ES2893170T3 - Microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens DSM23964 (CTC1) y su uso para la producción de un alimento - Google Patents

Abstract

Un producto alimenticio que comprende un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens DSM23964 (CTC1) y su uso para la producción de un alimento

Campo de la invención

La presente invención se refiere a productos alimenticios que comprenden microorganismos. En particular, se proporcionan productos alimenticios que comprenden microorganismos específicos de la especie Bacteroides xylanisolvens. Además, la presente invención proporciona el uso de estos microorganismos en la fermentación.

Antecedentes de la invención

Los productos alimenticios que contienen bacterias como componente integral o coadyuvante de producción se conocen desde hace mucho tiempo en la técnica. En particular, los alimentos fermentados tales como, por ejemplo, el yogur, el queso, las salchichas crudas y las verduras que se fermentan con ácido, son un componente integral de nuestra nutrición. Se usan varios métodos para producir alimentos fermentados, en donde, por ejemplo, se usa la fermentación espontánea o se añaden específicamente los microorganismos a la materia prima alimentaria. Los métodos de fermentación actuales se basan en particular en la adición de cultivos iniciadores a la respectiva materia prima alimentaria (por ejemplo, leche para producir yogur o queso). Los cultivos iniciadores brindan varios beneficios al contrario de los procesos de producción tradicionales. Por un lado, se evitan pérdidas económicas como resultado de menos producciones defectuosas y del acortamiento de los procesos de producción. Además, las materias primas pueden normalmente reaccionar mejor. Como también se puede usar una mezcla de varios cultivos iniciadores, a menudo los resultados con respecto al sabor, la seguridad y la homogeneidad, son mejores. Se pueden producir productos que de cualquier otra manera no serían posibles sin una intervención específica en el proceso de producción.

Un objetivo fundamental para desarrollar y mejorar los procesos de fermentación conocidos es el desarrollo y selección de microorganismos adecuados para el proceso de fermentación debido a que estos influyen decisivamente en el proceso de fermentación. La actividad metabólica del microorganismo usado es determinante, por ejemplo, para el aroma, el grado de acidificación y/o el color del producto acabado. Además, los microorganismos tienen un gran potencial para el campo de la nutrición al afectar positivamente el estado de salud o el metabolismo. Un ejemplo conocido de alimentos fermentados que afectan positivamente la salud del consumidor son los alimentos probióticos. Un probiótico es una preparación de microorganismos viables que, cuando se consumen en cantidades suficientes, tienen una influencia promotora de la salud del consumidor. Las bacterias probióticas ácido lácticas se han usado durante más tiempo, aunque también se usan levaduras y otras especies.

La mayoría de las cepas probióticas que se usan en la actualidad pertenecen al género Lactobacillus o Bifidobacterium, con solo unos pocas pertenecientes a otros géneros como Enterococcus, Escherichia, o Streptococcus. La principal razón es que Lactobacillus y Bifidobacterium se encuentran comúnmente en alimentos fermentados y, por lo tanto, generalmente se reconocen como seguros para los humanos. Las propuestas para el uso de especies no tradicionales en humanos generalmente suscitan una mayor preocupación sobre sus posibles efectos adversos. Por lo tanto, las cepas probióticas actuales se seleccionan principalmente por su aceptación general, un proceso de selección que descarta cepas potenciales con propiedades para la salud mucho mejores.

Por ejemplo, microorganismos del género Bacteroides que representan entre el 20 % y hasta el 40 % de la microbiota del colon humano no se usan generalmente para la fermentación o como cepa probiótica. Esto es sorprendente ya que determinadas especies de Bacteroides se conocen por poseer muchas funciones que son beneficiosas para la salud humana. Los Bacteroides poseen actividades metabólicas únicas implicadas en la fermentación de carbohidratos, la utilización de sustancias nitrogenadas y la biotransformación de ácidos biliares y otros esteroides. Además, se ha demostrado que los Bacteroides contienen ciertos antígenos polisacáridos con efecto inmunomodulador y están fuertemente implicados en el desarrollo del sistema inmunológico del huésped y en el mantenimiento de su capacidad para combatir patógenos y enfermedades.

Microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens se describen en los documentos US 2011/0076356, CN101560488, Mirrande, C. y otros, (2010) Journal of Applied Microbiology 109: 451-460 y Chassard, C. y otros, (2008) International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58: 1008-1013.

Sin embargo, algunas cepas de Bacteroides pueden participar en el desarrollo de infecciones extraintestinales graves en condiciones especiales. Por lo tanto, algunas cepas se clasifican como patógenos oportunistas y pueden suscitar algunas preocupaciones de seguridad. Por ejemplo, los microorganismos Bacteroides ovatus no se clasifican en la categoría de seguridad más baja de microorganismos y, por tanto, tienen un riesgo patógeno latente.

En vista de esto, es un objeto de la presente invención productos alimenticios que comprenden microorganismos que cumplen altos estándares de seguridad y, por tanto, pueden usarse de manera segura para el consumo humano. En particular, un objeto se dirige a los alimentos probióticos.

Resumen de la invención

Los presentes inventores descubrieron que los microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens pueden usarse ventajosamente como aditivo alimentario o ingrediente alimentario en productos alimenticios, en particular en alimentos fermentados y alimentos probióticos. Los productos alimenticios que contienen microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens tienen una variedad de propiedades ventajosas que proporcionan dichos microorganismos, usados ya sea en una forma viable o no viable. En particular, estos microorganismos tienen una patogenicidad muy baja y, por tanto, son altamente seguros para el consumo humano y producen ácidos grasos de cadena corta favorables.

Bacteroides xylanisolvens es una nueva especie del género Bacteroides, que se describió por primera vez por Chassard y otros ("Bacteroides xylanisolvens sp. Nov., a xylan-degrading bacterium isolated from human faeces"; International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2008); 58, 1008-1013). Es una bacteria bacilo gramnegativa que degrada el xilano y que puede aislarse a partir de heces humanas y, por tanto, es un microorganismo comensal humano. Bacteroides xylanisolvens se depositó como DSM 18836 en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), InhoffenstralJe 7B, 38124 Braunschweig (DE) y está disponible públicamente en el mismo. Sin embargo, su uso en productos alimenticios aún no se conocía ni se sugería en la técnica.

Se pudo demostrar que los microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens no tienen patogenicidad y, por tanto, se pueden consumir sin un alto riesgo de causar efectos secundarios adversos, en particular cuando los consumen los humanos. Adicionalmente, debido a la baja patogenicidad, no existen restricciones serias para la fabricación, distribución y comercialización de microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens por las regulaciones legales, que por tanto se pueden cumplir con poco esfuerzo. En particular, los microorganismos Bacteroides xylanisolvens se clasifican como agentes biológicos del grupo de riesgo 1 de acuerdo con la Directiva Europea 2000/54/EC y la "Biostoffverordnung" alemana. El grupo de riesgo 1 es el más bajo de los cuatro grupos de riesgo y se refiere a agentes biológicos que es poco probable que causen enfermedades humanas. Muchos otros microorganismos, incluidos también los microorganismos de otras especies de Bacteroides, se clasifican en grupos de riesgo mayores (por ejemplo, Bacteroides ovatus es un agente biológico del grupo de riesgo 2).

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un producto alimenticio que comprende un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un producto alimenticio fermentado en donde se combina una materia prima alimentaria con un cultivo iniciador de la fermentación, que se caracteriza porque se añade un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1. Además, se proporciona un alimento fermentado obtenible mediante dicho método.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

Como se demuestra en los ejemplos, los microorganismos de acuerdo con la presente invención en particular no contienen material de ADN plasmídico, los factores de virulencia más importantes y la mayoría de las enzimas extracelulares y factores patógenos relevantes, y no se adhieren a las células epiteliales del colon humano. Además, los microorganismos de acuerdo con la presente invención no mostraron efectos adversos en los estudios toxicológicos en ratones y ningún efecto adverso de cualquier naturaleza en humanos que tomaron dosis diarias de hasta 8,5*1011 CTC1 durante tres semanas. Por tanto, los microorganismos de acuerdo con la presente invención cumplen un estándar de seguridad muy alto y se pueden consumir por humanos sin riesgo de efectos secundarios no deseados. Además, los microorganismos de acuerdo con la presente invención son sensibles preferentemente a diversos antibióticos y, por tanto, pueden eliminarse fácil y efectivamente, si es necesario.

Adicionalmente, se pudo demostrar que los microorganismos de acuerdo con la invención muestran una superficie celular estable y homogénea, en particular una expresión estable y homogénea de estructuras de carbohidratos superficiales que pueden usarse como marcador de la calidad del producto. Las características de la superficie y en particular sus estructuras de carbohidratos pueden usarse como marcador de homogeneidad de los cultivos de microorganismos que contienen el microorganismo de acuerdo con la presente invención, y/o pueden usarse como marcador de la cantidad de microorganismos en un cultivo, de acuerdo con la presente invención.

Además, los presentes inventores descubrieron que los microorganismos de acuerdo con la presente invención son capaces de producir ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que se producen como productos finales de la fermentación microbiana de carbohidratos pueden tener propiedades promotoras de la salud. Como ejemplo, se informó que el propionato tiene efectos potenciales para reducir el colesterol y efectos antilipogénicos. Además, puede estimular la saciedad y, junto con el acetato y el butirato, presentan un efecto anticancerígeno.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 para la producción de un producto alimenticio, en particular como un cultivo iniciador de la fermentación.

Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción y de las reivindicaciones que se adjuntan.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores descubrieron que los microorganismos de la especie Bacteroides xylanisolvens son adecuados para el uso en productos alimenticios, en particular para el consumo humano. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se dirige a un producto alimenticio que comprende un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

Un microorganismo de la especie Bacteroides xylanisolvens en particular se refiere a un microorganismo que pertenece al género Bacteroides y que tiene preferentemente una o más de las siguientes características:

a) en un ensayo de hibridación ADN-ADN, muestra una relación ADN-ADN de al menos 30 %, preferentemente al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %, con mayor preferencia de al menos 98 % o al menos 99 % con el Bacteroides xylanisolvens depositado como DSM 18836 o DSM 23964;

b) muestra un nivel de similitud en la secuencia del gen del ARNr 16S de al menos 95 %, preferentemente al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %, con mayor preferencia de al menos 99,5 % con el Bacteroides xylanisolvens depositado como DSM 18836 o DSM 23964;

c) tiene una o más de las siguientes características:

i) como el Bacteroides xylanisolvens depositado como DSM 18836, no es capaz de degradar el almidón;

ii) tiene la capacidad de usar y/o metabolizar manitol, en particular D-manitol, melecitosa y/o sorbitol, en particular D-sorbitol, y/o producir ácido a partir de glicerol;

iii) expresa una actividad glutamil ácido glutámico arilamidasa;

iv) no produce indol;

v) no muestra actividad catalasa;

d) tiene una o más de las siguientes características:

i) es un microorganismo anaerobio;

ii) no forma esporas;

iii) es inmóvil; y

iv) es gramnegativo.

Preferentemente, se cumplen al menos dos o al menos tres, y con mayor preferencia todos los criterios definidos anteriormente de a) a d).

El término "relación ADN-ADN" en particular se refiere al porcentaje de similitud del ADN genómico o completo de dos microorganismos medido mediante el ensayo de hibridación/renaturalización ADN-ADN de acuerdo con De Ley y otros, (1970) Eur. J. Biochem. 12, 133-142 o HulJ y otros, (1983) Syst. Appl. Microbiol. 4, 184-192. En particular, el ensayo de hibridación ADN-ADN lo realiza preferentemente el Servicio de Identificación DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania). En una modalidad, el ensayo de hibridación ADN-ADN se realiza como se describe en el Ejemplo 1.2, más abajo.

El término "similitud de la secuencia del gen del ARNr 16S" en particular se refiere al porcentaje de nucleótidos idénticos entre una región de la secuencia de ácido nucleico del gen del ARN ribosómico (ARNr) 16S de un primer microorganismo y la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico del gen del ARNr 16S de un segundo microorganismo. Preferentemente, la región comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos, con mayor preferencia al menos 200 nucleótidos consecutivos, al menos 300 nucleótidos consecutivos o al menos 400 nucleótidos consecutivos, con la máxima preferencia aproximadamente 480 nucleótidos consecutivos. En una modalidad, la región de la secuencia de ácido nucleico del gen del ARNr 16S está flanqueada por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1 y 2 o sus secuencias complementarias, respectivamente.

En modalidades preferidas, el microorganismo de la especie Bacteroides xylanisolvens expresa estable y/u homogéneamente al menos una estructura de carbohidratos superficial. Los microorganismos que expresan establemente una estructura de carbohidratos superficial en particular se refieren a un grupo de microorganismos en donde al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o aproximadamente el 100 % de los microorganismos expresan la estructura de carbohidratos superficial. Los microorganismos que expresan homogéneamente una estructura de carbohidratos superficial en particular se refieren a un grupo de microorganismos en donde al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o aproximadamente el 100 % de los microorganismos expresan la estructura de carbohidratos superficial a un nivel de expresión que difiere del nivel de expresión promedio en no más del 50 %, preferentemente no más del 40 %, no más del 30 %, no más del 25 %, no más del 20 %, no más del 15 % o no más del 10 %. Un microorganismo que expresa una estructura de carbohidratos superficial en particular se refiere a un microorganismo que comprende la estructura de carbohidratos superficial en una cantidad que es detectable mediante métodos adecuados como se conoce en la técnica.

El microorganismo Bacteroides xylanisolvens es capaz preferentemente de producir ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que se producen como productos finales de la fermentación microbiana de carbohidratos pueden tener propiedades promotoras de la salud. Como ejemplo, se informó que el propionato tiene efectos potenciales para reducir el colesterol y efectos antilipogénicos. Además puede estimular la saciedad y, junto con el acetato y el butirato, presentan un efecto anticancerígeno. En modalidades preferidas, el microorganismo es capaz de producir uno o más AGCC seleccionados del grupo que consiste en propionato, acetato, succinato, formiato y lactato. Preferentemente, es capaz de producir propionato y/o acetato. En modalidades preferidas, estos AGCc también están presentes en el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención que contiene el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1. En determinadas modalidades en donde el producto alimenticio de acuerdo con la invención comprende el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 en una forma viable, dicho microorganismo todavía es capaz de producir dichos AGCC dentro del cuerpo del consumidor después del consumo del producto alimenticio.

En modalidades preferidas, el microorganismo Bacteroides xylanisolvens es capaz de sobrevivir a las condiciones en, en particular el paso a través del estómago, y preferentemente también a las condiciones en, en particular el paso a través de al menos una parte del intestino de un ser humano después de la ingestión. En particular, sobrevivir a las condiciones en el estómago de un ser humano se refiere a la supervivencia en el jugo gástrico durante al menos 180 min de al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 85 % de los microorganismos Bacteroides xylanisolvens en una composición que comprende los microorganismos, en particular en el producto alimenticio. Además, sobrevivir a las condiciones en el intestino de un ser humano se refiere a la supervivencia en el jugo intestinal durante al menos 240 min de al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de los microorganismos Bacteroides xylanisolvens en una composición que comprende los microorganismos, en particular en el producto alimenticio.

En modalidades preferidas, el microorganismo Bacteroides xylanisolvens tiene una o más de las siguientes características de seguridad:

(i) es sensible a los antibióticos metronidazol, meropenem y/o clindamicina;

(ii) no contiene el plásmido RP4 (DSM 3876) y/o el plásmido pSC101 (DSM 6202);

(iii) no contiene los genes de p-lactamasa cfiA y/o cfxA;

(iv ) no contiene los factores de virulencia polisacárido A de Bacteroides fragilis y/o enterotoxina Bft de Bacteroides fragilis y/o "proteína de membrana externa dependiente de TonB" codificada por el gen ompW;

(v) no muestra ninguna actividad DNasa extracelular, actividad condroitinasa extracelular, actividad hialuronidasa extracelular y/o actividad neuraminidasa extracelular; y

(vi) no se adhiere a las células epiteliales del colon humano.

En una modalidad preferida, el microorganismo Bacteroides xylanisolvens es

a) CTC1, depositado el 1 de septiembre de 2010 con el número de acceso DSM 23964 de acuerdo con los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), InhoffenstralJe 7B, 38124 Braunschweig (DE) por Glycotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlín (DE), (Ds M 23964),

b) un microorganismo que deriva de CTC1 o

c) un homólogo de CTC1.

CTC1 (DSM 23964) pertenece a la especie Bacteroides xylanisolvens. Preferentemente, CTC1 es una bacteria estrictamente anaerobia, no formadora de esporas, inmóvil, gramnegativa, y con forma bacilar de 0,4-0,5 |jm de ancho y generalmente de 1-2 jm de longitud que crece en colonias en agar Wilkins-Chalgren, las cuales después de 18 h son de 2-3 mm de diámetro con una superficie circular, lechosa, elevada y convexa.

Un microorganismo que deriva de CTC1 y/o un homólogo de CTC1 preferentemente tiene una o más de las siguientes características:

a) pertenece a la especie de Bacteroides xylanisolvens como se define anteriormente;

b) en un ensayo de hibridación ADN-ADN, muestra una relación ADN-ADN de al menos 30 %, preferentemente al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %, con mayor preferencia de al menos 98 % o al menos 99 % con CTC1 depositado como DSM 23964;

c) muestra un nivel de similitud en la secuencia del gen del ARNr 16S de al menos 95 %, preferentemente al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %, con mayor preferencia de al menos 99,5 %, y con la máxima preferencia de aproximadamente el 100 % con CTC1 depositado como DSM 23964;

d) es capaz de producir ácidos grasos de cadena corta;

e) tiene una o más de las características de seguridad descritas anteriormente; y/o

f) sobrevive a las condiciones en el estómago y/o el intestino de un ser humano.

Preferentemente, se cumplen al menos dos, con mayor preferencia al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco, y con la máxima preferencia todos los criterios definidos anteriormente de a) a f).

El término "un microorganismo" como se usa en la presente descripción puede referirse a un solo organismo unicelular, así como también a numerosos organismos unicelulares individuales. Por ejemplo, el término "un microorganismo de la especie Bacteroides xylanisolvens" puede referirse a una sola célula bacteriana Bacteroides xylanisolvens de la especie Bacteroides xylanisolvens así como también a múltiples células bacterianas de la especie Bacteroides xylanisolvens. Los términos "un microorganismo de la especie Bacteroides xylanisolvens" y "un microorganismo Bacteroides xylanisolvens" se usan como sinónimos en la presente descripción. En general, el término "un microorganismo" se refiere a numerosas células. En particular, dicho término se refiere a al menos 103 células, preferentemente al menos 104 células, al menos 105 o al menos 106 células.

De acuerdo con la presente invención, el término "producto alimenticio" se refiere a cualquier producto comestible, en particular cualquier producto que pueda usarse para la nutrición de los humanos y/o animales, preferentemente para la nutrición humana. Los productos alimenticios pueden variar desde nutrientes aislados, suplementos dietéticos y dietas específicas hasta alimentos transgénicos, productos herbales y alimentos procesados tales como alimentos fermentados, cereales, sopas y bebidas. El término producto alimenticio en particular se refiere a cualquier nutriente, composición de nutrientes o formulación, que pueda ingerirse por vía oral por un humano o animal, tal como, pero sin limitarse a nutrientes, aditivos nutricionales, aditivos alimentarios, suplementos dietéticos, alimento clínico, alimento parenteral, alimento enteral, alimentos para uso dietético especial, alimentos de uso específico para la salud o alimentos funcionales que se pueden aplicar por vía oral en diferentes formas, tal como, pero sin limitarse a, cápsulas, tabletas, emulsiones, polvo, líquidos, así como también en forma de cualquier alimento o bebida o como parte de los mismos. En casos especiales, el producto alimenticio puede administrarse por vía parenteral (alimento parenteral). El producto alimenticio puede administrarse solo o mezclado con al menos otro ingrediente. El producto alimenticio solo o su mezcla con al menos otro ingrediente puede administrarse solo o mezclado con un alimento o bebida. El término producto alimenticio también significa cualquier alimento, en particular un alimento fermentado, bebida, cápsula, tableta, emulsión, polvo o líquido. En determinadas modalidades, el producto alimenticio proporciona beneficios generales para la salud. En particular, el producto alimenticio puede ser probiótico.

El producto alimenticio de acuerdo con la invención comprende preferentemente el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 en una cantidad o concentración que resulta en una dosis diaria de aproximadamente 106 a aproximadamente 1013 microorganismos para el consumidor. Preferentemente, la dosis diaria no excede de 2,8*1012 microorganismos, preferentemente 2,3*1012 microorganismos, y/o es de al menos 108 microorganismos, preferentemente de al menos 109 microorganismos. En particular, la dosis diaria está en el intervalo de aproximadamente 1010 a aproximadamente 1012 microorganismos. El producto alimenticio preferentemente tiene forma de dosis unitarias individuales, cada una de las cuales comprende una dosis diaria del microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 como se describió anteriormente.

El producto alimenticio de acuerdo con la invención puede contener el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 en una forma viable, no reproductiva, no viable o lisada. Preferentemente, dicho microorganismo se usa en una forma no patógena, no reproductiva, no viable o lisada.

En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método para la producción de alimento fermentado, en donde la materia prima alimentaria se combina con un cultivo iniciador de la fermentación, caracterizado porque se añade un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

"Alimentos fermentados" de acuerdo con la invención se refiere en particular a alimentos producidos o conservados por la acción de microorganismos. En particular, se incluyen los procesos de fermentación que implican el uso de bacterias. Una lista ilustrativa no limitativa de productos producibles mediante el método de acuerdo con la invención incluye productos lácteos fermentados tales como suero agrio, leche cuajada/leche agria, gelatina, queso crema, queso suave, queso cortado, queso duro, queso procesado, quark, queso de leche cuajada, queso cocido, kéfir, ymer, avran, melaza, yogur, yogur de frutas, suero dulce, suero de mantequilla, queso fresco, mozzarella, queso feta, suero en polvo, crema agria, crema fresca, mascarpone, smetana, crema agria, crema agria de mantequilla, mantequilla, aceite de mantequilla, mantequilla semigrasa, mantequilla ligeramente agria, salchichas crudas como, por ejemplo, salami o carne salada, cacao, café, masa agria y verduras agrias como, por ejemplo, chucrut. La materia prima alimentaria se selecciona de acuerdo con el producto alimenticio fermentado a producir.

En el método de acuerdo con la presente invención para producir alimentos fermentados, el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 puede usarse como cultivo iniciador, ya sea solo o en combinación con otro microorganismo adecuado para la fermentación. Además, el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 puede añadirse a la materia prima alimentaria, durante la fermentación o al alimento fermentado después de la fermentación. Si el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 no se usa como cultivo iniciador, el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 se añade preferentemente en una forma no reproductiva, no viable o lisada. Si el microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 se añade en una forma viable, pueden volverse incapaz de reproducirse en el alimento fermentado final. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la irradiación de los microorganismos o mediante calentamiento. Preferentemente, se mata el microorganismo.

El método de acuerdo con la presente invención para producir alimentos fermentados comprende preferentemente al menos una de las siguientes etapas del método:

- inocular la materia prima alimentaria con un cultivo iniciador que contiene opcionalmente un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1;

- añadir al menos un azúcar, preferentemente glucosa; e

- incubar la materia prima alimentaria que contiene el cultivo iniciador de la fermentación, preferentemente en condiciones anaerobias.

El alimento fermentado producido tiene preferentemente una o más de las características descritas anteriormente con respecto al producto alimenticio de acuerdo con la presente solicitud. Se hace referencia a la descripción anterior, características y modalidades del microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 y el producto alimenticio que lo comprende. El microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 se añade preferentemente en una cantidad de al menos 106 células por mililitro de materia prima, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 109 a aproximadamente 1010 células por mililitro de materia prima, con mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 7*109 células por mililitro de materia prima.

Además, la presente invención proporciona alimentos fermentados obtenibles mediante el método de acuerdo con la invención para producir alimentos fermentados.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1. El microorganismo de la cepa CTC1 tiene preferentemente una o más de las características descritas anteriormente con respecto al microorganismo de la especie

Bacteroides xylanisolvens.

En modalidades preferidas, el microorganismo de acuerdo con la invención tiene una o más de las siguientes características:

(i) como el Bacteroides xylanisolvens depositado como DSM 18836, no es capaz de degradar el almidón;

(ii) tiene la capacidad de usar y/o metabolizar manitol, en particular D-manitol, melecitosa y/o sorbitol, en particular D-sorbitol, y/o producir ácido a partir de glicerol;

(iii) expresa una actividad glutamil ácido glutámico arilamidasa;

(iv) no produce indol;

(v) no muestra actividad catalasa.

Además, el microorganismo de acuerdo con la invención es un microorganismo anaerobio gramnegativo que no forma esporas y es inmóvil. Preferentemente, es capaz de producir ácidos grasos de cadena corta, en particular como se describió anteriormente, y/o es capaz de sobrevivir a las condiciones en el estómago y opcionalmente en el intestino de un ser humano después de la ingestión, en particular como se describió anteriormente.

En modalidades preferidas, el microorganismo de acuerdo con la invención tiene una o más de las siguientes características de seguridad:

(i) es sensible a los antibióticos metronidazol, meropenem y/o clindamicina;

(ii) no contiene el plásmido RP4 (DSM 3876) y/o el plásmido pSC101 (DSM 6202);

(iii) no contiene los genes de p-lactamasa cfiA y/o cfxA;

(iv ) no contiene los factores de virulencia polisacárido A de Bacteroides fragilis y/o enterotoxina Bft de Bacteroides fragilis y/o "proteína de membrana externa dependiente de TonB" codificada por el gen ompW;

(v) no muestra ninguna actividad DNasa extracelular, actividad condroitinasa extracelular, actividad hialuronidasa extracelular y/o actividad neuraminidasa extracelular; y

(vi) no se adhiere a las células epiteliales del colon humano.

El microorganismo de acuerdo con la invención en particular es un microorganismo aislado que no está presente preferentemente en su medio natural. En particular, el microorganismo no está presente dentro del cuerpo humano, preferentemente no está presente dentro de un cuerpo humano o animal. De acuerdo con una modalidad, el microorganismo de acuerdo con la invención se aisló de una composición que comprende microorganismos que no pertenecen a la especie Bacteroides xylanisolvens. De acuerdo con una modalidad, el microorganismo de acuerdo con la presente invención está presente en, o se obtiene a partir de un cultivo que comprende al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, preferentemente al menos 95 %, 97 %, 99 %, con la máxima preferencia de aproximadamente el 100 % de los microorganismos de acuerdo con la presente invención.

Además, la presente invención proporciona una composición que comprende el microorganismo de acuerdo con la presente invención. Con respecto a las características del microorganismo de acuerdo con la presente invención, se hace referencia a la descripción anterior. Preferentemente, el 80 % o más, con mayor preferencia el 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 98 % o más o el 99% o más, y con la máxima preferencia de aproximadamente el 100 % de los microorganismos en la composición son microorganismos de acuerdo con la invención. De acuerdo con una modalidad, el microorganismo en la composición está presente en una forma viable, no reproductiva, no viable o lisada. De acuerdo con una modalidad, dicha composición es un cultivo celular.

Preferentemente, la composición comprende al menos 103 microorganismos de acuerdo con la presente invención, con mayor preferencia al menos 104, al menos 105 o al menos 106 microorganismos de acuerdo con la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTCl para la producción de un producto alimenticio, en particular como un cultivo iniciador de la fermentación. Con respecto a las características del microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1, se hace referencia a la descripción anterior.

La expresión "comprende", como se usa en la presente descripción, además de su significado literal incluye, además, y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en". Por tanto, la expresión "comprende" se refiere a modalidades en donde el sujeto que "comprende" los elementos enumerados específicamente no comprende elementos adicionales así como también modalidades en donde el sujeto que "comprende" los elementos enumerados específicamente puede abarcar y/o verdaderamente abarca elementos adicionales. Igualmente, la expresión "tiene" debe entenderse como la expresión "comprende", que incluye, además, y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en".

Figuras

La Figura 1 muestra un análisis de restricción del microorganismo CTC1 de acuerdo con la invención y diferentes microorganismos de referencia. Los resultados respaldan que CTC1 es de la especie Bacteroides xylanisolvens.

La Figura 2 muestra la determinación de genes de plásmido y 13-lactamasa cfiA, cfxA y cepA. (A) Plásmido: Se aplicaron 20 |jg de cada ADN plasmídico aislado. Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb; 2, E. coli DSM 3876; 3, E. coli DSM 6202; 4, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964. (B) gen cfiA: Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb; 2, Bacteroides fragilis TAL 3636; 3, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 4, control negativo. (C) gen cfxA: Carriles: 1 y 6, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb; 2, Bacteroides ovatus MN7; 3, Bacteroides ovatus MN23; 4, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 5, control negativo. (D) gen cepA: Carriles: 1 y 6, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb; 2, Bacteroides fragilis DSM 1396; 3, Bacteroides ovatus MN23; 4, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; Carril 5, control negativo.

La Figura 3 muestra la determinación de genes que codifican virulencia bft, wcfR, wcfS, y ompW. (A) gen bft: Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb; 2, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 3, Bacteroides fragilis ATCC 43858; 4, control negativo. (B) gen wcfR: Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb; 2, Bacteroides fragilis DSM 1396; 3, Bacteroides fragilis ATCC 43858; 4, Bacteroides fragilis DSM 2151; 5, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 6, Bacteroides fragilis TAL 3636; 7, control negativo. (C) gen wcfS: Carriles: Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb; 2, Bacteroides fragilis DSM 1396; 3, Bacteroides fragilis ATCC 43858; 4, Bacteroides fragilis DSM 2151; 5, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 6, Bacteroides fragilis TAL 3636; 7, control negativo. (D) gen ompW: Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb; 2, Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; 3, Bacteroides caccae DSM 19024; 4, control negativo.

La Figura 4 muestra el análisis molecular de la unión de la cepa DSM 23964 a células Caco-2. (A) GAPDH y sacarasa isomaltasa. Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb (Bioline); 2, 1er día; 3, 3er día; 4, 6to día; 5, 8vo día; 6, 10mo día; 7, 13er día; 8, 14to día, 9, control negativo. (B) Detección de la cepa DSM 23964 y Bacteroides fragilis DSM 1396. Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb; 2, cepa DSM 23964 después de la 1ra etapa de lavado; 3, cepa DSM 23964 después de la 6ta etapa de lavado; 4, cepa DSM 23964 células Caco-2; 5, Bacteroides fragilis DSM 1396 después de la 1ra etapa de lavado; 6, Bacteroides fragilis DSM 1396 después de la 6ta etapa de lavado; 7, Bacteroides fragilis DSM 1396 células Caco-2; 8, células Caco-2; 9, cepa DSM 23964; 10, Bacteroides fragilis DSM 1396; 11, control negativo. (C) Detección de Lactobacillus acidophilus. Carriles: 1, Lactobacillus acidophilus DSM 9126 después de la 1ra etapa de lavado; 2, Lactobacillus acidophilus DSM 9126 después de la 6ta etapa de lavado; 3, Lactobacillus acidophilus DSM 9126 células Caco-2; 4, células Caco-2; 5, Lactobacillus acidophilus DSM 9126; 6, control negativo; 7, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb.

La Figura 5 muestra el peso corporal y el consumo de alimentos de los ratones durante un estudio de toxicidad oral de 90 días. (A) Pesos corporales de los ratones machos Crl:NMRI. (B) Pesos corporales de los ratones hembras Crl:NMRI. (C) Consumo de alimentos de los ratones machos Crl:NMRI. (D) Consumo de alimentos de los ratones hembras Crl:NMRI. Valores medios por grupo: Grupo 1 (0), Grupo 2 (1x106), Grupo 3 (1x107), Grupo 4 (1x108) UFC de Bacteroides xylanisolvens DSM 23964 y Grupo 5 (1x1011) Bacteroides xylanisolvens DSM 23964 pasteurizado/animal/día. Significación estadística indicada por P < 0,01. Valores de acuerdo con la prueba de Dunnett.

La Figura 6 muestra la detección de contaminación en soluciones inyectadas, mediante PCR múltiple específica de especie. Carriles: 1, control positivo (Bacteroides xylanisolvens DSM 23964); 2, Solución 2 (1x109 Bacteroides fragilis r Ma 6791/ml); 3, Solución 3 (1x109 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/ml); 4, Solución 4 (1,5x108 Bacteroides fragilis RMA 6791/ml); 5, Solución 5 (1,5x108 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/ml); 6, Solución 6 (5x106 Bacteroides fragilis r Ma 6791/ml); 7, Solución 7 (5x106 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/ml), 8, control positivo (Bacteroides fragilis RMA 6791); 9, Solución 1 (grupo de control). Controles de contaminación: Carril 10, mezcla de 90 % de Bacteroides fragilis RMA 6791 y 10 % Bacteroides xylanisolvens DSM 23964; Carril 11, mezcla de 10 % de Bacteroides fragilis RMA 6791 y 90 % de Bacteroides xylanisolvens DSM 23964. Carril 12, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb (Fermentas).

La Figura 9 muestra la PCR específica de especie del ADN aislado de abscesos perforados. (A) Detección de Bacteroides xylanisolvens en abscesos de animales, a los que se inyectó Bacteroides xylanisolvens DSM 23964. Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb (Fermentas); 2-3, Grupo 3 (4,6x109 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/kg de peso corporal); 4-5, Grupo 5 (6,9x108 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/kg de peso corporal); 6-7, Grupo 7 (2,3x107 Bacteroides xylanisolvens DSM 23964/kg de peso corporal); 8, control positivo (Bacteroides xylanisolvens DSM 23964); 9, control negativo (agua). (B) Detección de Bacteroides fragilis en abscesos de animales, a los que se inyectó Bacteroides fragilis RMA 6791. Carriles: 1, marcador de peso molecular de ADN de 100 pb (Fermentas); 2-3, Grupo 2 (4,6x109 Bacteroides fragilis RMA6791/kg de peso corporal); 4-5, Grupo 4 (6,9x108 Bacteroides fragilis RMA6791/kg de peso corporal); 6-7, Grupo 6 (2,3x107 Bacteroides fragilis RMA6791/kg de peso corporal), 8, control positivo (Bacteroides fragilis RMA 6791); 9, control negativo (agua); 10, marcador de peso molecular de ADN de 1kb (Fermentas).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: El microorganismo de acuerdo con la invención es una cepa distinta perteneciente a la especie Bacteroides xylanisolvens

1.1 Análisis taxonómico 1: Similitud de secuencias del ARNr 16S

La secuencia del gen del ARNr 16S (480 bases) de la cepa CTC1 se amplificó mediante PCR mediante el uso de los cebadores universales 27f (5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1)) y 519r (5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEQ ID NO: 2)). Los productos de PCR se purificaron mediante el uso del kit de purificación de productos de p Cr High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianápolis, EE. UU.) y la concentración de ADN y el tamaño del producto se estimaron mediante el uso de un marcador de peso molecular de masa baja de ADN (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.). Los productos de PCR se secuenciaron mediante el uso un kit de secuenciación DYEnamicTM ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Bioscience) y un secuenciador capilar ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La identificación de vecinos filogenéticos se realizó inicialmente mediante los programas BLAST (Altschul y otros, 1997) y megaBLAST (Zhang y otros, 2000) contra la base de datos de cepas tipo con nombres procarióticos válidamente publicados (Chun y otros 2007). A continuación, se seleccionaron las 50 secuencias con las puntuaciones más altas para el cálculo de la similitud de secuencias por pares mediante el uso del algoritmo de alineamiento global, que se implementó en el servidor EzTaxon (http://www.eztaxon.org/; Chun y otros, 2007). El alineamiento múltiple de secuencias resultante se corrigió manualmente mediante el uso del programa MEGA versión 5 (Tamura, 2007) para eliminar los huecos del alineamiento y las bases ambiguas y se construyó un árbol filogenético de acuerdo con el método de unión de vecinos (Saitou & Nei, 1987) con el programa MEGA versión 5 (Tamura, 2007).

El análisis de la secuencia del ARNr 16S de la cepa CTC1 mostró que esta cepa se agrupó con Bacteroides xylanisolvens DSM 18836 (100 % de similitud de secuencia del ARNr 16S), con Bacteroides ovatus ATCC 8483 (97,5 %), con Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29148 (94,2 %) y con Bacteroides finegoldii DSM 17565 (92,2 %). Se reconoce generalmente que los valores de similitud >97 % en la divergencia de la secuencia del gen del ARNr 16S son significativos para la delimitación de especies (Stackebrandty Goebel, 1994). Sin embargo, Stackebrandt y Ebers (2006) recomendaron que este valor se puede aumentar a 98,7-99 % sin sacrificar la calidad y precisión de una descripción de "especie", y como una ayuda para los taxónomos.

1.2 Análisis taxonómico 2: Hibridación ADN-ADN del genoma completo

La hibridación ADN-ADN se considera el estándar de referencia en taxonomía. El genoma completo de la cepa CTC1 se sometió a hibridación con el genoma completo de Bacteroides xylanisolvens DSM 18836, Bacteroides ovatus DSM 1896, Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079 y Bacteroides finegoldii DSM 17565 (esos análisis se realizaron en y por el DMSZ (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares). Brevemente, se usaron 3 g de biomaterial de cada cepa a comparar para la preparación de ADN. Se analizó la pureza del ADN aislado y el ADN se fragmentó mediante el uso de una prensa francesa y se desnaturalizó a alta temperatura (100 °C, 10 min). El ADN se fragmenta preferentemente en fragmentos que tienen un tamaño de entre 200 y 600 kDa, y la fracción principal tiene aproximadamente 450+/-100 kDa. La renaturalización del ADN de cada cepa, así como también de una mezcla del ADN de ambas cepas en concentraciones iguales (las concentraciones finales de ADN en las muestras son esencialmente idénticas y preferentemente se encuentran entre aproximadamente 20 y 100 ^g/ml, en particular aproximadamente 30 ^g/ml) se midió espectrofotométricamente mediante el uso de la absorbancia a 260 nm. La renaturalización se inició mediante el enfriamiento rápido de la solución a una temperatura de 25 °C por debajo de la temperatura de fusión del ADN y las mediciones se realizaron durante 30 min. La relación del ADN se calculó a partir de las diferentes pendientes de las curvas de renaturalización del ADN de cada una de las cepas bacterianas individuales y de la mezcla de ADN de ambas cepas. En particular, las tasas de renaturalización v' se determinaron como disminución de la absorbancia/min (AA/t), y el grado de unión (D), es decir, la relación del ADN, se calculó de acuerdo con la fórmula proporcionada por De Ley y otros, (ver anteriormente):

en donde D es el grado de unión (%), v'm es la tasa de renaturalización de la mezcla, v'a es la tasa de renaturalización del ADN de la primera cepa, y v'B es la tasa de renaturalización del ADN de la segunda cepa.

Los resultados de la hibridación del genoma completo se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1

Cepa de referencia Relación del ADN con CTC1

Bacteroides xylanisolvens DSM 18836 98,65 %

Bacteroides ovatus DSM 1896 26,9 %

Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079 28,65 %

Bacteroides finegoldii DSM 17565 25,2 %

1.3 Análisis taxonómico 3: Caracterización microbiológica y bioquímica

La cepa DSM 23964 pudo identificarse como estrictamente anaerobia, no formadora de esporas, inmóvil y gramnegativa. Los bacilos cortos o células bacilares tenían un ancho de 0,4-0,5 pm y una longitud variable; generalmente en el intervalo de 1-2 pm. Las colonias que crecieron en agar Wilkins-Chalgren (Oxoid) después de 18 h tenían 2 - 3 mm de diámetro, con una superficie circular, lechosa, elevada y convexa. El análisis bioquímico inicial mostró una similitud del 91 % con la especie Bacteroides ovatus (Databank BioMérieux). Por el contrario de Bacteroides ovatus, la cepa DSM 23964 no pudo utilizar el almidón, producir indol y no mostró actividad catalasa. La identificación bioquímica de las bacterias aisladas y sus enzimas constitutivas y perfiles de utilización del sustrato se realizó mediante el uso de kits bioquímicos rápidos ID 32Ay API 20A (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados de los análisis quimiotaxonómicos de la cepa Bacteroides xylanisolvens CTC1, Bacteroides xylanisolvens DSM 18836, Bacteroides finegoldii DSM 17565, Bacteroides ovatus DSM 1896, Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079 y Bacteroides fragilis DSM 1396 se resumen en la Tabla 2. Ambas cepas Bacteroides xylanisolvens CTC1 y Bacteroides xylanisolvens DSM 18836 tenían perfiles bioquímicos idénticos. Bacteroides xylanisolvens CTC1 pudo diferenciarse de Bacteroides ovatus DSM 1896 mediante la utilización de glicerol, D-sorbitol, D-manitol y D-melecitosa. Además, Bacteroides xylanisolvens CTC1 mostró actividad glutamil ácido glutámico arilamidasa, en contraste con los resultados para Bacteroides ovatus DSM 1896. Por otra parte, Bacteroides ovatus DSM 1896 fue capaz de expresar la actividad leucina arilamidasa, mientras que Bacteroides xylanisolvens CTC1 no lo hizo. Por lo tanto, Bacteroides xylanisolvens CTC1 pudo diferenciarse de Bacteroides finegoldii DSM 17565, Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079 y Bacteroides fragilis DSM 1396 (Tabla 2). Por el contrario de los resultados de Bacteroides xylanisolvens CTC1 y Bacteroides xylanisolvens DSM 18836, Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079 mostró un gran número de resultados positivos en las pruebas de actividad enzimática.

Tabla 2

Característica bioquímica 1 2 3 4 5 6 Formación de indol - - - -Actividades enzimáticas

N-acetil-p-glucosaminidasa - Ácido glutámico descarboxilasa - a-fucosidasa - Producción de indol - - - Arginina arilamidasa - - - - -Fenilalanina arilamidasa - - - - Leucina arilamidasa - - - Tirosina arilamidasa - - - - Glicina arilamidasa - - - - -Histidina arilamidasa - - - - Glutamil ácido glutámico arilamidasa - Serina arilamidasa - - - - -Producción de ácido a partir de:

D-Manitol - - - -Salicina - -Hidrólisis de esculina -Glicerol - - - -D-Melecitosa - - - -D-Sorbitol - - -D-trehalosa - -Actividades catalasa - - Cepas: 1: Bacteroides xylanisolvens CTC1; 2: Bacteroides xylanisolvens DSM 18836; 3:

Bacteroides finegoldii DSM 17565; 4: Bacteroides ovatus DSM 1896; 5: Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079; 6: Bacteroides fragilis DSM 1396. Las características se puntúan como: '+': reacción positiva; '-': reacción negativa.

1.4 Patrón de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) y análisis de genotipos

Para probar si CTC1 es una cepa distinta perteneciente la especie Bacteroides xylanisolvens, se realizó un ensayo RAPD. Se usaron cuatro cebadores aleatorios diferentes en reacciones separadas (mediante el uso de solo un cebador en cada reacción) para la amplificación del ADN molde. La mezcla de reacción de PCR (50 j l ) contenía: Tampón Taq ((N H ^SO ⁴ 16 mM, Tris HCl 67 mM), MgCl²2,5 mM, 0,25 mM de cada dNTP, cebador 1 jM , 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq y 2 j l de ADN molde. El programa de PCR fue: 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de 95 °C durante 1 min, 50 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, y finalmente 72 °C durante 6 min. Los patrones de bandas para todos los cebadores se analizaron en geles de agarosa al 1 %. Por tanto, para cada molde de ADN, se obtuvieron cuatro patrones de bandas diferentes (uno para cada cebador).

CTC1 se sometió al análisis RAPD y los resultados se compararon con los de las bacterias de referencia de las especies Bacteroides xylanisolvens (DSM 18836), Baceroides finegoldii (DSM 17565) y Bacteroides ovatus (DSM 1896) (véase la Figura 1 para un cebador ilustrativo). Los resultados demuestran que CTC1 es una cepa distinta que no es idéntica a la conocida cepa Bacteroides xylanisolvens DSM 18836.

1.5 Resumen

Los resultados de la similitud de la secuencia del ARNr 16S, la hibridación ADN-ADN del genoma completo y la caracterización bioquímica demostraron que el microorganismo aislado CTC1 es de la especie Bacteroides xylanisolvens. Además, el análisis de RAPD mostró que CTC1 es una cepa específica y distinta perteneciente a la especie Bacteroides xylanisolvens, que es diferente de las cepas conocidas de Bacteroides xylanisolvens.

Ejemplo 2: Efecto del jugo gástrico y el jugo intestinal simulados

Para simular el paso a través del tracto gastrointestinal, las bacterias CTC1 se sometieron a la acción de jugos gástricos e intestinales simulados. La tasa de supervivencia para la cepa CTC1 en el jugo gástrico fue superior al 90 % después de 180 min y superior al 96 % después de 240 min de exposición al jugo intestinal.

Ejemplo 3: Análisis de factores de virulencia

3.1 Resistencia a antibióticos de CTC1

El análisis de la concentración mínima inhibitoria (MIC) de varios antibióticos reveló que la cepa Bacteroides xylanisolvens CTC1 fue resistente a fármacos p-lactámicos como la penicilina G, ampicilina y mezlocilina. Sin embargo, fue sensible a los agentes antibióticos habituales como metronidazol, meropenem y clindamicina y la adición del inhibidor de p-lactamasa restauró la sensibilidad a los fármacos p-lactámicos.

3.2 Detección de plásmidos en CTC1

Para investigar la posible presencia de plásmidos en la cepa CTC1, se aisló material de ADN plasmídico de CTC1 y de ambas cepas de control, E. coli DSM 3876 y E. coli DSM 6202, respectivamente, que contienen los plásmidos de bajo número de copias RP4 (60 kb) y pSC101 (9,4 kb). Las mediciones de la concentración de ADN plasmídico a 260 nm no revelaron presencia de ADN en la preparación de plásmido de CTC1. La corrida de las preparaciones de plásmido en un gel de agarosa confirmó el aislamiento de ambos plásmidos de bajo número de copias de las cepas de control y la ausencia de material plasmídico detectable en Bacteroides xylanisolvens CTC1 (Figura 2A).

3.3 Identificación de los genes de p-lactamasa cfxA, cepA y cfiA en el genoma de CTC1

Para caracterizar la actividad p-lactamasa de la cepa CTC1, se realizaron ensayos de PCR específicos para cada uno de los genes de p-lactamasa cfiA, cfxA y cepA conocidos para el género Bacteroides. Los resultados indican que la cepa CTC1 contiene exclusivamente el gen cepA (Figura 2B-D).

3.4 Genes que codifican factores de virulencia en el género Bacteroides

El polisacárido A (PS A) de Bacteroides fragilis y la enterotoxina Bft de Bacteroides fragilis son los factores de virulencia más importantes del género Bacteroides. Para investigar la presencia de la enterotoxina Bft, se realizó una PCR específica para el gen bft. En el caso del PS A, se diseñaron PCR específicas para los marcos abiertos de lectura altamente conservados upaY, upaZ, ubicados aguas arriba de los genes de biosíntesis del PS A, y para los genes más importantes wcfR que codifican una aminotransferasa y wcfS que codifica una glicosiltransferasa. Por el contrario de Bacteroides fragilis ATCC 43858, la cepa CTC1 no posee el gen bft. Además, los genes wcfR, wcfS y ambos marcos abiertos de lectura upaY y upaZ no se detectaron (Figura 3A-C).

Además, se analizó la presencia del gen ompW que codifica el factor de virulencia "proteína de membrana externa unida a Ton B", que puede estar implicada en el desarrollo de la EII. No se pudo detectar ningún gen codificador ompW en la cepa CTC1 (Figura 3D).

3.5 Determinación de enzimas extracelulares y factores patógenos de CTC1

Además de la neuraminidasa, se describió que varias cepas del género Bacteroides producen exoenzimas no deseadas, incluidas colagenasa, DNasa y algunas proteasas que pueden participar en los procesos de infección. Las actividades exoenzimáticas más relevantes se analizaron por medio de PCR (neuraminidasa) o ensayos enzimáticos. La cepa CTC1 no muestra actividades de DNasa, condroitinasa, hialuronidasa y neuraminidasa, y solo actividades phemolíticas y colagenasas débiles.

3.6 Adhesión de CTC1 a células Caco-2

Se cultivaron células Caco-2 y se indujo la diferenciación. Los resultados demuestran que el nivel de expresión de GAPDH fue constante durante la diferenciación, mientras que el nivel de sacarasa isomaltasa aumentó durante la diferenciación. La observación microscópica confirmó que las células Caco-2 estaban bien diferenciadas como monocapa después de 14 días. La unión de bacterias a células Caco-2 diferenciadas después de 3 horas de coincubación en condiciones anaerobias se analizó por medio de una PCR específica de especie realizada a los sobrenadantes de etapas sucesivas de lavado y finalmente a las células Caco-2 raspadas. Por el contrario de los controles positivos, las células CTC1, que, por supuesto pudieron detectarse en el sobrenadante de la primera etapa de lavado, ya no pudieron detectarse en los sobrenadantes posteriores o en las células Caco-2 raspadas, lo que indica que las células CTC1 no se adhieren a las células epiteliales del colon humano (Figura 4).

Ejemplo 4: Estudios toxicológicos

4.1 Ensayo de viabilidad

La viabilidad de Bacteroides xylanisolvens CTC1 (DSM 23964) después de la liofilización y rehidratación se analizó en varios experimentos independientes. La tasa de supervivencia más baja identificada, indicó una concentración mínima de 4x109 UFC/g de bacterias viables. Esta concentración se aceptó como la "concentración disponible".

4.2 Estudio de mutagenicidad in vitro (prueba de Ames)

Esta prueba se realizó para detectar cualquier efecto tóxico o mutágeno de CTC1 o sus productos de fermentación. Se emplearon cinco dosis de bacterias viables que oscilaban entre 0,28 y 28,5 mg de bacterias/placa o una dosis de 59 mg de bacterias pasteurizadas/placa en dos experimentos independientes, cada uno de los cuales se llevó a cabo con y sin activación metabólica. No se observaron signos de citotoxicidad ni aumento en el número de colonias revertidas en comparación con los recuentos del control para ninguna concentración de las 5 cepas de prueba con y sin activación metabólica, y también en ambos formatos de prueba, incorporación en placa y modo de preincubación, respectivamente.

4.3 Evaluación in vitro de la actividad clastogénica (ensayo de aberración cromosómica in vitro)

La concentración máxima de CTC1 que se empleó en el estudio fue de 2,8 mg de bacterias viables/ml de medio de cultivo y 5,9 mg de bacterias pasteurizadas/ml de medio de cultivo, que se consideraron como la concentración máxima razonable. En ausencia de activación metabólica, la incidencia media de aberraciones cromosómicas (excluidos los huecos) que se observó en el control negativo fue de 1,0 % o 0,5 % después de 4 y 24 horas de exposición, respectivamente. Ninguna de las concentraciones de CTC1, ya sea viable o pasteurizada, produjo un aumento estadísticamente significativo de células aberrantes después de 4 y 24 horas de exposición (0,5 % a 2,5 %). Por el contrario, el control positivo presentó un aumento del 10,5 % y del 17,5 % de células aberrantes después de 4 y 24 horas de exposición, respectivamente. En presencia de activación metabólica, la incidencia media de las aberraciones cromosómicas (excluidos los huecos) que se observó en el control negativo fue de 0,5 % después de 4 horas de exposición. Otra vez, ninguna de las concentraciones de CTC1, ya sea viable o pasteurizada, produjo un aumento estadísticamente significativo de células aberrantes, lo que dio como resultado 0,0 % y 1,5 % en dos experimentos independientes, respectivamente. El control positivo presentó un 13,5 % y 16,5 % de células aberrantes después de 4 horas en dos experimentos, respectivamente. Para todas las concentraciones de CTC1 probadas, no se observó poliploidía o endorreduplicación relacionada con el elemento en los experimentos con o sin activación metabólica. Además, confirmando los resultados precedentes, no se observaron signos de citotoxicidad en ninguna concentración probada de CTC1 en los experimentos con y sin activación metabólica.

4.4 Estudio de toxicidad oral de 90 días en ratones

El objetivo de este estudio fue determinar si la ingesta oral de CTC1 tendría algún efecto toxicológico. Se asignaron ratones Crl:NMRI (50 machos y 50 hembras) a 5 grupos de prueba (10 machos y 10 hembras por grupo) y se les administraron dosis diarias de bacterias por vía oral a través de una sonda durante 90 días. Se probó el efecto de 1x106 hasta 1x108 UFC o 1x1011 CTC1 pasteurizadas por animal por día. Los resultados se muestran en la Figura 5. Durante los 90 días de prueba no se observó mortalidad en ningún grupo tratado con CTC1 viable o pasteurizada, ni en el grupo de control. Ninguno de los ratones tratados o no tratados reveló ningún cambio en su comportamiento o apariencia externa. Además, la observación funcional no reveló ninguna influencia relacionada con el elemento de prueba: motilidad, consistencia de las heces y consumo de agua, así como también la ganancia de peso corporal y el consumo de alimentos no presentaron diferencias significativas a lo largo del período experimental entre los grupos

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un producto alimenticio que comprende un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

2. El producto alimenticio de acuerdo con la reivindicación 1, comprende el microorganismo en una cantidad o concentración que resulta en una dosis diaria de aproximadamente 106 a aproximadamente 1013 microorganismos para el consumidor.

3. El producto alimenticio de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende el microorganismo en una forma viable, no reproductiva, no viable o lisada.

4. El producto alimenticio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, seleccionado del grupo que consiste en alimentos fermentados, alimentos probióticos, alimentos funcionales, suplementos dietéticos y aditivos alimentarios.

5. Un método para producir alimentos fermentados, en donde la materia prima alimentaria se combina con un cultivo iniciador de la fermentación, caracterizado porque se añade un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, que tiene una o más de las siguientes características:

a) dicho microorganismo se usa como cultivo iniciador, ya sea solo o en combinación con otro cultivo iniciador; b) dicho microorganismo se añade al alimento fermentado durante o después de la fermentación; y/o c) dicho microorganismo se usa en una forma viable, no reproductiva, no viable o lisada;

d) dicho microorganismo se añade en una cantidad de al menos 106 células por mililitro de materia prima, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 109 a 1010 células por mililitro de materia prima.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, que comprende al menos una de las siguientes etapas del método:

- inocular la materia prima alimentaria con un cultivo iniciador que contiene opcionalmente un microorganismo de la cepa DSM 23964;

- añadir al menos un azúcar, preferentemente glucosa; e

- incubar la materia prima alimentaria que contiene el cultivo iniciador de la fermentación, preferentemente en condiciones anaerobias.

8. Alimentos fermentados obtenibles mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1.

10. Una composición que comprende el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Uso de un microorganismo de la cepa DSM 23964 denominado CTC1 para la producción de un producto alimenticio, en particular como cultivo iniciador de la fermentación.