CN111542537B

CN111542537B - 抗cd123抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111542537B
Application number: CN201880000694.5A
Authority: CN
Inventors: 宁金鹰; 郝锋; 贺锋; 张文娜; 白兆帅; 彭浩
Original assignee: Kangyuan Bochuang Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Kangyuan Bochuang Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: WO2019237350A1; CN111542537A; CN116425874A

Abstract

本发明公开了抗CD123抗体及其制备方法和应用，该抗CD123抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3，轻链可变区包括三个互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3。所述抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，可特异性识别肿瘤细胞上的CD123。

Description

抗CD123抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及抗CD123抗体及其制备方法和应用。

背景技术

CD123蛋白的基因名称为IL3RA。CD123与IL-5受体和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体，形成为Beta common(βc)的膜受体细胞因子亚家族，这三种受体共享共同的βc亚基信号。其中这三种受体中的每一个受体都是由细胞因子特异性α亚基和普通βc亚基组成的异二聚体，使得能够高亲和力结合和细胞信号传导。这三个细胞因子发挥多种生物学功能，在控制正常和恶性血细胞生成方面，原生的和适应性免疫以及炎症反应等方面起着重要的生物学作用。

作为CD123陪体的IL-3是一种主要由活化T淋巴细胞产生的多效性细胞因子，其调节体内的造血功能和免疫细胞功能。IL-3最初称为多集落刺激因子(multi-CSF)因为其会刺激来自骨骼的广泛的造血细胞，包括嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞，红系细胞，巨核细胞和树突状细胞。IL-3的生物活性不仅仅体现在造血系统，同时也延伸到了造血系统内皮谱系，其中IL-3可以刺激内皮细胞增殖。

如上所述，IL-3R是一种包含alpha和beta链的异二聚体。IL-3Rα链是糖蛋白由360个氨基酸残基组成的Ig样结构域,其中包含287个氨基酸残基的胞外结构域，两个FnIII结构域，跨膜30个氨基酸残基的域和一个53个残基的胞内结构域。

最近的研究表明白细胞介素-3受体(IL-3RA或CD123)的α-链异常经常在一些白血病病症中观察到，并且可能有助于白血病细胞的增殖优势。很多研究分析了CD123在各种血液恶性肿瘤中过度表达，包括部分急性骨髓和B淋巴细胞白血病，突发性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)和毛细胞白血病。鉴于正常造血干细胞上CD123的低表达或缺失，其可以针对这种受体试作为一种药物靶点进行临床前及临床水平上的开发。由于CD123是一种膜受体，因此有两种方式来针对CD123靶点来进行药物开发，其中包括天然配体或单克隆抗体等两种常用的药物开发方式。最近的报道显示了使用由偶联至截短白喉毒素的人IL-3组成的融合分子在BPDCN和AML患者中良好的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的包括但不限于提供抗CD123抗体及其制备方法和应用。本发明通过我们自己设计的鼠源的Fc标签的CD123抗原来免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选分子水平与细胞水平和CD123亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用我们自己构建的细胞功能性实验在亲和力高的细胞株里筛选功能性最好的杂交瘤细胞株并测定出抗体序列，并确定了其CDR区序列。相关实验结果显示，该抗CD123抗体具有与肿瘤细胞表面的CD123蛋白特异性结合识别的能力，具有较强的亲和力和特异性。该抗CD123抗体或其功能片段具有广阔的应用前景。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种抗CD123抗体或其功能片段，所述抗CD123抗体或其功能片段具有重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；

所述轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

CDR-H1的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、12、22、32、42、51、61、71、81、89、99和107组成的组中的任意一种，或者，CDR-H1的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2、12、22、32、42、51、61、71、81、89、99和107中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；

CDR-H2的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.3、13、23、33、43、52、62、72、82、90和100组成的组中的任意一种，或者，CDR-H2的氨基酸序列为与SEQ ID NO.3、13、23、33、43、52、62、72、82、90和100中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；

CDR-H3的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.4、14、24、34、44、53、63、73、83、91、101和108组成的组中的任意一种，或者，CDR-H3的氨基酸序列为与SEQ ID NO.4、14、24、34、44、53、63、73、83、91、101和108中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；

CDR-L1的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.7、17、27、37、56、66、76、94、104和111组成的组中的任意一种，或者CDR-L1的氨基酸序列为与SEQ ID NO.7、17、27、37、56、66、76、94、104和111中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；

CDR-L2的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.8、18、28、38、47、57、67、77、95和112组成的组中的任意一种，或者，CDR-L2的氨基酸序列为与SEQ ID NO.8、18、28、38、47、57、67、77、95和112中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；

CDR-L3的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.9、19、29、39、48、58、68、78、86、96和113组成的组中的任意一种，或者，CDR-L3的氨基酸序列为与SEQ ID NO.9、19、29、39、48、58、68、78、86、96和113中的任意一种序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的的同一性的氨基酸序列；

所述CD123抗体或其功能片段具有与CD123蛋白的胞外区特异性结合的活性。

在本发明的一些实施方案中，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQID NO.2、3和4所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8和9所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.12、13和14所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17、18和19所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22、23和24所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.27、28和29所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.32、33和34所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.37、38和39所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.42、43和44所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.27、47和48所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.51、52和53所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.56、57和58所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.61、62和63所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.66、67和68所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.71、72和73所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.76、77和78所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.81、82和83所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17、18和86所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.89、90和91所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.94、95和96所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.99、100和101所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.104、8和9所示；

或者，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.107、3和108所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.111、112和113所示。

在本发明的一些实施方案中，CD123蛋白的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示。

在本发明的一些实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、11、21、31、41、50、60、70、80、88、98和106组成的组中的任意一种，或者，所述重链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1、11、21、31、41、50、60、70、80、88、98和106中的任意一种具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、16、26、36、46、55、65、75、85、93、103和110组成的组中的任意一种，或者，所述轻链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.6、16、26、36、46、55、65、75、85、93、103和110中的任意一种具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的重链恒定区。

在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的轻链恒定区。

在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示，或者，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.116具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示，或者，所述所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列为与SEQ ID NO.117具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述功能片段包括F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。

本发明所述的“功能片段”特别地指对于CD123蛋白或其胞外区段具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

本发明第一方面提供的抗CD123抗体或其功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。

本发明第一方面提供的抗CD123抗体无论在针对肿瘤细胞的CD123蛋白的亲和力和特异性识别肿瘤细胞上的CD123蛋白都有着独特的优势。由于CD123蛋白会高表达于血液瘤细胞，如ALL等，所以本发明提供的抗体会与肿瘤细胞表面的CD123蛋白结合识别肿瘤细胞。通过后期结合在ADC，CART药物或双特异抗体上的应用，会有效的杀伤肿瘤细胞。

总之，本发明第一方面提供的抗CD123抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，该抗CD123抗体通过特异性识别肿瘤细胞上的CD123的高亲和力的功能，今后在多种肿瘤治疗方式上有着良好的应用价值。因此该CD123抗体能够运用于治疗肿瘤疾病药物的制备中，如ADC，CART药物或双特异抗体类药物。

第二方面，本发明提供了一种重组蛋白，其包括：

(i)：如上第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及

(ii)：与该抗CD123抗体或其功能片段相融合的标记蛋白或功能蛋白或酶或标签序列。

第三方面，本发明提供了一种偶联物，其包括：

(1)：如上第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及

(2)：与所述抗CD123抗体或其功能片段相偶联的诊断剂和/或治疗剂。

在本发明的一些实施方案中，诊断剂选自由放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂以及光敏剂组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述放射性核素选自由¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁵⁴-¹⁵⁸Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述顺磁离子包括选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述荧光标记选自由Alexa 350、Alexa 405、Alexa430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，治疗剂选自裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、抗凋亡试剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物以及寡核苷酸组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述药物选自由吡咯苯并二氮类化合物(PBD)、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、氮芥、环磷酰胺、噻替派、顺铂、丝裂霉素、博莱霉素、喜树碱、鬼臼毒素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、长春碱、紫杉醇、三尖杉生物碱以及L-门冬酰胺酶组成的组中一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸选自由shRNA、miRNA和siRNA组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述免疫调节剂选自由细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞生长因子组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述细胞因子优选选自由人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT组成的组中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述趋化因子优选选自由RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10组成的组中的一种或多种。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供了一种检测CD123蛋白的试剂盒，其含有如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段。

在本发明的一些实施方案中，该试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

在本发明的一些实施方案中，该试剂盒包括用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。

第六方面，本发明提供了一种检测CD123蛋白的方法，其包括：将如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段与待测样品接触。通过抗原抗体特异性结合的机理，检测待测样品中是否存在抗原抗体结合复合物实现对待测样品中的CD123蛋白的检测。

第七方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自如下核酸：

(a)：DNA或RNA，其编码如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段；

(b)：与(a)中定义的核酸分子互补的核酸分子。

第八方面，本发明提供了一种载体，其含有如第七方面所述的分离的核酸分子。

第九方面，本发明提供了一种重组细胞，其含有如第八方面所述的载体或如第七方面所述的分离的核酸分子。

第十方面，本发明提供了如第一方面所述的抗CD123抗体或其功能片段的制备方法，其包括：培养如第九方面所述的重组细胞，从培养物中分离得到所述的抗CD123抗体或其功能片段。

第十一方面，本发明提供了如上所述的抗CD123抗体或其功能片段、如上所述的重组蛋白或如上所述的偶联物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的应用，所述疾病为急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDC Leukemia)。

第十二方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，给予患有疾病的主体施加如上所述的抗CD123抗体或其功能片段、如上所述的重组蛋白、如上所述的偶联物或如上所述的药物组合物，其中，所述疾病急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDC Leukemia)。

在本发明的一些实施方案中，其中，上述主体为人。

第十三方面，本发明提供了一种制备如上所述的抗CD123抗体或其功能片段的方法，其包括：培养第九方面所述的重组细胞，从培养产物中分离得到如上所述的抗CD123抗体或其功能片段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的A6抗体的Biacore实验的检测结果；

图2为本发明实施例中的A5抗体的Biacore实验的检测结果；

图3为本发明实施例中的A7抗体的Biacore实验的检测结果；

图4为本发明实施例中的A8抗体的Biacore实验的检测结果；

图5为本发明实施例中的A9抗体的Biacore实验的检测结果；

图6为本发明实施例中的A3抗体的Biacore实验的检测结果；

图7为本发明实施例中的A12抗体的Biacore实验的检测结果；

图8为本发明实施例中的A4抗体的Biacore实验的检测结果；

图9为本发明实施例中的A1抗体的Biacore实验的检测结果；

图10为本发明实施例中的A11抗体的Biacore实验的检测结果；

图11为本发明实施例中的A2抗体的Biacore实验的检测结果；

图12为本发明实施例中的A10抗体的Biacore实验的检测结果；

图13为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7分别在正常的293细胞与CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值；

图14为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7与未连接毒素的抗体A7在正常的293T细胞中的IC50值；

图15为本发明实施例中的已连接毒素的抗体A7与未连接毒素的抗体A7在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》中所述的条件，或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

杂交瘤细胞的制备

用包含CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)与小鼠IgG2a-FC(来自Genbank登记号AAH31470.1)的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，5只小鼠皮下免疫，5只小鼠肌肉免疫，佐剂采用quickantibody 5W水溶性佐剂，加强免疫以后2周测效价，选取效价高的两只小鼠进行免疫冲击，3天之后进行下文所述的细胞融合。

取准备融合的两只小鼠，取血清，然后解剖后，取脾脏，分离脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行融合，铺96孔板，同时加入选择性培养基进行筛选，7天后换液，10天后进行ELISA检测，选择OD值大于阴性对照10倍以上的再进行流式细胞仪检测。

挑选双阳的细胞，通过细胞有限稀释法进行亚克隆铺板，挑选单克隆细胞。将挑选出的单克隆细胞，取培养上清，进行ELISA检测及流式细胞仪检测，挑选双阳的细胞扩大培养。

实施例2

杂交瘤细胞的培养上清与CD123结合的ELISA检测

用包含CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)与人的IgG1-FC(来自Genbank登记号CAC20454.1)用包被液稀释至1-2μg/ml，然后以50-100μl/孔加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。每孔加入200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。用洗涤液洗3次，此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。

向每孔中加入50-100μl待检杂交瘤细胞的培养上清(由实施例1获取的)，同时设立阳性对照(加入融合小鼠的血清)、阴性对照(加入正常小鼠的血清)和空白对照(加入培养基)。在37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。然后向每孔中加入酶标二抗，为1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(SIGMA，货号A9044-2ml)，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。向每孔中加入新鲜配制的底物显色液TMB 50-100μl，37℃孵育10-30分钟。

加入2mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

结果判定：以P/N>2:1(P代表阳性数值，N代表正常小鼠血清数值)为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

实施例3

杂交瘤细胞的培养上清与CD123结合的FACS检测

将CD123蛋白(来自Genbank登记号NP_002174.1)的胞外区(SEQ ID NO:115)构建到PLVX病毒包装载体(clontech，virus package mix，货号631275)，转染293T细胞包装病毒，用该病毒感染HEK293细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染CD123的HEK293。然后将HEK293-CD123细胞在含2％FBS的PBS中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。

向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入50μl待检杂交瘤细胞的培养上清(由实施例1获取)，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入培养上清和抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307)，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入培养上清，仅加入细胞悬液和抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307))。

然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μlPE标记的抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号405307)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。

再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。

实施例4

基于EILSA，FACs双阳性选择相应的单克隆细胞，收集杂交瘤细胞培养上清，离心，过滤后通过流式检测方法计算每个单克隆细胞的EC50。再根据EC50结果选择候选抗体进行纯化。

选择protein G亲和层析柱，进行纯化，纯化的抗体通过SDS-PAGE电泳检测纯度，用BCA蛋白检测试剂盒检测抗体浓度，分装，保存于-80℃冰箱中备用。

纯化后的抗体再进行EC50实验，根据EC50结果选择最终的候选杂交瘤细胞进行测序。提RNA，再反转录cDNA，连入测序载体中进行测序分析。共得到12个抗体，各抗体名称以及测序结果如下：

(1)抗体名称：A1

重链可变区(V_H)：H11；

QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSAFMSRLSISKDKSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGSSYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.1)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.2、3和4；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.5；

轻链可变区(V_L)：KMK11-1；

DIVLTQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSSRSLLNSSTRKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGSGTKLEIK，(SEQ ID NO.6)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.7、8和9所示；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.10。

(2)抗体名称：A2；

重链可变区(V_H)：H8；

QVQLKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFMTYVIHWVKQKPGQGLEWFGYCNPYNDGINYNEKFKGKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSPSYYGRSYYYGMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.11)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.12、13和14；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.15；

轻链可变区(V_L)：L8-7；

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLDIK，(SEQ ID NO.16)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.17、18和19；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.20。

(3)抗体名称：A3；

重链可变区(V_H)：H9；

QVQLKQSGPELVKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMKWVKQSPGKSLEWIGDIIPNNGATFYNKNFKGKATLTVDKSSTTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGGIYYGYGAYWGQGTLVTVSV，(SEQ ID NO.21)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.22、23和24；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.25；

轻链可变区(V_L)：MKC9-1；

DIQMTQTPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLLYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIK，(SEQ ID NO.26)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.27、28和29；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.30。

(4)抗体名称：A4；

重链可变区(V_H)：16A5-3-1；

EVKLVESGGGLVRPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCARQGASYYFDYWGQGTTLTVSS，(SEQ ID NO.31)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是如SEQID NO.32、33和34；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.35；

轻链可变区(V_L)：MKC4-1；

DIVLTQSQKFMSTSVGDRISITCKASQNVGTGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLSISNMQSEDLADYFCQQYSSYPTFGSGTKLEIK，(SEQ ID NO.36)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.37、38和39；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.40。

(5)抗体名称：A5；

重链可变区(V_H)：4H31-H；

QVQLKQSGPELVKSGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNNATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGEGWLLPLACWGQGTLVTVSA，(SEQ ID NO.41)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.42、43和44；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.45；

轻链可变区(V_L)：4K52-L；

DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK，(SEQ ID NO.46)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.27、47和48；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.49。

(6)抗体名称：A6；

重链可变区(V_H)：2H32-H；

QVQLKQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFSSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARERGLYDYDETGYYAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.50)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.51、52和53；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.54；

轻链可变区(V_L)：2K81-L；

DIQLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISEIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYFCQNGHSFPYTFGGGTKLEIKR，(SEQ ID NO.55)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.56、57和58；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.59。

(7)抗体名称：A7；

重链可变区(V_H)：1D6-H；

EVQLQQSGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTNHWMDWVKQRPGQGLEWIGEIDFSDSDTNYNQKFRGKATLTVDKSSRTAYLQLSSLTSEDSAVYYCATYYRYDVYWGQGTLVTVSA，(SEQ ID NO.60)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.61、62和63；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.64；

轻链可变区(V_L)：1D6-L；

DIVMTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSFVHWFQQKPGTSPKLWIFSTSNLASGVPLRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRNSYPWTFGGGTKLEIK，(SEQ ID NO.65)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.66、67和68；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.69。

(8)抗体名称：A8；

重链可变区(V_H)：7H11-H；

DDVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSSNSNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.70)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.71、72和73；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.74；

轻链可变区(V_L)：7K61-L；

DIVLTQSPAIMSVFLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQFHRSPRTFGGGTKLEIK，(SEQ ID NO.75)；其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ ID NO.76、77和78；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.79。

(9)抗体名称：A9；

重链可变区(V_H)：9H51-H；

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKLKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYNCARSGSGYYYAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.80)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.81、82和83；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.84；

轻链可变区(V_L)：9K41-L；

DIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKR，(SEQ ID NO.85)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.17、18和86；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.87。

(10)抗体名称：A10；

重链可变区(V_H)：H13；

QVQLKQSGPELVKTGASVKMSCKASGYSFTDYYVHWVRQSHGKSLEWIGYISCYNGATNYNPKFKGKATFTVDTSSSTAYMQFKSLTSEDSAVYYCAGGEGYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.88)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.89、90和91；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.92；

轻链可变区(V_L)：L13-2；

DIQLTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGGDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDDLYTFGGGTKLEIK，(SEQ ID NO.93)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.94、95和96；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.97。

(11)抗体名称：A11；

重链可变区(V_H)：18H8-H，；

QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYDMSWIRQPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNSAFMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGSTYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.98)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.99、100和101；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.102；

轻链可变区(V_L)：18H8-L；

DIVMTQAPSSLAVSAGEKVTMSCQSSQSLLNSSTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGSGTKLEIK，(SEQ ID NO.103)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.104、8和9；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.105。

(12)抗体名称：A12；

重链可变区(V_H)：H3；

QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGGTNYNSAFMSRLSISKDKSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRGNSYVFAMDYWGQGTSVTVSS，(SEQ ID NO.106)；

其中，下划线区分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，对应的序列标识符分别是SEQ IDNO.107、3和108；

重链可变区的编码序列：SEQ ID NO.109；

轻链可变区(V_L)：MKC-3-1；

DVLMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQNLVHSNGYTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFKFGSGTKLEIK，(SEQ ID NO.110)；

其中，下划线区分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，对应的序列标识符分别是如SEQID NO.111、112和113；

轻链可变区的编码序列：SEQ ID NO.114。

上述各抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示。

实施例5

内吞实验

洗脱液：0.05M甘氨酸，0.1M氯化钠水溶液，pH 3.0；

中和液：0.15M Tris水溶液，pH 7.4。

96孔细胞培养板中每孔加入5×10⁵个293T CD123细胞。使用PBS配制10μg/ml的抗体溶液，使用100μl抗体溶液重悬细胞，细胞板于4℃放置1小时。使用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次。

使用PBS配制二抗溶液(1:10PE anti human IgG)，使用100μl二抗溶液重悬细胞，细胞板于4℃放置1小时。使用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次，使用完全培养基重悬细胞并均分为3份。其中1份标记为“内吞组(Internalization group)”并于37℃放置1小时，另外2份分别标记为“100％内吞对照组”和“0％内吞对照组”并于4℃放置1小时。内吞组和0％内吞对照组离心去上清后，使用200μl洗脱液重悬细胞，并与室温放置7分钟。离心去上清后，使用200μl中和液重悬细胞，再次离心去上清后，使用FACS缓冲液重悬细胞。100％内吞对照组不做洗脱和中和处理，离心去上清后，使用FACS缓冲液重悬细胞。使用流式仪器检测各组细胞的平均荧光强度(MFI)。内吞百分比使用以下公式计算：

结果如表1所示。

表1实施例4中部分抗体的内吞实验结果

因为我们是利用筛选的高亲和力的CD123抗体进行毒素的偶联来起到杀伤肿瘤细胞的效果，由于偶联得细胞毒素需要进入到细胞内部才能发挥细胞杀伤作用，因此需要我们的CD123抗体结合细胞表面的CD123后会引起被细胞内吞的功能，只有这样被偶联在CD123抗体上的毒素才能被带入至细胞内，通过进一步的毒素释放来起到杀伤肿瘤细胞的功能。

我们通过设计的吞实验来验证CD123抗体结合细胞表面后其进入细胞与未进入细胞的比例，从而反映我们的抗体是否适合进行后续的毒素偶联。

如上表1所示，内吞比例超过10％的抗体例如A10 A3 A12 A1 A2 A11 A4 A7均可考虑用于后期的毒素偶联。

实施例6

BIACORE实验

将实施例1中的融合蛋白即CD123蛋白的胞外区(SEQ ID NO:115)与小鼠IgG2a-FC融合的免疫原在PBS缓冲溶液中制备成最高浓度为30nM的溶液，并3倍稀释为6个浓度并设0浓度对照。将本发明实施例3的纯化抗体在PBS中制备为20nM的溶液。

用Biacore T200测定抗体抗原的亲和力。使用CM5芯片捕获本发明实施例4的抗体之后，将抗原CD123小鼠IgG2a Fc标签蛋白流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。

实验结果如图1-图12所示。

图1-图12反应的结果是测定了抗体与抗原的亲和力，KD为解离常数，指引起最大效应一半(50％受体被占位)时的药物浓度KD值越大，引起最大效应所需药物浓度越多，亲和力越小。图中曲线从上至下分别为30,10,3.3,1.1,0.37,0.12nM六个浓度的抗体与抗原的结合及解离曲线。

图1显示了A6抗体与抗原的亲和力KD＝3.462E-9；

图2显示了A5抗体与抗原的亲和力KD＝1.331E-9；

图3显示了A7抗体与抗原的亲和力KD＝6.446E-11；

图4显示了A8抗体与抗原的亲和力KD＝2.543E-9；

图5显示了A9抗体与抗原的亲和力KD＝5.942E-9；

图6显示了A3抗体与抗原的亲和力KD＝5.570E-10；

图7显示了A12抗体与抗原的亲和力KD＝2.779E-10；

图8显示了A4抗体与抗原的亲和力KD＝1.502E-9；

图9显示了A1抗体与抗原的亲和力KD＝3.075E-12；

图10显示了A11抗体与抗原的亲和力KD＝1.155E-9；

图11显示了A2抗体与抗原的亲和力KD＝4.835E-10；

图12显示了A10抗体与抗原的亲和力KD＝2.380E-10。

实施例7

ADC与细胞杀伤实验

共价连接的CD123抗体的细胞毒性药物制备。毒性药物的选择为pyrrolobenzodiazepine(PBD)二聚体，其化学结构如如下：

吡咯苯并二氮类化合物(PBD)是一类具有抗生素或抗肿瘤特性的天然产物，由各种放线菌产生，是序列选择性DNA烷化剂化合物。作为一类DNA交联剂，它们比全身性化疗药物显着更有效。一些PBD具有识别和结合DNA特定序列的能力。

使用1.3mol/mol抗体(实施例1中的抗体A7)的TCEP在25mM Tris HCL和5mM EDTA的缓冲液37摄氏度下2小时还原CD123抗体。反应最后冷却在15摄氏度。加入比例为2.7mol/mol抗体的溶解于DMSO中的linker payload后再逐步加入DMSO到最终DMSO浓度为6％(v/v)。反应1小时。使用N-acetyl cysteine来除去未反应的drug-linker。利用AKTA的FPLC系统的离子交换来去除CD123-ADC中的聚集态的高分子量的抗体和小分子。随后对洗脱下来的ADC进行缓冲液置换，置换为trangential flow filtration(TFF)。最后分析ADC的蛋白浓度，聚集状态，毒素与抗体的比例(DAR)等。

细胞培养和接种：

1.收获处于对数生长期的细胞并采用细胞计数仪进行细胞计数。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保各细胞系活力在90％以上。

2.用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μl细胞悬液至96孔板(T0板和待测药板)中使细胞密度达到指定的浓度。

3.96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养过夜。

加药

4.药物稀释，将被测化合物进行梯度稀释，得到10倍溶液。

5.加药，在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。被测化合物最高浓度为100nM，9个浓度，3.16倍稀释。

6.培养，将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行CTG检测。

终点读板：

7.融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟。

8.每孔加入等体积的CTG溶液。

9.在定轨摇床上振动2分钟使细胞裂解。

10.将细胞板放置于室温10分钟以稳定冷光信号。

11.用酶标仪读取冷光值。

数据处理：

12.使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。

13.细胞增值率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％。

结果如图13-15所示，图中：1D6代表抗体A7，1D6ADC代表偶联吡咯苯并二氮类化合物(PBD)毒素的抗体A7偶联物。

图13显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC(也就是连接毒素的A7抗体)分别在正常的293细胞与CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值，其在正常的293细胞中的IC50为49.01nM，在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50为0.26nM。

图14显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC与未连接毒素的CD123抗体1D6在正常的293T细胞中的IC50值，未连接毒素的CD123抗体A7的IC50大于100nM，已连接毒素的CD123抗体1D6ADC的IC50为49.01nM。

图15显示了已连接毒素的CD123抗体1D6ADC与未连接毒素的CD123抗体1D6在CD123过表达的细胞293T-X中的IC50值，未连接毒素的CD123抗体1D6 IC50大于100nM，已连接毒素的CD123抗体1D6ADC的IC50为0.26nM。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

工业实用性：本发明公开的抗CD123抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。该抗体对人源CD123蛋白具有高亲和力，该抗CD123抗体通过特异性识别肿瘤细胞上的CD123的高亲和力的功能，通过偶联相应的毒素后，可用于治疗急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell ALL)、经典霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin's Lymphoma)、多毛细胞白血病(Hairy CellLeukemia)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症(Systemic Mastocytosis)或浆细胞样树突状细胞白血病(pDC Leukemia)等疾病，有良好的应用前景和价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 康源博创生物科技（北京）有限公司

<120> 抗CD123抗体及其制备方法和应用

<160> 117

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Lys Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Ser Ser Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Ser Ser Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60

acctgcactg tctctggatt ctcattgacc agctatgata taagctggat tcgccagcca 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggaccg gtggaggcac aaattataat 180

tcagctttca tgtccagact gagtatcagc aaggacaagt ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacact gccatatatt attgtgtaag gggtagtagt 300

tacgtctttg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Asn Ser Ser Thr Arg Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr

1 5

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatattgtgc taactcagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgacctgca aatccagtcg aagtctactc aacagtagca cccgaaagaa cttcttggct 120

tggtaccagc agaaaccggg acagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatcta 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Met Thr Tyr

20 25 30

Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Phe

35 40 45

Gly Tyr Cys Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gly Tyr Thr Phe Met Thr Tyr Val Ile His

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Tyr Cys Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Ser Pro Ser Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 15

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgag ttggttaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg catctggata cacattcatg acctatgtca tacactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gtttggatat tgtaatcctt acaatgatgg tattaactat 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagtctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatccccc 300

tcttactacg gtcgtagtta ttactatggt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gacatccagc tgactcagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggacata aaa 333

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Ile Pro Asn Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Lys Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Val

115

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Asp Ile Ile Pro Asn Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Lys Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Gly Gly Ile Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactactaca tgaagtgggt gaagcagagc 120

cctgggaaga gccttgagtg gattggagat ataattccta acaatggtgc cactttctac 180

aacaagaact tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggggg 300

atctactatg gttacggggc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgta 357

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttttatttcc agcttggtcc cccctccgaa cgtgtacgga atactataat gttgctgaca 60

gaagtaatct gccaggtctt cagcctgcac actgctgatg gtaagagtga aatctgtccc 120

agatccactg cctatgaagc gatcagggac cccagattcc ctagtggatg caaagtataa 180

tagaagttta ggagactgtc ctggtttctg ctggtaccag gccaaatagt tcttttgatt 240

gctactattt aaaaggctct gactggactt gcagctcata gtgaccttct gtcctactga 300

catagccagg gaggatggag tctgtgtcat ctggatatc 339

<210> 31

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Ala Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Gln Gly Ala Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 35

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180

ccagacagtg tgaagggacg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtcagaggac acggcctttt attactgtgc aagacaaggg 300

gcatcgtact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354

<210> 36

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ile Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 37

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Gly Val Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 40

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gacattgtgc tgacccaatc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga caggatcagc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actggtgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatccagtc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctct ccatcagcaa tatgcagtct 240

gaagacctgg cagattattt ctgccagcaa tatagcagct atcccacgtt cggctcgggg 300

acaaagttgg aaataaaa 318

<210> 41

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 41

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Asn Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Gly Trp Leu Leu Pro Leu Ala Cys Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Asn Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Gly Glu Gly Trp Leu Leu Pro Leu Ala Cys

1 5 10

<210> 45

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgag ctggtgaagt ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcaaagc 120

catgtaaaga gccttgagtg gattggacgt attaatcctt acaataatgc tactagctac 180

aaccagaatt tcaaggacaa ggccagcttg actgtagata agtcttccag cacagcctac 240

atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggagag 300

ggatggttac taccccttgc ttgctggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 46

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Phe Ala Ser Thr Arg Asp Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 48

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 49

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 49

Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala

50 55 60

Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr

85 90 95

Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr

100 105 110

Ala Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala

115 120 125

Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly

130 135 140

Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys

165 170 175

Thr Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys

180 185 190

Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Thr Ala Gly

195 200 205

Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys

210 215 220

Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Ala Cys Cys

225 230 235 240

Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly

245 250 255

Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala

260 265 270

Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala

275 280 285

Cys Ala Thr Thr Ala Thr Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr

290 295 300

Gly Gly Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly

305 310 315 320

Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys

325 330 335

Ala Ala Ala

<210> 50

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 50

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Tyr Asp Glu Thr Gly Tyr Tyr Ala

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 51

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 52

Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 53

Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Tyr Asp Glu Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 54

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

caggtgcagc tgaagcagtc tggggctgag ctggtgaggt ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacattttcc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggacagg gcctggaatg gattggatat atttatcctg gaaatggtgg tactaactac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagatca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagagagcgg 300

ggcctctatg attacgacga gacggggtac tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 360

tcagtcaccg tctcctca 378

<210> 55

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 55

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Glu Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 56

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 57

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 58

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 59

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gacatccagc tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgta gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctga gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240

gaagatgttg gagtgtattt ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgtatac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 60

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 60

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Phe Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 61

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His Trp Met Asp

1 5 10

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 62

Glu Ile Asp Phe Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 63

Tyr Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr

1 5

<210> 64

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gaggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa cttgtgaagc ctgggacttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aaccactgga tggactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagaa attgattttt ctgatagtga tactaactac 180

aatcaaaaat tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag aacagcctac 240

ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aacctactat 300

aggtacgacg tttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 65

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 65

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Val

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Phe

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 66

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Val His

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 67

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 68

Gln Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 69

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gacattgtga tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcgt ctccagggga gaaggtcacc 60

cttacctgca gtgccagctc aagtgtaagt ttcgtgcact ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttttagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctcttcgt 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaaga aatagttatc cgtggacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aaatcaaac 319

<210> 70

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 70

Asp Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser

20 25 30

Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu

35 40 45

Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Ser Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 71

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5 10

<210> 72

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 72

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 73

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 73

Gly Met Asp Tyr

1

<210> 74

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtag ctctaactcc 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attattgtgc aagagggatg 300

gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcc 339

<210> 75

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 75

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Phe Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 76

Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His

1 5 10

<210> 77

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 77

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 78

His Gln Phe His Arg Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 79

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gatattgtgc taactcagtc tccagcaatc atgtctgtat ttctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagttc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtttcatc gttccccacg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat caaa 324

<210> 80

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 80

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Leu

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asn Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 81

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His

1 5 10

<210> 82

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 82

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Leu Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 83

Ser Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 84

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt taaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct ataactgtgc aagatcaggg 300

tccggttatt actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 85

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 85

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 86

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 87

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

gacattgtgc tgacccaatc tccaggttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcgacctat tactgtcagc aaactaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333

<210> 88

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 88

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 89

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 89

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Val His

1 5 10

<210> 90

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 90

Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 91

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 91

Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 92

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgaa ctagtgaaga ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gattactacg tacactgggt caggcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggatat attagttgtt acaatggtgc tactaactac 180

aacccgaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagttca aaagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aggaggggag 300

ggctactatg gttatgacgg ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 93

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 93

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 94

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala

1 5 10

<210> 95

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 95

Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro

1 5

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 96

Leu Gln Tyr Asp Asp Leu Tyr Thr

1 5

<210> 97

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

gacatccagc tgactcagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60

atcacttgca aggcaagcca agacattaac aagtatatag cttggtacca acacaagcct 120

ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acatctacat tacagccagg catcccatca 180

aggttcagtg gaagtgggtc tgggggagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240

gaagatattg caacttatta ttgtctgcag tatgatgatc tttacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaa 318

<210> 98

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 98

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Ser Thr Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 99

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Met Ser

1 5 10

<210> 100

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 100

Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 101

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 101

Gly Ser Thr Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 102

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60

acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc agctatgata tgagctggat tcgccagccg 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatgggctg gtggaggcac aaattataat 180

tcagctttca tgtccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt attgtgtaag gggtagtacc 300

tacgtctttg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 103

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 103

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 104

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 105

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gatattgtga tgacgcaggc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgcc aatccagtca aagtctactc aacagtagca cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatcta 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 106

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 106

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Lys Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Asn Ser Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 107

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 107

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 108

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 108

Gly Asn Ser Tyr Val Phe Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 109

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60

acctgcactg tctctggatt ctcattgacc aactatgata taagctggat tcgccagcca 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggactg gtggaggcac aaattataat 180

tcagctttca tgtccagact gagcatcagc aaggacaagt ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacact gccatatatt attgtgtaag gggtaatagt 300

tacgtctttg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctctg tcaccgtctc ctca 354

<210> 110

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 110

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Lys Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 111

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 111

Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 112

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 112

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 113

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 113

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Lys

1 5

<210> 114

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca atcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaaccttgta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agcctggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggagtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaagtac acatgttcca 300

ttcaagttcg gctcggggac aaagttggag ataaaa 336

<210> 115

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 115

Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Ile

20 25 30

Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn Asn Ser

35 40 45

Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn Tyr Thr

50 55 60

Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe Pro Glu

65 70 75 80

Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys Trp Ile

85 90 95

His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro Gly Ala

100 105 110

Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn Arg Arg

115 120 125

Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly Thr Arg

130 135 140

Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly Ile Pro

165 170 175

Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu Thr Pro

180 185 190

Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met His Trp

195 200 205

Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu Gln Ile

210 215 220

Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp Arg Thr

225 230 235 240

Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile Arg Ala

245 250 255

Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro Gln Arg

260 265 270

Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp Arg

275 280 285

<210> 116

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 116

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

1 5 10 15

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

20 25 30

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

35 40 45

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

50 55 60

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

85 90 95

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

100 105 110

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

130 135 140

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

145 150 155 160

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

165 170 175

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

180 185 190

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

195 200 205

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

210 215 220

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

225 230 235 240

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

245 250 255

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

260 265 270

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

275 280 285

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

290 295 300

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

305 310 315 320

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 117

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 117

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

1 5 10 15

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

20 25 30

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

35 40 45

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

50 55 60

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

85 90 95

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105 110

Claims

1.一种抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段具有重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；

所述轻链可变区包括三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、3和4所示，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8和9所示。

2.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，CD123蛋白的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.115所示。

3.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求3所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的重链恒定区。

5.根据权利要求3或4所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区选自由人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组中的任意一种人抗体的轻链恒定区。

6.根据权利要求3所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示。

7.根据权利要求3或6所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗CD123抗体或其功能片段的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.117所示。

8.根据权利要求1所述的抗CD123抗体或其功能片段，其特征在于，所述功能片段包括F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。

9.一种重组蛋白，其特征在于，其包括：

(i)：权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及

(ii)：与所述抗CD123抗体或其功能片段相融合的标记蛋白或功能蛋白或酶或标签序列。

10.一种偶联物，其特征在于，其包括：

(1)：权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；以及

11.一种药物组合物，其特征在于，其含有作为活性成分的权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。

12.一种检测CD123蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段。

13.权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段在制备用于检测CD123蛋白的试剂盒中的应用，其特征在于，将所述抗CD123抗体或其功能片段与待测样品接触。

14.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自如下核酸：

(a)：DNA或RNA，其编码权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段；

(b)：与(a)中定义的核酸分子互补的核酸分子。

15.一种载体，其特征在于，其含有权利要求14所述的分离的核酸分子。

16.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求15所述的载体或权利要求14所述的分离的核酸分子。

17.如权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段的制备方法，其特征在于，其包括：培养权利要求16所述的重组细胞，从培养物中分离得到所述的抗CD123抗体或其功能片段。

18.权利要求1-8任一项所述的抗CD123抗体或其功能片段、权利要求9所述的重组蛋白或权利要求10所述的偶联物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病、经典霍奇金淋巴瘤、多毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、系统性肥大细胞增多症或浆细胞样树突状细胞白血病。