CN108531399B - 一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用 - Google Patents

一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用，属于微生物领域。本发明提供的培养基配制方便，成本低，培养基中含有万古霉素、卡那霉素、唯一碳源及产酸指示剂等物质，配合使用后，能利用该唯一碳源的Bacteroidesxylanisolvens单菌落会在固体培养基表面发生显色反应，以此达到提高菌群样品中较低丰度的Bacteroides xylanisolvens的分离效率。

Description

一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用，属于微生物领域。
背景技术
Bacteroides xylanisolvens从属于拟杆菌属、拟杆菌门，为革兰氏阴性严格厌氧菌，无质粒；对氧气及其敏感，只能在完全无氧的环境中生长良好。可代谢木聚糖等多糖，也可代谢半纤维素、木糖等小分子糖。
Bacteroides xylanisolvens是人体正常肠道菌之一，但丰度较低。B.xylanisolvens的碳水化合物利用系统显著地优于其他拟杆菌种，能够在不同的碳源环境下高质量地存活。并且B.xylanisolvens能够提高血清中针对Thomsen-Friedenreich抗原的特异性免疫球蛋白M抗体的含量，已有研究表明该抗体对癌症的形成具有积极地抑制作用。因此，B.xylanisolvens所具有的免疫调节作用及强大的环境适应力正是微生物学家寻找的新一代益生元、益生菌所必备的特性之一。
目前对于Bacteroides xylanisolvens调节宿主免疫应答作用的机制尚不明朗。并且，布氏绵羊血培养基作为已知的普通拟杆菌(Bacteroidales)有效筛选手段(《Infection and Immunity》,2011,5,2012-2020)，只能大概率能分离得到肠道内高丰度的拟杆菌种，而较难得到低丰度的B.xylanisolvens，因而限制了其深入的科学研究。因此，如何设计特异性培养基从而高效的分离B.xylanisolvens，为研究该菌与人体健康的关系提供技术支持是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种Bacteroides xylanisolvens特异性筛选培养基及其应用方法，培养基中含有万古霉素、卡那霉素、唯一碳源及产酸指示剂等物质。配合使用后，能利用该唯一碳源的B.xylanisolvens单菌落会在固体培养基表面发生显色反应，以此达到提高菌群样品中较低丰度的B.xylanisolvens的分离效率，为研究该菌与人体健康的关系提供技术支持。
本发明的第一个目的是提供了一种Bacteroides xylanisolvens特异性筛选培养基，所述培养基包括分离培养基和生长培养基，所述分离培养基中含有万古霉素、卡那霉素、唯一碳源及产酸指示剂等物质。
在本发明的一种实施方式中，所述唯一碳源为阿拉伯糖。
在本发明的一种实施方式中，所述产酸指示剂为溴甲酚紫。
在本发明的一种实施方式中，所述分离培养基包括如下组分：唯一碳源阿拉伯糖4-6g/L，胰蛋白胨15-25g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸氢二钾0.04-0.06g/L，磷酸二氢钾0.04-0.06g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K10.001-0.002g/L，产酸指示剂溴甲酚紫0.010-0.014g/L，卡那霉素硫酸盐溶液4-5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5ml/L，琼脂15-20g/L，余量为无菌水，pH值为6.8-7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K10.001-0.002g/L，余量为无菌水。
在本发明的一种实施方式中，所述唯一碳源为木聚糖。
在本发明的一种实施方式中，所述产酸指示剂为溴甲酚紫。
溴甲酚紫在不同pH值下颜色变化为5.2(黄色)-6.8(紫色)，B.xylanisolvens菌悬液pH在5.3-5.8左右，属于溴甲酚紫颜色变化范围内，可用于指示B.xylanisolvens的生长及产酸状态。
在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素硫酸盐溶液的浓度为15-25mg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述万古霉素盐酸盐溶液的浓度为2-4mg/ml。
本发明还提供一种配制所述用于特异性分离筛选Bacteroides xylanisolvens的培养基的方法。
所述分离培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，若培养基pH值低于6.8，则用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50-55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
所述生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并按配方比例称量其他所有组分，混合均匀，115-121℃下灭菌15-20分钟。
本发明的第二个目的是提供一种应用所述培养基分离筛选菌群中Bacteroidesxylanisolvens的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)涂布分离：菌群样品用无菌生理盐水梯度稀释后，取100μl涂布于上述分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(2)一级纯化培养：挑取培养基颜色变黄区域的单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(3)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(4)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24-48小时；
(5)菌种保存：将三级菌悬液与40％-50％的无菌甘油溶液均匀混合，使甘油终浓度为20％以上，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
(6)菌种鉴定。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中用于梯度稀释的生理盐水，其制备方法为：按比例称量氯化钠9g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，均匀溶解于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中所述的40％-50％的无菌甘油溶液，其制备方法为：按纯甘油与蒸馏水的体积比为1:1-1:1.5混合后，添加半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，115-121℃下灭菌15-20分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中菌种鉴定的方法为：
(6.1)将三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(6.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(6.3)PCR体系为：27F引物溶液1μl，1492R引物溶液1μl，2X Taq Mastermix Dye25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(6.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(6.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6.3)中所述的27F引物溶液及1492R引物溶液浓度均为10μM。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明提供了一种高效分离筛选Bacteroides xylanisolvens的培养基及其应用方法。该培养基添加了由卡那霉素及万古霉素按特定浓度配成的拟杆菌选择性抗生素，可有效抑制其他门类的杂菌生长；依据伯杰氏手册，肠道内绝大多数高丰度拟杆菌不能利用木聚糖，本发明以木聚糖作为唯一碳源能有效富集低丰度的B.xylanisolvens；同时培养基中还加入溴甲酚紫，在筛选培养过程中，由于B.xylanisolvens能利用唯一碳源而迅速产酸，在其菌落周围会由于pH值的降低使得培养基变黄色，不能利用碳源的拟杆菌产酸较慢导致培养基仍为原始的紫色。因此本培养基可以依据颜色改变的深浅及快慢，分别出不同糖代谢能力的菌株，鉴别过程简单易行，提高了分离效率。所加入的氯化血红素及维生素K1为拟杆菌所需的生长因子，半胱氨酸盐酸盐能有效降低培养基中的氧气含量，从而促进B.xylanisolvens的生长。
本发明提供的特异性筛选的培养基相比于常规拟杆菌选择性培养基，更有利于分离低丰度的目标菌，加强了与杂菌的差异，提高了Bacteroides xylanisolvens的分离效率，更加快速便捷地从菌群样品中分离得到B.xylanisolvens。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明的技术方案作进一步说明
实施案例1：Bacteroides xylanisolvens特异性筛选培养基中碳源的选择
根据伯杰氏手册指导，肠道内高丰度拟杆菌如单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)、多型拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)等不能或只能少量利用木聚糖、鼠李糖及甘露醇。因此，本实施案例将甄别能辅助特异性富集分离Bacteroidesxylanisolvens的碳源。
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides xylanisolvens的培养基，包括分离培养基和生长培养基。
其中：
本实施案例中分离培养基配方如下：单一碳源(木聚糖、鼠李糖或甘露醇)5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，溴甲酚紫0.012g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，琼脂20g，余量为无菌水，pH值为7.0。
本实施案例中生长培养基配方如下：脑心浸液液体培养基(青岛海博生物)，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
本实施案例中分离培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至7.0后，121℃下灭菌15分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀，即配得本发明的培养基。
本实施案例中生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并添加半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
分离筛选的具体步骤如下：
(1)涂布分离：从山东泰安取健康老人粪便，用无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的生理盐水(pH7.0)梯度稀释10-1-10-7后，每个稀释梯度取100μl分别涂布于三种含有不同碳源的分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(2)一级纯化培养：分别在分离培养基颜色变黄区域挑选菌落形态不同的单菌落，并分别在新的培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(3)二级纯化培养：分别挑取三种培养基上的一级培养单菌落，在新的培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(4)三级纯化培养：分别挑取三种培养基上的二级培养单菌落，接种于5-10ml生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24小时；
(5)菌种保存：取500μl三级菌悬液与500μl 40％无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的甘油溶液均匀混合，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
(6)菌种鉴定：
(6.1)取1ml三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用1ml无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(6.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(6.3)PCR体系为：10μM的27F引物溶液1μl，10μM的1492R引物溶液1μl，2X TaqMastermix Dye 25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(6.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(6.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。测序结果见下表1.
注：分离筛选的操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表1含不同碳源的培养基所筛选得到的菌种
Figure BDA0001626564350000061
本实施案例结果表明，从木聚糖分离培养基中挑取的12个菌落中含有B.xylanisolvens菌落2个(占比16.7％)，而从甘露醇及鼠李糖分离培养基并未分离得到该低丰度的B.xylanisolvens。因此，选用木聚糖为用于B.xylanisolvens特异性筛选培养基的单一碳源。
实施案例2：特异性筛选培养基针对拟杆菌混合体系I中Bacteroidesxylanisolvens分离效率的验证
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides xylanisolvens的培养基，包括分离培养基和生长培养基。
其中：
分离培养基配方如下：木聚糖5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，溴甲酚紫0.012g/L，氯化血红素0.01g，维生素K10.002g，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，琼脂20g/L，余量为无菌水，pH值为6.8。
生长培养基配方如下：脑心浸液液体培养基(青岛海博生物)，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
分离培养基与生长培养基按如下步骤配制：与实施案例1相同。
为验证上述特异性筛选培养基针对Bacteroides xylanisolvens的分离效率，本实施案例中采用的对照培养基，包括分离培养基和生长培养基。
其中：
分离培养基按如下步骤配制：
(1)按脑心浸液培养基产品配方要求称量，加蒸馏水溶解，加入半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，琼脂20g，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按特异性筛选方法的分离培养基中相同浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀，即配得本实施案例对照筛选的分离培养基。
对照筛选的生长培养基配制方法与特异性筛选相同。
样品制备：本实施案例采用的样品为拟杆菌混合液I，将表2中所述拟杆菌菌悬液培养至稳定前期后，按表2中的比例混合。分离筛选操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表2拟杆菌混合液I的组成
菌种名 菌落数/cfu 占比％
Bacteroides uniformis 4×10<sup>8</sup> 14.81
Bacteroides caccae 3×10<sup>8</sup> 11.11
Bacteroides thetaiotaomicron 4×10<sup>8</sup> 14.81
Parabacteroides distasonis 4×10<sup>8</sup> 14.81
Bacteroides ovatus 2×10<sup>8</sup> 7.41
Bacteroides eggerthii 1×10<sup>8</sup> 3.70
Bacteroides xylanisolvens 1×10<sup>8</sup> 3.70
Prevotella copri 2×10<sup>8</sup> 7.41
Bacteroides fragilis 2×10<sup>8</sup> 7.41
Bacteroides cellulosilyticus 2×10<sup>8</sup> 7.41
Odoribacter splanchnicus 1×10<sup>8</sup> 3.70
Bacteroides salyersiae 1×10<sup>8</sup> 3.70
总计 2.7×10<sup>9</sup> 100.00
分离筛选后，16s测序结果如表3所示。
表3特异性筛选培养基和对照培养基对Bacteroides xylanisolvens筛选的结果
Figure BDA0001626564350000081
本实施案例结果表明，采用对照培养基未筛得B.xylanisolvens菌落，而从特异性筛选培养基中挑取的11个菌落中含有B.xylanisolvens菌落1个(占比9.09％)，相比于对照培养基的针对B.xylanisolvens的分离效率有所提高。
实施案例3：特异性筛选培养基针对拟杆菌混合体系II中Bacteroidesxylanisolvens分离效率的验证
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides xylanisolvens的培养基，包括分离培养基和生长培养基。其中：
分离培养基配方如下：木聚糖5g，胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.05g/L磷酸二氢钾0.05g，半胱氨酸盐酸盐1g，溴甲酚紫0.012g，氯化血红素0.01g，维生素K10.002g，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，琼脂20g，余量为无菌水，pH值为6.9。
生长培养基配方如下：脑心浸液液体培养基(青岛海博生物)，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
为验证上述特异性筛选培养基针对Bacteroides xylanisolvens的分离效率，本实施案例中采用的对照培养基，包括分离培养基和生长培养基。上述特异性筛选培养基及对照培养基的配置与分离筛选步骤与实施案例2相同。
样品制备：本实施案例采用的样品为拟杆菌混合液II，将表4中所述拟杆菌菌悬液培养至稳定前期后，按表4中的比例混合。分离筛选操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表4拟杆菌混合液II的组成
菌种名 菌落数/cfu 占比％
Bacteroides uniformis 4×10<sup>8</sup> 15.38
Bacteroides thetaiotaomicron 4×10<sup>8</sup> 15.38
Parabacteroides distasonis 4×10<sup>8</sup> 15.38
Parabacteroides merdae 3×10<sup>8</sup> 11.54
Bacteroides ovatus 1×10<sup>8</sup> 3.85
Bacteroides eggerthii 1×10<sup>8</sup> 3.85
Bacteroides xylanisolvens 1×10<sup>8</sup> 3.85
Prevotella copri 2×10<sup>8</sup> 7.69
Bacteroides fragilis 1×10<sup>8</sup> 3.85
Bacteroides cellulosilyticus 2×10<sup>8</sup> 7.69
Bacteroides dorei 2×10<sup>8</sup> 7.69
Bacteroides salyersiae 1×10<sup>8</sup> 3.85
总计 2.6×10<sup>9</sup> 100.00
分离筛选后，16s测序结果如表5所示。
表5特异性筛选培养基和对照培养基对Bacteroides xylanisolvens筛选的结果
Figure BDA0001626564350000091
本实施案例结果表明，采用对照培养基未筛得B.xylanisolvens菌落，而从特异性筛选培养基中挑取的11个菌落中含有B.xylanisolvens菌落1个(占比9.09％)，相比于对照培养基的针对B.xylanisolvens的分离效率有所提高。
实施案例1-3，仅是本发明的较佳实施案例，并非是对本发明所作的其他形式的限定。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示或改性为同等变化的等效实施案例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施案例所做出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种分离筛选菌群中Bacteroides xylanisolvens的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
(1)涂布分离：菌群样品用无菌生理盐水梯度稀释后，取100μL涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(2)一级纯化培养：挑取培养基颜色变黄区域的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(3)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(4)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10mL生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24-48小时；
(5)菌种保存：将三级菌悬液与40％-50％的无菌甘油溶液均匀混合，使甘油终浓度为20％以上，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用；
(6)菌种鉴定；
所述分离培养基包括如下组分：唯一碳源木聚糖4-6g/L，胰蛋白胨15-25g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸氢二钾0.04-0.06g/L，磷酸二氢钾0.04-0.06g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，产酸指示剂溴甲酚紫0.010-0.014g/L，浓度为15-25mg/mL的卡那霉素硫酸盐溶液4-5mL/L，浓度为2-4mg/mL的万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5mL/L，琼脂15-20g/L，余量为无菌水，pH值为6.8-7.0；
所述生长培养基包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，余量为无菌水。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中用于梯度稀释的生理盐水，其制备方法为：按比例称量氯化钠9g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，均匀溶解于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述的40％-50％的无菌甘油溶液，其制备方法为：按纯甘油与蒸馏水的体积比为1:1-1:1.5混合后，添加半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，115-121℃下灭菌15-20分钟。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(6)中菌种鉴定的方法为：
(6.1)将三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(6.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(6.3)PCR体系为：27F引物溶液1μL，1492R引物溶液1μL，2X Taq Mastermix Dye 25μL，无菌水22.5μL及模板0.5μL；
(6.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(6.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。
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