena de péptidos con dos regiones VH y dos VL, produciendo "scFv en tándem" (VHA-VLA-VHB-VLB). Otra posibilidad es la creación de scFv con enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas, lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Normalmente se utilizan enlazadores con una longitud de 5 residuos para generar estos dímeros. Este tipo se conoce como "diacuerpos". Los enlazadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) entre un dominio VH y VL conducen a la formación de trímeros monoespecíficos, los denominados "triacuerpos" o "tricuerpos". Los diacuerpos biespecíficos se forman expresando cadenas con la disposición VHA-VLB y VHB-VLA o VLA-VHB y VLB-VHA, respectivamente. Los diacuerpos monocatenarios (scDb) comprenden un fragmento VHA-VLB y VHB-VLA que están unidos por un péptido enlazador (P) de 12-20 aminoácidos, preferiblemente 14 aminoácidos, (VHA-VLB-P-VHB-VLA). Los "acopladores de células T biespecíficas (BiTE)" son proteínas de fusión que constan de dos scFv de diferentes anticuerpos en los que uno de los scFv se une a las células T a través del receptor CD3 y el otro a una célula tumoral a través de una molécula específica de tumor (Kufer et al., (2004) Trends Biotechnol. 22: 238-244). Las moléculas de redireccionamiento de afinidad dual (moléculas "DART") son diacuerpos estabilizados adicionalmente a través de un puente disulfuro del terminal C. La presente invención también incluye anticuerpos monocatenarios y anticuerpos híbridos humanizados en los que las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo donante no humano que exhibe una especificidad antigénica deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo aceptor humano.

Las secuencias del donante incluirán habitualmente al menos los residuos de aminoácidos del donante que se unen al antígeno, pero también pueden comprender otros residuos de aminoácidos estructural y/o funcionalmente relevantes del anticuerpo donante. Dichos híbridos se pueden preparar mediante varios métodos bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, el ligando o agente se une específicamente al péptido o polipéptido. La unión específica de acuerdo con la presente invención significa que el ligando o agente no debe unirse sustancialmente ("reaccionar de forma cruzada" con) otro péptido, polipéptido o sustancia presente en la muestra que se va a analizar. Preferiblemente, el péptido o polipéptido específicamente unido debería unirse con al menos 3 veces mayor afinidad, más preferiblemente al menos 10 veces mayor afinidad e incluso más preferiblemente al menos 50 veces mayor afinidad que cualquier otro péptido o polipéptido relevante. La unión no específica puede ser tolerable, si aún puede distinguirse y medirse de manera inequívoca, por ejemplo, de acuerdo con su tamaño en una transferencia Western, o por su abundancia relativamente mayor en la muestra. La unión del ligando se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, dicho método es semicuantitativo o cuantitativo. Los métodos adecuados se describen a continuación.

En primer lugar, la unión de un ligando se puede medir directamente, por ejemplo, por RMN o resonancia de plasmón de superficie. En segundo lugar, si el ligando también sirve como sustrato de una actividad enzimática del péptido o polipéptido de interés, se puede medir un producto de reacción enzimática (por ejemplo, la cantidad de una proteasa se puede medir midiendo la cantidad de sustrato escindido, por ejemplo, en una transferencia Western). Alternativamente, el ligando puede exhibir propiedades enzimáticas en sí mismo y el complejo "ligando/péptido o polipéptido" o el ligando que estaba unido por el péptido o polipéptido, respectivamente, puede ponerse en contacto con un sustrato adecuado que permita la detección mediante la generación de una señal de intensidad. Para la medición de productos de reacción enzimática, preferiblemente la cantidad de sustrato es saturante. El sustrato también se puede marcar con un marcador detectable antes de la reacción. Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con el sustrato durante un período de tiempo adecuado. Un período de tiempo adecuado se refiere al tiempo necesario para que se produzca una cantidad de producto detectable, preferiblemente mensurable. En lugar de medir la cantidad de producto, se puede medir el tiempo necesario para la aparición de una cantidad determinada (por ejemplo, detectable) de producto. En tercer lugar, el ligando puede acoplarse covalentemente o no covalentemente a un marcador que permite la detección y medición del ligando. El etiquetado puede realizarse por métodos directos o indirectos. La marcación directa implica el acoplamiento del marcador directamente (de forma covalente o no covalente) al ligando. La marcación indirecta implica la unión (covalente o no covalente) de un ligando secundario al primer ligando. El ligando secundario debería unirse específicamente al primer ligando. Dicho ligando secundario puede acoplarse con un marcador adecuado y/o ser la diana (receptor) del ligando terciario que se une al ligando secundario. El uso de ligandos secundarios, terciarios o incluso de orden superior se usa a menudo para aumentar la intensidad de la señal. Los ligandos secundarios adecuados y de orden superior pueden incluir anticuerpos, anticuerpos secundarios y el conocido sistema estreptavidina-biotina (Vector Laboratories, Inc.). El ligando o sustrato también se puede "etiquetar" con una o más etiquetas como se conoce en la técnica. Entonces, dichas etiquetas pueden ser dianas para ligandos de orden superior. Las etiquetas adecuadas incluyen biotina, digoxigenina, etiqueta His, Glutatión S transferasa, FLAG, GFP, etiqueta myc, hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A, proteína de unión a maltosa y similares. En el caso de un péptido o polipéptido, la etiqueta está preferiblemente en el extremo terminal N y/o terminal C. Los marcadores adecuados son cualquier marcador detectable mediante un método de detección apropiado. Las etiquetas típicas incluyen partículas de oro, perlas de látex, éster de acridán, luminol, rutenio, etiquetas enzimáticamente activas, etiquetas radiactivas, etiquetas magnéticas (por ejemplo, perlas magnéticas, incluidas etiquetas paramagnéticas y superparamagnéticas) y etiquetas fluorescentes. Los marcadores enzimáticamente activos incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa y derivados de las mismas. Los sustratos adecuados para la detección incluyen di-amino-bencidina (DAB), 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina, NBT-BCIP (cloruro de tetrazolio azul 4-nitro y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo), CDP-StarMR (Amersham Biosciences), ECFMR (Amersham Biosciences). Una combinación de enzima-sustrato adecuada puede dar como resultado un producto de reacción coloreado, fluorescencia o quimioluminiscencia, que se puede medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando una película sensible a la luz o un sistema de cámara adecuado). En cuanto a la medición de la reacción enzimática, los criterios dados anteriormente se aplican de forma análoga. Los marcadores fluorescentes típicos incluyen proteínas fluorescentes (tales como GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, Texas Red, fluoresceína y los tintes Alexa (por ejemplo, Alexa 568). Hay más etiquetas fluorescentes disponibles, por ejemplo, de Molecular Probes (Oregón). También se contempla el uso de puntos cuánticos como marcadores fluorescentes. Los marcadores radiactivos típicos incluyen 35S, 1251, 32P, 33P y similares. Un marcador radiactivo puede detectarse mediante cualquier método conocido y apropiado, por ejemplo, una película sensible a la luz o un generador de imágenes de fósforo. Los métodos de medición adecuados de acuerdo con la presente invención también incluyen precipitación (particularmente inmunoprecipitación), electroquimioluminiscencia (quimioluminiscencia generada por electricidad), RIA (radioinmunoensayo), ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), pruebas inmunológicas enzimáticas tipo sándwich, inmunoensayos tipo sándwich de electroquimioluminiscencia (ECLIA), fluoroinmunoensayo con lantánido de disociación mejorada (DELFIA), ensayo de centelleo de proximidad (SPA), turbidimetría, nefelometría, turbidimetría o nefelometría mejorada con látex, o pruebas inmunes en fase sólida, como por ejemplo, matrices de proteínas de fase inversa o matrices de anticuerpos. Otros métodos conocidos en la técnica (tales como electroforesis en gel, electroforesis en gel 2D, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), transferencia Western y espectrometría de masas), se pueden usar solos o en combinación con el etiquetado u otros métodos de detección como se describió anteriormente.

La cantidad de un péptido o polipéptido también se puede determinar como sigue: (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende un ligando para el péptido o polipéptido como se especificó anteriormente con una muestra que comprende el péptido o polipéptido y (b) medir la cantidad péptido o polipéptido que se une al soporte. El ligando, preferiblemente elegido del grupo que consta de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, anticuerpos y aptámeros, está preferiblemente presente sobre un soporte sólido en forma inmovilizada. Los materiales para fabricar soportes sólidos son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, materiales de columna disponibles comercialmente, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, chips y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas, láminas, duracitos, pocillos y paredes de bandejas de reacción, tubos de plástico, etc. El ligando o agente puede unirse a muchos vehículos diferentes. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los métodos adecuados para fijar/inmovilizar dicho ligando son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. También se contempla el uso de "matrices en suspensión" tal como matrices de acuerdo con la presente invención (Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20 (1): 9-12). En tales matrices en suspensión, el portador, por ejemplo, una microperla o microesfera, está presente en suspensión. La matriz consta de diferentes microperlas o microesferas, posiblemente marcadas, que portan diferentes ligandos. Los métodos para producir tales matrices, por ejemplo basados en la química en fase sólida y grupos protectores fotolábiles, son generalmente conocidos (documento Us 5.744.305).

Como se usa en este documento, el término "sitio CpG" se refiere a una secuencia de dinucleótidos 5'-CG-3' comprendida en un polinucleótido, preferiblemente comprendido en ADN, más preferiblemente comprendido en ADN genómico de un sujeto. Los sitios CpG a analizar de acuerdo con la presente invención son los sitios CpG ubicados en el intrón, exón o región promotora de un gen de interés. En caso de que los sitios CpG estén ubicados en la región promotora, dicha región es preferiblemente de 3000 nucleótidos, 2500 nucleótidos, 2100 nucleótidos o 1750 nucleótidos secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción del gen de interés respectivo. Más preferiblemente, los sitios CpG a analizar de acuerdo con la presente invención son los sitios CpG ubicados en la región de 1750-3000 nucleótidos, 2100-3000 nucleótidos o 2500-3000 nucleótidos secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción del gen de interés.

Por lo tanto, el análisis de un sitio CpG correspondiente a un sitio CpG de la presente invención también está abarcado por la presente invención. El experto en la materia sabe cómo determinar los sitios CpG en una muestra correspondiente a los sitios CpG detallados anteriormente en el presente documento, por ejemplo, determinando el sitio de inicio de la traducción del gen de interés y/o alineando dicha secuencia de una muestra con la secuencia del gen de interés. Además, la presente invención también prevé que el estado de metilación de otros sitios CpG se determine además de determinar el estado de metilación de un sitio CpG de la presente invención.

El término "determinar el estado de metilación" se refiere a determinar si un grupo metilo está presente en la posición 5 del anillo de pirimidina de una citosina en un polinucleótido. Preferiblemente, el residuo de citosina va seguido en la dirección 3' por un residuo de guanosina, formando los dos residuos un sitio CpG. La presencia de dicho grupo metilo se puede determinar mediante varios métodos bien conocidos por el experto, que incluyen, por ejemplo, PCR específica de metilación (MSP), secuenciación con bisulfito del genoma completo u otros métodos basados en secuenciación (secuenciación con bisulfito (BS-Seq), etiquetado posterior con adaptador de bisulfito (PBAT), secuenciación con bisulfito del genoma completo basado en fragmentación y etiquetado (T-WGBS), secuenciación oxidativa con bisulfito (oxBS-Seq), secuenciación con bisulfito asistida por Tet (TAB-Seq), secuenciación con inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP-Seq), secuenciación por captura de metilación (MetilCap), secuenciación por captura de dominio de unión a metilo (MBDCap), secuenciación con bisulfito de representación reducida (RRBS-Seq), métodos basados en PCR en tiempo real de ADN tratado con bisulfito, por ejemplo, luz de metilo, restricción con una enzima de restricción sensible a la metilación, por ejemplo, en el enriquecimiento del fragmento minúsculo HpaII mediante ensayo de PCR mediado por ligación (HELP), pirosecuenciación de ADN tratado con bisulfito, o AIMS similar, amplificación de sitios intermetilados; BC-seq, conversión con bisulfito seguida de captura y secuenciación; BiMP, perfil de metilación con bisulfito; BS, secuenciación con bisulfito; BSPP, sondas de candado de bisulfito; CHARM, matrices integrales de alto rendimiento para metilación relativa; COBRA, análisis combinado de restricción con bisulfito; DMH, hibridación por metilación diferencial; HELP, enriquecimiento de fragmentos minúsculos de HpaII mediante PCR mediada por ligación; MCA, amplificación de isla de CpG metilada; MCAM, MCA con hibridación de microarreglo; MeDIP, mDIP y mCIP, inmunoprecipitación de ADN metilado; MIRA, ensayo de recuperación de isla de CpG metilada; MMASS, evaluación de metilación basada en microarreglos de muestras individuales; MS-AP-PCR, PCR cebada arbitrariamente sensible a metilación; MSCC, recuento de corte sensible a la metilación; MSP, PCR específica de metilación; MS-SNuPE, extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación; NGS, secuenciación de próxima generación; RLGS, escaneo del genoma de referencia de restricción; RRBS, secuenciación con bisulfito de representación reducida; -seq, seguido por secuenciación; WGSBS, secuenciación con bisulfito de escopeta de genoma completo (Manel Esteller, Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps, Nature, 2007, 8: 286-298; Peter W. Laird, Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis.

Nature Review Genetics, 2010, 11: 191-203). Preferiblemente, el estado de metilación se determina mediante los métodos descritos en los ejemplos a continuación, por ejemplo, el ensayo de metilación Infinium 27K basado en secuenciación o el método basado en espectrometría de masas de espectrometría de masas MALDI-TOF. Como tal, el estado de metilación de un residuo de citosina específico en una molécula de polinucleótido específica sólo puede ser "no metilado" (significa, 0% de metilación) o "metilado" (significa, 100% de metilación). En el caso de un sitio CpG en una molécula de ADN de doble cadena, que comprende dos residuos de citosina, el estado de metilación puede ser "no metilado" (significa, 0% de metilación, es decir, ninguno de los dos residuos de citosina metilados), "hemimetilado" (significa, 50% de metilación, es decir, uno de los dos residuos de citosina metilados), o "metilado" o "completamente metilado" (significa, 100% de metilación, es decir, ambos residuos de citosina metilados). Una persona experta entiende sin embargo que si los polinucleótidos se obtienen a partir de una multitud de células y se determina el estado de metilación de un residuo de citosina específico dentro de dicha multitud de polinucleótidos, se determina un estado de metilación promedio, que puede, por ejemplo, expresarse preferiblemente como un porcentaje (% de metilación), y que puede asumir cualquier valor entre 0% y 100%. El experto también entenderá que el estado de metilación puede expresarse como un porcentaje en caso de que se determine la metilación promedio de diferentes poblaciones de células. Por ejemplo, las células sanguíneas de acuerdo con la presente invención son una mezcla de tipos celulares variantes. Es posible que ciertos tipos de células tengan niveles altos de metilación mientras que otros tipos de células tengan niveles de metilación más bajos y finalmente alcancen una metilación promedio de por ejemplo, 50%.

Como se usa en el presente documento, el término "agente de detección" se refiere a un agente que interactúa específicamente con, y por lo tanto reconoce, el nivel de expresión de un gen de interés, el estado de metilación de un gen de interés o la presencia o cantidad de un miARN de la presente invención. Preferiblemente, dicho agente de detección es una proteína, polipéptido, péptido, polinucleótido o un oligonucleótido. Preferiblemente, el agente de detección se etiqueta de manera que permita la detección de dicho agente de detección mediante medidas apropiadas. El etiquetado se puede realizar mediante diversas técnicas bien conocidas en el arte y dependiendo de la etiqueta que se utilice. Las etiquetas preferidas para usar son etiquetas fluorescentes que comprenden, entre otros, fluorocromos tales como fluoresceína, rodamina o Texas Red. Sin embargo, la etiqueta también puede ser una enzima o un anticuerpo. Se prevé que una enzima que se utilice como una etiqueta generará una señal detectable al reaccionar con un sustrato. Las enzimas, sustratos y técnicas adecuados son bien conocidos en la técnica. Un agente de detección que se utilizará como etiqueta puede reconocer específicamente una molécula diana que se puede detectar directamente (por ejemplo, una molécula diana que es en sí misma fluorescente) o indirectamente (por ejemplo, una molécula diana que genera una señal detectable, tal como una enzima). Los agentes de detección etiquetados de la muestra se pondrán en contacto con la muestra para permitir una interacción específica. Puede ser necesario un lavado para eliminar el agente de detección unido de forma no específica que, de otro modo, produciría valores falsos. Una vez finalizado esta etapa de interacción, un investigador colocará el dispositivo de detección en un dispositivo lector o escáner. Un dispositivo para detectar etiquetas fluorescentes, preferiblemente, consta de algunos láseres, preferiblemente un microscopio especial y una cámara. Las etiquetas fluorescentes serán excitadas por el láser, y el microscopio y la cámara trabajarán juntos para crear una imagen digital de la muestra. A continuación, estos datos pueden almacenarse en un ordenador y se utilizará un programa especial, por ejemplo, para restar datos de fondo. Los datos resultantes están, preferiblemente, normalizados y pueden convertirse a un formato unitario numérico y común. Los datos se analizarán para comparar muestras con referencias e identificar cambios significativos.

"Comparar", como se usa en este documento, abarca comparar la presencia, ausencia o cantidad de un indicador al que se hace referencia en este documento que está compuesto por la muestra a analizar con la presencia, ausencia o cantidad de dicho indicador en una muestra de referencia adecuada. Debe entenderse que comparar como se usa en este documento se refiere a una comparación de parámetros o valores correspondientes, por ejemplo, una cantidad absoluta del indicador como la mencionada en el presente documento se compara con una cantidad de referencia absoluta de dicho indicador; se compara una concentración del indicador con una concentración de referencia de dicho indicador; una señal de intensidad obtenida del indicador como se menciona en este documento en una muestra se compara con el mismo tipo de señal de intensidad de dicho indicador en una muestra de referencia. La comparación mencionada puede realizarse de forma manual o asistida por ordenador. Para una comparación asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada puede compararse con los valores correspondientes a referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos mediante un programa informático. El programa informático puede evaluar además el resultado de la comparación por medio de un sistema experto. Por consiguiente, el resultado de la identificación a la que se hace referencia en este documento puede proporcionarse automáticamente en un formato de salida adecuado.

El término "muestra" o "muestra de interés" se usan indistintamente en este documento, refiriéndose a una parte o pieza de un tejido, órgano o individuo, que normalmente es más pequeño que dicho tejido, órgano o individuo, destinado a representar la totalidad del tejido, órgano o individuo. Tras el análisis, una muestra proporciona información sobre el estado del tejido o el estado de salud o enfermedad de un órgano o individuo. Los ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, muestras de fluidos tales como sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas como por ejemplo, mama o próstata, o muestras de tejido como por ejemplo, extractos de tejido obtenidos de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. Otros ejemplos de muestras son cultivos de células o cultivos de tejidos tales como, entre otros, cultivos de diversas células cancerosas.

Las muestras se pueden obtener mediante técnicas bien conocidas e incluyen, preferiblemente, raspados, hisopos o biopsias del tracto digestivo, hígado, páncreas, canal anal, cavidad oral, tracto digestivo aéreo superior y epidermis. Tales muestras pueden obtenerse mediante el uso de cepillos, hisopos (de algodón), espátula, líquidos de enjuague/lavado, dispositivos de biopsia por punción, punción de cavidades con agujas o instrumentación quirúrgica. Pueden obtenerse muestras de tejidos u órganos de cualquier tejido u órgano mediante, por ejemplo, biopsia u otros procedimientos quirúrgicos. Más preferiblemente, las muestras son muestras de fluidos corporales, por ejemplo, preferiblemente, sangre, plasma, suero, orina, saliva, fluido lagrimal y fluidos que se pueden obtener de las glándulas mamarias, por ejemplo, leche. Lo más preferiblemente, la muestra de un fluido corporal comprende células del sujeto. Las células separadas se pueden obtener de los fluidos corporales o de los tejidos u órganos mediante técnicas de separación tales como filtración, centrifugación o clasificación celular. Preferiblemente, las muestras se obtienen de los fluidos corporales descritos a continuación en el presente documento. Más preferiblemente, las células se aíslan de dichos fluidos corporales como se describe a continuación en el presente documento.

El análisis de una muestra se puede realizar de forma visual o química. El análisis visual incluye, entre otros, imágenes microscópicas o escaneo radiográfico de un tejido, órgano o individuo que permite la evaluación morfológica de una muestra. El análisis químico incluye, entre otros, la detección de la presencia o ausencia de indicadores específicos o alteraciones en su cantidad o nivel.

El término "muestra de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra que se analiza de una manera sustancialmente idéntica a la muestra de interés y cuya información se compara con la de la muestra de interés. Por tanto, una muestra de referencia proporciona un estándar que permite evaluar la información obtenida de la muestra de interés. Una muestra de referencia puede derivarse de un tejido, órgano o individuo sano o normal, proporcionando así un estándar del estado saludable de un tejido, órgano o individuo. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia normal y el estado de la muestra de interés pueden ser indicativas del riesgo de desarrollo de una enfermedad o la presencia o progresión adicional de dicha enfermedad o trastorno. Una muestra de referencia puede derivarse de un tejido, órgano o individuo anormal o enfermo, proporcionando así un estándar del estado enfermo de un tejido, órgano o individuo. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia anormal y el estado de la muestra de interés pueden indicar un riesgo reducido de desarrollo de la enfermedad o la ausencia o mejora de dicha enfermedad o trastorno. Una muestra de referencia también puede derivarse del mismo tejido, órgano o individuo que la muestra de interés, pero se ha tomado en un momento anterior. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia tomada anteriormente y el estado de la muestra de interés pueden ser indicativas de la progresión de la enfermedad, es decir, una mejora o empeoramiento de la enfermedad con el tiempo. Se tomó una muestra de referencia en un momento anterior o posterior en caso de que haya transcurrido un período de tiempo entre la toma de la muestra de referencia y la toma de la muestra de interés. Dicho período de tiempo puede representar años (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 años), meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses), semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas), días ( por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 días), horas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12 horas), minutos (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutos) o segundos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 segundos).

Una muestra de referencia puede ser "tratada de manera diferente" o "expuesta de manera diferente" que una muestra de interés en caso de que ambas muestras se traten de una manera sustancialmente idéntica excepto por un solo factor. Dichos factores individuales incluyen, entre otros, el tiempo de exposición, la concentración de exposición o la temperatura de exposición a una determinada sustancia. En consecuencia, una muestra de interés puede exponerse a una dosis diferente de una determinada sustancia que la muestra de referencia o puede exponerse durante un intervalo de tiempo diferente al de la muestra de referencia o puede exponerse a una temperatura diferente a la de la muestra de referencia. Las diferentes dosis a las que se puede exponer una muestra de interés incluyen, pero no se limitan a la dosis aumentada o disminuida 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces y/o 1000 veces de la dosis a la que está expuesta la muestra de referencia. Los diferentes tiempos de exposición a los que puede estar expuesta una muestra de interés incluyen, pero no se limitan a, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces y/o 1000 veces más o menos tiempo que la exposición de la referencia. Las diferentes temperaturas de exposición a las que se puede exponer una muestra de interés incluyen, pero no se limitan a, una temperatura aumentada o disminuida 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces y/o 1000 veces que la exposición de la referencia. En un ejemplo no limitativo, una muestra de interés puede exponerse a una concentración de una sustancia 10 veces mayor que la muestra de referencia. El análisis de ambas muestras se realiza luego de una manera sustancialmente idéntica que permite determinar los efectos, es decir, un efecto beneficioso o adverso, del aumento de concentración de dicha sustancia en la muestra de interés. El experto en la materia apreciará que este ejemplo se aplica, haciendo los cambios necesarios, a diferentes intervalos de concentraciones, diferentes tiempos de exposición y/o diferentes temperaturas de exposición.

Los términos nivel "disminuido" o "reducido" de un indicador se refieren al nivel de dicho indicador en la muestra que se reduce en comparación con la referencia o muestra de referencia. Los términos nivel "elevado" o "aumentado" de un indicador se refieren a que el nivel de dicho indicador en la muestra es más alto en comparación con la referencia o muestra de referencia.

Las cantidades de referencia pueden, en principio, calcularse para un grupo o cohorte de sujetos como se especifica en el presente documento con base en los valores promedio o medianos para un miARN dado aplicando métodos estándar de estadísticos. En particular, la precisión de una prueba, tal como un método destinado a diagnosticar un evento, o no, se describe mejor por sus características de funcionamiento del receptor (ROC) (véase especialmente Zweig 1993, Clin. Chem. 39: 561-577). El gráfico de ROC es un gráfico de todos los pares de sensibilidad frente a especificidad que resultan de variar continuamente el umbral de decisión en todo el intervalo de datos observados. El rendimiento clínico de un método de diagnóstico depende de su precisión, es decir, de su capacidad para asignar correctamente a los sujetos a un determinado pronóstico o diagnóstico. El gráfico de ROC indica la superposición entre las dos distribuciones al representar la sensibilidad frente a la especificidad 1 para el intervalo completo de umbrales adecuados para hacer una distinción. En el eje y está la sensibilidad, o la fracción de verdaderos positivos, que se define como la relación entre el número de resultados verdaderos positivos y la suma del número de verdaderos positivos y el número de falsos negativos. Esto también se ha denominado positividad en presencia de una enfermedad o afección. Se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x está la fracción de falsos positivos, o especificidad 1, que se define como la relación entre el número de resultados falsos positivos y la suma del número de resultados negativos verdaderos y el número de resultados positivos falsos. Es un índice de especificidad y se calcula en su totalidad a partir del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones de verdadero y falso positivo se calculan completamente por separado, utilizando los resultados de la prueba de dos subgrupos diferentes, la gráfica de ROC es independiente de la prevalencia del evento en la cohorte. Cada punto de la gráfica de ROC representa un par de sensibilidad/especificidad correspondiente a un umbral de decisión particular. Una prueba con discriminación perfecta (sin superposición en las dos distribuciones de resultados) tiene una gráfica de ROC que pasa por la esquina superior izquierda, donde la fracción de verdadero positivo es 1.0, o 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción de falso positivo es 0 (especificidad perfecta). La gráfica teórica para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45° desde la esquina inferior izquierda hasta la esquina superior derecha. La mayoría de las parcelas se encuentran entre estos dos extremos. Si el gráfico de ROC cae completamente por debajo de la diagonal de 45°, esto se remedia fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor que" a "menor que" o viceversa. Cualitativamente, cuanto más cerca esté el gráfico de la esquina superior izquierda, mayor será la precisión general de la prueba. Dependiendo de un intervalo de confianza deseado, se puede derivar un umbral de la curva de ROC que permite el diagnóstico o la predicción de un evento dado con un equilibrio adecuado de sensibilidad y especificidad, respectivamente. Por consiguiente, la referencia que se utilizará para los métodos de la presente invención se puede generar, preferiblemente, estableciendo una ROC para dicha cohorte como se describió anteriormente y derivando una cantidad umbral a partir de ella. Dependiendo de una sensibilidad y especificidad deseadas para un método de diagnóstico, el gráfico de ROC permite derivar umbrales adecuados. Preferiblemente, las cantidades de referencia se encuentran dentro del intervalo de valores que representan una sensibilidad de al menos 75% y una especificidad de al menos 45%, o una sensibilidad de al menos 80% y una especificidad de al menos 40%, o una sensibilidad de al menos el 85% y una especificidad de al menos el 33%, o una sensibilidad de al menos el 90% y una especificidad de al menos el 25%.

Preferiblemente, la cantidad de referencia como se usa en este documento se deriva de muestras de sujetos obtenidas antes del tratamiento, pero para las cuales se sabe si sus donantes estaban afectados por BC o MBC o no. Este nivel de cantidad de referencia puede ser un valor discreto o puede ser un intervalo de valores. Evidentemente, el nivel o la cantidad de referencia pueden variar entre especies individuales de miARN. Por tanto, el sistema de medición se calibra preferiblemente con una muestra o con una serie de muestras que comprenden cantidades conocidas de cada miARN específico. El experto en la materia entenderá que, en tal caso, la cantidad de miARN puede expresarse preferiblemente como unidades arbitrarias (AU). Por tanto, preferiblemente, las cantidades de miARN se determinan comparando la señal obtenida de la muestra con las señales comprendidas en una curva de calibración. La cantidad de referencia aplicable para un sujeto individual puede variar dependiendo de varios parámetros fisiológicos como la edad o la subpoblación. Por tanto, se puede determinar una cantidad de referencia adecuada mediante los métodos de la presente invención a partir de una muestra de referencia que se analizará conjuntamente, es decir, simultáneamente o posteriormente, con la muestra de prueba. Además, se puede utilizar preferiblemente una cantidad umbral como cantidad de referencia. Una cantidad de referencia puede derivarse, preferiblemente, de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos que padecen BC o MBC que se sabe que padecen BC o MBC. Preferiblemente, una cantidad de referencia también puede derivarse de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos que se sabe que no padecen BC o MBC. Debe entenderse que las cantidades antes mencionadas pueden variar debido a estadísticas y errores de medición. Una desviación, es decir, una disminución o un aumento de las cantidades de miARN a las que se hace referencia en este documento es, preferiblemente, una desviación estadísticamente significativa, es decir, una disminución estadísticamente significativa o un aumento estadísticamente significativo.

Como se usa en este documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos de los trastornos que se están tratando; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno o trastornos que se están tratando; (d) limitar o prevenir la recurrencia del trastorno o trastornos en un individuo que previamente ha tenido el trastorno o trastornos; y (e) limitar o prevenir la recurrencia de síntomas en individuos que previamente eran sintomáticos del trastorno o trastornos.

Como se usa en este documento, "prevenir", "que previene", "prevención" o "profilaxis" de una enfermedad o trastorno significa prevenir que tal enfermedad o trastorno ocurra en el paciente.

Como se usa en este documento, el término "terapia" se refiere a todas las medidas aplicadas a un sujeto para mejorar las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en este documento o los síntomas que los acompañan en un grado significativo. Dicha terapia, como se usa en el presente documento, también incluye medidas que conducen a una restauración completa de la salud con respecto a las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en el presente documento. Debe entenderse que la terapia, tal como se usa de acuerdo con la presente invención, puede no ser eficaz en todos los sujetos a tratar. Sin embargo, el término requerirá que una parte estadísticamente significativa de sujetos que padecen una enfermedad o trastorno a los que se hace referencia en el presente documento pueda tratarse con éxito. El experto en la técnica puede determinar sin más preámbulos si una porción es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas descritas anteriormente en el presente documento.

El término "terapia del cáncer de mama", como se usa en el presente documento, se refiere a aplicar a un sujeto que padece cáncer de mama, incluido el cáncer de mama que hace metástasis, medidas para eliminar las células cancerosas del sujeto, para inhibir el crecimiento de células cancerosas, para matar las células cancerosas, o hacer que el cuerpo de un paciente inhiba el crecimiento de células cancerosas o las destruya. Preferiblemente, la terapia del cáncer de mama es quimioterapia, terapia antihormonal, terapia dirigida, inmunoterapia o cualquier combinación de las mismas. Sin embargo, también se prevé que la terapia contra el cáncer sea radioterapia o cirugía, sola o en combinación con otros regímenes de terapia. El experto en la materia entenderá que la selección de la terapia del cáncer de mama depende de varios factores, como la edad del sujeto, la estadificación del tumor y el estado del receptor de las células tumorales. Sin embargo, el experto en la técnica también entiende que la selección de la terapia del cáncer de mama puede ser asistida por los métodos de la presente invención: si, por ejemplo, se diagnostica BC mediante el método para diagnosticar el cáncer de mama, pero ningún CMM se diagnostica mediante el método de diagnóstico de CMM, la extirpación quirúrgica del tumor puede ser suficiente. Si, por ejemplo, BC se diagnostica mediante el método para diagnosticar BC y MBC se diagnostica mediante el método para diagnosticar MBC, medidas de terapia además de la cirugía, por ejemplo, quimioterapia y/o terapia dirigida, pueden ser apropiadas. Asimismo, si, por ejemplo, BC se diagnostica mediante el método para diagnosticar BC, y un estado de CTC desfavorable se determina mediante el método para determinar el estado de CTC, por ejemplo, Es posible que se requiera una adición adicional de inmunoterapia al régimen de terapia.

Como se usa en este documento, el término "quimioterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto con un fármaco antineoplásico. Preferiblemente, la quimioterapia es un tratamiento que incluye agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida), platino (por ejemplo, carboplatino), antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina o daunorrubicina) e inhibidores de la topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, irinotecano, topotecano, camptotecina o VP16), inhibidores de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) (por ejemplo, Crizotinib o AP26130), inhibidores de la quinasa aurora (por ejemplo, N-[4-[4-(4-Metilpiperazin-1-il)-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]pirimidin-2-il]sulfanilfenil] ciclopropanocarboxamida (VX-680)), agentes antiangiogénicos (por ejemplo, Bevacizumab) o yodo 131-1-(3-yodobencil)guanidina (metayodobencilguanidina terapéutica), inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), solos o cualquier combinación adecuada de los mismos. Debe entenderse que la quimioterapia, preferiblemente, se refiere a un ciclo completo de tratamiento, es decir, una serie de varias (por ejemplo, cuatro, seis u ocho) dosis de fármacos antineoplásicos aplicados a un sujeto separados por varios días o semanas sin tal aplicación.

El término "terapia antihormonal" se refiere a la terapia del cáncer de mama mediante el bloqueo de los receptores hormonales, por ejemplo, receptor de estrógeno o receptor de progesterona, expresado en células tumorales o bloqueando la biosíntesis de estrógeno. El bloqueo de los receptores de hormonas se puede lograr preferiblemente mediante la administración de compuestos, por ejemplo, tamoxifeno, que se une específicamente y de ese modo bloquea la actividad de dichos receptores hormonales. El bloqueo de la biosíntesis de estrógenos se logra preferiblemente mediante la administración de inhibidores de aromatasa como, por ejemplo, anastrozol o letrozol. El experto en la materia sabe que la terapia antihormonal sólo es aconsejable en los casos en que las células tumorales expresan receptores hormonales.

El término "terapia dirigida", como se usa en este documento, se refiere a la aplicación a un paciente de una sustancia química conocida por bloquear el crecimiento de células cancerosas al interferir con moléculas específicas que se sabe que son necesarias para la tumorigénesis o el crecimiento de cáncer o de células cancerosas. Los ejemplos conocidos por el experto en la técnica son moléculas pequeñas como, por ejemplo, Inhibidores de PARP (por ejemplo, Iniparib) o anticuerpos monoclonales como, por ejemplo, Trastuzumab.

El término "inmunoterapia", como se usa en este documento, se refiere al tratamiento del cáncer mediante la modulación de la respuesta inmune de un sujeto. Dicha modulación puede inducir, potenciar o suprimir dicha respuesta inmune. El término "inmunoterapia basada en células" se refiere a una terapia contra el cáncer de mama que comprende la aplicación de células inmunes, por ejemplo, células T, preferiblemente células NK específicas del tumor, a un sujeto.

Los términos "terapia de radiación" o "radioterapia" son conocidos por el experto en la materia. El término se refiere al uso de radiación ionizante para tratar o controlar el cáncer. La persona experta también conoce el término "cirugía", que se refiere a medidas operatorias para tratar el cáncer de mama, por ejemplo, escisión de tejido tumoral.

Como se usa en este documento, el término "monitorización de la terapia" se refiere a obtener una indicación sobre el efecto de un tratamiento contra el cáncer sobre el estado del cáncer de un sujeto que padece dicho cáncer. Preferiblemente, la monitorización de la terapia comprende la aplicación de un método de la presente invención en dos muestras del mismo sujeto, en el que se obtiene una primera muestra en un momento antes de la segunda muestra. Preferiblemente, el punto de tiempo para obtener la primera muestra está separado del punto de tiempo para obtener la segunda muestra en aproximadamente una semana, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente cinco semanas, aproximadamente seis semanas, aproximadamente siete semanas, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cinco meses, aproximadamente seis meses o más de aproximadamente seis meses. Sin embargo, también se contempla en la presente invención que el método de monitorización de la terapia se utilice para monitorizar sujetos a largo plazo, por ejemplo, monitorizar el tiempo de supervivencia sin recaídas o similares. En tal caso, el momento para la obtención de la primera muestra está separado del momento para la obtención de la segunda muestra, preferiblemente, al menos seis meses, al menos un año, al menos dos años, al menos tres años, al menos cuatro años, al menos cinco años, o al menos seis años. El experto en la materia sabe que la primera muestra se obtiene preferiblemente antes de que se inicie la terapia contra el cáncer, mientras que la segunda muestra se obtiene preferiblemente después de que se inicia la terapia. Sin embargo, también se prevé en la presente invención que ambas muestras se obtengan después de iniciar la terapia. El experto en la materia también entiende que se pueden obtener más de dos muestras sucesivas de acuerdo con el método de seguimiento de la terapia de la presente invención y que, en tal caso, la muestra obtenida en el primer momento puede usarse como la primera muestra en relación con la segunda muestra así como para una tercera muestra. Haciendo los cambios necesarios, la muestra obtenida en el segundo punto en el tiempo puede, no obstante, usarse como una primera muestra con respecto a una tercera muestra, y así sucesivamente.

El término "éxito del tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere preferiblemente a una mejora de las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en el presente documento o a sus síntomas en un grado significativo. Más preferiblemente, el término se refiere a una cura completa de dicho sujeto, es decir, a la prevención de la progresión y/o recaída del cáncer de mama metastatizante durante al menos cinco años. Por consiguiente, "determinar el éxito del tratamiento" se refiere a evaluar la probabilidad de acuerdo con la cual un sujeto fue tratado con éxito. Preferiblemente, el término se refiere a predecir la supervivencia libre de progresión y/o la supervivencia general del sujeto, más preferiblemente durante un período de tiempo específico. El término "predecir la supervivencia libre de progresión" se refiere a determinar la probabilidad de que un sujeto sobreviva sin recaída y/o progresión del cáncer de mama metastásico durante un período de tiempo específico. Por consiguiente, el término "predecir la supervivencia global" se refiere a determinar la probabilidad de acuerdo con la cual un sujeto sobrevivirá durante un período de tiempo específico. Preferiblemente, dicho período de tiempo es de al menos 12 meses, más preferiblemente de al menos 24 meses.

Los términos "compuesto farmacéutico", "medicamento" y "fármaco" se usan indistintamente en este documento para referirse a una sustancia y/o una combinación de sustancias que se usan para la identificación, prevención o tratamiento de un estado o enfermedad de un tejido.

El término "kit" como se usa en este documento se refiere a una colección de los componentes mencionados anteriormente, preferiblemente, proporcionados por separado o dentro de un solo recipiente. El recipiente, también preferiblemente, comprende instrucciones para llevar a cabo el método de la presente invención. En esta memoria descriptiva se dan ejemplos de tales componentes del kit, así como métodos para su uso. El kit, preferiblemente, contiene los componentes antes mencionados en una formulación lista para usar. Preferiblemente, el kit puede comprender adicionalmente instrucciones, por ejemplo, un manual del usuario para ajustar los componentes, por ejemplo, concentraciones de los agentes de detección, y para interpretar los resultados de cualquier determinación con respecto a los diagnósticos proporcionados por los métodos de la presente invención. En particular, dicho manual puede incluir información para asignar las cantidades del producto genético determinado al tipo de diagnóstico. Los detalles se encuentran en otra parte de esta memoria descriptiva. Además, dicho manual del usuario puede proporcionar instrucciones sobre el uso correcto de los componentes del kit para determinar la o las cantidades del biomarcador respectivo. Un manual del usuario puede proporcionarse en papel o en formato electrónico, por ejemplo, almacenado en CD o CD ROM. La presente invención también se refiere al uso de dicho kit en cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención.

El término "dispositivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de medios que comprende al menos los medios antes mencionados vinculados operativamente entre sí para permitir el diagnóstico. Los medios preferidos para determinar el estado de metilación o la cantidad de producto génico y los medios para llevar a cabo la comparación se describieron anteriormente en relación con los métodos de la invención. La forma de vincular los medios de una manera operativa dependerá del tipo de medios incluidos en el dispositivo. Por ejemplo, cuando se aplican medios para determinar automáticamente el estado de metilación o la cantidad de un producto génico, los datos obtenidos por dichos medios de funcionamiento automático pueden procesarse, por ejemplo, mediante un programa informáti

dispositivo en tal caso. Por consiguiente, dicho dispositivo puede incluir una unidad de análisis para determinar el estado de metilación o la cantidad de un producto génico en una muestra y una unidad de evaluación para procesar los datos resultantes para el diagnóstico. Los medios de detección preferidos se describen en relación con las realizaciones relacionadas con los métodos de la invención anterior. En tal caso, los medios están operativamente vinculados en el sentido de que el usuario del sistema reúne el resultado de la determinación de la cantidad y el valor diagnóstico del mismo debido a las instrucciones e interpretaciones dadas en un manual. Los medios pueden aparecer como dispositivos separados en tal realización y, preferiblemente, están empaquetados juntos como un kit. El experto en la técnica se dará cuenta de cómo vincular los medios sin más habilidades inventivas. Los dispositivos preferidos son aquellos que se pueden aplicar sin el conocimiento particular de un médico especializado, por ejemplo, tiras de prueba o dispositivos electrónicos que simplemente requieren cargarse con una muestra. Los resultados se pueden dar como salida de datos sin procesar de diagnóstico paramétrico, preferiblemente, como cantidades absolutas o relativas. Debe entenderse que estos datos necesitarán interpretación por parte del médico. Sin embargo, también se prevén dispositivos de sistema experto en los que la salida comprende datos en bruto de diagnóstico procesados cuya interpretación no requiere un médico especializado. Otros dispositivos preferidos comprenden las unidades/dispositivos de análisis (por ejemplo, biosensores, matrices, soportes sólidos acoplados a ligandos que reconocen específicamente los polipéptidos, dispositivos de resonancia de plasmón superficial, espectrómetros de RMN, espectrómetros de masas, etc.) o unidades/dispositivos de evaluación mencionados anteriormente de acuerdo con los métodos de la invención.

Realizaciones

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar cáncer de mama (BC) en un sujeto, que comprende

a) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y

b) determinar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b, en un sujeto.

El término miR-652 puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p (en particular miR-652-3p), el término miR-801 se refiere a la secuencia de la cadena -3p o -5p, el término miR-376c puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p (en particular miR-376c-3p), el término miR-376a puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p (en particular miR- 376a-3p), el término miR-127 puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p (en particular miR-127-3p), el término miR-409 puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p cadena (en particular miR-409-3p), y el término miR-148b puede referirse a la secuencia de la cadena -3p o -5p (en particular miR-148-3p).

Una alteración en el estado de metilación y/o nivel de expresión de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede indicar un cambio en el estado del tejido o enfermedad tal como el empeoramiento o mejoramiento de un estado o enfermedad de los tejidos, en particular cáncer. En particular, un estado de metilación disminuido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad del tejido. Un mayor estado de metilación de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de una mejoría del estado o enfermedad del tejido. Una alteración en el estado de metilación de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, también puede ser indicativo del riesgo de desarrollar un estado alterado del tejido o una enfermedad, en particular cáncer. Más específicamente, un estado de metilación disminuido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo del riesgo de desarrollar una enfermedad o estado degenerativo del tejido, en particular cáncer. Un estado de metilación alterado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, en particular un estado de metilación reducido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S 100P y/o DYRK4, también será indicativo de un individuo que padece un estado de tejido alterado o una enfermedad, en particular cáncer. Además, un estado de metilación alterado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RApSn , S100Py/o DYRK4, por ejemplo, un nivel elevado o reducido del estado de metilación de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100Py/o DYRK4, puede indicar la progresión o una etapa del estado de un tejido o una enfermedad, en particular cáncer, en un sujeto. En particular, un estado de metilación disminuido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad de un tejido, en particular cáncer.

En particular, un nivel de expresión aumentado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad del tejido. Un nivel de expresión disminuido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de una mejoría del estado o enfermedad del tejido. Una alteración en el nivel de expresión de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, también puede ser indicativo del riesgo de desarrollar un estado alterado del tejido o una enfermedad, en particular cáncer. Más específicamente, un nivel de expresión aumentado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo del riesgo de desarrollar una enfermedad o estado degenerativo del tejido, en particular cáncer. Un nivel de expresión alterado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, en particular un mayor nivel de expresión de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede también será indicativo de un individuo que padece un estado de tejido alterado o una enfermedad, en particular cáncer. Además, un nivel de expresión alterado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, por ejemplo, un nivel de expresión elevado o reducido de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede indicar la progresión o una etapa del estado de un tejido o una enfermedad, en particular cáncer, en un sujeto. En particular, un nivel de expresión aumentado de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y/o DYRK4, puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad de un tejido, en particular cáncer.

Una alteración en el nivel de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b puede indicar un cambio en el estado del tejido o una enfermedad tal como el empeoramiento o mejoría del estado o enfermedad de un tejido, en particular cáncer.

En particular, un nivel elevado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad del tejido. Un nivel reducido de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b puede ser indicativo de una mejoría del estado o enfermedad de los tejidos. Una alteración en el nivel de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b también puede ser indicativa del riesgo de desarrollar un estado alterado del tejido o un enfermedad, en particular cáncer. Más específicamente, un nivel elevado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b puede ser indicativo del riesgo de desarrollar una enfermedad o estado degenerativo del tejido, en particular cáncer. Un nivel alterado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b, en particular un nivel elevado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b también puede ser indicativo de un individuo que padece un estado tisular alterado o una enfermedad, en particular cáncer. Además, un nivel alterado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b, por ejemplo, un nivel elevado o reducido de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b, puede indicar la progresión o una etapa del estado de un tejido o una enfermedad, en un sujeto. En particular, un nivel elevado de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y/o miR-148b puede ser indicativo de un empeoramiento del estado o enfermedad de un tejido, en particular cáncer.

El estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la presencia, en particular la cantidad, de al menos un miARN es indicativo del pronóstico y/o diagnóstico de dicho sujeto. El pronóstico y/o diagnóstico de cáncer incluye

I. el riesgo de desarrollar cáncer,

ii. la presencia de cáncer, y/o

iii. la progresión, en particular el empeoramiento o la mejoría, del cáncer.

Se puede determinar el estado de metilación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores de metilación diferentes. En particular, se determinan los 7 marcadores de miARN. En caso de que se determinen los siete marcadores de miARN, esta combinación se denomina miR-7, es decir, miR-7 abarca los siete marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127p, m iR-409 y miR-148b.

Debe entenderse que se pueden usar diversas combinaciones específicas de marcador de metilación y miARN para pronosticar y/o diagnosticar cáncer.

En realizaciones particulares, se determina el estado de mutilación de los marcadores de mutilación RPTOR, MGRN1 y RAPSN, y la presencia, en particular se determina la cantidad, de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR- 376a, miR-l27-3p, miR-409-3p y miR-148b. Opcionalmente, también se determina el estado de metilación y/o el nivel de expresión de HYAL2.

En realizaciones particulares, se determina el estado de metilación de los marcadores de metilación DYRK4, S100P, FUT7 y SLC22A18, y se determina la presencia, en particular la cantidad, de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127-3p, miR-409-3p y miR-148b. Opcionalmente, también se determina el estado de metilación de HYAL2.

En otras realizaciones, se determina el estado de metilación de los marcadores de metilación MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y se determina la presencia de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127-3p, miR-409-3p y miR-148b. Opcionalmente, también se determina el estado de metilación de HYAL2.

La determinación del estado de metilación puede comprender determinar la metilación de al menos un sitio CpG dentro del gen HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100Py/o DYRK4. En particular, se determina el estado de metilación del promotor, intrón y/o región del exón de dichos genes.

En particular, el gen HYAL2 es el gen HYAL2 humano localizado en el cromosoma 3 humano (GenBank acceso No.: NC_000003.11 GI: 224589815). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 50334760 y la posición 50335700 en el cromosoma 3 humano. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición 50335694 (cg27091787), 50335584 (HYAL_CpG_1), 50335646 (HYAL_CpG_2), o 50335671 (HYAL_CpG_3), 50335166 (HYAL-is-310 CpG_1), 50335180 (HYAL-is-310 CpG_2), 50335192 (HYAL-is-310 CpG_3), 50335195 (HYAL-is-310 CpG_4), 50335227 (HYAL-is-310 CpG_5), 50335233 (HYAL-is-310 CpG_6), 50335300 (HYAL-is-310 CpG_7), 50335315 (HYAL-is-310 CpG_8), 50335375 (HYAL-is-310 CpG_9), 50335392 (HYAL-is-310 CpG_10), 50335401 (HYAL-is-310 CpG_11), 50334744 (HYAL2-is-325_CpG_1), 50334761 (HYAL2-is-325_CpG_2), 50334804 (HYAL2-is-325_CpG_3), 50334844 (HYAL2-is-325_CpG_4), 50334853 (HYAL2-is-325_CpG_5), 50334862 (HYAL2-is-325_CpG_6), 50334880 (HYAL2-is-325_CpG_7), 50334906 (HYAL2-is-325_CpG_8), 50334913 (HYAL2-is-325_CpG_9), 50334917 (HYAL2-is-325_CpG_10), 0334928 (HYAL2-is-325_CpG_11), 50334944 (HYAL2-is-325_CpG_12), 50334956 (HYAL2-is-325_CpG_13), 50334980 (HYAL2-is-325_CpG_14), 50334982 (HYAL2-is-325_CpG_15), 50335010 (HYAL2-is-325_CpG_16) 50335014 (HYAL2-is-325_CpG_17), 50331237 (cg08776109) and 50330420 (cg06721473).

Más específicamente, se selecciona al menos un sitio CpG de la lista que consta de cg27091787 en la posición 50335694, HYAL_CpG_1 en la posición 50335584, HYAL_CpG_2 en la posición 50335646 y HYAL_CpG_3 en la posición 50335671. En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de HYAL2 comprendida en la muestra a analizar. Por ejemplo, el gen HYAL2 se encuentra en el cromosoma 3: posiciones 50.355,221-50.360.337 en la construcción 37/hg19, pero en el cromosoma 3: posiciones 50.330.244-50.335,146 en la construcción 36/hg18.

En particular, el gen MGRN1 es el gen MGRN1 humano localizado en el cromosoma 16 humano (GenBank acceso No.: NC_000016.10, intervalo: 4624824-4690974, montaje primario GRCh38 de referencia; GenBank acceso No.: NC_018927.2, intervalo: 4674882 -4741756, ensamblaje alternativo CHM1_1.1; GenBank acceso No.: AC_000148.1, intervalo: 4641815-4707494, ensamblaje alterno HuRef). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 4654000 y la posición 4681000 en el cromosoma 16 humano. En particular, el sitio o sitios CpG están ubicados en una o más de las siguientes regiones del cromosoma 16: 4670069­ 4670542, 4654000-4655000, 4669000-4674000 y 4678000-4681000. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1 /hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 4670487 (MGRN1_CpG_1), 4670481 (MGRN1_CpG_2), 4670466 (MGRN1_CpG_3), 4670459 (MGRN1_CpG_4), 4670442 (MGRN1_CpG_5), 4670440 (MGRN1_CpG_6), 4670435 (MGRN1_CpG_7), 4670433 (MGRN1_CpG_8), 4670422 (MGRN1_CpG_9), 4670414 (MGRN1_CpG_10), 4670411 (MGRN1_CpG_11), 4670402 (MGRN1_CpG_12), 4670393 (MGRN1_CpG_13), 4670357 (MGRN1_CpG_14), 4670352 (MGRN1_CpG_15), 4670343 (MGRN1_CpG_16), 4670341 (MGRN1_CpG_17), 4670336 (MGRN1_CpG_18), 4670313 (MGRN1_CpG_19), 4670310 (MGRN1_CpG_20), 4670301 (MGRN1_CpG_21), 4670292 (MGRN1_CpG_22), 4670287 (MGRN1_CpG 23), 4670281 (MGRN1_CpG_24), 4670276 (MGRN1_CpG_25), 4670264 (MGRN1_CpG_26), 4670234 (MGRN1_CpG_27), 4670211 (MGRN1_CpG_28), 4670180 (MGRN1_CpG 29), 4670174 (MGRN1_CpG_30), 4670157 (MGRN1_CpG_31), 4670137 (MGRN1_CpG_32), 4670123 (MGRN1_CpG_33), 4670117 (MGRN1_CpG_34). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de MGRN1 comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen RPTOR es el gen RPTOR humano ubicado en el cromosoma 17 humano (GenBank acceso No.: NC_000017.11, intervalo: 80544825-80966373, ensamblaje primario GRCh38; GenBank acceso No.: NG_013034.1, intervalo: 5001- 426549, RefSeqGene; GenBank acceso No.: NC_018928.2, intervalo: 78604958-79026514, ensamblaje alternativo CHM1_1.1; GenBank acceso No.: NG_013034.1; GenBank acceso No.: AC_000149.1, intervalo: 73954508-74378467, ensamble alternativo HuRef). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 76.297.000 y la posición 76.416.000 en el cromosoma 17 humano. En particular, el sitio o sitios CpG están ubicados en una o más de las siguientes regiones del cromosoma 17: 76.369.937-76.370.536, 76.297.000-76.310.000, 76.333.000-76.341.000, 76.360.000-76.380.000 y 76.411.000­ 76.416.000. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 76370001 (RPTOR_CpG_1), 76370037 (RPTOR_CpG_2), 76370073 (RPTOR_CpG_3), 76370092G (RPTOR_CpG_1), 76370172 (RPTOR_CpG_5), 76370199 (RPTOR_CpG_6), 76370220 (RPTOR_CpG_7), 76370253 (RPTOR_CpG_8). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de RPTOR comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen SLC22A18 es el gen SLC22A18 humano ubicado en el cromosoma 11 humano (GenBank acceso No.: NC_000011.10, intervalo: 2899721-2925246, ensamblaje primario de referencia GRCh38; GenBank acceso No.: NG_011512.1, intervalo: 5001 -30526, RefSeqGene; GenBank acceso No.: NT_187585.1, intervalo: 131932-157362, Referencia GRCh38 ALT_REF_LOCI_1; GenBank acceso No.: AC_000143.1, intervalo: 2709509-2734907, ensamblaje alternativo HuRef; GenBank acceso No.: NC_018922.2, intervalo: 2919878-2945340, ensamblaje alternativo CHM1_1.1). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 2876000 y la posición 2883000 en el cromosoma 11 humano. En particular, los sitios CpG se encuentran en 2.877.113-2.877.442. Más específicamente, crm11: 2.876.000 - crm11: 2.883.000, una región de metilación diferencial asociada a cáncer de 7000 pb, en particular asociada a BC, OvCa y/o PaCa, que cubre la región promotora, una isla de CpG y parte de la región del cuerpo génico de SLC22A18 (variantes de transcripción). Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg 18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 2877395 (SLC22A18_CpG_1), 2877375 (SLC22A18_CpG_2), 2877365 (SLC22A18_CpG_3), 2877341 (SLC22A18_CpG_4), 2877323 (SLC22A18_CpG_5), 2877311 (SLC22A18_CpG_6), 2877193 (SLC22A18_CpG_7), 2877140 (SLC22A18_CpG_8). En particular, se determinan el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de SLC22A18 comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen FUT7 es el gen FUT7 humano ubicado en el cromosoma 9 humano (GenBank acceso No.: NC_000009.12, intervalo: 137030174-137032840, ensamblaje primario de referencia GRCh38; GenBank acceso No.: NG_007527.1, intervalo: 5001-7667, RefSeqGene; GenBank acceso No.: AC_000141.1, intervalo: 109383478­ 109386144, ensamblaje alternativo HuRef; GenBank acceso No.: NC_018920.2, intervalo: 140073389-140076055, ensamblaje alternativo CHM1_1.1). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 139046000 y la posición 139048000 en el cromosoma 9 humano. Más específicamente, una región de metilación diferencial asociada a BC, OvCa y/o PaCa de 2000 pb ubicada en la región promotora de FUT7. En particular, los sitios CpG se encuentran en 139.047.218-139.047.610. 139.046.000­ 139.048.000 y 139.045.065-139.045.817. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 139047253 (FUT_CpG_1), 139047314 (FUT_CpG_2), 139047346 (FUT_CpG_3), 139047427 (FUT)_Cp, 139047445 (FUT_CpG_5), 139047467 (FUT_CpG_6), 139047483 (FUT_CpG_7), 139047566 (FUT_CpG_8). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de FUT7 comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen RAPSN es el gen RAPSN humano localizado en el cromosoma 11 humano (GenBank acceso No.: NC_000011.10. intervalo: 47437757-.47449178, ensamblaje primario de referencia GRCh38; GenBank acceso No.: NG_008312.1, intervalo: 5001-16423, RefSeqGene; GenBank acceso No.: NC_018922.2, intervalo: 47458570­ 47469991, ensamblaje alternativo CHM1_1.1; GenBank acceso No.: AC_000143.1, intervalo: 47159075-47170494, ensamblaje alternativo HuRef). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 47427500 y la posición 47428500 en el cromosoma 11 humano. Preferiblemente, los sitios CpG están ubicados en 47427500-47428300. Más específicamente, una región de metilación diferencial asociada a cáncer de 1000 pb, preferiblemente asociada a BC, OvCa y/o a PaCa, ubicada en la región promotora de RAPSN. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 47427787 (RAPSN_CpG_1), 47427825 (RAPSN_CpG_2), 47427883 (RAPSN_CpG_3), 47427915 (RAPSN_CpG_3), 47427915 (RAPSN_CpG_3), 47427930 (RAPSN_CpG_5), 47427976 (RAPSN_CpG_6), 47428029 (RAPSN_CpG_7), 47428110 (RAPSN_CpG_8). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de RAPSN comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen S100P es el gen S100P humano ubicado en el cromosoma 4 humano (GenBank acceso No.: NC_000004.12, intervalo: 6693839-6697170, ensamblaje primario de referencia GRCh38; GenBank acceso No.: AC_000136.1, intervalo: 6627254 -6630595, ensamblaje alternativo HuRef; GenBank acceso No.: NC_018915.2, intervalo: 6693944-6697285, ensamblaje alternativo CHM1_1.1). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 6746000 y la posición 6747000 en el cromosoma 4 humano. Más específicamente, una región de metilación diferencial asociada a cáncer de 1000 pb (preferiblemente asociada a BC, OvCa y/o PaCa) ubicada desde la región promotora hasta el primer exón de S100P. En particular, los sitios CpG se encuentran en 6.746.537-6.746.823. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados en la posición: 6746565 (S100P_CpG_1), 6746599 (S100P_CpG_2), 6746609 (S100P_CpG_3), 6746616 (S100P )_Cp, 6746623 (S100P_CpG_5), 6746634 (S100P_CpG_6), 6746710 (S100P_CpG_7), 6746728 (S100P_CpG_8), 6746753 (S100P_CpG_9), 6746779 (S100P_CpG_712G_10). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de S100P comprendida en la muestra a analizar.

En particular, el gen DYRK4 es el gen DYRK4 humano ubicado en el cromosoma 12 humano (GenBank acceso No.: NC_000012.12, intervalo: 4590072-4613888, ensamblaje primario de referencia GRCh38; GenBank acceso No.: AC_000144.1, intervalo: 4555932-4579747, ensamblaje alternativo HuRef; GenBank acceso No.: NC_018923.2, intervalo: 4698860-4722666, ensamblaje alterno CHM1_1.1). En particular, se determina el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicados entre la posición 4569000 y la posición 4571000 en el cromosoma 12 humano. Más específicamente, una región de metilación diferencial asociada a cáncer de 2000 pb, preferiblemente BC, OvCa y/o PaCa, ubicada en la región promotora de DYRK4. En particular, los sitios CpG están ubicados en 4569448­ 4569945. Más específicamente, en particular refiriéndose a la construcción 36.1/hg18 del genoma humano, el estado de metilación de al menos uno de los sitios CpG ubicado en la posición: 4569879 (DYRK4_CpG_1), 4569809 (DYRK4_CpG_2), 4569707 (DYRK4_CpG_3), 4569493 (DYRK4_CpG_4). En particular, se determina el estado de metilación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce o al menos quince sitios CpG de la presente invención. El experto en la materia entenderá que la numeración exacta de dichos sitios CpG puede depender de la secuencia genómica específica y de la secuencia específica de la región promotora de DYRK4 comprendida en la muestra a analizar.

El método de pronóstico y/o diagnóstico de cáncer puede comprender además la etapa de comparar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y la presencia, en particular la cantidad, de los marcadores de miARN en dicho sujeto, con el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y la presencia, en particular la cantidad, de los marcadores de miARN en una o más referencias. En particular, la referencia es un valor de umbral, un valor de referencia o una muestra de referencia.

En los casos en los que la referencia es un valor de umbral, un estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, que está por debajo un valor de umbral indica que un sujeto padece cáncer, un mayor riesgo de desarrollar cáncer o un empeoramiento de la enfermedad; mientras que un estado de metilación igual o superior al valor de umbral es indicativo de un sujeto que no padece cáncer, de un menor riesgo de desarrollar cáncer o de una mejoría de la enfermedad. Debe entenderse que el nivel antes mencionado puede variar debido a estadísticas y errores de medición.

En los casos en los que la referencia es un valor de umbral, un nivel de expresión del marcador de metilación al menos en el grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, que es igual hasta o por encima del valor de umbral es indicativo de que un sujeto padece cáncer, un mayor riesgo de desarrollar cáncer o un empeoramiento de la enfermedad; mientras que un nivel de expresión que está por debajo del valor de umbral es indicativo de que un sujeto no padece cáncer, de un menor riesgo de desarrollar cáncer o de una mejoría de la enfermedad. Debe entenderse que el nivel antes mencionado puede variar debido a estadísticas y errores de medición.

En los casos en los que la referencia es un valor de umbral, una cantidad de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b, que es igual o superior al valor de umbral indica que un sujeto padece cáncer, un riesgo aumentado de desarrollar cáncer o un empeoramiento de la enfermedad; mientras que una cantidad que está por debajo del valor de umbral indica que un sujeto no padece cáncer, un menor riesgo de desarrollar cáncer o una mejoría de la enfermedad. Debe entenderse que las cantidades antes mencionadas pueden variar debido a estadísticas y errores de medición.

El valor de umbral para un sujeto que padece cáncer, un mayor riesgo de desarrollar cáncer o un empeoramiento de la enfermedad para HYAL2 puede ser un estado de metilación de menos del 90% de los controles y un nivel de expresión más de 1,2 veces más alto que los controles. El valor de umbral para MGRN1 puede ser un estado de metilación de menos del 90% de los controles. El valor de umbral para RPTOR puede ser un estado de metilación de menos del 95% de los controles. El valor de umbral para SLC22A18 puede ser un estado de metilación de menos del 95% de los controles y un nivel de expresión de más de 1,1 veces más alto que los controles. El valor de umbral para FUT7 puede ser un estado de metilación de menos del 92% de los controles. El valor de umbral de RAPSN puede ser un estado de metilación de menos del 98% de los controles. El valor de umbral para S100P puede ser un estado de metilación de menos del 90% de los controles y un nivel de expresión de más de 2 veces más alto que los controles. El valor de umbral para DYRK4 puede ser un estado de metilación de menos del 85% de los controles.

El nivel de umbral para miR-652 puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-801 puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.6 Ct menor que los controles (o más de 1.5 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-376c puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-376a puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.6 Ct menor que los controles (o más de 1.5 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-127 puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-409 puede ser una cantidad de al menos un valor de 0.4 Ct menor que los controles (o más de 1.3 veces mayor que los controles). El nivel de umbral para miR-148b puede ser una cantidad de al menos un valor de 0. 3 Ct menor que los controles (o más de 1.2 veces mayor que los controles).

En los casos en los que la referencia es un valor de referencia, dicho valor de referencia puede ser un valor representativo de la ausencia de cáncer, de la presencia de cáncer o de un riesgo aumentado o disminuido de desarrollar cáncer.

La muestra de referencia se puede seleccionar del grupo que consta de una muestra de referencia derivada de un individuo sano, una muestra de referencia derivada de un individuo enfermo, una muestra de referencia derivada del mismo individuo que la muestra de interés tomada en un punto de tiempo anterior o posterior y una muestra de referencia representativa de un individuo sano o representativa de la presencia o ausencia de cáncer o representativa de un aumento o disminución del riesgo de desarrollar cáncer.

En los casos en los que la referencia es un sujeto sano o un sujeto con un riesgo reducido de desarrollar cáncer o un estado de metilación de un marcador de metilación o una cantidad de miARN representativa de la ausencia de cáncer, un nivel de metilación disminuido y/o una expresión aumentada de al menos un marcador de metilación y la presencia o una cantidad aumentada de al menos un marcador de miARN en comparación con la referencia indica

1. el riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

ii. la presencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

iii. la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa en el sujeto.

En los casos en los que la referencia es un sujeto enfermo o un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer o un estado de metilación de un marcador de metilación o una cantidad de miARN representativa de la presencia de cáncer, un estado de metilación o nivel de expresión similar de al menos un marcador de metilación y una cantidad similar de al menos un marcador de miARN indica

i. el riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

ii. la presencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

iii. la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa en el sujeto.

En los casos en los que la muestra de referencia se deriva del mismo sujeto que la muestra de interés y se tomó en un momento anterior,

(i) una metilación disminuida y/o una expresión aumentada de al menos un marcador de metilación y la presencia o una cantidad aumentada de al menos un marcador de miARN en comparación con la referencia indica

i. el riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

ii. la presencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

iii. la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

(ii) una metilación aumentada y/o una expresión más baja de al menos un marcador de metilación y la ausencia o una cantidad disminuida de al menos un marcador de miARN en comparación con la referencia indica

i. un menor riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

ii. la ausencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

iii. una progresión disminuida del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

y/o

(iii) un nivel similar de metilación y/o expresión de al menos un marcador de metilación y una cantidad similar de al menos un marcador de miARN en comparación con la referencia indica

i. un riesgo similar de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

ii. un estancamiento en la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

y/o

iii. una persistencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, en el sujeto.

De acuerdo con la presente invención, se determina la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b. Preferiblemente, una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces mayor que los controles) de miR-652 es indicativa de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.6 Ct menor que los controles (o más de 1.5 pliegues más alto que los controles) de miR-801 es indicativo de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces más alto que los controles) de miR-376c es indicativo de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.6 Ct menor que los controles (o más de 1.5 veces más alto que los controles) de miR-376a es indicativo de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.5 Ct menor que los controles (o más de 1.4 veces más alto que los controles) de miR -127 es indicativo de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.4 Ct menor que los controles (o más de 1.3 veces mayor que los controles) de miR-409 es indicativo de cáncer, una cantidad de al menos un valor de 0.3 Ct menor que los controles (o más de 1.2 veces más alto que los controles) de miR-148b es indicativo de cáncer.

La muestra de interés y/o la muestra de referencia pueden ser una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. La muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. Preferiblemente, el fluido corporal es sangre.

La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

El sujeto puede ser un mamífero, un reptil o un ave. En particular, el sujeto puede seleccionarse del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe un método para determinar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención del cáncer o el tratamiento del cáncer en un sujeto, sin embargo dicho método no forma parte de la invención, que comprende las etapas de

(a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una muestra de un sujeto, y

(b) determinar la dosis de un producto farmacéutico dependiendo del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés.

En particular, el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, se determina en una referencia para comparar con el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés.

En particular, la dosificación de un producto farmacéutico se determina en función de la comparación del estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN a en la muestra de interés y la referencia o muestra de referencia.

En particular, la muestra de interés y/o la muestra de referencia es una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. En realizaciones particulares, la muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. En particular, el fluido corporal es sangre.

La muestra de tejido es preferiblemente un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

En particular, el sujeto puede ser un mamífero, reptil o ave. Preferiblemente, el sujeto se selecciona del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe un método para adaptar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o tratamiento del cáncer, sin embargo dicho método no forma parte de la invención y comprende las etapas de

(a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra,

(b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia,

(c) examinar la muestra analizada en cuanto a si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicha muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, y

(d) adaptar la dosis de un producto farmacéutico dependiendo de si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia.

En particular, la dosis de un producto farmacéutico aumenta si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación está disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o menor en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual a aumentado en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual a aumentado en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o el riesgo disminuido de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el aumento del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un momento anterior.

En particular, la dosis de un producto farmacéutico se reduce si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o aumentado en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de mutilación de al menos un marcador de mutilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual o disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN es igual o disminuida en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia del enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

En particular, la muestra de interés y/o la muestra de referencia pueden ser una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. La muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. En particular, la muestra de fluido corporal puede ser una muestra de sangre.

La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

En particular, el sujeto es un mamífero, reptil o ave. En particular, el sujeto se selecciona del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe un método para determinar los efectos beneficiosos y/o adversos de una sustancia sobre el cáncer o el desarrollo de cáncer, sin embargo dicho método no forma parte de la invención, que comprende las etapas de

(a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S 100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y el cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra,

(b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, y

(c) examinar la muestra de interés en cuanto a si el estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicha muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia,

en el que la muestra de interés fue expuesta de manera diferente a dicha sustancia que la una o más referencias o muestras de referencia.

La muestra de interés se puede exponer de manera diferente a dicha sustancia en cuanto al tiempo y/o concentración. Así, la muestra de interés puede exponerse a dicha sustancia durante un intervalo de tiempo más largo o más corto, y/o a una concentración más alta o más baja de dicha sustancia.

En los casos en los que la muestra de interés se expone a una concentración más alta y/o durante un intervalo de tiempo más largo, se determina un efecto adverso de una sustancia si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación está disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o menor en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de mutilación de al menos un marcador de mutilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual o aumentado en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual a aumentado en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o el riesgo disminuido de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el aumento del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un momento anterior.

En los casos en los que la muestra de interés se expone a una concentración más alta y/o durante un intervalo de tiempo más largo, se determina un efecto beneficioso de una sustancia si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o aumentado en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual o disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN es igual o disminuida en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia del enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

En los casos en los que la muestra de interés se expone a una concentración más baja y/o durante un intervalo de tiempo más corto, no se determina ningún efecto o un efecto adverso de una sustancia si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación está disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o menor en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual o aumentado en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual a aumentado en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN aumenta en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o el riesgo disminuido de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el aumento del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativa de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN es igual o aumenta en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un momento anterior.

En los casos en los que la muestra de interés se expone a una concentración más baja y/o durante un intervalo de tiempo más corto, se determina un efecto beneficioso de una sustancia si

a) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual o aumentado en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

b) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

c) el estado de metilación de al menos un marcador de metilación es igual a disminuido en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

d) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación es igual o disminuido en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia de la enfermedad.

e) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

f) el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

g) la cantidad de al menos un miARN es igual o disminuida en comparación con una referencia indicativa de la ausencia de la enfermedad o la disminución del riesgo de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto sano o representativo de la ausencia del enfermedad.

h) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una referencia indicativa de la presencia de la enfermedad o el riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad, o muestra de referencia de un sujeto enfermo o representativo de la presencia de la enfermedad.

i) la cantidad de al menos un marcador de miARN disminuye en comparación con una muestra de referencia obtenida de dicho sujeto en un punto de tiempo anterior.

En particular, la muestra de interés y/o la muestra de referencia es una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. La muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, tales como por ejemplo, mama o próstata. La muestra de líquido corporal puede ser una muestra de sangre.

La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

En particular, el sujeto es un mamífero, reptil o ave. En particular, el sujeto se selecciona del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe, pero no forma parte de la presente invención, un método para identificar a un paciente como el que responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas del sujeto posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación aumentado de la al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y la ausencia o cantidad disminuida de al menos un marcador de miARN indica una respuesta al tratamiento.

La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. En particular, la muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. Preferiblemente, la muestra de fluido corporal es una muestra de sangre.

La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

El sujeto puede ser un mamífero, reptil o ave. En particular, el sujeto se selecciona del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, conejillo de indias, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe, pero no forma parte de la presente invención, un método para identificar a un paciente como aquel que no responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que una disminución del estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de al menos un marcador de metilación, y la presencia o cantidad aumentada de al menos un marcador de miARN indica una falta de respuesta al tratamiento.

La muestra de interés y/o la muestra de referencia pueden ser una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. En particular, la muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o cultivos de tejidos.

El sujeto puede ser un mamífero, reptil o ave. En particular, el sujeto puede seleccionarse del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

También se describe, pero no forma parte de la presente invención, un método para tratar el cáncer, que comprende las etapas:

(i) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra de un sujeto;

(ii) iniciar el tratamiento de dicho sujeto con un primer régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes o terapias contra el cáncer,

(iii) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y la cantidad de al menos un miARN en una o más segundas muestras tomadas posteriormente de dicho sujeto;

(iv) opcionalmente repetir las etapas (ii) y (iii) una o más veces;

(v) continuar tratando al sujeto con el primer régimen de tratamiento si hay un aumento sustancial del estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o ausencia disminuida de al menos un marcador de miARN, o

(vi) modificar el tratamiento o terminar el tratamiento del sujeto con el primer régimen de tratamiento y tratar al sujeto en su lugar con un segundo régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes anticancerosos o terapias no comprendidas en el primer régimen de tratamiento si hay un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un mayor nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y una mayor cantidad o presencia de al menos un marcador de miARN.

La muestra de interés y/o la muestra de referencia pueden ser una muestra de fluido corporal o una muestra de tejido. En particular, la muestra de fluido corporal puede seleccionarse del grupo que consta de sangre, suero, plasma, fluido sinovial, orina, saliva, fluido linfático, fluido lagrimal y fluido obtenible de las glándulas, como por ejemplo, mama o próstata. En particular, la muestra de fluido corporal es una muestra de sangre.

La muestra de tejido puede ser un extracto de tejido obtenido de tejido tumoral o tejido adyacente a un tumor. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un cultivo celular o cultivo de tejidos, como por ejemplo, pero sin limitarse a, cultivos de diversas células cancerosas. La muestra de interés y/o la muestra de referencia puede ser un medio obtenido a partir de dichos cultivos celulares o de tejidos.

El sujeto puede ser un mamífero, reptil o ave. En particular, el sujeto puede seleccionarse del grupo que consta de animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata), animales domésticos (incluyendo, por ejemplo, cobaya, conejo, caballo, burro, vaca, oveja, cabra, cerdo, pollo, camello, gato, perro, tortuga acuática, tortuga terrestre, serpiente o lagarto) o primates, incluidos chimpancés, bonobos, gorilas y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

El régimen de tratamiento se puede seleccionar de la lista que consta de quimioterapia, terapia antihormonal, inmunoterapia y radioterapia.

También se describen medios para pronosticar y/o diagnosticar

. el riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

i. la presencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

ii. la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, que comprende

c) uno o más medios para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y

d) uno o más medios para detectar la cantidad de al menos un marcador de miARN.

Dichos medios pueden detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTo R, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente.

Los uno o más medios para detectar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación pueden comprender al menos un polinucleótido específico de metilación. En particular, el polinucleótido específico de metilación puede ser un cebador específico de metilación y/o una sonda específica de metilación.

Los uno o más medios para detectar el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación pueden comprender una fracción de unión. Dicha fracción de unión es en particular un polinucleótido, péptido, proteína o aptámero. La fracción de unión se puede seleccionar del grupo que consta de anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, anticuerpos de dominio único (sdAb), nanocuerpos, Fv monocatenario (scFv), fragmentos variables divalentes monocatenarios (di-scFv), scFv en tándem, diacuerpos, triacuerpos, diacuerpos biespecíficos, diacuerpos monocatenarios (scDb), acopladores de células T biespecíficas (BiTE) y moléculas DART".

La fracción de unión puede unirse a una parte del producto génico del marcador de metilación. Por consiguiente, en los casos en los que la fracción de unión es un polinucleótido, dicho polinucleótido se une al ARNm transcrito del gen del marcador de metilación respectivo, es decir, el gen de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P o DYRK4.

En los casos en los que la fracción de unión es un péptido, proteína o aptámero, dicho péptido, proteína o aptámero se une a una parte, en particular a un epítopo, de la proteína traducida del gen del marcador de metilación respectivo, es decir el gen de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P o DYRK4.

Dichos medios pueden detectar al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especifica en detalle más arriba.

Los uno o más medios para detectar la cantidad de al menos un marcador de miARN pueden comprender al menos un polinucleótido específico de miARN.

En particular, dicho al menos un polinucleótido específico de miARN puede tener una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1-13

Dichos medios pueden usarse en el método especificado en detalle anteriormente. En particular, dichos medios son para uso en un método seleccionado del grupo que consta de:

(i) un método para pronosticar y/o diagnosticar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, en un sujeto, que comprende (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado entre los grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, y (b) determinar la presencia, en particular la cantidad, de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR- 801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, en un sujeto, en el que el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de mutilación y la presencia de al menos un miARN es indicativo del pronóstico y/o diagnóstico de dicho sujeto,

(ii) un método para determinar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de un sujeto, y opcionalmente determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una referencia para comparar con el estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, y (b) determinar la dosificación de un producto farmacéutico dependiendo del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, opcionalmente dependiendo de la comparación del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador a de miARN en la muestra de interés y la referencia o muestra de referencia, (iii) un método para adaptar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, (c) examinar la muestra analizada para determinar si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicho muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, y (d) adaptar la dosis de un fármaco dependiendo de si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia,

(iv) un método para determinar los efectos beneficiosos y/o adversos de una sustancia sobre el cáncer o el desarrollo de cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado de entre grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de interés, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y el cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, y (c) examinar la muestra de interés en cuanto a si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicha muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, en el que la muestra de interés se expuso de manera diferente a dicha sustancia que una o más referencias o muestras de referencia,

(v) un método para identificar a un paciente que responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se ha especificado en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación aumentado de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y la ausencia o disminución de la cantidad de al menos un marcador de miARN indica una respuesta al tratamiento,

(vi) un método para identificar a un paciente como que no responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR- 409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de el al menos un marcador de metilación, y la presencia o mayor cantidad de al menos un marcador de miARN indica una falta de respuesta al tratamiento, y

(vii) un método para tratar el cáncer, que comprende las etapas: (i) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra de un sujeto; (ii) iniciar el tratamiento de dicho paciente con un primer régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes o terapias contra el cáncer, (iii) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y la cantidad de al menos un miARN en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente de dicho sujeto; (iv) opcionalmente repetir las etapas (ii) y (iii) una o más veces; (v) continuar tratando al paciente con el primer régimen de tratamiento si hay un aumento sustancial del estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o ausencia disminuida de al menos un marcador de miARN, o (vi) modificar el tratamiento o terminar el tratamiento del paciente con el primer régimen de tratamiento y tratar al paciente en su lugar con un segundo régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes anticancerosos o terapias no comprendidas en el primer régimen de tratamiento si hay un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o presencia aumentada de al menos un marcador de miARN.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de BC, comprendiendo el kit uno o más medios para detectar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y medios para detectar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente.

El kit puede comprender además

(a) un recipiente, y/o

(b) un soporte de datos, en el que el soporte de datos comprende información tal como

(i) instrucciones sobre métodos para identificar el riesgo de desarrollar y/o identificar la presencia y/o monitorear la progresión del cáncer

(ii) instrucciones de uso de los medios para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN, en particular en una muestra, más específicamente en una muestra de un individuo y/o del kit,

(iii) información de calidad, tal como información sobre el lote/número de lote de los medios para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN y/o del kit, el lugar de fabricación o ensamblaje o la fecha de expiración o caducidad, información sobre el correcto almacenamiento o manipulación del kit,

(iv) información sobre la composición del tampón o los tampones, diluyente o diluyentes, reactivo o reactivos para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN y/o de los medios para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN,

(v) información relativa a la interpretación de la información obtenida al realizar los métodos antes mencionados para identificar y/o controlar la progresión del cáncer,

(vi) una advertencia sobre posibles malas interpretaciones o resultados incorrectos al aplicar métodos inadecuados y/o medios inadecuados, y/o

(vii) una advertencia sobre posibles malas interpretaciones o resultados incorrectos cuando se utiliza un reactivo o reactivos y/o un tampón o tampones inadecuados.

El kit descrito en este documento se puede usar en el método especificado en detalle anteriormente. En particular, el kit puede usarse en un método seleccionado del grupo que consta de:

(i) un método para pronosticar y/o diagnosticar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, en un sujeto, que comprende (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado entre los grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, y (b) determinar la presencia, en particular la cantidad, de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR -801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, en un sujeto, en el que el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la presencia de al menos un miARN es indicativo del pronóstico y/o diagnóstico de dicho sujeto,

(ii) un método para determinar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de un sujeto, y opcionalmente determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una referencia para comparar con el estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, y (b) determinar la dosificación de un producto farmacéutico dependiendo del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, opcionalmente dependiendo de la comparación del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador a de miARN en la muestra de interés y la referencia o muestra de referencia, (iii) un método para adaptar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de mutilación seleccionado entre el grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, (c) examinar la muestra analizada para determinar si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicho muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, y (d) adaptar la dosis de un fármaco dependiendo de si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia,

(iv) un método para determinar los efectos beneficiosos y/o adversos de una sustancia sobre el cáncer o el desarrollo de cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado de entre grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de interés, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y el cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, y (c) examinar la muestra de interés en cuanto a si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicha muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, en el que la muestra de interés se expuso de manera diferente a dicha sustancia que una o más referencias o muestras de referencia,

(v) un método para identificar a un paciente que responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se ha especificado en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación aumentado de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y la ausencia o disminución de la cantidad de al menos un marcador de miARN indica una respuesta al tratamiento,

(vi) un método para identificar a un paciente como alguien que no responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR- 409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de el al menos un marcador de metilación, y la presencia o mayor cantidad de al menos un marcador de miARN indica una falta de respuesta al tratamiento, y

(vii) un método para tratar el cáncer, que comprende las etapas: (i) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra de un sujeto; (ii) iniciar el tratamiento de dicho paciente con un primer régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes o terapias contra el cáncer, (iii) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y la cantidad de al menos un miARN en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente de dicho sujeto; (iv) opcionalmente repetir las etapas (ii) y (iii) una o más veces; (v) continuar tratando al paciente con el primer régimen de tratamiento si hay un aumento sustancial del estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o ausencia disminuida de al menos un marcador de miARN, o (vi) modificar el tratamiento o terminar el tratamiento del paciente con el primer régimen de tratamiento y tratar al paciente en su lugar con un segundo régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes anticancerosos o terapias no comprendidas en el primer régimen de tratamiento si hay un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o presencia aumentada de al menos un marcador de miARN.

También se describen medios para detectar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente y la presencia, en particular la cantidad, de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, o el kit que comprende dichos medios, como se especificó en detalle anteriormente, para pronosticar y/o diagnosticar

. el riesgo de desarrollar cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa,

i. la presencia de cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa, y/o

ii. la progresión del cáncer, en particular BC, OvCa y/o PaCa.

Dichos medios y/o dicho kit se pueden utilizar en uno de los métodos especificados en detalle anteriormente. En particular, se pueden usar en un método seleccionado del grupo que consta de:

(i) un método para pronosticar y/o diagnosticar cáncer, preferiblemente BC, OvCa y/o PaCa, en un sujeto, que comprende (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, y (b) determinar la presencia, en particular la cantidad, de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, en un sujeto, en el que el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la presencia de al menos un miARN es indicativo del pronóstico y/o diagnóstico de dicho sujeto,

(ii) un método para determinar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de un sujeto, y opcionalmente determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una referencia para comparar con el estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, y (b) determinar la dosificación de un producto farmacéutico dependiendo del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés, opcionalmente dependiendo de la comparación del estado de metilación y/o nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN a en la muestra de interés y la referencia o muestra de referencia, (iii) un método para adaptar la dosis de un fármaco para la alteración del cáncer o la prevención o el tratamiento del cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado entre los grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, (c) examinar la muestra analizada para determinar si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicho muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, y (d) adaptar la dosis de un fármaco dependiendo de si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN en la muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia,

(iv) un método para determinar los efectos beneficiosos y/o adversos de una sustancia sobre el cáncer o el desarrollo de cáncer, que comprende las etapas de (a) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado de entre grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR- 376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una muestra de interés, (b) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y el cantidad de al menos un marcador de miARN en una o más referencias o muestras de referencia, y (c) examinar la muestra de interés en cuanto a si el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación y la cantidad de al menos un marcador de miARN presente en dicha muestra de interés es diferente del nivel en una o más referencias o muestras de referencia, en el que la muestra de interés fue expuesta de manera diferente a dicha sustancia que la una o más referencias o muestras de referencia.

(v) un método para identificar a un paciente que responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR-148b, como se ha especificado en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación aumentado de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y la ausencia o disminución de la cantidad de al menos un marcador de miARN indica una respuesta al tratamiento,

(vi) un método para identificar a un paciente como alguien que no responde a un tratamiento de cáncer, que comprende determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR- 409, miR-148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra y en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente a la primera muestra, en el que un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de el al menos un marcador de metilación, y la presencia o mayor cantidad de al menos un marcador de miARN indica una falta de respuesta al tratamiento, y

(vii) un método para tratar el cáncer, que comprende las etapas: (i) determinar el estado de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4, como se especificó en detalle anteriormente, y la cantidad de al menos un marcador de miARN seleccionado del grupo que consta de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409, miR- 148b, como se especificó en detalle anteriormente, en una primera muestra de un sujeto; (ii) iniciar el tratamiento de dicho paciente con un primer régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes o terapias contra el cáncer, (iii) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o el nivel de expresión de al menos un marcador de metilación, y la cantidad de al menos un miARN en una o más muestras adicionales tomadas posteriormente de dicho sujeto; (iv) opcionalmente repetir las etapas (ii) y (iii) una o más veces; (v) continuar tratando al paciente con el primer régimen de tratamiento si hay un aumento sustancial del estado de metilación de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión más bajo de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o ausencia disminuida de al menos un marcador de miARN, o (vi) modificar el tratamiento o terminar el tratamiento del paciente con el primer régimen de tratamiento y tratar al paciente en su lugar con un segundo régimen de tratamiento que comprende uno o más agentes anticancerosos o terapias no comprendidas en el primer régimen de tratamiento si hay un estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y/o un nivel de expresión aumentado de al menos un marcador de metilación, y una cantidad o presencia aumentada de al menos un marcador de miARN.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al dispositivo de identificación de BC, que comprende:

(a) una unidad de análisis que comprende

(i) uno o más medios para detectar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y

(ii) medios para detectar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b en una muestra de un sujeto; y

(b) una unidad de evaluación que comprende un procesador de datos que tiene incluido tangiblemente un algoritmo para realizar una comparación de la cantidad determinada por la unidad de análisis con una referencia y que es capaz de generar un archivo de salida que contiene un diagnóstico establecido con base en dicha comparación.

Los dispositivos particulares son aquellos que se pueden aplicar sin el conocimiento particular de un médico especializado, por ejemplo, tiras de prueba o dispositivos electrónicos que simplemente requieren cargar con una muestra. Los resultados se pueden presentar como salida de datos sin procesar de diagnóstico paramétrico, en particular, como cantidades absolutas o relativas. Debe entenderse que estos datos necesitarán interpretación del médico. Sin embargo, también se prevén dispositivos de sistema experto en los que la salida comprende datos brutos de diagnóstico procesados cuya interpretación no requiere un médico especializado. Otros dispositivos preferidos comprenden las unidades/dispositivos de análisis (por ejemplo, biosensores, matrices, soportes sólidos acoplados a ligandos que reconocen específicamente los miARN de la presente invención, dispositivos de resonancia de plasmón de superficie, espectrómetros de RMN, espectrómetros de masas, etc.) o unidades/dispositivos de evaluación.

Los aspectos y realizaciones de la presente invención también se detallan en las reivindicaciones adjuntas.

Los siguientes ejemplos simplemente ilustrarán la invención. No se interpretarán, en ningún caso, como una limitación del alcance de la invención.

Ejemplos

Población de estudio

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Heidelberg (Alemania). Todos los pacientes con cáncer y los controles sanos eran caucásicos. Todos los casos y controles reclutados dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio. El ADN genómico se aisló de sangre total periférica utilizando kits de aislamiento de ADN de Qiagen. Los leucocitos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después del aislamiento y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Se aislaron ADN y ARN de leucocitos usando el minikit AllPrep para ADN/RNA/proteína de Qiagen. La información detallada de las muestras se muestra en la Tabla 1. Por favor consulte los datos clínicos de los pacientes con cáncer de mama esporádico en la Tabla 5 y la Tabla 6.

Casos de BC y controles emparejados

Las muestras de sangre periférica de 270 pacientes con cáncer de mama familiar con índice de mutación negativa de BRCA1/2 (primera ronda de validación) fueron recolectadas por los centros del Consorcio Alemán para el Cáncer Hereditario de Mama y Ovario en Heidelberg y Colonia. Todos los casos de BC familiar se reclutaron de acuerdo con los criterios de antecedentes familiares. Se recolectaron muestras de sangre periférica de 350 pacientes esporádicos de BC (189 en la segunda ronda de validación y 161 en la tercera ronda de validación) en el momento del primer diagnóstico de BC antes de cualquier tratamiento y cirugía de BC en el Hospital Universitario de Heidelberg. Las características clínicas de los pacientes con cáncer de mama esporádico se definieron de acuerdo con el manual de estadificación del cáncer del American Joint Committee on Cancer (AJCC). Las muestras de sangre periférica de 459 controles femeninos sanos (251 en la primera ronda de validación y 189 en la segunda ronda de validación) fueron recolectadas de donantes de sangre por el Servicio de Sangre de la Cruz Roja Alemana de Baden-Württemberg-Hessen. Se recolectaron muestras de sangre periférica de 151 controles femeninos sanos (tercera ronda de validación) en el Hospital Universitario de Heidelberg. Todos los casos y controles de la tercera ronda de validación se procesaron de la misma forma en paralelo. Los leucocitos se aislaron de sangre periférica usando tampón de lisis de glóbulos rojos dentro de las cuatro horas posteriores a la extracción de sangre en e1Hospital Universitario de Heidelberg. Todos los leucocitos de casos y controles se procesaron en paralelo.

Casos de PaCa y controles emparejados

Se recogieron muestras de sangre periférica de 147 pacientes con PaCa esporádica (80 casos masculinos y 67 casos femeninos) de múltiples centros en Alemania. Los casos de PaCa fueron especialmente seleccionados con mayor porcentaje de casos en estadio temprano. El Servicio de Sangre de la Cruz Roja Alemana de Baden-Württemberg-Hessen recogió muestras de sangre periférica de 191 controles sanos (115 casos masculinos y 76 casos femeninos) de donantes de sangre.

Casos de OvCa y controles emparejados

Se recogieron muestras de sangre periférica de 84 pacientes con OvCa esporádicos en e1Hospital Universitario de Heidelberg. Los casos de OvCa se seleccionaron especialmente con un mayor porcentaje de casos en etapa temprana. Se recolectaron muestras de sangre periférica de 148 controles sanos en e1Hospital Universitario de Heidelberg.

Ejemplo 1: Análisis del marcador de metilación

Ensayo de metilación Infinium 27k y Ensayo de metilación Infinium 450k

En la ronda de descubrimiento, 500 ng de ADN genómico de cada muestra se trataron con el kit de metilación de ADN EZ-96 (Zymo Research) para la conversión con bisulfito y se sometió a un cribado de metilación en todo el genoma mediante Human Methylation27 BeadChip (Illumina) y el kit Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Steemers FJ, Chang W, Lee G, Barker DL, Shen R, Gunderson KL. Whole-genome genotyping with the single-base extension assay. Nat Methods 2006; 3: 31-3. Bork S, Pfister S, Witt H, et al. DNA methylation pattern changes upon long-term culture and aging of human mesenchymal stromal cells. Aging Cell 2009; 9: 54-63). Todas las muestras pasaron el control de calidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de metilación mediante espectrometría de masas Maldi-TOF

La espectrometría de masas MALDI-TOF (Sequenom) descrita por Breitling et al., (Breitling LP, Yang R, Korn B, Burwinkel B, Brenner H. Tobacco-smoking-related differential DNA methylation: 27K discovery and replication. Am J Hum Genet 2011; 88: 450-7) se utilizó en varias rondas de verificación. El ADN se convirtió con bisulfito mediante el kit Gold de metilación de ADN EZ-96 (Zymo Research) y se amplificó mediante cebadores específicos para bisulfito (Fig. 1). Los productos de PCR se trataron de acuerdo con el protocolo estándar del ensayo Sequenom EpiTyper y se dispensaron a un 384 SpectroCHIP mediante un nanodispensador. Los chips fueron leídos por un sistema de espectrómetro de masas Sequenom. Los datos se recopilaron con el software SpectroACQUIRE v3.3.1.3 y se visualizaron con el software MassArray EpiTyper v1.0. Se eligieron aleatoriamente muestras al 5% para el análisis de duplicación.

PCR cuantitativa en tiempo real para la expresión de ARN

Se transcribieron 100 ng de ARN total de cada muestra a ADNc mediante los reactivos de transcripción inversa TaqMan® (Applied Biosystems). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando un LightCycler480 (Roche) en combinación con ensayos de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems) para HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y el gen DYRK4 y el gen de mantenimiento HPRT1 como control endógeno. Los valores de los puntos de cruce se calcularon utilizando el método máximo de segunda derivada mediante el software básico LightCycler 480 (Roche). La expresión relativa de genes para cada muestra se calculó de acuerdo con el método de AACt por normalización a HPRT1. Todos los casos y controles se procesaron en paralelo.

Cebadores específicos de bisulfito para diferentes amplicones

Cebadores específicos para bisulfito para amplicones diferentes

Amplicones Cebadores Secuencias

S100P ^sentido aggaagagagGGAAGGTGGGTTTGAATTTAGTATT

_antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctCTATCCCTCTTACCTCTAAACCCCT aggaagagagTAAGTGGAATTTTGGTATTTTTGGA

SLC22A18 ^sentido

_antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctCACTCCAAACCTAAACTCACCTCTA ^sentido aggaagagagGGTTTTTTTAAAATTGGTTTTGGAT DYRK4 _antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAACCCCATTTTTATTCCCATAAT FUT7 ^sentido aggaagagagGAAGAGGAAGGGATTTAGTTTGAAG

_antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctACAAACCTTAACCTCCCAAAATACT ^sentido aggaagagagGTGGGGTTTTTGTAGTAGTTGAGA RPTOR _antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAATAACCCAAAACCAAACCCTAAC

MGRN1 ^{sentido aggaagagagTTTTGGGGTATAAGGGAAGTTTAAG}

_{antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCTAACCAACAAAAAACCTAAAAAA} RAPSN ^sentido aggaagagagGATTTTTAGTTGGTGAGAGGTTTGA

_antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAACCACTAAATTACCCAACCAAA ^sentido aggaagagagTTTTAAATTTAGTAGGGTGTGAGAGGA HYAL2 _antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctCTCATCCATATTATAAAAAACCCCC ^sentido aggaagagagTTTTTTTGGGGTGAGTTTTTTTAGT

HYAL2-310 _antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctCACCTAATCCTAAACCCATAACCTT HYAL2-325 ^sentido aggaagagagTTGTTTAGTTTTTGAGGTTTTTTGG

_antisentido cagtaatacgactcactatagggagaaggctATTACACTCCCTCCCTCTCCTAAC

Análisis estadístico

Los datos de la matriz Illumina 27K fueron procesados por el software Illumina BeadStudio con la configuración predeterminada. Se retiraron las sondas con valor P de detección > 0.01 y las muestras se normalizaron por cuantiles. La asociación de las sondas con el estado de casos/controles se evaluó mediante modelos de regresión beta con un enlace logístico y pruebas de Wald asociadas utilizando el paquete R betareg v2.2-3 30. Se utilizaron pruebas de razón de verosimilitud para comparar el modelo de caso/control con el modelo anidado para las diferencias de chip con el fin identificar posibles falsos positivos debido a la confusión por efectos de chip. Se realizaron múltiples ajustes de prueba con el método Benjamini-Hochberg controlando la tasa de falsos descubrimientos al nivel de 0.05. Todo el análisis se realizó con el software estadístico R v2.11.1.

Todos los análisis estadísticos de los datos de expresión génica se realizaron con el software SPSS Statistics 17.0. Las correlaciones se evaluaron mediante los coeficientes de correlación de intervalo de Spearman. Se utilizaron modelos de regresión logística y pruebas no paramétricas para las comparaciones entre dos y múltiples grupos. Los resultados de la regresión logística se ajustaron para los posibles efectos de confusión de la edad y los diferentes lotes de medición mediante la inclusión de covariables adicionales en los modelos de regresión logística. Se realizó un análisis de la curva de características de funcionamiento del receptor (ROC) para evaluar el poder discriminatorio de los niveles de metilación.

Ejemplo 2: Análisis del marcador de miARN

Procesamiento de sangre y aislamiento de miARN del plasma

Se recogieron muestras de sangre con EDTA de los casos y de los individuos de control y se procesaron para el plasma dentro de las 2 horas posteriores a la recolección. Para evitar la contaminación con células epiteliales de la punción cutánea inicial, el primer tubo de sangre recogido durante la flebotomía no se procesó para el plasma. La sangre se centrifugó a 1300 g durante 20 minutos a 10 °C. El sobrenadante (plasma) se transfirió a tubos de microcentrífuga seguido de una segunda etapa de centrifugación a alta velocidad a 15500 g durante 10 minutos a 10 °C para eliminar los residuos y fragmentos celulares. El plasma se dividió en alícuotas en viales criogénicos, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Se extrajo el ARN total (incluidos los miARN) de 400 pl de plasma. La desnaturalización y la separación de fases se llevaron a cabo utilizando TRIzol LS (Invitrogen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante, con una modificación menor: se añadieron 10 fmol de una mezcla de miR-39/miR-238 de C. elegans. La fase acuosa se transfirió a otro tubo, se añadieron 1.5 volúmenes de etanol absoluto y la mezcla se aplicó a columnas del kit miRNeasy Mini (Qiagen, Alemania). Después de lavar, los miARN se eluyeron en 30 pl de agua libre de RNasa.

Validación de candidatos a marcadores seleccionados

Las reacciones de transcripción inversa (RT) se realizaron usando el kit de transcripción inversa de miARN TaqMan (Applied Biosystems, Alemania) y cebadores de RT específicos de miARN para miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b (Applied Biosystems, Alemania). Se llevaron a cabo reacciones uniplex (cáncer de mama primario) o multiplex (cáncer de mama metastásico) en un volumen de 7.5 pl o 15 pl, respectivamente. Cada reacción comprendía tampón de RT 1x, dNTP 1 mM, cebadores RT específicos de miARN 0.3x, inhibidor de RNasa de 0.25 U, transcriptasa inversa multiscribe de 3.3 U y un volumen fijo de plantilla de miARN (2 o 1 pl, respectivamente).

Para muestras de tejido de cáncer de mama benigno y maligno, las reacciones se llevaron a cabo en 15 |jl y comprendieron lo siguiente: tampón de RT 1x, dNTP 1 mM, cebadores de RT específicos de miARN 0.6x y RNU6B, inhibidor de RNasa de 0.25 U, transcriptasa inversa multiscribe de 3.3 U y 5 ng de ARN. El análisis ciego de las muestras y una investigación aleatoria y simultánea de casos y controles en placas de reacción tenía como objetivo minimizar el sesgo y los efectos del lote durante la validación. La RT se llevó a cabo en un ciclador de PCR G-STORM GS2 (Alphametrix, Alemania) bajo las siguientes condiciones: 16 °C durante 30 min, 42 °C durante 30 min y 85 °C durante 5 min, seguido de un mantenimiento a 4 °C.

Las reacciones de PCR en tiempo real de TaqMan se realizaron por triplicado en reacciones reducidas que comprendían 2.5 jL de mezcla maestra de PCR universal TaqMan 2x sin AmpErase UNG (Applied Biosystems, Alemania), 0.25 jL mezcla de cebador/sonda específica de miARN 20x (Applied Biosystems, Alemania ) y 2.25 jL del producto de transcripción inversa (diluido 1: 4). La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un termociclador LightCycler 480 (Roche, Alemania) bajo las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, luego 50 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguido de un mantenimiento a 4 °C.

Los datos sin procesar de los estudios de validación en plasma sanguíneo se normalizaron a cel-miR-39 enriquecido como se describe en Kroh et al., (Kroh EM, Parkin RK, Mitchell PS, Tewari M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods 2010; 50: 298­ 301). Los valores de Ct sin procesar de las muestras de tejido mamario se normalizaron a RNU6B como se describe en el Boletín del usuario No. 2: Sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems).

Comparación de casos de cáncer con controles

Para evaluar el potencial de detección de cáncer de mama y cáncer de próstata, se construyeron curvas características de funcionamiento del receptor (ROC) y se calcularon las áreas bajo las curvas (AUC). Con base en las curvas de ROC con intervalos de confianza del 95%, se calcularon las especificidades más bajas a sensibilidades predefinidas (75% a 90%) para miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b. Sobre la base de las curvas de ROC, se calcularon las especificidades más bajas en sensibilidades predefinidas (75% a 90%) para el modelo más informativo y menos redundante de miARN como los límites inferiores de los intervalos de confianza del 95% (Tom Fawcett (2006) "An introduction to ROC analysis". Pattern Recognition Letters 27, 861-874. DOI: 10.1016/j.patrec.2005.10.010; usando el paquete R pROC v1.3.2).

Potencial diagnóstico de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b en plasma

Se realizó un análisis de la curva de ROC para evaluar el potencial diagnóstico de miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b para la detección del cáncer de mama y de próstata en plasma sanguíneo. El poder discriminatorio entre las muestras de tumor y de control está representado por las áreas bajo las curvas (AUC). Al investigar diferentes combinaciones de miR-148b, miR-376c, miR-409-3p y miR-801, encontramos que una curva de ROC combinada con los siete miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, m iR -127, miR-409 y miR-148b produjeron el panel de miARN más informativo y menos redundante con un AUC de 0.89.

Ejemplo 3: combinación de metilación y marcador de miARN

Preparación de la muestra

Se recogieron muestras de sangre periférica de 161 pacientes con BC esporádico (la tercera ronda de validación) en el momento del primer diagnóstico de BC antes de cualquier tratamiento y cirugía de BC en e1Hospital Universitario de Heidelberg. Las características clínicas de los pacientes con cáncer de mama esporádico se definieron de acuerdo con el manual de estadificación del cáncer del American Joint Committee on Cancer (AJCC). Se recolectaron muestras de sangre periférica de 151 controles femeninos sanos (tercera ronda de validación) en e1Hospital Universitario de Heidelberg. Todos los casos y controles de la tercera ronda de validación se procesaron de la misma forma en paralelo. El ADN de la sangre completa y el miARN del plasma se extrajeron de cada muestra.

Determinación del nivel de metilación del ADN y el nivel de miARN. Los niveles de metilación del ADN se determinaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (Sequenom) como se describe en el Ejemplo 1. Los niveles de miARN del plasma se determinaron mediante PCR en tiempo real como se describe en el Ejemplo 2.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos de los datos de expresión génica se realizaron mediante el software SPSS Statistics 17.0. Los resultados del conjunto de marcadores (combinación de metilación de ADN y marcadores de miARN) se generaron con el uso de un algoritmo de regresión logística. Se utilizaron modelos de regresión logística y pruebas no paramétricas para las comparaciones entre dos y múltiples grupos. Los resultados de la regresión logística se ajustaron para los posibles efectos de confusión de la edad y los diferentes lotes de medición mediante la inclusión de covariables adicionales en los modelos de regresión logística. Se realizó un análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) para evaluar el poder discriminatorio de los niveles de metilación.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar el cáncer de mama (BC) en un sujeto, que comprende

a) determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y

b) determinar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b, en un sujeto,

en el que el estado de metilación disminuido de al menos un marcador de metilación y la presencia de los miARN es indicativo del riesgo del sujeto de padecer BC.

2. El método de la reivindicación 1, en el que

a) se determina el estado de metilación del marcador de metilación RPTOR, MGRN1 y RAPSN, y opcionalmente HYAL2, y

b) se determina la presencia de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que

a) se determina el estado de metilación del marcador de metilación DYRK4, S100P, FUT7 y SLC22A18, y opcionalmente HYAL2, y

b) se determina la presencia de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que

a) se determina el estado de metilación del marcador de metilación MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P, DYRK4 y opcionalmente HYAL2, y

b) se determina la presencia de los marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b.

5. Uso de un kit para el diagnóstico de BC

que comprende

a) uno o más medios para detectar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y

b) medios para detectar la cantidad de marcadores de miARN miR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b.

6. Un dispositivo para identificar BC, que comprende:

(a) una unidad de análisis que comprende

(i) un agente de detección para determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación seleccionado del grupo que consta de HYAL2, MGRN1, RPTOR, SLC22A18, FUT7, RAPSN, S100P y DYRK4, y (ii) agentes de detección para determinar la presencia de miARN iR-652, miR-801, miR-376c, miR-376a, miR-127, miR-409 y miR-148b en una muestra de un sujeto; y

(b) una unidad de evaluación que comprende un procesador de datos que tiene incluido tangiblemente un algoritmo para realizar una comparación de la cantidad determinada por la unidad de análisis con una referencia y que es capaz de generar un archivo de salida que contiene un diagnóstico establecido basado en dicha comparación.