CN116425874A - 抗cd123抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗cd123抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗CD123抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药领域。该抗CD123抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3，轻链可变区包括三个互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3。该抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，该抗CD123抗体通过特异性识别肿瘤细胞上的CD123的高亲和力的功能，有着良好的应用前景和价值。

Description

抗CD123抗体及其制备方法和应用
本分案申请是基于申请号为2018800006945、申请日为2018年06月15日、发明名称为“抗CD123抗体及其制备方法和应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及抗CD123抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CD123蛋白的基因名称为IL3RA。CD123与IL-5受体和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体，形成为Beta common(βc)的膜受体细胞因子亚家族，这三种受体共享共同的βc亚基信号。其中这三种受体中的每一个受体都是由细胞因子特异性α亚基和普通βc亚基组成的异二聚体，使得能够高亲和力结合和细胞信号传导。这三个细胞因子发挥多种生物学功能，在控制正常和恶性血细胞生成方面，原生的和适应性免疫以及炎症反应等方面起着重要的生物学作用。
作为CD123陪体的IL-3是一种主要由活化T淋巴细胞产生的多效性细胞因子，其调节体内的造血功能和免疫细胞功能。IL-3最初称为多集落刺激因子(multi-CSF)因为其会刺激来自骨骼的广泛的造血细胞，包括嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞，红系细胞，巨核细胞和树突状细胞。IL-3的生物活性不仅仅体现在造血系统，同时也延伸到了造血系统内皮谱系，其中IL-3可以刺激内皮细胞增殖。
如上所述，IL-3R是一种包含alpha和beta链的异二聚体。IL-3Rα链是糖蛋白由360个氨基酸残基组成的Ig样结构域,其中包含287个氨基酸残基的胞外结构域，两个FnIII结构域，跨膜30个氨基酸残基的域和一个53个残基的胞内结构域。
最近的研究表明白细胞介素-3受体(IL-3RA或CD123)的α-链异常经常在一些白血病病症中观察到，并且可能有助于白血病细胞的增殖优势。很多研究分析了CD123在各种血液恶性肿瘤中过度表达，包括部分急性骨髓和B淋巴细胞白血病，突发性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)和毛细胞白血病。鉴于正常造血干细胞上CD123的低表达或缺失，其可以针对这种受体试作为一种药物靶点进行临床前及临床水平上的开发。由于CD123是一种膜受体，因此有两种方式来针对CD123靶点来进行药物开发，其中包括天然配体或单克隆抗体等两种常用的药物开发方式。最近的报道显示了使用由偶联至截短白喉毒素的人IL-3组成的融合分子在BPDCN和AML患者中良好的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的包括但不限于提供抗CD123抗体及其制备方法和应用。本发明通过我们自己设计的鼠源的Fc标签的CD123抗原来免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选分子水平与细胞水平和CD123亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用我们自己构建的细胞功能性实验在亲和力高的细胞株里筛选功能性最好的杂交瘤细胞株并测定出抗体序列，并确定了其CDR区序列。相关实验结果显示，该抗CD123抗体具有与肿瘤细胞表面的CD123蛋白特异性结合识别的能力，具有较强的亲和力和特异性。该抗CD123抗体或其功能片段具有广阔的应用前景。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗CD123抗体或其功能片段，所述抗CD123抗体或其功能片段具有重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
CDR-H1的氨基酸序列选自由seq_2、12、22、32、42、51、61、71、81、89、99和107组成的组中的任意一种，或者，CDR-H1的氨基酸序列为与seq_2、12、22、32、42、51、61、71、81、89、99和107中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；
CDR-H2的氨基酸序列选自由seq_3、13、23、33、43、52、62、72、82、90和100组成的组中的任意一种，或者，CDR-H2的氨基酸序列为与seq_3、13、23、33、43、52、62、72、82、90和100中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；
CDR-H3的氨基酸序列选自由seq_4、14、24、34、44、53、63、73、83、91、101和108组成的组中的任意一种，或者，CDR-H3的氨基酸序列为与seq_4、14、24、34、44、53、63、73、83、91、101和108中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；
CDR-L1的氨基酸序列选自由seq_7、17、27、37、56、66、76、94、104和111组成的组中的任意一种，或者CDR-L1的氨基酸序列为与seq_7、17、27、37、56、66、76、94、104和111中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；
CDR-L2的氨基酸序列选自由seq_8、18、28、38、47、57、67、77、95和112组成的组中的任意一种，或者，CDR-L2的氨基酸序列为与seq_8、18、28、38、47、57、67、77、95和112中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；
CDR-L3的氨基酸序列选自由seq_9、19、29、39、48、58、68、78、86、96和113组成的组中的任意一种，或者，CDR-L3的氨基酸序列为与seq_9、19、29、39、48、58、68、78、86、96和113中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；
所述CD123抗体或其功能片段具有与CD123蛋白的胞外区特异性结合的活性。
在本发明的一些实施方案中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_2、3和4所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_7、8和9所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_12、13和14所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_17、18和19所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_22、23和24所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_27、28和29所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_32、33和34所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_37、38和39所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_42、43和44所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_27、47和48所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_51、52和53所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_56、57和58所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_61、62和63所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_66、67和68所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_71、72和73所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_76、77和78所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_81、82和83所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_17、18和86所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_89、90和91所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_94、95和96所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_99、100和101所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_104、8和9所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_107、3和108所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_111、112和113所示。
在本发明的一些实施方案中，CD123蛋白的胞外区的氨基酸序列如seq_115所示。
在本发明的一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列选自由seq_1、11、21、31、41、50、60、70、80、88、98和106组成的组中的任意一种，或者，所述重链可变区的氨基酸序列为与seq_1、11、21、31、41、50、60、70、80、88、98和106中的任意一种具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_6、16、26、36、46、55、65、75、85、93、103和110组成的组中的任意一种，或者，所述轻链可变区的氨基酸序列为与seq_6、16、26、36、46、55、65、75、85、93、103和110中的任意一种具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的重链恒定区。
在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的轻链恒定区。
在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列如seq_116所示，或者，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列为与seq_116具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列如seq_117所示，或者，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列为与seq_117具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述功能片段包括F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
本发明所述的“功能片段”特别地指对于CD123蛋白或其胞外区段具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
本发明第一方面提供的抗CD123抗体或其功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如AppliedBioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
本发明第一方面提供的抗CD123抗体无论在针对肿瘤细胞的CD123蛋白的亲和力和特异性识别肿瘤细胞上的CD123蛋白都有着独特的优势。由于CD123蛋白会高表达于血液瘤细胞，如ALL等，所以本发明提供的抗体会与肿瘤细胞表面的CD123蛋白结合识别肿瘤细胞。通过后期结合在ADC，CART药物或双特异抗体上的应用，会有效的杀伤肿瘤细胞。
总之，本发明第一方面提供的抗CD123抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，该抗CD123抗体通过特异性识别肿瘤细胞上的CD123的高亲和力的功能，今后在多种肿瘤治疗方式上有着良好的应用价值。因此该CD123抗体能够运用于治疗肿瘤疾病药物的制备中，如ADC，CART药物或双特异抗体类药物。
第二方面，本发明提供了一种重组蛋白，其包括：
(i)：如上第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及
(ii)：与该抗CD123抗体或其功能片段相融合的标记蛋白或功能蛋白或酶或标签序列。
第三方面，本发明提供了一种偶联物，其包括：
(1)：如上第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及
(2)：与所述抗CD123抗体或其功能片段相偶联的诊断剂和/或治疗剂。
在本发明的一些实施方案中，诊断剂选自由放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂以及光敏剂组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述放射性核素选自由110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述顺磁离子包括选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述荧光标记选自由Alexa 350、Alexa 405、Alexa430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，治疗剂选自裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、抗凋亡试剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物以及寡核苷酸组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述药物选自由吡咯苯并二氮类化合物(PBD)、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、氮芥、环磷酰胺、噻替派、顺铂、丝裂霉素、博莱霉素、喜树碱、鬼臼毒素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、长春碱、紫杉醇、三尖杉生物碱以及L-门冬酰胺酶组成的组中一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸选自由shRNA、miRNA和siRNA组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫调节剂选自由细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞生长因子组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述细胞因子优选选自由人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述趋化因子优选选自由RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，所述放射性核素选自由110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr组成的组中的一种或多种。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。
第五方面，本发明提供了一种检测CD123蛋白的试剂盒，其含有如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段。
在本发明的一些实施方案中，该试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
在本发明的一些实施方案中，该试剂盒包括用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。
第六方面，本发明提供了一种检测CD123蛋白的方法，其包括：将如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段与待测样品接触。通过抗原抗体特异性结合的机理，检测待测样品中是否存在抗原抗体结合复合物实现对待测样品中的CD123蛋白的检测。
第七方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自如下核酸：
(a)：DNA或RNA，其编码如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；
(b)：与(a)中定义的核酸分子互补的核酸分子。
第八方面，本发明提供了一种载体，其含有如第七方面所述的分离的核酸分子。
第九方面，本发明提供了一种重组细胞，其含有如第八方面所述的载体或如第七方面所述的分离的核酸分子。
第十方面，本发明提供了如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段的制备方法，其包括：培养如第九方面所述的重组细胞，从培养物中分离得到所述的抗CD123抗体或其功能片段。
第十一方面，本发明提供了如上所述的抗CD123抗体或其功能片段、如上所述的重组蛋白或如上所述的偶联物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的应用，所述疾病为急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDC Leukemia)。
第十二方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，给予患有疾病的主体施加如上所述的抗CD123抗体或其功能片段、如上所述的重组蛋白、如上所述的偶联物或如上所述的药物组合物，其中，所述疾病急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDCLeukemia)。
在本发明的一些实施方案中，其中，上述主体为人。
第十三方面，本发明提供了一种制备如上所述的抗CD123抗体或其功能片段的方法，其包括：培养第九方面所述的重组细胞，从培养产物中分离得到如上所述的抗CD123抗体或其功能片段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中的A6抗体的Biacore实验的检测结果；
图2为本发明实施例中的A5抗体的Biacore实验的检测结果；
图3为本发明实施例中的A7抗体的Biacore实验的检测结果；
图4为本发明实施例中的A8抗体的Biacore实验的检测结果；
图5为本发明实施例中的A9抗体的Biacore实验的检测结果；
图6为本发明实施例中的A3抗体的Biacore实验的检测结果；
图7为本发明实施例中的A12抗体的Biacore实验的检测结果；
图8为本发明实施例中的A4抗体的Biacore实验的检测结果；
图9为本发明实施例中的A1抗体的Biacore实验的检测结果；
图10为本发明实施例中的A11抗体的Biacore实验的检测结果；
图11为本发明实施例中的A2抗体的Biacore实验的检测结果；
图12为本发明实施例中的A10抗体的Biacore实验的检测结果；
图13为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7分别在正常的293细胞与CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值；
图14为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7与未连接毒素的抗体A7在正常的293T细胞中的IC50值；
图15为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7与未连接毒素的抗体A7在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》中所述的条件，或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
杂交瘤细胞的制备
用包含CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)与小鼠IgG2a-FC(来自Genbank登记号AAH31470.1)的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，5只小鼠皮下免疫，5只小鼠肌肉免疫，佐剂采用quickantibody 5W水溶性佐剂，加强免疫以后2周测效价，选取效价高的两只小鼠进行免疫冲击，3天之后进行下文所述的细胞融合。
取准备融合的两只小鼠，取血清，然后解剖后，取脾脏，分离脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行融合，铺96孔板，同时加入选择性培养基进行筛选，7天后换液，10天后进行ELISA检测，选择OD值大于阴性对照10倍以上的再进行流式细胞仪检测。
挑选双阳的细胞，通过细胞有限稀释法进行亚克隆铺板，挑选单克隆细胞。将挑选出的单克隆细胞，取培养上清，进行ELISA检测及流式细胞仪检测，挑选双阳的细胞扩大培养。
实施例2
杂交瘤细胞的培养上清与CD123结合的ELISA检测
用包含CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)与人的IgG1-FC(来自Genbank登记号CAC20454.1)用包被液稀释至1-2μg/ml，然后以50-100μl/孔加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。每孔加入200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。用洗涤液洗3次，此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
向每孔中加入50-100μl待检杂交瘤细胞的培养上清(由实施例1获取的)，同时设立阳性对照(加入融合小鼠的血清)、阴性对照(加入正常小鼠的血清)和空白对照(加入培养基)。在37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。然后向每孔中加入酶标二抗，为1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(SIGMA，货号A9044-2ml)，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。向每孔中加入新鲜配制的底物显色液TMB 50-100μl，37℃孵育10-30分钟。
加入2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
结果判定：以P/N>2:1(P代表阳性数值，N代表正常小鼠血清数值)为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
实施例3
杂交瘤细胞的培养上清与CD123结合的FACS检测
将CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)构建到PLVX病毒包装载体(clontech，virus package mix，货号631275)，转染293T细胞包装病毒，用该病毒感染HEK293细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染CD123的HEK293。然后将HEK293-CD123细胞在含2％FBS的PBS中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入50μl待检杂交瘤细胞的培养上清(由实施例1获取)，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入培养上清和抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307)，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入培养上清，仅加入细胞悬液和抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307))。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μlPE标记的抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。
实施例4
基于EILSA，FACs双阳性选择相应的单克隆细胞，收集杂交瘤细胞培养上清，离心，过滤后通过流式检测方法计算每个单克隆细胞的EC50。再根据EC50结果选择候选抗体进行纯化。
选择protein G亲和层析柱，进行纯化，纯化的抗体通过SDS-PAGE电泳检测纯度，用BCA蛋白检测试剂盒检测抗体浓度，分装，保存于-80℃冰箱中备用。
纯化后的抗体再进行EC50实验，根据EC50结果选择最终的候选杂交瘤细胞进行测序。提RNA，再反转录cDNA，连入测序载体中进行测序分析。共得到12个抗体，各抗体名称以及测序结果如下：
(1)抗体名称：A1
重链可变区(VH)：H11；
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSAFMSRLSISKDKSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGSSYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_1)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_2、3和4；
重链可变区的编码序列：seq_5；
轻链可变区(VL)：KMK11-1；
DIVLTQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSSRSLLNSSTRKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGSGTKLEIK，(seq_6)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_7、8和9所示；
轻链可变区的编码序列：seq_10。
(2)抗体名称：A2；
重链可变区(VH)：H8；
QVQLKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFMTYVIHWVKQKPGQGLEWFGYCNPYNDGINYNEKFKGKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSPSYYGRSYYYGMDYWGQGTSVTVSS，(seq_11)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_12、13和14；
重链可变区的编码序列：seq_15；
轻链可变区(VL)：L8-7；
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLDIK，(seq_16)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_17、18和19；
轻链可变区的编码序列：seq_20。
(3)抗体名称：A3；
重链可变区(VH)：H9；
QVQLKQSGPELVKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMKWVKQSPGKSLEWIGDIIPNNGATFYNKNFKGKATLTVDKSSTTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGGIYYGYGAYWGQGTLVTVSV，(seq_21)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_22、23和24；
重链可变区的编码序列：seq_25；
轻链可变区(VL)：MKC9-1；
DIQMTQTPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLLYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIK，(seq_26)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_27、28和29；
轻链可变区的编码序列：seq_30。
(4)抗体名称：A4；
重链可变区(VH)：16A5-3-1；
EVKLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCARQGASYYFDYWGQGTTLTVSS，(seq_31)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是如seq_32、33和34；
重链可变区的编码序列：seq_35；
轻链可变区(VL)：MKC4-1；
DIVLTQSQKFMSTSVGDRISITCKASQNVGTGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLSISNMQSEDLADYFCQQYSSYPTFGSGTKLEIK，(seq_36)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_37、38和39；
轻链可变区的编码序列：seq_40。
(5)抗体名称：A5；
重链可变区(VH)：4H31-H；
QVQLKQSGPELVKSGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNNATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGEGWLLPLACWGQGTLVTVSA，(seq_41)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_42、43和44；
重链可变区的编码序列：seq_45；
轻链可变区(VL)：4K52-L；
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK，(seq_46)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_27、47和48；
轻链可变区的编码序列：seq_49。
(6)抗体名称：A6；
重链可变区(VH)：2H32-H；
QVQLKQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFSSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARERGLYDYDETGYYAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_50)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_51、52和53；
重链可变区的编码序列：seq_54；
轻链可变区(VL)：2K81-L；
DIQLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISEIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYFCQNGHSFPYTFGGGTKLEIKR，(seq_55)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_56、57和58；
轻链可变区的编码序列：seq_59。
(7)抗体名称：A7；
重链可变区(VH)：1D6-H；
EVQLQQSGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTNHWMDWVKQRPGQGLEWIGEIDFSDSDTNYNQKFRGKATLTVDKSSRTAYLQLSSLTSEDSAVYYCATYYRYDVYWGQGTLVTVSA，(seq_60)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_61、62和63；
重链可变区的编码序列：seq_64；
轻链可变区(VL)：1D6-L；
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSFVHWFQQKPGTSPKLWIFSTSNLASGVPLRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRNSYPWTFGGGTKLEIK，(seq_65)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_66、67和68；
轻链可变区的编码序列：seq_69。
(8)抗体名称：A8；
重链可变区(VH)：7H11-H；
DDVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSSNSNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGMDYWGQGTSVTVSS，(seq_70)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_71、72和73；
重链可变区的编码序列：seq_74；
轻链可变区(VL)：7K61-L；
DIVLTQSPAIMSVFLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQFHRSPRTFGGGTKLEIK，(seq_75)；其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_76、77和78；
轻链可变区的编码序列：seq_79。
(9)抗体名称：A9；
重链可变区(VH)：9H51-H；
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKLKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYNCARSGSGYYYAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_80)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_81、82和83；
重链可变区的编码序列：seq_84；
轻链可变区(VL)：9K41-L；
DIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKR，(seq_85)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_17、18和86；
轻链可变区的编码序列：seq_87。
(10)抗体名称：A10；
重链可变区(VH)：H13；
QVQLKQSGPELVKTGASVKMSCKASGYSFTDYYVHWVRQSHGKSLEWIGYISCYNGATNYNPKFKGKATFTVDTSSSTAYMQFKSLTSEDSAVYYCAGGEGYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_88)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_89、90和91；
重链可变区的编码序列：seq_92；
轻链可变区(VL)：L13-2；
DIQLTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGGDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDDLYTFGGGTKLEIK，(seq_93)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_94、95和96；
轻链可变区的编码序列：seq_97。
(11)抗体名称：A11；
重链可变区(VH)：18H8-H，；
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYDMSWIRQPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNSAFMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGSTYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_98)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_99、100和101；
重链可变区的编码序列：seq_102；
轻链可变区(VL)：18H8-L；
DIVMTQAPSSLAVSAGEKVTMSCQSSQSLLNSSTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGSGTKLEIK，(seq_103)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是seq_104、8和9；
轻链可变区的编码序列：seq_105。
(12)抗体名称：A12；
重链可变区(VH)：H3；
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSAFMSRLSISKDKSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGNSYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(seq_106)；
其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是seq_107、3和108；
重链可变区的编码序列：seq_109；
轻链可变区(VL)：MKC-3-1；
DVLMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQNLVHSNGYTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFKFGSGTKLEIK，(seq_110)；
其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是如seq_111、112和113；
轻链可变区的编码序列：seq_114。
上述各抗体的重链恒定区氨基酸序列如seq_116所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq_117所示。
实施例5
内吞实验
洗脱液：0.05M甘氨酸，0.1M氯化钠水溶液，pH 3.0；
中和液：0.15M Tris水溶液，pH 7.4。
96孔细胞培养板中每孔加入5×105个293T CD123细胞。使用PBS配制10μg/ml的抗体溶液，使用100μl抗体溶液重悬细胞，细胞板于4℃放置1小时。使用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次。
使用PBS配制二抗溶液(1:10PE anti human IgG)，使用100μl二抗溶液重悬细胞，细胞板于4℃放置1小时。使用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次，使用完全培养基重悬细胞并均分为3份。其中1份标记为“内吞组(Internalizationgroup)”并于37℃放置1小时，另外2份分别标记为“100％内吞对照组”和“0％内吞对照组”并于4℃放置1小时。内吞组和0％内吞对照组离心去上清后，使用200μl洗脱液重悬细胞，并与室温放置7分钟。离心去上清后，使用200μl中和液重悬细胞，再次离心去上清后，使用FACS缓冲液重悬细胞。100％内吞对照组不做洗脱和中和处理，离心去上清后，使用FACS缓冲液重悬细胞。使用流式仪器检测各组细胞的平均荧光强度(MFI)。内吞百分比使用以下公式计算：
Figure BDA0003825095430000201
结果如表1所示。
表1 实施例4中部分抗体的内吞实验结果
Figure BDA0003825095430000202
因为我们是利用筛选的高亲和力的CD123抗体进行毒素的偶联来起到杀伤肿瘤细胞的效果，由于偶联得细胞毒素需要进入到细胞内部才能发挥细胞杀伤作用，因此需要我们的CD123抗体结合细胞表面的CD123后会引起被细胞内吞的功能，只有这样被偶联在CD123抗体上的毒素才能被带入至细胞内，通过进一步的毒素释放来起到杀伤肿瘤细胞的功能。
我们通过设计的吞实验来验证CD123抗体结合细胞表面后其进入细胞与未进入细胞的比例，从而反映我们的抗体是否适合进行后续的毒素偶联。
如上表1所示，内吞比例超过10％的抗体例如A10A3A12A1A2A11A4A7均可考虑用于后期的毒素偶联。
实施例6
BIACORE实验
将实施例1中的融合蛋白即CD123蛋白的胞外区(SEQ ID NO:115)与小鼠IgG2a-FC融合的免疫原在PBS缓冲溶液中制备成最高浓度为30nM的溶液，并3倍稀释为6个浓度并设0浓度对照。将本发明实施例3的纯化抗体在PBS中制备为20nM的溶液。
用Biacore T200测定抗体抗原的亲和力。使用CM5芯片捕获本发明实施例4的抗体之后，将抗原CD123小鼠IgG2a Fc标签蛋白流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。
实验结果如图1-图12所示。
图1-图12反应的结果是测定了抗体与抗原的亲和力，KD为解离常数，指引起最大效应一半(50％受体被占位)时的药物浓度KD值越大，引起最大效应所需药物浓度越多，亲和力越小。图中曲线从上至下分别为30,10,3.3,1.1,0.37,0.12nM六个浓度的抗体与抗原的结合及解离曲线。
图1显示了A6抗体与抗原的亲和力KD＝3.462E-9；
图2显示了A5抗体与抗原的亲和力KD＝1.331E-9；
图3显示了A7抗体与抗原的亲和力KD＝6.446E-11；
图4显示了A8抗体与抗原的亲和力KD＝2.543E-9；
图5显示了A9抗体与抗原的亲和力KD＝5.942E-9；
图6显示了A3抗体与抗原的亲和力KD＝5.570E-10；
图7显示了A12抗体与抗原的亲和力KD＝2.779E-10；
图8显示了A4抗体与抗原的亲和力KD＝1.502E-9；
图9显示了A1抗体与抗原的亲和力KD＝3.075E-12；
图10显示了A11抗体与抗原的亲和力KD＝1.155E-9；
图11显示了A2抗体与抗原的亲和力KD＝4.835E-10；
图12显示了A10抗体与抗原的亲和力KD＝2.380E-10。
实施例7
ADC与细胞杀伤实验
共价连接的CD123抗体的细胞毒性药物制备。毒性药物的选择为pyrrolobenzodiazepine(PBD)二聚体，其化学结构如如下：
Figure BDA0003825095430000221
吡咯苯并二氮类化合物(PBD)是一类具有抗生素或抗肿瘤特性的天然产物，由各种放线菌产生，是序列选择性DNA烷化剂化合物。作为一类DNA交联剂，它们比全身性化疗药物显着更有效。一些PBD具有识别和结合DNA特定序列的能力。
使用1.3mol/mol抗体(实施例1中的抗体A7)的TCEP在25mM Tris HCL和5mM EDTA的缓冲液37摄氏度下2小时还原CD123抗体。反应最后冷却在15摄氏度。加入比例为2.7mol/mol抗体的溶解于DMSO中的linker payload后再逐步加入DMSO到最终DMSO浓度为6％(v/v)。反应1小时。使用N-acetyl cysteine来除去未反应的drug-linker。利用AKTA的FPLC系统的离子交换来去除CD123-ADC中的聚集态的高分子量的抗体和小分子。随后对洗脱下来的ADC进行缓冲液置换，置换为trangential flow filtration(TFF)。最后分析ADC的蛋白浓度，聚集状态，毒素与抗体的比例(DAR)等。
细胞培养和接种：
1.收获处于对数生长期的细胞并采用细胞计数仪进行细胞计数。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保各细胞系活力在90％以上。
2.用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μl细胞悬液至96孔板(T0板和待测药板)中使细胞密度达到指定的浓度。
3.96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养过夜。
加药
4.药物稀释，将被测化合物进行梯度稀释，得到10倍溶液。
5.加药，在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。被测化合物最高浓度为100nM，9个浓度，3.16倍稀释。
6.培养，将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行CTG检测。
终点读板：
7.融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟。
8.每孔加入等体积的CTG溶液。
9.在定轨摇床上振动2分钟使细胞裂解。
10.将细胞板放置于室温10分钟以稳定冷光信号。
11.用酶标仪读取冷光值。
数据处理：
12.使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
13.细胞增值率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％。
结果如图13-15所示，图中：1D6代表抗体A7，1D6ADC代表偶联吡咯苯并二氮类化合物(PBD)毒素的抗体A7偶联物。
图13显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC(也就是连接毒素的A7抗体)分别在正常的293细胞与CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值，其在正常的293细胞中的IC50为49.01nM，在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50为0.26nM。
图14显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC与未连接毒素的CD123抗体1D6在正常的293T细胞中的IC50值，未连接毒素的CD123抗体A7的IC50大于100nM，已连接毒素的CD123抗体1D6ADC的IC50为49.01nM。
图15显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC与未连接毒素的CD123抗体1D6在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值，未连接毒素的CD123抗体1D6IC50大于100nM，已连接毒素的CD123抗体1D6ADC的IC50为0.26nM。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
工业实用性：本发明公开的抗CD123抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。该抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，该抗CD123抗体通过特异性识别肿瘤细胞上的CD123的高亲和力的功能，通过偶联相应的毒素后，可用于治疗急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy CellLeukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDC Leukemia)等疾病，有良好的应用前景和价值。

Claims (18)

1.一种抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段具有重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_12、13和14所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_17、18和19所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_22、23和24所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_27、28和29所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_32、33和34所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_37、38和39所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_42、43和44所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_27、47和48所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_51、52和53所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_56、57和58所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_61、62和63所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_66、67和68所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_71、72和73所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_76、77和78所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_81、82和83所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_17、18和86所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_89、90和91所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_94、95和96所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_99、100和101所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_104、8和9所示；
或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如seq_107、3和108所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如seq_111、112和113所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，CD123蛋白的胞外区的氨基酸序列如seq_115所示。
3.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_11所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_16所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_21所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_26所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_31所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_36所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_41所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_46所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_50所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_55所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_60所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_65所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_70所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_75所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_80所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_85所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_88所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_93所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_98所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_103所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq_106所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq_110所示。
4.根据权利要求3所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的重链恒定区。
5.根据权利要求3或4所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的轻链恒定区。
6.根据权利要求3所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列如seq_116所示。
7.根据权利要求3或6所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列如seq_117所示。
8.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述功能片段包括F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
9.一种重组蛋白，其特征在于，其包括：
(i)：权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及
(ii)：与所述抗CD123抗体或其功能片段相融合的标记蛋白或功能蛋白或酶或标签序列。
10.一种偶联物，其特征在于，其包括：
(1)：权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及
(2)：与所述抗CD123抗体或其功能片段相偶联的诊断剂和/或治疗剂。
11.一种药物组合物，其特征在于，其含有作为活性成分的权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。
12.一种检测CD123蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段。
13.权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段在制备用于检测CD123蛋白的试剂盒中的应用，其特征在于，将所述抗CD123抗体或其功能片段与待测样品接触。
14.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自如下核酸：
(a)：DNA或RNA，其编码权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；
(b)：与(a)中定义的核酸分子互补的核酸分子。
15.一种载体，其特征在于，其含有权利要求14所述的分离的核酸分子。
16.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求15所述的载体或权利要求14所述的分离的核酸分子。
17.如权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段的制备方法，其特征在于，其包括：培养权利要求16所述的重组细胞，从培养物中分离得到所述的抗CD123抗体或其功能片段。
18.权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段、权利要求9所述的重组蛋白或权利要求10所述的偶联物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、经典霍奇金淋巴瘤、多毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、系统性肥大细胞增多症或浆细胞样树突状细胞白血病。
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