ES2887273T3 - Anticuerpos anti-CD123 y conjugados y derivados de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende: (i) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (ii) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 72; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 71; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o (iii) a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 70; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD123 y conjugados y derivados de los mismos
Campo de la invención
La presente invención generalmente se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos de los mismos, polipéptidos e inmunoconjugados que se unen al antígeno CD123 (la cadena a del receptor de interleucina-3, o IL-3Ra). La presente invención también se refiere a métodos para utilizar dichas moléculas de unión a CD123 para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades, tales como neoplasias malignas de linfocitos B.
Antecedentes de la invención
El CD123 (receptor de interleucina 3 alfa, IL-3Ra) es una molécula de 40 kDa que forma parte del complejo de receptor de interleucina 3 (IL-3R). La citocina interleucina 3 (IL-3) marca la diferenciación temprana de células madres multipotentes en progenitores eritroides, mieloides y linfoides. CD123 se expresa en progenitores comprometidos con CD34 , pero no en células madre hematopoyéticas normales (HSC) CD34 /CD38- . El CD123 es expresado por basófilos, mastocitos, células dendríticas plasmacitoides, expresado en cierta medida por monocitos, macrófagos y eosinófilos, y poco expresado o no expresado por neutrófilos y megacariocitos. Algunos tejidos no hematopoyéticos, tales como placenta, células de Leydig de los testículos, ciertos elementos de células cerebrales y algunas células endoteliales, también expresan CD123. Sin embargo, la expresión es mayormente citoplasmática.
Se ha informado que CD123 es expresado por blastocitos leucémicos (blastocitos de leucemia) y células madre de leucemia (LSC) (Jordan et al., Leukemia 14:1777-1784, 2000; Jin et al., Blood 113:6603-6610, 2009). En poblaciones de precursores normales humanos, CD123 es expresado por un subconjunto de células progenitoras hematopoyéticas (HPC), pero no lo hacen las HPC normales. También se informa que las células dendríticas plasmacitoides (pDC) y los basófilos expresan CD123, y que también lo hacen monocitos y eosinófilos en menor medida.
Se ha informado la sobreexpresión de CD123 células malignas en un amplio intervalo de neoplasias malignas hematológicas que incluyen leucemia mieloide aguda (LMA) y síndrome mielodisplásico (SMD) (Muñoz et al., Haematologica 86(12): 1261-1269, 2001). La sobreexpresión de CD123 se asocia con pronósticos pobres en LMA (Tettamanti et al., Br. J. Haematol. 161: 389-401, 2013). Se cree que la LMA y MDS surgen y se perpetúan en una pequeña población de células madre leucémicas (LSC), que generalmente están inactivas (es decir, células que no se dividen rápidamente) y, por lo tanto, resisten la muerte celular (apoptosis) y los agentes quimioterapéuticos convencionales. Las LSC se caracterizan por una sobreexpresión de CD123, mientras que CD123 no está presente en la correspondiente población de células madre hematopoyéticas normales en la médula ósea humana normal (Jin et al., Blood 113: 6603-6610, 2009; Jordan et al., Leukemia 14: 1777-1784, 2000). La expresión de CD123 también está asociada con muchas otras neoplasias/pre-neoplasias: células progenitoras de leucemia mieloide crónica (LMC) (incluida LMC de crisis blástica); Células Reed Sternberg (RS) de Hodgkin; linfoma no Hodgkin transformado (NHL); algo de leucemia linfocítica crónica (CLL) (CD11c+); un subconjunto de leucemia linfoblástica T aguda (LLA-T) (16%, la mayoría inmaduras, en su mayoría adultos), neoplasias de células dendríticas plasmocitoides (pDC) (DC2) y neoplasias malignas de células de médula ósea CD34 /CD38' síndrome mielodisplásico (MDS).
La LMA es una enfermedad clonal que se caracteriza por la proliferación y la acumulación de células progenitoras mieloides transformadas en la médula ósea, lo que lleva a fallo hematopoyético. La incidencia de LMA aumenta con la edad y, típicamente los pacientes mayores tienen peores pronósticos de tratamiento que los pacientes más jóvenes (Robak et al., Clin. Ther. 2:2349-2370, 2009). Desafortunadamente, en la actualidad, la mayoría de los adultos que padecen de LMA mueren debido a su enfermedad.
El tratamiento para la LMA se concentra, inicialmente, en la inducción de la remisión (terapia de inducción). Una vez que se logra la remisión, el tratamiento varía para centrarse en asegurar tal remisión (terapia de consolidación o postremisión) y, en algunos casos, terapia de mantenimiento. El paradigma de inducción de remisión estándar para LMA es quimioterapia con combinación de antraciclina/citarabina, seguida de quimioterapia de consolidación, normalmente con dosis más elevadas de los mismos fármacos utilizados durante el período de inducción, o trasplante de células madre humanas, dependiendo de la capacidad del paciente para tolerar tratamiento intensivo y la probabilidad de cura únicamente con quimioterapia (véase Roboz, Curr. Opin. Oncol. 24: 711-719, 2012).
Los agentes frecuentemente utilizados en terapia de inducción incluyen citarabina y antraciclinas. La citarabina, también conocida como AraC, destruye las células cancerosas y otras células normales que se dividen rápidamente mediante la interferencia con la síntesis de ADN. Los efectos secundarios asociados al tratamiento con AraC incluyen resistencia reducida a infecciones como resultado de la producción reducida de leucocitos, sangrado como resultado de la producción reducida de plaquetas y anemia debido a la posible reducción de glóbulos rojos. Otros ejemplos secundarios incluyen náusea y vómitos. Las antraciclinas (p. ej., daunorrubicina, doxorrubicina e idarrubicina) tienen varios modos de acción que incluyen la inhibición de la síntesis de ADN y ARN, la alteración de las estructuras de orden superior del ADN y la producción de radicales de oxígeno libres que dañan las células. El efecto adverso más
importante de las antraciclinas es la cardiotoxicidad representa, lo que limita considerablemente la dosis administrada durante la vida y, en cierta medida, su utilidad.
Por lo tanto, desafortunadamente, a pesar del progreso importante en el tratamiento de LMA recientemente diagnosticado, del 20% al 40% de los pacientes no logra entrar en remisión con la quimioterapia de inducción estándar y se espera que del 50% al 70% de los pacientes que entran a una primera remisión completa, presenten recaídas en un plazo de 3 años. Aún no se tiene certeza cuál es la estrategia óptima al momento de la recaída, o para pacientes con la enfermedad resistente. El trasplante de células madre se ha establecido como la forma más eficaz de terapia antileucémica en pacientes con LMA en primera remisión o en remisiones posteriores (Roboz, 2012).
Los conjugados de fármaco y anticuerpo (ADC) y otros conjugados de fármaco y agente de unión a células emergen como una clase potente de agentes antitumorales eficaces para una variedad de cánceres. Los conjugados de agente de unión a células y fármaco (tales como los ADC) se componen comúnmente de tres elementos distintos: un agente de unión a células (p. ej., un anticuerpo); un enlazador; y un resto citotóxico. Convencionalmente, el resto de fármaco citotóxico se une covalentemente a los residuos de lisina en el anticuerpo o a residuos de cisteína obtenidos mediante la reducción de enlaces disulfuro entre cadenas, lo que resulta en ADC que son mezclas heterogéneas con cantidades diferentes de fármacos enlazados en posiciones diferentes en la molécula de anticuerpo.
En el documento WO 2015/044386 (Ablynx NV), se describen polipéptidos biespecíficos que comprenden un primer y un segundo dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), en donde el primer ISV se une a un primer diana en la superficie de una célula cancerosa con una afinidad baja y, cuando se une inhibe una función de dicha primera diana, y el segundo ISV se une a una segunda diana en la superficie de dicha célula con una afinidad alta y en donde dicha primera diana es diferente de dicha segunda diana. También se describen métodos para identificar y fabricar tales polipéptidos biespecíficos.
En el documento WO 2015/026892 (Macrogenics Inc) se describen diacuerpos monovalentes biespecíficos CD 123 x CD3 de secuencia optimizada, que son capaces de unirse simultáneamente a CD 123 y CD3. También se describen los usos de dichos diacuerpos en el tratamiento de neoplasias hematológicas.
X. Du, M. Ho e I. Pastan en J. Immunother., 2007, 30 (6), 607-613, informan sobre la síntesis de inmunotoxinas desarrolladas para dirigir selectivamente CD123. Los ARN totales se extraen de los hibridomas 26292, 32701 y 32716 anti-CD123 y se utilizan para producir fragmentos variables de cadena sencilla que después se fusionan con un fragmento de 38 Kd de la exotoxina Ade pseudomonas.
En el documento EP 2426148 (Kyowa Hakko Kirin Co), se describe un anticuerpo a la cadena IL-3RA humana, que no inhibe la IL-3 de señalización y se une al dominio B pero no lo hace se unen al dominio C de la cadena IL-3Ra humana. También se describe una composición para prevenir o tratar un tumor sanguíneo en la que se encuentra una célula que expresa IL-3Ra en la médula ósea o sangre periférica de un sujeto, que comprende el anticuerpo contra IL-3Ra humano como principio activo, así como un método para tratar un tumor sanguíneo en el que se encuentra una célula que expresa IL-3Ra en la médula ósea o sangre periférica, comprendiendo el método administrar, a un sujeto, una composición que comprende el anticuerpo IL-3Ra como principio activo.
En el documento WO 2012/021934(CSL Ltd), se describen aislados o anticuerpos recombinantes capaces de unirse específicamente a la interleuquina cadena IL-3Ra, y usos de los mismos. Los anticuerpos comprenden regiones variables de cadena ligera y variables de cadena pesada específicas.
En el documento WO 2008/127735 (Stemline Therapeutics Inc), se describen anticuerpos que se unen a la cadena subunidad IL-3Ra (113 Ra), y composiciones que comprenden tales anticuerpos. También se describen métodos para inhibir o reducir una población de células que expresan IL-3Ra, y comprenden poner en contacto una población de células que expresan IL-3Ra con los anticuerpos. También se describen conjugados que comprenden los anticuerpos enlazados a un agente citotóxico o agente anticelular y composiciones que comprenden tales conjugados, así como métodos para prevenir, tratar y/o manejar un trastorno asociado a células que expresan IL-3Ra, que comprenden administrar el anticuerpo.
Huang, L. en "Generation and Functional Assays of Acute Myeloid Leukemic Stem Cells Targeted Anti-CD123 Monoclonal Antibody", 2011, una tesis doctoral presentada a la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, describe la purificación e identificación de un dominio extracelular de IL3-Ra/proteína de fusión Fc como un inmunógeno.
Compendio de la invención
La presente invención se basa en la inesperada observación de que los conjugados de la presente invención son muy potentes contra varias células cancerosas que expresan CD123, particularmente, leucemia, con al menos un factor de prognosis negativa.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede (a) unir a un epítopo entre los aminoácidos 101 a 346 de antígeno CD123/IL3-Ra humano y (b) inhibir la proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas a antígenos.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a un epítopo entre los aminoácidos 101 a 204 del antígeno CD123 humano. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a un epítopo entre los aminoácidos 205 a 346 del antígeno CD123 humano.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede (a) unir a un epítopo entre los aminoácidos 1 a 100 del antígeno CD123 humano y (b) inhibir la proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas a antígeno con un valor de IC50 de 0,1 nM o menos (por ejemplo, 0,08 nM, 0,05 nM, 0,03 nM).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este inhibe la proliferación de células madre leucémicas o blastocitos de leucemia, pero no de células madre hematopoyéticas.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a células positivas a antígeno CD123 humano con una constante de disociación (Kd) de 0,3 nM o menor, tal como entre 0,01 nM y 0,3 nM, entre 0,01 nM y 0,2 nM, entre 0,01 nM y 0,19 nM, entre 0,01 nM y 0,18 nM, entre 0,01 nM y 0,15 nM, o entre 0,01 nM y 0,1 nM.
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une al CD123 de mono cynomolgus. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a CD123 de mono cynomolgus con un Kd entre 0,05 y 0,3 nM, entre 0,05 y 0,2 nM, entre 0,05 nM y 0,19 nM, entre 0,05 nM y 0,18 nM, entre 0,05 nM y 0,15 nM o entre 0,05 y 0,1 nM. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir tanto a CD123 humano como de mono cynomolgus con una afinidad de unión sustancialmente similar. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a CD123 humano y de mono cynomolgus con un Kd entre 0,05 y 0,3 nM, entre 0,05 y 0,2 nM, o entre 0,05 y 0,1 nM. La Kd se puede medir mediante citometría de flujo, resonancia de plasmón superficial, o radioinmunoensayo.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inhibir al menos 50% de proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas a antígeno a una concentración de 0,5 nM o menor.
En un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
(i) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 18;
(ii) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 72; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 71; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o
(iii) a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 70; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado con injerto de CDR que comprende regiones de CDR de ratón y en donde uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) residuos de la zona de Vernier de la región marco de cadena ligera y/o la cadena pesada de dicho anticuerpo son de origen de ratón.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo del extremo N de la SEQ ID NO: 34, es Phe. En otras realizaciones, Xaa es Val.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40;
y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41, excepto que el residuo N-terminal es Ser.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo N-terminal es Ser, y excepto que el residuo en una posición correspondiente a la misma posición Kabat del 5 al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys(es decir,Cys en la posición 442 de la numeración UE/OU); y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo en una posición correspondiente a la misma posición Kabat del 5 al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41, excepto que el residuo N-terminal es Ser.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56 y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37.
En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo del extremo N de las SEQ ID NOS: 38, 34, 56, y 54, es Phe. En otras realizaciones, Xaa es Val.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo en la posición correspondiente a la misma posición Kabat del 5 al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54 y b) una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35.
En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo del extremo N terminal de la SEQ ID NO: 54 o 56, es Phe. En ciertas realizaciones, Xaa es Val.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la s Eq ID NO: 1, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 o 3, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 16, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecido en SEQ ID NO: 18.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 o 10, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 11; y, b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida
en la SEQ ID NO: 19 o 20, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 13 o 14, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 15; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 23, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 25.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una secuencia Vh al menos 95% idéntica a una secuencia Vh de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (preferiblemente 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o, b) una secuencia Vl al menos 95% idéntica a una secuencia Vl de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (preferiblemente 27, 29, 31, 35 y 37). En ciertas realizaciones, la secuencia Vh es al menos un 99% idéntica a una de las SEC ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (preferiblemente 26, 28, 30, 32, 34 y 38), y/o donde la secuencia V Les al menos 99% idéntica a una de las SEQ ID n O: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (preferiblemente 27, 29, 31, 35 y 37). En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender: a) una secuencia Vh seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (preferiblemente 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o, b) una secuencia Vl seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (preferiblemente 27, 29, 31, 35 y 37). En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una secuencia Vh de SEQ ID NO: 26 y una secuencia Vl de SEQ ID NO: 27, o una secuencia Vh de SEQ ID NO: 28 y una secuencia Vl de SEQ ID NO: 29, o una secuencia Vh de SEQ ID NO: 30 y una secuencia Vl de SEQ ID NO: 31, o una secuencia Vh de SEQ ID NO: 34 y una secuencia Vl de SEQ NO: 35.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo murino, de mamífero no humano, quimérico, humanizado o humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo con injerto de CDR o un anticuerpo recubierto. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En ciertas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno del mismo es Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla o scFv, Fv con enlace disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2 , minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2 , (scFv)2 o scFv-Fc.
Un segundo aspecto de la invención proporciona un polipéptido que comprende las secuencias V h y Vl de cualquier anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno de este. El polipéptido puede ser una fusión con una proteína que no es una toxina pseudomona.
Un tercer aspecto de la invención proporciona una célula que produce el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención, que comprende: (a) cultivar la célula de la invención; y (b) aislar el anticuerpo, su fragmento de unión a antígeno o polipéptido de la célula cultivada. En ciertas realizaciones, la célula es una célula eucariota.
Un quinto aspecto de la invención proporciona un inmunoconjugado con la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido del mismo de la invención, que se enlaza covalentemente a través de un residuo lisina a CyL1;
W l es un número entero de 1 a 20; y
CyL1 se representa mediante la siguiente fórmula:,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X se encuentre ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es unalquilo (C1-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1');
o
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B3');
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
m es un número entero de 1 a 6; y
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En ciertas realizaciones, Ra y Rbson ambos H; y R5 es H o Me.
En ciertas realizaciones, P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, se puede seleccionar P Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En ciertas realizaciones, Q es -SO3 M.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
Ċ 
5
Ċ 
5
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, en donde W l es un número entero de 1 a 10, la línea doble - -entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando es un enlace doble, X se encuentra ausente e Y es -H y cuando es un enlace sencillo, X es -H e Y es -OH o -SO3M.
El quinto aspecto también proporciona un inmunoconjugado tiene la fórmula:
CBA - f — CyL2J
' ' wL
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido de este de la invención, enlazado en forma covalente a través de un residuo lisina a CyL2, W l es un número entero de 1 a 20; y
CyL2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X se encuentre ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
Rxi y x2r son independientemente alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O) n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En ciertas realizaciones, Re es H o Me; Rx1y Rx2 son independientemente -(CH2 )p- (CRfRg) -, en donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C4); y p es 0, 1,2 o 3.
En ciertas realizaciones, Rf y Rg son los mismos o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en los que WL es un número entero de 1 a 10;
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X se encuentre ausente e Y sea -H; y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M.
En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X se encuentra ausente e Y es -H. En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X es -H e Y es - S O 3 M . En ciertas realizaciones, M es H+, Na+ o K+.
En el quinto aspecto de la invención, también se proporciona un inmunoconjugado que tiene la fórmula:
CBA (CyL3)WL,
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido de la invención, que está enlazado covalentemente a CyL3 através de un residuo Lys;
W l es un número entero de 1 a 20;
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3 ); y
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En ciertas realizaciones, m' es 1, y R1y R2 son ambos H. En ciertas otras realizaciones, m' es 2, y R1y R2 son ambos Me.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde W l es un número entero de 1 a 10.
En ciertas realizaciones, M es H+,Na+ o K+.
En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un inmunoconjugado con la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o el polipéptido del mismo de la invención, enlazado covalentemente al grupo Jcb';
W s es 1, 2, 3 o 4;
Jcb' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina (en el que el resto 2-hidroxietilamina puede ser parte de una serina, treonina, hidroxilisina, 4-hidroxiornitio o 2,4-diamino-5- residuo de ácido hidroxi valérico) en el N-terminal de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polipéptido del mismo, y un grupo reactivo con aldehído en Cys1, y está representado por la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio unido covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys Cys1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X se encuentre ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos,
Zd1 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O),
R9 es -H o un alquilo (C1-C3);
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
r y r' son independientemente un entero de 1 a 6,
W' es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es unalquilo (C1-C6);
L es -NRg-(CRaRb)r" o está ausente; y
r" es un número entero de 0 a 6.
A efectos de simplificación, en cada caso en la que se indica Ser como el residuo del extremo N, se debe entender que se contempla otro resto 2-hidroxietilamina como parte de un residuo serina, treonina, hidroxilisina, 4-hidroxiornitina o ácido 2,4-diamino-5-hidroxivalérico cuando corresponda, especialmente respecto a la Thr.
En ciertas realizaciones, Ra y Rb son ambos H, y R5 y R9 son ambos H o Me.
En ciertas realizaciones, P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, se puede seleccionar P de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N91osil-Arg, Phe-N9_nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala. En ciertas realizaciones, Q es -SO3M.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en el que la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X se encuentre ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M.
En un sexto aspecto de la invención, proporciona un inmunoconjugado que tiene la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o el polipéptido del mismo de la invención, enlazado covalentemente al grupo Jcb',
Jcb' es un resto formado mediante la reacción de un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un extremo N de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polipéptido del mismo de la invención, o el polipéptido de este de la invención, y un grupo reactivo aldehído en Cys2, y se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys Cys2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X se encuentre ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
M es H+ o un catión.
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(Ci-C6);
W es -NRe',
Re 'es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6,
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
L1 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb',
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys2;
Za2 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O),
R9 es -H o un alquilo(C1-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable,
Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o alquilo (C1-C3); y
q1 y r1 son cada uno es independientemente un entero de 0 a 10, siempre que q1 y r1 no sean ambos 0. En ciertas realizaciones, -L1- se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es H o -SO3M.
En ciertas realizaciones, Re es H o Me; y Rx1 es -(CH2)p-(CRfRg)-, y Rx2 es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C4); y p es 0, 1, 2 o 3. En ciertas realizaciones, Rf y Rgson iguales o diferentes y se seleccionan entre -H y -Me.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en el que la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X se encuentre ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M.
En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H.
En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X es -H e Y es -SO3M .
En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un inmunoconjugado que tiene la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o el polipéptido del mismo de la invención, enlazado covalentemente al grupo Jcb';
Jcb' es un resto formado haciendo reaccionar un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un extremo N-terminal de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polipéptido del mismo, y un grupo reactivo aldehído en Cys3, y se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al cBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a c y s3; c y s3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3);
L1 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys3;
Za2 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
Rg es -H o un alquilo(Ci-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Rai, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o un alquilo (C1-C3); y
q1 y r1 son cada uno independientemente un entero de 0 a 10, siempre que q1 y r1 no sean ambos 0. En ciertas realizaciones, m' es 1 y R1 y R2 son ambos H. En ciertas realizaciones, m' es 2 y R1 y R2 son ambos Me. En ciertas realizaciones, -L1- se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde R es H o -SO3M y M es H+ o un catión.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde DM se representa mediante la siguiente fórmula:
En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un inmunoconjugado que tiene la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o el polipéptido del mismo de la invención, enlazado covalentemente al grupo Jcb',
Jcb' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un N-terminal de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, o el polipéptido del mismo, y un grupo reactivo aldehído en Cys4 y se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al cBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys4; c y s4 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -NMe- en Cys4;
Zb1 y Zb2 están ambos ausentes o uno de Zb1 y Zb2 está ausente y el otro es -CH2-O- o -O-CH2-;
Zb1' y Zb2' cada están ausentes, -CH2-O-, -O-CH2-, -NR9-C(=O)-CH2- o -CH2-C(=O)-NR9-;
R9 es H o alquilo (C1-C3);
n1 y m1 cada uno es independientemente un entero de 1 a 6;
uno de E1 y E2 es -C(=O)- y el otro es -NR9-, o uno de E1 y E2 es -C(=O)- o -NR9- y el otro está ausente; P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos, y
Rb1, Rb2 , Rb3, Rb4, Rb5 y Rb6, para cada aparición, son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3). En ciertas realizaciones, Rb1, Rb2 , Rb3, Rb4, Rb5 y Rb6 son todos H. En ciertas realizaciones, R9 es H.
En ciertas realizaciones, Zb1' y Zb2 ' se encuentran ausentes, o Zb1' es -CH2-O- y Zb2 ' se encuentra ausente, o Zb1' es -CH2-C(=O)-NR9- y Zb2 ' es -O CH2 o está ausente.
En ciertas realizaciones, P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, se puede seleccionar Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala y D-Ala-D-Ala.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
Ċ 
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la DM está representada por la siguiente fórmula estructural:
En un séptimo aspecto de la invención se proporciona un inmunoconjugado representado por la siguiente fórmula:
CBA-(— Cyc1)
' ywc
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido de este de la invención, enlazado covalentemente a CyC1 a través de un residuo cisteína; W c es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X se encuentre ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6); y,
Lc se representa mediante
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA, y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo C (=O) en CyC1, en donde:
R19 y R20, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
m” es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo (C1-C3).
En ciertas realizaciones, Ra y Rb son ambos H; y R5 es H o Me.
En ciertas realizaciones, P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, P se puede seleccionar Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9'tosil-Arg, Phe-N9'nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val
D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala. En ciertas realizaciones, Q es -SO3 M.
En ciertas realizaciones, R19 y R20 son H; y m” es un número entero de 1 a 6.
En ciertas realizaciones, -Lc- se representa mediante la siguiente fórmula:
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante:
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en el que la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M.
En el séptimo aspecto de la invención, también se proporciona un inmunoconjugado representado por la siguiente fórmula:
CBA (CyC2)Wc,
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido de este de la invención, enlazado covalentemente a CyC2 a través de un residuo de cisteína; WC es 1 o 2;
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X está ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe';
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
Lc' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC2; Z es C(=O)-NR9-, o -NR9-C(=O);
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
q y r, en cada caso, son independientemente un entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos,
En ciertas realizaciones, P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, P se puede seleccionar de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9'tosil-Arg, Phe-N9'nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En ciertas realizaciones, en el inmunoconjugado, -Lc'- se representa mediante la siguiente fórmula:
En ciertas realizaciones, Re es H o Me; Rx1 es -(CH2)p-(CRfRg) - y Rx2es -(CH2)p-(CRfRg) -, en donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o a alquilo (C1-C4); y p es 0, 1, 2 o 3. En ciertas realizaciones, Rf y Rg son iguales o diferentes y se seleccionan de -H y -Me.
En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en el que la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X está ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M.
En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H.
En ciertas realizaciones, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X es -H e Y es -SO3M. En ciertas realizaciones, M es H+, Na+ o K+.
En el séptimo aspecto de la invención, también se proporciona un inmunoconjugado que tiene la siguiente fórmula:
CBA (CyC3)WC,
en donde:
CBA es un anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, que comprende: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o el polipéptido de este de la invención, enlazado covalentemente a CyC3 a través de un residuo de cisteína; WC es 1 o 2;
CyC3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
Ri y R2 son cada uno independientemente -H o unalquilo (C1-C3);
Lc' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC3; Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9 , R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3); q y r, en cada caso, son independientemente un entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos.
En ciertas realizaciones, P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos. Por ejemplo, P' se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N91osil-Arg, Phe-N9_nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En ciertas realizaciones, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En ciertas realizaciones, -Lc'- se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde M es H+ o un catión.
En ciertas realizaciones, m' es 1 yR1yR2son ambos H. En ciertas realizaciones, m' es 2 y R1yR2son ambos Me. En ciertas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde DM es una fracción de fármaco representada por la siguiente fórmula:
Un octavo aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención, o el inmunoconjugado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un noveno aspecto de la invención proporciona un método in vitro o ex vivo para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD123, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención, o el inmunoconjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención.
En ciertas realizaciones, la célula es una célula tumoral. En ciertas realizaciones, la célula es una célula de leucemia o una célula de linfoma.
En un décimo aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o un polipéptido de la invención, o un inmunoconjugado de la invención, o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, en donde las células del cáncer expresan CD123. El método puede comprender administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención, o el inmunoconjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención.
En ciertas realizaciones, el cáncer o trastorno proliferativo celular es leucemia o linfoma. En ciertas realizaciones, el cáncer o trastorno proliferativo celular se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), lo que incluye leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLA-B), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas (HCL), síndrome mielodisplásico, leucemia con neoplasia de células dendríticas plasmacitoides básica (BPDCN), linfomas no hodgkinianos que incluyen linfoma de células del manto y leucemia de Hodgkin (LH). En ciertas realizaciones, el cáncer es leucemia mieloide aguda (LMA). En ciertas realizaciones, el cáncer es leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B).
En el décimo aspecto de la invención, también se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o un polipéptido de la invención, o un inmunoconjugado de la invención, o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, en donde las células del trastorno de proliferación celular expresan CD123. El método puede comprender administrar
a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, o el polipéptido de la invención, o el inmunoconjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, en una cantidad suficiente para tratar dicho trastorno de proliferación celular.
Se contempla que cualquier realización descrita en el presente documento, incluyendo las descritas únicamente en un aspecto de la invención (pero no en otros o que no se repite en otros) y las descritas únicamente en los ejemplos, se puede combinar con cualquier otra o más realizaciones de la invención, a menos que se indique explícitamente o no sea aplicable.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra la inhibición de la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1 por el anticuerpo CD123-6 quimérico (chCD123-6) y sus anticuerpos huCD123-6 con injertos de CDR (huCD123-6Gv4.6 y huCD123-6Gv4.7).
Las FIGs. 2A y 2B muestran que los tres anticuerpos murinos anti-CD123 (muCD123-3, -6 y -14) inhiben la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1 al menos tanto como 7G3. La FIG. 2A muestra la inhibición de células TF-1 cultivadas en presencia de IL-3 (1 ng/mL) por los diversos anticuerpos anti-CD123, que incluye los anticuerpos de control de unión a CD123 7G3, 6H6 y 9F5. La FIG. 2B muestra la inhibición de células TF-1 cultivadas en presencia de GM-CSF (2 ng/mL) por los mismos anticuerpos anti-CD123.
La FIG. 3 muestra que los anticuerpos murinos anti-CD123 muCD123-3, -6 y -14 inhiben la proliferación dependiente de IL-3 (1 ng/mL) de células TF-1 de una manera dependiente de la dosis y en un grado mayor que el 7G3 anticuerpo. muCD123-16 es un anticuerpo anti-CD123 de control negativo que se une a CD123 pero no inhibe la proliferación de células TF-1 dependiente de IL-3.
Las FIGs. 4A y 4B muestran que los anticuerpos muCD123-3, -6 y -14 murinos tienen una afinidad de unión mayor a células de LmA positivas a CD123 que el anticuerpo 7G3 en TF-1 que expresan CD123 (Figura 4A) y células HNT-34 (Figura 4B).
Las FIGs. 5A y 5B muestran que los anticuerpos quiméricos anti-CD-123 chCD123-3, -6 y -14 retienen una alta afinidad de unión de sus homólogos murinos, usando células HNT-34 (Figura 5A) o la leucemia mieloide aguda (LMA) positiva para CD123 línea celular MOLM-13 (Figura 5B). El anticuerpo quimérico cdKTI, el que no se une a CD123, se incluyó como control negativo.
La FIG. 6 muestra que los anticuerpos anti-CD-123 chCD123-3, 6 y 14 quiméricos anti-CD-123 retienen la actividad funcional de sus equivalentes murinos, tal como lo demuestra su capacidad para inhibir la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1. Se incluyó un anticuerpo anti-CD123 quimérico no funcional (chCD123-18) que se une a CD123, pero que no inhibe la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1 como control negativo.
La FIG. 7A muestra que los anticuerpos murinos (muCD123-6), quiméricos (chCD123-6) y huCD123-6 con injertos de CDR (huCD123-6Gv4.7S2 y huCD123-6Gv4.7S3) tienen mayor afinidad que 7G3 a células HNT-34 que expresan CD123. El anticuerpo quimérico cdKTI, el que no se une a CD123, se incluyó como control negativo. Las FIGs. 7B y 7C muestran que la conjugación del anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3 o huCD123-Gv4.7 a los compuestos D1 o d 2 mediante enlace a Lys, Ser o Cys solo afectó las afinidades de unión de estos conjugados ADC en forma moderada, es decir, huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-sD1 (vea la estructura en la Figura 17) y huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8 con enlace a Ser, huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1 y huCD123-6Gv4.7S3-D2 en la Figura 7B con enlace a Lys, y huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4 y huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 en la Figura 7C con enlace a Cys. En la Fig. 7C, el anticuerpo huCD123-6Gv4.7 no conjugado tiene una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54, en la que Xaa es Val. Los conjugados con "S3-SeriMab" tienen un enlace de citotoxina (en este caso, la indolinobenzodiazepina o los compuestos "IGN" de aquí en adelante) a través de Ser N-terminal oxidado en la cadena ligera. Los conjugados con "CysMab" tienen enlaces a citotoxina (en este caso, compuestos IGN) a través de la Cys modificada en la cadena pesada (es decir, la Cys correspondiente a la 5' Cys anterior a la última en la SEQ ID NO: 54).
La FIG. 8A muestra que los anticuerpos huCD123-6 con injertos de CDR (huCD123-6Gv4.7S2 y huCD123-6Gv4.7S3) y quiméricos (chCD123-6) inhiben la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1 mejor que los anticuerpos 7G3. La inhibición dependiente de IL-3, dado que estos anticuerpos no presentaron efectos inhibitorios al cultivar las células en presencia de GM-CSF (FIG. 8B).
La FIG. 9A muestra constructos de expresión de dominio extracelular IL-3Ra (CD123) y proteínas de receptores quiméricos que comprenden dominios IL-3Ra (gris) y GMRa (blanco). La FIG. 9B muestra que el anticuerpo CD123-6 se une principalmente al dominio CRM de IL-3Ra (residuos 101-306). La FIG. 9C muestra que el anticuerpo CD123-3 se une principalmente al dominio CRM de IL-3Ra (residuos 101-306). La FIG. 9D muestra que el anticuerpo CD123-14 se une exclusivamente al dominio de extremo N terminal de IL-3Ra (residuos 1-100). La FIG. 9E muestra que el anticuerpo 7G3 se une exclusivamente al dominio de extremo N terminal de IL-3Ra (residuos 1-100). La FIG. 9F muestra que el anticuerpo 6H6 se une exclusivamente al dominio de extremo N terminal de IL-3Ra (residuos 1-100). La FIG. 9G muestra que el anticuerpo 9F5 se une exclusivamente al dominio de extremo N terminal de IL-3Ra (residuos 1-100).
La FIG. 10 demuestra que el conjugado DM1 maitansinoide del anticuerpo huCD123-6Rv1.1 recubierto, huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1, presenta citotoxicidad dependiente de la dosis en la línea celular de LMA que expresa CD123 independientemente del factor de crecimiento OCI-LMA4. La citotoxicidad depende de CD123, tal como lo demuestra la capacidad del exceso de anticuerpo huCD123-6 no conjugado (500 nM) para impedir la citotoxicidad.
La FIG. 11A muestra la citotoxicidad in vitro de los diversos conjugados huCD123-6Rv1.1-IGN enlazados a lisina recubiertos en múltiples líneas celulares malignas positivas a CD123 de origen diferente.
La FIG. 11B muestra la citotoxicidad in vitro de los diversos conjugados huCD123-6-IGN enlazados a cisteína o lisina en múltiples líneas celulares de LLA-B positivas a CD123. Se incluyen conjugados con base en anticuerpos KTI sin capacidad de unión como controles negativos.
La FIG. 11C muestra que los diversos compuestos IGN enlazados a Lys o Cys se encuentran muy activos en las líneas celulares de LMA positivas a P-gp (P-glicoproteína) Kasumi-3 y MOLM-1. Se producen curvas de control con puntos de datos sin relleno en presencia de exceso de anticuerpos huCD123 equivalentes no conjugados.
La FIG. 11D muestra que prácticamente todos los diversos conjugados CD123-IGN enlazados a Lys o Cys de la invención destruyen 90% de las células progenitoras de LMA de 9 muestras de pacientes de LMA a concentraciones de nM o menores de nM.
La FIG. 11E muestra que el conjugado huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 enlazado a Cys destruye células sanguíneas normales a concentraciones más de 100 veces más elevadas que las necesarias para destruir progenitores de LMA. En comparación, Mylotarg no presenta tal efecto de muerte preferencial.
Las FIGs. 12A y 12B muestran la citotoxicidad in vitro de los diversos conjugados huCD123-6Rv1.1-IGN enlazados a lisina en células primarias de pacientes con LMA. En la FIG. 12A se presenta el resultado de un ensayo normal de CFU de una muestra de paciente primaria. La FIG. 12B ilustra los valores de IC90 para todas las muestras de pacientes con LMA tratados con los conjugados.
Las FIGs. 13A-13C muestran que el conjugado IGN de CysMab de huCD123-6 (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5, círculo negro relleno) es al menos tan activo como el conjugado enlazado a lisina (huCD123-6Gv4.6-D2, cuadrado negro relleno) del mismo anticuerpo contra la línea celular de LMA EOL-1 (Figura 13A), la línea celular B-ALL KOPN-8 (Figura 13B) y la línea celular de CML MOLM-1 (Figura 13C). Las curvas de puntos que conectan los puntos de datos abiertos en cada figura representan la actividad de los conjugados respectivos (es decir, círculo abierto para huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 y cuadrado abierto para huCD123-6Gv4.6-D2) en presencia de concentración de bloqueo (500 nM) del anticuerpo chCD123-6 no conjugado.
Las FIGs. 14A-14C muestran que SeriMab de huCD123-6 (huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8, círculo negro relleno) es al menos tan activo como el conjugado enlazado a lisina (huCD123-6Rv1.1-D2, triángulo negro lleno hacia abajo) del mismo anticuerpo en las líneas celulares de LMA SHI-1 (Figura 14A) y HNT-34 (Figura 14B), así como en la línea celular de CML MOLM-1 (Figura 14C). Las curvas de puntos que conectan los puntos de datos abiertos en cada figura representan la actividad de los conjugados respectivos (es decir, círculo abierto para huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8, y triángulo abierto hacia abajo para huCD123-6Rv1.1-D2) en presencia de bloqueo concentración (500 nM) del anticuerpo huCD123-6 no conjugado.
La FIG. 15 muestra una figura esquemática que muestra las etapas generales que pueden ser utilizadas para sintetizar un conjugado con enlace a Ser de la invención.
La FIG. 16 muestra una figura esquemática que muestra las etapas generales que pueden ser utilizadas para sintetizar un conjugado con enlace a Ser de la invención.
La FIG. 17 muestra una figura esquemática que ilustra las etapas generales que pueden ser utilizadas para sintetizar un conjugado con enlace a Ser de la invención.
La FIG. 18 muestra que el conjugado huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 enlazado a Cys tiene mayor actividad que la ozogamicina de gemtuzumab (GO) (también conocida como Mylotarg) en muestras de pacientes con LMA no seleccionadas.
La FIG. 19 muestra que el conjugado huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 enlazado a Cys destruye células progenitoras normales a concentraciones más de 100 veces más elevadas que las necesarias para destruir progenitores de LMA. En comparación, Mylotarg y huCD123-6G4.7-CysMab-D5' (Ad C del reticulante de ADN D5') no presentan tal efecto destructor preferencial.
La FIG. 20 muestra la eficacia in vivo de los conjugados CD123-IGN en el modelo de ratones subcutáneos de LMA MV4-11.
La FIG. 21 muestra que el conjugado de huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 enlazado a Cys es muy activo en varias líneas celulares de LMA positivas a CD123 con factores de pronóstico malo.
La FIG. 22 muestra imágenes de bioluminiscencia in vivo de ratones tratados con conjugado huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 en comparación con ratones tratados con vehículo y control el día 26. El tratamiento con el conjugado reduce en forma significativa la carga tumoral en ratones.
La FIG. 23 muestra que el tratamiento con conjugado de huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 extendió la supervivencia en 6/6 ratones en comparación con ratones tratados con vehículo y control.
La FIG. 24 muestra que la incubación de células MV4-11 con conjugado de huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 lleva al daño de ADN, interrupción del ciclo celular en la fase S y muerte celular mediada por apoptosis.
La FIG. 25 muestra la eficacia in vivo de los conjugados CD123-IGN en el modelo diseminado de LMA Molm-13.
La FIG. 26 muestra la eficacia in vivo de los conjugados CD123-IGN en el modelo de ratones subcutáneos de EOL-1.
La FIG. 27 muestra la eficacia in vivo del conjugado huCD123-CysMab-D5 a diversas dosis en el modelo subcutáneo EOL-1.
La FIG. 28 muestra la eficacia in vivo del conjugado huCD123-CysMab-D5 en comparación con la correspondiente forma de fármaco libre de la carga útil (FGN849 o D5), anticuerpo desnudo, control, citarabina y azacitidina en el modelo subcutáneo EOL-1.
La FIG. 29 muestra la eficacia in vivo de los conjugados CD123-IGN en el modelo diseminado de LMA MV4-11 LMA.
La FIG. 30 muestra la eficacia in vivo de los conjugados CD123-IGN en el modelo de ratones subcutáneos de LMA MV4-11.
La FIG. 31 muestra que el tratamiento con conjugado de huCD123-CysMab-D5 extendió la supervivencia en comparación con ratones tratados con vehículo y control.
La FIG. 32 muestra la tolerabilidad in vivo de los conjugados huCD123-CysMab-D5 y CD123-SeriMab-sD1 en ratones.
La FIG. 33 muestra la tolerabilidad in vivo del conjugado huCD123-lisina enlazado a D2 en ratones.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente invención, se define una serie de términos y frases a continuación.
Los términos "IL-3Ra (humano)", "receptor de interleucina 3 alfa" o "CD123" se usan en forma intercambiable en el presente documento y hacen referencia a cualquier CD123 o IL-3Ra (humano) de origen natural, a menos que se indique lo contrario. La proteína CD123 es una subunidad específica para interleucina 3 de un receptor de citocina heterodimérico (receptor de IL-3 o IL-3R). El IL-3R se comprende de una subunidad alfa específica para ligandos y una subunidad beta común de transducción de señales (también conocida como CD131) compartida por los receptores para interleucina 3 (IL3), factor de estimulación de colonias 2 (CSF2/GM-CSF) y interleucina 5 (IL5). La unión de CD123/IL-3Ra a IL3 depende de la subunidad beta. La unión a ligandos activa la subunidad beta y es necesaria para las actividades biológicas de IL3.
Todos estos términos relativos a CD123 se pueden referir ya sea a una secuencia de ácido nucleico o proteína, tal como se indica en el presente documento. El término "CD123/IL-3Ra" comprende CD123/IL-3Ra no procesado de longitud completa, así como cualquier forma de CD123/IL-3Ra que resulta del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de proteína o ácido nucleico CD123/IL-3Ra, p. ej., variantes de empalme, variantes alélicas e isoformas. Se puede aislar los polipéptidos y polinucleótidos de cDl23/IL-3Ra descritos en el presente documento de una variedad de fuentes, tal como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararlos mediante métodos recombinantes o de síntesis. Ejemplos de secuencias de CD123/IL-3Ra incluyen, pero no se limitan a, los números de referencia de NCBI NP_002174 y NM_002183 (secuencias de proteínas y ácidos nucleicos para la variante 1 de CD123 humano), y NP_001254642 y NM_001267713 (secuencias de proteínas y ácidos nucleicos para la variante 2 de CD123 humano).
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a un objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de estos a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser una de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de estas (p. ej., IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), basados en la identidad de sus dominios de cadena pesada a los que se hace referencia como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas como toxinas, radioisótopos, etc. etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo no natural. En algunas realizaciones, se purifica un anticuerpo a partir de componentes naturales. En algunas realizaciones, un anticuerpo se produce de forma recombinante. En algunas realizaciones, un hibridoma produce un anticuerpo.
Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une, tal como CD123/IL-3Ra. En una cierta realización, los anticuerpos bloqueadores o antagonistas inhiben en forma sustancial o total la actividad biológica del antígeno. De manera ideal, se reduce la actividad biológica un 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso un 100%.
El término "anticuerpo anti-CD123", "anticuerpo anti-IL-3Ra" o "anticuerpo que se une (específicamente) a CD123/IL-3Ra" hacen referencia a un anticuerpo capaz de unirse a CD123/IL-3Ra con afinidad suficiente tal que el anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico para la selección de CD123/IL-3Ra como diana. A menos que se especifique lo contrario, la extensión de la unión de un anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra a una proteína no CD123/IL-3Ra es menor de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a CD123/IL-3Ra tal como se midió, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a CD123/IL-3Ra tiene una constante de disociación (Kd) <0,5 nM, <0,3 nM, <0,1 nM, <0,05 nM o <0,01 nM. En una realidad, el anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra no se une a la cadena beta común de CD131. En una realización, el anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra no se une al mismo epítopo de CD123 al que se unen los anticuerpos CD123 comercialmente disponibles tales como 7G3 (IgG2a de ratón), 6H6 (IgG1 de ratón) y 9F5 (IgG1 de ratón) (Sun et al., Blood 87(1):83-92, 1996).
En las Tablas 1-6 que se encuentran a continuación, se proveen las secuencias de anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de estos de la invención. Se proporciona la nomenclatura para los diversos anticuerpos e inmunoconjugados de la invención por separado más adelante.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables de determinación antigénica de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluye uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada mediante determinados fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (sin limitación): (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y CH1 (p. ej., un anticuerpo digerido por papaína produce tres fragmentos: dos fragmentos Fab de unión a antígeno y un fragmento Fcque no se une a antígenos), (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que compren de dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra (p. ej., un anticuerpo digerido por pepsina produce dos fragmentos: un fragmento F(ab')2 de unión a antígeno bivalente y un fragmento Fc' que no se une a antígenos) y su unidad monovalente F(ab') relacionada, (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1 (es decir, la parte de la cadena pesada incluida en el Fab), (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único grupo de un anticuerpo y e Fv con enlace disulfuro, (v) un fragmento dAb (anticuerpo de dominio) o sdAb (anticuerpo de dominio simple) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) que consiste en un dominio Vh y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR).
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos implicada en la unión y el reconocimiento muy específicos de un único determinante antigénico, o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos que se dirigen a diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" abarca tanto anticuerpos monoclonales intactos como de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpos (como Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv), mutantes de cadena sencilla (scFv), proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo. porción, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos realizados de cualquier cantidad de maneras que incluyen, pero no se limitan a hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, y animales transgénicos.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de estas que contienen secuencias no humanas mínimas (p. ej., murinas). Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante complementaria (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster) que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad (Jones et al, Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988).
En algunos casos, se reemplazan los residuos de región marco (FR) Fv de una inmunoglobulina humana con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tienen la especificidad deseada, afinidad
y capacidad. El anticuerpo humanizado se puede modificar adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales en la región del marco Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente, dos o tres dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas, o sustancialmente todas, las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana de consenso. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Se describen ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados en Pats. de EE. UU. 5,225,539 y 5,639,641, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (3): 969-973, 1994; y Roguska y col., Protein Eng. 9 (10): 895-904, 1996. En algunas realizaciones, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo recubierto. En algunas realozaciones, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo con injerto de CDR.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones marco (FR) conectadas mediante tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273: 927-948, 1997). Además, se usan algunas veces en la técnica combinaciones de estas dos soluciones para determinar las CDR.
Generalmente se usa el sistema de numeración de Kabat cuando se refiere a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (p. ej., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
La numeración de posición de aminoácido de Kabat se refiere al sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., 1991, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. Al usar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácido lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento o una inserción en una FR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (p. ej., residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de la cadena pesada FR. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia de anticuerpos con una secuencia de numeración de Kabat "estándar". Por el contrario, Chothia se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917,1987). Cuando se numera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, el extremo del bucle CDR-H1 Chothia varía entre H32 y H34 según la longitud del bucle. Esto se debe a que el sistema de numeración Kabat ubica las inserciones en H35A y H35B - si 35A y 35B no se encontraran presentes, el bucle termina en 32; si solo 35A se encuentra presente, el bucle termina en 33; si tanto 35A como 35B se encuentran presentes, el bucle termina en 34. Las regiones hipervariables AbM representan un punto intermedio entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan en el software de realización de modelos de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.
Bucle Kabat AbM Chiothia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B (Numeración de Kabat) H26-H32..34
H1 H31-H35 H26-H35 (Numeración de Chothia) H26-H32
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H9S-H102 H95-H102 H95-H102
El término "anticuerpo humano" significa un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un humano mediante cualquier método conocido en la técnica. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (p. ej., ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de otro (normalmente humano) para evitar o reducir la posibilidad de provocar una respuesta inmune en esa especie (p. ej., humano). En ciertas realizaciones, el anticuerpo quimérico puede incluir un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana.
Los términos "epítopo" o "determinante antigénico" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refiere a la parte de un antígeno que puede ser reconocida y enlazarse en forma específica a un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente tras la desnaturalización de proteínas, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente tras la desnaturalización de proteínas. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la resistencia de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión simple de una molécula (p. ej., un anticuerpo) y su compañero de unión (p. ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd) o la concentración media máxima eficaz (EC50). La afinidad se puede calcular usando métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer enlazados por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión y cualquiera de ellos se puede utilizar a efectos de la presente invención. Realizaciones ilustrativas específicas se describen en el presente documento.
"O mejor" cuando se usa en el presente documento para hacer referencia a la afinidad de unión, se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. "O mejor" cuando se usa en el presente documento se refiere a una unión más fuerte, representada por un valor Kd numérico más pequeño. Por ejemplo, cuando un anticuerpo tiene una afinidad por un antígeno de "0,3 nM o mejor', la afinidad del anticuerpo por el antígeno es <0,3 nM, p. ej., 0,29 nM, 0,28 nM, 0,27 nM, etc., o cualquier valor igual o menor de 0,3 nM. En una realización, la afinidad del anticuerpo determinada por una Kdestará entre aproximadamente 10-3 y aproximadamente 10-12M, entre aproximadamente 10-6 y aproximadamente 10-11M, entre aproximadamente 10-6 y aproximadamente 10'10M , entre aproximadamente 10-6 y aproximadamente 10-9M, entre aproximadamente 10-6 y aproximadamente 10-8M, o entre aproximadamente 10-6 y aproximadamente 10-7M.
Por "se une específicamente" generalmente se entiende que un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, mediante su dominio de unión al antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio, no relacionado. El término "especificidad" se usa en el presente documento para calificar la afinidad relativa mediante la cual determinado anticuerpo se une a cierto epítopo. Se puede considerar, por ejemplo, que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad con respecto a un epítopo específico que el anticuerpo "B" o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene con respecto al epítopo "D" relacionado.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención "se une específicamente" a un antígeno CD123, porque tiene una especificidad de unión mayor por el antígeno CD123 (de cualquier especie) que por un antígeno no CD123. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención "se une específicamente" a un antígeno CD123 humano, porque tiene una especificidad de unión mayor por el antígeno CD123 humano que por un antígeno CD123 no humano (por ejemplo, un CD123 de ratón o rata).
Por "se une preferiblemente", se entiende que el anticuerpo se une de forma específica a un epítopo con mayor facilidad de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que "se une preferiblemente" a un epítopo específico tendría más probabilidades de unirse a dicho epítopo que a un epítopo relacionado, incluso si dicho anticuerpo puede tener una reacción cruzada con el epítopo relacionado. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención "se une preferiblemente" a un antígeno CD123 humano sobre un CD123 de ratón.
Se dice que un anticuerpo "inhibe competitivamente" la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo específico si se une preferiblemente a dicho epítopo al punto que bloquea, en cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo específico en al menos un 90%, al menos un 80%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50%.
La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", tal como se usa en la presente, indica un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (generalmente, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación), tal que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tendría poca o ninguna importancia estadística y/o biológica en el contexto de las características biológicas medidas por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es menor de aproximadamente 50%, menor de aproximadamente 40%, menor de aproximadamente 30%, menor de aproximadamente 20% o menor de aproximadamente 10% en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos purificados hasta un grado en el que ya no están en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. Un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición aislado es sustancialmente puro.
Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes), al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 98% puro o al menos 99% puro.
Los términos "inmunoconjugado", "conjugado" o "ADC" tal como se usan en el presente documento se refieren a un compuesto o un derivado de este enlazado a un agente de unión celular (es decir, un anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra o fragmento de este) y se define por una fórmula genérica: A-L-C, en donde C = citotoxina, L = enlazador y A = agente de unión a células (CBA), tal como anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra o fragmento de anticuerpo. Los inmunoconjugados también se pueden definir mediante la fórmula genérica en orden inverso: C-L-A.
Un "enlazador" es cualquier resto químico capaz de enlazar un compuesto, normalmente un fármaco, tal como un agente citotóxico descrito en el presente documento (p. ej., compuestos de maitansinoide o IGN (indolinobenzodiazepina)), a un agente de unión celular tal como un anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra o un fragmento del mismo en una forma covalente estable. , Los enlazadores pueden ser susceptibles o sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasa, la escisión inducida por esterasa y la escisión de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo permanecen activos. Se conocen en la técnica enlazadores adecuados e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa y grupos lábiles a esterasa. Los enlazadores también incluyen enlazadores cargados y formas hidrofílicas de estos tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.
los términos "CD123/IL-3Ra elevado", "expresión elevada de CD123/IL-3Ra" y "sobreexpresión de CD123/IL-3Ra" se refiere a una muestra que contiene niveles elevados de expresión de CD123. El CD123 puede estar elevado, aumentado o sobreexpresado en comparación con un valor de control (p. ej., nivel de expresión en una muestra biológica, tejido o célula de un sujeto sin cáncer, una muestra o cáncer que se sabe que no expresa CD123/IL-3Ra, una muestra normal o un cáncer que no tiene valores elevados de CD123/IL-3Ra). Por ejemplo, una muestra (p. ej., una de un cáncer hematológico como leucemia y linfoma) con expresión aumentada puede contener un aumento de al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 o al menos 50 veces con respecto a un control/valores normales.
Se puede usar una "muestra de referencia" para establecer una correlación y comparar los resultados obtenidos con los métodos de la invención a partir de una muestra de prueba. Las muestras de referencia pueden ser células (p. ej., líneas celulares, sedimentos celulares) o tejido. Los niveles de CD123/IL-3Ra en la "muestra de referencia" pueden ser una cantidad absoluta o relativa, un intervalo de cantidades, una cantidad mínima y/o máxima, una cantidad promedio y/o una cantidad mediana de CD123/IL-3Ra. Una "muestra de referencia" también puede servir como punto de referencia para la expresión de CD123/IL-3Ra con la que se compara la muestra de prueba. La "muestra de referencia" puede incluir una muestra anterior o muestra de referencia del mismo paciente, una referencia normal con un nivel conocido de expresión de CD123/IL-3Ra, o una referencia de una población de pacientes relevante con un nivel conocido de expresión de CD123/IL-3Ra. Los niveles de CD123/IL-3Ra también se pueden expresar como valores en una curva estándar. Una curva estándar es un método cuantitativo para graficar datos de ensayo para determinar la concentración de CD123/IL-3Ra en una muestra. Una muestra de referencia es un estándar de antígeno que comprende CD123/IL-3Ra purificado. Los métodos diagnósticos de la invención pueden implicar una comparación entre niveles de expresión de CD123/IL-3Ra en una muestra de prueba y un "valor de referencia". Un valor de referencia es el nivel de expresión de CD123/IL-3Ra en una muestra de referencia. Un valor de referencia puede ser un valor predeterminado y también se puede determinar a partir de muestras de referencia (p. ej., muestras biológicas de control o muestras de referencia) analizadas en paralelo con las muestras de prueba. Un valor de referencia puede
ser un único valor de corte, como una mediana o media, o un intervalo de valores, como un intervalo de confianza. Se pueden establecer valores de referencia para varios subgrupos de individuos.
El término "anticuerpo primario" en el presente documento se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno proteico diana en una muestra. Un anticuerpo primario es generalmente el primer anticuerpo utilizado en un ensayo ELISA o un procedimiento de IHC. Un anticuerpo primario es el único anticuerpo usado en un procedimiento IHC.
El término "anticuerpo secundario" en el presente documento se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo primario, de manera que forma un puente o enlace entre el anticuerpo primario y un reactivo posterior, si lo hubiera. El anticuerpo secundario es generalmente el segundo anticuerpo usado en un procedimiento inmunohistoquímico.
Una "muestra" o "muestra biológica" de la presente invención es de origen biológico, tal como de organismos eucariotas. La muestra es una muestra humana, pero también se pueden usar muestras animales. Fuentes no limitantes de una muestra para su uso en la presente invención incluyen tejido sólido, aspirados de biopsia, extractos fluidos, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, tumores, órganos, cultivos celulares y/o constituyentes de cultivos celulares, por ejemplo. Una “muestra cancerosa” es una muestra que contiene una célula cancerosa. Se puede usar el método para examinar un aspecto de la expresión de CD123/IL-3Ra o un estado de una muestra que incluye, pero no se limita, la comparación de diferentes tipos de células o tejidos, la comparación de diferentes etapas de desarrollo y la detección o determinación de la presencia y/o tipo de enfermedad o anomalía.
Como se usa en el presente documento, el término "reactivo de captura" se refiere a un reactivo capaz de unir y capturar una molécula objetivo en una muestra tal que, en condiciones adecuadas, el complejo reactivo de capturamolécula objetivo se pueda separar del resto de la muestra. El reactivo de captura se puede inmovilizar. El reactivo de captura en un inmunoensayo tipo sándwich puede ser un anticuerpo o una mezcla de diferentes anticuerpos contra un antígeno diana.
Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo detectable" se refiere a un anticuerpo que puede ser detectado ya sea en forma directa mediante una etiqueta amplificada por un medio de detección, o en forma indirecta, p. ej., otro anticuerpo marcado. Para el marcado directo, el anticuerpo se conjuga típicamente con un resto que es detectable por algún medio. En una realización, el anticuerpo detectable es un anticuerpo biotinilado.
Como se usa en el presente docuemento, la expresión "medio de detección" se refiere a un resto o técnica utilizados para detectar la presencia del anticuerpo detectable e incluye agentes de detección que amplifican la etiqueta inmovilizada tal como una etiqueta capturada en una placa de microtitulación. En una realización, el medio de detección es un agente de detección fluorimétrico tal como avidina o estreptavidina.
Comúnmente, un "ELISA sándwich" emplea las siguientes etapas: (1) la placa de microtitulación se recubre con un anticuerpo de captura; (2) se añade la muestra y cualquier antígeno presente se une al anticuerpo de captura; (3) se añade el anticuerpo de detección y se une al antígeno; (4) se añade un anticuerpo secundario enlazado a enzima y se une al anticuerpo de detección; y (5) se añade el sustrato y se convierte mediante enzima en una forma detectable.
Cuando se utiliza en el presente documento, el término "etiqueta" se refiere a una composición o compuesto conjugado en forma directa o indirecta al anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". La etiqueta se puede detectar por sí mismo (p. ej., etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.
Por "correlacionar" o "correlación" se entiende comparar en cualquier forma el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis al realizar el segundo análisis y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis para determinar si se debería realizar un segundo análisis y/o se pueden comparar los resultados de un primer análisis con los resultados de un segundo análisis. El aumento de la expresión de CD123/IL-3Ra se puede correlacionar con una mayor probabilidad de efectividad de una terapia dirigida a CD123/IL-3Ra.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen las condiciones fisiológicas en mamíferos en los que una población de células se caracteriza por crecimiento celular no regulado. “Tumor” y “neoplasma” se refieren a una o más células que dan como resultado un excesivo crecimiento o proliferación celular, tanto benigno (no canceroso) como maligno (canceroso) incluyendo lesiones precancerosas.
Ejemplos de cáncer incluyen linfoma y leucemia. Ejemplos de cáncer o enfermedades tumorígenas que es posible tratar y/o prevenir con los métodos y reactivos (p. ej., anticuerpo anti-CD123, fragmento de unión a antígeno de este o inmunoconjugado del mismo) de la invención incluye LMA, l Mc , LLA (p. ej., LLA-B), LLC, síndrome mielodisplásico, leucemia con neoplasia de células dendríticas plasmacitoides básica (BPDCN), linfomas de linfocitos B que incluye linfomas no hodgkinianos (LNH), linfoma/leucemia linfoblástica de linfocitos B precursores y neoplasia de linfocitos B maduros, tal como leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (LLC-B)/linfoma linfocítico pequeño (LLP), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmático, linfoma de células del manto (LCM), linfoma folicular (LF), lo que
incluye LF de bajo grado, grado intermedio y grado elevado, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma de linfocitos B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y tipo esplénico), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de linfocitos B grandes difusos, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células grandes anaplásicas (LCLA) y leucemia de Hodgkin (LH).
Los cánceres también abarcan cánceres que contienen células con niveles de expresión de CD123/IL-3Ra elevados. Tales cánceres con CD123/IL-3Ra elevado incluyen, pero no se limitan a, LMA, LMC, LLA (p. ej., LLA-B) y LLC.
Los términos "célula cancerosa", "célula tumoral" y equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células derivadas un tumor o una lesión precancerosa, lo que incluye células no tumorigénicas, que comprenden la mayor parte de la población de células tumorales y células madre tumorigénicas (células madre cancerosas). Como se usa en el presente documento, el término "célula tumoral" se modificará por el término "no tumorigénico" cuando se refiere solamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir aquellas células tumorales de las células madre cancerosas.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamífero) que incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que será el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable en el presente documento para hacer referencia a un sujeto humano.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación en forma tal que permite que la actividad biológica del principio activo sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que resulte inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se administre la formulación. Tal formulación puede ser estéril.
Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo o inmunoconjugado, tal como se describe en el presente documento, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad eficaz" se puede determinar de forma empírica y de manera rutinaria, en relación al propósito establecido.
En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerosas, reducir el tamaño tumoral, inhibir (es decir, enlentecer en cierta medida y En ciertas realizaciones, detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, inhibir (es decir, enlentecer en cierta medida y En ciertas realizaciones, detener) la metástasis tumoral, inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral, aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer y/o producir una respuesta favorable tal como mayor supervivencia sin evolución (PFS), supervivencia sin enfermedad (DFS) o supervivencia general (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR) o, en algunos casos, enfermedad estable (SD), una disminución de enfermedad progresiva (PD), un menor tiempo para evolución (TTP) o cualquier combinación de estos. Véase la definición de "tratar" en el presente documento. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, aunque no necesariamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
El término "responder favorablemente" generalmente se refiere a provocar un estado beneficioso en un sujeto. Con relación al tratamiento del cáncer, el término se refiere a proporcionar un efecto terapéutico en el sujeto. Es posible medir los efectos terapéuticos positivos en el cáncer en diversas formas (véase W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50: 1S-10S (2009)). Por ejemplo, se pueden usar todas las técnicas de inhibición de crecimiento tumoral, expresión de marcador molecular, expresión de marcador sérico e imagen molecular para evaluar la eficacia terapéutica de un agente terapéutico anticancerígeno. Con respecto a la inhibición del crecimiento tumoral, de acuerdo con los estándares del NCI un T/C < 42% es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10% se considera un nivel alto de actividad antitumoral, con T/C (%) = Volumen tumoral medio del tratado/Volumen tumoral medio del control x 100. Se puede evaluar una respuesta favorable, por ejemplo, mediante una mayor supervivencia sin evolución (PFS), supervivencia sin enfermedad (DFS) o supervivencia general (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR) o, en algunos casos, enfermedad estable (SD), una disminución en enfermedad progresiva (PD), un menor tiempo para evolución (TTP) o cualquier combinación de los mismos.
Se puede medir PFS, DFS y OS conforme a estándares establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer y la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados enlazados para la aprobación de nuevos fármacos. VéaseJohnson et al., (2003) J. Clin. Oncol. 21 (7): 1404-1411.
La "supervivencia sin evolución" (PFS) se refiere al tiempo desde la inscripción en el estudio hasta la evolución de la enfermedad o la muerte. La PFS se mide generalmente mediante el método Kaplan-Meier y los estándares 1.1 del
criterio de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST, por sus siglas en inglés). Generalmente, la supervivencia sin evolución se refiere a la situación en la que un paciente permanece vivo sin que el cáncer empeore.
Una "respuesta completa", o "remisión completa" o "CR" indica la desaparición de todas las señales de tumor o cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se haya curado.
Una "respuesta parcial" o "PR" se refiere a una reducción del tamaño o volumen de uno o más tumores o lesiones o, en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.
"Enfermedad estable" se refiere a enfermedad sin evolución o recaída. En la enfermedad estable no hay suficiente encogimiento del tumor para que califique como respuesta parcial ni suficiente aumento del tumor para que califique como enfermedad progresiva.
"Enfermedad progresiva" se refiere a la aparición de una o más lesiones o tumores nuevos y/o a la evolución inequívoca de lesiones no diana existentes. La enfermedad progresiva también se puede referir a un crecimiento tumoral de más de 20 por ciento desde el inicio del tratamiento, ya sea debido a aumentos en la masa o a la propagación del tumor.
"Supervivencia sin enfermedad" (DFS) se refiere a la extensión de tiempo durante el tratamiento y posterior a este durante la que el paciente permanece sin enfermedad.
"Supervivencia global" (OS) se refiere al tiempo desde la inscripción del paciente en el estudio hasta su muerte o hasta la fecha en la que se le vio vivo por última vez. La OS incluye una prolongación de la expectativa de vida en comparación con individuos o pacientes sin tratamiento. La supervivencia global se refiere a la situación en la que un paciente permanece vivo durante un período de tiempo definido, como un año, cinco años, etc., p. ej., desde el momento del diagnóstico o tratamiento.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Términos tales como "tratar", "tratamiento" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, enlentecen, reducen los síntomas y/o detienen la evolución de una afección o un trastorno patológico diagnosticado. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen a quienes se les diagnóstico el trastorno y también pueden incluir a aquellos con enfermedad residual mínima, enfermedad resistente o reaparición de enfermedad. En ciertas realziaciones, un sujeto se "trata" exitosamente contra el cáncer de acuerdo con métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de los siguientes: una reducción en la cantidad o ausencia total de células cancerosas, una reducción en el tamaño tumoral, inhibición o ausencia de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, propagación del cáncer en tejido blando y huesos, inhibición o ausencia de metástasis tumoral, inhibición o ausencia de crecimiento tumoral, alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico, menor morbilidad y mortalidad, mejora en la calidad de vida, reducción de la tumorigenicidad, frecuencia tumorigénica o capacidad tumorigénica de un tumor, reducción en la cantidad o frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, diferenciación de células tumorigénicas de un estado no tumorigénico, aumento de la supervivencia sin evolución (PFS), supervivencia sin enfermedad (DFS) o supervivencia general (OS), respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD), una disminución de enfermedad progresiva (PD), un menor tiempo para evolución (TTP) o cualquier combinación de los mismos.
Las medidas preventivas o profilácticas hacen referencia a medidas para prevenir y/o enlentecer el desarrollo de una afección o un trastorno patológico diana. Por lo tanto, quienes necesitan medidas profilácticas o preventivas incluyen a quienes presentan predisposición a padecer el trastorno y a quienes requieren prevenir el trastorno.
Las medidas profilácticas o preventivas hacen referencia a medidas terapéuticas para prevenir y/o enlentecer el desarrollo de una afección o un trastorno patológico diana. Por lo tanto, quienes necesitan medidas profilácticas o preventivas incluyen a quienes presentan predisposición a padecer el trastorno y a quienes requieren prevenir el trastorno.
Tal como se usa en el presente documento, "proveedor de cuidados de salud" se refiere a individuos o instituciones que interactúan en forma directa con sujetos vivos, p. ej., pacientes humanos. Los ejemplos no limitantes de proveedores de cuidados de salud incluyen doctores, enfermeras, técnicos, terapeutas, farmacéuticos, consejeros, practicantes de medicina alternativa, instituciones médicas, consultorios médicos, hospitales, salas de emergencia, centros de cuidado de urgencia, clínicas/instalaciones de medicina alternativa y cualquier otra entidad que proporciona tratamiento, mantenimiento, terapia, medicación y/o asesoría general y/o especializada relacionada con la totalidad o una parte del estado de salud del paciente, lo que incluye, de modo no taxativo, tratamiento, evaluación, mantenimiento, terapia medicación y/o asesoría médica general, médica especializada, quirúrgica y/o de otro tipo.
Un proveedor de servicios de salud puede administrar o instruir a otro proveedor de servicios de salud para administrar una terapia para tratar un cáncer. La “administración” de una terapia, tal como se usa en el presente documento, incluye recetar una terapia a un sujeto, así como administrarle, aplicarle o proporcionarle la terapia al sujeto. Un proveedor de atención médica puede implementar o instruir a otro proveedor de atención médica o paciente para que realice las siguientes acciones: obtener una muestra, procesar una muestra, enviar una muestra, recibir una muestra, transferir una muestra, analizar o medir una muestra, cuantificar una muestra, proporcionar la resultados obtenidos
después de analizar/medir/cuantificar una muestra, recibir los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una muestra, comparar/calificar los resultados obtenidos después de analizar/medir/cuantificar una o más muestras, proporcionar la comparación/puntuación de una o más muestras, obtener la comparación/puntuación de una o más muestras, administrar una terapia o un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de unión a CD123/IL-3Ra), comenzar la administración de una terapia, suspender la administración de una terapia, continuar una terapia, interrumpir temporalmente la administración de una terapia, aumentar la cantidad de un agente terapéutico administrado, disminuir la cantidad de un agente terapéutico administrado, continuar el administración de una cantidad de un agente terapéutico, aumentar la frecuencia de administración de un agente terapéutico, disminuir la frecuencia de administración de un agente terapéutico, mantener la misma frecuencia de dosificación de un agente terapéutico, reemplazar una terapia o agente terapéutico por al menos otra terapia o agente terapéutico, combinar una terapia o agente terapéutico con al menos otra terapia o agente terapéutico adicional. Estas acciones las puede realizar un proveedor de atención médica de forma automática mediante un método implementado por computadora (p. ej., a través de un servicio web o un sistema informático independiente).
Tal como se utilizan en forma intercambiable en la presente, "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, bases o nucleótidos modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De existir, la modificación de la estructura del nucleótido se puede producir antes o después del montaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (p. ej., metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos , etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (p. ej., alfa anoméricos ácidos nucleicos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido(s). Además, se puede reemplazar cualquiera de los grupos hidroxilo presentes comúnmente en los azúcares, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, los pueden proteger grupos protectores estándares o se pueden activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o se pueden conjugar con soportes sólidos. Los OH de extremos terminales 5' y 3' se pueden fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos de terminación orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hid roxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogos de azúcares de ribosa o desoxirribosa generalmente conocidos en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, 2'-0-metil-ribosa, 2'-0-alil-ribosa, 2'-fluoro-ribosa o 2'-azido-ribosa, análogos de azucares carboxílicos, azúcares alfaanoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acícliclos y análogos de nucleósidos abásicos tales como ribósidometilo. Se pueden remplazar uno o más enlaces fosfodiéster con grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en donde se reemplaza el fosfato con P(O)S (tioato), P(S )S (ditioato), (O)NR2 (amidato), P(O)R, P(O)OR*, CO o CH2 (formacetal), en los que R o R es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que opcionalmente contiene un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en, incluidos el ARN y el ADN.
El término "vector' se refiere a una construcción que es capaz de entregar y expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tal como las células productoras.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento y hacen referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales,etc.),así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en anticuerpos, en ciertas realizaciones, los polipéptidos se pueden presentar como cadenas simples o cadenas asociadas. En algunas realizaciones, un polipéptido, péptido o proteína no es de origen natural. En algunas realizaciones, un polipéptido, péptido o proteína se purifica a partir de otros componentes de origen natural. En algunas realizaciones, un polipéptido, péptido o proteína se produce de forma recombinante.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de nucleótidos o de residuos aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean (con la introducción de brechas, si fuera
necesario) para una máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir mediante el uso de software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En la técnica se conocen varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineación de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264-2268, 1990, como modificados en Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877, 1993, e incorporados en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1991). Gapped b La ST se puede usar como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; BLAST-2, W u -BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480, 1996), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) están disponibles adicionalmente al público programas de software que se pueden utilizar para alinear secuencias. Se puede determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos con el programa GAP en software GCG (p. ej., usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 o 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). Alternativamente, es posible utilizar el programa GAP en el paquete de software GCG que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453, 1970) para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (p. ej., con una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usando un PAM120 con tabla de residuos, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4. Se pueden determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante un software de alineación particular por un experto en la técnica. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados del software de alineación. El porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos se puede calcular como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas en la alineación de la primera y segundas secuencias (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineación de secuencias en particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor a la de la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto a la primera secuencia.
Como un ejemplo no limitante, se puede determinar si cualquier polinucleótido particular tiene un determinado porcentaje de identidad de secuencia (p. ej., es al menos 80% idéntico, al menos 85% idéntico, al menos 90% idéntico y, a veces, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico) a una secuencia de referencia mediante el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan de forma tal que el porcentaje de identidad se calcula respecto a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permiten brechas en la homología de hasta 5% de la cantidad total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En algunas realizaciones, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, si tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% y en algunas realizaciones, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos aminoácidos o nucleótidos al compararlos y alinearlos para obtener una máxima correspondencia, tal como se miden con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Puede existir identidad en una región de secuencias que es de al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 residuos de longitud o cualquier valor entero intermedio, o en una región de más de 60-80 residuos, al menos aproximadamente 90-100 residuos o las secuencias son sustancialmente idénticas en su longitud completa comparada, tal como, por ejemplo, la región codificante de una secuencia de nucleótidos.
Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que se reemplaza el residuo aminoácido con otro residuo aminoácido con una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales de ramificación beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una tirosina con una fenilalanina es una sustitución conservativa. Las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos a los antígenos, es decir, CD123/IL-3Ra, a los que se une el polipéptido o anticuerpo. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígenos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187, 1993; Kobayashi et al., Protein Eng 12 (10): 879-884, 1999; y Burks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417, 1997).
Como se usa en el presente documento, "P-glicoproteína 1", también conocida como "glicoproteína de permeabilidad", "P-gp" o "Pgp", "proteína 1 de resistencia multifármaco (MDR1)", "miembro 1 de subfamilia B de casete de unión a
ATP (ABCB1)" o "conjunto de diferenciación 243 (CD243)", es un transportador de ABC de la subfamilia MDR/TAP que transporta una amplia variedad de sustratos a través de membranas extracelulares e intracelulares. Es una bomba de flujo dependiente de ATP con amplia especificidad de sustrato. P-gp se distribuye y se expresa ampliamente en el epitelio intestinal, en el que bombea xenobióticos (tales como toxinas o fármacos) nuevamente hacia el interior del lumen intestinal, en células hepáticas en las que los bombea hacia el interior de conductos biliares, en las células de túbulos próximos del riñón en el que los bombea hacia el interior de conductos de orina y en las células endoteliales capilares que conforman la barrera hematoencefálica y la barrera hematotesticular, donde los bombea nuevamente hacia el interior de los capilares. Algunas células cancerosas también expresan grandes cantidades de P-gp, lo que hace que dichos cánceres tengan resistencia multifármaco.
"Alquilo" como se usa en el presente documento se refiere a un radical hidrocarburo de cadena ramificada o lineal saturada de uno a veinte átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo, incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, 1-propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-1 -propilo, -CH2CH(c H3)2), 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1 -pentilo, 2-peintl 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1 -butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo), 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, 1 -heptilo, 1-octilo, y similares. Preferiblemente, el alquilo tiene uno a diez átomos de carbono. Más preferiblemente, el alquilo tiene uno a cuatro átomos de carbono.
Se puede especificar la cantidad de átomos de carbono en un grupo en la presente mediante el prefijo "Cx-xx", en donde x y xx son números enteros. Por ejemplo, "alquilo C1-4" es un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
El término "compuesto" y "compuesto citotóxico" se utilizan de forma intercambiable. Estos pretenden incluir compuestos para los que se ha descrito una estructura o fórmula o cualquier derivado de esta en la presente invención. El término también incluye estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, solvatos, metabolitos y sales (p. ej., sales farmacéuticamente aceptables) de un compuesto de todas las fórmulas descritas en la presente invención. El término también incluye cualquier solvato, hidrato y polimorfo de cualquiera de los anteriores. No se debe interpretar la referencia específica a "estereoisómeros", "isómeros geométricos", "tautómeros", "solvatos", "metabolitos", "sal", "conjugados", "sales conjugadas", "solvato", "hidrato" o "polimorfo" en ciertos aspectos de la invención descritos en la presente solicitud como una omisión voluntaria de dichas formas en otros aspectos de la invención en la que el término "compuesto" se utiliza sin referencia a dichas otras formas.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse a su imagen especular, mientras que el término "aquiral" hace referencia a moléculas que se superponen a sus imágenes especulares.
El término "estereoisómero" se refiere a compuestos con constitución química idéntica y conectividad, pero diferentes orientaciones espaciales de sus átomos que no se pueden interconvertir mediante la rotación en torno a enlaces simples.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y a aquellas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, p.ej., puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Se pueden separar mezclas de diasterómeros mediante procedimientos analíticos de alta resolución como cristalización, electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones que se utilizan en el presente documento siguen, generalmente, lo planteado por S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y por Eliel, E. y Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invención pueden contener centros quirales o asimétricos y, por lo tanto, existen en diferentes formas estereoisoméricas. Se pretende que formen parte de la presente invención todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, que incluyen, pero no se limitan a, diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de los mismos, tales como mezclas racémicas. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. Al describir un compuesto ópticamente activo, se utilizan los prefijos D y L o R y S para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Se utilizan los prefijos d y l o (+) y (-) para designar el signo de la rotación del plano de luz polarizada por el compuesto, y (-) o l indican que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo que son imágenes especulares uno del otro. También se puede referir a un estereoisómero específico como un enantiómero, y, a menudo, se hace referencia a una mezcla de dichos isómeros como una mezcla enantiomérica. Se hace referencia a una mezcla 50:50 de enantiómeros como mezcla racémica o racemato, y esta puede surgir cuando una reacción o proceso químico no es estereoselectiva o estereoespecífica. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas sin actividad óptica.
Los términos "tautómero" o "forma tautomérica" se refieren a isómeros estructurales de energías diferentes que son interconvertibles a través de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros por transferencia de protones (también conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones a través de la migración de un protón,
tal como isomerizaciones de ceto-enol e imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones mediante la reorganización de algunos de los electrones del enlace.
El término "reactivo que reacciona con imina" se refiere a un reactivo capaz de reaccionar con un grupo imina. Los ejemplos de reactivo que reacciona con imina incluyen, pero no se limitan a, sulfitos (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3" , SO32" o HSO2" formado con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra-tiofosfatos (PO3SH3, PO2S2H3 , POS3H3 , PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23", POS33" o PS43" formada con un catión), ésteres de tio fosfato ((RiO)2PS(ORi), RiSH, RSOH, RiSO2H, RSO3H), diversas aminas (hidroxil amina (p.ej., NH2OH), hidrazina (p.ej., NH2NH2), NH2O-Ri, Ri,NH-Ri, NH2-Ri), NH2-CO-NH2 , NH2-C(=S)-NH2' tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32' formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42' formada con un catión), fósforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2' formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, en donde R1 y Ri y Ri' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Ri)2 , -CO2H, -SO3H, y -PO3H; Ri y Ri' puede estar opcionalmente sustituido además con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente memoria; Rj es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferiblemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; más preferiblemente , Rk es metilo, etilo o propilo). Preferiblemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+. Preferiblemente, el reactivo que reacciona con imina se selecciona de sulfitos, hidroxilamina, urea e hidrazina. Más preferiblemente, el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
Tal y como se usa en el presente documento, la frase "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de la invención. Las sales ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato "mesilato", etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), sales de metales alcalinos (p.ej., sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., magnesio) y sales de amonio. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabiliza la carga en el compuesto original. Asimismo, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo con carga en su estructura. Los casos donde los átomos con carga múltiple son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden presentar múltiples contraiones. Por consiguiente, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos con carga y/o uno o más contraiones.
Si el compuesto de la invención es una base, se puede preparar la sal farmacéuticamente aceptable deseada mediante cualquier método adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, el tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, un ácido de piranosidilo, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfa hidroxiácido, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinnámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido etanosulfónico, o similares.
Si el compuesto de la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, tratamiento del ácido libre con una base orgánica o inorgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo, o similares. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
Como se usa en la presente, el término "solvato" significa un compuesto que también incluye una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente tal como agua, isopropanol, acetona, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y diclorometano de etanolamina, 2-propanol o similares, enlazados mediante fuerzas intermoleculares no covalentes. Los solvatos o hidratos de los compuestos se preparan fácilmente mediante la adición de al menos un equivalente molar de un disolvente hidroxílico como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol o agua al compuesto para dar como resultado la solvatación o hidratación del resto de imina.
Un "metabolito" o "catabolito" es un producto producido mediante catabolismo o metabolismo en el cuerpo de un compuesto específico o de un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, o una sal del mismo. Se puede identificar los metabolitos de un compuesto, un derivado del mismo o un conjugado del mismo mediante técnicas de rutina conocidas en la técnica y determinar sus actividades mediante ensayos tales como los descritos en el presente documento. Por ejemplo, tales productos pueden ser el resultado de la oxidación, hidroxilación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desestirificación, escisión enzimática y similares del compuesto administrado.
En consecuencia, la invención incluye metabolitos de compuestos, un derivado de los mismos o un conjugado de estos, de la invención, incluyendo compuestos, un derivado de los mismos o un conjugado de los mismo, producidos por un proceso que comprende poner en contacto un compuesto, un derivado del mismo o un conjugado del mismo, de la presente invención con un mamífero durante un período suficiente para producir un producto metabólico del mismo.
La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser químicamente y/o toxicológicamente compatible con los otros principios comprendidos en una formulación y/o el mamífero que se trata con estos.
El término "grupo protector" o "resto protector" se refiere a un sustituyente que se utiliza comúnmente para bloquear 0 proteger una funcionalidad particular, al tiempo que se hacen reaccionar otros grupos funcionales del compuesto, un derivado del mismo o un conjugado del mismo. Por ejemplo, un "grupo protector de amina" o un "resto protector de amino" es un sustituyente enlazado a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Tales grupos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, P. Wuts y T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) y están ejemplificados por carbamatos tales como carbamato de metilo y etilo, FMOC , carbamatos de etilo sustituidos, carbamatos escindidos por eliminación de 1,6-p (también denominados "autoinmolativos"), ureas, amidas, péptidos, derivados de alquilo y arilo. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para una descripción general de grupos protectores y de su uso, véase P. G.M. Wuts y T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 2007.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o aminoácidos de origen no natural. En una realización, el aminoácido representado por NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH, en donde Raa y Raa son cada uno independientemente H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo o heterociclilo o Raa y el átomo de nitrógeno N-terminal pueden formar conjuntamente un anillo heterocíclico (p.ej., como en prolina). El término "residuo aminoácido" se refiere al residuo correspondiente cuando se elimina un átomo de hidrógeno del extremo amina y/o carboxi del aminoácido, como -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O- .
El término "catión" se refiere a un ion con carga positiva. El catión puede ser monovalente (p. ej., Na+, K+, NH4+ etc.), bi-valent (e.g., Ca2+, Mg2+, etc.) o multi-valente (p. ej., Al3+ etc.). Preferiblemente, el catión es monovalente.
El término "grupo éster reactivo" se refiere a un grupo éster que puede reaccionar con un grupo amina para formar un enlace amida. Ejemplos de grupos éster reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalamida, ésteres de N-hidroxisulfosuccinimida, ésteres de para-nitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo y sus derivados, en donde dichos derivados facilitan la formación de enlaces amida. El grupo éster reactivo puede ser un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster N-hidroxisulfosuccinimida.
La expresión "grupo reactivo amina" se refiere a un grupo que puede reaccionar con un grupo amina para formar un enlace covalente. Ejemplos de grupos reactivos a amina incluyen, pero no se limitan a, grupos éster reactivos, haluros de acilo, haluros de sulfonilo, imidoésteres o grupos tioéster reactivos. Un grupo reactivo con amina puede ser un grupo éster reactivo. Un grupo reactivo a amina puede ser un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster de N-hidroxisulfosuccinimida.
La expresión "grupo reactivo a tiol" se refiere a un grupo que puede reaccionar con un grupo tiol (-SH) para formar un enlace covalente. Ejemplos de grupos reactivos a tiol incluyen, pero no se limitan a, maleimida, haloacetilo, aloacetamida, vinilsulfona, vinilsulfonamida o vinilpiridina. Un grupo reactivo con tiol puede ser la maleimida
Tal como se usan en la presente descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen formas plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Se entiende que siempre que se describan realizaciones en la presente con la expresión "que comprende", también se proveen realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
El término "y/o", tal como se usa en una frase como "A y/o B" en la presente pretende incluir tanto "A y B", "A o B" como "A" y "B". De manera similar, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (sólo); B (sólo); y C (sólo).
Nomenclatura de anticuerpos, compuestos e inmunoconjugados
Como se utiliza en el presente documento, la nomenclatura utilizada para los anticuerpos anti-CD123, compuestos citotóxicos y sus inmunoconjugados generalmente adoptan los siguientes significados.
CD123-3, -6 y -14 (o CD123 Mu-3, -6 y -14, o muCD123-3, -6 y -14) y tres anticuerpos monoclonales anti-CD123. Se proporcionan las secuencias CDR1-3 de las cadenas ligeras y pesadas (VH-CDR1-3 y VL-CDR1-3) en las Tablas 1 y 2 con las SEQ ID NOs asociadas: 1-25. Se proporcionan las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR)
en la Tabla 3A con las SEQ ID NOs asociadas: 26, 28 y 30. Se proporcionan sus secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) en la Tabla 4A con las SEQ ID NOs asociadas: 27, 29 y 31. Las secuencias de cadena pesada (HC) de longitud completa de los anticuerpos murinos se proporcionan en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 42, 44 y 46), y las secuencias de cadena ligera (LC) de longitud completa de los anticuerpos murinos se proporcionan en la Tabla 6 (SEQ ID NOs: 43, 45 y 47).
chCD123-3, -6 y -14 son los correspondientes anticuerpos quiméricos murino-humano que tienen las regiones variables de la cadena pesada y ligera murina y las secuencias de la región constante humana. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico chCD123-6 está compuesto por el HCVR y el LCVR de ratón de las SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente, junto con las secuencias constantes de IgG1 y Kappa humanas para las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Véase el Ejemplo 3.
huCD123-3, -6 y -14 son los correspondientes anticuerpos humanizados. Cuando la humanización se produce mediante injerto de CDR de las seis regiones de CDR murinas correspondientes (CDR1-3 de HC y LC), la letra "G" sigue inmediatamente la designación del clon, lo que a su vez es seguido por un número de versión que designa el origen de las secuencias de regiones variables de cadenas ligeras y pesadas humanas. Por lo tanto, huCD123-6Gv4.6 se refiere al anticuerpo CD123 humanizado con base en la realización de injertos ("G") en las seis regiones de CDR del anticuerpo muCDR123-6 correspondiente en la región variable de cadena ligera humana Gv4 y la región variable de cadena pesada Gv6. De manera similar, -Gv4.7 comprende la región variable de cadena ligera humana Gv4 y la región de variable de cadena pesada Gv7, y -Gv1.1 comprende la región variable de cadena ligera humana Gv1 y la región variable de cadena pesada Gv1.
Las tres secuencias de HCVR, huCD123-6Gv1, -Gv6 y -Gv7 se proporcionan en la Tabla 3A (SEQ ID NO: 32 y 34, con SEQ ID NO: 34 representando tanto -Gv6 como -Gv7 ya que difieren solo en el 2° residuo Xaa) y sus secuencias de codificación de ADN en la Tabla 3B (SEC ID N°: 62, 64 y 66). Las tres secuencias de HC de longitud completa, huCD123-6Gv1, -Gv6 y - Gv7 se proporcionan en la Tabla 5 (SEQ ID NOs: 48 y 50, con SEQ ID NO: 50 que representan tanto -Gv6 como -Gv7 de longitud completa ya que solo difieren en el 2°residuo Xaa ).
Las dos secuencias LCVR, huCDI23-6Gv1 y -Gv4, se proporcionan en la Tabla 4A (SEQ ID NO: 33 y 35, y sus secuencias de codificación de ADN en la Tabla 4B (SEQ ID NO: 63 y 65). Se proporcionan las dos secuencias Lc de longitud completa, huCD123-6Gv1 y Gv4, en la Tabla 6 (SEQ ID NOs: 49 y 51).
Cuando la humanización se realiza mediante el resurgimiento, las secuencias de cadena pesada resurgidas se designan por "rh" inmediatamente después del número de clon del anticuerpo CD123 murino, y se designan además por una de las dos versiones de las secuencias resurgeladas, v1.0 o v1.1. Por tanto, huCD123-6rhv1.0 y -rhv1.1 son secuencias de cadena pesada resurgidas con regiones CDR correspondientes al anticuerpo muCD123-6, con designación de versión 1.0 y 1.1 respectivamente. Véase las SEQ ID NOs: 39 y 40 de HCVR en la Tabla 3A y las SEQ ID NOs: 68 y 69 en la Tabla 3B. Véase también las HC de longitud completa de SEQ ID NOs: 59 y 60 en la Tabla 5.
Asimismo, la única versión de la secuencia de cadena ligera resurgida, huCD123-6r1v1.0, tiene LCVR SEQ ID NO: 41 en la Tabla 4A, y LC SEQ ID NO: 61 de longitud completa en la Tabla 6.
Un anticuerpo recubierto que tiene huCD123-6rhv1.0 y huCD123-6rlv1.0 es huCD123-6Rv1.0; y un anticuerpo recubierto que tiene huCD123-6rhv1.1 y huCD123-6rlv1.0 es huCD123-6Rv1.1.
NTS2 recubierto o "S2" para abreviar se refiere a un anticuerpo que tiene una Ser modificada en el extremo N terminal de la cadena pesada. La variante S2 de huCD123-6Gv6/7 tiene la secuencia de HCVR SEQ ID NO: 38 en la Tabla 3A, y la secuencia de proteína HC de longitud completa SEQ ID NO: 53 en la Tabla 5.
Asimismo, NTS3, o "S3", para abreviar se refiere a un anticuerpo con una Ser modificada en el extremo N terminal de la cadena ligera. La variante S3 de huCD123-6Gv4 tiene la secuencia de LCVR SEQ ID NO: 37 en la Tabla 4A, y la secuencia de proteína LC de longitud completa SEQ ID NO: 58 en la Tabla 6.
Un anticuerpo que comprende una Ser modificada en el extremo N terminal (ya sea S2 o S3) se puede conjugar con un fármaco/agente citotóxico mediante la Ser de extremo N terminal oxidada, o a través del enlace de Lys "convencional". Si el enlace de fármaco se produce mediante la Ser de extremo N oxidada, el nombre del conjugado contiene la designación "SeriMab". Si el enlace de fármaco se produce mediante Lys, después, el nombre del conjugado no contiene SeriMab (a pesar del hecho de que exista una designación S2 o S3 para indicar la presencia de Ser modificada en el extremo N terminal). El tipo de enlace particular también resultará evidente con base en el grupo reactivo citotoxina. Por ejemplo, huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8 se refiere a conjugados entre D8 y el anticuerpo CD123 humanizado huCD123-6Gv4.7S3 a través de Ser de extremo N terminal oxidada en la cadena ligera. El anticuerpo CD123 humanizado tiene las regiones de CDR CD123-6 murinas con injerto, LC humana Gv4 y cadena pesada Gv7, y el extremo N de la cadena ligera tiene una Ser modificada (S3). En contraste, huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1 hace referencia a conjugados entre D1 y el mismo anticuerpo CD123 humanizado huCD123-6Gv4.7S3 a través de enlace de Lys mediante un enlazador SPDB sulfonado.
En ciertas realizaciones, si tanto el extremo N de cadena ligera como de cadena pesada contienen la Ser modificada, "S2S3" o "S2S3-SeriMab" puede aparecer en el nombre del anticuerpo.
Ciertos anticuerpos de la invención tienen una Cys modificada en el dominio CH3 de cadena pesada en una posición correspondiente a la misma posición Kabat de la 5' anterior a la última Cys en la SEQ ID NO: 54. Tales HCs o anticuerpos que comprenden tales HC contienen la designación "CysMab". Por lo tanto, huCD123-6Gv4.6-CysMab es un anticuerpo CD123 humanizado que tiene regiones CDR muCDl23-6 con injerto con base en las secuencias de cadena ligera humana Gv4 y cadena pesada Gv6, en las que una Cys modificada se ubica en la región CH3 de HC en una posición correspondiente a la 5' anterior a la última Cys en la SEQ ID NO: 54. De manera similar, su secuencia de cadena pesada es huCD123-6Gv6-CysMab. Además, huCD123-6Gv4.6S2-CysMab es por lo demás idéntico, pero tiene una Ser diseñada en el extremo N-terminal de la cadena pesada, y su secuencia de cadena pesada es huCD123-6Gv6S2-CysMab.
Se puede modificar adicionalmente el anticuerpo recubierto anteriormente descrito para que contenga Ser en el extremo N terminal, ya sea en la cadena ligera (variante S3 del anticuerpo recubierto) o cadena pesada (variante S2 del anticuerpo recubierto), o ambas (véase a continuación). Alternativamente o además, el anticuerpo recubierto puede tener una Cys modificada en el dominio CH3 de cadena pesada en una posición correspondiente a la misma posición Kabat de la 5' anterior a la última Cys de SEQ ID NO: 54 (la versión CysMab del anticuerpo recubierto). Un anticuerpo recubierto puede tener tanto una Cys modificada como una Ser en el extremo N termianal.
Sin embargo, en los conjugados que se forman entre tales CysMab y citotoxina, al menos en teoría, la citotoxina se puede enlazar a CysMab ya sea a través de la Cys o a través de la Lys convencional. Como se usa en el presente documento, sin indicación específica, un conjugado con una designación de CysMab se refiere a un conjugado entre CysMab y una citotoxina a través del enlace Cys (no el enlace Lys). El tipo de enlace particular también resultará evidente con base en el grupo reactivo citotoxina.
También se contemplan otras variaciones o combinaciones de la nomenclatura general anterior y serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Por ejemplo, huCD123-6Rv1.1-CysMab es la versión recubierta de huCD123-6 (v1.1) que tiene una Cys modificada ubicada en la región HC CH3 en una posición correspondiente a la 5' a la última Cys en la SEC ID NO: 54.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos de la invención se pueden conjugar a determinados agentes citotóxicos, ya sea mediante enlace a el grupo amino de cadena lateral Lys, el grupo tiol de cadena lateral Cys o una Ser/Thr de extremo N terminal oxidada. A continuación, se enumeran determinados agentes citotóxicos representativos (no limitantes) descritos en la memoria descriptiva (incluyendo los ejemplos) a efectos ilustrativos. Cabe observar que se pueden sulfonar la mayoría de los compuestos, tales como D1, D2, D4, DGN462, D3, D6, etc. (no se muestran aquí, pero véase el compuesto sD1 de la FIG. 17, compuesto sDGN462 de la FIG. 15 y el compuesto sD8 de la FIG. 16) en uno de los monómeros de indolinobenzodiazepina en determinados ejemplos. En el caso del compuesto D5', se pueden sulfonar ambos monómeros de indolinobenzodiazepina. El compuesto D5' no forma parte de la invención.
Se observa que varios agentes sólo difieren levemente debido a la diferente química de enlace necesaria para enlazar la citotoxina a diferentes cadenas laterales de anticuerpos (es decir, enlace Lys, enlace Cys, enlace Ser en el extremo N terminal oxidada). No obstante, dichas citotoxinas relacionadas tienen diferentes designaciones "D". Véase D1 y D4, así como D2, D5 y D8.
Los conjugados de los anticuerpos sujetos y los agentes citotóxicos siguen generalmente la nomenclatura de anticuerpos y agentes citotóxicos descritos anteriormente.
Por ejemplo, huCD123-6Gv4.6-sulfo-SPDB-D1 es un conjugado del anticuerpo huCD123-6Gv4.6 al compuesto D1 a través de un enlazador SPDB sulfonado, en uno o más residuos Lys del anticuerpo. huCD123-6-CX1-1-DM1 es un conjugado del anticuerpo huCD123-6 conjugado con el agente citotóxico DM1 mediante un enlazador de triglicilo denominado "enlazador CX1-1", en uno o más de los residuos Lys del anticuerpo. Véase el Ejemplo 9e.
Una excepción notable es el conjugado huCD123-6-SeriMab-sD1 mostrado en las Figs. 7B y 17, en los que la secuencia de enlazador corta entre huCD123-6-SeriMab y la citotoxina sD1 no se menciona explícitamente en el nombre del conjugado. De manera similar, conjugue huCD123-6-SeriMab-sDGN462 en la FIG. 15 también es una excepción a las reglas generales anteriores.
2. Agentes de unión a CD123
La presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a CD123/IL-3Ra, tales como CD123/IL-3Ra humano. Estos agentes generalmente se hacen referencia en el presente documento como "agentes de unión de CD123/IL-3Ra". Los agentes de unión de CD123/IL-3Ra son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (o "anticuerpos" a efectos de simplificación), inmunoconjugados de los mismos o polipéptidos de los mismos.
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para humanos y otras especies de CD123/IL-3Ra son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de proteína de la variante 1 de empalme de CD123/IL-3Ra humano como se muestra en NCBI RefSeq NP_002174 se reproduce a continuación:
1 MVLLWLTLLL IALPCLLQTK EDPNPPITNL RMKAKAQQLT WDLNRNVTDI ECVKDADYSM
61 PAVNNSYCQF GAISLCEVTN YTVRVANPPF STWILFPENS GKPWAGAENL TCWIHDVDFL
121 SCSWAVGPGA PADVQYDLYL NVANRRQQYE CLHYKTDAQG TRIGCRFDDI SRLSSGSQSS
181 HILVRGRSAA FGIPCTDKFV VFSQIEILTP PNMTAKCNKT HSFMHWKMRS HFNRKFRYEL
241 QIQKRMQPVI TEQVRDRTSF QLLNPGTYTV QIRARERVYE FLSAWSTPQR FECDQEEGAN
301 TRAWRTSLLI ALGTLLALVC VFVICRRYLV MQRLFPRIPH MKDPIGDSFQ NDKLWWEAG
361 KAGLEECLVT EVQWQKT (SEQ ID NO: 36)
La secuencia anterior muestra la proteína de cadena de precursor de CD123/IL-3R alfa compuesta por 378 aminoácidos que contiene el dominio extracelular (residuos 1-306 que incluye un péptido señal de extremo N terminal de 18 residuos), un dominio transmembrana de 20 aminoácidos y una cola citoplasmática corta de 52 aminoácidos.
Se reproduce a continuación la secuencia de ácido nucleico de variante de escisión 1 CD123/IL-3Ra tal como se ilustra en la secuencia de referencia de NCBI NM 002183:
1 GTCAGGTTCA TGGTTACGAA GCTGCTGACC CCAGGATCCC AGCCCGTGGG AGAGAAGGGG
61 GTCTCTGACA GCCCCCACCC CTCCCCACTG CCAGATCCTT ATTGGGTCTG AGTTTCAGGG
121 GTGGGGCCCC AGCTGGAGGT TATAAAACAG CTCAATCGGG GAGTACAACC TTCGGTTTCT
181 CTTCGGGGAA AGCTGCTTTC AGCGCACACG GGAAGATATC AGAAACATCC TAGGATCAGG
241 ACACCCCAGA TCTTCTCAAC TGGAACCACG AAGGCTGTTT CTTCCACACA GTACTTTGAT
301 CTCCATTTAA GCAGGCACCT CTGTCCTGCG TTCCGGAGCT GCGTTCCCGA TGGTCCTCCT
361 TTGGCTCACG CTGCTCCTGA TCGCCCTGCC CTGTCTCCTG CAAACGAAGG AAGATCCAAA
421 CCCACCAATC ACGAACCTAA GGATGAAAGC AAAGGCTCAG CAGTTGACCT GGGACCTTAA
481 CAGAAATGTG ACCGATATCG AGTGTGTTAA AGACGCCGAC TATTCTATGC CGGCAGTGAA
541 CAATAGCTAT TGCCAGTTTG GAGCAATTTC CTTATGTGAA GTGACCAACT ACACCGTCCG
601 AGTGGCCAAC CCACCATTCT CCACGTGGAT CCTCTTCCCT GAGAACAGTG GGAAGCCTTG
661 GGCAGGTGCG GAGAATCTGA CCTGCTGGAT TCATGACGTG GATTTCTTGA GCTGCAGCTG
721 GGCGGTAGGC CCGGGGGCCC CCGCGGACGT CCAGTACGAC CTGTACTTGA ACGTTGCCAA
781 CAGGCGTCAA CAGTACGAGT GTCTTCACTA CAAAACGGAT GCTCAGGGAA CACGTATCGG
841 GTGTCGTTTC GATGACATCT CTCGACTCTC CAGCGGTTCT CAAAGTTCCC ACATCCTGGT
901 GCGGGGCAGG AGCGCAGCCT TCGGTATCCC CTGCACAGAT AAGTTTGTCG TCTTTTCACA
961 GATTGAGATA TTAACTCCAC CCAACATGAC TGCAAAGTGT AATAAGACAC ATTCCTTTAT
1021 GCACTGGAAA ATGAGAAGTC ATTTCAATCG CAAATTTCGC TATGAGCTTC AGATACAAAA
1081 GAGAATGCAG CCTGTAATCA CAGAACAGGT CAGAGACAGA ACCTCCTTCC AGCTACTCAA
1141 TCCTGGAACG TACACAGTAC AAATAAGAGC CCGGGAAAGA GTGTATGAAT TCTTGAGCGC
1201 CTGGAGCACC CCCCAGCGCT TCGAGTGCGA CCAGGAGGAG GGCGCAAACA CACGTGCCTG
1261 GCGGACGTCG CTGCTGATCG CGCTGGGGAC GCTGCTGGCC CTGGTCTGTG TCTTCGTGAT
1321 CTGCAGAAGG TATCTGGTGA TGCAGAGACT CTTTCCCCGC ATCCCTCACA TGAAAGACCC
1381 CATCGGTGAC AGCTTCCAAA ACGACAAGCT GGTGGTCTGG GAGGCGGGCA AAGCCGGCCT
1441 GGAGGAGTGT CTGGTGACTG AAGTACAGGT CGTGCAGAAA ACTTGAGACT GGGGTTCAGG
1501 GCTTGTGGGG GTCTGCCTCA ATCTCCCTGG CCGGGCCAGG CGCCTGCACA GACTGGCTGC
1561 TGGACCTGCG CACGCAGCCC AGGAATGGAC ATTCCTAACG GGTGGTGGGC ATGGGAGATG
1621 CCTGTGTAAT TTCGTCCGAA GCTGCCAGGA AGAAGAACAG AACTTTGTGT GTTTATTTCA
1681 TGATAAAGTG ATTTTTTTTT TTTTAACCCA AAA (SEQ ID NO: 52)
Se pueden recuperar secuencias proteicas y de ácidos nucleicos de CD123/IL-3Ra de otras especies no humanas de bases de datos públicas tales como GenBank con herramientas de búsqueda de secuencias conocidas en la técnica (tales como BLASTp o BLASTn de NCBI) y las secuencias proteicas y de ácidos nucleicos anteriores como secuencias de búsqueda, respectivamente.
Se pueden alinear tales secuencias de especies no humanas con las secuencias humanas mediante cualquiera de las diversas herramientas de alineamiento de secuencias reconocidas en la técnica, tal como las descritas en el presente documento y anteriormente, tal como que sea posible obtener en forma sencilla cualesquiera residuos aminoácidos o nucleótidos "correspondientes a" cualesquiera secuencias humanas dadas o regiones de secuencias.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo: (a) se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 101 a 346 del antígeno CD123 humano, y (b) inhibe la proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas al antígeno.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra o fragmento de unión a antígeno de este se puede unir específicamente a un epítopo de SEQ ID NO: 36. En ciertas realizaciones, el epítopo se encuentra en una región correspondiente a los residuos 101-346 de CD123/IL-3Ra humano. En ciertas realizaciones, el epítopo se encuentra en una región correspondiente a los residuos 101-204 de SEQ ID NO: 36. En otras ciertas realizaciones, el epítopo se encuentra en una región correspondiente a los residuos 205-346 de SEQ ID NO: 36. En ciertas realizaciones, el epítopo no se encuentra en una región correspondiente a los residuos 1-100 de CD123/IL-3Ra humano.
En ciertas realizaciones, los agentes de unión a CD123/IL-3Ra (p. ej., anticuerpos) inhiben la señalización dependiente de IL3, tales como la proliferación dependiente de IL-3 de células TF-1 positivas para CD123. Sin desear estar enlazado a ninguna teoría en particular, los agentes de unión a CD123/IL-3Ra (p. ej., anticuerpos) de la invención se unen a CD123, como dentro de una región CD123 correspondiente a los residuos 101-346 (p. ej., residuos 101-204,
o 205-346) de CD123/IL-3Ra humano, y previene, reduce, disminuye o inhibe de otro modo la unión productiva entre CD123 y el ligando de IL-3, y/o unión productiva entre CD123 y la cadena beta común CD131, que conduce a una reducción o eliminación de la señalización dependiente de IL-3.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede: (a) unirse a un epítopo dentro de los aminoácidos 1 a 100 del antígeno CD123 humano, y (b) inhibir la proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas al antígeno, con un valor de IC50 de 0,1 nM o menos (p. ej., 0,08 nM, 0,05 nM, 0,03 nM).
En ciertas realizaciones, la unión mediante los agentes de unión a CD123/IL-3Ra (p. ej., anticuerpos) de la invención inhibe (p. ej., inhibe en forma preferencial) la proliferación de células madre leucémicas (LSC), progenitores de leucemia (LP) o blastos de leucemia, pero no inhiben en forma sustancial la proliferación de las células madre hematopoyéticas normales (HSC).
Se puede llevar a cabo la inhibición de la proliferación celular mediante cualquier ensayo estándar conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, citometría de flujo. Por ejemplo, se puede separar HSC, LSC, LP y blastos de leucemia normales mediante citometría de flujo con base en la diferencia de expresión de marcadores de superficie celular y es posible medir en forma cuantitativa y comparar la cantidad relativa de las células restantes o supervivientes, después de la incubación con los agentes de ensayo.
También es posible determinar la inhibición de proliferación celular de LSC, LP o blastos de leucemia en comparación con HSC normales mediante ensayo de potencia in vitro en células cancerosas primarias, tales como células de LMA primarias. Por ejemplo, se pueden exponer células de LMA (o muestras de médula ósea humana normal que contienen HSC normales) a varias concentraciones de los anticuerpos anti-CD123 del sujeto, fragmentos de unión a antígeno del mismo, inmunoconjugados de los mismos o polipéptidos que comprenden los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno durante 24 horas. También se pueden usar en el ensayo anticuerpos no dirigidos (con isotipo coincidente) o control de inmunoconjugados (ADC). Se puede dividir las muestras en un ensayo de cultivo líquido a corto plazo (STLC) para medir la citotoxicidad relativa a LSC, LP o blastos de leucemia y un ensayo de cultivo líquido a largo plazo (LTLC) para medir el efecto sobre las LSC y HSC normales. La STLC se puede usar para medir las unidades formadoras de colonias de 10-14 días en las células, p. ej., después de la siembra en placa en medio semisólido MethoCult H4230 (tecnologías Stemcell). Los ensayos de LTLC se pueden realizar de forma similar con la adición de factores de crecimiento para cultivo a largo plazo durante 5-7 semanas. En ambos ensayos, se pueden contar las colonias para determinar las unidades de formación de colonias por cantidad de células inicialmente colocadas en placas. Las colonias de LTLC se pueden analizar adicionalmente para determinar la presencia de marcadores moleculares de cáncer (p. ej., LMA) usando PCR o FISH o ambos.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a células positivas para antígeno CD123 humanas con una constante de disociación (Kd) de 0,3 nM o menos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a CD123 humano con una Kd entre 0,05 y 0,3 nM, o entre 0,05 y 0,2 nM, o entre 0,05 y 0,1 nM, o entre 0,01 nM y 0,3 nM, o entre 0,01 nM y 0,2 nM, o entre 0,01 nM y 0,1 nM.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a CD123 de mono cynomolgus. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al CD123 de mono cynomolgus con una Kd entre 0,05 y 0,3 nM, o entre 0,05 y 0,2 nM, o entre 0,05 y 0,1 nM.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen tanto a CD123 humano como de mono cynomolgus con una afinidad de unión sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a CD123 humano y de mono cynomolgus con Kd entre 0,05 y 0,3 nM, o entre 0,05 y 0,2 nM, o entre 0,05 y 0,1 nM.
En ciertas realizaciones, el valor de Kd se basa en un ensayo de unión con base celular. En ciertas realizaciones, el valor de Kd se mide mediante citometría de flujo. En ciertas realizaciones, el valor de Kd se mide mediante resonancia de plasmones superficiales (tal como mediante el uso del sistema de resonancia de plasmones superficiales BIOCORETM). En ciertas realizaciones, el valor de Kd se mide mediante radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, la Kd se mide mediante cualquier otro método reconocido en la técnica.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe al menos 50% de proliferación dependiente de IL3 en células TF-1 positivas a antígeno a una concentración de 0,5 nM o menos.
Los agentes de unión a CD123/IL-3Ra son anticuerpos CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), de las que cada una comprende tres regiones de c Dr (CDR1-CDR3 para HCVR y CDR1-CDR3 para LCVR), en donde las CDR compuestas para HCVR y LCVR son como se describen en el primer aspecto. Los anticuerpos CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden las secuencias proporcionadas en las Tablas 1 y 2 a continuación.
T l 1 n i m in i D R r i n ri l n
Tabla 2 Secuencias de aminoácidos de CDR de re ión variable de cadena li era
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado con injerto de CDR que comprende regiones de CDR de ratón y en donde uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) residuos de la zona de Vernier de la región marco de cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo son de origen de ratón.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene un amino secuencia de ácido expuesta en SEQ ID NO: 1, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 o 3, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4; y 2) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 16, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17 y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecido en SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 3.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden: a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene un amino secuencia de ácido expuesta en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 o 10, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 11; y 2) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19 o 20, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21, y una CDR3 que tiene un amino secuencia de ácido establecida en la SEQ ID NO: 22. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 6, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 7, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 8, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 9 y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 10, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 6 y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 20. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 7 y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 20. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 8 y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 20. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 9, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 20. En ciertas realizaciones, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 10 y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 20. Para cada combinación por pares de CDR2 de región variable de cadena pesada con región variable de cadena ligera CDR1 anterior, la región variable de cadena pesada CDR1 y 3 son las SEQ ID NOs: 5 y 11, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR2 y 3 son las SEQ ID NOs: 21 y 22, respectivamente.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de os mismos comprenden: a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene un amino secuencia de ácido expuesta en SEQ ID NO: 12, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada establecida en la SEQ ID NO: 13 o 14, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 15; y 2) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 23, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 24, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 25. En ciertas realizaciones, CDR2 de la región de cadena pesada variable es la SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones, CDR2 de la región de cadena pesada variable es la s Eq ID NO: 14.
Se contemplan en el presente documento todas las combinaciones posibles con base en las SEQ ID NO: 1-25 en la Tabla 1, particularmente aquellas relativas al mismo número de anticuerpo (por ejemplo, las seis CDR de cadena ligera y de cadena pesada provienen de CD123-3, o de CD123-6, o de CD123-14) sin enumerar en forma exhaustiva todas las combinaciones específicas.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen sustituciones de aminoácidos conservadas en 1, 2 o 3 residuos consecutivos en una o más cualquiera de las secuencias de CDR anteriores. Es decir, en algunas realizaciones, los anticuerpos sujeto y fragmentos de unión a antígeno de estos pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadas en 1, 2 o 3 residuos consecutivos en cualquiera una o más de las SEQ ID NO: 1-25.
En ciertas realizaciones, el HCVR y el LCVR son de las secuencias proporcionadas en las Tablas 3A y 4A a continuación. En las Tablas 3B y 4B se encuentran secuencias de ácidos nucleicos correspondientes seleccionadas que codifican HCVR y LCVR.
T l A n i m in i D R r i n ri l n
T l B n i i n l i r i n ri l n l i n
Tabla 4A Secuencias de aminoácidos de CDR de re ión variable de cadena li era
T a b la 4B S e c u e n c ia s de á c idos n u c le ico s de reg ión v a ria b le de c a d e n a lige ra se le c c io n a d a s
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: (a) una secuencia Vh al menos 95% idéntica a una secuencia V h de referencia seleccionada de un grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl idéntica al menos en un 95% a una secuencia V l de referencia seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 ( o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: (a) una secuencia Vh al menos 96% idéntica a una secuencia V h de referencia seleccionada de un grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl al menos 96% idéntica a una secuencia Vl de referencia seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 ( o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden: (a) una secuencia Vh al menos 97% idéntica a una secuencia V h de referencia seleccionada de un grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl idéntica al menos en un 97% a una secuencia Vl de referencia
seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden: (a) una secuencia Vh idéntica al menos en un 98% a una secuencia V h de referencia seleccionada entre un grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl idéntica al menos en un 98% a una secuencia V l de referencia seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123 y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden: (a) una secuencia Vh idéntica al menos en un 99% a una secuencia V h de referencia seleccionada de un grupo que tiene amino secuencias de ácido representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl idéntica al menos en un 99% a una secuencia V l de referencia seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo CD123/IL-3Ra/fragmento de unión al antígeno del mismo tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (preferiblemente SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38) y/o 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37) difiere de las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 , y 38) y/o 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 y 37) solo mediante sustituciones conservadoras de aminoácidos, como 1, 2 , o 3 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservativas son sustituciones de 1,2 o 3 aminoácidos consecutivos en una o más regiones de CDR de las cadenas pesada y/o ligera.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: (a) una secuencia VH idéntica a una secuencia V H de referencia seleccionada de un grupo que tiene amino secuencias de ácido representadas por las SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 y 40 (o SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 y 38); y/o (b) una secuencia Vl idéntica a una secuencia V l de referencia seleccionada del grupo que tiene secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 y 41 (o SEQ ID NO : 27, 29, 31, 35 y 37).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: una secuencia Vh tal establecida en la SEQ ID NO:26, y/o una secuencia Vl establecida en la SEQ ID NO: 27.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: una secuencia Vh establecida en la SEQ ID NO: 28 y/o, una secuencia Vl establecida en la SEQ ID NO: 29.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: una secuencia Vh establecida en la SEQ ID NO: 30, y/o una secuencia Vl establecida en la SEQ ID NO: 31.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: una secuencia VH tal establecida en la SEQ ID NO: 34, y/o una secuencia VL establecida en la SEQ ID NO: 35.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de estos comprenden una secuencia VH y una secuencia VL con una combinación de SEQ ID NO seleccionadas del grupo que consiste en: 32/33, 34/33, 38/33, 39/33, 40/33, 32/35, 34/35, 38/35, 39/35, 40/35, 32/37, 34/37, 38/37, 39/37, 40/37, 39/33, 39/35, 39/37, 39/41,40/33, 40/35, 40/37, y 40/41.
Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno comprenden de los mismos: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41. En ciertas realizaciones, la secuencia V Hse establece en la SEQ ID NO: 39, y la secuencia Vl se establece en la SEQ ID NO: 41. En ciertas realizaciones, la secuencia Vh se establece en la Se Q ID NO: 40, y la secuencia Vl se establece en la SEQ ID NO: 41.
En una realización relacionada, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 34 es Phe (F). En algunas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 34 es Val(V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en
la SEQ ID NO: 39 o 40, excepto que el primer residuo se sustituye por Ser (S); y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41, excepto que el primer residuo se reemplaza por Ser (S).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno del mismo comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo N terminal es Ser, y excepto que el residuo correspondiente a la 5' al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo correspondiente a la5' al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41, excepto que el residuo N terminal es Ser.
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 38 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 38 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37. En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 34 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 34 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ Id NO: 56 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 56 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37. En ciertas realizaciones, Xaa en la s Eq ID NO: 54 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 54 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 o 60, excepto que el residuo correspondiente a la 5' al último residuo de la SEQ ID NO: 54 es Cys; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En ciertas realizaciones, Xaa en la s Eq ID NO: 54 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 54 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 56 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 56 es Val (V).
En otra realización, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden: a) una región de la cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y, b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37. En ciertas realizaciones, Xaa en la s Eq ID NO: 54 es Phe (F). En ciertas realizaciones, Xaa en la SEQ ID NO: 54 es Val (V).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen específicamente a anti-CD123/IL-3Ra. En ciertas realizaciones, el anticuerpo CD123/IL-3Ra o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo murino, quimérico humanizado o humano o fragmento de unión a antígeno de este que se une específicamente a CD123/lL-3Ra. En ciertas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento es un anticuerpo recubierto o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo recubierto o con injerto de CDR o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra son anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos de longitud completa pueden comprender cualquiera de los anticuerpos definidos anteriormente por las secuencias de CDR 1-6 (CDR1-CDR3 de las cadenas pesada y ligera), o cualquiera de los anticuerpos definidos anteriormente por el LCVR y/o el HCVR, o cualquier de los anticuerpos de longitud completa que tienen una secuencia de cadena pesada en la Tabla 5, o cualquiera de los anticuerpos de longitud completa que tienen una secuencia de cadena ligera en la Tabla 6, o cualquiera de los anticuerpos de longitud completa que tienen una secuencia de cadena pesada en la Tabla 5 y un secuencia de cadenas ligeras en la Tabla 6.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra son anticuerpos de longitud completa que comprenden: (a) una cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de cadena pesada de longitud completa anteriores, tal como cualquiera de las secuencias de cadena pesada de longitud completa en la Tabla 5; y/o (b) una cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de cadena ligera de longitud completa anteriores, como cualquiera de las secuencias de cadena ligera de longitud completa en la Tabla 6. En cierto, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra son anticuerpos de longitud completa que comprenden una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una combinación de secuencia de cadena ligera de longitud completa seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 42/43, 44/45, 46/47, 48/49, 50/49, 53/49, 54/49, 56/49, 59/49, 60/49, 48/51, 50/51, 53/51, 54/51, 56/51, 59/51, 60/51, 48/58, 50/58, 53/58, 54/58, 56/58, 59/58, 60/58, 59/49, 59/51, 59/58, 59/61, 60/49, 60/51, 60/58 y 60/61, o anticuerpos con al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de cadena pesada de longitud completa y/o secuencias de cadena ligera de las mismas.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra hay anticuerpos de longitud completa que comprenden una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una combinación de secuencia de cadena ligera de longitud completa seleccionada del grupo que consta de s Eq ID NO: 59/61, y 60/61, o anticuerpos con al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de cadena pesada de longitud completa y/o secuencias de cadena ligera de las mismas. Tales anticuerpos pueden comprender además Ser/Thr del extremo N terminal modificadas en la cadena ligera, cadena pesada o ambas. Tales anticuerpos también pueden comprender Cys modificadas en el dominio CH3 de cadena pesada en una posición correspondiente a la 5' Cys anterior a la última de SEQ ID NO: 54.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra es un anticuerpo murino, quimérico humanizado o humano que se une específicamente a CDl23/IL-3Ra. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra que tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO de longitud completa difiere de dichas SEQ ID NO solo por sustituciones conservadoras de aminoácidos, p. ej., por 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservativas consecutivas solamente. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservativas se encuentran fuera de las CDR.
En ciertas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno de los mismos es o comprende un Fab, Fd, Fab', F(ab')2 , Fv de cadena sencilla o scFv, Fv con enlace disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 , o scFv-Fc, de cualquiera de los anticuerpos anteriores.
En el segundo aspecto, la invención también proporciona un polipéptido que comprende cualquiera de los anticuerpos 0 fragmentos de unión a antígeno de los mismos, cualquiera de las secuencias de Vh y/o Vl anteriores, cualquiera de HCVR y/o LCVR anteriores, o cualquiera de las secuencias de CDR de HCVR y/o LCVR anteriores. Por ejemplo, el polipéptido puede ser una fusión con un dominio o proteína no anticuerpo. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión no se fusiona con una toxina pseudomonas.
Se puede determinar la afinidad o avidez de un anticuerpo para un antígeno en forma experimental mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej., citometría de flujo, ensayo de inmunoabsorbción enlazado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA), o cinética (p. ej., análisis BIACORE™). Se puede emplear formatos de ensayos de unión directa, así como de ensayos de unión competitiva. Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, NY (1992), y métodos descritos en el presente documento.
La afinidad medida de una interacción antígeno-anticuerpo particular puede variar si se mide bajo condiciones diferentes (p. ej., concentración de sal, pH, temperatura). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígenos (p. ej., Kd o Kd, kon, koff) se realizan con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado, como se conoce en la técnica y tal como el tampón descrito en el presente documento.
Se pueden realizar ensayos de unión mediante citometría de flujo en células que expresan el antígeno CD123/IL-3Ra en la superficie. Por ejemplo, se puede incubar células positivas a CD123/IL-3Ra con concentraciones diferentes de anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra con 1 x 105 células por muestra en 100 pL de tampón FACS (p. ej., medio RPMI-1640 complementado con suero de cabra normal al 2%). Después, las células se pueden sedimentar, lavar e incubar durante 1 hora con 100 pL de anticuerpo IgG de cabra antihumano o de cabra antirratón conjugado con FITC (el cual se obtiene en, por ejemplo, Jackson Laboratory, 6 pg/mL en tampón FACS). Después las células se vuelven a sedimentar una vez más, se lavan con tampón FACS y se vuelven a suspender en 200 pl de PBS que contiene formaldehído al 1%. Las muestras se pueden adquirir, por ejemplo, mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos de h Ts y se analiza mediante el uso de CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE.UU.). Para cada muestra la intensidad media de fluorescencia para FL1 (MFI, por sus siglas en inglés) se puede exportar y graficar en función de la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica para generar una curva de unión. Se ajusta una curva de dosis-respuesta sigmoidea para las curvas de unión y los valores de EC50 se calculan utilizando programas como GraphPad Prism v4 con parámetros predeterminados (software GraphPad, San Diego,
CA). Se pueden usar los valores de EC50 como medida de la constante de disociación aparente, "Kd" o "Kd", para cada anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el uso de métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Mediante el uso del método de hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal hospedador adecuado para provocar la producción mediante linfocitos de anticuerpos, los cuales se unirán específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. Seguido de la inmunización, se aíslan los linfocitos y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada, por ejemplo, con polietilenglicol, para formar células de hibridoma que después se pueden seleccionar de linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido según lo determinado por inmunoprecipitación, inmunotransferencia o un ensayo de unión in vitro (p. ej., radioinmunoensayo (RIA); ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA)) se pueden después propagar mediante cultivo in vitro utilizando métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden después purificar del medio de cultivo o del fluido ascítico como se describe para los anticuerpos policlonales.
Alternativamente, es posible producir los anticuerpos monoclonales mediante métodos de ADN recombinante tal como se describe en la patente de EE.UU. 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de células de hibridoma o linfocitos B maduros, tal como por r T-PCR con cebadores de oligonucleótidos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, y su secuencia se determina con procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan después en vectores de expresión adecuados, que cuando se transfectan en células hospedadoras tales como células E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, los anticuerpos monoclonales son generados por las células huésped. También, se pueden aislar anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas de bibliotecas de expresión de fagos que expresan CDR de las especies deseadas, tal como se describe (McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991).
El o los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden modificar además de distintas maneras utilizando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas realizaciones, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada, por ejemplo, de un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden sustituir 1) por las regiones, por ejemplo, de un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) por un polipéptido no inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En otras realizaciones, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Se puede usar mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal contra el CD123/IL-3Ra humano es un anticuerpo humanizado. Tales anticuerpos se pueden utilizar terapéuticamente para reducir las respuestas de1HAMA (anticuerpo antirratón humano) y la antigenicidad cuando se administran a un sujeto humano.
Los métodos para modificar, humanizar o recubrir anticuerpos humanos o no humanos también se pueden usar y son bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado, repavimentado o modificado similar puede tener uno o más residuos aminoácidos de una fuente que no es humana, p. ej., pero no se limita a, ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos aminoácidos no humanos se reemplazan por residuos que a menudo se denominan residuos "importados", que normalmente se toman de una variable, constante u otro dominio "importado" de una secuencia humana conocida.
Tales secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o para reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida y cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. Por consiguiente, se mantiene parte o la totalidad de las secuencias de CDR humanas o no humanas, al tiempo que las secuencias no humanas de las regiones constante y variable se pueden reemplazar con aminoácidos humanos u otros aminoácidos.
Opcionalmente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, recubiertos, modificados o humanos modificados con retención de afinidad elevada por el antígeno CD123/IL-3Ra y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, es posible preparar anticuerpos anti-CD123/IL-3Ra humanizados (o humanos) o modificados y anticuerpos recubiertos opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados y modificados conceptuales con modelos tridimensionales de las secuencias parentales, modificadas y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas pantallas permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno, tal como CD123/IL-3Ra. De esta forma, los residuos de marco (FR) se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias de consenso e importadas, de
forma tal que se logre la característica del anticuerpo deseada, tal como una mejor afinidad por el o los antígenos objetivo.
La humanización, el recubrimiento o la modificación de los anticuerpos de la presente invención se pueden realizar usando cualquier método conocido, tal como, pero no limitado a, los descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988, Sims et al., J. Immunol.
151:2296, 1993; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901, 1987, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993; Raguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(3):969-973, 1994; Pat. de EE.UU. Nos. 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483;5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089;5,225,539;4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; y 7,342,110.
En ciertas realizacione alternativas, el anticuerpo contra CD123/IL-3Ra es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (véase, p. ej., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; Boemer et al., 1991, J. Immunol , 147 (1): 86-95; y patente de EE.UU. 5,750,373). Además, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, como se describe, por ejemplo, en Vaughan et al., Nat. Biotecnología. 14: 309-314, 1996, Sheets et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 95: 6157-6162, 1998, Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381, 1991, y Mark et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991). También se describen técnicas para la generación y el uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos en las patentes de EE.UU. Nos. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915;6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; y 7,264,963; y Rothe et al., J. Mol. Bio. doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018, 2007. Las estrategias de maduración por afinidad y las estrategias de reorganización de cadenas (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992) son conocidas en la técnica y se pueden emplear para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
También se pueden producir anticuerpos humanizados en ratones transgénicos que contienen locus de inmunoglobulina humana capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena después de su inmunización. Este procedimiento se describe en las patentes de EE.UU. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126;5,633,425; y 5,661,016.
En ciertas realizaciones, se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración del tumor. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos ( por ejemplo , Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1993), y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). En ciertas realizaciones, los fragmentos de anticuerpos se producen de forma recombinante. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv se pueden expresar y secretarse a partir de E. coli u otras células hospedadoras, permitiendo así la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Tales fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo también puede ser anticuerpos lineales como se describe en la Patente de EE.UU. 5,641,870, por ejemplo, y puede ser monoespecífica o biespecífica. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el practicante experto.
Para los propósitos de la presente invención, se debe entender que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que haga posible la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un CD123/IL-3Ra humano. En este sentido, la región variable puede comprender o derivar de cualquier tipo de mamífero en el que se puede inducir una respuesta humoral y que puede generar inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de primate humano, murino, no humano (p. ej., monos cynomolgus, macacos, etc.) o de origen lupino. En algunas realizaciones, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras realizaciones, las regiones variables de anticuerpos compatibles (normalmente derivadas de una fuente no humana) se pueden modificar o adaptar específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o alterar de otro modo mediante la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.
Los dominios variables tanto en la cadena pesada como en la ligera se ven alterados por el reemplazo al menos parcial de una o más CDR y, de ser necesario, por la modificación de la secuencia y el reemplazo parcial de la región marco. Aunque se puede derivar las CDR de un anticuerpo de la misma clase, o incluso de la misma subclase, que el anticuerpo a partir del cual derivan las regiones marco, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de una clase diferente y En ciertas realizaciones, de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, puede ser necesario solamente transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a antígeno. Dadas las explicaciones establecidas en las Patentes de EE.UU. Nos. 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762, estará dentro de la competencia de los expertos en la técnica, ya sea mediante la realización de una experimentación de rutina o mediante pruebas de ensayo y error para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
Independientemente de las alteraciones de región variable, los expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos modificados de la presente invención comprenderán anticuerpos (p. ej., anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunorreactivos de los mismos) en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o alterado de otro modo para proporcionar las características bioquímicas deseadas, como una mayor localización del tumor o una semivida sérica reducida en comparación con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunas realizaciones, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con esta invención comprenden adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descritos en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunas realizaciones, se contemplan regiones constantes modificadas en donde se eliminan en forma parcial o total uno o más dominios. En algunas realizaciones, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones o variantes con eliminación de dominio en donde se eliminó todo el dominio de CH2 (constructos ACH2). En algunas realizaciones, los dominios de la región constante omitidos se reemplazarán por un espaciador de aminoácidos corto (p. ej., 10 residuos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular impartida típicamente por la región constante ausente.
Se observará que en ciertas realizaciones, los anticuerpos modificados se pueden modificar para fusionar el dominio CH3 directamente con la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos. En otros constructos, puede ser deseable proporcionar un espaciador peptídico entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, se podrían expresar constructos compatibles en donde se ha suprimido el dominio CH2 y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Se puede añadir un espaciador, por ejemplo, para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región de bisagra permanezca flexible. Sin embargo, cabe señalar que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, resultar inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra el constructo. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, cualquier espaciador añadido al constructo será relativamente no inmunogénico, o incluso se omitirá por completo, para mantener las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.
Más allá de la deleción total de los dominios de región constante, se reconocerá que es posible proporcionar los anticuerpos de la presente invención mediante la eliminación o sustitución parcial de unos pocos aminoácidos o incluso, de un único aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir de manera sustancial la unión de Fc y de esa manera aumentar la ubicación del tumor. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente la parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (p. ej., la unión del complemento C1Q) que se va a modular. Tales deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero), mientras que dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante del sujeto. Además, como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos se pueden modificar, p. ej., mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, lo que puede mejorar el perfil del constructo resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (p. ej., unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Ciertas realizaciones pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar más unión de citotoxina o carbohidrato. En tales realizaciones, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.
La presente invención abarca además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, establecidos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativas, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro de la misma clase general, tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución conservadora de aminoácidos es bien conocido en la técnica, como los definidos anteriormente.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento del mismo, contra un CD123/IL-3Ra humano. Se reconocerá en la técnica que es posible que algunas secuencias de aminoácidos de la invención varíen sin efecto significativo en la estructura o la función de la proteína. Por lo tanto, la invención también incluye variaciones de los polipéptidos que presentan actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o fragmento del mismo, contra un antígeno CD123, tal como CD123 humano. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo.
Se pueden modificar además los polipéptidos y análogos para que contengan restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Los restos derivados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario deseable de
las proteínas y similares. Puede encontrar una descripción general de esos restos en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
Los polipéptidos aislados descritos en se pueden producir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos van desde métodos de síntesis de proteínas directas hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas aisladas y que expresa esas secuencias en un huesped transformado adecuado. Se puede construir una secuencia de ADN usando tecnología recombinante al aislar o sintetizar una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo salvaje de interés. Opcionalmente, es posible someter la secuencia a mutagénesis específica del sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, p.ej., Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066, 1984, y la Pat de EE.UU. No. 4,588,585.
Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés (p. ej., anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido de la invención) se construiría en forma total o parcial mediante síntesis química con un sintetizador de oligonucleótidos. Se pueden diseñar tales oligonucleótidos de acuerdo con la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y al seleccionar los codones que se favorecen en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican partes del polipéptido deseado se pueden sintetizar y después ligarse. Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente salientes 5 'o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensambladas (mediante síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de la expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. Se puede confirmar el ensamblaje adecuado por medio de secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe estar operativamente enlazado a secuencias de control de la expresión transcripcional y traduccional que sean funcionales en el huésped de expresión elegido.
Se pueden utilizar vectores de expresión recombinante para amplificar y expresar los anticuerpos que codifican ADN, o fragmentos de los mismos, contra CD123/IL-3Ra humano. Los vectores de expresión recombinante son constructos reproducibles de ADN que tienen fragmentos de ADN sintético o derivados de ADNc que codifican una cadena polipeptídica de un anticuerpo anti-CD123/IL-3Ra, o fragmento del mismo, enlazado en forma operativa a elementos de regulación de transcripción o traducción que derivan de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Una unidad de transcripción comprende generalmente un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que desempeñan un rol regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores de transcripción, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en una proteína y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de transcripción y traducción. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia de operador para controlar la transcripción. Se puede incorporar además la capacidad de replicarse en un huésped, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN se encuentran enlazadas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) se encuentra enlazado operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia, o un sitio de unión a un ribosoma se encuentra enlazado operativamente a una secuencia codificante si se ubica de manera que permita la traducción. Los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo metionina en el extremo N terminal. Este residuo se puede opcionalmente escindir posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de secuencia de control de expresión y vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de vector/huésped de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, que incluyen pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo de huésped más amplio, tales como M13 y fagos de ADN monocatenario filamentoso.
Las células huésped adecuadas para expresión de un anticuerpo o polipéptido de unión a CD123/IL-3Ra (o una proteína CD123/IL-3Ra para usar como antígeno) incluyen células procariotas, de levadura, de insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilli.Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero, tal como células CHO. También podrían emplearse sistemas de traducción libres de células. Se describen vectores de clonación y expresión adecuados para uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura
y mamífero en Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985). Se puede encontrar información adicional relativa a métodos de producción de proteínas, lo que incluye producción de anticuerpos, p. ej., en la publicación de la Patente de EE.UU. No. 2008/0187954, las Patentes de e E.UU. Nos. 6,413,746 y 6,660,501, y la publicación de Patente Internacional WO 04009823.
También se emplean ventajosamente diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar proteína recombinante. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos se puede realizar porque dichas proteínas generalmente están correctamente plegadas, apropiadamente modificadas y completamente funcionales. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, células L, CI 27, 3T3, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado enlazado al gen que se va a expresar y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5 'o 3', y secuencias no traducidas 5 'o 3', según sea necesario sitios de unión a ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Por lo tanto, un aspecto de la invención también proporciona una célula que produce cualquiera de los anticuerpos sujeto o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o cualquiera de los polipéptidos sujeto. En ciertas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula es una célula HEK-293 o HEK-293T, una célula COS-7, una célula L, una célula CI 27, una célula 3T3, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula HeLa o una célula BHK. En ciertas realizaciones, la célula es una célula CHO.
Las proteínas producidas por un huésped transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Tales métodos estándar incluyen cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Se pueden acoplar a la proteína etiquetas de afinidad tal como una secuencia de recubrimiento de influenza, poli-histidina o glutatión-S-transferasa mediante técnicas recombinantes estándar para permitir una purificación fácil mediante un pasaje a través de la columna de afinidad adecuada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente usando tales técnicas como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteínas recombinantes en medios de cultivo primero se pueden concentrar mediante el uso de un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativa, es posible emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución (RP-HPLC) en fase reversa que emplean medio RP-HPLC hidrófobo, p. ej., gel de sílice que tiene metilo colgante u otros grupos alifáticos, para purificar además un agente de unión CD123/IL-3Ra. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, también se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, mediante extracción inicial de sedimentos celulares, seguida de una o más concentración, salificación, intercambio iónico acuoso o etapas de cromatografía de exclusión por tamaño. Se puede emplear cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante se pueden romper mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. Nos. 2008/0312425, 2008 /0177048 y 2009/0187005.
En ciertas realizaciones, el agente de unión a CD123/IL-3Ra de la presente invención tiene una serina de extremo N terminal que se puede oxidar con un agente oxidante para formar un agente de unión a CD123/IL-3Ra con un grupo aldehído de extremo N terminal.
Se puede utilizar cualquier agente oxidante adecuado en la etapa (a) de los métodos descritos aquí. El agente oxidante puede ser un peryodato. Más específicamente, el agente oxidante puede ser peryodato de sodio.
Se puede utilizar un exceso de equivalentes molares del agente oxidante respecto al agente de unión a CD123/IL-3Ra. Se puede usar aproximadamente 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 o 5-10 equivalentes molares del agente oxidante. Se pueden utilizar aproximadamente 10 o aproximadamente 50 equivalentes del agente oxidante. Cuando se utiliza una gran cantidad del agente oxidante, se emplea un tiempo de reacción breve para evitar la sobreoxidación. Por ejemplo,
cuando se utilizan 50 equivalentes del agente oxidante, la reacción de oxidación se lleva a cabo durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos. Alternativamente, cuando se usan 10 equivalentes del agente oxidante, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas. Se pueden usar 5-10 equivalentes molares del agente oxidante y la reacción de oxidación se puede llevar a cabo durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos (p. ej., aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 minutos).
La reacción de oxidación puede no conducir a una oxidación sin objetivo significativa. Por ejemplo, ningún grado significativo (p. ej., menos del 20%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1%) de metionina y/o glicanos se puede oxidar durante el proceso de oxidación de la serina N terminal para generar el agente de unión a CD123/IL-3Ra oxidado que tiene un grupo aldehido N terminal.
En ciertas realizaciones, el agente de unión a CD123/IL-3Ra de la presente invención tiene un residuo Cys modificado en forma recombinante, tal como un residuo Cys que corresponde a la 5' Cys anterior a la última en, por ejemplo, SEQ ID NO:54 o 56 (es decir, un residuo Cys en la posición 442 de la numeración EU/OU). Por lo tanto, la expresión "anticuerpo modificado con cisteína" incluye un anticuerpo con al menos una Cys que normalmente no se encuentra presente en un residuo dado de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo. Tales Cys, que también se pueden referir como "Cys modificadas", se pueden modificar usando cualquier biología molecular convencional o tecnología de ADN recombinante (p. ej., reemplazando la secuencia codificante de un residuo que no es Cys en el residuo diana con una secuencia codificante Cys). Por ejemplo, si el residuo original es Ser con una secuencia codificante de 5'-UCU-3', la secuencia codificante puede mutar (p. ej., mediante mutagénesis dirigida al sitio) en 5'-UGU-3', la que codifica Cys. En ciertas realizaciones, el anticuerpo modificado con Cys de la invención tiene una Cys modificada en la cadena pesada. En ciertas realizaciones, la Cys modificada se encuentra en o cerca del dominio CH3 de la cadena pesada. En ciertas realizaciones, la Cys modificada que corresponde a la 5 ' Cys anterior a la última en, por ejemplo, SEQ ID NO: 54 o 56. Se puede insertar la secuencia de cadena pesada (o ligera) del anticuerpo modificado en un vector de expresión recombinante adecuado para producir el anticuerpo modificado con el residuo Cys modificado en lugar del residuo Ser original.
3. Inmunoconjugados
La presente invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden agentes de unión a CD123/IL-3Ra descritos en el presente documento enlazados covalentemente a una o más moléculas de agentes citotóxicos descritos en el presente documento.
El inmunoconjugado de la presente invención puede comprender agentes de unión a CD123/IL-3Ra (incluyendo anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o polipéptido que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) descritos en el presente documento enlazados covalentemente a un agente citotóxico descrito en el presente documento a través del grupo amino £ de uno o más residuos de lisina ubicados en los agentes de unión a CD123/IL-3Ra.
En una 1' realización específica del quinto aspecto, se representa el inmunoconjugado de la presente invención mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, que está enlazado covalentemente a través de un residuo de lisina a CyL1;
W l es un número entero de 1 a 20; y
CyL1 es un compuesto citotóxico representado por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1');
o
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-SZs1- (B3');
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
m es un número entero de 1 a 6; y
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En una 2a realización específica, para conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado mediante la fórmula (L1a); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1a realización específica.
En una 3a realización específica, para los conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado por la fórmula (L1b); y el de variables son como se describieron anteriormente en la 1a realización específica. Más específicamente, RX3 es un alquilo (C2-C4).
En una 4a realización específica, para conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado por la fórmula (L1a); Raand Rbare ambos H; R5 es H o Me, y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 1a realización específica.
En una 5a realización específica, P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables se describen anteriormente en la 1a, 2a o 4a realización específica. En una realización más específica, P se selecciona del grupo que consiste en Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9'tosil-Arg, Phe-N9_nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. Más específicamente, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 6a realización específica, Q es -SO3M; y el resto de las variables se describen anteriormente en la 1a, 2a, 4a o 5a realización específica o en la misma se describen variables más específicas.
En una 7a realización específica, el inmunoconjugado del quinto aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Wi_es un número entero de 1 a 10; la línea doble - -entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H; y cuando es un enlace sencillo, X es -H e Y es -OH o -SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M.
En una8‘ realización específica, el inmunoconjugado del quinto aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA (CyL2)wL(L2),
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, que está enlazado covalentemente a CyL2 através de un residuo de lisina; W l es un número entero de 1 a 20; y
CyL2 es un compuesto citotóxico representado por la siguiente fórmula estructural:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
Rx1 y x2R son independientemente alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W' es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En una 9' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (L2), CyL2 se representa mediante la fórmula (L2a); y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 8' realización específica.
En una 10' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (L2), CyL2 se representa mediante la fórmula (L2b); y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 8' realización específica.
En una 11' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L2), Re es H o Me; Rxi y Rx2 son independientemente -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde cada Rf y Rg es independientemente -H o un alquilo (C1 -C4) y p es 0, 1, 2 o 3; y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 8', 9' o 10' realización específica. Más específicamente, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan entre -H y -Me.
En una 12' realización específica, el inmunoconjugado del quinto aspecto está representado por la siguiente fórmula:
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde WL es un número entero de 1 a 10; la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H; y cuando es un enlace sencillo, X es -H e Y es -OH o -SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un doble enlace. En otra realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -S O 3M.
En una 13' realización específica, los inmunoconjugados del quinto aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA (CyL3)wL(L3),
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, que está enlazado covalentemente a CyL3 através de un residuo Lys; W l es un número entero de 1 a 20;
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3); y
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
En una 14' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L3), m' es 1 y tanto R1 como R2 son ambos H; y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 13' realización específica.
En una 15' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L3), m' es 2 y tanto R1 como R2 son ambos Me y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 13' realización específica.
En una 16'realización específica, los inmunoconjugados del quinto aspecto se representan por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Wi_es un número entero de 1 a 10.
En una 17' realización específica, para los inmunoconjugados del quinto aspecto, M es H+, Na o K+, y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en cualquiera de la 1' a 16' realización específica o cualesquiera realizaciones más específicas descritas aquí.
En cualquiera de las anteriores 1' a 17' realización específica, el anticuerpo sujeto o fragmento de unión al antígeno del mismo puede tener uno o más (p. ej., sustancialmente todo o el 100%) de los residuos Lys en cualquiera de las seis regiones CDR de cadena ligera o cadena pesada (si corresponde) sustituidos con Arg. El anticuerpo objeto o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 o 40; y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo también puede comprender una Ig HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y un LCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35. El anticuerpo objeto o fragmento de unión a antígeno del mismo puede
comprender además una Ig HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs: 32, 34, 38, 39 o 40; y un LCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs: 33, 35, 37 o 41. En ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo N terminal de la SEQ ID NO: 34 es Phe, mientras que en otras ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo Nterminal de la SEQ ID NO: 34 es Val.
Los inmunoconjugados descritos en el quinto aspecto o en cualquier forma específica descrita en el mismo se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica., véase, por ejemplo, los documentos WO 2012/128868 y WO 2012/112687.
Los inmunoconjugados del quinto aspecto se pueden preparar mediante un primer método que comprende las etapas de hacer reaccionar el CBA con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo con amina.
Para el primer método descrito anteriormente, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina, tal como NaHSO3.
Para el primer método descrito anteriormente, el agente citotóxico que tiene un reactivo reactivo con amina puede estar representado mediante la siguiente fórmula:
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
Lc se representa mediante la siguiente fórmula:
-NR5-PC (=O) -(CRaRb)m-C (=O) E (B1);
o
-NR5-PC (=O) -(CRaRb)m-SZs (B2)
C (=O) E es un grupo éster reactivo, como éster de N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxisulfosuccinimida, éster de nitrofenilo (p. ej., 2 o 4-nitrofenil), éster de dinitrofenilo (p. ej., 2,4-dinitrofenilo), sulfo -tetrafluorofenil (p. ej., 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenil) éster o pentafluorofenil éster, preferiblemente éster de N-hidroxisuccinimida;
Zs se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
U es -H o SO3M; y
las variables restantes son como se describen en cualquiera de los específicos 1' a 7' y 17' o cualquiera más específico descrito aquí.
Los inmunoconjugados del quinto aspecto se pueden preparar mediante un segundo método que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar un agente citotóxico con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol para formar un compuesto de agente citotóxico y enlazador con el grupo reactivo con amina enlazado a este; y
(b) hacer reaccionar el CBA con el compuesto de agente citotóxico y enlazador.
Para el segundo método descrito anteriormente, la reacción en la etapa (a) se puede llevar a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina.
Para el segundo método descrito anteriormente, el compuesto de agente citotóxico y enlazador puede reaccionar con el CBA sin purificación. Alternativamente, se puede purificar el compuesto de agente citotóxico y enlazador antes de hacerse reacción con el CBA.
Se pueden preparar los inmunoconjugado de la segunda realización mediante un tercer método que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar el CBA con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol para formar un CBA modificado con un grupo reactivo con tiol enlazado a este; y
(b) hacer reaccionar el CBA modificado con el agente citotóxico.
Para el tercer método descrito anteriormente, la reacción en la etapa (b) se puede llevar a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina.
Los inmunoconjugados del quinto aspecto se pueden preparar mediante un cuarto método que comprende las etapas de hacer reaccionar el CBA, un compuesto citotóxico y un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol.
Para el cuarto método, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente que reacciona con imina.
Para el segundo, tercer o cuarto método, descritos anteriormente, el compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde X es halógeno; Jd-SH, -SSRd, o -SC (= O) Rg; Rd es fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxynitrophenyl, piridilo o nitropiridil; Rg es un alquilo; y las variables restantes son como se describieron anteriormente para la fórmula (a1) -(a10); y el agente citotóxico se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables son como se describen en cualquiera de las 8'al 12' y 17' realizaciones específicas y cualquier realización más específica descrita en el aquí.
Para los métodos segundo, tercero o cuarto descritos anteriormente, el compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol puede estar representado por cualquiera de las fórmulas (a1L) - (a10L) y el agente citotóxico puede estar representado por lo siguiente fórmula:
en donde las variables son como se describieron anteriormente en cualquiera de las variables específicas 13 a 17 y cualquier otra variable específica descrita aquí.
En un sexto aspecto, el inmunoconjugado de la presente invención comprende un anticuerpo oxidado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o polipéptido que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo enlazado covalentemente a un agente citotóxico descrito en el presente documento a través de uno o más grupos aldehído ubicados en el anticuerpo oxidado, fragmento de unión a antígeno o polipéptido. Los grupos aldehído se generan oxidando uno o más restos de 2-hidroxietilamina en los extremos N terminal del anticuerpo, fragmento de unión al antígeno o polipéptido. El resto 2-hidroxietilamina puede formar parte de un residuo de serina, treonina, hidroxilisina, 4-hidroxiornitina o ácido 2,4-diamino-5-hidroxi valérico; Se pueden generar los grupos aldehído oxidando el resto 2-hidroxietilamina de uno o más residuos serina del extremo N terminal ubicados en el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido (por ejemplo, 1, 2, 3 o hasta 4 residuos Ser en los extremos N terminal de las cadenas ligeras y/o cadenas pesadas).
En una 1' realización específica del sexto aspecto, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o un polipéptido descrito anteriormente;
W s es 1, 2, 3 o 4;
JCB' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un N-terminal de dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido con un grupo reactivo aldehído en Cys1, y se representa por lo siguiente fórmula:
s y h
SK m , — Kl.^ i
S '^ o - U H, ° “ 5 s2
. cío
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys1; Cys1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Zd1 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
R9 es -H o un alquilo(C1-C3);
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado un grupo ionizable Q;
r y r' son independientemente un número entero de 1 a 6;
W' es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6);
L es -NR9-(CRaRb)r"o está ausente; y
r” es un número entero de 0 a 6.
En una 2' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S1), Cys1 se representa mediante la fórmula (S1a); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' realización específica.
En una 3' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S1), Cys1 se representa mediante la fórmula (S1b); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' realización específica. Más específicamente, Rx3 es un alquilo (C2-C4).
En una 4' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S1), Ra y Rb son ambos H, y R5 y R9 son ambos H o Me; y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' o la 2' realización específica.
En una 5' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (S1), P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1', 2' y 4' realización específica. En una realización más específica, P se selecciona del grupo que consiste en Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9'tosil-Arg, Phe-N9 nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. Aun más específicamente, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 6' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S1), Q es -SO3M; y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1', 2', 4' o 5' realización específica.
En una 7'realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Ċ
5 o
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H, y cuando sea un enlace sencillo, X sea -H, e y es -OH o -SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e y es -H. En otra realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M.
En una 8' realización específica, los inmunoconjugados de la presente invención se representan mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o un polipéptido descrito anteriormente;
Jcb' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehido derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un extremo N terminal de dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido y un grupo reactivo aldehido en Cys2, y se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys2;
Cys2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
M es H+ o un catión;
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
L1 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys2;
Za2 está ausente, -C (=O) -NR9-, o -NR9-C (=O) -;
R9 es -H o un alquilo (C1-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o alquilo (C1-C3); y
q1 y r1 son cada uno independientemente un número entero de 0 a 10, siempre que q1 y r1 no sean ambos 0. En una realización más específica, Za2 está ausente; q1 y r1 son cada uno independiente, un número entero de 0 a 3, siempre que q1 y r1 no sean 0 y las variables restantes son tal como se describen anteriormente en la 8' realización. Incluso más específicamente, Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4 son todos -H.
En otra realización específica adicional, Za2 es -C(=O)-NH- o -NH9-C(=O)-; cada q1 y r1 es independientemente un número entero de 1 a 6 y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 8' realización específica. Incluso más específicamente, Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4 son todos -H.
En una 9' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (S2), Cys2 se representa mediante la fórmula (S2a); y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 8' realización específica o cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 10' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (S2), Cys2 se representa mediante la fórmula (S2b); y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 8' realización específica o cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 11' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (S2), -Li- se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R es H o -SO3M; y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 8', 9' o 10' realización específica o cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 12' realización específica, para inmunoconjugado de fórmula (S2), Re es H o Me; y Rx1 es -(CH2)p-(CRfRg) - y Rx2 es -(CH2)p-(CRfRg) -, en donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C4); y p es 0, 1 ,2 o 3. Más específicamente, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan entre -H y -Me.
En una13' realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Ċ 
5
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo o un doble enlace, siempre que cuando sea un doble enlace, X esté ausente e Y sea -H; y cuando es un enlace sencillo, X es -H; e Y es -OH o - SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M.
En una 14' realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o un polipéptido descrito anteriormente;
Jcb' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehido derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un extremo N terminal de dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido y un grupo reactivo aldehido en Cys3, y se representa por la siguiente fórmula:
en donde s i es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys3; Cys3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3);
L1 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys3;
Za2 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
R9 es -H o un alquilo(C1-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o un alquilo (C1-C3); y
q1 y r1 son cada independientemente un número entero de 0 a 10, siempre que q1 y r1 no sean ambos 0. En una realización más específica, Za2 se encuentra ausente; q1 y r1 son cada uno independiente, un número entero de 0 a 3, siempre que q1 y r1 no sean 0 y las variables restantes son tal como se describen anteriormente en la 14' realización específica. Incluso más específicamente, Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4 son todos -H.
En otra realización más específica, Za2 es -C(=O)-NH- o -NH9-C(=O)-; q1 y r1 son cada uno independientemente un número entero de 1 a 6 y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 14' realización específica. Incluso más específicamente, Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4 son todos -H.
En una 15' realización esecífica, para los inmunoconjugados de fórmula (S3), m' es 1 y tanto R1 como R2 son H y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 14' realización específica o cualesquiera realizaciones más específicas descritas aquí.
En una 16' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S3), m 'es 2; R1 y R2 son ambos Me; y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 14' realización específica o cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 17' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S3), -Li- se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es H o -SO3M y M es H+ o un catión.
En una 18' realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde DM se representa mediante la siguiente fórmula:
En una 19' realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37,
o un polipéptido descrito anteriormente;
Jcb' es un resto formado al hacer reaccionar un grupo aldehido derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un extremo N-terminal de dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido y un grupo reactivo aldehido en Cys4 y se representa por la siguiente fórmula:
en donde s i es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys4;
Cys4 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -NMe- en Cys4;
Zb1 y Zb2 están ambos ausentes, o uno de Zb1 y Zb2 está ausente y el otro es -CH2-O- o -O-CH2-;
Zb1' y Zb2' están cada uno independientemente ausentes, -CH2-O-, -O-CH2-, -NR9-C(=O)-CH2-, o -CH2-C(=O)-NR9-;
R9 es H o alquilo (C1-C3);
n1 y m1 son cada uno independientemente un número entero de 1 a 6;
uno de E1 y E2 es -C(=O)- y el otro es -NR9-; o uno de E1 y E2 es -C(=O)- o -NR9-, y el otro está ausente; P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos; y
Rb1, Rb2 , Rb3, Rb4, Rb5 y Rb6, en cada caso, son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3).
En una 20' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (S4), Rb1, Rb2 , Rb3, Rb4 , Rb5 y Rb6 son todos H; y el resto de las variables son como se describieron anteriormente en la 19' realización específica.
En una 21' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (S4), R9 es H; y el resto de las variables son como se describieron anteriormente en la 19' o 20' realización específica.
En una 22' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (S4), tanto Zb1' y Zb2 ' están ausentes; o Zb1' es -CH2-O- y Zb2 ' está ausente; o Zb1' es -CH2-C(=O)-NR9-; y Zb2' es -O-CH2 o está ausente y las variables restantes son tal como se describen anteriormente en la 19', 20' o 21' realización específica.
En una 23' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (S4), P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos; y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 19', 20', 21' o 22' realización específica. En una realización más específica, P se selecciona del grupo que consiste en Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala, y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 23' realización específica. Aun más específicamente, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 24' realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa por la siguiente fórmula:
ismo, en donde la DM se representa por la siguiente fórmula estructural:
En una 25' realización específica, para los inmunoconjugados de la sexta realización, M es H+, Na o K+, y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en cualquiera de la 1' a 24' realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En cualquiera de las 1' a 25' realizaciones específicas anteriores, el anticuerpo oxidado sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener 1, 2, 3 o hasta 4 restos de 2-hidroxietilamina del extremo N terminal oxidados a grupo(s) aldehído, para enlazar covalentemente a. El resto 2-hidroxietilamina del extremo N terminal puede ser parte de un residuo serina, treonina, hidroxilisina, 4-hidroxiornitina o ácido 2,4-diamino-5-hidroxivalérico, preferiblemente Ser o Thr. A efectos de simplificación, la descripción a continuación, que incluye la reacción de oxidación y cualquier conjugación posterior con enlazadores o agentes citotóxicos, puede hacer referencia a Ser como un ejemplo específico de tales restos 2-hidroxietilamina del extremo N terminal, pero en general debería interpretarse que hace referencia a todos los restos 2-hidroxietilamina del extremo N terminal. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un HCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38; y un LCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33, 35 o 41 (preferiblemente SEQ ID NO: 35). El anticuerpo sujeto o fragmento de unión al antígeno del mismo también puede comprender una HCVR Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 32, 38, 39, o 40. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo también puede comprender una región de cadena pesada de Ig (HC) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53 o 56; y un LCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33, 35 o 41 (preferiblemente SEQ ID NO: 35). El anticuerpo sujeto o fragmento de unión al antígeno del mismo también puede comprender una región de HC de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 48, 50, 53, 54, 56, 59, o 60 (preferiblemente SEQ ID NO: 53). En ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo N-terminal de las SEQ ID NOs: 34, 38, 50, 53, 54 o 56 es Phe, mientras que en otras ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo N terminal de las SEQ ID NOs: 34, 38, 50, 53, 54 o 56 es Val.
Se pueden preparar los inmunoconjugados del sexto aspecto mediante un primer método que comprende hacer reaccionar el CBA que tiene un aldehído en el extremo N-terminal descrito en el sexto aspecto de la invención con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo aldehído.
Los inmunoconjugados del sexto aspecto se pueden preparar mediante un segundo método que comprende hacer reaccionar el CBA que tiene un aldehído N-terminal descrito en el sexto aspecto de la invención con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo aldehído para formar un CBA modificado que tiene un enlazador unido al mismo, seguido de la reacción del CBA modificado con un agente citotóxico.
Los inmunoconjugados del sexto aspecto se pueden preparar mediante un tercer método que comprende poner en contacto el CBA que tiene un aldehído N terminal descrito en el sexto aspecto de la invención con un agente citotóxico seguido de la adición de un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo con aldehído.
Los inmunoconjugados del sexto aspecto se pueden preparar mediante un cuarto método que comprende las etapas de:
(a) oxidar el CBA que tiene un resto 2-hidroxietilamina en el extremo N terminal (p. ej., Ser/Thr) con un agente oxidante para formar un CBA oxidado que tiene un grupo aldehído del extremo N terminal; y
(b) hacer reaccionar el CBA oxidado que tiene el grupo aldehído en el extremo N con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo aldehído.
Los inmunoconjugados del sexto aspecto se pueden preparar mediante un quinto método que comprende las etapas de:
(a) oxidar el CBA que tiene un resto 2-hidroxietilamina en el extremo N terminal (p. ej., Ser/Thr) con un agente oxidante para formar un CBA oxidado que tiene un grupo aldehído del extremo N terminal;
(b) hacer reaccionar el CBA oxidado que tiene el grupo aldehído del extremo N terminal con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo aldehído para formar un CBA modificado que tiene un enlazador unido al mismo, seguido de la reacción del CBA modificado con un agente citotóxico.
Los inmunoconjugados del sexto aspecto se pueden preparar mediante un sexto método que comprende las etapas de:
(a) oxidar el CBA que tiene un resto 2-hidroxietilamina en el extremo N terminal (p. ej., Ser/Thr) con un agente oxidante para formar un CBA oxidado que tiene un grupo aldehído del extremo N terminal;
(b) poner en contacto el CBA oxidado que tiene el grupo aldehído N-terminal con un agente citotóxico seguido de la adición de un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo aldehído.
Para el primer o cuarto método descrito anteriormente, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo aldehido puede estar representado por la siguiente fórmula:
o un sal aceptable del mismo, en donde JCBse representa mediante la siguiente fórmula:
y las variables restantes son como se ha descrito anteriormente en una cualquiera de las 1'a 7' y 25'de realizaciones especificas y cualquiera de las realizaciones más especificas descritas aqui.
Para el primer o cuarto método descrito anteriormente, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo aldehido puede estar representado por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Jcb es como se describe anteriormente y las variables restantes son como se describen en una cualquiera de las 19' al 25' realizaciones especificas y cualquiera de las realizaciones más especificas descritas aqui.
Para el segundo, tercer, quinto o sexto método descrito anteriormente, el compuesto enlazador puede estar representado por la siguiente fórmula:
en donde Jd-SH, -SSRd, o -SC (=O) Rg; Rdes fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxynitrophenyl, piridilo o nitropiridil; Rges un alquilo; JcBes como se describió anteriormente; el agente citotóxico se representa mediante la siguiente fórmula:
y las variables restantes son como se describió anteriormente en una cualquiera de las 8'a 13' y 25' realizaciones específicas y cualquiera de las realizaciones más específica descritas aquí.
Para el segundo, tercer, quinto o sexto método descrito anteriormente, el compuesto enlazador puede estar representado por la fórmula (Lsa) anterior; el compuesto citotóxico puede estar representado por la siguiente fórmula:
y las variables restantes son como se describen en cualquiera de 14' a 18' y 25' realizaciones específicas y cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
Para el primer o cuarto método descritos anteriormente, el agente citotóxico se puede hacer reaccionar con un reactivo con imina, tal como NaHSÜ3, para formar un agente citotóxico modificado antes de reaccionar con el CBA oxidado que tiene el aldehído en el extremo N-terminal. El agente citotóxico modificado no necesita purificarse antes de la reacción con el CBA oxidado que tiene el aldehído del extremo N terminal. El agente citotóxico modificado se puede purificar antes de la reacción con el CBA oxidado que presenta el aldehído del extremo N terminal.
Para el segundo o quinto método descrito anteriormente, el agente citotóxico se puede hacer reaccionar con un reactivo que reacciona con imina, tal como NaHSÜ3, para formar un agente citotóxico modificado antes de la reacción con el c Ba modificado que tiene un enlazador que se enlaza al mismo. El agente citotóxico modificado se puede purificar antes de la reacción con el CBA modificado al que tiene un enlazador que se enlaza al mismo. Alternativamente, el agente citotóxico modificado se puede no purifiar antes de la reacción con el CBA oxidado que tiene el aldehído del extremo N terminal.
Para el tercer o sexto método descrito anteriormente, se lleva a cabo la reacción del CBA oxidado, el agente citotóxico y el compuesto enlazador en presencia de un reactivo que reacciona con imina, tal como NaHSÜ3.
Se puede usar cualquier agente oxidante en la etapa (a) del cuarto, quinto o sexto método descrito anteriormente. El agente oxidante puede ser un peryodato. Más específicamente, el agente oxidante es peryodato de sodio.
Se puede usar un exceso de equivalentes molares del agente oxidante respecto al CBA. Se puede usar aproximadamente 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 o 5-10 equivalentes molares del agente oxidante. Se pueden usar aproximadamente 10 o aproximadamente 50 equivalentes del agente oxidante. Cuando se usa una gran cantidad del agente oxidante, se emplea un tiempo de reacción breve para evitar la sobreoxidación. Por ejemplo, cuando se utilizan 50 equivalentes del agente oxidante, la reacción de oxidación se lleva a cabo durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos. Alternativamente, cuando se usan 10 equivalentes del agente oxidante, la reacción se
lleva a cabo durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas. Se pueden usar 5-10 equivalentes molares del agente oxidante y la reacción de oxidación se puede llevar a cabo durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos (p. ej., aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 minutos).
Un catalizador puede estar presente en la reacción en el primer, segundo o tercer método descrito anteriormente o en la reacción de la etapa (b) en el cuarto, quinto o sexto método descrito anteriormente. Se puede usar cualquier catalizador adecuado en la técnica. El catalizador es una anilina o una anilina sustituida. Los catalizadores anilina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anilina, o-fenilendiamina, m-fenilendiamina, ácido 3,5-diaminobenzoico, pfenilendiamina, 2-metil-p-fenilendiamina, N-metil-p-fenilendiamina, o-aminofenol, m-aminofenol, p-aminofenol, pmetoxianilina, ácido 5-metoxi-antranílico, ácido o-aminobenzoico y 4-aminofenetilalcohol. El catalizador puede ser 4-aminofenetilalcohol. La reacción de la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5. La reacción de la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5,0.
Para la reacción en el primer, segundo o tercer método descrito anteriormente o en la reacción de la etapa (b) en el cuarto, quinto o sexto método descrito anteriormente, se puede usar el compuesto que tiene un grupo reactivo aldehído (p. ej., el agente citotóxico o el compuesto enlazador descrito en el presente documento) en exceso molar respecto al agente de unión celular oxidado (p. ej., anticuerpo oxidado o parte de unión al antígeno oxidado). La relación para el compuesto que tiene un grupo reactivo aldehído respecto al agente de unión celular oxidado es entre aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1,1:1, entre aproximadamente 5:1 a aproximadamente 2:1. La relación puede ser aproximadamente 4:1.
En un séptimo aspecto, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o polipéptido descrito anteriormente, enlazado covalentemente a un agente citotóxico descrito en el presente documento a través del grupo tiol (-SH) de uno o más residuos de cisteína ubicados en el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido.
En una '''realización específica, el inmunoconjugado del séptimo aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA (CyC1)wc(C1),
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, enlazado covalentemente a CyC1 através de un residuo de cisteína; wC es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6); y,
Lc se representa mediante:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA, y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo C(=O) en CyC1, en donde:
R19 y R20, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
m” es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo (C1-C3).
En una 2' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 se representa por la fórmula (C1a); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' realización específica.
En una 3' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 se representa por la fórmula (C1b); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' realización específica.
En una 4' realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 se representa por la fórmula (C1a); Ra y Rb son ambos H; y R5 es H o Me; y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 1' o la 2' realización específica.
En una 5' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 1', 2' o 4' realización específica. En una realizción más específica, P se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En otra realización más específica, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 6a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), Q es -S O 3M; y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 1a, 2a, 4a o 5a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En una 7a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (Ci), tanto Recomo R2oson H y m” es un número entero de 1 a 6, y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a o 6a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas allí aquí.
En una 8a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), -L-Lc- se representa mediante la siguiente fórmula:
y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a o 7a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En una 9arealización específica, el inmunoconjugado del séptimo aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H, y cuando sea un enlace sencillo, X sea -H e Y sea -OH o -SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M.
En una 10a realización específica, el inmunoconjugado de la tercera realización se representa por la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, enlazado covalentemente a CyC2 através de un residuo de cisteína; WC es 1 o 2;
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W 'es -NRe';
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
Lc' se representa mediante la siguiente fórmula:
o
en donde:
s i es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC2;
Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
q y r, en cada caso, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos.
En una realización más específica, q y r son cada uno independientemente un número entero de entre 1 y 6, más específicamente, un número entero de entre 1 y 3. aún más específicamente, R10, R11, R12 y R13 son todos H.
En otra realización más específica, m y n son cada uno independientemente un número entero de entre 1 y 6, más específicamente, un número entero de entre 1 y 3. Aún más específicamente, R19, R20, R21 y R22 son todos H.
En una 11' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (C2), CyC2 se representa por la fórmula (C2 a); y las variables restantes son como se describieron anteriormente en la 10' realización específica o en cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 12' realización específica, para inmunoconjugados de fórmula (C2), CyC2 se representa por la fórmula (C2b); y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 10' realización específica.
En una 13' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos y las variables restantes son tal como se describieron en la 10', 11' o 12' realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí. En una realización más específica, P' se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En otrarealización más específica, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 14' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), -LC'- se representa mediante la siguiente fórmula:
o
En una 15' realización específica, para los inmunoconjugados de (C2), Re es H o Me; Rxi es -(CH2)p-(CRfRg)- y Rx2 es -(CH2)p-(CRfRg)-, en el que Rf y Rg son independientemente -H o un alquilo (C1-C4) y p es 0, 1, 2 o 3; y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 10 ', 11', 12', 13' o 14' realización específica. Más específicamente, Rfy Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me.
En una 16' realización específica, el inmunoconjugado de la tercera realización se representa mediante la siguiente fórmula:
o
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H, y cuando sea un enlace sencillo, X sea - H, e y es -OH o -SO3M. En una realización más específica, la línea doble - - entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e y es -H. En otra realización específica, la línea doble - - entre N y C representa un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M.
En una 17' realización específica, el inmunoconjugado de la tercera realización se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
o un polipéptido descrito anteriormente, enlazado covalentemente a CyC3 através de un residuo de cisteína; W c es 1 o 2;
CyC3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
Lc' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s i es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC3; Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9 , R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3); q y r, en cada caso, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos.
En una realización más específica, q y r son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero entre 1 y 3. Incluso más específicamente, R10, R11, R12 y R13 son todos H.
En otra realización más específica, m y n son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero de 1 a 3. Incluso más específicamente, R19, R20, R21 y R22 son todos H.
En una 18' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 17' realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí. En una realización más específica, P' se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, y Met-Ala. En otra realización más específica, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 19' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), -Lc'- se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde M es H o un catión; y el resto de variables son como se describieron anteriormente en la 17' o 18' realización específica o en cualquier realización más específica descrita aquí.
En una 20' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), m' es 1 y Ri como R2 son ambos H y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 17', 18' o 19' a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En una 21' realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), m' es 2 y R1 y R2 son ambos Me y las variables restantes son tal como se describieron anteriormente en la 17', 18' o 19' realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En una 22'realización específica, el inmunoconjugado del séptimo aspecto se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la DM es un resto de fármaco representado por la siguiente fórmula:
En una 23' realización específica, para los inmunoconjugados de la tercera realización, M es H+, Na o K+, y las variables restantes son tal como se describieron en cualquiera de la 1' a 22' realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
En cualquiera de las realizaciones específicas de la 1' a la 23' anteriores, el anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de la cadena pesada de inmunoglobulina (HC) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 54; y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo, o polipéptido que comprende el anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene un residuo de Cys en una ubicación correspondiente a la Cys modificada en el dominio CH3 de la cadena pesada (es decir, del 5' al último residuo) de las SEQ ID NOs: 54. El anticuerpo sujeto o fragmento de unión al antígeno del mismo también puede comprender una HCVR Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33, 37, o 41 (preferiblemente SEQ ID NO: 37). El anticuerpo sujeto o fragmento de unión a antígeno del mismo también puede comprender una región de cadena pesada de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 56; y un LCVR de Ig que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 33, 37 o 41 (preferiblemente SEQ ID NO: 37). En ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo N terminal de las SEQ ID NOs: 54 y 56 es Phe, mientras que en otras ciertas realizaciones, el segundo residuo del extremo N terminal de las SEQ ID NOs: 54 y 56 es Val.
Los inmunoconjugados del séptimo aspecto descrito anteriormente (p. ej., inmunoconjugados de cualquiera de las 1' a 23' realizaciones específicas o cualquier realización más específica descrita aquí) se pueden preparar haciendo reaccionar el CBA que tiene una o más cisteínas libres con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo con tiol descrito en el presente documento.
El agente citotóxico que tiene un grupo reactivo con tiol se puede representar por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde -Lccse representa mediante la siguiente fórmula:
en donde las variables son como se describió anteriormente en una cualquiera de la 1' a 9' y 23' realizaciones específicas cualquiera o más realizaciones específicas descritas aquí.
El agente citotóxico que tiene un grupo reactivo con tiol se puede representar por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que Lcc se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde las variables son como se describió anteriormente en uno cualquiera de los 10' al 6' de y 23' realizaciones específicas o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
El agente citotóxico que tiene un grupo reactivo con tiol se puede representar por la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Lcc se describe anteriormente y el resto las variables son como se describen anteriormente en uno cualquiera de las 17' a 23' realizaciones específicas o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas aquí.
Se usan los solventes orgánicos en la reacción del CBA y el agente citotóxico para solubilizar el agente citotóxico. Los disolventes orgánicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, dimetilacetamida (DMA), propilenglicol, etc. La reacción del CBA y el agente citotóxico se puede llevar a cabo en presencia de DMA y propilenglicol.
4. Composiciones y métodos de uso
La presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos sujeto o fragmentos de unión al antígeno del mismo, o inmunoconjugados del mismo (p. ej., conjugados de Fórmulas (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) y (C3)) descritos en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención también incluye una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos sujeto o fragmentos de unión al antígeno del mismo, o conjugado de Fórmulas (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) y (C3)) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y comprende además un segundo agente terapéutico. Las presentes composiciones son útiles para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo en un mamífero (p. ej., humano), incluyendo cáncer hematológico, leucemia o linfoma.
En particular, la presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes de unión a CD123 o inmunoconjugados de estos descritos en presente documento. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas son útiles para inhibir el crecimiento tumoral y tratar el cáncer en pacientes humanos, incluyendo cáncer hematológico, leucemia o linfoma.
Las formulaciones se pueden preparar para su almacenamiento y uso mediante la combinación de un anticuerpo purificado o inmunoconjugado de este de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (p. ej., vehículo, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20.a Edición Mack Publishing, 2000). Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones no tóxicos tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (p. ej. , cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (p. ej., menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos); proteínas como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes
quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y tensioactivos no iónicos como TWEEN o polietilenglicol (PEG) .
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documentp se pueden administrar en cualquier cantidad de formas para tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (como en las membranas mucosas, incluido el parto vaginal y rectal), tales como parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos; pulmonar (p. ej., por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico y transdérmico); oral; o parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal (p. ej., intratecal o intraventricular). La administración puede ser intravenosa. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también se pueden usar in vitro o ex vivo.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede combinar en una formulación de combinación farmacéutica o un régimen de dosificación como la terapia de combinación, con un segundo compuesto, tal como uno que se sabe que es eficaz en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno de interés. El segundo compuesto puede ser un agente anticanceroso. La administración del segundo compuesto y un inmunoconjugado de la invención puede resultar en una mejor eficacia en comparación con la administración del inmunoconjugado solo. El segundo compuesto se puede administrar a través de cualquier cantidad de formas, que incluyen, por ejemplo, administración tópica, pulmonar, oral, parenteral o intracraneal. La administración puede ser oral. La administración puede ser intravenosa. La administración puede ser tanto oral como intravenosa.
Un anticuerpo o inmunoconjugado también se puede combinar en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación como terapia de combinación con un analgésico u otros medicamentos.
Un anticuerpo o inmunoconjugado se puede combinar en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anticanceroso. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o el régimen de dosificación puede presentar actividades complementarias al ADC de la combinación, tal que no se afecten negativamente entre sí. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a CD123 y el segundo agente anticanceroso.
Otro aspecto de la invención provee un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD123 que comprende poner la célula en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este de la invención, o el polipéptido de la invención, o el inmunoconjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención. La presente invención también incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; un polipéptido; un inmunoconjugado; o una composición farmacéutica descrita en el presente documento para su uso en un método para tratar un sujeto que tiene cáncer o para su uso en un método para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, en donde las células del cáncer o el trastorno de proliferación celular expresan CD123. El método puede ser para tratar a un mamífero (p. ej., un ser humano) que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o inmunoconjugados (p. ej., conjugados de fórmulas (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) y (C3)) descritos en el presente documento, o una composición de los mismos, solo o en combinación con un segundo agente terapéutico.
En ciertas realizaciones, el crecimiento celular anormal o trastorno proliferativo en un mamífero es una enfermedad o afección caracterizada por la expresión de CD123 o asociada a ella, tal como cáncer, incluyendo cáncer hematológico, leucemia o linfoma. En ciertas realizaciones, el trastorno proliferativo es un cáncer de un órgano linfático o una neoplasia maligna hematológica.
Por ejemplo, el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (LMA, que incluye LMA con baja CD33, LMA con P-glicoproteína positiva, LMA reincidente o LMA refractaria), leucemia mielógena crónica (LMC), que incluye la crisis blástica de LMC y el oncogén de Abelson asociado con LMC (translocación de Bcr-ABL), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfoblástica aguda B o leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (B-LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), que incluye el síndrome de Richter o la transformación de LLC de Richter, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia promielocítica aguda (LPA), enfermedad linfoproliferativa crónica de linfocitos B (B-CLPD), leucemia linfocítica crónica atípica (preferiblemente con una expresión de CD11c marcada), neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blástica (BPDCN), linfomas no Hodgkin (LNH), que incluye leucemia de células del manto (MCL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica y linfoma de Burkitt.
En ciertas realizaciones, la B-LLA es una B-LLA de CD19 positivo. En otras ciertas realizaciones, la B-LLA es una B-LLA de CD19 negativo.
En ciertas realizaciones, el cáncer presenta al menos un factor de pronóstico negativo, p. ej., sobreexpresión de P-glicoproteína, sobreexpresión de EVI1, una alteración de p53, mutación de DNMT3A, duplicación en tándem interna de FLT3.
En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos sujeto o fragmentos de unión al antígeno de estos o inmunoconjugados (p. ej., conjugados de fórmulas (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) y (C3)) descritos en el presente documento, o una composición de estos, sola o en combinación con un segundo agente terapéutico, preferencialmente inhibe la proliferación de células madre leucémicas (LCS), progenitores leucémicos (LP) y/o blastos leucémicos respecto a células madre hematopoyéticas (HSC) normales. En ciertas realizaciones, el valor de IC50 o la concentración media máxima de los agentes sujetos anteriores para inhibir la proliferación de células madre leucémicas (LSC), progenitores de leucemia (LP) y/o blastos leucémicos, es de al menos 10, 20, 30, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 150-, 300-, 500-veces o más bajo que el de las células madre hematopoyéticas normales (HSC).
Una terapia antileucémica de la invención no solo necesita apuntar y destruir blastos leucémicos, sino que preferiblemente también apunta y destruye los progenitores leucémicos (LP) y las ventas de tallos leucémicos (LSC). La terapia puede ser menos selectiva contra las HSC normales. En ciertas realizaciones, la expresión de CD123 en LSC, LP y blastos de leucemia es mucho mayor (p. ej., al menos 20-25 veces mayor en LSC, progenitores de LMA y blastos de LMA) en comparación con los linfocitos normales (que pueden ser casi negativos). En ciertas realizaciones, los niveles de expresión de CD123 en LP y LSC son al menos tan elevados como los de los blastos leucémicos.
También se describe en el presente documento un método para inducir la muerte celular en poblaciones de células seleccionadas que comprende poner en contacto células diana o tejido que contiene células diana con una cantidad eficaz de los anticuerpos objeto o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o inmunoconjugados de la presente invención. Las células diana son células a las que se puede unir el agente de unión a la célula de los conjugados.
Si se desea, se pueden administrar otros agentes activos, como otros agentes antitumorales, junto con el conjugado.
Las terapias contra el cáncer y sus dosificaciones, vías de administración y uso recomendados se conocen en la técnica y se describen en tal literatura como el Physician's Desk Reference (PDR). El PDR describe dosificaciones de los agentes que se han usado en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y las dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos antes mencionados que son terapéuticamente eficaces dependerán del cáncer particular que se trate, la extensión de la enfermedad y otros factores conocidos por el médico experto en la técnica y que el médico los puede determinar. Un experto en la técnica puede estudiar el PDR, usando uno o más de los siguientes parámetros, para determinar el régimen de dosis y las dosificaciones de los conjugados y agentes quimioterapéuticos que se pueden usar de acuerdo con las enseñanzas de la esta invención. Estos parámetros incluyen: índice completo; Fabricante; Productos (por nombre de medicamento de la compañía o marca registrada); Índice de categoría; Índice genérico/químico (nombres de medicamentos comunes que no son marcas comerciales); Imágenes en color de medicamentos; Información del producto, de acuerdo con el etiquetado de la FDA; Información química; Función/acción; Indicaciones y contraindicaciones; Investigación de ensayos, efectos secundarios, advertencias.
Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para matar células enfermas o malignas: tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para matar células T competentes y prevenir injerto contra enfermedad del huésped (EICH); tratamientos de cultivos celulares para matar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para matar variantes que expresan un antígeno no deseado.
Las condiciones de uso no clínico in vitro pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica.
Los ejemplos de uso clínico ex vivo son retirar células tumorales o células linfoides de la médula ósea antes del transplante autólogo en el tratamiento contra el cáncer o el tratamiento de enfermedades autoinmunes o eliminar linfocitos T y otras células linfoides de tejido o médula ósea alogénica o autóloga antes del transplante para prevenir la EICH. El tratamiento se puede llevar a cabo de la siguiente manera. Se recoge la médula ósea del paciente u otro individuo y después se incuba en medio que contiene suero al cual se le añade el agente citotóxico de la invención, las concentraciones varían entre aproximadamente 10 M y aproximadamente 1 pM, durante entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37 °C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, las determina fácilmente un experto en la técnica. Después de la incubación, las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por vía intravenosa de acuerdo con los métodos conocidos. En circunstancias donde el paciente recibe otro tratamiento como una secuencia de quimioterapia ablativa u otra irradiación corporal total entre el momento de la extracción de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de la médula tratadas se almacenan en estado congelado en nitrógeno líquido mediante equipos médicos estándar.
Para uso clínico in vivo, los compuestos citotóxicos o conjugados de la invención se pueden suministrar como una solución o un polvo liofilizado que se somete a prueba para determinar la esterilidad y los niveles de endotoxina.
Los portadores, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos y los pueden determinar los expertos en la técnica según lo amerite la situación clínica. Ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) Solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene o no contiene sin aproximadamente 1 mg/mL a 25 mg/mL de albúmina de suero humano, (2) 0,9% de
solución salina (0,9% p/v de NaCI), (3) 5% (p/v) de dextrosa y también puede contener un antioxidante, tal como triptamina y un agente estabilizante, tal como Tween 20.
El método de la invención para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas, para inhibir el crecimiento celular y/o para tratar el cáncer, se pone en práctica in vitro, in vivo o ex vivo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Generación de anticuerpos monoclonales de ratón contra antígeno CD123 humano y cynomolgus
Para producir anticuerpos anti-CD123 murinos, se inyectaron ratones hembra BALB/c de tipo salvaje (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) por vía subcutánea con CD123 humano que expresa la línea celular estable 300-19, que es una línea celular pre-B derivada de BALB/c (M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355), en PBS a una dosis de 5 x 106 células/ratón cada 2 semanas durante cinco veces. Tres días antes de sacrificarse para la generación de hibridomas, los ratones inmunizados recibieron una inyección intraperitoneal de otra dosis de antígeno. Se recogió el bazo del ratón de conformidad con los protocolos de animales estándares y se molió entre dos portaobjetos microscópicos esmerilados estériles para obtener una suspensión celular única en un medio RPMI-1640. Después de que los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis ACK, las células del bazo se mezclaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (células P3) (JF Kearney et al., 1979, J. Immunol, 123: 1548-1550) en una proporción de 1 células P3: 3 células de bazo. La mezcla de células de bazo y células P3 se lavó y trató con pronasa en medio de fusión (manitol 0,3 M/D-sorbitol, CaCl20,1 mM, MgCb 0,5 mM y de BSA 1 mg/ml) a temperatura ambiente durante 3 min. La reacción se detuvo mediante la adición de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen); después se lavaron las células, se resuspendieron en 2 mL de medio de fusión frío y se fusionaron con una máquina de electrofusión BTX ECM 2001 (Aparato de Harvard). Las células fusionadas se añadieron suavemente al medio de selección RPMI-1640 que contiene hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma Aldrich), se incubaron durante 20 minutos a 37 °C y después se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano a 200 pL/pocillo. Después, las placas se incubaron en una incubadora con CO2 al 5% a 37 °C hasta que los clones de hibridoma estuvieron listos para el análisis del anticuerpo. También se pueden usar otras técnicas de inmunización y producción de hibridomas, incluyendo las descritas en J. Langone y H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Tomo 121, Immunochemical Techniques, Parte I, Academic Press, Florida) y E. Harlow y D. Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY).
Análisis y selección del hibridoma
El análisis del hibridoma se hizo usando ensayo de unión de citometría de flujo con CD123 humano que expresa las líneas celulares 300-19 estables y células 300-19 de tipo salvaje. En resumen, las células 300-19 de tipo salvaje se etiquetaron primero con CellTraceTM DDAO-SE rojo intenso (Invitrogen), se mezclaron con células sin tratar en una relación de 1:1 y se incubaron con el sobrenadante de hibridoma durante 2 horas en hielo. Las células se lavaron después, se incubaron con IgG antirratón marcada con PE (Jackson Immunoresearch), se lavaron, se fijaron con formalina y se analizaron con FACS Array (BD Bioscience). El hibridoma con reactividad específica al antígeno CD123 humano se expandió y los sobrenadantes se volvieron a cribar mediante un ensayo de unión por citometría de flujo utilizando tres líneas celulares independientes: CD123 humano que expresa la línea celular estable 300-19, cynomolgus CD123 que expresa la línea celular 300-19 estable y la línea celular 300-19 tipo salvaje. Se subclonó adicionalmente el hibridoma con unión positiva a antígenos CD123 humano y cynomolgus pero negativa en células 300-19 de tipo salvaje mediante dilución limitada. Se seleccionó un subclon de cada hibridoma, el que demostró unión específica a antígenos CD123 cynomolgus y humano, para su análisis posterior.
Se llevó a cabo un total de seis fusiones durante el transcurso de la esta investigación. Se analizaron aproximadamente 6000 hibridomas, se generaron 33 hibridomas específicos para antígenos CD123 cynomolgus y humanos y se subclonaron 18 hibridomas. Se cultivaron los subclones estables y se identificó el isotipo del anticuerpo monoclonal con reactivos isotipados de IgG de ratón comerciales (tal como el kit de isotipado de anticuerpo monoclonal de ratón IsoStrip de Roche Diagnostics GmbH, Alemania, Producto No. 11493027001).
Purificación de anticuerpos
Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes de subclones de hibridoma usando métodos estándar, tal como, por ejemplo cromatografía de la Proteína A o G (Proteína A o G HP de HiTrap, 1 mL, Amersham Biosciences). Brevemente, el sobrenadante se preparó para la cromatografía mediante la adición de 1/10 volumen de tampón Tris/HCl 1 M, pH 8.0. El sobrenadante con pH ajustado se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 pm y se cargó en una columna equilibrada con el tampón de unión (PBS, pH 7,3). La columna se lavó con tampón de unión hasta que se obtuvo un punto de referencia estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con tampón de ácido acético 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M, pH 2,8, usando un caudal de 0,5 mL/min. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,25 mL y se neutralizaron mediante la adición de 1/10 de volumen de Tris/HCl 1 M, pH 8,0. La(s) fracciones pico se dializaron durante la noche dos veces contra 1 x PBS y se esterilizaron al filtrarlas a través de una membrana de filtro de 0,2 pm. El anticuerpo purificado se cuantificó mediante absorbancia a A280.
Las fracciones de proteína A purificadas se pulieron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico (IEX) con cromatografía de amonio cuaternario (Q) para anticuerpos murinos. Brevemente, las muestras de la
purificación de proteína A se intercambiaron con tampón en tampón de unión (Tris 10 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 8,0) y se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm. La muestra preparada se cargó después en una resina Q fast flow (GE Lifesciences) que se equilibró con tampón de unión a una velocidad de flujo de 120 cm/hr. Se eligió un tamaño de columna que tuviera suficiente capacidad para unir todos los MAb en la muestra. La columna se lavó después con un tampón de unión hasta que se obtuvo un punto de referencia estable sin absorbancia a 280 nm. Se eluyó el anticuerpo al iniciar un gradiente de cloruro de sodio 10 mM a 500 mM en volumen de columna (CV) 20. Se recogieron las fracciones de pico con base en la medida de absorbancia a 280 nm (A280). Se evaluó el porcentaje de monómero con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en un gel TSK G3000SWXL, 7,8 x 300 mm con una columna de guarda SWXL, 6,0 x 4 0 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) mediante un sistema Agilent HPLC 1100 (Agilent, Santa Clara, CA ). Se agruparon las fracciones con contenido de monómero superior a 95%, el tampón se intercambió a PBS (pH 7,4) usando un sistema TFF y se esterilizaron mediante filtración a través de una membrana de filtro de 0,2 pm. Se determinó la concentración de IgG del anticuerpo purificado mediante A280 usando un coeficiente de extinción de 1,47. También se usaron métodos alternativos tales como cerámica hidroxiapatita (CHT) para pulir los anticuerpos con buena selectividad. Se usaron resinas CHT tipo II con tamaño de partícula de 40 pm (Bio-Rad Laboratories) con un protocolo similar al descrito para la cromatografía de IEX. El tampón de unión para CHT corresponde a fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 y el anticuerpo se eluyó con un gradiente de fosfato de sodio 20-160 mM sobre 20 CV.
Ejemplo 2 Clonación y secuenciación de las regiones Vl y V h de los anticuerpos anti -CD123
Clonación de las regiones Vl y Vh
Se preparó ARN celular total a partir de 5 x 106 células de los hibridomas CD123 usando un kit RNeasy (QIAgen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente se sintetizó ADNc a partir de ARN total utilizando el kit de síntesis de SuperScript II cDNA (Invitrogen).
Los procedimientos de PCR para amplificar los ADNc de la región variable del anticuerpo derivados de células de hibridoma se basaron en los métodos descritos en Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233: 167-77) y Co et al. ((1992) J Immunol. 148: 1149-54). Las secuencias de Vl y Vh se amplificaron mediante cebadores degenerados en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante de IgG1 o kappa murina, respectivamente, en el extremo 3'. Los amplicones purificados se enviaron al Beckman Coulter Genomics para su secuenciación.
Dado que los cebadores degenerados usados para clonar las secuencias de ADNc de Vl y Vh alteran el extremo 5', fueron necesarios esfuerzos adicionales de secuenciación para verificar las secuencias completas de ADNc. Las secuencias preliminares se ingresaron en una búsqueda del sitio IgBlast de la NCBI para identificar las secuencias de línea germinal murina de la cual se derivaron las secuencias de anticuerpo. Se diseñaron después cebadores de PCR para aparearse con la secuencia líder unida a la línea germinal del anticuerpo murino de modo que esta nueva reacción de PCR produjera una secuencia de ADNc de región variable completa, inalterada por los cebadores de PCR.
Determinación de masa para confirmación de secuencia
Las secuencias de ADNc de región variable obtenidas para cada uno de los anticuerpos anti-CD123 se combinaron con secuencias de región constante de línea germinal para obtener secuencias de ADNc de anticuerpo de longitud completa. Los pesos moleculares de las cadenas pesada y ligera se calcularon después a partir de las traducciones de las secuencias de ADNc y se compararon con los pesos moleculares obtenidos a partir de los análisis de LC/MS de los anticuerpos anti-CD123 murinos purificados. Los pesos moleculares observados para cada cadena pesada y ligera coincidieron con los valores esperados.
Ejemplo 3 Humanización de anticuerpos
Expresión del anticuerpo recombinante
Las secuencias de aminoácidos de región variable confirmadas para los anticuerpos CD123 murinos se optimizaron con codones, se sintetizaron y se clonaron en marco con regiones constantes de anticuerpo humano mediante Blue Heron Biotechnology a fin de construir versiones quiméricas de los anticuerpos CD123. Los vectores, las regiones constantes y los esquemas de clonación utilizados para los anticuerpos CD123 quiméricos fueron idénticos a los utilizados para los anticuerpos CD123 humanizados descritos a continuación. El anticuerpo quimérico chCD123-6 está compuesto por las secuencias de la región variable de ratón de las SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente, junto con las secuencias constantes de IgG1 y Kappa humanas para las cadenas pesada y ligera, respectivamente. La región variable de cadena ligera se clonó en los sitios EcoRI y BsiWI del plásmido pAbKZeo y la región variable de cadena pesada se clonó en los sitios HindIII y Apa1 del plásmido pAbG1Neo. Estos constructos de expresión fueron producidas en forma transitoria ya sea en células HEK-293T adherentes mediante células HEK-293T adaptadas a la suspensión con un procedimiento de PEI modificada en matraces de agitación. Las transfecciones transitorias de PEI se realizaron como se describió anteriormente (Durocher et al., Nucleic Acids Res. 30 (2): E9 (2002)), excepto que las células HEK-293T se cultivaron en Freestyle 293 (Invitrogen) y se dejó el volumen de cultivo. sin diluir después de la adición de los complejos PEI-ADN. Se incubaron las transfecciones durante una semana y después se purificaron los sobrenadantes eliminados mediante cromatografía de proteína A estándar seguida de procedimientos de cromatografía de pulido.
Humanización de anticuerpos
El anticuerpo CD123-6 murino se humanizó usando procedimientos de injerto de región determinante complementaria (CDR) sustancialmente como se describe en Jones et al., Nature 321: 604-608, 1986, Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988., la Patente de EE.UU. No. 5,225,539 y la Patente de EE.UU. No. 5,585,089. Generalmente el injerto de CDR consiste en reemplazar las regiones marco Fv (FR) de un anticuerpo de ratón con regiones marco Fv de anticuerpo humano al tiempo que se conservan los residuos CDR de ratón críticos para las propiedades de unión al antígeno específicas del anticuerpo original. Los CDR ejemplares del anticuerpo CD123-6 conforme al esquema de numeración de Kabat y a las definiciones de CDR de Kabat son tal como se indican en la Tabla A a continuación.
Tabla A
El proceso de injerto de CDR comienza con la selección de marcos aceptores humanos adecuados, típicamente los derivados de genes de anticuerpo humano que comparten la homología de secuencia más elevada con el anticuerpo murino original. Las secuencias de cadena ligera y pesada de la línea germinal de inmunoglobulina humana con la mayor homología con el anticuerpo CD123-6 murino se identificaron utilizando la herramienta interactiva, DomainGapAlign, del International ImMunoGeneTics Information system® (IMGT (http column double slash imgt dot cines dot fr slash) como se describe en Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res. 38: D301-307 (2010). Las secuencias de la línea germinal humana seleccionadas como estructuras aceptoras para los dominios Vl y Vh del anticuerpo CD123-6 fueron IGKV1-16 * 01 e IGHV1-46 * 03, respectivamente.
El alineamiento de secuencia entre la parte relevante de la secuencia Vl de muCD123-6 original, la secuencia de la línea germinal humana correspondiente IGKV1-16 * 01 y las secuencias huCD123-6VLGv1 y huCD123-6VLGv4 correspondientes se muestra a continuación.
m u C D l23 -6 VL ( 62 ) FSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDAFPYTFGGGTKLEIKRÍSEQ ID NO: 83)
h uC D 123 -6 V LG vl ( 62 ) -------------- T -F T ----------- Q P --F A T ------------------------------Q----- V-------- (SEQ ID NO: 84)
huC D 123-6VLG v4 ( 62 ) -------------- N— T ----------- Q P --F A T ------------------------------Q----- V -------- (SEQ ID NO: 85)
IG K V l-16 *01 ( 62 ) -------------- T -F T ----------- QP— FAT— Q— NSY- (SEQ ID NO: 86)
A continuación, se muestra el alineamiento de secuencia entre la parte relevante de la secuencia original de muCD123-6 Vh, la secuencia de línea germinal humana correspondiente IGHV1-46 * 03 y las correspondientes secuencias huCD123-6VHGv1, huCD123-6VHGv6 y huCD123-6VHGv7.
Se sintetizaron y se expresaron las construcciones de ADN humanizado y los anticuerpos recombinantes se purificaron tal como se describió anteriormente para el análisis de unión a CD123 posterior en comparación con el anticuerpo original.
Se estableció claramente que los residuos marco también pueden efectuar contribuciones estructurales a la unión al antígeno y se pueden volver a introducir como mutaciones inversas para conservar al máximo la afinidad de unión al antígeno. Foote y Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992). Una plataforma de residuos directamente debajo de las CDR, a la que se hace referencia como zona de Vernier, puede ayudar a preservar la conformación de los bucles de CDR que dirigen la especificidad y afinidad del anticuerpo. Por tanto, se elaboraron variantes que contenían una o más mutaciones inversas de los residuos de la zona de nonio, y posteriormente se evaluaron para la unión al antígeno así como para la actividad de inhibición de IL3 funcional. Las retromutaciones de residuos de la zona del nonio probadas incluyeron 3 residuos en el Vl (posición 46 en FW-L2 y posiciones 69, 71 en FW-L3) y 8 residuos en el Vh (posiciones 2, 28 en FW-H1, posición 48 en FW-H2, y posiciones 67, 69, 71, 73, 78 en FW-H3). Varios anticuerpos CD123-6 injertados con CDR con mutaciones inversas en la zona de vernier exhibieron actividad de inhibición de IL3 en células TF-1 como se ejemplifica en la versión 4.6 o denominada "Gv4.6" en el presente documento (Vl Gv4 y Vh Gv6) y la versión 4.7 o denominada "Gv4.7" en el presente documento (Vl Gv4 y Vh Gv7) (FIG. 1).
El uso del residuo marco específico de los anticuerpos CD123-6 injertos en CDR descritos se presenta a continuación en las Tablas B y C.
Tabla B Injerto de CDR del anticuerpo CD123-6 Vl
Tabla C Injerto de CDR del anticuerpo CD123-6 Vh
Adicionalmente, a fin de minimizar las inquietudes respecto al impacto de conjugar las lisinas comprendidas por los CDR, se reemplazó lisina 24 en CDR-L1 de anticuerpo CD123-6 murino por arginina en injertos de CDR (véase la Tabla A anterior).
También se humanizó el anticuerpo CD123-6 mediante el recubrimiento del dominio variable, siguiendo métodos descritos anteriormente, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973, 1994 y Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996. Generalmente, el recubrimiento implica la identificación de los residuos de la superficie del marco de la región variable en las cadenas ligeras y pesadas, y su reemplazo con equivalentes humanos. Las CDR murinas y los residuos marco enterrados se preservan en el anticuerpo recubierto. Los CDR ejemplares de de los anticuerpos CD123-6 se definen tal como se indica en la Tabla D.
Tabla D
Para minimizar las inquietudes respecto al impacto de la conjugación de lisinas comprendidas por las CDR, se reemplazó la lisina 24 de CDR-L1 de cadena ligera del anticuerpo CD123-6 murino con arginina. De manera similar, se reemplazaron las lisinas 52 y 59 de CDR-H2 de cadena pesada del anticuerpo CD123-6 murino con argininas para la versión 1.0 recubierta. Se empleó la definición de CDR-H2 de cadena pesada de AbM para el recubrimiento, de manera que los proporciona la tabla, al igual que ejemplos de secuencias de CDR-H2 de cadena pesada definidas por Kabat tanto para la versión murina como humana del anticuerpo CD123-6.
Las posiciones de residuo de superficie se definieron como cualquier posición con una accesibilidad relativa del 30% o mayor (Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235: 959-973, 1994). Los residuos superficiales calculados se alinearon con secuencias de superficie de línea germinal para identificar la secuencia superficial humana más homóloga. La secuencia de la línea germinal humana usada como superficie de reemplazo para el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo CD123-6 fue IGKV1-16*01 mientras que IGHV1-69 * 10 se usó como superficie de reemplazo para el dominio variable de cadena pesada. los cambios del residuo de superficie de marco específico se presentan en las Tablas E y F a continuación.
Tabla E Recubrimiento del anticuerpo CD123-6 Vl
Table F Resurfacing of CD123-6 antibody Vh
Los alineamientos de secuencia más adelante muestran las secuencias recubiertas para el dominio variable del anticuerpo CD123-6 tanto de cadena ligera (Vl) como pesada (Vh) con sus equivalentes murinos. Véase la SEQ ID NO: 41 para la secuencia Vl de huCD123-6 recubierto, y las Se Q ID NO: 39 y 40 para las secuencias Vh de huCD123-6 recubiertas.
m uC D 123-6 V H E F Q L Q Q S G P E L V K P G A S V K M S C K A S G Y IF T S S IN H W N K Q K P G Q G L E W IG Y IK P Y N D G T K Y N , s e Q r D N O 8 ' ) h u C D 123 -6 V H v l . O Q V — V — A - V ----------------------------------------------T ----------------------------------------------------------------------- R ---------------- R — (S E Q I D N O : 76) h u C D 123 -6 V H V l . l q ____ v ____ A - V ____________________________ T ___________________________________________________________(S E Q I D N O . 77 )
62 121
IBUCD123-6 VH EKFKGKATLTSDKSSSTANMELNSLTSEDSAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTSVTVSS (S E Q ID N O : 92)
h u C D 123 -6 V H v l.O Q Q------------R--------- ---------- ------------------------------------------ ----------- (S E Q ID N O : 78) h u C D 123 -6 V H V l . l Q— Q.............................. - .............................................................................. (S E Q ID N O : 97 )
Ejemplo 4 Análisis para determinar los anticuerpos anti-CD123 que inhiben la señalización mediada por IL3 y la proliferación
La capacidad de los anticuerpos anti-CD123 para inhibir la proliferación y señalización mediada por IL3 se examinó in vitro usando la línea celular de eritroleucemia TF-1 que solo puede proliferar en presencia de uno de los siguientes factores de crecimiento, ya sea IL-3 o GM-CSF. Se cultivaron las células TF-1 en el medio RPMI completo (RPMI-1640, 10% de suero fetal bovino y 50 pg/mL de sulfato de gentamicina; todos los reactivos fueron de Invitrogen) complementado con GM-CSF (2 ng/mL). Antes de preparar los ensayos de proliferación, se lavaron las células y después se privaron de factores de crecimiento durante la noche. Para bloquear los receptores Fc en la superficie celular, se complementó el medio de cultivo con anticuerpo chKTI 100 nM (un anticuerpo que no es de unión del mismo isotipo). Las células TF-1 se colocaron en placas a 6000 células por pocillo en el medio RPMI completo ya sea en presencia o ausencia de 10 pg/mL de un anticuerpo anti-CD123. Se añadió un factor de crecimiento, ya sea IL-3 (1 ng/mL) o GM-CSF (2 ng/mL), a las células para iniciar la proliferación celular. Las células se incubaron a 37°C en un incubador humidificado al 5% CO2 durante 3 días. Se determinó la cantidad relativa de células viables en cada pocillo mediante el ensayo colorimétrico WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, EUA). Se reduce WST-8 mediante dehidrogenasas en células viables hasta un producto formazán anaranjado que es soluble en medio de cultivo tisular. La cantidad de formazán producido es directamente proporcional a la cantidad de células viables. Se añadió WST-8 a los pocillos al 10% del volumen final y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% durante 2-6 horas más. Depués, se midió la absorbancia en un espectrofotómetro lector de placas en el modo de longitud de onda doble 450 nm/650 nm y la absorbancia en la de 650 nm (dispersión de luz no específica por células) se restó de la de 450 nm. La cantidad de células relativa en cada pocillo se calculó, primero corrigiendo la absorbancia de fondo del medio y después al dividir el valor de cada muestra tratada con un anticuerpo entre los valores promedio de pocillos con las células sin tratar (control).
Los resultados de un ensayo típico se presentan en las FIGs. 2A y 2B. De acuerdo con los datos informados anteriormente (Sun et al. 1996), el anticuerpo 7G3 pero no 6H6 o 9F5 inhibió sustancialmente la proliferación dependiente de IL-3. De manera inesperada, varios anticuerpos anti-CD123 generados en este estudio fueron capaces
de inhibir la proliferación dependiente de IL-3 de las células TF-1 incluso más significativamente que 7G3 (FIG. 2A). Por ejemplo, los anticuerpos 3, 6 y 14 redujeron la cantidad de células TF-1 a menos de 5% de las que se encuentran en el control (células TF-1 cultivadas en ausencia de un anticuerpo), mientras que el anticuerpo 7G3 redujo la cantidad de células a 15% de las que se encuentran en el control. Por el contrario, el tratamiento con los demás anticuerpos anti-CD123 (p. ej., los anticuerpos 2, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 18, 20, 21 y 22) sólo tenía un efecto mínimo en la proliferación celular o ningún tipo de efecto.
La inhibición de la proliferación de células TF-1 mediante los anticuerpos 3, 6, 14 y 7G3 fue dependiente de IL-3, ya que estos anticuerpos no tenían efecto inhibidor cuando las células se cultivaban en presencia de otro factor de crecimiento GM-CSF (FIG. 2B).
A continuación, se determinaron las concentraciones de los anticuerpos 3, 6, 14 (renombrados muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14, respectivamente) y 7G3 que se precisaron para inhibir la proliferación dependiente de IL3. Las células TF-1 se colocaron en placas a 6000 células por pocilio in 100 pL de medio de cultivo. Los anticuerpos se diluyeron en el medio de cultivo con una serie de dilución 6 veces y se añadieron 50 pL de material diluido por pocillo. Después, se añadió IL3 a las células en la concentración final de 1 ng/mL. La concentración final de anticuerpo típicamente varió de 6 x 10'8 M a 8 x 10'12 M. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% durante 3 días. Se determinó la cantidad de células relativa en cada pocillo mediante el ensayo WST-8, tal como se describió anteriormente. El valor relativo del número de células se representó frente a la concentración de anticuerpo y se presentó en la FIG. 3. Es evidente que muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 y 7G3 inhiben la proliferación de células TF-1 dependiente de IL-3 sustancialmente y de una manera dosis-dependiente, mientras que un anti-CD123 no funcional de control el anticuerpo no tuvo tal efecto. Por ejemplo, el tratamiento con 7G3 redujo el número relativo de células al 18% a la concentración de anticuerpo más alta probada, con un valor de IC50 de 0,33 nM. El tratamiento con muCD123-3 redujo el número relativo de células al 2% a la concentración de anticuerpo más alta probada, con un valor de IC50 de 0,26 nM. Asimismo, el tratamiento con muCD123-14 o muCD123-6 redujo el número relativo de células a menos del 1% a la concentración de anticuerpo más alta probada, con valores de IC50 de 0,08 nM o 0,05 nM, respectivamente. Por lo tanto, muCD123-3, muCD123-6 y muCD123-14 inhiben la proliferación dependiente de IL-3 de las células TF-1 a un grado significativamente más elevado que el anticuerpo 7G3.
Ejemplo 5 Afinidad de unión de anticuerpos anti-CD123 murinos
La afinidad de unión se probó mediante citometría de flujo con anticuerpos purificados. Los histogramas de FACS que demuestran la unión de muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 y 7G3 a células TF-1 y HNT-34 que expresan CD123 se presentan en las FIGs. 4A y 4B, respectivamente. Se incubaron las células TF-1 (5*104 células por muestra) con concentraciones variadas de anticuerpos murinos en 200 pL de solución tampón FACS (medio DMEM complementado con suero de cabra normal al 2%). Las células se sedimentaron, se lavaron dos veces y se incubaron durante 1 hora con 100 pL de anticuerpo IgG antirratón de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson Laboratory). Las células se sedimentaron una vez más, se lavaron con amortiguador FACS y se resuspendieron en 200 pl de PBS que contenía formaldehído al 1%. Las muestras se adquirieron mediante un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador de múltiples pocillos de HTS o un citómetro de flujo FACS Array y se analizó con CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE.UU.). Para cada muestra, se calculó la intensidad media geométrica de fluorescencia para FL2 y se representó graficamente en función de la concentración de anticuerpos en una gráfica semilogarítmica. Se generó una curva de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal y se calculó el valor EC50 de cada curva, que corresponde a la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo, utilizando GraphPad Prism v4 (software GraphPad, San Diego, CA). Se observó una fuerte unión en todos los anticuerpos evaluados y los valores Kd corresponden a 0,3 nM, 0,1 nM, 0,3 nM y 0,9 nM en los anticuerpos muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 y 7G3, respectivamente (FIG.
4A). Por lo tanto, en este experimento, la unión mediante los anticuerpos CD123 murinos sujeto es al menos 3-9 veces mejor que la del anticuerpo 7G3.
Asimismo, también se observó una unión fuerte cuando se empleó otra línea celular de leucemia mieloide aguda positiva a CD123, HNT-34, para el mismo ensayo de citometría de flujo descrito anteriormente. Los valores Kd , calculados tal como se describió anteriormente, fueron 0,2 nM, 0,07 nM, 0,5 nM y 2 nM en muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 y 7G3, respectivamente (FIG. 4B). Por lo tanto, en este experimento, la unión mediante los anticuerpos CD123 murinos sujeto es al menos 4-28 veces mejor que la del anticuerpo 7G3.
Estos datos demuestran que muCD123-3, muCD123-6 y muCD123-14 presentan menor Kd (lo que representa una afinidad más elevada) que el anticuerpo 7G3 respecto a las células de l Ma positivas a CD123.
Ejemplo 6 Afinidad de unión de anticuerpos anti-CD123 quiméricos
Se ensayaron los anticuerpos chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 quiméricos para determinar su afinidad de unión a células HNT-34 en comparación con un isotipo IgG de control quimérico (chKTI). Se llevaron a cabo ensayos de unión de citometría de flujo y se analizaron tal como se describió en el Ejemplo 5 con anticuerpos secundarios antihumanos de cabra conjugados con PE. La FIG. 5A representa las curvas en respuesta a la dosis para cada anticuerpo. El valor de la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo se calculó usando GraphPad Prism v4 (software GraphPad, San Diego, CA). Los datos mostraron que la quimerización sólo afecta moderadamente las afinidades de unión de estos anticuerpos. Los valores Kd para chCD123-3, chCD123-6, y chCD123-14 fueron 0,1
nM, 0,04 nM, y 0,2 nM, respectivamente. Estos valores fueron como máximo 2,5 veces diferentes de los de sus homólogos murinos descritos en el Ejemplo 5. Como era de esperar, el anticuerpo chKTI no se unió a las células a las concentraciones probadas (FIG. 5A).
Se confirmó la afinidad elevada de chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 respecto a células LMA con otra línea celular de leucemia mieloide aguda positiva a CD123, MOLM-13. Los ensayos de unión de citometría de flujo se llevaron a cabo y se analizaron tal como se describieron anteriormente. La FIG. 5B presenta las curvas en respuesta a la dosis para cada anticuerpo. Los valores para la constante de disociación aparente (Kd) de chCD123-3, chCD123-6, y chCD123-14 fueron 0,2 nM, 0,08 nM, y 0,2 nM, respectivamente. Se observó únicamente unión marginal para isotipo IgG de control quimérico (anticuerpo chKTI) en la concentración más elevada probada (10 nM).
Por lo tanto, chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 conservan la afinidad elevada de sus equivalentes murinos.
Actividad funcional de anticuerpos quiméricos
Se ensayaron chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 y un anticuerpo anti-CD123 no funcional, usados como control negativo, para determinar su capacidad para inhibir la proliferación dependiente de IL3 de las células TF-1. Los ensayos se llevaron a cabo y analizaron como se describe en el Ejemplo 4. El tratamiento con chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 redujo el número relativo de células de una manera dependiente de la dosis con los valores de IC50 de 0,1 nM, 0,03 y 0,05 nM, respectivamente (FIG. 6). El anticuerpo no funcional de control no afectó el crecimiento celular. Por lo tanto, chCD123-3, chCD123-6 y chCD123-14 conservaron la actividad funcional de sus equivalentes murinos.
Ejemplo 7 Afinidad de unión de anticuerpos anti-CD123 humanizados
La afinidad de unión de los anticuerpos anti-CD123 humanizados ejemplares, huCD123-6Gv4.7S2 y huCD123-6Gv4.7S3, respecto a las células HNT-34 se comparó con la de sus equivalentes murinos y quiméricos, muCD123-6 y chCD123-6, respectivamente. El anticuerpo 7 G3 y un isotipo IgG de control quimérico (chKTI) se probaron en paralelo. Los ensayos de unión de citometría de flujo se llevaron a cabo y se analizaron tal como se describieron en el Ejemplo 5. La FIG. 7A representa las curvas dosis-respuesta para cada anticuerpo. Estos datos muestran que la humanización no afectó a la afinidad de unión del anticuerpo , ya que Kd para huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 y muCD123-6 son aproximadamente 0,06 nM. La Kd aparente para el anticuerpo 7G3 fue significativamente mayor, aproximadamente 2 nM. El anticuerpo chKTI no se unió a las células en las concentraciones probadas. Por lo tanto, ambos clones de huCD123-6Gv4.7 retienen la alta afinidad de los equivalentes murino y quimérico y tienen una mayor afinidad (p. ej., al menos aproximadamente 30 veces mayor) que el anticuerpo 7G3 para las células que expresan CD123.
De manera similar, las afinidades de unión de los conjugados ADC del anticuerpo huCD123-6Gv4.7 humanizado ejemplar se ensayaron usando células HNT-34, en comparación con las del huCD123-6Gv4.7 no conjugado. Se llevaron a cabo ensayos de unión por citometría de flujo y se analizaron como se describe en el Ejemplo 5 usando anticuerpos antihumanos de cabra secundarios conjugados con PE. Las FIGs. 7B y 7C representan las curvas de respuesta a la dosis para cada anticuerpo y los conjugados correspondientes. Los datos mostraron que la conjugación sólo afecta moderadamente a las afinidades de unión de estos anticuerpos.
Actividad funcional de anticuerpos anti-CD123 humanizados
La actividad funcional (la capacidad de inhibir la proliferación dependiente de IL3 de las células TF-1) de los ejemplos de anticuerpos anti-CD123 humanizados, huCD123-6Gv4.7S2 y huCD123-6Gv4.7S3, se comparó con la de su equivalente quimérico, el anticuerpo chCD123-6. El anticuerpo 7 G3 se probó en paralelo. Los ensayos se llevaron a cabo y se analizaron tal como se describió en el Ejemplo 4.
El tratamiento con huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3 y chCD123-6 inhibió la proliferación dependiente de IL-3 de manera similar: la proliferación se inhibió por completo a 1 nM con un IC50 de 0,02 nM (FIG. 8A). Sin embargo, el tratamiento con 7G3 no tuvo un efecto tan profundo sobre la proliferación de las células: la IC50 del anticuerpo fue de 0,2 nM y no pudo inhibir la proliferación celular completamente, sino que solo redujo el número de células al 18% a la concentración más alta (10 nM).
La inhibición de la proliferación de células TF-1 mediante huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 y 7G3 fue dependiente de IL-3, dado que estos anticuerpos no tenían efecto inhibidor cuando las células se cultivaban en presencia de otro factor de crecimiento GM-CSF (FIG. 8B).
Por lo tanto, huCD123-6Gv4.7 retiene la actividad funcional de sus equivalentes murinos y quiméricos, y es significativamente más activa que el anticuerpo 7G3 en la inhibición de la proliferación dependiente de IL-3.
Ejemplo 8 Mapeo de epítopos
El antígeno CD123, la cadena a del receptor IL-3 (IL-3Ra) se compone de 378 aminoácidos que contienen un dominio extracelular de 306 aminoácidos implicado en la unión a IL-3, un dominio transmembrana de 20 aminoácidos y una
cola citoplásmica corta de 52 aminoácidos. El dominio extracelular se puede dividir además en un dominio N terminal (DTN) que comprende una región desde la treonina en la posición 19 de la proteína madura (p. ej., después de la escisión del péptido señal), hasta la serina en la posición 100 y el motivo de reconocimiento de citocinas (CRM) compuesto por dos dominios de plegamiento discretos: dominio 2 (aminoácidos 101-204) y dominio 3 (aminoácidos 205-306). Los epítopos para ciertos anticuerpos anti-CD123 descritos en el presente documento fueron mapeados mediante el diseño de proteínas quiméricas con combinaciones del dominio extracelular de IL-3Ra y la cadena a del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMRa), el que conserva la topología IL-3Ra y comparte una subunidad p en común que es esencial para la señalización.
Clonación y expresión de variantes de IL-3 Ra
El dominio extracelular de CD123/IL-3Ra (residuos 1-306) se expresó como una proteína marcada con histidina. La secuencia de proteínas se optimizó con codones y se sintetizó mediante Life Technologies y se clonó en marco con una etiqueta de 10-histidina en el vector de expresión de mamífero pABLT usando los sitios de restricción EcoRI y HindlIl. De manera similar, se sintetizó y se clonó el dominio extracelular de la proteína GMRa de control (residuo 1 325), que también comprende un dominio N terminal desde la serina en la posición 25 hasta la serina en la posición 114 de la proteína madura y un dominio CRM que comprende la glicina en la posición 115 hasta la valina en la posición 325. Después, los vectores de expresión de proteínas de receptores quiméricos IL3Ra/GMRa se construyeron mediante digeridos de restricción que reemplazan ya sea el dominio del extremo N (residuos 1-100) o el dominio CRM (residuos 101-306) de la molécula IL-3Ra con las secuencias correspondientes de la molécula GMRa. IL3Ra (1-100) codifica residuos IL3Ra 1-100 fusionados a residuos GMRa 115-325, e IL3Ra (101-306) codifica residuos GMRa 1 114 fusionados a residuos IL3Ra 101-306, tal como se ilustró en la FIG. 9A.
Se expresaron IL3-Ra, GMRa y las dos proteínas quiméricas IL-3Ra marcadas con His, IL3-Ra (1-100) e IL3-Ra (101 306), mediante la transfección temporal de células HEK 293T y se purificaron a partir del sobrenadante de las células transfectadas usando cromatografía excel Ni Sepharose (GE healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Unión de anticuerpos a varios constructos de IL3Ra
Se probaron los anticuerpos anti-IL3Ra quiméricos y humanizados en el formato de ensayo de inmunoabsorción enlazada a la enzima (ELISA) para su unión a las proteínas IL-3Ra descritas anteriormente. En resumen, cada proteína purificada IL-3Ra marcada con His mediante cromatografía excel Ni Sepharose se diluyó hasta 1 ng/mL en tampón de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6 y se añadieron 100 pL a cada pocillo. Después de una incubación de 16 horas a 4 °C, se lavaron las placas con solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,1% (TBST), después se bloqueó con 200 pL de tampón de bloqueo (TBS con BSA al 1%). A continuación, se añadiern 100 pL de anticuerpo primario, diluido en serie en la solución tamponadora de bloqueo, por duplicado en los pocillos de ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se lavaron las placas 3 veces con TBST antes de añadir 100 pL de IgG anti-humana (H+L)-HRP (Jackson ImmunoResearch) en cada pocillo. Una vez más las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de tres lavados con TBST. Finalmente, se añadieron 100 pL de un sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (Surmodics) a cada pocillo y se incubaron durante 5 minutos. Se detuvo la reacción mediante la adición de 100 pL de solución de detención (Surmodics) y se leyeron las absorbancias a 450 nm.
Se evaluó la unión de los anticuerpos CD123 a las proteínas IL-3Ra quiméricas en comparación con las IL-3Ra de tipo salvaje. La FIG. 9B demuestra que el anticuerpo huCD123-6 se une tanto a IL-3Ra como IL-3Ra (101-306) con afinidades subnanomolares similares. Por el contrario, el anticuerpo huCD123-6 no se une al constructo GMRa y no se elimina la unión para el constructo de proteína quimérica IL-3Ra (1-100). Estos resultados indican que el anticuerpo huCD123-6 se une primariamente al dominio CRM, quizás con únicamente una contribución mínima del dominio N terminal de IL-3Ra. De manera similar, el anticuerpo chCD123-3 se une principalmente al dominio CRM de IL-3Ra aunque tiene una afinidad de unión reducida en comparación con IL-3Ra de tipo salvaje (FIG. 9C). La reducción en la afinidad de unión a la proteína de receptor quimérico IL-3Ra (101-306) sugiere una posible implicación del dominio N terminal de IL-3Ra en la unión del anticuerpo CD123-3. Sin embargo, el anticuerpo chCD123-14 no reconoce el receptor quimérico IL-3Ra (101-306) (FIG. 9d); más bien, se une tanto a IL-3Ra como a IL-3Ra (1-101) con una afinidad equivalente. Estos resultados demuestran que el anticuerpo chCD123-14 se une exclusivamente al dominio N terminal de IL-3Ra. En comparación, el anticuerpo 7G3 junto con los otros dos anticuerpos comercialmente disponibles, 6H6 y 9F5, también se unen al dominio N terminal de IL-3Ra y los constructos de IL-3Ra de tipo salvaje, pero no reconocen el dominio CRM de IL3Ra (FIGs. 9E, 9F, y 9G, respectivamente). En resumen, estos datos demuestran que los epítopos de los anticuerpos CD123-6 y CD123-3 se ubican principalmente en el dominio CRM de IL-3Ra, y se diferencian del epítopo del anticuerpo 7G3, el que se limita al dominio N terminal de IL-3Ra. El anticuerpo CD123-14 también une un epítopo confinado en el dominio N terminal de IL-3Ra.
Ejemplo 9 Preparación de DM1 enlazados a lisina y conjugados IGN del anticuerpo huCD123-6
a. Preparación de huCD123Gv4.7S3-sulfo-SPDB-D1
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo CD123-6G4.7S3 y 3,5 equivalentes molares de mezcla in situ sulfo-SPDB-D1 mediante enlazadores en HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina) 15 mM,
tampón de pH 8,5 y se dejó que el codisolvente DMA (N,N dimetilacetamida) al 15% v/v se conjugara durante 3-4 horas a 25 °C. La mezcla in situ se preparó al hacer reaccionar el enlazador sulfo-SPDB 3,0 mM con 3,9 mM del compuesto sulfonado D1 en DMA durante 5 horas a 25 °C en presencia de N,N diisopropiletilamina (DIPEA) 20 mM.
Después de la reacción, se purificó el conjugado y la solución tampo se intercambió en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5% p/v, Tween 20 0,01%, bisulfito de sodio 50 pM, tampón de formulación pH 6,2, con columnas de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a temperatura ambiente y después, durante la noche, a 4 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tiene una concentración de proteínas final de 1,2 mg/ml y un promedio de 2.9 moléculas del compuesto D1 enlazadas por anticuerpo (mediante UV Vis con coeficientes de extinción molar £ 330 nm= 15,484 cm'1M'1 y 280 nm= 30,115 cm^M'1 para el compuesto D1 y 280 nm= 207,360 cm'1M'1 para el anticuerpo huCD123-6G4.7S3); ); 94,3% de monómeros (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y < 2% de compuesto D1 sin conjugar (UPLC en doble columna, análisis de HPLC de fase inversa).
b. Preparación de huCD123-6Gv4.7S3-D2
Se incubó una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3 y equivalentes molares 5,0 del compuesto D2 (pretratado con exceso de bisulfito de sodio 5 veces en 90:10 DMA:succinato 50 mM, pH 5,5, durante 4 horas a 25 °C) en HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina) 15 mM, pH 8,5 solución tampón y codisolvente d Ma (N,N-dimetilacetamida) al 10% v/v durante 4 horas a 25 °C.
Después de la reacción, se purificó el conjugado y el tampón se intercambió en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5% p/v, Tween 20 al 0,01%, formulación tampón de bisulfito de sodio 50 pM pH 6,2, con columnas de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a temperatura ambiente y después, durante la noche, a 4 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tiene una concentración de proteínas final de 1,2 mg/ml y un promedio de 2.9 moléculas del compuesto d 2 enlazado por anticuerpo (mediante UV Vis con coeficientes de extinción molar £ 330 nm= 15,484 cm'1M'1 y 280 nm= 30, 115 cm_1M'1 para el compuesto D2 y 280 nm= 207,360 cm_1M'1 para el anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3); 99,3% de monómeros (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y < 2% de compuesto D2 sin conjugar (UPLC en doble columna, análisis de HPLC de fase inversa).
C.Preparación de huCD123-6Gv1.1-sulfo-SPDB-DGN462
Se formó NHS-sulfo-SPDB-sDGN462 in situ mediante la incubación del enlazador sulfo-SPDB 1,5 mM, DGN462 sulfonado (sDGN462) 1,95 mM en DMA que contiene DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) 10 mM durante 20 minutos antes de añadir MPA (ácido 3-maleimidopropionico) 0,9 mM para inactivar tiol IGN sin reaccionar durante 15 minutos a 25 °C. Se incubó una reacción que contiene 2,5 mg/mL de anticuerpo huCD123-6Gv1.1 y 7,5 equivalentes molares del NHS-sulfo-SPDB-DGN462 resultante en tampón HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina) 15 mM pH 8,5 y codisolvente DMA al 15% v/v durante la noche a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó en histidina 20 mM, NaCl 50 mM, sacarosa al 8,5%, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación de bisulfito de sodio 50 pM pH 6.2, con columnas de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante la noche, a 4 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tiene una concentración de anticuerpos final de 0,95 mg/ml y un promedio de 2,8 moléculas de DGN462 enlazadas por anticuerpo (mediante UV-Vis con coeficientes de extinción molar £ 330 nm= 15,484 cm-1M'1 y 280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para DGN462 y 280 nm= 207,360 cm'1M'1 para el anticuerpo huCD123-6Gv1.1); 99,5% de monómeros (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y < 0,6% de DGN462 sin conjugar (mediante precipitación en acetona, análisis de HPLC de fase inversa).
d. Preparación de huCD123-6Gv1.1-D3
Se incubó una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huCD123-6Gv1.1 y 3,5 de equivalentes molares de D3 (pretratado con exceso de bisulfito de sodio 5 veces en 90:10 DMA:succinato 50 mM, pH 5,5, durante 4 horas a 25 °C) en tampón HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina) 15 mM pH 8,5 y codisolvente DMA (N,N-dimetilacetamida) al 10% v/v durante 4 horas a 25 °C. Después de la reacción, se purificó el conjugado y el tampón se intercambió en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5% p/v, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación de bisulfito de sodio 50 pM pH 6,2, con columnas de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a temperatura ambiente y después, durante la noche, a 4 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tiene una concentración de proteínas final de 0,9 mg/ml y un promedio de 3,4 moléculas de D3 enlazado por anticuerpo (mediante UV-Vis con coeficientes de extinción molar £ 330 nm= 15,484 cirr
1M-1 y 280 nm= 30,115 cm -'M para D3 y 280 nm= 207,360 cm -'M para el anticuerpo huCD123-6Gv1.1); 96% de monómeros (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y < 1% de D3 sin conjugar (doble columna, análisis de HPLC de fase inversa).
e. Preparación de conjugados huCD123-6Rv1.1-CX1-1-maitansinoide
Se conjugó el anticuerpo anti-CD123 humanizado (huCD123-6Rv1.1 recubierto) en los residuos lisina con carga maitansinoide a través de triglicil, enlazador CX1-1. Se incubó una mezcla que contenía triglicil 5 mM, enlazador heterobifuncional CX1-1 (que lleva grupos N-hidroxisuccinimida y maleimida) y maitansinoide DM1 6,5 mM en N, N-dimetilacetamida (DMA) que contiene N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) 20 mM durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente. Se inactivó DM1 sin reaccionar con ácido maleimidopropionico (MPA) 2 mM durante aproximadamente de 20 minutos a temperatura ambiente antes de añadir la mezcla de reacción al anticuerpo anti-CD123 humanizado (huCD123-6Rv1.1) a 4 mg/mL en tampón EPPS 140 mM, pH 8, que contiene aproximadamente DMA al 8%, a un exceso de aproximadamente 7,6* o 15* aducto de CX1-1-DM1 respecto al anticuerpo. Se incubaron las mezclas de reacción de la conjugación durante la noche a 25 °C, después de lo cual se purificaron los conjugados y el tampón se intercambió por tampón succinato 10 mM, pH 5,5, que contiene glicina 250 mM, sacarosa al 0,5%, Tween 20 al 0,01% con columnas de desalinización NAP (Illustra, Sephadex G-25, GE Healthcare). La diálisis se realizó en el tampón succinato descrito anteriormente durante la noche a 4 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (Thermo Scientific; membrana de límite de peso molecular 10000).
Se encontró que los conjugados purificados contenían un promedio de 4,3 y 6,7 moléculas maitansinoide enlazadas por anticuerpo (mediante espectrometría UV/Vis y HPLC de exclusión por tamaño, usando coeficientes de extinción molar de £ 252 nm= 26350 cirr1 M'1 y 280 nm= 5456 cirr1 M'1 para DM1, y 280 nm= 207076 cirr1 M'1 para el anticuerpo huCD123), 98% de monómeros (mediante cromatografía de exclusión por tamaño) y una concentración de proteínas final de 2,1 mg/mL y 1,2 mg/mL, respectivamente. Se estimó que los niveles de maitansinoide sin purificar en conjugados purificados fueron bajos (< 1%) mediante HPLC. La espectrometría de masas de conjugados deglicosilados indicaron especies maitansinoide enlazadas.
Ejemplo 10 Ensayos de citotoxicidad in vitro
Se midió la capacidad de los conjugados de fármaco y anticuerpo (ADC) de huCD123-6 para destruir células que expresen CD123 en su superficie celular con ensayos de citotoxicidad in vitro. Se cultivaron las líneas celulares en medio de cultivo, tal como lo recomendó el proveedor de células (ATCC o DSMZ). Se añadieron las células, 2.000 a 10.000 en 100 pL del medio de cultivo, a cada pocilio de las placas de 96 pocilios de fondo plano. Para bloquear los receptores Fc en la superficie celular, se complementó el medio de cultivo con anticuerpo chKTI 100 nM (un anticuerpo del mismo isotipo). Los conjugados se diluyeron en el medio de cultivo usando series de 3 veces de dilución y se añadieron 100 pL por pocillo. Para determinar la contribución de la citotoxicidad independiente de CD123, se añadió el bloque CD123 (p. ej., 100 nM de anticuerpo chCD123-6) a algunos pocillos antes de los conjugados. En cada placa de ensayo se incluyeron pocillos de control que contenían células y el medio pero carecían de conjugados, así como también pocillos que contenían únicamente medio. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada punto de datos. Las placas se incubaron a 37 °C en un incubador humidificado al 6% CO2 durante 4 a 7 días. Después, se determinó el número relativo de células viables en cada pocillo usando el Cell Counting Kit-8 basado en WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD) como se describe en el Ejemplo 4. La fracción de supervivencia aparente de células en cada pocillo se calculó corrigiendo primero la absorbancia de fondo media y después dividiendo cada valor por el promedio de los valores en los pocillos de control (células no tratadas). Se representó graficamente la fracción superviviente de células en función de la concentración de conjugados en gráficas semilogarítmicas.
Los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico se muestran en la FIG. 10. La línea celular OCI-LMA4 de LMA puede proliferar sin factores de crecimiento en medios de cultivo. Las células se trataron con el conjugado mitansinoide huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1. El tratamiento dio como resultado la muerte celular dependiente de la dosis con un valor de IC50 de 0,07 nM. A fin de evaluar si la muerte fue debido a la expresión de CD123, se bloqueó el antígeno mediante un exceso de anticuerpo chCD123-6 sin conjugar (500 nM) y se evaluó la potencia del conjugado en las células. El tratamiento posterior no afectó la viabilidad de las células en las concentraciones menores a 3 nM y sólo tuvo un efecto moderado en la viabilidad celular a 10 nM (la concentración probada más elevada). Por lo tanto, el
conjugado huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1 demuestra citotoxicidad dependiente de CD123 elevada en células OCI-LMA4.
También se probó in vitro la citotoxicidad de los conjugados del anticuerpo huCD123-6 enlazados a otros agentes citotóxicos (DGN462, D3, D1 y D2) a través de lisinas. En el estudio se usaron quince líneas celulares positivas a CD123 de distinto origen (LMA, B-LLA, CML y NHL) (tabla inmediatamente a continuación). La mayoría de las líneas celulares se derivaron de pacientes portadores de una neoplasia maligna con al menos un factor pronóstico negativo (p. ej., sobreexpresión de la glicoproteína P, sobreexpresión de EVI1, alteraciones de p53, mutación DNMT3A, duplicación en tándem interno de FLT3). Los conjugados demostraron potencia elevada en tales líneas celulares con valores IC50 que varían entre sub-pM y bajo nM (tabla inmediatamente a continuación, FIG. 11A).
Citotoxicidad in vitro de los diversos conjugados huCD123-6-IGN enlazados a lisina en líneas celulares positivas para CD123 de diferente origen
Los datos anteriores parecen sugerir que las líneas celulares B-LLA (KOPN8 y JM-1) son muy sensibles a los compuestos IGN. Para validar además este descubrimiento, se evaluó la citotoxicidad de los conjugados del anticuerpo huCD123-6Gv4.7 enlazados a D1 o D2, mediante lisinas o cisteínas, con las mismas líneas celulares de B-LLA, KOPN8 y JM-1, además de una línea celular de B-LLA adicional de "380 células". En los ensayos se incluyeron los
controles negativos con conjugados con un anticuerpo que no se une a estas líneas celulares B-LLA - KTI Los resultados en la FIG. 11B confirmaron el descubrimiento anterior.
La tabla anterior también muestra que los compuestos huCD123-IGN son muy activos contra las distintas líneas celulares de LMA. Los datos representativos que emplean compuestos IGN enlazados a Lys y Cys se muestran en la FIG. 11C. De acuerdo con los datos mostrados en la FIG. 11C, los datos adicionales (mostrados en la tabla a continuación y la FIG. 21) sobre la citotoxicidad del conjugado enlazado a Cys (huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5) demuestran que el conjugado es muy potente contra varias líneas celulares de LMA positivas para CD123, incluyendo aquellos con factores de mal pronóstico.
Resulta interesante que los datos preliminares sugieren que el conjugado D5 enlazado a Cys parece ser particularmente potente en las células progenitoras de LMA, incluso cuando se compara con conjugados potentes de D2 enlazado a Lys o D1 enlazado a Lys. Véase la FIG. 11D, en la que se usan 9 muestras de pacientes con LMA a fin de evaluar la potencia de los distintos conjugados IGN de la invención.
Estudios in vitro adicionales demuestran que el conjugado D5 enlazado a Cys tiene una actividad 74 veces mayor que la actividad de Mylotarg en muestras de pacientes con LMS no seleccionadas. Véase la FIG. 18.
Además, la FIG. 11E y FIG. 19 muestran que el conjugado de huCD123 D5 enlazado a Cys destruye las células sanguíneas normales en concentraciones que son > 100 veces más altas que las necesarias para matar a los progenitores de LMA. En comparación, Mylotarg (ozogamicina de gemtuzumab) no presenta tal efecto de muerte preferencial, sino una diferencia de citotoxicidad de solamente 10 veces entre células progenitoras normales y células progenitoras de LMA. En la FIG. 19, se probaron muestras de pacientes de LMA adicionales. Además, también se
evaluó el conjugado de huCD123 de D5', un reticulante de ADN, y sólo presenta una diferencia de 6 veces de citotoxicidad entre células progenitoras normales y células progenitoras de LMA (véase la FIG. 19)
Ejemplo 11 Potencia in vitro de conjugados de IGN enlazados a lisina en muestras primarias de pacientes con LMA
Se midió la capacidad de los distintos conjugados huCD123-6-IGN enlazados a lisina para destruir células de LMA primarias con ensayos de unidad formadora de colonias (CFU). Se adquirieron las células mononucleares de sangre periférica congelada (PBMC) y las células mononucleares de médula ósea (BMMC) de pacientes con LMA de Conversant Biologics Inc. (Huntsville, AL) y AllCells, LLC (Alameda, CA). Las células se descongelaron tal como lo recomendaron los proveedores, se lavaron y se volvieron a resuspender en el medio de cultivo RPMI (RPMI-1640, suero fetal bovino al 10%, SCF 50 ng/mL y FLT3L 50 ng/mL). Para bloquear los receptores Fc en la superficie celular, se complementó el medio de cultivo con anticuerpo chKTI 100 nM (un anticuerpo del mismo isotipo). Se añadieron las células, 200.000 en 150 pL del medio de cultivo, a cada pocilio de las placas de 96 pocilios de fondo plano. Los conjugados se diluyeron en el medio con una serie de dilución de 10 veces y se añadieron 50 pL por pocillo. Los pocillos de control contenían células y el medio pero carecían de conjugados. Las placas se incubaron a 37 °C en un incubador humidificado al 6% CO2 durante 18 horas. Después, las células se transfirieron a tubos que contenían 2,2 mL de Methocult™ H4534 sin EPO (StemCell Technologies, Vancouver, BC), se mezclaron y las mezclas se transfirieron a placas de 6 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada al 6% de CO2 hasta que se formaron colonias (normalmente de 10 a 16 días) y se contaron. Se determinó el porcentaje de inhibición de formación de colonias comparando los conteos en las muestras tratadas con conjugado con los del control no tratados. El porcentaje de inhibición de colonias se representó gráficamente frente a la concentración de conjugado y se determinó la concentración de conjugado que inhibe el 90% de la formación de colonias (IC90) a partir de las curvas.
El resultado de un ensayo de CFU típico para una muestra de paciente primaria se presenta en la FIG. 12A. Los conjugados huCD123-6-IGN demostraron una citotoxicidad dependiente de la dosis con valores de IC90 de 0,1 nM, 0,01 nM, 0,03 nM y 0,012 nM para huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123- 6Gv1.1-sSPDB-D1 y huCD123-6Gv1.1-D2, respectivamente. La FIG. 12B muestra los valores de IC90 para todas las muestras de pacientes con LMA tratados con los conjugados. Los valores medianos de IC90 para cada conjugado se presentan como líneas continuas e iguales a 2 nM, 0,1 nM, 0,03 nM y 0,02 nM para huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123-6Gv1.1 -sSPDB-D1 y huCD123-6Gv1.1-D2, respectivamente. Por lo tanto, los conjugados huCD123-6-IGN enlazados a lisina demostraron potencia elevada en muestras de pacientes con LMA.
Ejemplo 12 Preparación de conjugados del anticuerpo huCD123-6 específicos del sitio Ser
a) Conjugación de anticuerpo N-terminal: un enfoque de dos etapas
El anticuerpo huCD123-6Gv4.6/7S3 (que tiene huCD123-6Gv4 LCVR (SEQ ID NO: 37, que incluye un Ser N-terminal modificado) y HCVR Gv6/7 (SEQ ID NO: 34) ) ([1], en elEsquema 1 como se muestra en la FIG. 15; 3 mg/ml en PBS, pH 7,4) se trató con peryodato de sodio acuoso 5 mM (50 equivalentes, 25 °C, 30 minutos). Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en tampón de acetato de sodio, pH 5,0.
La solución resultante se trató con 4-aminofenetil alcohol (100 mM en DMA [N,N-dimetilacetamida]) hasta el codisolvente al 10% v/v. Posteriormente se introdujo el enlazador 1 heterobifuncional ([ 3] en el Esquema 1; 5 equivalentes), y el recipiente de reacción se selló y se incubó a 37 °C durante 24 horas.
Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en tampón HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina), pH 8,5. Después, la solución se ajustó con codisolvente DMA (N, N-dimetilacetamida) (10% v/v) y se trató con DGN462 sulfonado (sDGN462) ([5], Esquema 1; tiol libre; 5 equivalentes), a 25 °C durante 6 horas.
El conjugado resultante se intercambió con un tampón en glicina 250 mM, histidina 10 mM, sacarosa al 1%, Tween 20 al 0,01%, tampón del tampón de bisulfito de sodio 50 pM a pH 6,2 usando una columna de filtración NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a 25 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado ([6] , Esquema 1) tenía un promedio homogéneo de dos moléculas DGN462 unidas por anticuerpo (mediante espectrometría de masas Q-ToF), > 98% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <2 % de fármaco libre (mediante análisis de HPLC de fase inversa precipitado con acetona) y una concentración final de proteína de 0,18 mg/mL (mediante UV-Vis usando coeficientes de extinción molar £280 = 213320 M-1cm_1 para el anticuerpo huCD123-6Gv4.6/7S3).
b) Enlace directo de conjugación de anticuerpos N-terminal- IGN
El anticuerpo huCD123-6Gv4.7S2 N-terminal que contiene Ser, modificado con una serina N-terminal en la cadena pesada (huCD123-6Gv4.7S2, que comprende la secuencia de cadena pesada SEQ ID NO: 53 en la que Xaa es Val, y la secuencia de cadena ligera SEQ ID NO: 51) ([1] en el Esquema 2, Figura 16; 3 mg/ml en PBS, pH 7,4) se trató
con peryodato de sodio acuoso 5 mM (50 equivalentes molares) a 25 °C por 30 minutos. Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en un tampón de acetato de sodio, pH 5,0.
La solución resultante se trató con codisolvente p-fenilenediamina (100 mM en DMA [N,N-dimetilacetamida] ) al 10% v/v Después, se introdujo posteriormente anin situsulfonated-D8 (o sD8) ([3], esquema 2; 5 equivalentes molares) y el recipiente de reacción se selló y se incubó a 37 °C durante 24 horas.
Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en glicina 250 mM, histidina 10 mM, tampón de sacarosa al 1% a pH 6,2. Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a 25 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10 000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado ([4] , Esquema 2) tenía un promedio homogéneo de dos moléculas D8 unidas por anticuerpo (mediante espectrometría de masas Q-ToF), > 96% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <3 % de fármaco libre (mediante análisis de HPLC de fase inversa HISEP) y una concentración final de proteína de 1,4 mg/mL (mediante UV-Vis usando coeficientes de extinción molar £280 = 213320 M^cirr1 para el anticuerpo huCD123-6Gv4.7S2) .
El D8 sulfonado in situ (o sD8) descrito anteriormente se preparó de acuerdo con el siguiente procedimiento: El reactivo D8, como un sólido blanco liofilizado, se disolvió en d Ma (n , N-dimetilacetamida ) a una solución de concentración madre de 10-20 mM. Se añadió bisulfito de sodio fresco (solución en agua 500 mM, 5 equivalentes molares) y la solución resultante se hizo reaccionar durante 4-6 horas a 25 °C antes de una etapa de parada de 15 horas a 4 °C. Se introdujo una alícuota adicional de bisulfito de sodio fresco (solución en agua 500 mM, 2 equivalentes molares) y se dejó que reaccionara durante 4 horas a 25 °C antes de su almacenamiento a -80 °C hasta nuevo uso.
c) Protocolo de dos etapas de conjugación de anticuerpos N-terminal para CD123-6Gv4.7
El anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3 (véase anteriormente) modificado con una serina N-terminal en la cadena ligera (huCD123-6Gv4.7S3) ([1] en el Esquema 3, FIG. 17; 3 mg/mL en PBS, pH 7,4) se trató con peryodato de sodio acuoso 5 mM (50 equivalentes molares) a 25 °C durante 30 minutos. Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en tampón de acetato de sodio, pH 5,0.
La solución resultante se trató con 4-aminofenetil alcohol (100 mM en DMA [N,N-dimetilacetamida]) a codisolvente al 10% v/v. Posteriormente se introdujo el enlazador 1 heterobifuncional ([ 3] en el Esquema 3; 5 equivalentes), y el recipiente de reacción se selló y se incubó a 37 °C durante 24 horas.
Después, la mezcla se intercambió con un tampón a través de una columna de desalinización NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) en tampón HEPES (ácido etanosulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina), pH 8,5. Después, se ajustó la solución con codisolvente DMA (N,N-dimetilacetamida) (10% v/v) y se trató con D1 sulfonado (o sD1) ([5], Esquema 3; tiol libre; 5 equivalentes molares), a 25 °C durante 6 horas.
El conjugado resultante se intercambió con tampón en glicina 250 mM, histidina 10 mM, sacarosa al 1%, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación de bisulfito de sodio 50 pM a pH 6,2 con una columna de filtración NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a 25 °C utilizando cassettes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado ([6], Esquema 3) tenía un promedio de 2,0 moléculas de D1 enlazadas por anticuerpo (mediante espectrometría de masas Q-ToF), > 96% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <3 % de fármaco libre (mediante análisis de HPLC de fase inversa precipitado con acetona) y una concentración final de proteína de 0,4 mg/mL (mediante UV-Vis usando coeficientes de extinción molar £280 = 213320 M'1cm_1 para el anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3).
Ejemplo 13 Citotoxicidad in vitro de conjugados específicos de s itio del anticuerpo huCD123-6
La capacidad de los conjugados específicos de sitio de huCD123-6 con los diversos compuestos IGN (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 y huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8) para destruir células que expresan CD123 en su superficie celular se comparó con la de los conjugados enlazados a lisina que contenían el anticuerpo coincidente y la carga útil (huCD123-6Gv4.6-D2 y huCD123-6Rv1.1-D2) usando ensayos de citotoxicidad in vitro. Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo y se analizaron tal como se describió en el Ejemplo 10.
El conjugado huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 (en el que el huCD123-6Gv4.6-CysMab tiene una secuencia de cadena pesada de Ig de SEQ ID NO: 54, y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 51) fue al menos tan activo como el conjugado huCD123-6Gv4.6-D2 enlazado a enlazado (en el que el anticuerpo huCD123-6Gv4.6 tiene una secuencia de cadena pesada de Ig de SEQ ID NO: 50, y una secuencia de cadena de SEQ ID NO: 51) en múltiples líneas celulares. Se muestran varios ejemplos del ensayo de citotoxicidad usando la línea celular de LMA, EOL-1, la línea celular de B-LLA, KOPN-8, y la línea celular de LMC, MOLM-1, en las FIGs. 13A-13C, respectivamente. Ambos
conjugados destruyeron las células de una manera dependiente de la dosis con valores de IC50 de aproximadamente 0,002 nM, 0,005 nM y 0,02 nM para células EOL-1, células KOPN-8 y células MOLM-1, respectivamente. La muerte fue dependiente de CD123 ya que los conjugados fueron al menos 100 veces menos tóxicos para las células cuando el antígeno CD123 fue bloqueado por el anticuerpo chCD123-6 sin conjugar.
El conjugado huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8 (en el que el anticuerpo huCD123-6Rv1.1S2 recubierto tiene una secuencia de cadena pesada de Ig de SEQ ID NO: 60 excepto que el residuo N-terminal es Ser, y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 61) mantuvo la unión de la diana (CD123) y fue al menos tan activa como el conjugado huCD123-6Rv1.1-D2 enlazado a lisina (en el que el huCD123-6Rv1.1 recubierto tiene una secuencia de cadena pesada de Ig de SEQ ID NO: 60, y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 61) en múltiples líneas celulares. Se muestran varios ejemplos del ensayo de citotoxicidad usando las líneas celulares de LMA SHI-1 y HNT-34, así como la línea celular de CML MOLM-1 en las FIGs. 14A-14C, respectivamente. Ambos conjugados destruyeron las células de una manera dependiente de la dosis con valores de IC50 de aproximadamente 0,01 nM, 0,002 nM y 0,03 nM para células SHI-1, células HNT-34 y células MOLM-1, respectivamente. La muerte fue dependiente de CD123 ya que los conjugados fueron al menos 100 veces menos tóxicos para las células cuando el antígeno CD123 fue bloqueado por el anticuerpo huCD123-6 sin conjugar.
En otro experimento, se encontró que el compuesto DGN462 enlazado a Ser con el anticuerpo huCD123 tiene una potencia específica del antígeno 3 veces más elevada que la versión enlazada con lisina con dA r más elevado (datos no mostrados).
Ejemplo 14 Estudios de eficacia in vivo utilizando los conjugados CD123-IGN en el modelo de ratones subcutáneos de LMA MV4-11.
Las células tumorales implantadas subcutáneamente representan un medio conveniente para evaluar posibles fármacos anticanceroso novedosos in vivo. Una gran variedad de líneas celulares humanas y murinas derivadas tanto de tumores sólidos como leucemias, cubriendo un amplio intervalo de genotipos y fenotipos tumorales, se han adaptado a fin de ser cultivadas en un hospedador murino y, por lo tanto, permiten la evaluación de un agente terapéutico sujeto en el modelo de tumor adecuado.
Un modelo de leucemia mieloide aguda subcutánea (LMA), tal como se delinea en el protocolo más adelante, se utiliza para evaluar la eficacia de los conjugados de fármaco y anticuerpo sujeto CD123 (ADC) a fin de determinar su capacidad para reducir la carga tumoral in vivo. Específicamente, cada ratón SCID hembra es inoculado subcutáneamente en el flanco derecho con aproximadamente 1 x 107 células MV4-11, una línea celular de LMA humana. En el día 14 posterior a la inoculación, se dividieron los ratones en forma aleatoria en grupos con base en el volumen tumoral y se trataron con 400 mg/kg de IgG humana mediante inyección intraperitoneal para bloquear los receptores de Fc en las células MV4-11. Los ADC anti-D123 sujetos o controles de anticuerpos no dirigidos (chKTI-lisina enlazado a D1, DchKTI-lisina enlazado a D2 y a huKTI-CysMab enlazado a D2 en los que el anticuerpo huKTI tiene una Cys modificada en una posición correspondiente a la 5' al anterior residuo de SEQ ID NO: 54) se administran por vía intravenosa una vez, el día 15 posterior a la inoculación, a una dosis de 1 o 3 pg/kg. Se trataron los ratones con 100 mg/kg de IgG humana nuevamente el día 20 posterior a la inoculación. Los animales son controlados diariamente y el volumen tumoral se mide dos veces por semana. A continuación, se enumeran los grupos de tratamiento y los grupos de control con las dosis respectivas.
El anticuerpo huCD123 usado en el estudio es el anticuerpo huCD123-6Gv4.7 humanizado, el que se enlaza a D1 o D2 a través del enlace a Lys o a través del enlace a Cys modificado, tal como se describió anteriormente. También se incluyen los conjugados iGn con base en el anticuerpo KTi quimérico enlazado a Lys y los conjugados IGN con base en el anticuerpo KTi humano enlazado a Cys como controles. El último anticuerpo KTi CysMab presenta un Cys modificado en el dominio CH3 de cadena pesada a una posición que corresponde al 5° residuo anterior al último de la SEQ ID NO: 54.
Los datos preliminares muestran que los compuestos IGN enlazados a Cys y con Lys son muy activos contra los tumores de xenoinjerto MV4-11 en el modelo de ratón in vivo.
Ejemplo 15. Preparación de conjugados específicos de s itio Cys del anticuerpo huCD123-6 huCD 123-6Gv1.1S2-CysMab-D7
huCD123-6Gv1.1S2-CysMab es un anticuerpo humanizado injertado con CDR con secuencias LCVR de SEQ ID NO: 33 y secuencia de HC de SEQ ID NO: 48 (excepto que el primer residuo es Ser), y que incluye una Cys modificada correspondiente al 5°último residuo de la SEQ ID NO: 54 o 56.
Este anticuerpo huCD123 que contiene dos residuos cisteína no apareados en su estado reducido se preparó usando procedimientos estándares. Se añadió N,N-dimetilacetamida (DMA), propilenglicol y 10 equivalentes molares de D7 como una solución madre en DMA a una solución de este intermedio en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), ácido N,N,N',N'-etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM, pH 6,0, para producir una mezcla de reacción con una composición de disolvente final de DMA al 2% v/v y propilenglicol al 38% v/v en PBS, EDTA 5 mM, pH 6,0. La reacción se dejó proceder durante 24 horas a 25 °C.
El conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5%, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación bisulfito de sodio 50 pM, pH 6,2, usando columnas de desalinización Sephadex G25, se concentró mediante ultrafiltración a través de una membrana con límite de peso molecular 10 kDa y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm. Después, el conjugado se sometió a diálisis contra el mismo tampón usando una membrana con límite de peso molecular 10 kDa.
Se encontró que el conjugado tiene un anticuerpo 2 mol D7/mol mediante UV-Vis; 97,2% de monómeros mediante SEC y 1,9% de D7 sin conjugar mediante s Ec /HPLC de fase inversa. No se muestra LC-MS del conjugado deglicosilado.
huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5
huCD123-6Gv4.7-CysMab es un anticuerpo humanizado injertado en CDR con secuencias LCVR de SEQ ID NO: 34 (en la que Xaa es Val) y secuencia de HCVR de SEQ ID NO: 35, e que inluye una Cys modificada correspondiente al 5°al último residuo de la SEQ ID NO: 54 o 56.
Este anticuerpo huCD123 que contiene dos residuos de cisteína no apareados en su estado reducido se preparó usando procedimientos estándares. A una solución de este intermedio en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se añadió ácido N,N,N' N'-etilendiaminotetracético (EDTA) 5 mM pH 6,0, N,N-dimetilacetamida (DMA), propilenglicol y 10 equivalentes molares de D5 como una solución madre en DMA para dar una mezcla de reacción con una composición final de disolvente de DMA al 2% v/v y propilenglicol al 38% v/v en PBS EDTA 5 mM pH 6,0 . La reacción se dejó proceder durante 24 horas a 25 °C.
El conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5%, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación bisulfito de sodio 50 pM, pH 6,2, usando columnas de desalinización Sephadex G25, se concentró mediante ultrafiltración a través de una membrana con límite de peso molecular 10 kDa y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm. Después, el conjugado se sometió a diálisis contra el mismo tampón mediante una membrana con límite de peso molecular 10 kDa.
Se encontró que el conjugado tiene un anticuerpo 2 mol D5/mol mediante UV-Vis y 94,8% de monómeros mediante SEC. No se muestra LC-MS del conjugado deglicosilado.
huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4
El anticuerpo huCD123 anterior que contiene dos residuos de cisteína no apareados en su estado reducido se preparó mediante procedimientos estándares. A una solución de este intermedio en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se añadió ácido N,N,N',N'-etilendiaminotetracético (EDTA) 5 mM pH 6,0, N, N-dimetilacetamida (DMA), propilenglicol y 5 equivalentes molares de D4 como una solución madre en d Ma para dar una mezcla de reacción con una composición final de disolvente de DMA al 2% v/v y propilenglicol al 38% v/v en PBS EDTA 5 mM pH 6,0 . La reacción se dejó proceder durante 6 horas a 25 °C.
El conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5%, Tween 20 al 0,01%, tampón de formulación bisulfito de sodio 50 pM, pH 6,2, usando columnas de desalinización Sephadex G25, se concentró mediante ultrafiltración a través de una membrana con límite de peso molecular 10 kDa y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm. Después, el conjugado se sometió a diálisis contra el mismo tampón mediante una membrana con límite de peso molecular 10 kDa.
Se encontró que el conjugado tiene un anticuerpo 1,8 mol D4/mol mediante UV-Vis y 97,4% de monómeros mediante SEC. No se presenta LC-MS del conjugado deglicosilado.
Ejemplo 16. Síntesis del compuesto D1
Compuesto 1a:
A una solución agitada de (5-amino-1,3-fenileno) dimetanol (1,01 g, 6,59 mmol) en dimetilformamida anhidra (16,48 ml) y tetrahidrofurano anhidro (16,48 ml) se le añadió 4-metil-4-( ácido metildisulfanil) pentanoico (1,281 g, 6,59 mmol), clorhidrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida (2,53 g, 13,19 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (0,081 g, 0,659 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de cloruro de amonio saturada y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con agua y salmuera y después se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. La disolución se filtró y se concentró a vacío y el residuo resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (Hexanos/EtOAc) para obtener el compuesto 1a como un sólido blanco (0,70 g, 32% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): ó 9,90 (s, 1H), 7,43 (s, 2H), 6,93 (s, 1H), 5,16 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 4,44 (d, 4H, J = 5,7 Hz), 2,43 (s, 3H), 2,41-2,38 (m, 2H), 1,92-1,88 (m, 2H), 1,29 (s, 6H). MS (m/z), encontrado 330,0 (M 1)+.
Compuesto 1b:
A una solución enfriada (-10 °C) del compuesto 1a (219 mg, 0,665 mmol) en diclorometano anhidro (6,65 ml) se le añadió trietilamina (463 pl, 3,32 mmol) seguido de la adición gota a gota de anhídrido metanosulfónico (298 mg, 1,662 mmol). Se agitó la mezcla a -10 °C durante 2 horas, después la mezcla se inactivó con agua helada y se extrajo con acetato de etilo frío (2 x 30 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con agua helada, se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para obtener el dimesilato bruto.
El dimesilato crudo (227 mg, 0,467 mmol) y monómero A de IGN (o indolinobenzodiazepina) (303 mg, 1,028 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (3,11 mL). Se añadió carbonato de potasio (161 mg, 1,169 mmol) y la mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se añadió agua desionizada y el precipitado resultante se filtró y se enjuagó con agua. El sólido se redisolvió en diclorometano y se lavó con agua. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (metanol/diclorometano) para dar el compuesto 1b (227 mg, 36% de rendimiento). MS (m/z), encontrado 882,5 (M 1)+.
Compuesto 1c:
A una suspensión del compuesto 1b (227 mg, 0,167 mmol) en 1,2-dicloroetano anhidro (3,346 ml) se le añadió triacetoxiborohidruro de sodio (37,3 mg, 0,167 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora tras cual se inactivó con solución de cloruro de amonio saturado. La mezcla se extrajo con diclorometano y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó mediante r P-HPLC (C18, agua/acetonitrilo). Las fracciones que contenían el producto deseado se extrajeron con diclorometano, se secaron con sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el compuesto 1c (35 mg, 19% de rendimiento). MS (m/z), encontrado 884,3 (M 1)+.
Compuesto 1d:
A una solución del compuesto 1c (18 mg, 0,017 mmol) en acetonitrilo (921 pL) y metanol (658 pL) se le añadió clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina (17,51 mg, 0,060 mmol) (neutralizado con una solución de bicarbonato de sodio saturado (0,2 ml) en tampón fosfato de sodio (132 pl, 0,75 M, pH 6,5). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas, después se diluyó con diclorometano y agua desionizada. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para obtener el tiol bruto. MS (m/z), encontrado 838,3 (M 1)+.
Se disolvió el tiol crudo (15,5 mg, 0,018 mmol) en 2-propanol (1,23 mL). Se añadieron agua desionizada (617 pL) y bisulfito de sodio (5,77 mg, 0,055 mmol) y la mezcla se agitó durante cinco horas a temperatura ambiente. La reacción se congeló en un baño de acetona/hielo seco, liofilizado y purificado mediante RP-HPLC (C18, agua desionizada/acetonitrilo). Se congelaron fracciones que contenían producto deseado y se liofilizaron para dar el compuesto de ácido (12S,12aS)-9-((3-(4-mercapto-4-metilpentanamido)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)bencil)oxi)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-12-sulfónico (compuesto sulfonado-D1 (sD1)) (6,6 mg, 39% de rendimiento). MS (m/z), encontrado 918,2 (M - 1)'.
Ejemplo 17. Síntesis de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo 6-(((S)-1- (((S)-1-((3-(((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo [5,6] [1,4] diazepino[1,2-a] indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8 -metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6] [1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato, compuesto D2
Etapa 1: Se disolvieron ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanoico (5 g, 22,40 mmol) e hidrocloruro de (S)-terc-butil 2-aminopropanoato (4,48 g, 24,64 mmol) en anhidro Dm F (44,8 ml). Se añadieron Ed CHCI (4,72 g, 24,64 mmoles), HOBt (3,43 g, 22,40 mmoles) y DIPEA (9,75 mL, 56,0 mmoles). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y después se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El aceite crudo se purificó por cromatografía en gel de sílice (Hexanos/Acetato de Etilo) para rendir el compuesto 2a (6,7 g, 85% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCla): ó 7,38-7,31 (m, 5H), 6,53-6,42 (m, 1H), 5,42 5,33 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,32-4,20 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,38 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Etapa 2: El Compuesto 2a (6,7 g, 19,12 mmol) se disolvió en metanol (60,7 mL) y agua (3,03 mL). La disolución se purgó con argón durante cinco minutos. Se añadió lentamente paladio sobre carbono (húmedo, 10%) (1,017 g, 0,956 mmoles). La reacción se agitó toda la noche bajo una atmósfera de hidrógeno. La disolución se filtró a través de Celite, se enjuagó con metanol y se concentró. Se destiló en forma azeotrópica con metanol y acetonitrilo y el aceite resultante se coloocó directamente en alto vacío para dar el compuesto 2b (4,02 g, 97% de rendimiento) que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, CDCla): ó 7,78-7,63 (m, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,55-3,50 (m, 1H), 1,73 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Etapa 3: El Compuesto 2b (4,02 g, 18,59 mmol) y mono metiladipato (3,03 mL, 20,45 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (62,0 mL). Se añadieron EDCHCl (3,92 g, 20,45 mmoles), HOBt (2,85 g, 18,59 mmoles) y DIPEA (6,49 mL, 37,2 mmoles). La mezcla se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con diclorometano/metanol (150 mL, 5:1) y se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. Se secó en sulfato de sodio, se filtró y depuró. El compuesto se destiló en forma azeotrópica con acetonitrilo (5x), después se bombeó en alto vacío a 35 °C para proporcionar el compuesto 2c (6,66 g, 100% de rendimiento). El material crudo se llevó a la siguiente etapa sin purificación. 1H RMN (400 MHz, CDCb): ó 6,75 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,52-4,44 (m, 1H), 4,43-4,36 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 2,35-2,29 (m, 2H), 2,25-2,18 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,36 (t, 6H, J = 6,0 Hz).
Etapa 4: El compuesto 2c (5,91 g, 16,5 mmol) se agitó en TFA (28,6 mL, 372 mmol) y agua desionizada (1,5 mL) a temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla de reacción se concentró con acetonitrilo y se colocó en alto vacío para proporcionar el compuesto crudo 2d como un sólido pegajoso (5,88 g, 100% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCla): ó 7,21 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,81 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 4,69-4,60 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,40-2,33 (m, 2H), 2,31-2,24 (m, 2H), 1,72-1,63 (m, 4H), 1.51-1.45 (m, 3H), 1.42-1.37 (m, 3H).
Etapa 5: El compuesto 2d (5,6 g, 18,52 mmoles) se disolvió en diclorometano anhidro (118 mL) y metanol anhidro (58,8 mL). Se añadieron (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,70 g, 17,64 mmoles) y EEDQ (8,72 g, 35,3 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. El disolvente se depuró y se añadió acetato de etilo. La suspensión de sólidos resultante se filtró, se lavó con acetato de etilo y se secó bajo vacío/N2 para dar el compuesto 2e (2,79 g, 36% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): ó 9,82 (s, 1H), 8,05, (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,01 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,46 (s, 2H), 6,95 (3, 1H), 5,21-5,12 (m, 2H), 4,47-4,42 (m, 4H), 4,40-4,33 (m, 1H), 4,33-4,24 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,16-2,09 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 4H), 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,22 (d, 3H, J = 4,4 Hz).
Etapa 6: El compuesto 2e (0,52 g, 1,189 mmol) y tetrabromuro de carbono (1,183 g, 3,57 mmol) se disolvieron en DMF anhidro (11,89 mL). Se añadió trifenilfosfina (0,935 g, 3,57 mmol) y la mezcla se agitó en argón durante cuatro horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (10:1), se lavó con agua y salmuera, se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para dar el compuesto 2f (262 mg, 39% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): ó 10,01 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 6,8 Hz),
8,03 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,67 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,70-4,64 (m, 4H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,18-2,10 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,21 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Etapa 7: Se disolvieron el compuesto dibromuro 2 f y el compuesto monómero IGN I-1 en DMF. Se añadió carbonato de potasio y se agitó a t.a. durante la noche. Se añadió agua a la mezcla de reacción para precipitar el producto. La suspensión se agitó a ta durante 5 min y luego se filtró y se secó bajo vacío/N2 durante 1 h. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (metanol/diclorometano) para dar el compuesto 2g (336 mg, 74% de rendimiento). LCMS = 5,91 min (método de 15 min). MS (m/z): 990,6 (M 1)+.
Etapa 8: Se disolvió el compuesto diimina 2g en 1,2-dicloroetano. Se añadió NaBH(OAc)3 a la mezcla de reacción y se agitó a ta durante 1 h. La reacción se diluyó con CH2Cl2 y se inactivó con solución aq de NH4Cl sat. Las capas se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El material crudo se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para dar el compuesto 2h (85,5 mg, 25% de rendimiento). LCMS = 6,64 min (método de 15 min). MS (m/z): 992,6 (M 1)+.
Etapa 9: Se disolvió el compuesto metiléster 2h en 1,2-dicloroetano. Se añadió trimetilestananol a la mezcla de reacción y se calentó a 80 °C durante toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió a t.a. y se diluyó con agua. Se acidificó la capa acuosa hasta pH ~ 4 con HCl 1 M. La mezcla se extrajo con CH2Cl2/MeOH (10: 1, 3 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El material crudo se pasó a través de un lecho de sílice para dar el compuesto 2i (48,8 mg, 80% de rendimiento). LCMS = 5,89 min (método de 15 min). MS (m/z): 978,6 (M 1)+.
Etapa 10: Se añadió EDCHCl a una solución agitada de compuesto ácido 2i y N-mdroxisuccmamida en CH2Cl2 a t.a. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con agua (1 x 15 mL) y salmuera (1 x 15 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó a través de RPHp Lc (columna C18, acetonitrilo/agua) para dar 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato, compuesto D2 (8,2 mg, 30% de rendimiento). LCMS = 6,64 min (método de 15 min). EM (m/z): 1075,4 (M 1)+.
Ejemplo 18. Síntesis de N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil)-11-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil-13,13-dimetil-2,5,8-trioxa-14,15-ditia-11-azanonadecan-19-amida, compuesto D6
Etapa 1: A una solución del tio IDGN462 libre ( 40 mg, 0,042 mmol) y NHS 4-(2-p¡rid¡ld¡t¡o) butanato de (35 mg, 80% de pureza, 0,085 mmol) en diclorometano anhidro (0,5 mL) se añadió diisopropiletilamina anhidra (0,015 ml, 0,085 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se inactivó con cloruro de amonio saturado acuoso y se diluyó con diclorometano. La mezcla obtenida se separó en un embudo de separación. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó en sulfato de sodio anhidro, se filtró y se depuró bajo presión reducida. The residue was purified by semi-preparative reverse phase HPLC (C18 column, CH3CN/H2O). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, congelaron y liofilizaron para dar el éster de NHS deseado, compuesto 6a (29,7 mg, 60% de rendimiento). LCMS = 9,1 min (método de 15 min). MS (m/z): 1157,3 (M 1)+.
Etapa 2: A una solución del éster NHS, se añadió el compuesto 6a (12,3 mg, 0,011 mmol) y clorhidrato de N-(2-aminoetil) maleimida (2,0 mg, 0,011 mmol) en diclorometano anhidro (0,3 mL) DIPEA (0,0022 ml, 0,013 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y después se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC de fase inversa semipreparativa (columna C18, CH3CN/H2O). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, congelaron y liofilizaron para dar el éster de NHS deseado, compuesto D6 (10 mg, 80% de rendimiento). LCMS = 8,3 min (método de 15 min). MS (m/z): 1181,8 (M 1)+.
Ejemplo 19. Síntesis de N1-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)adipamida, compuesto D5
Se disolvieron éster NHS, compuesto 5a (8,2 mg, 7,6 pmol) y clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (2,2 mg, 0,011 mmol) en diclorometano anhidro (305 pL) a temperatura ambiente. Se añadió DIPEA (2,66 pL, 0,015 mmol) y la reacción se agitó durante 3,5 horas. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, 35% a 55%). Las fracciones de producto deseadas se congelaron y liofilizaron para dar maleimida, compuesto D5 como un polvo blanco sólido (5,3 mg, 58% de rendimiento). LCMS = 5,11 min (método de 8 min). MS (m/z): 1100,6 (M 1)+.
Ejemplo 20. Síntesis de ácido 1-((2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil)amino)-4-((5-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)-1-oxobutano-2-sulfónico, compuesto D4
A una suspensión del tiol libre, D1 (88 mg, 0,105 mmol) y 1-((2,5-dioxopirrolidin-1-il oxi)-1 -oxo-4-(piridin-2-yldisulfanilo) se añadió ácido butano-2-sulfónico (sulfo-SPDB) (64,0 mg, 0,158 mmol) en diclorometano anhidro (2,10 mL) DIPEA (55,0 pL, 0,315 mmol) bajo nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 16 horas y después se
añadieron clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrolo-2,5-diona (55,6 mg, 0,315 mmol), diclorometano anhidro (1,0 mL) y DIPEA (0,055 mL, 0,315 mmol). La mezcla se agitó durante 5 horas más a temperatura ambiente, tras lo cual la reacción se concentró al vacío.El residuo resultante se purificó mediante RP-HPLC (C18, CH3CN/H2O). Las fracciones que contenían el producto deseado se congelaron y liofilizaron para dar maleimida, D4 (20 mg, 16% de rendimiento) como un sólido blanco. LCMS = 4,92 min (método de 8 min). m S (m/z): 1158,6 (M 1)+.
Ejemplo 21. Síntesis de N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil)-11-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)-2,5,8-trioxa-11-azapentadecan-15-amida, compuesto D7
A una solución de éster NHS, 7a (5 mg, 4,82 pmol) e hidrocloruro de 1-(2-aminoetil) -1H-pirrol-2,5-diona (1,7 mg, 9,64 pmol) en diclorometano anhidro (200 pL) se añadió DIPEA (1,512 pl, 8,68 pmol) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y después se concentró al vacío.El residuo resultante se purificó mediante RP-HPLC (C18, CH3CN/H2O). Las fracciones que contenían el producto deseado se congelaron y liofilizaron para dar maleimida, D7 (3,5 mg, 68% de rendimiento). LCMS = 4,61 min (método de 15 min). MS (m/z): 1062,8 (M 1)+.
Ejemplo 22. Síntesis del compuesto D8
Etapa 1: Se disolvió hidroxicarbamato de terc-butilo (1,490 g, 11,19 mmol) en DMF anhidra (22,38 mL). Se añadieron 2-(3-bromopropil) isoindolina-1,3-diona (3 g, 11,19 mmol) y carbonato potásico (3,09 g, 22,38 mmol) y la reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se diluyó con agua fría y se extrajo con EtOAc. El producto orgánico se lavó con salmuera, se secó en sulfato de sodio y el residuo crudo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/Hex, gradiente, 0% a 45%) para obtener el compuesto 8a como un sólido pegajoso (2,41 g, 67% de rendimiento). LCMS = 4,99 min (método de 8 min). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 67,86-7,83 (m, 2H), 7,73-7,77 (m, 2H), 7,28 (bs, 1H), 3,92 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 3,82 (t, 2H, 6,9Hz), 2,05-1,98 (m, 2H), 1,47 (s, 9H).
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 8a (2,41 g, 7,52 mmol) en DCM anhidro (18,81 ml) y se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. Se añadieron una solución recientemente mezclada de DCM (9,40 ml) y TFA (9,40 ml) y se eliminó el baño de hielo. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora y se diluyó con DCM y se lavó con bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó, se filtró y se concentró para dar el compuesto 8b (1,32 g, 80% de rendimiento). El material crudo se utilizó sin purificación adicional. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 67,85 7,82 (m, 2H), 7,72-7,69 (m, 2H), 3,78 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,72 (t, 2H, 6,0Hz), 1,99-1,93 (m, 2H).
Etapa 3: Se disolvió el compuesto 8b (100 mg, 0,454 mmol) en DCM anhidro (4,5 mL) TEA (127 pl, 0,908 mmol) y 2,5-dioxopirrolidin-1-il(2-(trimetilsilil)etil) carbonato (177 mg, 0,681 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se diluyó la reacción con DCM, se lavó con salmuera, se secó, se filtró y se evaporó. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/Hex, gradiente, 0% a 40%) para obtener el compuesto 8c (148 mg, 89% de rendimiento). LCMS = 5,91 min (método de 8 min). 1H NMR (400 MHz, CDCb): 6
7,86-7,83 (m, 2H), 7,73-7,69 (m, 2H), 7,39 (bs, 1H), 4,26-4,20 (m, 2H), 3,94 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 3,83 (t, 2H, 6,9Hz), 2,06-1,98 (m, 2H), 1,05-0,98 (m, 2H), 0,04 (s, 9H).
Etapa 4: Se disolvió el compuesto 8c (148 mg, 0,406 mmol) en etanol (2,7 mL) y se agitó hasta ser completamente soluble. Se añadió hidrazina (63,7 pl, 2,030 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta la formación rápida de un precipitado blanco a 1 hora. La reacción se filtró a través de celite y se enjuagó con etanol adicional. El filtrado se evaporó y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (A= MeOH, B= EtOAc gradiente, 100% a 10%). Las fracciones del producto se detectaron en masa y se evaporaron para dar el compuesto 8d como un sólido pegajoso.(67,5mg, 71% yield). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 64,27-4,21 (m, 2H), 3,98 (t, 2H, J= 5,9 Hz), 2,92 2,87 (m, 2H), 1,85-1,77 (m, 2H), 1,06-0,99 (m, 2H), 0,04 (s, 9H).
Etapa 5: Se suspendió el compuesto 2i (30 mg, 0,031 mmol) descrito anteriormente en el Ejemplo 17 en DCM anhidro (613 pl). Se añadió gota a gota DMF anhidro hasta que la solución se aclaró. Se añadió el compuesto 8d (21,57 mg, 0,092 mmol), EDC ■ HCl (29,4 mg, 0,153 mmol) y DMAP (0,749 mg, 6,13 pmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyó con DCM/MeOH 10:1 y después se lavó con agua. La capa acuosa se extrajo con DCM/MeOH 10: 1 y la fase orgánica combinada se secó y se concentró para dar el Compuesto 8e (49 mg) que se usó sin purificación adicional. LCMS = 5,94 min (método de 8 min). MS (m/z): 1194,4 (M 1)+.
Etapa 6: Se disolvió el compuesto 8e (49 mg, 0,041 mmol) en THF (820 pL) y la reacción se enfrió hasta 0 °C en un baño de hielo. Se añadió TBAF (205 pl, 0,205 mmol) y la reacción se agitó durante 15 minutos antes de que se eliminara el baño de hielo. Se agitó a temperatura ambiente hasta completarse. La reacción se enfrió a 0°C, se inactivó con cloruro de amonio saturado y se extrajo con DCM/MeOH 10:1. La orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se evaporó. El material crudo se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para dar el compuesto D8 (17,6 mg, 54% de rendimiento en 2 etapas). LCMS = 5,1 min (método de 8 min). MS (m/z): 1050,4 (M 1)+.
Ejemplo 23. Síntesis del compuesto D9
Etapa 1: Se disolvió el compuesto 9a (17 mg, 0,016 mmol) en DCM (328 pL). Se añadieron el compuesto 8d (5,76 mg, 0,025 mmol) y DIPEA (5,71 pl, 0,033 mmol) a temperatura ambiente y la reacción se agitó hasta que se completó. Se diluyó con 10:1 DCM:MeOH y se lavó con salmuera. La orgánica se secó y se concentró para dar el compuesto 9b que se usó directamente.
Etapa 2: El compuesto D9 se preparó de manera similar al compuesto D8 en el Ejemplo 23. El material crudo se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para dar el compuesto (5 mg, 31% de rendimiento en 2 etapas). LCMS = 5,68 min (método de 8 min). MS (m/z): 1012,5 (M 1) .
Ejemplo 24. Eficacia in vivo de huCD123-CysMab-D5 en el modelo diseminado Kasumi-3-Luc-mCh-Puro
Para probar la eficacia de huCD123-CysMab-D5 en cuanto a la capacidad de disminuir la carga tumoral diseminada in vivo, se usó un modelo de tumor diseminado que expresa luciferasa en combinación con imágenes de animales vivos, como se describe en el protocolo a continuación.
Se inyectaron cada uno de los ratones hembra NSG (Jackson Labs) por vía intravenosa (IV) en la vena de la cola con 5x106 células Kasumi-3-Luc-mCh-Puro, una línea celular de LMA humana diseñada para expresar luciferasa y mCherry (en Molecular Imaging, Ann Arbor, MI). La expresión de luciferasa por las células Kasumi-3 permite cuantificar la carga tumoral usando un generador de imágenes de animales vivos, que detecta la señal de bioluminiscencia producida por la luciferasa tras la exposición in vivo al sustrato de luciferasa inyectado, D-luciferina. El día 6 posterior a la inoculación, se tomaron imágenes de los ratones y se asignaron al azar a los grupos de estudio según la imaginación bioluminiscente (BLI). 24 h antes de cada administración de conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal (IP) 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores Fc en las células de la LMA Kasumi-3, evitando la absorción inespecífica del conjugado. Los días 7 y 41 posteriores a la inoculación con Kasumi-3, se administraron inyecciones IV individuales en la vena de la cola lateral de vehículo, 10 pg/kg (por D5, 0,80 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5, 0,240 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5 o 10 pg/kg de un conjugado de control de KTI-CysMab-D5 no dirigido. Los días 5 y 10 posteriores a la administración de conjugados, se administró una inyección IP de 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido a los ratones para garantizar la continuación de obstrucción de receptores de Fc en las células de tumores de LMA.
Se obtuvieron imágenes de los ratones los 11, 13, 17, 20, 24, 27, 31, 38, 41, 45, 52, 59, 66, 73 y 80 después de la inoculación con Kasumi-3. La imagenología de bioluminiscencia in vivo se realizó en Molecular Imaging (Ann Arbor, MI) usando un dispositivo de imagenología óptica IVIS 50 (Xenogen, Alameda, CA). Las imágenes se obtuvieron de a tres en forma simultánea con anestesia con gas isoflurano al ~1-2%. A cada ratón se le inyectó IP 150 mg/kg de D-luciferina (sustrato de luciferasa) y se obtuvieron imágenes en las posiciones prona, luego supina, 10 minutos después de la inyección. Se usó agrupamiento de mayor a menor de chip CCD y se ajustó el tiempo de exposición (2 segundos a 2 minutos) para obtener al menos varios cientos de conteos de los tumores observables en cada ratón en la imagen y para impedir la saturación del chip CCD. Se analizaron las imágenes usando Matlab R2015a. Un script adaptado ubicó las ROI de volumen fijo de cuerpo completo en imágenes de decúbito prono y supino para cada animal individual, y las etiquetó con base en la identificación del animal. Se calculó el flujo total (fotones/segundo) y se exportó para todas las ROI para facilitar los análisis entre grupos. Se sumaron las ROI de decúbito prono y supino para estimar la carga tumoral de cuerpo entero.
Se calculó %T/C en la forma siguiente = [(T, mediana de BLI de grupo tratado)/ (C, mediana de BLI de grupo de control)] x 100%. De acuerdo con los estándares de NCI, un T/C < 42% es el nivel mínimo de actividad antitumoral, mientras que un valor de T/C > 42% es inactivo, y un valor de T/C < 10% se considera muy activo.
El % de retraso de la carga tumoral (% TBD) se calculó de la siguiente manera: % TBD = (TC)/C x 100%, donde TC, donde T es el tiempo (en días) para el grupo tratado y C es el tiempo (en días) para que el grupo de control alcance la señal BLI designada. Adaptando las mismas métricas aplicadas al % ILS, consideramos % TBD > 25 como mínimamente activo, % TBD > 40 como activo y % TBD > 50 como muy activo.
Se pesaron los ratones dos veces por semana y se controló la presencia de indicios clínicos durante el estudio. Se practicó eutanasia a todos los ratones que cumplieron con los criterios para ello. Se registraron las muertes espontáneas a medida que se descubrieron. Se terminó el estudio el día 115 posterior a la inoculación con células tumorales.
Los experimentos preliminares muestran que el tratamiento con cualquier dosis de huCD123-CysMab-D5 casuó una regresión inicial de la carga tumoral con el transcurso del tiempo hasta llegar a un nadir el día 27, mientras que la carga tumoral aumentó en forma constante en los grupos tratados con vehículo y KTI-CysMab-D5 durante dicho período de tiempo. Véase, por ejemplo, la FIG. 22. La inhibición de crecimiento tumoral (valor de T/C) calculada para dichos experimentos preliminares mostró que 10 pg/kg y 3 pg/kg de huCD123-CysMab-D5 son muy activas el día 27 con valores de%T/C de 0,20 y 0,25, respectivamente. También se calculó el porcentaje de desfase de carga tumoral (%TBD) usando la señal BLI el día 45 del grupo tratado con vehículo como el BLI designado. De acuerdo con este parámetro, ambas dosis de huCD123-CysMab-D5 son muy activas, lo que resulta en un %TBD > 75% (10 pg/kg de huCD123-CysMab-D5) y > 65% (3 pg/kg de huCD123-CysMab-D5), en contraste con el 0% TBD observado con 10 pg/kg del conjugado de KTI-CysMab-D5 de control. Además, el tratamiento con huCD123-CysMab-D5 en dosis tanto de 3 pg/kg como de 10 pg/kg extendió la supervivencia en 6/6 ratones con LMA resistente multifármaco y con mutación P53 en comparación con el control (véase la FIG. 23).
Se presenta la supervivencia para cada uno de los cuatro grupos de estudio al momento de su finalización en la FIG.
31 y se resume en la tabla que se encuentra a continuación. Los ratones tratados con vehículo presentaron una mediana de supervivencia de 70 días. En contraste, los ratones tratados con 10 pg/kg (por D5, 0,80 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5 presentaron una mediana de supervivencia de 115 días, lo que resulta en un 64% ILS (muy activo). De igual forma, los ratones tratados con 3 pg/kg (por D5, 0,240 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5 presentaron una mediana de tiempo de supervivencia de 105 días, lo que resulta en un 50% ILS (muy activo). Los ratones tratados con 10 pg/kg (por D5) de conjugado de control no dirigido de huKTI-CysMab-D5 tuvieron
una mediana de supervivencia de 65,5 días, lo que generó 0% ILS (inactivo), lo que indica que la gran actividad obtenida con huCD123-CysMab-D5 depende de CD123.
Para N = 6, la supervivencia del medio (días) es la media de los días en los que se pierden el 3 ° y 4° ratón. Usando los valores de supervivencia media, el % ILS (aumento de la esperanza de vida) se calcula como: % ILS = (TC)/C x 100%, donde T es la supervivencia media (en días) del grupo tratado y C es la supervivencia media (en días) del grupo de control. Los estándares del NCI para modelos diseminados son: ILS > 25% es mínimamente activo, ILS > 40% es activo e ILS > 50% es muy activo.
Ejemplo 25: El conjugado huCD123-CysMab-D5 induce daño en el ADN, detención del c iclo celular principal en fase S y muerte celular mediada por apoptosis de células MV4-11
Para evaluar el mecanismo de la muerte celular mediada por huCD123-CysMab-D5, se trataron células de LMA MV4-11 que expresan CD123 con 10 nM de huCD123-CysMab-D5 durante una hora, seguido de una incubación adicional en un medio de cultivo libre de conjugado durante 48 horas a 37 °C. Se usaron células MV4-11 no tratadas como control. Se cultivaron las células y se tiñeron con varios reactivos para cuantificar la cantidad de células en diferentes etapas del ciclo celular (yoduro de propidio), células con daño de ADN (pH2AX), apoptosis (anexina V y caspasa 3 escindida) y membrana plasmática perforada (TO-PRO-3). Como se demuestra en la FIG. 24, la incubación de las células MV4-11 con huCD123-CysMab-D5 provoca daño en el ADN, detención en la fase S del ciclo celular y muerte celular mediada por apoptosis.
Ejemplo 26. Eficacia in vivo de huCD123-CysMab-D5 en el modelo diseminado Molm-13
Recopilación y análisis de datos para todos los modelos diseminados: Los ratones se pesaron dos veces por semana y se controlaron para detectar signos clínicos durante la duración del estudio. El punto final medido fue la supervivencia. Los animales se sacrificaron cuando hubo parálisis de las patas traseras, el peso corporal disminuyó en > 20% del peso de pretratamiento, apareció un tumor visible o cualquier signo de malestar era visible. Se registraron las muertes espontáneas a medida que se observaron. Para modelos diseminados, el retraso del crecimiento tumoral se calcula como T-C, donde T es el tiempo de supervivencia medio (en días) de un grupo tratado y C es el tiempo de supervivencia medio (en días) del grupo de control del vehículo. Se calcula el porcentaje de plazo de vida aumentado (%ILS) para modelos diseminados usando la siguiente fórmula: %ILS = (T-C)/C x 100%. La actividad antitumoral se evaluó según los estándares del NCI para modelos diseminados: ILS > 25% es mínimo activo, ILS> 40% está activo e ILS > 50% es muy activo.
Para probar la eficacia de huCD123-CysMab-D5 en cuanto a la capacidad de disminuir la carga tumoral in vivo, se usó un modelo de tumor diseminado como se describe en el protocolo a continuación.
Se inyectaron cada uno de los ratones desnudos atímicos hembra por vía intravenosa en la vena lateral de la cola con 10x106 células Molm-13, una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio sin suero. El día 7 posterior a la inoculación, se asignaron los ratones en forma aleatoria a los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores Fc en las células de LMA Molm-13, evitando la captación inespecífica del conjugado. El día 7 posterior a la inoculación de Molm-13, los ratones recibieron una única inyección intravenosa, en la vena lateral de la cola, de vehículo, 0,1 pg/kg (por D5, 0,008 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 0,3 pg/kg (por D5, 0,024 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D5, 0,08 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D5, 0,08 mg/kg por huKTI) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 0,1 pg/kg (por D2, 0,0059 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2, 0,3 pg/kg (por D2, 0,018 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2, 1 pg/kg (por D2, 0,059 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2 o 1 pg/kg (por D2, 0,059 mg/kg por chKTI) de conjugado de control de chKTI-lisina enlazado a D2. Los días 4 y 9 posteriores a la administración
del conjugado, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para asegurar el bloqueo continuo de los receptores Fc en las células tumorales de LMA. Los resultados se resumen en la tabla a continuación y en la FIG. 25.
El conjugado huCD123-CysMab-D5 presentó actividad elevada para las tres dosis probadas, lo que generó un %ILS > 262,5 días. En contraste, una dosis de 1 pg/kg (por D5) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5 no dirigido estaba inactivo, generando un 0% de ILS. Esto demuestra la actividad dependiente de CD123 huCD123-CysMab-D5. De manera similar, huCD123-lisina enlazado a D2 fue muy activo en las tres dosis probadas, generando cada una un % ILS de > 59. Sin embargo, una dosis 1 pg/kg (por D2) de conjugado de control no dirigido chKTI-lisina enlazado a D2, lo que genera un 11% ILS, lo que demuestra la actividad dependiente a CD123 de huCD123-lisina enlazado a D2. La única diferencia obvia entre huCD123-CysMab-D5 y huCD123-lisina enlazado a D2 se puede ver al comparar el % ILS obtenido con la dosis de 0,1 pg/kg, la dosis más baja probada, de cada conjugado dirigido a CD123. El % ILS obtenido con 0,1 pg/kg de huCD123-CysMab-D5 fue de 262,5 días, al tiempo que el obtenido con una dosis de 0,1 pg/kg de huCD123-lisina enlazado a D2 fue de 59 días, lo que indica la superioridad de huCD123-CysMab-D5 en este modelo.
Ejemplo 27 Eficacia in vivo de huCD123-CysMab-D5 en modelos subcutáneos EOL-1
Recopilación y análisis de datos para todos los modelos subcutáneos: Los ratones se pesaron dos veces por semana y se controlaron para detectar signos clínicos durante la duración del estudio. Se sometió a los animales a eutanasia cuando presentaron parálisis de las patas traseras, se redujo su peso corporal > 20% respecto al peso antes del tratamiento, se produjeron ulceraciones tumorales o fueron visibles señales de dolor. Se midieron los volúmenes tumorales una a dos veces por semana en forma tridimensional con un calibre. El volumen del tumor se expresó en mm3 usando la fórmula V = Largo x Ancho x Alto x A (Tomayko y Reynolds, Cancer Chemother. Pharmacol. 24: 148 54 (1989)). Se evaluó la actividad tal como se describió en Bissery et al., Cancer Res. 51: 4845-52 (1991). La inhibición del crecimiento tumoral (valor T/C) también se evaluó usando la siguiente fórmula: T/C (%) = (volumen tumoral medio del tratado/volumen tumoral medio del control) x 100%. Se determinó el volumen tumoral somultáneamente para los grupos tratado (T) y de control vehículo (C) cuando el volumen tumoral del control vehículo llegó a un tamaño predeterminado (Bissery et al., Cancer Res. 51: 4845-52 (1991). Se determinó la mediana del volumen tumoral diario de cada grupo tratado, incluidos los ratones sin tumor (0 mm3). De acuerdo con los estándares del NCI [Instituto Nacional del Cáncer] un T/C < 42% es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C < 10% se considera un nivel de actividad antitumoral elevado.
Para probar la eficacia de huCD123-CysMab-D5 en cuanto a la capacidad de disminuir la carga tumoral in vivo, se utilizaron tres estudios en un modelo de tumor subcutáneo como se describe en los protocolos siguientes.
En un primer estudio, se inoculó cada uno de los ratones lampiños atímicos hembra con células EOL-1 10x106 , una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio sin suero/matrigel en forma subcutánea en el flanco derecho. El día 6 después de la inoculación con EOL-1, se asignaron los ratones en forma aleatoria a los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores Fc en las células LMA EOL-1, evitando la absorción inespecífica del conjugado. El día 7 posterior a la inoculación con EOL-1, se administró una única inyección intravenosa a los ratones en la vena de cola lateral de vehículo, 1 pg/kg (por D5, 0,08 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5, 0,24 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D2, 0,050 mg/kg por huCD123) de huCD123-enlazado a lisina-D2, 3 pg/kg (por D2, 0,151 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2, 1 pg/kg (por D5, 0,08 mg/kg por huKTI) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5, 0,24 mg/kg por huKTI) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D2, 0,050 mg/kg por chKTI) de chKTI-lisina enlazado a D2 o 3 pg/kg (por D2, 0,151 mg/kg por chKTI) de conjugado de control chKTI-lisina enlazado a D2. Los días 4 y 9 posteriores a la administración de conjugados, se administró una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido a los ratones para garantizar la continuación de obstrucción de receptores de Fc en las células de tumores de LMA. Los resultados se representan en la tabla siguiente y en la FIG. 26.
Las dosis de 1 pg/kg (por D5) y de 3 pg/kg de huCD123-CysMab-D5 fueron activas y muy activas, respectivamente, generando 13% (3/6 CR) y 2% T/C (5/6 CR), respectivamente. En contraste, las dosis de 1 pg/kg (por D5) y 3 pg/kg de conjugado de control no dirigido huKTI-CysMab-D5 fueron inactivas, con% T/C de > 73, lo que demuestra que la actividad de huCD123-CysMab -D5 era dependiente de CD123. Las dosis de 1 pg/kg (por D2) y 3 pg/kg de huCD123-lisina enlazada-D2 fueron activas y muy activas, respectivamente, generando 30% (1/6 CR) y 1% (6/6 CR), respectivamente. En contraste, las dosis de 1 pg/kg (por D2) y 3 pg/kg del conjugado de control no dirigido chKTI-lisina unida-D2 fueron inactivas, generando un 75% de T/C (0/6 CR) y un 81% T/C (0/6 CR), respectivamente. Esto demuestra que la actividad de huCD123-D2 enlazado a lisina era dependiente de CD123. Una diferencia entre los dos conjugados dirigidos a CD123 se hace evidente al comparar 1 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5 con 1 pg/kg (por D2) de huCD123-lisina enlazada a D2, ya que el primero da como resultado un 13% T/C y 3/6 CR y el último da como resultado un 30% T/C y solo 1/6 CR, lo que demuestra la aparente superioridad de huCD123-CysMab-D5 en este modelo.
En un segundo estudio, se inoculó cada uno de los ratones nude atímicos hembra con células EOL-1 10x106, una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio libre de suero/matrigel en forma subcutánea en el flanco derecho. El día 6 después de la inoculación con EOL-1, se asignaron los ratones en forma aleatoria a los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneala 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores Fc en las células LMA EOL-1, evitando la absorción inespecífica del conjugado. El día 7 después de la inoculación de EOL-1, los ratones recibieron una única inyección intravenosa, en la vena lateral de la cola, de vehículo, 0,5 pg/kg (por D5; 0,04 mg/kg por huCD123) huCD123-CysMab-D5 o 1 pg/kg (por D5; 0,08 mg/kg por huCD123) huCD123-CysMab-D5. Los días 4 y 9 posteriores a la administración
de conjugados, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para garantizar la continuación de obstrucción de receptores de Fc en las células de tumores de LMA. Los resultados se representan en la tabla a continuación y en la FIG. 27.
La dosis de 0,5 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5 fue activa, generando una T/C del 11% y 3/6 CR. De manera similar, la dosis de 1 pg/kg de huCD123-CysMab-D5 fue muy activa, generando un 3% de T/C y 6/6 CR.
En un tercer estudio, se inoculó cada uno de los ratones lampiños atímicos hembra con células EOL-1 10x106 , una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio libre de suero/matrigel en forma subcutánea en el flanco derecho. El día 6 posterior a la inoculación con EOL-1, se aletoreizaron los ratones a los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores Fc en las células LMA EOL-1, evitando la absorción inespecífica del conjugado. El día 7 posterior a la inoculación de EOL-1, los ratones recibieron una única inyección intravenosa, en la vena lateral de la cola, de vehículo, huCD123-CysMab-D53 pg/kg (por D5; 0,24 mg/kg por huCD123), FGN849 (forma de fármaco libre de la carga útil) 3 pg/kg (por D5), anticuerpo huCD123 no conjugado (desnudo) 0,24 mg/kg o conjugado de control huKTI-CysMab-D5 3 pg/kg (por D5; 0,24 mg/kg por huKTI) . Los ratones tratados con citarabina recibieron una única inyección intraperitoneal los días 7, 8, 9, 10 y 11 posterior a la inoculación de EOL-1, y los ratones tratados con azacitidina recibieron una única inyección intraperitoneal los días 7, 10, 13, 16 y 19 posterior a la EOL -1 inoculación. Los días 4 y 9 posteriores a la administración de conjugados, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido a los ratones para garantizar la continuación de obstrucción de receptores de Fc en las células de tumores de LMA. Los resultados se representan en la tabla a continuación y en la FIG. 28.
De todos los artículos probados, solo la dosis de 3 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5 demostró actividad, generando un 1% de T/C y 8/8 CR, en contraste con la dosis de 3 pg/kg (por D5) del conjugado de control no dirigido a huKTI-CysMab-D5, que generó un 69% T/C y 0/8 CR. Una dosis de 3 pg/kg (por D5) del fármaco libre no conjugado, FGN849, también fue inactiva, con un 92% de T/C y 0/8 CR. Asimismo, una dosis de 0,24 mg/kg de anticuerpo huCD123 no conjugado ("desnudo"), que coincidía con la dosis de anticuerpo de huCD123-CysMab-D5, estaba inactiva, con un T/C del 60% y 0/8 CR. La citarabina, administrada a una dosis de 75 mg/kg al día durante 5 días, estuvo inactiva, con una T/C del 84% y una CR de 0/8. La azacitidina, administrada a una dosis de 3,75 mg/kg una vez cada tres días durante 5 dosis, estuvo inactiva, con una T/C del 59% y una CR de 0/8.
Ejemplo 28 Eficacia in vivo de huCD123-CysMab-D5 en el modelo diseminado Molm-13
Para probar la eficacia de huCD123-CysMab-D5 y huCD123-SeriMab-sD1 para determinar la capacidad de disminuir la carga tumoral in vivo, se usó un modelo de tumor diseminado como se describe en el protocolo a continuación.
Se pretrataron ratones NOD SCID hembra con 150 mg/kg de ciclofosfamida para extirpar parcialmente la médula ósea con el fin de mejorar el injerto de células MV4-11. La ciclofosfamida (Baxter, Lote #4E011, Exp 05.2017) se reconstituyó con NaCl al 0,9% y se administró por vía intraperitoneal a los ratones el día -3 y el día -2 antes de la inoculación de células MV4-11 el día 0. Después del tratamiento con ciclofosfamida como se describe anteriormente, a los ratones se les inyectaron cada uno por vía intravenosa en la vena lateral de la cola con células MV4-11 3x106 , una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio libre de suero. El día 7 posterior a la inoculación con MV4-11, se aleatorizaron los ratones en los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores de Fc en las células de LMA MV4-11, evitando la absorción inespecífica del conjugado. El día 7 posterior a la inoculación con MV4-11, los ratones recibieron una única inyección intravenosa en la vena de cola lateral de vehículo, 1 pg/kg (por D5, 0,08 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5, 0,24 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D2, 0,054 mg/kg por huCD123) de huCD123-enlazado a lisina-D2, 3 pg/kg (por D2, 0,163 mg/kg por huCD123) de huCD123-enlazado a lisina-D1, 1 pg/kg (por D1, 0,08 mg/kg por huKTI) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5, 0,24 mg/kg por huKTI) de conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D1,0,07 mg/kg por chKTI) de D2-enlazado a lisina-chKTI o 3 pg/kg (por D1, 0,21 mg/kg por chKTI) de conjugado de control D1-enlazado a lisina-chKTI. Los resultados se muestran en la tabla a continuación y en la FIG. 29.
Tanto las dosis de 1 pg/kg como las de 3 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5 fueron muy activas, y cada una generó un % de ILS > 70. En contraste, la dosis de 1 pg/kg (por D5) de conjugado de control no dirigido huKTI-CysMab-D5 estaba mínimamente activa, generando un 28% de ILS. La dosis de 3 pg/kg de huKTI-CysMab-D5 estaba inactiva, con un ILS del 0%, lo que demuestra la actividad dependiente de CD123 de huCD123-CysMab-D5. Las dosis de 1 pg/kg y 3 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMab-sD1 fueron ambas muy activas, generando cada una un % de ILS de > 101. Sin embargo, cuando se examina la actividad de los conjugados de control chKTI-SeriMab-sD1 no dirigidos, se observa un alto grado de actividad no dirigida a CD123 no específica a partir de la dosis de 3 pg/kg (por sD1), que genera un 65% de ILS (muy activo). Esto indica que parte de la alta actividad de la dosis de 3 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMab-sD1 dirigido a CD123 probablemente se deba a mecanismos de absorción de fármaco no específicos que no implican que se dirija a CD123. Por el contrario, la dosis de 1 pg/kg (por sD1) del conjugado de control chKTI-SeriMab-sD1 está inactiva, con un % ILS de 15, lo que demuestra que la actividad inespecífica de la dosis de 3 pg/kg de chKTI-SeriMab- sD1 es dependiente de la dosis y que la alta actividad de la dosis de 1 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMab-sD1 es de hecho dependiente de CD123.
Ejemplo 29 Eficacia in vivo de huCD123-CysMab-D5 y huCD123-SeriMab-sD1 en el modelo subcutáneo MV4-11
Para probar la eficacia de huCD123-CysMab-D5 y huCD123-SeriMab-sD1 para determinar la capacidad de disminuir la carga tumoral in vivo, se usó un modelo de tumor subcutáneo como se describe en el protocolo a continuación.
Se inoculó cada uno de los ratones lampiños atímicos hembra con células MV4-11 10x106, una línea celular de LMA humana, en 100 pl de medio sin suero/matrigel en forma subcutánea en el flanco derecho. En el día 14 posterior a la inoculación con MV4-11, se aleatorizaron los ratones en los grupos de estudio. 24 h antes de la administración del conjugado, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal 400 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para bloquear los receptores de Fc en las células de LMA MV4-11, evitando la absorción inespecífica del conjugado. El día 15 posterior a la inoculación de MV4-11, los ratones recibieron una única inyección intravenosa, en la vena lateral de la cola, de vehículo, 0,3 pg/kg (por D1; 0,016 mg/kg por huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 1 pg/kg (por D1; 0,054 mg/kg por huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 3 pg/kg (por D1; 0,16 mg/kg por huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 0,3 pg/kg (por D5; 0,024 mg/kg por huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 pg/kg (por D5; 0,08 mg/kg por huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 pg/kg (por D5; 0,24 mg/kg por huCD123) huCD123-CysMab -D5, 0,3 pg/kg (por D1; 0,021 mg/kg por chKTI) conjugado de control chKTI-SeriMab-sD1, 1 pg/kg (por D1; 0,07 mg/kg por chKTI) conjugado de control chKTI-SeriMab-sD1, 3 pg/kg (por D1; 0,21 mg/kg por chKTI) conjugado de control chKTI-SeriMab-sD1, 0,3 pg/kg (por D5; 0,024 mg/kg por huKTl) conjugado de control huKTI-CysMab-D5, 1 pg/kg ( por D5; 0,08 mg/kg por huKTI) conjugado de control huKTI-CysMab-D5 o 3 pg/kg (por D5; 0,24 mg/kg por huKTI) conjugado de control huKTI-CysMab-D5. El día 20 después de la inoculación de MV4-11, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 100 mg/kg de anticuerpo chKTI no dirigido para asegurar el bloqueo continuo de los receptores Fc en las células tumorales de LMA. Los resultados se representan en la tabla a continuación y en la FIG. 30.
Las dosis de 1 pg/kg y 3 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMab-sD1 fueron muy activas, cada una de las cuales generó un % T/C de 0 y 6/6 CR. La dosis más baja de huCD123-SeriMab-sD1 probada, 0,3 pg/kg (por sD1) estaba inactiva, con un % T/C de 43 y 0/6 CR. Sin embargo, cuando se examina la actividad de los conjugados de control chKTI-SeriMab-sD1 no dirigidos, se observa un alto grado de actividad no dirigida a CD123 no específica a partir de la dosis de 3 pg/kg (por sD1), que genera un 6% T/C (muy activo) y 3/6 CR. Esto indica que parte de la alta actividad de la dosis de 3 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMab-sD1 dirigido a CD123 probablemente se deba a mecanismos de absorción de fármaco no específicos que no implican que se dirija a CD123. En contraste, tanto las dosis de 1 pg/kg (por sD1) como las de 0,3 pg/kg del conjugado de control chKTI-SeriMab-sD1 estaban inactivas, generando 73% T/C y 83% T/C, respectivamente, lo que demuestra que la alta actividad inespecífica de la dosis de 3 pg/kg (por sD1) de chKTI-SeriMab-sD1 depende de la dosis y que la alta actividad de la dosis de 1 pg/kg (por sD1) de huCD123-SeriMabsD1 es de hecho dependiente de CD123.
Las dosis de 1 pg/kg y 3 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5 fueron altamente activas, cada una de las cuales generó un 0% de T/C y 5/6 y 6/6 CR, respectivamente. La dosis de 0,3 pg/kg (por D5) de huCD123-CysMab-D5, la dosis más baja probada, estaba inactiva, con un T/C del 69% y 0/6 CR. En contraste, las tres dosis (por D5) del conjugado de control no dirigido huKTI-CysMab-D5 estaban inactivas, cada una generaba > 43% T/C y 0/6 CR; demostrando la actividad dependiente de CD123 de huCD123-CysMab-D5.
Ejemplo 30 Tolerabilidad in vivode conjugados huCD123-IGN en ratones
Para probar la tolerabilidad de huCD123-CysMab-D5 y otros conjugados de huCD123-IGNin vivo, se usó un modelo de ratón como se describe en el protocolo a continuación.
Ratones hembra CD-1 recibieron una única inyección intravenosa en la vena lateral de la cola del vehículo, 150 pg/kg (por D5, 12 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 125 pg/kg (por D5, 10 mg/kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 100 pg/kg (por D5, 8 mg kg por huCD123) de huCD123-CysMab-D5, 150 pg/kg (por sD1, 14,3 mg/kg por huCD123) de huCD123-SeriMab-sD1 o 125 pg/kg (por sD1, 11,9 por huCD123) de huCD123-SeriMab-sD1. El anticuerpo huCD123 no reacciona de forma cruzada con CD123 de ratón, lo que hace que este modelo de ratón in vivo seaun indicador de toxicidad fuera del objetivo únicamente. Los ratones se observaron diariamente durante 33 días y se determinaron los pesos corporales. Si un animal experimentaba una pérdida de peso corporal superior al 20% o estaba moribundo, se sacrificaba al animal. Aparte de la pérdida de peso corporal, no se realizaron otras observaciones clínicas durante el curso del estudio en ninguno de los tratamientos.
Los ratones hembra CD-1 recibieron una única inyección intravenosa en la vena lateral de la cola del vehículo, 75 pg/kg (por D2, 4,4 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2, 100 pg/kg (por D2, 5,9 mg/kg por huCD123) de huCD123 enlazada a lisina-D2 o 125 pg/kg (por D2, 7,4 mg/kg por huCD123) de huCD123-lisina enlazado a D2. El anticuerpo huCD123 no reacciona de forma cruzada con CD123 de ratón, lo que hace que este modelo de ratón in vivo sea un indicador de toxicidad fuera del objetivo únicamente. Los ratones se observaron diariamente durante 22 días y se determinaron los pesos corporales. Si un animal experimentaba una pérdida de peso corporal superior al 20% o estaba moribundo, se sacrificaba al animal.
Los resultados se muestran en la tabla a continuación y en la FIG. 32 y FIG. 33.
huCD123-CysMab-D5 no se toleró a 150 pg/kg (por D5, 12 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 12, con una disminución del 11%. Uno de cada ocho ratones fue sacrificado el día 12 debido a una pérdida de peso corporal > 20%. huCD123-CysMab-D5 no se toleró bien a 125 pg/kg (por D5, 10 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 10, con una disminución del 8,6%. Uno de cada ocho ratones fue sacrificado el día 9 debido a la pérdida de peso corporal. huCD123-CysMab-D5 se toleró a 100 pg/kg (por D5, 8 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 6, con una disminución del 7%. Ninguno de los ratones de este grupo de tratamiento fue sacrificado debido a la pérdida de peso corporal.
huCD123-SeriMab-sD1 no se toleró a 150 pg/kg (14,3 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 10, con una disminución del 17,3%. Dos de cada ocho ratones fueron sacrificados el día 10 debido a la pérdida de peso corporal. huCD123-SeriMab-sD1 no fue bien tolerado a 125 pg/kg (por sD1, 11,9 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 10, con una disminución del 6,7%. Uno de cada ocho ratones fue sacrificado el día 12 debido a la pérdida de peso corporal.
huCD123-lisina enlazado a D2 se toleró a 75 pg/kg (por D2, 4,4 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 5, con una disminución del 6%. Ninguno de los ratones de este grupo de tratamiento fue sacrificado debido a la pérdida de peso corporal. huCD133-lisina enlazado a D2 se toleró a 100 pg/kg (por D2, 5,9 mg/kg por huCD123). El nadir del cambio medio en el peso corporal se produjo el día 7, con una disminución del 8%.
Claims (25)
1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
(i) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
(ii) (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID No : 10; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; y (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 72; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 71; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o
(iii) a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una CDR2 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 70; y b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
opcionalmente en donde:
(i) Xaa, el segundo residuo del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 34, es Phe; o
(ii) Xaa, el segundo residuo del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 34, es Val.
3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la reivindicación 1, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37.
4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la reivindicación 1, que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
opcionalmente en donde:
(i) Xaa, el segundo residuo del extremo N terminal de SEQ ID NO: 54, es Phe; o
(ii) Xaa, el segundo residuo del extremo N terminal de la SEQ ID NO: 54, es Val.
5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la reivindicación 1, que comprende:
a) una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 o 10, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 11; y
b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19 o 20, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 que tiene un aminoácido secuencia establecida en la SEQ ID NO: 22.
6. El Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 11; y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 20, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 22.
7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID. NO: 51, opcionalmente en donde Xaa, segundo residuo del extremo N-terminal de la SEC ID NO: 54, es Val.
8. Un polipéptido que comprende lassecuencias V Hy VLde cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Una célula que produce el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polipéptido de la reivindicación 8.
10. Un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polipéptido de la reivindicación 8, que comprende:
(a) cultivar la célula de la reivindicación 9; y
(b) aislar dicho anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o polipéptido de dicha célula cultivada.
11. Un inmunoconjugado que tiene la siguiente fórmula:
o
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 2, o el polipéptido del mismo, que se enlaza covalentemente a través de un residuo lisina a CyL1, CyL2 o CyL3;
WL es un número entero de 1 a 20;
CyL1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1');
o
-NR5-PC(=O)-(CRaRb)m-SZs1- (B3');
R5 es -H o un alquilo (C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son cada uno independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo Q ionizable;
m es un número entero de 1 a 6; y
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
y
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H o un catión,
CyL2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3 M;
Rxi y rx2 son independientemente alquilo (C1-C6);
Rees -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es -H+ o un catión; y
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
m' es 1 o 2;
R1 y R2son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3); y
Zs1se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y
M es H+ o un catión.
12. Un inmunoconjugado que presenta la siguiente fórmula:
o 
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3, o el polipéptido del mismo de la reivindicación 8, unido covalentemente al grupo Jcb';
Ws es 1,2, 3 o 4;
Jcb 'es un resto formado por reacción de un grupo aldehído derivado de la oxidación de un resto 2-hidroxietilamina en un N-terminal de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3, o el polipéptido del mismo de la reivindicación 8, y un aldehído reactivo grupo en Cys1, Cys2, Cys3 o Cys4, y se representa por la siguiente fórmula:
en donde s1 es el sitio enlazado covalentemente al CBA; y s2 es el sitio enlazado covalentemente a Cys1, Cys2, Cys3 o Cys4;
Cys1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4 ) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Zd1 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
R9 es -H o un alquilo(C1-C3);
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado un grupo ionizable Q; r y r' son independientemente un entero de 1 a 6;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6);
L es -NR9-(CRaRb)r-o está ausente; y
r” es un número entero de 0 a 6;
Cys2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3M;
M es H+ o un catión;
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
L1 e representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys2;
Za2 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
R9 es -H o un alquilo(C1-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Ra1, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o alquilo (C1-C3); y q1 y r1 son cada uno independientemente un entero de 0 a 10, siempre que q1 y r1 no son ambos 0;
Cys3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2son cada uno independientemente H o un alquilo (C1-C3);
L1 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en Cys3;
Za2 está ausente, C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O);
R9es -H o un alquilo(C1-C3);
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Raí, Ra2 , Ra3, Ra4, en cada caso, son independientemente H o un alquilo (C1-C3); y
q1 y r1 son cada uno independientemente un número entero de 0 a 10, siempre que
q1 y r1 no son ambos 0;
Cys4 se representa mediante la siguiente fórmula:
L1' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s3 es el sitio enlazado covalentemente al grupo Jcb';
s4 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -NMe- en Cys4;
Zb1 y Zb2 están ambos ausentes o uno de Zb1 y Zb2 está ausente y el otro es -CH2-O- o -O-CH2-;
Zb1' y Zb2 ' están cada uno independientemente ausente, es -CH2-O- , -O-CH2-, -NRg-C(=O)-CH2- o -CH2-C(=O)-NRg-;
R9 es H o alquilo (C1-C3);
n1 y m1 son cada uno independientemente un número entero de 1 a 6;
uno de E1 y E2 es -C(=O)- y el otro es -NR9-, o uno de E1 y E2 es -C(=O)- o -NR9- y el otro está ausente; P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos aminoácidos; y
Rb1, Rb2 , Rb3, Rb4, Rb5 y Rb6, en cada caso, son cada uno
independientemente H o un alquilo (C1-C3).
13. Un inmunoconjugado representado mediante la siguiente fórmula:
CBA (CyC1)wc;
CBA (CyC2)wc;
o
CBA (CyC3)wc,
en donde:
CBA es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, o el polipéptido del mismo de la reivindicación 8, enlazado covalentemente a CyC1, CyC2 o CyC3 a través de un residuo de cisteína;
Wc es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
R5 es -H o un alquilo (C1-C3);
P es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Ra y Rb, en cada caso, son independientemente -H, alquilo (C1-C3), o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W es -NRe',
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo (C1-C6); y,
Lc se representa mediante
s1 es el sitio
enlazado covalentemente a CBA, y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo C(=O) en CyC1, en donde:
R19 y R20, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
m” es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo(C1-C3);
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H o un alquilo (C1-C4) y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3M y M sea H+ o un catión;
Rx1 es un alquilo (C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe';
Re' es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero de 2 a 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo (C1-C6);
LC' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC2; Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3); q y r, en cada caso, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(Ci-C3); y
P' es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos;
Cyc3 se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C3);
Lc' se representa mediante la siguiente fórmula:
en donde:
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBA y s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC3; Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9 , R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22, en cada caso, son independientemente -H o un alquilo (C1-C3); q y r, en cada caso, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos aminoácidos; opcionalmente en donde el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -o H o -SO3M.
14. El inmunoconjugado de la reivindicación 13, que se representa mediante la fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
15. El inmunoconjugado de la reivindicación 14, en donde:
Ra y Rb son ambos H;
R5 es H o Me;
P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos aminoácidos; y
Lc se representa mediante la siguiente fórmula:
16. El inmunoconjugado de la reivindicación 13, que se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la línea doble - - entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando es un enlace doble, X está ausente e Y es -H, y cuando es un enlace sencillo, X es -H e Y es -SO3M, M es H+, Na+ o K+; y en donde CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8, y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida adelante en SEQ ID NO: 11; y
b) una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 20, una CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 21 y una CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida adelante en SEQ ID NO: 22.
17. El inmunoconjugado de la reivindicación 16, en donde CBA es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:
a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 34; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 35,
opcionalmente en donde:
(i) Xaa, el segundo residuo del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 34, es Phe; o
(ii) Xaa, el segundo residuo del extremo N terminal de la SEQ ID NO: 34, es Val.
18. El inmunoconjugado de la reivindicación 16, en donde CBA es un anticuerpo que comprende:
a) una región de cadena pesada de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; y
b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51.
19. El inmunoconjugado de la reivindicación 18, en donde Xaa, el segundo residuo del extremo N terminal de SEQ ID NO: 54 es Val.
20. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polipéptido de la reivindicación 8, o el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11-19, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21. Un método in vitro o ex vivo para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD123, que comprende poner la célula en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el polipéptido de la reivindicación 8, o el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11-19 o la composición farmacéutica de la reivindicación 20, opcionalmente en donde:
(i) la célula es una célula tumoral; o
(ii) la célula es una célula de leucemia o una célula de linfoma.
22. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el polipéptido de la reivindicación 8, o el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11-19, o una composición farmacéutica de la reivindicación 20, para uso en un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer o para su uso en un método para tratar un trastorno de proliferación celular en un sujeto, en donde las células del cáncer o el trastorno de proliferación celular expresan CD123, opcionalmente en donde:
(i) el cáncer es leucemia o linfoma;
(ii) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (l Lc );
(iii) el cáncer es leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B),
(iv) el cáncer es leucemia mieloide aguda (LMA);
(v) el trastorno proliferativo celular se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLA-B), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas (HCL), síndrome mielodisplásico, leucemia con neoplasia de células dendríticas plasmacitoides básica (BPDCN), linfomas no hodgkinianos (LNH), linfoma de células del manto y leucemia de Hodgkin (LH);
(vi) el trastorno proliferativo celular es una neoplasia de DC plasmocitoide básica (BPDCN); o
(vii) el trastorno prolifertivo celular es la mastocitosis sistémica.
23. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polipéptido, el inmunoconjugado o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 22, que es para tratar un sujeto que tiene leucemia de neoplasma de DC plasmocitoide básico (BPDCN).
24. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polipéptido, el inmunoconjugado o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 22, que es para tratar a un sujeto que tiene leucemia linfoblástica aguda (LLA).
25. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polipéptido, el inmunoconjugado o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 22, que es para tratar un sujeto que tiene leucemia mieloide aguda (LMA).
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4588585A (en) | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US6492107B1 (en) | 1986-11-20 | 2002-12-10 | Stuart Kauffman | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
| EP0229046B1 (fr) | 1985-03-30 | 1994-05-04 | BALLIVET, Marc | Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn |
| US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| DE3600905A1 (de) | 1986-01-15 | 1987-07-16 | Ant Nachrichtentech | Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen |
| US5681718A (en) | 1986-03-14 | 1997-10-28 | Celltech Limited | Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| CA2016841C (en) | 1989-05-16 | 1999-09-21 | William D. Huse | A method for producing polymers having a preselected activity |
| CA2016842A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-16 | Richard A. Lerner | Method for tapping the immunological repertoire |
| WO1990014443A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-29 | Huse William D | Co-expression of heteromeric receptors |
| US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
| US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
| DK1024191T3 (da) | 1991-12-02 | 2008-12-08 | Medical Res Council | Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker |
| ES2202310T3 (es) | 1991-12-13 | 2004-04-01 | Xoma Corporation | Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos. |
| US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
| US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| EP0859841B1 (en) | 1995-08-18 | 2002-06-19 | MorphoSys AG | Protein/(poly)peptide libraries |
| US7264963B1 (en) | 1995-08-18 | 2007-09-04 | Morphosys Ag | Protein(poly)peptide libraries |
| US5714352A (en) | 1996-03-20 | 1998-02-03 | Xenotech Incorporated | Directed switch-mediated DNA recombination |
| WO2001002588A2 (en) | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Morphosys Ag | Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests |
| US7538195B2 (en) | 2002-06-14 | 2009-05-26 | Immunogen Inc. | Anti-IGF-I receptor antibody |
| GB0216648D0 (en) | 2002-07-18 | 2002-08-28 | Lonza Biologics Plc | Method of expressing recombinant protein in CHO cells |
| MXPA05004712A (es) | 2002-11-07 | 2005-11-23 | Immunogen Inc | Anticuerpos anti-cd33 y metodo para tratamiento de leucemia mieloide aguda utilizando los mismos. |
| WO2005075514A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-08-18 | Lonza Ltd. | Method for producing antibodies |
| WO2006024497A1 (en) | 2004-08-30 | 2006-03-09 | Lonza Biologics Plc. | Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies |
| DK2913343T3 (en) * | 2005-12-20 | 2018-11-26 | Sbi Biotech Co Ltd | Anti-ILT7 antibody |
| US7691980B2 (en) | 2007-01-09 | 2010-04-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers |
| WO2008127735A1 (en) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Stemline Therapeutics, Inc. | Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof |
| EP2287174B8 (en) | 2008-01-18 | 2016-12-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enhanced purification of antibody fragments by apatite chromatography |
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| NZ604510A (en) * | 2010-08-17 | 2013-10-25 | Csl Ltd | Dilutable biocidal compositions and methods of use |
| MX346635B (es) * | 2011-02-15 | 2017-03-27 | Immunogen Inc | Derivados citotoxicos de la benzodiazepina. |
| JP6136279B2 (ja) | 2013-01-15 | 2017-05-31 | 株式会社ジェイテクト | 転がり軸受装置 |
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| CA2947602A1 (en) * | 2014-05-20 | 2015-11-26 | Immunogen, Inc. | Methods for characterizing and treating acute myeloid leukemia |
| US10988531B2 (en) * | 2014-09-03 | 2021-04-27 | Immunogen, Inc. | Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents |
| ES2815353T3 (es) * | 2014-09-03 | 2021-03-29 | Immunogen Inc | Derivados de benzodiazepina citotóxicos |
| EA037647B1 (ru) * | 2014-09-05 | 2021-04-27 | Янссен Фармацевтика Нв | Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения |
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| JP2019501139A (ja) * | 2015-11-25 | 2019-01-17 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | 医薬製剤及びその使用 |
| US9816280B1 (en) | 2016-11-02 | 2017-11-14 | Matthew Reitnauer | Portable floor |
| TWI755450B (zh) * | 2016-11-23 | 2022-02-21 | 美商伊繆諾金公司 | 苯二氮平衍生物之選擇性磺化 |
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| AU2018335780A1 (en) * | 2017-09-22 | 2020-03-26 | Immunogen, Inc. | Methods of preventing methionine oxidation in immunoconjugates |
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