ES2881807T3 - Anticuerpo anti-EGFR específico de tumor y aplicación del mismo - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que reconoce específicamente EGFRvIII expresado o EGFR sobreexpresado por células tumorales, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55; la CDR2 de la región variable de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 53; la CDR3 de la región variable de la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57; la CDR1 de la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; la CDR2 de la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52; la CDR3 de la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50; preferiblemente, el anticuerpo incluye: anticuerpo (a), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 43, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 45, CDR3 de SEQ ID NO: 46, anticuerpo (b), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 47, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 48, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 49, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (c), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 48, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 51, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (d), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 43, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 52, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (e), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 43, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 45, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (f), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 53, CDR3 de SEQ ID NO: 54, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 51, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (g), en el que la región variable de la cadena ligera tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 54, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 51, CDR3 de SEQ ID NO: 50, 5 anticuerpo (h), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 55, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 56, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 45, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (i), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 53, CDR3 de SEQ ID NO: 56, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 52, CDR3 de SEQ ID NO: 50, anticuerpo (j), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 56, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 52, CDR3 de SEQ ID NO: 50, o anticuerpo (k), en el que la región variable de la cadena ligera del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 41, CDR2 de SEQ ID NO: 42, CDR3 de SEQ ID NO: 57, y la región variable de la cadena pesada del mismo tiene CDR1 de SEQ ID NO: 44, CDR2 de SEQ ID NO: 52, CDR3 de SEQ ID NO: 50. más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 13; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 13; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 59; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 59; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 61; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 61; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 63; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 63; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 65; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 65; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 67; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 67; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 69; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 69; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 71; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 71; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 73; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 73; La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 75; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 75; o La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo se muestra en las posiciones 124 a 239 de SEQ ID NO: 77; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra en las posiciones 1-108 de SEQ ID NO: 77.

Description

DESCRIPCIÓ N
A n tic u e rp o a n ti-E G F R e sp e c ífico de tu m o r y a p lica c ió n de l m ism o
C am po técn ico
La p re se n te inve n c ió n se re fie re al ca m p o de in m u n o lo g ía y, en p a rticu la r, la p re se n te in ve n c ió n se re fie re a a n ticu e rp o s a n ti-E G F R e sp e c ífico s de tu m o r y u so s de los m ism o s .
A ntecedentes
E G F R se s o b re e x p re s a o m u ta en m u ch o s tu m o re s , y es in d u d a b le m e n te u n a cu e s tió n c ie n tíf ic a m uy im p o rta n te la m a n e ra de re co n o ce r s e le c tiva m e n te e s te E G F R so b re e x p re s a d o o m u ta do . H as ta a ho ra , se c re e q ue los a n ticu e rp o s co n tra e l e p íto p o E G F R 287 -302 co n s ig u e n el p ro p ó s ito de re co n o ce r EG F R , E G F R vIII y d e 4 E G F R so b re e xp re sa d o sob re la su p e rfic ie de tu m o re s , en lu g a r de E G F R en c é lu la s n o rm a le s . D e sa fo rtu n a d a m e n te , los a n ticu e rp o s co n tra e s te e p íto p o aún tien en e fe c to s s e cu n d a rio s ta le s co m o e ru p c io n e s en e n sa yo s c lín ico s (h ttp ://m e e tin g lib ra ry .a sc o .o rg /co n te n t/115945 -132 ), lo q ue su g ie re q ue a b o rd a r e s te e p íto p o p u e d e id e n tif ic a r EG FR en c é lu la s n o rm a le s (ta les co m o q u e ra tin o c ito s ). A d e m á s, e l d o c u m e n to EP 2 835 379 d e sc rib e un a n ticu e rp o b io fu n c io n a l con e sp e c ific id a d a u m e n ta d a p a ra e l re co n o c im ie n to tu m o ra l de tu m o re s liga d os a EG F R . S in e m b a rg o , e s te a n ticu e rp o tie n d e a a g re g a rse , lo q ue d e m u e s tra su p oca e s ta b ilid a d .
P o r lo tan to , es m uy u rg e n te c r ib a r a n ticu e rp o s a n ti-E G F R con m a yo r e sp e c ific id a d tum o ra l.
Sum ario de la invención
El o b je to de la p re se n te inve nc ión es p ro p o rc io n a r a n ticu e rp o s a n ti-E G F R e sp e c ífico s de tu m o r y u so s de los m ism os. En un p rim e r a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un a n ticu e rp o q u e re co n o ce e sp e c ífica m e n te E G F R vIII e xp re sa d o o E G F R so b re e xp re sa d o p o r c é lu la s tu m o ra le s , en e l q ue el a n ticu e rp o co m p re n d e u n a re g ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra y u na reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p esad a ,
la CDR1 de la re g ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u na s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 41, S E Q ID N O : 47, S E Q ID N O : 55;
la C D R 2 de la re g ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u na s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 42, S E Q ID N O : 53;
la C D R 3 de la re g ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u na s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 43, S E Q ID N O : 48, S E Q ID N O : 54, S E Q ID N O : 56, S E Q ID N O : 57; la CDR1 de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a p e sa d a tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 44; la C D R 2 de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a tie n e u n a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 45, S E Q ID N O : 49, S E Q ID N O : 51, S E Q ID N O : 52;
la C D R 3 de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a tie n e u n a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 46, S E Q ID N O : 50.
En u n a re a liza c ió n p re fe rid a , e l a n ticu e rp o inc luye :
a n ticu e rp o (a), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la re g ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a d e l m ism o tien e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 46,
a n ticu e rp o (b), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 47, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 48, y la re g ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a d e l m ism o tien e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 49, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (c), en e l q u e la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 48, y la re g ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a d e l m ism o tien e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (d), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la re g ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a d e l m ism o tien e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (e), en e l q u e la re g ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (f), en e l q u e la re g ión v a r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 53, C D R 3 de S E Q ID N O : 54, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (g), en e l q ue la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, c D r 3 de S E Q ID N O : 54, y la re g ión va r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (h), en e l q u e la re g ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 55, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (i), en e l q u e la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 53, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (j), en e l q u e la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (k), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de s EQ ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 57, y la reg ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50.
El a n ticu e rp o de a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n ta m b ié n a b a rca un a n ticu e rp o (1) q u e re co n o ce e l m ism o d e te rm in a n te a n tig é n ico q ue e l re co n o c id o p o r e l a n ticu e rp o de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de (a) a (k).
De a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n , p a ra c a d a re a liza c ió n co m o se d e sc rib e a n te rio rm e n te , e l a n ticu e rp o inc lu ye la re g io n e s va r ia b le s de la c a d e n a lig e ra C D R 1, C D R 2 y C D R 3 o las re g io n e s va r ia b le s de la ca d e n a p e s a d a C D R 1, C D R 2 y C D R 3 co m o se m e n c io n a a n te rio rm e n te .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l a n ticu e rp o q u e re co n o ce e sp e c ífica m e n te E G F R vIII e xp re sa d o o EG FR so b re e x p re s a d o p o r c é lu la s tu m o ra le s p u e d e ser: a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio (scFV ), a n ticu e rp o m o no c lo na l, a n ticu e rp o de d o m in io , fra g m e n to Fab, fra g m e n to Fd, fra g m e n to Fv, fra g m e n to F (a b ')2 y un d e riv a d o de los m ism os , u o tra s fo rm a s de a n ticu e rp o ; p re fe rib le m e n te a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l a n ticu e rp o q u e re co n o ce e sp e c ífica m e n te E G F R vIII e xp re sa d o o EG FR so b re e xp re sa d o p o r c é lu la s tu m o ra le s e s tá h u m a n iza d o , co m p le ta m e n te h u m a n iza d o , es q u im é rico o m urino .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticue rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 13; y la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 13;
L a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 59; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 59;
L a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 61; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 61;
L a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 63; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 63;
L a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 65; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 65;
L a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 67; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 67;
La se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 69; y la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 69;
La se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 71; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 71;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 73; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 73;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 75; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 75; o
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 77; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 77.
De a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n , p a ra ca d a re a liza c ió n co m o se d e sc rib e a n te rio rm e n te , e l a n ticu e rp o inc lu ye la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a en las p o s ic io n e s co m o se m e nc ion a a n te r io rm e n te o la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la c a d e n a lige ra en las p o s ic io n e s co m o se m e n c io n a a n te rio rm e n te .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , el a n ticu e rp o es a n ticu e rp o (a); m á s p re fe rib le m e n te , la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 13; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 13.
En o tro a sp e c to de la inve n c ió n , se p ro p o rc io n a un á c ido n u c le ico q u e co d ific a e l a n ticu e rp o co m o se d e sc rib e a n te rio rm e n te .
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un v e c to r de e xp re s ió n , q u e co m p re n d e e l á c id o n uc le ico . En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l v e c to r de e xp re s ió n es un v e c to r P H /D H F R .
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a u n a cé lu la h o sp e d a d o ra , q u e co m p re n d e e l v e c to r de e xp re s ió n o q ue tie n e e l á c ido n u c le ico in te g ra d o en su g e n o m a . En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , la c é lu la h o sp e d a d o ra es u n a c é lu la h o sp e d a d o ra e u c a r io ta o c é lu la h o sp e d a d o ra p ro ca rio ta ; p re fe rib le m e n te u n a c é lu la h o sp e d a d o ra e u ca rio ta , m ás p re fe rib le m e n te cé lu la de o va rio de h á m s te r ch in o (C H O ).
En o tro a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a e l u so de uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e s c rito s a n te r io rm e n te p a ra la fa b rica c ió n de un fá rm a co de d ire cc ió n , co n ju g a d o de fá rm a c o y a n ticu e rp o o a n ticu e rp o m u ltifu n c io n a l q ue a b o rd a e sp e c ífica m e n te cé lu la s tu m o ra le s q u e e xp re sa n E G F R vIIIe d o q ue s o b re e xp re sa n E G F R ; o un a g e n te p a ra el d ia g n ó s tico de tu m o re s q ue e xp re sa n E G F R vIII o s o b re e xp re sa n E G F R ; o se u sa p a ra p re p a ra r un in m u n o c ito m o d ifica d o con re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s ; p re fe rib le m e n te , el in m u n o c ito inc luye : lin fo c ito T, lin fo c ito N K o lin fo c ito NKT.
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, q u e co m p re n d e : uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te ; y u na m o lé cu la fu n c io n a l liga d a al m ism o (in c lu ye n d o ligada co va le n te m e n te , co n ju g a d a , f ija d a , a d so rb id a ); la m o lé cu la fu n c io n a l se se le cc io n a de un g ru p o q ue c o n s is te en una m o lé cu la q ue se d ir ig e a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie tu m o ra l, u n a m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l, u na m o lé cu la q u e se d ir ig e a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie de un in m u n o c ito o un m a rc a d o r d e te c ta b le .
En u n a re a liza c ió n p re fe rid a , la m o lé cu la q u e se d ir ig e al m a rc a d o r de su p e rfic ie tu m o ra l es un a n ticu e rp o o liga n do q u e se une a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie tu m o ra l; o la m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l es u n a c ito c in a a n titu m o ra l o una to x in a a n titu m o ra l; p re fe rib le m e n te , las c ito c in a s inc lu ye n , a u n q u e s in lim ita c ió n : IL-12, IL-15, IF N -be ta , T N F -a lfa .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , en e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, el m a rc a d o r d e te c ta b le inc lu ye un m a rca d o r f lu o re sc e n te y un m a rc a d o r c ro m o g é n ico .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , en el in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, la m o lé cu la q u e se d ir ig e al m a rc a d o r de sup e rfic ie d e l in m u n o c ito es un a n ticu e rp o o liga n do q u e se u ne a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie de in m u n o c ito ; p re fe rib le m e n te , los m a rca d o re s de s u p e rfic ie de in m u n o c ito s inc lu ye n , a u n q u e s in lim ita c ió n : C D 3, C D 16, C D 28.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , en el in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, la m o lé cu la q u e se d ir ig e al m a rc a d o r de sup e rfic ie d e l in m u n o c ito es un a n ticu e rp o q u e se une a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie de lin fo c ito s T, q u e p u e d e fo rm a r un a n ticu e rp o b ifu n c io n a l de a co p la m ie n to a lin fo c ito s T con u no c u a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te (a co p la d o r de lin fo c ito s T b ie sp e c ífico , B iTE ).
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , en e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, e l a n ticu e rp o q ue se une al m a rc a d o r de sup e rfic ie de in m u n o c ito es un a n ticu e rp o a n ti-C D 3. En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l a n ticu e rp o a n ti-C D 3 es un a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio (scFV ), un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l, un fra g m e n to Fab, un fra g m e n to Fd, un fra g m e n to Fv, un fra g m e n to F (a b ')2 y un a n ticu e rp o d e riva d o de los m ism o s ; p re fe rib le m e n te a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio . En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l a n ticu e rp o a n ti-C D 3 e s tá h u m a n iza d o , es co m p le ta m e n te h um a no , q u im é rico o m urino .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l es un p o lip é p tid o de fu s ió n y co m p re n d e a d e m á s un p é p tid o c o n e c to r (co n e c to r) e n tre uno cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te y la m o lé cu la fu n c io n a l u n id a al m ism o.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l p é p tid o c o n e c to r tie n e la s e cu e n c ia (G lyG lyG lyG lyS e r)n , en la q u e n es un n úm e ro e n te ro de 1 a 5; m ás p re fe rib le m e n te , n = 3.
De a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n , e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l se a d m in is tra en fo rm a de p o lip é p tid o o en m o do de a d m in is tra c ió n g én ica .
En o tro a sp e c to de la inve n c ió n , se p ro p o rc io n a un á c id o n u c le ico q u e co d ific a e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l. En o tro a sp ec to , se p ro p o rc io n a e l u so de uno cu a lq u ie ra de los in m u n o co n ju g a d o s m u ltifu n c io n a le s d e sc rito s a n te r io rm e n te de a cu e rd o con la inve nc ión , p a ra la p re p a ra c ió n de un a g e n te a n tin e o p lá s ico o un a g e n te p a ra el d ia g n ó s tico de tu m o re s q u e e xp re sa n E G F R vIII o so b re e xp re sa n E G F R ; o p a ra la p re p a ra c ió n de in m u n o c ito s m o d ifica d o s con re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s . P re fe rib le m e n te , los in m u n o c ito s inc lu ye n lin fo c ito T, lin fo c ito N K o lin fo c ito NKT.
En o tro a sp e c to , se p ro p o rc io n a un re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s q ue co m p re n d e u no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te de a cu e rd o con la inve nc ión , y e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s se e x p re sa sob re la s u p e rfic ie de un in m u n o c ito y c o m p re n d e : u no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te , u na reg ión tra n s m e m b ra n a r ia y u n a reg ión de señ a l in tra ce lu la r, q u e se u nen s e cu e n c ia lm e n te ; y la reg ión de señ a l in tra ce lu la r se s e le cc io n a de un g ru p o q ue c o n s is te en s e cu e n c ia s de re g ión de señ a l in tra c e lu la r de CD3Z, Fc sR Iy , C D 27 , C D 28, C D 137 y C D 134 , o u n a c o m b in a c ió n de las m ism as .
En u n a re a liza c ió n p re fe rid a , la re g ión tra n s m e m b ra n a r ia co m p re n d e u n a reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de C D 8 o C D 28. En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , los in m u n o c ito s inc lu ye n lin fo c ito T, lin fo c ito N K o lin fo c ito NKT.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e el s ig u ie n te a n ticu e rp o , reg ión tra n s m e m b ra n a r ia y reg ión de se ñ a l in tra c e lu la r u n id os s e cu e n c ia lm e n te :
U no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e s c rito s a n te rio rm e n te , C D 8 y CD3Z;
U no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e s c rito s a n te rio rm e n te , C D 8, C D 137 y CD3Z;
U no c u a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te , u n a re g ión tra n s m e m b ra n a r ia de u n a m o lé cu la C D 28, u n a re g ión de señ a l in tra c e lu la r de u n a m o lé cu la C D 28 y CD3Z; o
U no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te rio rm e n te , u n a re g ión tra n s m e m b ra n a r ia de u n a m o lé cu la C D 28 , u n a reg ión de señ a l in tra c e lu la r de u n a m o lé cu la C D 28 , C D 137 y CD3Z.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , el a n ticu e rp o es un a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio o un a n ticu e rp o de d om in io .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e :
S E Q ID N O : 36 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -601 ; o
S E Q ID N O : 37 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -702 ; o
S E Q ID N O : 38 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -744 ; o
S E Q ID N O : 39 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -749 ; o
S E Q ID N O : 40 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -791.
En o tro a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a un á c id o n u c le ico q u e co d ifica u no cu a lq u ie ra de los re ce p to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s d e sc rito s a n te rio rm e n te . De a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n , e l á c id o n uc le ico que c o d ific a e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e :
S E Q ID N O : 31 o la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s
Figure imgf000006_0001
966 -1916 ; o
Figure imgf000006_0002
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un v e c to r de e xp re s ió n q ue co m p re n d e el á c id o n uc le ico d e sc rito a n te rio rm e n te .
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l v e c to r de e xp re s ió n d e riva de l p lá sm id o len tiv ír ico p W P T (o p W P T -e G F P ).
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un v iru s q ue co m p re n d e e l v e c to r d e sc rito a n te rio rm e n te . Se p ro p o rc io n a e l uso de u no cu a lq u ie ra de los re ce p to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s o un á c id o n u c le ico co d ific a n te de los m ism o s de a cu e rd o con la inve nc ión , o un v e c to r de e xp re s ió n o v iru s q ue co m p re n d e e l á c id o n u c le ico de a cu e rdo con la inve nc ión , p a ra la p re p a ra c ió n de in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te q ue se d ir ig e n a c é lu la s tu m o ra le s q u e e xp re sa n E G F R vIII o so b re e xp re sa n EG FR.
En o tro a sp e c to de la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un in m u n o c ito m o d ifica d o g e n é tica m e n te , q ue se tra n sd u ce con el á c ido n uc le ico , o e l v e c to r de e xp re s ió n o e l v iru s ; o e xp re sa el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s en su sup e rfic ie de a cu e rd o con la inve nc ión .
En u n a re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o c ito p o rta a d e m á s u na s e cu e n c ia c o d ifica n te e xó g e n a de c ito c in a ; p re fe rib le m e n te , la c ito c in a inc lu ye : IL-12, IL -15 o IL-21.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s o tro re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o q u e no c o n tie n e CD3Z, p e ro c o n tie n e e l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C D 28 , e l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C D 137 , o u na co m b in a c ió n de am bos.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s un re c e p to r de q u im io c in a s ; p re fe rib le m e n te , e l re ce p to r de q u im io c in a s inc lu ye C C R 2.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s A R N ip q u e p u e d e re d u c ir la e xp re s ió n de PD-1 o una p ro te ín a q ue p ue de b lo q u e a r P D -L 1.
En o tra re a liza c ió n p re fe rid a , e l in m u n o c ito e x p re sa a d e m á s un c o n m u ta d o r de se g u rid a d ; p re fe rib le m e n te , el c o n m u ta d o r de se g u rid a d inc lu ye ica sp a sa -9 , E G F R tru n c a d o o R Q R 8.
En o tro a sp e c to de la inve n c ió n , se p ro p o rc io n a e l u so de d ich o s in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te de a cu e rdo con la in ve n c ió n p a ra la p re p a ra c ió n de un fá rm a co in h ib id o r de tu m o re s , y d ich o tu m o r es e l tu m o r q u e e xp re sa E G F R vIII o s o b re e x p re s a EG FR .
En o tro a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a u n a co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a (que inc lu ye m e d ica m e n to o re ac tivo de d ia g n ó s tico ), q ue co m p re n d e :
u no cu a lq u ie ra de los a n ticu e rp o s d e sc rito s a n te r io rm e n te o un á c id o n uc le ico q ue co d ific a e l a n ticu e rp o de a cu e rd o con la in ve n c ió n ; o
u no cu a lq u ie ra de los in m u n o co n ju g a d o s d e sc rito s a n te r io rm e n te o un á c id o n u c le ico q u e c o d ific a el co n ju g a d o de a cu e rd o con la inve nc ión ; o
u no cu a lq u ie ra de los re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s d e sc rito s a n te r io rm e n te o un á c id o n u c le ico que c o d ific a e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de a cu e rd o con la in ve n c ió n ; o
u no cu a lq u ie ra de los in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te d e sc rito s a n te r io rm e n te de a cu e rd o con la inve nc ión .
O tros a sp e c to s de la in ve n c ió n se rán e v id e n te s p a ra los e xp e rto s en la m a te ria en v is ta de la d ivu lg a c ió n de este d o cu m e n to .
D escripción de los dibujos
F ig u ra 1. A n ticu e rp o s 7B 3 e Y 022 p ue de n u n irse e sp e c ífica m e n te a a n tíg e n o s E G F R vIII y N 1 N 2 -806 (ensayo E L IS A de fag os ).
F ig u ra 2. C u rva de u n ión de a n ticu e rp o 7 B 3 fre n te al a n tíg e n o E G F R vIII.
F ig u ra 3. C u rva de u n ión de a n ticu e rp o Y 022 fre n te al a n tíg e n o E G F R vIII.
F ig u ra 4. E le c tro fe ro g ra m a de la p u rifica c ió n de tre s a n ticu e rp o s de fu s ió n scF v-F c .
F ig u ra 5. D e tecc ión de a n ticu e rp o s m o n o ca te n a rio s s cF v-Y 022 -F c , s cF v -806 -F c y scF v -C 225 -F c p o r su c a p a c id a d de u n irse a E G F R de su p e rfic ie c e lu la r p o r FAC S.
F ig u ra 6. D ia g ra m a e s tru c tu ra l de l v e c to r de e xp re s ió n p H -Y 022 /C D 3.
F ig u ra 7. D e tecc ión p o r S D S -P A G E de a n ticu e rp o s b ifu n c io n a le s m o n o ca te n a rio s Y 022 /C D 3 , 806 /C D 3 y C 225 /C D 3.
F ig u ra 8. D e tecc ión de a n ticu e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio Y 022 /C D 3 p o r su e sp e c ific id a d de u n ión a a n tíg e n o p o r FAC S.
F ig u ra 9. D ia g ra m a s de c ito to x ic id a d de a n ticu e rp o s b ifu n c io n a le s m o n o ca te n a rio s .
F ig u ra 10. Ilus tra c ió n e s q u e m á tic a de l o rde n de lig a m ie n to de d ive rsa s p a rte s d e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s.
M odos para realizar la invención
D e sp u é s de in ve s tig a c ió n y c rib a d o in te ns ivos , los a u to re s de la p re se n te inve nc ión o b tu v ie ro n un a n ticu e rp o que re co n o ce e sp e c ífica m e n te E G F R vIII o E G F R so b re e xp re sa d o en c é lu la s tu m o ra le s y re co n o ce e sc a sa m e n te E G FR en c é lu la s n o rm a le s . El a n ticu e rp o de la p re se n te inve n c ió n p ue de u sa rse p a ra p re p a ra r d ive rso s fá rm a co s a n titu m o ra le s de d ire cc ió n y fá rm a c o s p a ra e l d ia g n ó s tico de tu m o re s .
A nticuerpo anti-EG FR
Los a u to re s de la p re se n te in ve n c ió n re a liza ro n a d e m á s c rib a d o y m u ta c io n e s a m in o a c íd ica s b a sa d a s en los a n ticu e rp o s h u m a n iz a d o s o b te n id o s en la fa s e p rev ia , y e n co n tra ro n un a n ticu e rp o a n ti-E G F R q u e p ue de a b o rd a r E G F R de cé lu la s tu m o ra le s con m a yo r e sp e c ific id a d , q ue se u ne s e le c tiva m e n te a un tu m o r q u e s o b re e xp re sa E G FR o E G F R vIII, m ie n tra s q ue no se u ne a E G F R en c é lu la s n orm a le s .
Los a n ticu e rp o s de la inve n c ió n p u e d e n s e r m o lé cu la s de in m u n o g lo b u lin a in ta c ta s o fra g m e n to s de un ión a a n tíge no in c lu ye n d o , a u n q u e s in lim itac ió n , fra g m e n to s Fab, fra g m e n to s Fd, fra g m e n to s Fv, fra g m e n to s F (a b ')2, fra g m e n to s de la reg ión d e te rm in a n te de la co m p le m e n ta rie d a d (C D R ), a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio (scFv), a n ticu e rp o de d om in io , a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio b iva le n te , a n ticu e rp o fá g ic o m o n o ca te n a rio , d ia cu e rp o b ie sp e c ífico , a n ticu e rp o trica te n a rio , a n ticu e rp o te tra ca te n a rio .
Las p ro p ie d a d e s de u n ión a a n tíg e n o de un a n ticu e rp o p ue de n d e sc rib irse m e d ia n te tre s re g io ne s e sp e c ífica s u b ica d a s en re g io n e s va r ia b le s de las c a d e n a s p e sa d a s y lige ras , d e n o m in a d a s re g io n e s d e te rm in a n te s de la co m p le m e n ta rie d a d (C D R ), q ue d iv id e n las re g io n e s va r ia b le s en cu a tro re g io n e s f la n q u e a n te s (FR ), y las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s de cu a tro f R son re la tiva m e n te co n se rva tiva s , no d ire c ta m e n te im p lica d a s en la re acc ión de un ión. E s tas C D R fo rm a n u na e s tru c tu ra de buc le , en q u e los p lie g u e s p fo rm a d o s p o r las FR e s tá n u b ica d o s c e rca e n tre sí en e l e sp a c io y e l s itio de un ión a a n tíg e n o de l a n ticu e rp o e s tá co n s titu id o p o r las C D R en la c a d e n a p e sa d a y las C D R en la ca d e n a lige ra c o rre sp o n d ie n te . Es p o s ib le d e te rm in a r los a m in o á c id o s q u e co m p o n e n las re g io n e s FR o C D R co m p a ra n d o las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s de l m ism o tip o de a n ticu e rp o . Las re g io n e s C D R son s e cu e n c ia s de p ro te ín a s de in te rés in m u n o ló g ico y las re g io n e s C D R de los a n ticu e rp o s de la in ve n c ió n son co m p le ta m e n te n o ve d o sa s . El a n ticu e rp o p u e d e c o m p re n d e r dos, tre s , cua tro , c in co o las se is re g io n e s C D R d iv u lg a d a s en e ste d o cu m e n to .
O tro a sp e c to de la d ivu lg a c ió n inc lu ye va r ia n te s fu n c io n a le s de los a n ticu e rp o s d e sc rito s en e s te d o cu m e n to . Si la v a r ia n te p u e d e c o m p e tir con e l a n ticu e rp o o rig in a l p o r la u n ión e sp e c ífica a S E Q ID N O : 1 y su ca p a c id a d de re co n o ce r E G F R vIII o E G F R so b re e xp re sa d o en c é lu la s tu m o ra le s es c e rca n a a la de los a n ticu e rp o s e sp e c ífico s p ro p o rc io n a d o s en los e je m p lo s de la p re se n te d ivu lg a c ió n . Las va r ia n te s fu n c io n a le s p ue de n te n e r m o d ifica c io n e s co n s e rv a tiv a s de la se cu e n c ia , in c lu ye n d o su s titu c io n e s , a d ic io n e s y e lim in a c io n e s de n u c le ó tid o s y a m in o á c id o s . E s tas m o d ifica c io n e s p u e d e n in tro d u c irse m e d ia n te té c n ica s co n v e n c io n a le s c o n o c id a s en la té cn ica , ta le s co m o m u ta g é n e s is d ir ig id a y m u ta g é n e s is a le a to ria m e d ia d a p o r PC R, y p ue de n in c lu ir n u c le ó tid o s y a m in o á c id o s ta n to n a tu ra le s co m o no na tu ra les . P re fe rib le m e n te , la m o d ifica c ió n de la s e c u e n c ia se p ro d u ce en u na reg ión fu e ra de la reg ión C D R d e l a n ticue rp o .
Inm unoconjugado
En la p re se n te inve nc ión , ta m b ié n se p ro p o rc io n a un in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, q u e co m p re n d e los a n ticu e rp o s de a cu e rd o con la inve nc ión d e s c rita en e s te d o c u m e n to y q u e co m p re n d e a d e m á s al m e no s u na m o lé cu la fu n c io n a l de o tro tip o . La m o lé cu la fu n c io n a l se se le cc io n a de, a u n q u e sin lim itac ió n , u na m o lé cu la q u e se d ir ig e a un m a rca d o r de su p e rfic ie tu m o ra l, u na m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l, u n a m o lé cu la q ue se d ir ig e a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie de un in m u n o c ito , o un m a rc a d o r d e te c ta b le . El a n ticu e rp o y la m o lé cu la fu n c io n a l p u e d e n fo rm a r un co n ju g a d o p o r fijac ión co va le n te , a co p la m ie n to , f ija c ió n , re ticu lac ió n o s im ila res .
C o m o m o do p re fe rid o , el in m u n o co n ju g a d o p u e d e c o m p re n d e r un a n ticu e rp o de la inve nc ión y al m e no s u n a m o lécu la q u e se d ir ig e a un m a rc a d o r de su p e rfic ie tu m o ra l o u na m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l. La m o lé cu la de sup re s ió n tu m o ra l p ue de s e r c ito c in a s a n titu m o ra le s o to x in a s a n titu m o ra le s . P re fe rib le m e n te , las c ito c in a s inc lu ye n , a u n q u e sin lim ita c ió n IL-12, IL-15, IF N -be ta , T N F -a lfa . Las m o lé cu la s q ue se d ir ig e n a m a rca d o re s de su p e rfic ie tu m o ra l, p o r e je m p lo , p u e d e n a c tu a r s in é rg ica m e n te con los a n ticu e rp o s de la inve nc ión p a ra a b o rd a r de fo rm a m ás p re c isa las c é lu la s tu m o ra le s .
C o m o m o do p re fe rid o , e l in m u n o co n ju g a d o p u e d e c o m p re n d e r un a n ticu e rp o de la p re se n te inve nc ión y un m a rca d o r d e te c ta b le . D ichos m a rca d o re s d e te c ta b le s inc lu ye n , a u n q u e sin lim ita c ió n , m a rca d o re s flu o re sce n te s , m a rca d o re s c ro m o g é n ic o s ta le s co m o e n z im a s , g ru p o s p ro s té tico s , m a te ria le s flu o re sce n te s , m a te ria le s lu m in isce n te s , m a te ria le s b io lu m in isce n te s , m a te ria le s ra d ia c tivo s , m e ta le s e m iso re s de p o s itro n e s e iones m e tá lico s p a ra m a g n é tico s no ra d ia c tivo s . T a m b ié n p ue de in c lu irse m ás de un m a rcad o r. De a cu e rd o con la p re se n te d ivu lg a c ió n , el m a rc a d o r se u sa p a ra m a rca r e l a n ticu e rp o con fin e s de d e te cc ió n y /o a n á lis is y /o d ia g n ó s tico y d e p e n d e de la té c n ica y /o m é to do de d e te c c ió n /a n á lis is /d ia g n ó s tic o p a rtic u la r u sa do , p o r e je m p lo , m u e s tra s de tin c ió n in m u n o h is to q u ím ica (te jido ), c ito m e tría de flu jo y s im ila re s . Los m a rca d o re s a d e cu a d o s p ara té c n ica s y /o m é to d o s de d e te c c ió n /a n á lis is /d ia g n ó s tic o co n o c id o s en la té c n ica son b ien c o n o c id o s p o r los e xp e rto s en la m a te ria .
C o m o m o do p re fe rid o , e l in m u n o co n ju g a d o p u e d e c o m p re n d e r un a n ticu e rp o de la inve nc ión , a s í co m o u n a m o lé cu la q u e se d ir ige a un m a rc a d o r de su p e rfic ie de un inm un oc ito . La m o lé cu la q ue se d ir ig e a m a rca d o re s de s u p e rfic ie de in m u n o c ito s p u e d e re co n o ce r in m u n o c ito s y tra n s p o rta r los a n ticu e rp o s de la inve n c ió n a los in m u n o c ito s , de m o do q u e los a n ticu e rp o s de la inve n c ió n p ue da n d ir ig ir los in m u n o c ito s a las c é lu la s tu m o ra le s y, p o r ta n to , a c tiven los in m u n o c ito s p a ra d e s tru ir e sp e c ífica m e n te el tum o r.
C o m o m e d io de g e n e ra c ió n q u ím ica de un in m u n o co n ju g a d o p o r c o n ju g a c ió n , d ire c ta o in d ire c ta m e n te (p o r e je m p lo , m e d ia n te un co n e c to r), e l in m u n o co n ju g a d o p ue de p ro d u c irse co m o u na p ro te ín a de fu s ió n q u e co m p re n d e un a n ticu e rp o de la inve nc ión y o tra s p ro te ín a s a d e cu a d a s . La p ro te ín a de fu s ió n p ue de p ro d u c irse m e d ia n te un m é todo co n o c id o en la té cn ica , p o r e je m p lo , p ro d u c irse de fo rm a re co m b in a n te co n s tru y e n d o y p o s te rio rm e n te e xp re sa n d o la m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q u e c o d ific a e l a n ticu e rp o en el m ism o m arco con u n a se c u e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ific a un m a rc a d o r a d e cu a d o .
En o tro a sp e c to de la inve nc ión , se p ro p o rc io n a u n a m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue c o d ific a al m e no s un a n ticue rp o de la inve nc ión , u na va r ia n te fu n c io n a l o un in m u n o co n ju g a d o d e l m ism o. U na v e z se o b tie n e la se cu e n c ia p e rtin e n te , p u e d e u sa rse e l m é to do de re co m b in a c ió n p a ra o b te n e r la se cu e n c ia p e rtin e n te en g ra n d e s ca n tid a d e s . Esto se hace h a b itu a lm e n te c lo n á n d o la en un ve c to r, tra n s fir ié n d o la a u n a c é lu la y d e sp u é s a is la n d o la se cu e n c ia p e rtin e n te d e sd e las c é lu la s h o sp e d a d o ra s en p ro life ra c ió n p o r m é to d o s co n ve n c io n a le s .
La p re se n te inve nc ión ta m b ié n se re fie re a v e c to re s q u e co m p re n d e n las s e cu e n c ia s de A D N a p ro p ia d a s d e sc rita s a n te r io rm e n te de a cu e rd o con la inve nc ión , a s í co m o p ro m o to re s o se cu e n c ia s de co n tro l a p ro p ia d a s . E s tos v e c to re s p u e d e n u sa rse p a ra tra n s fo rm a r u n a c é lu la h o sp e d a d o ra a p ro p ia d a p a ra p o s ib ilita r la e xp re s ió n de la p ro te ína . La c é lu la h o sp e d a d o ra p u e d e s e r u n a c é lu la p ro ca rio ta , ta l co m o u n a c é lu la b a c te ria n a ; o u n a cé lu la e u c a rio ta in fe rio r, ta l co m o u na c é lu la de leva d u ra ; o u n a c é lu la e u c a rio ta su p e rio r, ta l co m o u n a c é lu la de m a m ífe ro .
R eceptor qu im érico de an tígenos e inm unocito m odificado genéticam ente
En la p re se n te inve nc ión , se p ro p o rc io n a un re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s e xp re sa d o en la s u p e rfic ie de u n a cé lu la e fe c to ra in m u n ita ria (in m u n o c ito ), en e l q u e e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e s e c u e n c ia lm e n te liga d os : re g ión de u n ión e x tra ce lu la r, re g ión tra n s m e m b ra n a r ia y re g ión de señ a l in tra ce lu la r, y la re g ión de u n ión e x tra c e lu la r co m p re n d e el a n ticu e rp o de la inve nc ión . A l e xp re s a r el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s en la su p e rfic ie de cé lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s , las c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s p u e d e n te n e r un e fe c to c ito tó x ico a lta m e n te e sp e c ífico sob re las c é lu la s tu m o ra le s q ue e xp re sa n E G F R vIII o so b re e xp re sa n EG FR.
C o m o se usa en e s te d o cu m e n to , " in m u n o c ito s " y "cé lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s " se usa n in d is tin ta m e n te e inc lu ye n : lin fo c ito s T, lin fo c ito s N K o lin fo c ito s N KT, y s im ila res .
C o m o u na re a liza c ió n p re fe rid a de la p re se n te inve nc ión , e l a n ticu e rp o co n te n id o en el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s es un a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio , q u e e s tá co n e c ta d o a C D 8 o la re g ión tra n s m e m b ra n a r ia de C D 28 a tra vé s de la re g ión de b isa g ra de C D 8, y la re g ión tra n s m e m b ra n a r ia e s tá se g u id a in m e d ia ta m e n te de la re g ión de se ñ a l in trace lu la r.
La inve n c ió n ta m b ié n inc lu ye á c id o s n u c le ico s q ue co d ifica n los re ce p to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s . La p rese n te d ivu lg a c ió n ta m b ié n se re fie re a v a r ia n te s de los p o lin u c le ó tid o s d e s c rito s a n te r io rm e n te , q ue c o d ifica n un p o lip ép tid o , o un fra g m e n to , a n á lo g o y d e riva d o de l p o lip é p tid o q ue tie n e la m ism a se cu e n c ia de a m in o á c id o s q ue la p re se n te inve nc ión .
La re g ión tra n s m e m b ra n a r ia de l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s p ue de s e le cc io n a rse de la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de u na p ro te ín a ta l co m o C D 8 o C D 28. La p ro te ín a C D 8 h u m a n a es un h e te ro d ím e ro c o m p u e s to de d o s ca d e n a s , ap o yS. En u n a re a liza c ió n de la inve nc ión , la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia se s e le cc io n a de la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de C D 8 a o C D 28. A d e m á s, la b isa g ra C D 8 a es u n a reg ión f le x ib le de m o do q u e C D 8 o C D 28 y la reg ión tra n sm e m b ra n a ria , a s í co m o la re g ión de b isa g ra se u san p a ra c o n e c ta r e l d o m in io de re co n o c im ie n to de d ia n a scF v de l re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s C A R a la reg ión de señ a l in trace lu la r.
La reg ión de señ a l in tra c e lu la r p u e d e s e le cc io n a rse de un g ru p o q ue co n s is te en la reg ión de se ñ a l in tra c e lu la r de CD3Z, FcsR Iy , C D 28 , C D 137 , p ro te ín a C D 134 y c o m b in a c io n e s de las m ism as . La m o lé cu la C D 3 c o n s is te en c inco su b u n id a d e s , en q u e la su b u n id a d CD3Z (ta m b ié n c o n o c id a co m o C D 3 ze ta , a b re v ia d a co m o Z) c o n tie n e 3 m o tivos ITA M q u e son re g io n e s im p o rta n te s de tra n sd u cc ió n de se ñ a le s en el co m p le jo de T C R -C D 3. C D 35 Z es u na se cu e n c ia CD3Z tru n c a d a sin m o tivo ITAM y en g e n e ra l se c o n s tru ye en la p re se n te inve n c ió n co m o co n tro l n eg a tivo . Fc s R Iy se d is tr ib u ye p rin c ip a lm e n te en la su p e rfic ie de m a s to c ito s y b asó filo s , q ue c o n tie n e un m o tivo ITAM , q u e es s im ila r a CD3Z en e s tru c tu ra , d is trib u c ió n y fu n c ió n . A d e m á s, co m o se m e n c io n a a n te r io rm e n te , C D 28 , C D 137 y C D 134 son m o lé cu la s de se ñ a liza c ió n c o e s tim u la d o ra s . El e fe c to c o e s tim u la d o r de sus s e g m e n to s de se ñ a liza c ió n in tra ce lu la r tra s la u n ión a los re sp e c tivo s liga n do s p ro vo ca la p ro life ra c ió n c o n tin u a d a de c é lu la s e fe c to ra s inm un ita ria s , p rin c ip a lm e n te lin fo c ito s T, y a u m e n ta el n ive l de c ito c in a s ta le s co m o IL-2 e IF N -y se c re ta d a s p o r c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s , y e l p e rio d o de su p e rv iv e n c ia y e l e fe c to a n titu m o ra l de c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s C A R in vivo se a um e n ta n .
El re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la p re se n te inve n c ió n p u e d e liga rse s e c u e n c ia lm e n te co m o s igu e :
El a n ticu e rp o de la inve nc ión , C D 8 y CD3Z;
El a n ticu e rp o de la inve nc ión , C D 8, C D 137 y CD3Z;
El a n ticu e rp o de la inve nc ión , la re g ión tra n s m e m b ra n a r ia de la m o lé cu la C D 28 , la reg ión de se ñ a l in tra ce lu la r de la m o lé cu la C D 28 y CD3Z; o
Los a n ticu e rp o s de la inve nc ión , la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de la m o lé cu la C D 28, la re g ión de seña l in tra c e lu la r de la m o lé cu la C D 28 , C D 137 y CD3Z.
Y c o m b in a c io n e s de los m ism os , en los q u e C D 28 a en la p ro te ín a de re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s p e rtin e n te re p re se n ta la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de la m o lé cu la C D 28 y C D 28 b re p re se n ta la reg ión de señ a l in tra c e lu la r de la m o lé cu la C D 28. Los d ive rso s re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s d e sc rito s a n te r io rm e n te se d e n o m in a n co le c tiv a m e n te scF v (E G F R )-C A R .
La p re se n te inve n c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a un v e c to r q u e co m p re n d e e l á c id o n u c le ico de a cu e rd o con la inve nc ión q u e co d ific a u na p ro te ín a de re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s e xp re sa d a en la su p e rfic ie de u na cé lu la e fe c to ra in m u n ita ria . En u na re a liza c ió n e sp e c ífica , el v e c to r u sa d o en la p re se n te in ve n c ió n es un v e c to r p la sm íd ico len tiv ír ico p W P T -e G F P . Este p lá sm id o p e rte n e ce a la te rce ra g e n e ra c ió n de s is te m a de v e c to r le n tiv ír ico a u to in a c tiva d o r. El s is te m a tie n e tre s p lá sm id o s , e l p lá sm id o de e m p a q u e ta d o p sP A X 2 q u e co d ific a la p ro te ín a G a g /P o l, q u e c o d ific a la p ro te ín a R ev; e l p lá sm id o de e n v u e lta P M D 2.G q ue c o d ific a la p ro te ín a V S V -G ; y e l v e c to r va c ío p W P T -e G F P , q ue p u e d e u sa rse p a ra la in tro d u cc ió n re co m b in a n te de u n a se c u e n c ia de á c id o n u c le ico de in te ré s , es d ec ir, un ácido n u c le ico q ue co d ifica C A R . En el v e c to r v a c ío p W P T -e G F P , la e xp re s ió n de p ro te ín a flu o re sc e n te v e rd e p o te n c ia d a (e G F P ) se re gu la m e d ia n te e l p ro m o to r d e l fa c to r- la de e lo n g a c ió n (E F -1a ). M ie n tra s e s tá en e l v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te p W P T -e G F P -F 2 A -C A R q u e c o n tie n e la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ific a C A R , la c o e xp re s ió n de e G F P y C A R se c o n s ig u e p o r sa lto rib o só m ico de la se cu e n c ia 2A (a b re v ia d a co m o F2A) d e l v iru s de la fieb re a fto sa (F M D V ).
La inve nc ión ta m b ié n inc lu ye v iru s q ue co m p re n d e n los v e c to re s de a cu e rd o con la inve nc ión . Los v iru s de la inve nc ión inc lu ye n v iru s in fe cc io so s e m p a q u e ta d o s , a s í co m o v iru s a e m p a q u e ta r q u e co n tie n e n los c o m p o n e n te s n ecesa rios p a ra e m p a q u e ta d o en v iru s in fe cc io so s . O tro s v iru s c o n o c id o s en la té c n ica q u e p u e d e n u sa rse p a ra tra n s d u c ir g en es e xó g e n o s en c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s y sus c o rre sp o n d ie n te s v e c to re s p la sm íd ico s ta m b ié n sin ú tile s en la p re se n te inve nc ión .
La p re se n te inve n c ió n inc lu ye a d e m á s un lin fo c ito T m o d ifica d o g e n é tica m e n te , q ue se tra n sd u ce con un á c id o n uc le ico de la p re se n te inve nc ión o se tra n s d u c e con el p lá sm id o re co m b in a n te m e n c io n a d o a n te r io rm e n te q ue c o n tie n e el á c id o n uc le ico de la p re se n te inve n c ió n o un s is te m a v ír ico q u e c o n tie n e el p lá sm id o . P ue d en u sa rse m é to d o s de tra n s d u c c ió n co n v e n c io n a le s de á c id o s n uc le ico s en la té cn ica , in c lu ye n d o m é to d o s de tra n s d u c c ió n a v írico s y v ír icos , en la p re se n te inve nc ión . Los m é to d o s de tra n s d u c c ió n a v írico s inc lu ye n m é to d o s de e le c tro p o ra c ió n y tra n sp o só n . R e c ie n te m e n te , e l in s tru m e n to de tra n s fe cc ió n n u c le a r N u c le o fe c to r d e sa rro lla d o p o r A m a xa p u e d e in tro d u c ir d ire c ta m e n te g e n e s e xó g e n o s en e l n úc leo p a ra c o n s e g u ir u na tra n s d u c c ió n a lta m e n te e fica z de g e n e s d ia n a . A de m á s, en c o m p a ra c ió n con la e le c tro p o ra c ió n co n ve n c io n a l, la e fic a c ia de tra n s d u c c ió n d e l s is te m a de tra n s p o s ó n b a sa d o en el s is te m a S le e p in g B e a u ty o e l tra n s p o s ó n P igg yB ac se m e jo ró s ig n ifica tiva m e n te . Se ha in fo rm a d o de la c o m b in a c ió n d e l in s tru m e n to de tra n s fe cc ió n N u c le o fe c to r y e l s is te m a de tra n sp o só n S B S le e p in g B e a u ty [D a v ie s JK ., et al. C o m b in in g C D 19 re d ire c tio n and a llo a n e rg iza tio n to g e n e ra te tu m o r-sp e c ific hum an T ce lls fo r a llo g e n e ic ce ll th e ra p y o f B -ce ll m a lig n a n c ie s . C a n ce r Res, 2010 , 70 (10 ): O F 1 -10.], y p u e d e c o n s e g u ir a lta e fic a c ia de tra n sd u cc ió n e in te g rac ión d ir ig id a al s itio de g e n e s d ia n a p o r e s te m é to do . En u n a re a liza c ió n de la inve nc ión , e l m é to do de tra n s d u c c ió n de un lin fo c ito T m o d ifica d o p o r un gen de re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s es un m é to d o de tra n sd u cc ió n b a sa d o en un v iru s ta l co m o un re tro v iru s o un len tiv irus . El m é to do tie n e las ve n ta ja s de a lta e fic a c ia de tra n sd u cc ió n y e xp re s ió n e s ta b le de g en e xó g e n o , y e l t ie m p o p a ra cu ltivo in vitro de lin fo c ito s T h as ta n ive l c lín ico p u e d e a co rta rse . El á c id o n u c le ico tra n s d u c id o se e xp re sa sob re la su p e rfic ie de los lin fo c ito s T tra n s g é n ico s p o r tra n sc rip c ió n , tra d u cc ió n . El e n sa yo de c ito to x ic id a d in vitro re a liza d o en d ive rsa s c é lu la s tu m o ra le s c u ltiva d a s d e m o s tró q ue las c é lu la s e fe c to ra s in m u n ita ria s de la p re se n te inve n c ió n tie n e n e fe c to s de d e s tru cc ió n de c é lu la s tu m o ra le s a lta m en te e sp e c ífico s (ta m b ié n c o n o c id o s co m o c ito to x ic id a d ). P o r lo ta n to , e l á c id o n u c le ico q ue co d ific a u n a p ro te ín a de re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la p re se n te inve nc ión , un p lá sm id o q ue co m p re n d e el á c id o n uc le ico , un v iru s q ue co m p re n d e el p lá sm id o , y u n a cé lu la e fe c to ra in m u n ita ria tra n s g é n ica tra n s fe c ta d a con el á c id o n uc le ico , p lá sm id o o v iru s d e sc rito a n te r io rm e n te p ue de u sa rse de m a n e ra e fica z en in m u n o te ra p ia tu m o ra l.
Los in m u n o c ito s de la p re se n te inve nc ión ta m b ié n p ue de n p o rta r s e cu e n c ia s co d ifica n te s e xó g e n a s de c ito c in a s inc lu ye nd o , a u n q u e sin lim ita c ió n , IL-12, IL-15 o IL-21. E s tas c ito c in a s tie n e n a c tiv id a d in m u n o m o d u la d o ra o a n titu m o ra l, p o te n c ia n la fu n c ió n de los lin fo c ito s T e fe c to re s y los lin fo c ito s N K a c tiva d o s , o e je rce n d ire c ta m e n te e fe c to s a n titu m o ra le s . P o r lo tan to , los e xp e rto s en la m a te ria e n te n d e rá n q ue el uso de e s ta s c ito c in a s a yu d a rá a los in m u n o c ito s a fu n c io n a r m ejor.
A d e m á s de l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s d e sc rito a n te r io rm e n te , los in m u n o c ito s de la p re se n te inve n c ió n ta m b ié n p ue de n e xp re s a r o tro re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s, q ue no c o n tie n e CD3Z, p e ro c o n tie n e e l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C D 28 y e l d o m in io de se ñ a l in tra c e lu la r de C D 137, o u n a c o m b in a c ió n de a m bo s.
Los in m u n o c ito s de la p re se n te inve nc ión ta m b ié n p ue de n e xp re s a r re ce p to re s de q u im io c in a s ; los re ce p to re s de q u im io c in a s inc lu ye n , a u n q u e s in lim ita c ió n , C C R 2. Un e xp e rto en la m a te ria e n te n d e rá q ue el re ce p to r de q u im io c in a s C C R 2 p u e d e u n irse de fo rm a c o m p e tit iv a a C C R 2 en el o rg a n ism o y es b e n e fic io so p a ra b lo q u e a r la m e tá s ta s is del tu m o r.
Los in m u n o c ito s de la p re se n te inve n c ió n ta m b ié n p u e d e n e xp re sa r A R N ip q ue p ue de n re d u c ir la e xp re s ió n de PD-1 o las p ro te ín a s de b lo q u e o de P D -L 1. Un e xp e rto en la m a te ria e n te n d e rá q ue el b lo q u e o co m p e tit iv o de la in te ra cc ió n e n tre PD-L1 y su re c e p to r PD-1 fa c ilita rá la re cu p e ra c ió n de re sp u e s ta s de lin fo c ito s T a n titu m o ra le s , in h ib ie n d o de e se m o do el c re c im ie n to tu m o ra l.
Los in m u n o c ito s de la p re se n te inve n c ió n ta m b ié n p ue de n e xp re sa r un c o n m u ta d o r de se g u rid a d ; p re fe rib le m e n te , el c o n m u ta d o r de se g u rid a d inc lu ye ica sp a sa -9 , E G F R tru n c a d o o R Q R 8.
C om posición farm acéutica
Los a n ticu e rp o s , in m u n o co n ju g a d o s q ue co m p re n d e n los a n ticu e rp o s e in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te de la p re se n te inve n c ió n p ue de n u sa rse en la p re p a ra c ió n de u na co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a o re a c tivo de d ia g n ó s tico . A d e m á s de u n a ca n tid a d e fica z de l a n ticu e rp o , c o n ju g a d o in m u n o ló g ico o inm un oc ito , la co m p o s ic ió n p uede c o m p re n d e r a d e m á s un v e h ícu lo fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le . La e xp re s ió n "fa rm a cé u tica m e n te a ce p ta b le " s ig n ifica q ue cu a n d o las e n tid a d e s m o le cu la re s y c o m p o s ic io n e s se a d m in is tra n a p ro p ia d a m e n te a a n im a le s o se res hum a no s , no p ro vo ca n re a cc io n e s a d ve rsa s , a lé rg ica s u o tra s re a cc io n e s ina p rop ia da s.
E je m p lo s e sp e c ífico s de a lg u n a s de las su s ta n c ia s q u e p ue de n u sa rse co m o ve h ícu lo s fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le s o co m p o n e n te s de los m ism os son g lú c id o s , ta le s c o m o lac tosa , d e x tro sa y sa ca ro sa ; a lm id o n e s , ta le s co m o a lm idó n de m a íz y a lm id ó n de pa ta ta ; ce lu lo s a y sus d e riva d o s , ta le s co m o c a rb o x im e tilce lu lo s a sód ica , e tilc e lu lo s a y m e tilce lu lo sa ; g o m a de tra g a ca n to ; m a lta ; g e la tin a ; ta lco ; lu b rica n te s só lid o s ta le s co m o á c id o e s te á rico y e s te a ra to de m a g n e s io ; su lfa to de c a lc io ; a ce ite s v e g e ta le s , ta le s co m o a ce ite de c a ca h u e te , a ce ite de s e m illa de a lg o d ó n , ace ite de sésa m o, a ce ite de o liva , a ce ite de m a íz y m a n te ca de ca ca o ; a lco h o le s p o lih íd rico s ta le s co m o p ro p ile n g lico l, g lice rin a , so rb ito l, m a n ito l y p o lie tile n g lico l; á c id o a lg ín ico ; e m u ls io n a n te s ta le s co m o T w e e n ® ; a g e n te s h u m e cta n te s ta le s co m o lau ril su lfa to de so d io ; a g e n te s co lo ra n te s ; a g e n te s a ro m a tiza n te s ; e s ta b iliz a n te s d e c o m p rim id o s ; a n tio x id a n te s ; co n s e rv a n te s ; a g u a a p iró g e n a ; s o lu c io n e s sa lin a s iso tó n ica s ; y ta m p o n e s fo s fa to y s im ila re s .
La c o m p o s ic ió n de la p re se n te inve n c ió n p u e d e p re p a ra rse en d iv e rs a s fo rm a s fa rm a cé u tica s según lo n e ce sa rio , y la d o s ifica c ió n a a d m in is tra r a un p a c ie n te p u e d e d e te rm in a rse p o r un m é d ico de a cu e rd o con fa c to re s , ta le s co m o tipo , edad , p e so co rp o ra l y e s ta do p a to ló g ico g e n e ra l d e un p ac ie n te , m o do d e a d m in is tra c ió n y s im ila res . P or e je m p lo , p ue de u sa rse inye cc ió n u o tro tra ta m ie n to .
La p re se n te in ve n c ió n se d e sc rib e a d ic io n a lm e n te a co n tin u a c ió n con re fe re n c ia a re a liza c io n e s e sp e c ífica s . D ebe e n te n d e rse q u e e s to s e je m p lo s son ú n ica m e n te p a ra ilu s tra r la p re se n te in ve n c ió n y no están d e s tin a d o s a lim ita r el a lca n ce de la p re se n te inve nc ión . Se re a liza n p ro ce d im ie n to s e xp e rim e n ta le s en los s ig u ie n te s e je m p lo s d o n d e no se ind ican co n d ic io n e s e sp e c ífica s de a cu e rd o con las c o n d ic io n e s d e sc rita s en las co n d ic io n e s h a b itu a le s ta le s com o las co m p ila d a s p o r J. S a m b ro o k etal., M o le cu la r C lo n in g E xp e rim e n ts G u ide , te rce ra ed ic ión , S c ie n ce P ress, 2002 , o de a cu e rd o con las c o n d ic io n e s su g e rid a s de l fa b rica n te .
Ejem plo 1. C onstrucción de colección m adurada por afin idad de anticuerpo m onocatenario 7B3
El a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B 3 es un fra g m e n to de a n ticu e rp o h u m a n iza d o q u e re co n o ce e sp e c ífica m e n te un e p íto p o c ríp tico (287C G A D S Y E M E E D G V R K C 302 (S E Q ID N O : 1)) fo rm a d o a p a rtir de la se c u e n c ia de a m in o á c id o s de las p o s ic io n e s 287 -302 de E G F R e xp u e s ta s en cé lu la s tu m o ra le s . Las s e cu e n c ia s de n u c le ó tid o s d e los g e n e s de V L y V H se o b tu v ie ro n d e las s e cu e n c ia s S E Q ID N O : 14 y S E Q ID N O : 13 co m o se m u e s tra en la so lic itu d de p a ten te CN 103382223 A y se liga ro n en el o rde n de V L 7 B 3 -co n e c to r-V H 7 B 3.
S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s (717 p a re s de bases , S E Q ID N O : 2) de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B 3:
GAT A TT CAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GTGACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACAGCAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT A T CAT GGCAAAAACCT GGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTT AGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTT ACCCT GACCATTAGCAGCCT GCAGCCG GAAGATTTT GCGACCTATT A TT GCGTT CAGT ACGCCCAGTT CCCAT AT AC A TTT GGCCAG GGCACCAAAGTGGAAATTAAACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGA TCGGKIGT GCAGCT GGTGGAAAGCGGCGGCGGCCT GGT GCAGCCGGGCGGCAGC CT GCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATT AT GCGT GGAACT GG ATTCGT CAGGCGCCGGGCAAAGGCCT GGAAT GGCT GGGCT A T ATTAGCT ATCGT GGCCGC ACCAGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT A TT AGCATT ACCCGTGAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCT GCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT ATT A T T GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCT ACT GGGGCCAGGGCACCCT GGT GACCGT GAGCAGC
La se c u e n c ia de a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7 B 3 (239 a m in o á c id o s , S E Q ID N O : 3; la zo n a s u b ra ya d a e ra 7 B 3 V L C D R 1, C D R 2, C D R 3, 7 B 3 V H C D R 1, C D R 2, C D R 3, re sp e c tiva m e n te ):
D IQ M TQ SPSSLSA SVG DR VTITC HA SQ DIN SN IG W LQQKPGKAFKGLIYHGKNLEDGVPSR FSG SG SG TDFTLTISSLQ P EDFATYYCVQYAQFPYTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAWNW IRQAPGKGLEWLGY IS YRG R TSYN PSLK SR ISITR D N S K N TFFLQ LN S LR A ED TA VY Y C A R LGRGFRYWGQGTLVTVSS
P ara p o te n c ia r la ca p a c id a d de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B 3 de u n irse a E G F R , a lg u n o s a m in o á c id o s en C D R 3 de la c a d e n a lig e ra y C D R 3 de la c a d e n a p e s a d a se m u ta ro n a le a to ria m e n te y se c o n s tru ye ro n c o le cc io n e s m a du ra s c o rre sp o n d ie n te s .
1. C onstrucción de colección m adurada por afin idad de CDR3 de la cadena ligera de 7B3
M e d ia n te a lin e a c ió n de se c u e n c ia y a n á lis is de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B3, se se le cc io n ó p a rte de los a m in o á c id o s en la te rce ra reg ión C D R de la c a d e n a lig e ra d e 7 B 3 y se in tro d u je ro n m u ta c io n e s a le a to riza d a s m e d ia n te ce b a d o re s p a ra c o n s tru ir u n a co le cc ió n m a d u ra d a p o r a fin id a d de la c a d e n a lige ra .
P a ra p re p a ra r un fra g m e n to de A D N q u e co d ifiq u e la co le cc ió n de m u ta n te s de 7B 3, se o b tu v ie ro n re sp e c tiva m e n te d o s fra g m e n to s de A D N p o r PC R u sa nd o el p lá sm id o p C a n ta b 5 E -7 B 3 (in se rta n d o 7B 3 en el s itio s fiI/N o tI de p C a n ta b 5 E -7 B 3 ) co m o m o lde , se g u id o de co rte y e m p a lm e a tra vé s de l m é to do de P C R de d e riva c ió n . E sp e c ífica m e n te , se usó el s ig u ie n te p ro ce d im ie n to : p a ra s in te tiz a r g en es , se re a liza ro n re a cc io n e s d e P C R en un vo lu m e n d e 50 pl ca d a uno u sa n d o el p lá sm id o p C a n ta b 5 E -7 B 3 co m o m o lde con una co n c e n tra c ió n fina l d e 0 ,2 pM p a ra c a d a c e b a d o r y se a ñ a d ie ro n 5 pl de ta m p ó n K O D P lus 10 x, 4 pl de d N T P (dA TP , d C T P , d G T P y d T T P , 2 m M ca d a uno), 2 pl de MgSO4 25 m M y 1 U de K O D P lus (de T a ka ra ) y e l p ro c e d im ie n to de PC R se in ic ió en un te rm o c ic la d o r d e sp u é s de c o m p e n s a r e l v o lu m e n con agua. La re acc ión se ca le n tó en p r im e r lu g a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u to s y d e sp u é s se incubó d u ra n te 25 c ic lo s de 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 56 °C d u ra n te 30 se g u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y fin a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m in u tos . El p rim e r fra g m e n to se a m p lificó u sa n d o los c e b a d o re s p C 7 B 3 fw (S E Q ID NO : 4, A T A A C A G G C C C A G C C G G C C A T G G A T A T T C A G A T G A C C C A G A G ) y L R 3 re (S E Q ID N O : 5, C A C T T T G G T G C C C T G G C C A A A T G T M N N T G G G N N M N N M N N M N N C T G M N N G C A A T A A T A G G T C G C A A A A T C ) y el se g u n d o fra g m e n to se a m p lificó u sa n d o e l c e b a d o r L R 3 f2 fw (S E Q ID N O : 6, A C A T T T G G C C A G G G C A C C A A A G ) y p C 7 B 3 re (S E Q ID N O : 7, A T A A A T G C G G C C G C G C T G C T C A C G G T C A C ).
Los p ro d u c to s de PCR e sp e ra d o s se id e n tifica ro n p o r e le c tro fo re s is a n a lít ica en g e l de a g a ro sa y se p u rifica ro n a p a rtir de m u e s tra s m e d ia n te k its W iza rd S V G e l y PC R C le a n -u p (d isp o n ib le en P ro m e ga ). Los d os fra g m e n to s se a ña d ie ro n en re lac ió n e q u im o la r a u n a s e g u n d a ro nd a de PC R in te rm e d ia co m o m o lde y e l s is te m a de re acc ión aún u só el s is te m a K O D P lus m e n c io n a d o a n te r io rm e n te . La re acc ión se ca le n tó en p rim e r lu g a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u tos y d e sp u é s se incu bó d u ra n te 10 c ic lo s , las co n d ic io n e s de c a d a re acc ión de c ic la c ió n fu e ro n 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 60 °C d u ra n te 30 se g u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y fin a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m inu tos . P o s te rio rm e n te , se a ña d ie ro n d ire c ta m e n te los ce b a d o re s p C 7 B 3 fw y p C 7 B 3 re al s is te m a de re acc ión a una co n ce n tra c ió n fin a l de 0 ,2 pM , y se in ic ió e l p ro g ra m a de PC R. La re a cc ió n se ca le n tó en p r im e r lu g a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u to s y d e sp u é s se incu bó d u ra n te 25 c ic lo s de 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 56 °C d u ra n te 30 seg u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y f in a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m in u tos . Los p ro d u c to s de PC R e sp e ra d o s se se p a ra ro n p o r e le c tro fo re s is p re p a ra tiva en ge l de a g a ro sa y se p u rifica ro n m e d ia n te k its W iza rd S V G e l y PC R C lea n -up de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s d e l fab rica n te .
En la co le cc ió n , los fra g m e n to s de A D N c o m p le to s co n te n ía n s itio s de re co n o c im ie n to de e n z im a s de re s tr icc ió n sfiI y N otl en ca d a e x tre m o , y se d ig irie ro n p o r la e n d o n u c le a s a de re s tr icc ió n s fiI/N o tI (a d q u ir id a en N e w E ng la nd B io labs) p a ra d ig e s tió n de re s tr icc ió n y se inse rta ro n en e l v e c to r fa g ó m id o p C A N T A B 5E d ig e rid o p o r las d o s m ism as e n z im a s . L os p ro d u c to s de liga m ie n to se a is la ro n y d e sa la ro n u sa n d o k its W iza rd S V G e l y PC R C le a n -u p p ara e le c tro tra n s fo rm a c ió n . P ara e le c tro tra n s fo rm a c ió n , se usó E. coIí E R 2738 co m p e te n te ca s e ra (d isp o n ib le en N ew E ng la nd B io la bs ) con c u b e ta de e le c tro p o ra c ió n e in s tru m e n to de e le c tro p o ra c ió n G e n e P u lse r II (de B io -R a d ). F in a lm e n te se co n firm ó u n a co le cc ió n q ue co n te n ía 1,9 x 109 m u ta n te s .
2. C onstrucción de colección m adurada por afin idad de CDR3 de la cadena pesada de 7B3
M e d ia n te a lin e a c ió n de s e cu e n c ia y a n á lis is de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B 3, se se le cc io n ó p a rte de los a m in o á c id o s en la te rce ra reg ión C D R de la ca d e n a p e sa d a de 7B 3 y se in tro d u je ro n m u ta c io n e s a le a to riza d a s m e d ia n te ce b a d o re s p a ra c o n s tru ir u na co le cc ió n m a d u ra d a p o r a fin ida d de la ca d e n a pesada .
P ara p re p a ra r un fra g m e n to de A D N q u e co d ifiq u e la co le cc ió n de m u ta n te s de 7B 3, se o b tu v ie ro n re sp e c tiva m e n te d o s fra g m e n to s de A D N p o r PCR u sa n d o el p lá sm id o p C a n ta b 5 E -7 B 3 co m o m o lde , se g u id o de co rte y e m p a lm e a tra vé s d e l m é to do de PC R de d e riva c ió n . E sp e c ífica m e n te , se usó e l s ig u ie n te p ro ce d im ie n to : p a ra s in te tiz a r g en es , se re a liza ro n re a cc io n e s de PC R en un v o lu m e n de 50 pl c a d a u no u sa n d o el p lá sm id o p C a n ta b 5 E -7 B 3 co m o m o lde con u n a c o n ce n tra c ió n fin a l de 0 ,2 pM p a ra c a d a c e b a d o r y se a ñ a d ie ro n 5 p l de ta m p ó n K O D P lus 10 x, 4 p l de d N T P (dA TP , d C T P , d G T P y d T T P , 2 m M c a d a uno), 2 pl de M g S O 425 m M y 1 U de K O D P lus y e l p ro ce d im ie n to de PCR se in ic ió en un te rm o c ic la d o r d e s p u é s de c o m p e n s a r el v o lu m e n con agua. La re acc ión se ca le n tó en p r im e r lug a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u tos y d e sp u é s se incu bó d u ra n te 25 c ic lo s de 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 56 °C d u ra n te 30 se g u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y f in a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m in u tos . El p rim e r fra g m e n to se a m p lificó u sa n d o los c e b a d o re s H R 3 flfw (S E Q ID N O : 8, T C G C A A T T C C T T T A G T T G T T C C ) y H R 3 flre (S E Q ID N O : 9, C A G G G T G C C C T G G C C C C A G T A A G C G C G C G C A A T A A T A C A C ) y e l s e g u n d o fra g m e n to se a m p lif icó u sa n d o el c e b a d o r H R 3 f2 fw (S E Q ID N O : 10, T A C T G G G G C C A G G G C A C C C T G )
ffJ
H R 3 f2 re (S E Q ID N O : 11, G G A A T A G G T G T A T C A C C G T A C T C A G ).
Los p ro d u c to s de PC R e sp e ra d o s se id e n tifica ro n p o r e le c tro fo re s is a n a lít ica en g e l de a g a ro sa y se p u rifica ro n a p a rtir de m u e s tra s m e d ia n te k its W iza rd S V G e l y PC R C le a n -u p . Los d o s fra g m e n to s se a ñ a d ie ro n en re lac ió n e q u im o la r a u na s e g u n d a ro nd a de PC R in te rm e d ia co m o m o lde y el s is te m a de re acc ión aún usó el s is te m a K O D P lus m e n c io n a d o a n te r io rm e n te . La re acc ión se ca le n tó en p rim e r lu g a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u to s y d e sp u é s se incu bó d u ra n te 10 c ic lo s , las co n d ic io n e s de c a d a re acc ión de c ic la c ió n fu e ro n 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 60 °C d u ra n te 30 seg u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y fin a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m in u tos . P o s te rio rm e n te , se a ñ a d ie ro n d ire c ta m e n te los ce b a d o re s H R 3 flfw y H R 3 f2 re al s is te m a de re acc ión a u na c o n ce n tra c ió n fin a l de 0 ,2 pM , y se in ic ió e l p ro g ra m a de PC R. La re acc ión se ca le n tó en p rim e r lu g a r h as ta 94 °C d u ra n te 5 m in u to s y d e sp u é s se incu bó d u ra n te 25 c ic lo s de 94 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , 56 °C d u ra n te 30 se g u n d o s y 68 °C d u ra n te 30 se g u n d o s , y fin a lm e n te , a 68 °C d u ra n te 10 m in u tos . Los p ro d u c to s de PC R e sp e ra d o s se se p a ra ro n p o r e le c tro fo re s is p re p a ra tiv a en g e l de a g a ro sa y se p u rifica ro n m e d ia n te k its W iza rd S V G e l y PC R C le a n -u p de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s d e l fa b rica n te .
En la co le cc ió n , los fra g m e n to s de A D N c o m p le to s co n te n ía n s itio s de re co n o c im ie n to de e n z im a s de re s tr icc ió n sfil y N otl en ca d a e x tre m o , y se d ig ir ie ro n p o r la e n d o n u c le a s a de re s tr icc ió n s fiI/N o tI p a ra d ig e s tió n de re s tr icc ió n y se in se rta ro n en el v e c to r fa g ó m id o p C A N T A B 5E d ig e rid o p o r las d o s m ism a s e n z im a s . Los p ro d u c to s de lig a m ie n to se a is la ro n y d e sa la ro n u sa n d o k its W iza rd S V G e l y PC R C le a n -u p p a ra e le c tro tra n s fo rm a c ió n . Para e le c tro tra n s fo rm a c ió n , se usó E. coIí E R 2738 co m p e te n te ca s e ra con c u b e ta de e le c tro p o ra c ió n e in s tru m e n to de e le c tro p o ra c ió n G ene P u lse r II. F in a lm e n te se co n firm ó u n a co le cc ió n q u e co n te n ía 6 ,0 x 109 m u tan tes .
Ejem plo 2. C ribado fren te a EG FRvIlI usando colección de m aduración por afin idad de 7B3
P ara o b te n e r m u ta n te s de 7B 3 con m a yo r a fin ida d , se re a liza ro n cu a tro ro nd a s de c rib a d o u sa n d o co le cc io n e s de m u ta n te s de la c a d e n a lige ra y la c a d e n a p esad a , re sp e c tiva m e n te , co m o s igu e : se o b tu vo u n a co le cc ió n de fag os co rre sp o n d ie n te de la co le cc ió n a n te r io r a tra vé s de in fe cc ió n d e l fa g o a u x ilia r M 13K O 7. La co le cc ió n de fa g o s se incu bó con e l a n tíg e n o E G F R vIII m a rca d o con b io tin a (a d q u ir id o en S h a n g h a i ra yge ne b io te c h n o lo g y C o., LTD ) d u ra n te 2 hora s a te m p e ra tu ra a m b ie n te y d e sp u é s se incu ba ro n con m ic ro e s fe ra s m a g n é tica s de e s tre p ta v id in a b lo q u e a d a s con B S A (se ro a lb ú m in a b ov ina , a d q u ir id a en S h a n g h a i B io e n g in e e rin g ) al 2 % (p /v) M yO n e Cl (de Inv itro ge n ) a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 30 m in u tos . Las m ic ro e s fe ra s e n to n c e s se lava ro n con ta m p ó n P B S T (que co n te n ía T w e e n -20 al 0,1 % ) p a ra re tira r e l fa g o no u n id o e sp e c ífica m e n te o con c a p a c id a d de un ión m ás d éb il. Los fa g o s de u n ió n fu e rte se e lu ye ro n de las m ic ro e s fe ra s m a g n é tica s con g lic in a -H C l (pH 2 ,2 ), se n e u tra liza ro n con so lu c ió n n e u tra liza n te de T ris (pH 9 ,1 ), y d e sp u é s se u sa ro n p ara in fe c ta r E. coIí E R 2738 en la fa se de c re c im ie n to se m ilo g a rítm ic a p a ra la s ig u ie n te ro nd a de c rib ad o .
En las cu a tro ro nd a s d e s c rita s a n te r io rm e n te de c rib a d o , las ca n tid a d e s de m ic ro e s fe ra s m a g n é tica s fu e ro n 50 pl, 25 pl, 10 p l y 10 pl, las co n ce n tra c io n e s de a n tíg e n o E G F R vIII m a rca d o con b io tin a fu e ro n 10 nM, 1 nM, 0 ,5 nM y 0,1 nM, re sp e c tiva m e n te , y se usó P B S T p a ra lava do d u ra n te 10, 10, 15 y 20 ve ce s . De la s e g u n d a ro nd a de c rib a d o , se a ñ a d ió un e xce so de 50, 500 y 1000 v e ce s de a n tíg e n o E G F R vIII sin m arcar, re sp e c tiva m e n te , co m o c o m p e tid o r a n tes de e lu c ió n p a ra re tira r los m u ta n te s con ca p a c id a d de u n ión m ás d éb il.
P ara la p ro d u cc ió n de fa g o q u e p re se n ta m u ta n te s d e l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 7B3 en la sup e rfic ie , se in o cu ló la ce p a en g lice ro l o b te n id a en e l e je m p lo 1 en 400 ml de m e d io 2 Y T /a m p ic ilin a p a ra lle va r la d e n s id a d c e lu la r a D O 600 = 0 ,1, y a 37 °C y 200 rpm , se c u ltivó con a g ita c ió n h as ta q ue la d e n s id a d c e lu la r a lca n zó D O 600 = 0 ,5. S e u sa ron 1012 u fp de fa g o a u x ilia r M 13K O 7 en in fe cc ió n y se incu ba ro n a 30 °C y 50 rpm d u ra n te 30 m in u tos . D e sp u é s de a ñ a d ir 50 m g/l de ka n a m ic in a y a g ita c ió n a 37 °C y 200 rpm d u ra n te 30 m in u tos , se sep a ró e l s e d im e n to p o r ce n tr ifu g a c ió n (15 m in u tos , 1600 x g, 4 °C) y se re su sp e n d ió en 400 ml de m e d io 2 Y T /a m p ic ilin a /k a n a m ic in a y se c u ltivó d u ra n te 16 horas a 37 °C con a g ita c ió n a 200 rpm . F in a lm e n te , e l se d im e n to se se p a ró p o r ce n tr ifu g a c ió n (5000 rpm , 4 °C d u ra n te 20 m in u to s ) y se d e sca rtó . El so b re n a d a n te se f iltró a tra vé s de un f iltro de 0 ,45 pm y se a ñ a d ió 1/4 de v o lu m e n de PEG 8000 al 20 % (p /v), so lu c ió n de N aC l 2 ,5 M y se incu bó en un b añ o de h ie lo d u ra n te 1 h o ra p a ra p re c ip ita r los s e d im e n to s de fa g o . El se d im e n to se ce n tr ifu g ó e n to n ce s (20 m in, 8000 x g, 4 °C) y se d e sca rtó el so b re n a d a n te . El fa g o se re su sp e n d ió en 25 m l de PBS e n fr ia d o p re v ia m e n te (N a C l 137 m M , KC l 2 ,7 m M , Na2HPO4 8 m M , K H 2P O 42 m M ) y se ce n tr ifu g ó (5 m in u tos , 20000 x g, 4 °C). Se a ñ a d ió 1/4 de vo lu m e n de p Eg 8000 al 20 % (p/v), so lu c ió n de N aC l 2 ,5 M al so b re n a d a n te y se incu bó en un b añ o de h ie lo d u ra n te 30 m in u tos p a ra p re c ip ita r las p a rtícu la s de fa g o de n ue vo . El se d im e n to se o b tu vo p o r ce n tr ifu g a c ió n (30 m in a 20000 x g a 4 °C), se re su sp e n d ió en 2 ml de PBS e n fr ia d o p re v ia m e n te de nuevo , se m a n tu vo en h ie lo d u ra n te 30 m in y se ce n tr ifu g ó (30 m in , 17000 x g, 4 °C). El so b re n a d a n te se m e zc ló con B S A al 4 % (p /v) en PBS a 1: 1, se c o lo có en u n a m e zc la d o ra g ira to ria y se incubó d u ra n te 30 m in u tos a te m p e ra tu ra a m b ie n te , y d e sp u é s se u só d ire c ta m e n te en c rib ad o .
Ejem plo 3. Identificación de m utantes de 7B3 que se unen espec íficam ente a EGFRvIII
D espu és de cu a tro rondas de c rib a d o fre n te a a n tíg e n o E G F R vIII, se se le cc io n a ro n a le a to ria m e n te 96 c lo n e s de los c lo n e s o b te n id o s en la cu a rta ro nd a de c rib a d o y se a n a liza ro n p a ra su co m b in a c ió n con a n tíg e n o s E G F R vIII y N 1N 2-806 (a d q u ir id o s en S h a n g h a i ra yg e n e b io te c h n o lo g y C o., LTD ) u sa n d o E L IS A (e n sa yo de in m u n o a d so rc ió n e n z im á tica ) de un so lo fa g o , d o n d e N 1 N 2 -806 es u na p ro te ín a de fu s ió n d e l d o m in io N 1N 2 de la p ro te ín a PIII de l fa g o M 13 y los a m in o á c id o s en las p o s ic io n e s 287 -302 de EG F R . P ara e s te p ro p ó s ito , ca d a co lo n ia in d iv id u a l se ino cu ló en 300 pl de m e d io 2 Y T /a m p ic ilin a (que c o n te n ía g lu c o s a al 2 % ) en u n a p la ca de p o c illo s p ro fu n d o s de 96 p o c illo s y se c u ltivó con a g ita c ió n a 37 °C y 250 rpm d u ra n te 16 horas . Se ino cu la ro n 20 pl de cu ltivo en 500 p l de m e d io 2 Y T /a m p ic ilin a (que co n te n ía g lu c o s a al 0,1 % ) y se a g ita ro n a 37 °C y 250 rpm d u ra n te 1,5 horas . P ara p re p a ra r la so lu c ió n de fa g o a ux ilia r, se to m a ro n 75 pl de M 13 K O 7 (v a lo r cu a n tita tivo de 3 x 1012 u fp /m l) y se m e zc la ro n en 15 ml de m e d io 2 Y T y se a ñ a d ie ro n a u n a p la ca a 50 p l/p o c illo . Se rea lizó incu ba c ió n a 37 °C y 150 rpm d u ra n te 30 m in u tos , y d e s p u é s se a ñ a d ie ro n 50 p l/p o c illo de so lu c ió n de ka n a m ic in a p re p a ra d a (180 pl de ka n a m ic in a a 50 m g /m l to m a d o s y a ñ a d id o s a 15 ml de m e d io 2YT ) y se cu ltiva ro n a 37 °C y 250 rpm d u ra n te 16 hora s con a g ita c ió n . F in a lm e n te , las c é lu la s se p re c ip ita ro n p o r ce n tr ifu g a c ió n (30 m in u to s a 5000 x g, 4 °C) y e l so b re n a d a n te se tra n s fir ió a u n a n ue va p la ca de p o c illo s p ro fu n d o s de 96 p oc illos .
P ara re a liza r E L IS A de un so lo fa g o , se u sa ro n 100 n g /p o c illo de a n tíg e n o E G F R vIII, N 1 N 2 -806 y p ro te ín a s de con tro l n e g a tivo B S A y N 1N 2 (a d q u ir id a s en S h a n g h a i ra yg e n e b io te c h n o lo g y C o., LTD ) en p la ca E L IS A M e d iS o rp de 96 p o c illo s (a d q u ir id a en N un c) a 50 p l/p o c illo , y se re cu b rie ro n d u ra n te u n a n oche a 4 °C. C a d a p o c illo se b lo q u e ó con P B S T q u e c o n te n ía B S A al 2 % (p /v). Los p o c illo s e n to n ce s se lava ro n con P B S T d u ra n te tre s ve ce s . E n to nce s, cad a so lu c ió n d e fa g o p re p a ra d a a n te r io rm e n te se a ñ a d ió a c a d a p o c ilio d e la p la ca a 100 p l/p oc illo . D e sp u é s de incu b a c ió n d u ra n te 2 horas a 37 °C, se lavó d u ra n te tre s ve c e s con PBST. P a ra d e te c ta r fag o un ido , se d ilu yó co n ju g a d o de a n ticu e rp o a n ti-M 13 con su p e ró x id o d is m u ta s a (a d q u ir id o en G E H e a lth ca re ) a 1: 5000 en P B S T y se a ñ a d ie ro n 100 pl a c a d a p oc illo . D e sp u é s d e in cu b a c ió n a 37 °C d u ra n te 1 hora , los p o c illo s se a c la ra ro n tre s ve c e s con P B S T y d e s p u é s se a c la ra ro n tre s ve ce s con PBS. F in a lm e n te , se a ñ a d ie ro n 50 pl de su s tra to T M B a los p o c illo s y se re ve la ron d u ra n te 10 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te , se g u id o d e la a d ic ió n de 50 pl de H 2S O 42 M p o r p o c illo p a ra d e te n e r la re a cc ió n de co lo r. Se m id ie ron los va lo re s de e x tin c ió n a 450 nm con un e n sa yo de in m u n o a d so rc ió n e n z im á tic a (B io-Rad).
Se s e le cc io n a ro n los c lo n e s con señ a l m ás fu e rte de u n ión a a n tíg e n o en lu g a r d e B S A en E L IS A y se usa ro n en p o s te rio r e va lu a c ió n y a n á lis is d e se cu e n c ia . Los a n ticu e rp o s o b te n id o s de la co le cc ió n d e m a d u ra c ió n p o r a fin id a d de la ca d e n a lig e ra se c o m b in a ro n a d ic io n a lm e n te e n to n ce s con los a n ticu e rp o s o b te n id o s de l e je m p lo 2 en la co le cc ió n de m a d u ra c ió n p o r a fin id a d de la ca d e n a p e sa d a en la s e c u e n c ia de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lig e ra y la se c u e n c ia de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a y los a n tic u e rp o s re su lta n te s ta m b ié n p od ía n un irse e sp e c ífica m e n te a los a n tíg e n o s E G F R v lII y N 1N 2 -806 , en lug a r de las p ro te ín a s d e co n tro l B S A y N 1N 2.
A p a rtir de la e s tru c tu ra c ris ta lin a d e l a n ticu e rp o y e l d e te rm in a n te a n tig é n ico , se a n a lizó e s tru c tu ra lm e n te la un ión de a n ticu e rp o s co m b in a d o s o b te n id o s de m u ta c io n e s de la c a d e n a lige ra y p e s a d a d e 7B 3 y E G F R 287-302, y fin a lm e n te , se se le cc io n a ro n a lg u n a s p o s ic io n e s a m in o a c íd ic a s p a ra m a d u ra c ió n a d ic io n a l p a ra m a yo r a fin id a d y e sta b ilid a d . T o d a s las p o s ic io n e s a m in o a c íd ic a s a lte ra d a s inc lu ye n S31 en la reg ión CDR1 de la c a d e n a lige ra , V 89 , A 92 , Q 93, F94 e Y 96 en la re g ión C D R 3 d e la ca d e n a lige ra , S 182 en la re g ión C D R 2 de la ca d e n a p esad a , L222, R 224, G 225, F 226 y R 227 en la reg ión C D R 3 de la ca d e n a p esad a . B a sa do en las s e cu e n c ia s d e a n ticu e rp o s co m b in a d o s d e sp u é s de m u ta g é n e s is de las ca d e n a s lig e ra s y p esad as , los s itio s de m u ta c ió n se in tro d u je ro n a d ic io n a lm e n te p a ra o b te n e r el a n ticu e rp o Y 022. En c o m p a ra c ió n con el a n ticu e rp o o rig in a l 7B 3 , Y 022 co n tie n e 12 s itio s d e m u ta c ión a m in o a c íd ic a (S 31V , V 89 N , A 92 E , Q 93 N , F94I, Y 96 L , S 182 Q , L222M , R 224K , G 225N , F 226 W y R 227D ). C o m o se m u e s tra en la fig u ra 1, en un e n sa yo E L IS A de un so lo fago , Y 022 p o d ía un irse e sp e c ífica m e n te a los a n tíg e n o s E G F R vIII y N 1N 2-806 s in u n ión a las p ro te ín a s de co n tro l B S A y N 1N 2.
S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 (717 b ases ; S E Q ID N O : 12):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTTAAAGGCCTGATTTATCATGGCAAAAACCTGGAAGATGGCGTGCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT ATT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT ATCCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCAGT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCAT GGGT AAGAATT GGGATTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 13):
D IQ M TQ S PS SLSA S VG D R V TITC H A S Q D IN V N IG ffLQQKPG KAFKG LIYHGKNLEDGVPS
R FSG SG SG TD FTLTISSLQ PED FA TYYC N Q Y E N IP L T FGQGTKVEIKRGGGG5GGGG5GG GG5DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAWNWIRQAPGKGLEW LGYISYRGR
TQYNPSLKSR IS ITR D N S K N TFFLQ LN S LR A ED TA VY Y C A R MGKNWDYWGQGTLVTVSS
En el q u e la ca d e n a lig e ra en las p o s ic io n e s 1 -108 y la s e c u e n c ia CDR1 de la ca d e n a lige ra : H A S Q D IN V N IG (S E Q ID N O : 41), se c u e n c ia C D R 2: H G K N LE D (S E Q ID N O : 42 ), s e c u e n c ia C D R 3 : N Q Y E N IP L T (S E Q ID N O : 43).
En el q ue la c a d e n a p e s a d a en las p o s ic io n e s 124 -239 y la s e c u e n c ia CDR1 de la c a d e n a p e sa d a : G Y S IT S D Y A W N (S E Q ID N O : 44), s e c u e n c ia C D R 2: Y IS Y R G R T Q Y N P S L K S (S E Q ID N O : 45), s e c u e n c ia C D R 3: M G K N W D Y (S E Q ID N O : 46).
C o m o se c rib ó en la co le cc ió n de m u ta n te s c o n s tru id a p re v ia m e n te y se so m e tió a m u ta g é n e s is d ir ig id a al s itio , la se c u e n c ia de n u c le ó tid o s de Y 022 e s ta b a c o n te n id a en p C a n ta b 5E , d e n o m in a d o p lá sm id o p C a n ta b 5 E -Y 022.
Los a u to re s de la in ve n c ió n ta m b ié n o b tu v ie ro n 10 c lo n e s de a n ticu e rp o a d ic io n a le s con a fin id a d y e s ta b ilid a d s ig n ific a tiv a m e n te m e jo ra d a s u sa n d o el m ism o m é to d o q u e p a ra la p ro d u cc ió n de a n ticu e rp o Y 022 , c o n c re ta m e n te M 14, M 15, M 25, M 26, S7, S8, S 17 , S 22 , S 23 y S 29. En c o m p a ra c ió n con el a n ticu e rp o o rig in a l 7B 3 , to d o s los a n ticu e rp o s m o n o ca te n a rio s co n te n ía n s itio s d e m u ta c ión a m in o a c íd ic a co m o se m u e s tra en la ta b la 1.
T a b la 1
Figure imgf000015_0001
S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 14 (717 b a se s ; S E Q ID N O : 58):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACAGCAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCAATT A C A TTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCAACT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 14 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 59):
I) I Q\H QSI'SSI SASV:,l)R\ r ITCHASQDINSNIGVVI.QQKPGKAN\GI. I YHGKNLF.DGYTS
l’ l'S(,S(,S(,TI)l'TLT ISSI tJI'KIII'ATYV( NOYI-NNI’ l 'i l'(,Q(,TK\ K IKRGGGGSGGGGSGG
GGSDVljl AKSGGGI A'tjPGGSI.RI.SCAVSGYSITSDYAWNW I RCJAPGKGI.ílWI.GYISYRGR
TXYM’SLKSR IS I I R I)\S k \T IT I Ql \S I RAKIIT U YYCARI GRGlimu.QGTI \ T\ SS
Las s e cu e n c ia s d e a m in o á c id o s de CDR1 de la ca d e n a lig e ra d e M 14 (H A S Q D IN S N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N N P IT ) y CDR1 de la c a d e n a p e s a d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T N Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID N O : 47, 42, 48, 44, 49, 50 , re sp e c tiva m e n te .
Secuencia de nucleótidos del anticuerpo monocatenario M15 (717 bases; SEQ ID NO: 60):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCAATT A CATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCAGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 15 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 61):
D IQ M T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C IIA S Q D I\\\IG IV I .QQ KPG K A FK G LIY IIG K M ED G VPS
R FSG SG SG TD FTLTISSLQ PED FA TYYC XQ YEW 'P ITP G Q G TK VE IK R GGGGSGGGGSGG
GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYS PTSÜYAWNffIRQAPGKGLEWLGY1SYRGR
Las se cu e n c ia s d e a m in o á c id o s de CDR1 de la c a d e n a lig e ra de M 15 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N N P IT ) y CDR1 de la c a d e n a p e sa d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T S Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID N O : 41,42 , 48, 44, 51,50 , re sp e c tiva m e n te .
S e cu e n c ia d e n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 25 (717 b ases , S E Q ID N O : 62):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT ATCCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 25 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 63):
D IQ M TQ SPSSLSA SVG DR VTITC IIA SQ I) I XVX IGWI .QQKPGKAFKGLIYI IGKM.EDGVPS
R FS G SG SG TD FTLTIS SLQ PE D EA TY YC X Q Y EX IP I.TE G Q G TK V EIK R GGGGSGGGGSGG
GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYS11'S D Y A W\W IRQAPGKGLEW I.(i Y IS Y R G R
1 ir, \|N| I.GRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCARI G R G rir, WGQGTLVTVSS
Las se cu e n c ia s d e a m in o á c id o s de CDR1 de la c a d e n a lig e ra de M 25 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N IP L T ) y CDR1 de la c a d e n a p e sa d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T R Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID n O: 41,42 , 43, 44, 52, 50, re sp e c tiva m e n te .
Secuencia de nucleótidos del anticuerpo monocatenario M26 (717 bases, SEQ ID NO: 64):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT ATCCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCAGT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio M 26 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 65):
DIQ M TQ SPSSLSA SYG DR VTI TCIlASQi) IXVN IG W I .QQKPGKAFKGLIYllGKM .ElíGVPS
R FS G SG SG TD FTLTIS SLQ PE D FA TYY C YQ YE M PE TFG Q G TK V EIK R GGGGSGGGGSGG GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVS1..'i M N m V.1 \ffIR Q A PG K G LEIV I.G YISYR G R
TQYNPSEKSRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEUIAYYYCAREG RGl-'RYW G QGTLVTVSS
Las se cu e n c ia s d e a m in o á c id o s de CDR1 de la c a d e n a lig e ra de M 26 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N IP L T ) y CDR1 de la c a d e n a p e s a d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T Q Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID n O: 41,42 , 43, 44, 45, 50, re sp e c tiva m e n te .
S e cu e n c ia d e n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 7 (717 b ases ; S E Q ID N O : 66):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCACCAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCAATT A CATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCAGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 7 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 67):
D IQ M TQ S PS SLSA S VG D R V TITC II \S i ¡PI \ \ \ I GGKPGKAFKGLIYUGTNI.EDGVPS
R FS G SG SG TD FTLTIS SLQ PE D FA T 11ÜGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG
GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGY-SITSDYA W \ W IRQAPGKGLEWLt i Y 1 SYRGR
| V , \ | N KSEISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEUTAYYYCAREGRGFRYW GQGTLVTVSS
Las secuencias de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera de S7 (HASQDINVNIG), CDR2 (HGTNLED), CDR3 (NQYENNPIT) y CDR1 de la cadena pesada (GYSITSDYAWN), CDR2 (YISYRGRTSYNPSLKS), CDR3 (LGRGFRY) son SEQ ID NO: 41,53, 54, 44, 51,50, respectivamente.
Secuencia de nucleótidos del anticuerpo monocatenario S8 (717 bases; SEQ ID NO: 68):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAAGCTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCAATT A CATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCAGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S8 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 69):
D IQ M TQSPSSLSASVG DRVTITCHASQDIXYXIGW I.Q QKPG KSFKG LIYIIGKXEEDGVPS
R FSG SG SG TD FTLTIS SLQ PE D IG V IYY C N Q YIA N PITFG Q G TK VE IK R GGGGSGGGGSGG GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAIVXWIRQAPGKGLEWLGYISYRGR TSYXPSEKSRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCAREGRGFRYW GQGTLVTVSS
Las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s d e CDR1 de la c a d e n a lig e ra de S8 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N N P IT ) y CDR1 de la c a d e n a p e sa d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T S Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID N O : 41,42 , 54, 44, 51,50 , re sp e c tiva m e n te .
S e cu e n c ia d e n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 17 (717 b ases , S E Q ID N O : 70):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACACCAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCAGT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 17 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 71):
D IQ M T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C IIW j| 11X | \ I GQKPGKAFKGLIYIIGKXEEDGVPS
R FS G SG SG TD FTLTIS SLQ PE D FA TYY C XQ YE W P LTFG Q G TK V EIK R GGGGSGGGGSGG GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITS DYAWXWIRQAPGKGLEWLGYISYRG R
liT i X I’S IY .sklSITR D N SK N TFFLQ LN SLRA EU TA YYYC A R EG R G FR YW G Q G TLVTVSS
Las secuencias de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera de S17 (HASQDINTNIG), CDR2 (HGKNLED), CDR3 (NQYENNPLT) y CDR1 de la cadena pesada (GYSITSDYAWN), CDR2 (YISYRGRTQYNPSLKS), CDR3 (LGRGFRY) son SEQ ID nO: 55, 42, 56, 44, 45, 50, respectivamente.
Secuencia de nucleótidos del anticuerpo monocatenario S22 (717 bases; SEQ ID NO: 72):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCACCAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGTGGAAATTAAACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 22 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 73):
D IQ M T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C I1A S Q D I\V \IG W I .QQ KPGKAFKGL]YUGTM.EDGVPS
r f s g s g s g t d f t l t i s s l q p e d f a t y y c n q y e -w p i .t f g q g t k v e ik r g g g g s g g g g s g g
GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSDYAWXWIRQAPGKGLEW] .G V 1SYRGR
t r y x p s l k s r i s i t r d n s k n t f f l q l n s l r a e d t a v y y c a r l g r g f Ry w g q g t l v t v s s
L a s s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s de C DR 1 de la c a d e n a lig e ra d e S 22 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G T N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N N P L T ) y CDR1 de la c a d e n a p e s a d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T R Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID n O: 41,53 , 56, 44, 52, 50, re sp e c tiva m e n te .
S e cu e n c ia d e n u c le ó tid o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 23 (717 b a se s ; S E Q ID N O : 74):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAAGCTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAAT AACCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 23 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 75):
RFSG SG SG TD FTLTISSLQ PED FA TYYC XQ YEXXPETFG Q G TKVEIK R GGGGSGGGGSGG GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSi .'i s I I s i i ',\w \WIRQAPGKGLEWLGY I SYRGR
ÍISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCAREGRGFRYW G QGTLVTVSS
Las secuencias de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera de S23 (HASQDINVNIG), CDR2 (HGKNLEDG), CDR3 (NQYENNPLT) y CDR1 de la cadena pesada (GYSITSDYAWN), CDR2 (YISYRGRTRYNPSLKS), CDR3 (LGRGFRY) son SEQ ID nO: 41,42, 56, 44, 52, 50, respectivamente.
Secuencia de nucleótidos del anticuerpo monocatenario S29 (717 bases; SEQ ID NO: 76):
GAT ATTCAGAT GACCCAGAGCCCGAGCAGCCT GAGCGCGAGCGT GGGCGACCGT GT GACC ATTACCT GCCAT GCGAGCCAGGAT A TT AACGT GAACATT GGCT GGCT GCAGCAGAAACCG GGCAAAGCGTTT AAAGGCCT GATTT AT CAT GGCAAAAACCTGGAAGAT GGCGT GCCGAGC CGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCG GAAGATTTT GCGACCT A TT ATTGCAAT CAGT ATGAAAATTTCCCACT GACATTT GGCCAG GGCACCAAAGT GGAAATT AAACGT GGT GGAGGCGGTT CAGGCGGAGGT GGCTCT GGCGGT GGCGGAT CGGAT GTGCAGCT GGT GGAAAGCGGCGGCGGCCTGGT GCAGCCGGGCGGCAGC CTGCGTCT GAGCT GCGCGGT GAGCGGCT AT AGCATT ACCAGCGATTAT GCGTGGAACT GG ATTCGTCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAAT GGCT GGGCT AT A TT AGCT A T CGT GGCCGC ACCCGCT AT AACCCGAGCCT GAAAAGCCGT ATTAGCATT ACCCGT GAT AACAGCAAAAAC A C C TTTTTC C T GCAGCT GAACAGCCTGCGT GCGGAAGAT ACCGCGGT GT A TTA TT GCGCG CGCCT GGGACGCGGCTT CCGCTACT GGGGCCAGGGCACCCTGGT GACCGT GAGCAGC
S e cu e n c ia d e a m in o á c id o s de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio S 29 (239 a m in o á c id o s ; S E Q ID N O : 77):
D IQ M TQSPSSLSASVG DRVTITCI1ASQI) I \ \ \ IG I\LQ Q K PG K AFKG LIYI1G K \I.E Í)G VPS
R FS G SG SG TD FTLTIS SLQ PE D PA 1'V VC \Q YP M :PI J I :(iQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG
GGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC.U S G Y S IT S I) YAWNWIRQAPGKGLEWLGYISYRGR TRYXPSEKSRISITRDNSKNTFFLQLNSLRAEDTAVYYCAREGRGFRYW G QGTLVTVSS
Las s e cu e n c ia s d e a m in o á c id o s d e CDR1 d e la c a d e n a lig e ra de S 23 (H A S Q D IN V N IG ), C D R 2 (H G K N L E D ), C D R 3 (N Q Y E N F P L T ) y CDR1 de la c a d e n a p e s a d a (G Y S IT S D Y A W N ), C D R 2 (Y IS Y R G R T R Y N P S L K S ), C D R 3 (L G R G F R Y ) son S E Q ID N O : 41,42 , 57, 44, 52, 50, re sp e c tiva m e n te .
Ejem plo 4. Expresión y purificación de anticuerpo
Se inse rta ron g e n e s de ca d a a n ticu e rp o en el s itio N de I/X h o I d e l v e c to r de e xp re s ió n p E T 22 B (+ ), las p ro te ín a s de a n ticu e rp o se p ro d u je ro n d e fo rm a re co m b in a n te en E. coIí BL21 (D E 3) y se p u rifica ro n m e d ia n te c o lu m n a s d e n íque l u sa nd o p o lip é p tid o s con 6 h is tid in a s fu s io n a d a s en el e x tre m o ca rb o x ílico . En p a rticu la r, p a ra p re p a ra r la p ro te ín a de a n ticu e rp o , ca d a c o lo n ia in d iv id u a l se ino cu ló en 5 ml d e m e d io 2 x Y T /a m p ic ilin a y se cu ltivó con a g ita c ió n a 37 °C y 220 rpm d u ra n te 16 horas . Se usó 1 ml de este p re cu ltivo p a ra in o cu la r 100 m l de m e d io 2 x Y T /a m p ic ilin a y se cu ltivó con a g ita c ió n a 37 °C y 220 rpm h a s ta q u e la d e n s id a d c e lu la r a lca nzó D O 600 = 0 ,5. D e sp u é s de ind u cc ión de la e xp re s ió n d e gen e xó g e n o m e d ia n te a -D -is o p ro p ilt io g a la c tó s id o (IP TG ) 1 m M , el cu ltivo se a g itó d u ra n te 6 ho ra s a 30 °C y 220 rpm . Las cé lu la s e n to n ce s se p re c ip ita ro n p o r ce n tr ifu g a c ió n (15 m in u to s a 3500 x g, 4 °C) y se re su sp e n d ie ro n en 35 m l de ta m p ó n de d e sco m p o s ic ió n (P B 50 m M , N aC l 300 m M , u re a 2 M, T rito n X -100 al 0 ,5 % , pH 8 ,0). D espu és d e so n ica c ió n , la m u e s tra se a g itó a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 30 m in u to s p a ra lisa r co m p le ta m e n te los d e se ch o s c e lu la re s . E n to n ce s se re co g ie ro n los se d im e n to s d e cu e rp o s de inc lu s ió n p o r ce n tr ifu g a c ió n (15 m in u tos , 10 000 x g, 4 °C) y se a ñ a d ie ro n 20 m l de ta m p ó n d e sn a tu ra liz a n te (P B 50 m M , N aC l 300 m M , u re a 8 M, im id a zo l 10 m M , pH 8 ,0 ) y se a g ita ron d u ra n te u n a h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . Los s e d im e n to s se re tira ro n p o r ce n tr ifu g a c ió n (15 m in , 10 000 x g, 4 °C), e l lisad o se re co g ió y la p ro te ín a se p u rificó con 5 ml de co lu m n a de p u rifica c ió n H isT rap HP (d isp o n ib le en el m e rca d o en G E H ea lth ca re ). La p u re z a de la p ro te ín a de a n ticu e rp o p u rif ic a d a se a n a lizó p o r e le c tro fo re s is en ge l de S D S p o lia c r ila m id a y la c o n ce n tra c ió n de p ro te ín a se d e te rm in ó m e d ia n te el m é to do d e BC A.
Ejem plo 5. Ensayo de activ idad de unión de anticuerpo
La a c tiv id a d de un ión de un a n ticu e rp o al a n tíg e n o E G F R vIII se d e te rm in ó m e d ia n te e n sa yo E L IS A en g ra d ie n te de c o n ce n tra c ió n . P ara e ste p rop ó s ito , el a n tíg e n o E G F R vIII se d ilu yó con so lu c ió n de re cu b rim ie n to de N aH CO 3 (pH 9 ,6) 0,1 M y c a d a p o c illo se re cub rió con 200 ng a 50 p l/p o c illo d u ra n te una n oche a 4 °C y se b lo q u e ó con P B S T que c o n te n ía B S A al 2 % (p /v) d u ra n te 2 ho ra s a te m p e ra tu ra a m b ie n te . La p la ca e n to n ce s se a c la ró tre s ve c e s con P b S t . P o s te rio rm e n te , se a ña d ie ro n 100 pl d e ca d a so lu c ió n de p ro te ín a d e a n ticu e rp o en P B S T q u e c o n te n ía u n a serie de co n c e n tra c io n e s (c o n ce n tra c io n e s in ic ia le s d e 50 n g /po c illo , d ilu id o 18 nM h a s ta 1: 81) a ca d a p la ca d e p o c illo s y ca d a m u e s tra se e n sa yó u sa nd o a n á lis is p a ra le lo de tre s poc illos . D espu és d e in cu b a c ió n d u ra n te 2 h o ra s a 37 °C, la p la ca se a c la ró tre s v e ce s con P B S T s e g u id o de a d ic ión de 100 p l/p o c illo de una d ilu c ió n 1: 2000 d e a n ticu e rp o d e ra tón a n tim a rc a de H is (d isp o n ib le en S a n ta c ru z ) d u ra n te 1 h o ra a 37 °C. P ara e n sa ya r e l a n ticu e rp o un ido , se d ilu yó a n ticu e rp o de c a b ra a n tirra tó n m a rca d o con H R P (a d q u ir id o en S a n ta C ru z) en P B S T a u n a d ilu c ió n 1: 15 000 y se a ñ a d ie ro n 100 pl p o r p oc illo y se incu bó a 37 °C d u ra n te 1 hora . P a ra la d e te cc ió n , los p o c illo se a c la ra ro n tre s ve ce s con P B S T se g u id o de a c la ra d o tres v e ce s con P B S y fin a lm e n te se a ña d ió T M B p a ra el re ve la d o d u ra n te 15 m in . La re acc ión c ro m o g é n ic a se d e tu vo con 50 pl de H 2S O 42 M p o r p oc illo y el v a lo r de e x tin c ió n se m id ió a 450 nm usa nd o in m u n o e n sa yo e n z im á tico (B io -R ad ). Los v a lo re s d e a b s o rb a n c ia o b te n id o s se e va lu a ro n u sa nd o el p ro g ra m a in fo rm á tico S ig m a P lo t y se ca lcu ló la fu e rz a de un ión de un a n ticu e rp o . P a ra e ste p rop ó s ito , el v a lo r de e xtin c ió n m e d id o en c a d a ca so se re p re se n tó fre n te a la co rre sp o n d ie n te c o n ce n tra c ió n de a n ticu e rp o y la c u rva re su lta n te se a ju s tó u sa n d o la s ig u ie n te re g re s ió n no linea l.
a * x
y = (b+i)
En la q ue e l e q u ilib r io de u n ió n /d iso c ia c ió n id e n tifica d o e n tre e l a n tíg e n o in m o v iliza d o y la p ro te ín a de a n ticu e rp o es:
x = co n c e n tra c ió n de p ro te ín a de a n ticu e rp o ;
y = c o n ce n tra c ió n de co m p le jo de a n tíg e n o /a n ticu e rp o (m ed ido in d ire c ta m e n te p o r a b s o rb a n c ia d e sp u é s de la re acc ión de co lo r);
a = c o n ce n tra c ió n to ta l de a n tíg e n o in m o v iliza d o ;
b = co n s ta n te de d iso c ia c ió n (K d).
La c u rva de u n ión o b te n id a p a ra el a n ticu e rp o 7B3 en e n sa yo E L IS A en g ra d ie n te de c o n ce n tra c ió n se m u e s tra de m a n e ra e je m p la r en la fig u ra 2 con K d de a p ro x im a d a m e n te 22 ,4 nM ; la c u rva de u n ión de l a n ticu e rp o Y 022 a E G F R vIII se m u e s tra en la fig u ra 3 con K d a p a re n te de a p ro x im a d a m e n te 2 ,7 nM.
Ejem plo 6. A nális is de actividad sobre la unión de Y022 a EGFR de superfic ie celular
1. Expresión y purificación de anticuerpo de fusión scFv-Y022-Fc, scFv-806-Fc y scFv-C 225-Fc
De a cu e rd o con un e sq u e m a co n ve n c io n a l, e l fra g m e n to scF v-Y 022 se a m p lificó a p a rtir de los c lo n e s re su lta n te s u sa n d o e l p a r de ce b a d o re s V 5 -Y 022 -F (S E Q ID N O : 14, A C A G T G C T A G C A G A T A T T C A G A T G A C C C A G ) y V 5 -Y 022 -R (S E Q ID N O : 15, A A G A A T G C G G C C G C G C T G C T C A C G G T C A C C A G ); S cF v -806 se a m p lificó u sa n d o e l p a r de c e b a d o re s V 5 -806 -F (S E Q ID N O : 16, A C A G T G C T A G C A G A C A T C C T G A T G A C C C A A T ) y V 5 -806 -R (S E Q ID N O : 17, A A G A A T G C G G C C G C T G C A G A G A C A G T G A C C A G ) y p H -806 /C D 3 (vé ase el d o c u m e n to 201210094008.X ) com o m o lde ; e l fra g m e n to scF v-C 225 se c lo n ó u sa n d o los p a re s de ce b a d o re s V 5 -C 225 -F (S E Q ID N O : 18, A C A G T G C T A G C A G A C A T C T T G C T G A C T C A G ) y V 5 -C 225 -R (S E Q ID N O : 19, A A G A A T G C G G C C G C T G C A G A G A C A G T G A C C A G ) y e l fra g m e n to de A D N C 225 (V L -co n e c to r-V H ) (la s e cu e n c ia de l m ism o se d e te rm in ó de a cu e rd o con S E Q ID N O : 10 y S E Q ID N O : 12 en e l d o c u m e n to U S 20090099339 A 1 y se o b tu vo a tra vé s de s ín te s is de to d o el g e n o m a p o r S h a n g h a i ra yg e n e b io te c h n o lo g y C o., LTD ) co m o m o lde ; y el p ro d u c to a m p lif ica d o se d ig irió m e d ia n te N he I/N o tI (a d q u ir id a en N E B ), se ligó con p lá sm id o de v e c to r p C M V -V 5 -F c d ig e rid o con N he I/N o tI (en el ve c to r, e l fra g m e n to Fc de IgG1 h u m a n a se fu s io n ó en d ire cc ió n 3' de l s itio de c lo n a c ió n m ú ltip le , a b re v ia d o co m o V 5-F c , a d q u irid o en S h a n g h a i ra yge ne b io te c h n o lo g y C o., LTD ) con A D N lig a sa T4 (a d q u ir id a en N E B ) y tra n s fo rm a d o en la c e p a h o sp e d a d o ra T O P 10. S e se le cc io n a ro n los c lo n e s y se id e n tifica ro n los c lo n e s p o s itivo s m e d ia n te PC R y se co n firm a ro n p o r se cu e n c ia c ió n , p a ra o b te n e r p lá sm id o s de e xp re s ió n e u ca rio ta s de V 5 -scF v -Y 022 -F c , V 5 -scF v -806 -F c y V 5 -scF v -C 225 -F c , re sp e c tiva m e n te .
Los p lá sm id o s de e xp re s ió n a n te r io re s se tra n s fe c ta ro n re sp e c tiva m e n te en c é lu la s H E K -293 F de c re c im ie n to en p oc illo , se cu ltiva ro n a 37 °C, 5 % de C O 2, a g ita d o r a 125 rpm d u ra n te 7 d ía s , y se c e n tr ifu g a ro n a 4000 rpm d u ra n te 10 m in. El p re c ip ita d o se re tiró , e l so b re n a d a n te se re cog ió y se f iltró con m e m b ra n a de 0 ,45 gm . La m u e s tra se p urificó p o r a fin ida d con c o lu m n a de a fin ida d de p ro te ín a A (de G E ) p a ra o b te n e r fin a lm e n te las p ro te ín a s de fu s ió n p u rifica d a s de a n ticu e rp o -F c scF v -Y 022 -F c , scF v -806 -F c y scF v -C 225 -F c . Los re su lta d o s se m u e s tra n en la fig u ra 4.
2. Detección de la capacidad de unión de scFv-Y022-Fc, scFv-806-Fc y scFv-C 225-Fc m on ocatenarios a EGFR de superfic ie celu lar por FACS
Las ca p a c id a d e s de u n ión de c a d a u no de los a n ticu e rp o s m o n o ca te n a rio s s cF v-Y 022 -F c , s cF v -806 -F c y scF v -C 225 -Fc a las s ig u ie n te s líne as ce lu la re s se a n a liza ro n p o r c la s if ica c ió n de c é lu la s a c tiva d a s con f lu o re sc e n c ia (F A C S ) (BD , FA C S C a lib u r).
Los m é to d o s e sp e c ífico s son co m o s igue:
1) Se ino cu la ro n c é lu la s tu m o ra le s en fa se de c re c im ie n to lo g a rítm ico co m o se e n u m e ra en la ta b la 2 en u n a p laca de 6 cm con u na d e n s id a d c e lu la r de in o cu la c ió n de a p ro x im a d a m e n te un 90 % , y se incu ba ro n en e s tu fa de in cu b a c ió n a 37 °C d u ra n te u na noche .
2) Las c é lu la s se d ig irie ro n con E D TA 10 m M y las c é lu la s se re co g ie ro n p o r ce n tr ifu g a c ió n a 200 g d u ra n te 5 m in.
Las c é lu la s se re su sp e n d ie ro n en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to al 1 % (N B S PBS) q u e c o n te n ía sue ro de te rn e ra a u n a c o n ce n tra c ió n de 1 x 106 a 1 x 107/m l, y se a ñ a d ie ro n a un tu b o de flu jo en una c a n tid a d de 100 g l/tubo .
3) Las c é lu la s se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in, y se d e sca rtó e l so b re n a d a n te .
4) Los a n ticu e rp o s a e n sa ya r, scF v -Y 022 -F c , s cF v -806 -F c y scF v -C 225 -F c , se a ñ a d ie ro n re sp e c tiva m e n te . Y se u só PBS co m o co n tro l n eg a tivo . La c o n ce n tra c ió n f in a l de a n ticu e rp o fu e 20 p g /m l, se a ñ a d ie ro n 100 pl a c a d a tu b o y se co lo ca ro n en un b añ o de h ie lo d u ra n te 45 m inu tos .
5) Se a ñ a d ie ro n 2 ml de N B S PBS al 1 % a ca d a tu b o y se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in d os vece s.
6) Se d e sca rtó e l so b re n a d a n te y se a ña d ió a n ticu e rp o de ca b ra a n tih u m a n o m a rca d o con F ITC f lu o re sc e n te (de S h a n g h a i K a n g ch e n g B io -e n g in e e rin g C o m p a n y ) a u na d ilu c ió n de 1 :50, y se a ñ a d ie ro n 100 ul a ca d a tu b o y se co lo ca ro n en un b añ o de h ie lo d u ra n te 45 m in u tos .
7) Se a ñ a d ie ro n 2 ml de N B S PBS al 1 % a ca d a tu b o y se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in d os vece s.
8) Se d e sca rtó e l so b re n a d a n te , se re su sp e n d ió en 300 ul de N B S PBS al 1 % y se d e te c tó p o r c ito m e tría de flu jo .
9) Los d a to s se a n a liza ro n u sa n d o e l p ro g ra m a in fo rm á tico de a n á lis is de d a tos de c ito m e tría de f lu jo W in M D I 2.9.
T a b la 2
Figure imgf000022_0001
Los re su lta d o s se m u e s tra n en la fig u ra 5, e l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 de la p re se n te inve n c ió n p u e d e un irse , con d ife re n te s g ra d o s , a U 87 -E G F R q u e e xp re sa de fo rm a e xó g e n a E G F R (el m é to do de c o n s tru cc ió n p uede e n c o n tra rs e en W a n g H., etal., Id e n tifica tio n o f an Exon 4 -D e le tio n V a ria n t o f E p id e rm a l G row th F a c to r R e ce p to r w ith Inc re ase d M e ta s ta s is -P ro m o tin g C ap a c ity . N eo p la s ia , 2011 , 13, 461 -471 ) y U 87 -E G F R v III q u e s o b re e x p re s a E G F R v lII (e l m é to do de co n s tru cc ió n p ue de e n co n tra rse en el d o cu m e n to W O /2011 /035465 ), A 431 , C A L27 , m Da -M B -468 q ue e xp re sa n de fo rm a e n d ó g e n a E G F R , y e sp e c ia lm e n te se u ne fu e rte m e n te a c é lu la s U 87 -E G F R v III y A 431 , p e ro su c a p a c id a d de u n ión no fu e ta n a lta co m o la de l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 806. La ca p a c id a d de u n ión de l a n ticue rp o m o n o ca te n a rio C 225 a e s ta s c é lu la s es m u y fu e rte . E s tos a n ticu e rp o s m o n o ca te n a rio s tie n e n p oca u n ión a cé lu las U87.
A d e m á s, los d o s a n ticu e rp o s m o n o ca te n a rio s Y 022 y 806 ca s i no se u n ían a c é lu la s U 87 de la línea c e lu la r de g lio m a . E sp e c ia lm e n te , e l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 ta m p o c o se u ne a c é lu la s e p ite lia le s de p ró s ta ta n o rm a le s R W P E -1 y q u e ra tin o c ito p rim a rio h u m a n o K2, m ie n tra s q ue e l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio 806 se u ne a e s ta s d o s cé lu las n o rm a le s con d ife re n te s g rad o s.
E s to s re su lta d o s ind ican q ue e l a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 se u ne e sp e c ífica m e n te a c é lu la s tu m o ra le s que s o b re e xp re sa n EG F R , a s í co m o EG FR vI 11, m ie n tra s se unen p oco a c é lu la s q u e e xp re sa n E G F R norm a l.
Ejem plo 7. Construcción de vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos b ifuncionales m onocatenarios Y022/CD 3
La a m p lifica c ió n p o r PC R se rea lizó u sa n d o e l p lá sm id o p C a n ta b 5 E -Y 022 o b te n id o en e l e je m p lo 3 co m o m o lde y un p a r de c e b a d o re s , e l c e b a d o r d ire c to p H 7 B 3 f2 _ fw (S E Q ID N O : 20, G A T A T T C A G A T G A C C C A G A G C C C G A G C A G ) y e l c e b a d o r in ve rso p H 7 B 3 f2 _ re (S E Q ID N O : 21, A A T A G G A T C C A C C A C C T C C G C T G C T C A C G G T C A C ) p a ra o b te n e r e l fra g m e n to de A D N de Y 022 scF v. Se o b tu vo o tro fra g m e n to de A D N q u e co n te n ía la se cu e n c ia de p é p tid o señ a l de l v e c to r pH p o r PC R u sa n d o p lá sm id o p H -7 B 3 /C D 3 (vé ase el d o c u m e n to 201210094008.X e je m p lo 3 y fig u ra 2) com o m o lde y e l c e b a d o r d ire c to p H 7 B 3 f1 _ fw (S E Q ID n O: 22, C C A T T G A C G C A A A T G G G C G G T A G G ) y e l c e b a d o r inve rso p H 7 B 3 f1 _ re (S E Q ID N O : 23, C T G C T C G G G C T C T G G G T C A T C T G A A T A T C ). Los d o s fra g m e n to s se m e zc la ro n en re lac ió n e q u im o la r p a ra co rte y e m p a lm e de l fra g m e n to y PC R. Las c o n d ic io n e s de co rte y e m p a lm e fu e ro n : d e s n a tu ra liz a c ió n : 94 °C d u ra n te 4 m in ; d e sn a tu ra liz a c ió n : 94 °C d u ra n te 40 s ; h ib rid a c ió n : 60 °C d u ra n te 40 s; e x te n s ió n : 68 °C d u ra n te 140 s d u ra n te 5 c ic lo s , y d e sp u é s e x te n s ió n to ta l de 68 °C, 10 m in. Y d e sp u é s se co m p le m e n ta ro n la A D N p o lim e ra sa y e l c e b a d o r d ire c to p H 7 B 3 f1 _ fw y c e b a d o r inve rso p H 7 B 3 f2 _ re , se re a liza ro n 30 c ic lo s de a m p lifica c ió n , y las co n d ic io n e s de a m p lif ica c ió n fu e ro n : 94 °C, 4 m in ; d e sn a tu ra liza c ió n : 94 °C, 40 s; h ib rid a c ió n : 60 °C, 40 s; 68 °C d u ra n te 140 s d u ra n te 30 c ic lo s y d e sp u é s e x te n s ió n to ta l 68 °C d u ra n te 10 m in.
La se cu e n c ia a m p lif ica d a se d ig ir ió con la e n d o n u c le a s a de re s tr icc ió n N he I/B a m H I y se d ig irió d o b le m e n te de a cu e rdo con las co n d ic io n e s de re acc ión re c o m e n d a d a s p o r e l p ro v e e d o r de la e n z im a (N e w E ng land B io la bs , N E B ). El v e c to r de e xp re s ió n pH (véase e l d o c u m e n to 201210094008.X e je m p lo 3 y fig u ra 2) ta m b ié n se d ig ir ió de fo rm a s im ila r con la e n z im a de re s tr icc ió n N h e I/B a m H I. El fra g m e n to Y 022 scF v d ig e rid o d o b le m e n te y e l fra g m e n to de l v e c to r pH e n to n ce s se liga ron con A D N liga sa T 4 s ig u ie n d o las co n d ic io n e s de re acc ión re co m e n d a d a s p o r e l p ro v e e d o r de la e n z im a (N E B ). La s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q u e c o d ific a e l p o lip é p tid o de a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio Y 022 o b te n id o de e s te m o do se c lo n ó en un ve c to r, y se tra n s c rib ió ju n to con la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s ya c o n te n id a en e l v e c to r q ue c o d ific a e l p o lip é p tid o de a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio C D 3 en un A R N m , q u e fin a lm e n te se tra d u jo en el p o lip é p tid o de a n ticu e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio Y 022 /C D 3. El n uevo p lá sm id o se d e n o m in ó p H -Y 022 /C D 3 , y la e s tru c tu ra d e ta lla d a se m o stró en la fig u ra 6.
Ejem plo 8. Expresión y purificación del anticuerpo b ifuncional m onocatenario Y022/CD 3, pH -806/C D3 y pH-C225/CD3
Los v e c to re s de e xp re s ió n p H -Y 022 /C D 3 , p H -806 /C D 3 y p H -C 225 /C D 3 (vé ase el d o c u m e n to 201210094008.X ) se tra n s fe c ta ro n en c é lu la s de o va rio de h á m s te r ch in o (C H O ) de a cu e rd o con el p ro ce d im ie n to de l re ac tivo de tra n s fe cc ió n F ree S ty le M A X R e a g e n t (de Inv itro ge n ). Y d e sp u é s se c rib a ro n los c lo n e s e s ta b le s de a cu e rd o con el k it de e xp re s ió n de p ro te ín a s O p tiC H O ™ (de Inv itro ge n ). Los c lo n e s e s ta b le s de c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s con ca d a u no de los v e c to re s de e xp re s ió n a n te r io re s se cu ltiva ro n en m a tra ce s de a g ita c ió n a 37 °C d u ra n te 7 d ía s a 130 rpm , y e l m e d io u sa do fu e C D O p tiC H O (de G ib co). El so b re n a d a n te de cu ltivo se o b tu vo p o r ce n tr ifu g a c ió n y d e sp u é s se a lm a ce n ó a -20 °C.
La p u rifica c ió n de p ro te ín a s se re a lizó u sa n d o u na c o lu m n a de a fin id a d de h is tid in a (co lu m n a H is T ra p HP, d isp o n ib le en G E H e a lth ca re ) de a cu e rd o con las e ta p a s de l m é to do de fa b rica n te . E sp e c ífica m e n te , la co lu m n a se e q u ilib ró con ta m p ó n A (fo s fa to de sod io 20 m M pH 7 ,4 , N aC l 0 ,4 M) y d e sp u é s el so b re n a d a n te de c u ltivo c e lu la r (500 ml de l so b re n a d a n te ) se a ñ a d ió a la co lu m n a (1 m l) con un ca u d a l de 3 m l/m in d e sp u é s de d iá lis is en PBS. La c o lu m n a e n to n ce s se lavó con 5 v o lú m e n e s de ta m p ó n A y 10 vo lú m e n e s de ta m p ó n A q u e co n te n ía im id a zo l 50 m M p a ra re tira r la p ro te ín a de im p ureza . La p ro te ín a de in te ré s u n id a se e lu yó con el m ism o ta m p ó n A co m p le m e n ta d o con im id azo l 250 m M . T o d a s las e ta p a s de p u rifica c ió n se re a liza ro n a 4 °C.
Los a n ticu e rp o s b ifu n c io n a le s m o n o ca te n a rio s p u rifica d o s se d e te c ta ro n p o r S D S -P A G E re d u c to r. C om o se m u e s tra en la fig u ra 7, los p e so s m o le cu la re s de e s ta s m o lé cu la s de a n ticu e rp o e ran to d o s de a p ro x im a d a m e n te 60 kD a, q ue c o rre sp o n d ía al peso m o le c u la r d e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio ca lc u la d o a p a rtir de las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s .
Ejem plo 9. A nális is de la especific idad de unión a antígeno del anticuerpo b ifuncional m onocatenario tal com o Y022/CD 3
Las ca p a c id a d e s de un ión d e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio Y 022 /C D 3 a E G F R se a n a liza ro n p o r c la s ifica c ió n de c é lu la s a c tiva d a s con f lu o re sc e n c ia (F A C S ) (BD , FA C S C a lib u r).
Los m é to d o s e sp e c ífico s son co m o s igu e :
1. S e ino cu la ro n c é lu la s tu m o ra le s en fa se de c re c im ie n to lo g a rítm ico co m o se e n u m e ra en la ta b la 2 en u n a p la ca de 6 cm con u na d e n s id a d c e lu la r de ino cu la c ió n de a p ro x im a d a m e n te un 90 % , y se incu ba ro n en e s tu fa de in cu b a c ió n 37 °C d u ra n te u n a noche .
2. Las c é lu la s se d ig irie ro n con E D TA 10 m M y las c é lu la s se re co g ie ro n p o r ce n tr ifu g a c ió n a 200 g d u ra n te 5 m in.
Las c é lu la s se re su sp e n d ie ro n en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to al 1 % (N B S PBS) q u e c o n te n ía sue ro de te rn e ra a u n a co n ce n tra c ió n de 1 x 106 a 1 x 107/m l, y se a ñ a d ie ro n a un tu b o de flu jo en una c a n tid a d de 100 g l/tubo .
3. Las c é lu la s se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in, y se d e sca rtó e l so b re n a d a n te .
4. S e a ñ a d ió e l a n ticu e rp o Y 022 /C D 3 a e n sa ya r. Y se u só a n ticu e rp o N G R /C D 3 irre le va n te co m o co n tro l n eg a tivo . La c o n ce n tra c ió n fin a l de a n ticu e rp o fu e 5 g g /m l, se a ñ a d ie ro n 100 g l a ca d a tu b o y se co lo ca ro n en un baño de h ie lo d u ra n te 45 m in u tos .
5. S e a ñ a d ie ro n 2 ml de N B S PBS al 1 % a ca d a tu b o y se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in d os vece s.
6. Se d e sca rtó e l so b re n a d a n te y se a ñ a d ió a n ticu e rp o de ra tón a n tim a rca de his (de S h a n g h a i G e n o m ics T e ch n o lo g y C o., L td .) a u n a d ilu c ió n de 1 :50, y se a ñ a d ie ro n 100 ul a ca d a tu b o y se co lo ca ro n en un baño de h ie lo d u ra n te 45 m in u tos .
7. S e a ñ a d ie ro n 2 ml de N B S PBS al 1 % a ca d a tu b o y se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in d os vece s.
8. Se d e sca rtó e l so b re n a d a n te y se a ñ a d ió a n ticu e rp o de ca b ra a n tirra tó n m a rca d o con F ITC f lu o re sc e n te (de S h a n g h a i K a n g ch e n g B io -e n g in e e rin g C o m p a n y ) a u na d ilu c ió n de 1 :50, y se a ñ a d ie ro n 100 ul a ca d a tu b o y se co lo ca ro n en un b añ o de h ie lo d u ra n te 45 m in u tos .
9. S e a ñ a d ie ro n 2 ml de N B S PBS al 1 % a ca d a tu b o y se c e n tr ifu g a ro n a 200 g x 5 m in d os vece s.
10. S e d e sca rtó e l so b re n a d a n te , se re su sp e n d ió en 300 ul de N B S PBS al 1 % y se d e te c tó p o r c ito m e tría de flu jo .
11. Los d a to s se a n a liza ro n u sa n d o el p ro g ra m a in fo rm á tico de a n á lis is de d a to s de c ito m e tría de f lu jo W inM D I 2.9.
Los re su lta d o s se m u e s tra n en la fig u ra 8, e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l Y 022 /C D 3 de la p re se n te inve nc ión p ue de u n irse a cé lu la s U 87 -E G F R , U 87 -E G F R v III y A 431, sin e m b a rg o , se u ne p oco a c é lu la s U 87 y c é lu la s e p ite lia le s q u e ra tin o sa s h um a na s . E s tos re su lta d o s ind ican q ue Y 022 /C D 3 p u e d e u n irse e sp e c ífica m e n te a c é lu la s tu m o ra le s q u e e xp re sa n E G F R h u m a n o m u ta n te y q ue so b re e xp re sa n E G F R , p ero no a te jid o s q u e e xp re sa n n o rm a lm e n te EG FR.
A d e m á s, Y 022 /C D 3 ta m b ié n p ue de u n irse a le u co c ito s m o n o m o rfo n u c le a re s en la sa n g re p e rifé rica (P B M C ) h um a n o s o c é lu la s Ju rka t ( lin fo c ito s T de le u ce m ia en la sa n g re p e rifé rica h um a no s , C D 3 p o s itivo s ) co m o se m u e s tra en la figu ra , lo q ue su g ie re q ue e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l de la p re se n te inve nc ión p ue de u n irse e sp e c ífica m e n te al a n tíg e n o C D3 de la su p e rfic ie de lin fo c ito s T.
Los p lá sm id o s de e xp re s ió n se c o n s tru ye ro n de a cu e rd o con los m é to d o s m e n c io n a d o s en los e je m p lo s 7 y 8, re sp e c tiva m e n te (Y 022 en los e je m p lo s 7 y 8 se re m p la za ro n con o tra s fo rm a s m u ta d a s de a n ticu e rp o s ), y M 14/C D 3 , M 15/C D 3 , M 25 /C D 3 , M 26 /C D 3 , S 7 /C D 3 , S 8 /C D 3 , S 17 /C D 3 , S 22 /C D 3 , S 23 /C D 3 , S 29 /C D 3 se e xp re sa ro n y p u rifica ron . De a cu e rd o con el m é to do de e s te e je m p lo , las ca p a c id a d e s de u n ión de e s to s a n ticu e rp o s a U 87 -E G F R v III que s o b re e xp re sa E G F R vIII y a c é lu la s C A L 27 q u e so b re e xp re sa n de fo rm a e n d ó g e n a E G F R se d e te rm in a ro n re sp e c tiva m e n te . Los a n ticu e rp o s a n te r io re s p u d ie ro n u n irse a e s ta s d os cé lu la s , y sus va lo re s de in te n s id a d m e d ia de f lu o re sc e n c ia (IM F) se m u es tra n en la ta b la 13.
T a b la 13
Figure imgf000024_0001
Ejem plo 10. A nális is de actividad b io lógica de anticuerpo b ifuncional m onocatenario , tal com o Y022/C D 3 -cito toxic idad contra diversas célu las tum orales
Se a is la ro n le u co c ito s m o n o m o rfo n u c le a re s en la sa n g re p e rifé ric a (P B M C ) de sa n g re de d o n a d o re s h um a n o s sanos s ig u ie n d o p ro ce d im ie n to s co n v e n c io n a le s u sa n d o ce n tr ifu g a c ió n en g ra d ie n te de d e n s id a d de F ico ll (de B ioch ro m ). D e sp u é s de ce n trifu g a c ió n , las c é lu la s se lava ron con so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to (P B S ) a una c o n ce n tra c ió n de 0,1 M y d e s p u é s se re su sp e n d ie ro n en m e d io c o m p le to RPM I 1640 (G ibco ) y la c o n ce n tra c ió n c e lu la r se a ju s tó h as ta 5 x105/m l. Los PB M C s irv ie ro n co m o cé lu la s e fe c to ra s en e xp e rim e n to s de c ito to x ic id a d . D ife re n te s c é lu la s tu m o ra le s a c túan co m o c é lu la s d ia n a . La c o n ce n tra c ió n de c é lu la s d ia n a se a ju s tó h as ta 5 x104/m l con m edio co m p le to R PM I 1640. S e m e zc ló e l m ism o v o lu m e n de c é lu la s d ia n a y c é lu la s e fe c to ra s de m o do q ue la re lac ió n de c é lu la s e fe c to ra s :c é lu la s d ia n a (E : T ) fu e ra 10: 1.
La su sp e n s ió n c e lu la r m e zc la d a se a ñ a d ió a u n a p la ca de 96 p o c illo s en un v o lu m e n de 75 p l/p o c illo . D e sp u é s se a ñ a d ie ro n 25 pl d e l s ig u ie n te re ac tivo d ilu id o en se rie d ie z v e c e s de 1000 ng/m l a 0,1 ng /m l a ca d a p oc illo :
(1) A n tic u e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio Y 022 /C D 3 (B iTe );
(2) M e d io co m p le to RPM I 1640 (fo nd o);
(3) A n tic u e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio N G R /C D 3 (co n tro l neg a tivo , N G R e ra un p é p tid o de d ire cc ió n n e o va s cu la r q ue no tie n e s itio de u n ión c ru za d a con E G F R , y se p re p a ra de a cu e rd o con un m é to do c o n ve n c io n a l)
D espu és de incu b a c ió n d u ra n te 40 hora s en u n a e s tu fa de in cu b a c ió n a 37 °C, 5 % de C O 2, se e n sa yó la c ito to x ic id a d d e l a n ticu e rp o u sa n d o e l k it de e n sa yo de c ito to x ic id a d no ra d ia c tiva C y to T o x 96 ® (de P ro m e ga ) de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s d e l fa b rica n te .
El e n sa yo de c ito to x ic id a d no ra d ia c tiva C y to T o x 96 ® es un e n sa yo de b ase co lo rim é tr ic a q ue p ue de re m p la z a r el e n sa yo de lib e ra c ió n de 51C r. El e n sa yo C y to T o x 96 ® m ide la lac ta to d e s h id ro g e n a s a (LD H ) cu a n tita tiva m e n te . LDH es u n a e n z im a c ito s ó lic a e s ta b le q u e se libe ra tra s la lis is de las c é lu la s y se libe ra de la m ism a m a n e ra en q ue se libe ra e l 51 C r ra d ia c tivo . El so b re n a d a n te con m e d io de LDH lib e ra d a p ue de d e te c ta rse m e d ia n te u n a reacc ión e n z im á tic a a co p la d a de 30 m in u to s en q ue LDH co n v ie rte u na sa l de te tra z o lio (IN T) en un fo rm a z a n o ro jo. La ca n tid a d de p ro d u c to ro jo p ro d u c id o es p ro p o rc io n a l al n úm e ro de c é lu la s lisadas.
S e u sa ro n c in co c é lu la s tu m o ra le s a so c ia d a s a E G F R e n u m e ra d a s en la ta b la 3 a co n tin u a c ió n p a ra a n a liza r la ca p a c id a d d e s tru c tiv a de los tu m o re s de los lin fo c ito s T m e d ia d a p o r el a n ticu e rp o b ifu n c io n a l Y 022 /C D 3 de la p rese n te inve n c ió n y e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l m o n o ca te n a rio N G R /C D 3 q u e no e s tá a so c ia d o con E G F R co m o con tro l, re sp e c tiva m e n te .
La ta s a de d e s tru cc ió n de c é lu la s tu m o ra le s (es d ec ir, % de c ito to x ic id a d ) se c a lcu ló b a sá n d o se en la s ig u ie n te fó rm u la p ro p o rc io n a d a en e l m a nu a l d e l e n sa yo de c ito to x ic id a d no ra d ia c tiva G 1780 C y to T o x 96® :
% de c ito tox ic ida d^ [(experimental - célula electora espontáneamente - célula diana espontáneamente (/(célula diana máxima - célula diana esponlánoamente)|xlOO
en la que :
"E x p e rim e n ta l" se re fie re a la libe ra c ión de LDH p ro d u c id a en los p o c illo s e xp e rim e n ta le s , en q ue se a ña d ie ro n a n tic u e rp o /c é lu la s e fe c to ra s /c é lu la s d iana,
"cé lu la e fe c to ra e sp o n tá n e a m e n te " se re fie re a la lib e ra c ió n de LDH p ro d u c id a p o r las c é lu la s e fe c to ra s e sp o n tá n e a m e n te ,
"cé lu la d ia n a e sp o n tá n e a m e n te " se re fie re a la lib e ra c ió n de LDH p ro d u c id a p o r c é lu la s q ue no se tra ta n m e d ia n te o tro s fa c to re s ,
"cé lu la d ia n a m á x im a " se re fie re a la libe ra c ión de LDH re su lta n te de la lis is co m p le ta de c é lu la s d ia n a d e sp u é s de tra ta m ie n to con T rito n X -100 al 0 ,8 %,
"cé lu la d ia n a m á x im a - cé lu la d ia n a e sp o n tá n e a m e n te " se re fie re a la libe ra c ión de LDH re su lta n te de la lis is co m p le ta de c é lu la s d e sp u é s de tra ta m ie n to e x te rno .
T a b la 3
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0002
Los re su lta d o s de la ta b la 3 a n te r io r m u es tra n q u e to d a s las c é lu la s tu m o ra le s q u e e xp re sa n E G F R m u ta n te y /o q ue s o b re e xp re sa n E G F R , ta le s co m o U 87 -E G F R v III, U 87 -E G F R y A 431 , se d e s tru irá n e sp e c ífica m e n te p o r lin fo c ito s T d ir ig id o s p o r e l a n ticu e rp o b ifu n c io n a l Y 022 /C D 3.
E sp e c ífica m e n te , en e l g ru p o de c é lu la s tu m o ra le s a n te r io r tra ta d o con Y 022 /C D 3 , la c ito to x ic id a d e sp e c ífica m ín im a fu e de un 32,1 % y la m á x im a fu e de un 66 ,2 % . M ie n tra s q ue la c ito to x ic id a d de Y 022 /C D 3 c o n tra las c é lu la s que e xp re sa n b a jos n ive les de E G F R , U 87 y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h um a n o s fu e m u y b a ja a un 3 ,4 % y un 4 ,5 %, re sp e c tiva m e n te , q u e e ra s ig n ifica tiva m e n te m e n o r q ue la de las c é lu la s m u ta n te s m e n c io n a d a s a n te r io rm e n te que e xp re sa n E G F R y /o s o b re e xp re sa n EG FR .
M ás e sp e c ífica m e n te , e l % de c ito to x ic id a d de Y 022 /C D 3 y e l a n ticu e rp o de co n tro l N G R /C D 3 a d ive rsa s c o n c e n tra c io n e s c o n tra ca d a tu m o r se m u e s tra en las ta b la s 4 -8 a co n tin u a c ió n .
Figure imgf000026_0001
T a b la 7
Figure imgf000027_0001
T a b la 8
Figure imgf000027_0002
A d e m á s, se re a lizó a n á lis is de c ito to x ic id a d in vitro m e d ia n te e l m ism o m é to do en los s ig u ie n te s B iTe e xp re sa d o s y p u rif ica d o s : M 14 /C D 3 , M 15 /C D 3 , M 25 /C D 3 , M 26 /C D 3 , S 7 /C D 3 , S 8 /C D 3 , S 17 /C D 3 , S 22 /S 29 /C D 3 , y los re su lta d o s se m u e s tra n en la fig u ra 9.
C om o p u e d e o b se rva rse en la fig u ra 9, las c é lu la s tu m o ra le s q u e e xp re sa n E G F R m u ta do y /o q ue so b re e xp re sa n E G F R , ta le s co m o U 87 -E G F R v III, U 87 -E G F R y C A L27 , p ue de n d e s tru irse m e d ia n te lin fo c ito s T d ir ig id o s p o r los a n ticu e rp o s e sp e c ífico s b ifu n c io n a le s M 14 /C D 3 , M 15 /C D 3 , M 25 /M 26 /C D 3 , S 7 /C D 3 , S 8 /C D 3 , S 17 /C D 3 , S 22 /C D 3 , S 23 /C D 3 , S 29 /C D 3 a g ra d o s d ife re n te s . M ie n tra s q u e p a ra U 87, u n a c é lu la q ue e xp re sa n ive les b a jo s de EG F R , hay p o co e fe c to d e s tru c tivo .
E je m p lo 11. C o n s t r u c c ió n d e p lá s m id o le n t iv í r ic o q u e e x p re s a la p ro te ín a d e re c e p to r q u im é r ic o d e a n t íg e n o s c o d if ic a d a p o r e l á c id o n u c le ic o d e la p re s e n te in v e n c ió n y e m p a q u e ta d o d e l v iru s
La c o n s tru cc ió n de l re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s , y el o rde n de co n e x ió n de los re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o e je m p lific a d o s en la p re se n te inve nc ión , se m u e s tra en la ta b la 9 y fig u ra 10.
T a b la 9
Figure imgf000027_0003
1. A m plificación de fragm entos de ácido nucleico
(1) A m plificación de secuencias de scFv
Y 022 scF v se o b tu vo p o r PCR u sa n d o el p lá sm id o p C a n ta b 5 E -Y 022 co m o m o lde con un c e b a d o r d ire c to (S E Q ID N O : 24, q u e co m p re n d e p a rte de la s e cu e n c ia d e l p é p tid o señ a l de C D 8 ) y un c e b a d o r in ve rso (S E Q ID N O : 25, que co m p re n d e p arte de la se cu e n c ia de la b isa g ra de C D 8).
S E Q ID N O : 24 (T G C T C C A C G C C G C C A G G C C G G A T A T T C A G A T G A C C C A G )
S E Q ID N O : 25 (C G C G G C G C T G G C G T C G T G G T G C T G C T C A C G G T C A C )
(2) Secuencias de ácido nucle ico de otras partes del receptor qu im érico de antígenos
Las s e cu e n c ia s de á c id o n u c le ico de o tra s p a rte s de la p ro te ín a d e l re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s a n ti-E G F R v III e xce p to Y 022 scF v se o b tu v ie ro n re sp e c tiva m e n te p o r PC R u sa n d o las s e cu e n c ia s S E Q ID N O : 26, 27, 28, 29 y 30 d iv u lg a d a s en la so lic itu d de p a te n te n.° 201310164725.X co m o m o lde s. E sp e c ífica m e n te , la s e cu e n c ia de e G F P -F 2 A -C D 8 sp se o b tu vo p o r a m p lif ica c ió n p o r PC R u sa n d o e l p lá sm id o de S E Q ID N O : 27 co n te n id o en la so lic itud de p a te n te n.° 201310164725.X co m o m o lde y p a re s de ce b a d o re s (S E Q ID N O : 26 y 27). C D 8 -C D 35 ze ta (5Z) se o b tu vo p o r a m p lif ica c ió n p o r PC R u sa n d o e l p lá sm id o de S E Q ID N O : 26 en la so lic itud de p a te n te C N 201310164725.X com o m o lde y p a re s de ce b a d o re s (S e Q ID N O : 28 y 29). Los C D 8 -C D 3 ze ta (Z), C D 8 -C D 137 -C D 3 ze ta (B B Z ), C D 28 a -C D 28 b -C D 3 ze ta (28Z ) y C D 28 a -C D 28 b -C D 137 -C D 3 ze ta (28B B Z ) se o b tu v ie ro n p o r a m p lifica c ió n p o r PCR re sp e c tiva m e n te u sa n d o S E Q ID N O : 27, S E Q ID N O : 28, S E Q ID N O : 29 y S E Q ID N O : 30 en la so lic itu d de p a ten te C N 201310164725.X co m o m o lde s y p a re s de c e b a d o re s (S E Q ID N O : 28, 30).
S E Q ID N O : 26 (T G C A G T A G T C G C C G T G A A C )
S E Q ID N O : 27 (C G G C C T G G C G G C G T G G A G C A )
S E Q ID N O : 28 (A C C A C G A C G C C A G C G C C G C G A C C A C )
S E Q ID N O : 29 (G A G G T C G A C C T A C G C G G G G G C G T C T G C G C T C C T G C T G A A C T T C A C T C T )
S E Q ID N O : 30 (G A G G T C G A C C T A G C G A G G G G G C A G G G C C T G C A T G T G A A G )
2. C orte y em palm e de fragm ento s de ácido nucleico
El fra g m e n to de á c id o n u c le ico de e G F P -F 2 A -C D 8 s p o b te n id o co m o se d e sc rib e a n te r io rm e n te y e l fra g m e n to de ácido n u c le ico de Y 022 scF v e q u im o la r y los fra g m e n to s de á c id o n u c le ico de C D 8 -C D 35 ze ta (5Z) o C D 8 -C D 3 ze ta (Z) o C D 8 -C D 137 -C D 3 ze ta (B B Z ) o C D 28 a -C D 28 b -C D 3 ze ta (28Z ) o C D 28 a -C D 28 b -C D 137 -C D 3 ze ta (28B B Z ) e q u im o la re s se so m e tie ro n a co rte y e m p a lm e de tre s s e g m e n to s y PC R co m o se m u e s tra en la fig u ra 9 en las s ig u ie n te s co n d ic io n e s : P re d e sn a tu ra liza c ió n : 94 °C d u ra n te 4 m in ; d e sn a tu ra liz a c ió n : 94 °C d u ra n te 40 s; h ib rid ac ió n : 60 °C d u ra n te 40 s; e x te n s ió n : 68 °C d u ra n te 140 s d u ra n te 5 c ic lo s y d e sp u é s e x te n s ió n to ta l a 68 °C d u ra n te 10 m in. A D N p o lim e ra sa y c e b a d o r d ire c to (S E Q ID N O : 24) y c e b a d o r in ve rso (el c e b a d o r in ve rso co rre sp o n d ie n te a C D 8 -C D 35 ze ta e ra s Eq ID N O : 29, y o tro e ra S E Q ID n O: 30) se c o m p le m e n ta ro n , y d e sp u é s se re a lizó PC R d u ra n te 30 c ic lo s con las co n d ic io n e s de a m p lif ica c ió n : P re d e sn a tu ra liza c ió n : 94 °C d u ra n te 4 m in ; d e sn a tu ra liz a c ió n : 94 °C d u ra n te 40 s; h ib rid a c ió n : 60 °C d u ra n te 40 s; e x te n s ió n : 68 °C d u ra n te 140 s d u ra n te 30 c ic lo s y d e s p u é s e x te n s ió n to ta l a 68 °C d u ra n te 10 m in . Los fra g m e n to s a m p lif ica d o s se re m iten a (ta b la 2):
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -5 Z (S E Q ID N O : 31),
e G F P -F 2 A -Y 022 scF v -Z (S E Q ID N O : 32),
e G F P -F 2 A -Y 022 scF v -B B Z (S E Q ID N O : 33),
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -28 Z (S E Q ID N O : 34),
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -28 B B Z (S E Q ID N O : 35).
3. C onstrucción de vector p lasm ídico lentivírico
A m o do de e je m p lo , e l s is te m a de v e c to r u sa do p a ra los v e c to re s p la sm íd ico s le n tiv ír ico s co n s tru id o s a co n tin u a c ió n p e rte n e ce al s is te m a de v e c to r le n tiv ír ico a u to in a c tiv a d o r de la te rce ra g e n e ra c ió n , q u e tie n e tre s p lá sm ido s , c o n c re ta m e n te , p lá sm id o de e m p a q u e ta d o p sP A X 2 q u e co d ific a la p ro te ín a G a g /P o l, q ue c o d ific a la p ro te ín a R ev (de a d d g e n e ); el p lá sm id o de e n v u e lta P M D 2.G q u e c o d ific a la p ro te ín a V S V -G (de a d d g e n e ); y e l v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te q u e c o d ific a e l g en de in te ré s C A R b a sa d o en el v e c to r v a c ío p W P T -e G F P (de a dd ge ne ).
En el v e c to r v a c ío p W P T -e G F P , la e xp re s ió n de p ro te ín a f lu o re sc e n te ve rd e p o te n c ia d a (e G F P ) se re g u la m e d ia n te el p ro m o to r de l fa c to r- la de e lo n g a c ió n (E F -1a ). D e sp u é s de in se rta r las co n s tru c c io n e s co n s tru id a s co m o se d e sc rib e en e s te e je m p lo en un v e c to r va c ío , se fo rm ó un v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te q ue co d ifica C A R d e l gen d ia n a , en el q ue la co e xp re s ió n de e G F P y e l g en d ia n a C A R se co n s ig u e m e d ia n te sa lto r ib o só m ico de la se cu e n c ia d e l v iru s de la fie b re a fto sa (F M D V , F2A ). F2A es u n a se c u e n c ia ce n tra l de 2A (o "p o lip é p tid o de a u to e sc is ió n 2A ") de l v iru s de la fie b re a fto sa q ue p osee la fu n c ió n de "a u to co rte " de 2A q u e p o s ib ilita la c o e xp re s ió n g é n ica en d ire cc ió n 5 ' y en d ire cc ió n 3'. 2A p ro p o rc io n a u n a e s tra te g ia e fica z y v ia b le p a ra c o n s tru ir v e c to re s p o lic is tró n ico s p a ra g e n o te ra p ia d e b id o a su a lta e fic a c ia de co rte , a lto e q u ilib r io de e xp re s ió n g é n ica en d ire cc ió n 5' y en d ire cc ió n 3' y se cu e n c ia co rta p o r s í m ism os . E sp e c ia lm e n te en in m u n o te ra p ia b a sa d a en lin fo c ito s T m o d ifica d o s con el g en d e l re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s, e s ta se cu e n c ia se u sa fre cu e n te m e n te p a ra c o n s e g u ir la co e xp re s ió n de l gen d ia n a con G F P o e G F P . La e xp re s ió n de C A R p ue de d e te c ta rs e in d ire c ta m e n te d e te c ta n d o G F P o e G F P .
En e s te e je m p lo , se c o n s tru yó un v e c to r de e xp re s ió n le n tiv ír ico q ue c o e x p re s a e G F P y C A R e sp e c ífico ligado p o r F2A, d e n o m in a d o co le c tiv a m e n te p W P T -e G F P -F 2 A -C A R . El g en d ia n a e G F P -F 2 A -C A R (vé ase 2 en e l e je m p lo 7, el co m p o n e n te d e sp u é s de F2A se a b re v ia co m o C A R ) o b te n id o en la e ta p a 2 a n te r io r se d ig irió d o b le m e n te m e d ia n te las e n z im a s de re s tr icc ió n M luI y S a l I y se ligó en e l m ism o v e c to r p W P T d ig e rid o d o b le m e n te p a ra c o n s tru ir un v e c to r le n tiv ír ico q u e e xp re sa c a d a re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s . El v e c to r c o n s tru id o se ide n tificó m e d ia n te d ig e s tió n con M luI y S a l I y se se cu e n c ió c o rre c ta m e n te , q u e e s ta b a lis to p a ra e m p a q u e ta d o len tiv ír ico . C om o se m e nc ion a a n te r io rm e n te , se tra n s c rib ió e G F P -F 2 A -C A R en un A R N m , p ero fin a lm e n te se tra d u jo en d o s c a d e n a s p e p tíd ica s de e G F P y re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s a n ti-E G F R v III, d o n d e e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s a n ti-E G F R v III se lo ca liza rá b a jo la g u ía d e l p é p tid o señ a l de C D 8 a en la m e m b ra n a ce lu la r.
Los v e c to re s q ue co n tie n e n los C A R d e se a d o s son co m o s igu e (los c o m p o n e n te s d e sp u é s de F2A p ue de n a b re v ia rse co m o C A R ):
p W P T -e G F P -F 2 A -Y 022 scF v-5Z ;
p W P T -e G F P -F 2 A -Y 022 scF v-Z ;
p W P T -e G F P -F 2 A -Y 022 scF v-B B Z ;
p W P T -e G F P -F 2 A -Y 022 scF v-28 Z ;
p W P T -e G F P -F 2 A -Y 022 scF v-28 B B Z .
Se o b tu v ie ro n re sp e c tiva m e n te 5 s e cu e n c ia s p o lip e p tíd ica s de e G F P -F 2 A -C A R a tra vé s de la co n s tru cc ió n a n te rio r, q ue se d e n o m in a n :
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -5 Z (S E Q ID N O : 36);
e G F P -F 2 A -Y 022 scF v -Z (S E Q ID N O : 37);
e G F P -F 2 A -Y 022 scF v -B B Z (S E Q ID N O : 38);
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -28 Z (S E Q ID N O : 39);
e G F P -F 2 A -Y 022 s cF v -28 B B Z (S E Q ID N O : 40).
4. Lentivirus de em paquetado de 293T transfectad as con p lásm ido
C é lu la s H E K -293 T (A T C C : C R L -11268 ) c u ltiva d a s en el p ase 6 a pase 10 se se m b ra ro n a u n a d e n s id a d de 6 x 106 en p la cas de 10 cm y se cu ltiva ro n d u ra n te u na n oche a 37 °C en un 5 % de C O 2 p a ra tra n s fe c c ió n . El m e d io fue D M E M (d isp o n ib le en PA A ) q u e co n te n ía su e ro b o v in o fe ta l (a d q u ir id o en PA A ) al 10 % .
Las e ta p a s de tra n s fe cc ió n son co m o s igu e :
4.1 P re pa ra c ión de líqu ido A : se d isu e lve n 10 gg de co n tro l s im u la d o o 10 gg de c a d a uno de los p lá sm id o s g é n ico s d e se a d o s p W P T -e G F P -F 2 A -C A R con 7 ,5 gg de l p lá sm id o de e m p a q u e ta d o P A X 2: y 3 gg de p lá sm id o de e n v u e lta p M D 2.G en 800 g l de m e d io D M E M s in sue ro y se m e zc la b ien .
4.2 P re pa ra c ión de líqu ido B: se d isu e lve n 60 gg de PEI (p o lie tile n im in a , a d q u ir id a en P o lysc ie n ce s ) en 800 gl de m e d io D M E M sin sue ro , se m e zc la su a ve m e n te y se in cu b a a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 5 m in.
4.3 F o rm a c ió n de co m p le jo de tra n s fe c c ió n : se a ña de líqu ido A en líqu ido B y se m e zc la n su a ve m e n te , se a g itan con v ó rtic e o se m e zc lan su a ve m e n te in m e d ia ta m e n te d e sp u é s de la a d ic ión , se incu ba n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 20 m in.
4.4 Se a ña de n g o ta a g o ta 1,6 ml de l co m p le jo de tra n s fe cc ió n en c é lu la s H E K -293 T , y d e sp u é s de 4 -5 h, se a m b ia a D M E M con FBS al 2 % p a ra c é lu la s 293 T tra n s fe c ta d a s .
A l s ig u ie n te d ía d e sp u é s de la tra n s fe c c ió n , se o b se rvó la e fic a c ia de tra n s fe cc ió n (es d ec ir, la p ro p o rc ió n de cé lu la s flu o re sc e n te s ve rd e s ): ~ 80 % de la e fic a c ia de tra n s fe cc ió n p o s itiv a re p re se n ta los e xp e rim e n to s de tra n s fe cc ió n s a tis fa c to rio s . D e spu és de 72 h de tra n s fe c c ió n , el v iru s se re cog ió p o r f iltra c ió n u sa n d o un f iltro de 0 ,45 gm (d ispo n ib le en M illip o re C o rp o ra tio n ) y se ce n tr ifu g ó a 28 000 rpm u sa n d o u na u ltra c e n tr ifu g a d o ra B e ckm a n O p tim a L -100 X P d u ra n te 2 hora s a 4 °C. El so b re n a d a n te se d e sca rtó y e l se d im e n to re su lta n te se ce n tr ifu g ó a 1/10 ~ 1 /50 de so lu c ió n m a dre de A IM -V (a d q u ir id o en Inv itro g e n ) y se re su sp e n d ió a 100 g l/tu b o en -80 °C p a ra v a lo ra c ió n d e l v iru s o in fe cc ió n de lin fo c ito s T.
5. D eterm inación de valores cuantitativos de lentiv irus em paquetados con sim ulación o eG FP-F2A-CA R
En el p rim e r d ía , se ino cu la ro n c é lu la s 293 T a 1 x 105/m l en p la cas de c u ltivo de 96 p oc illos , 100 g l/p o c illo , y se cu ltiva ro n a 37 °C, 5 % de C O 2, y e l m e d io de c u ltivo e ra D M E M q u e co n te n ía sue ro b o v in o fe ta l al 10 % . A l s ig u ie n te d ía , se d e sca rta ro n 50 g l/p o c illo de so b re n a d a n te de cu ltivo , se co m p le m e n ta ro n 50 g l/p o c illo de m e d io re c ie n te y h ab ía p o lib re n o a c o n ce n tra c ió n f in a l de 6 g g /m l co n te n id o . El c u ltivo se incu bó d u ra n te 30 m in a 37 °C con un 5 % de C O 2. Se a ñ a d ie ro n 10 g l/p o c illo de so lu c ió n m a dre de v iru s o 1 g l/p o c illo de c o n ce n tra d o de v iru s (d ilu id o 3 ve ce s , 6 g ra d ie n te s , d o s p o c illo s re p lica d o s) y se incu ba ro n a 37 °C en un 5 % de C O 2. A las 48 h d e sp u é s de la in fe cc ió n , se d e te c tó e G F P p o r c ito m e tría de flu jo , las c é lu la s con un 5 a un 20 % de la ta s a p o s itiva son a p ro p ia d a s p a ra c a lc u la r e l v a lo r cu a n tita tivo (U /m l) = ta s a p o s itiva x fa c to r de d ilu c ió n x 100 x 104. Los va lo re s cu a n tita tiv o s de v iru s q ue co m p re n d e el co n tro l de v e c to r v a c ío s im u la d o m e n c io n a d o a n te r io rm e n te y c a d a e G F P -F 2 A -C A R e m p a q u e ta d o en el m é to d o de tra n s fe c c ió n de PEI e ra n a m bo s de a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 a 1x 107 U /m l, y e l v a lo r cu a n tita tivo de v iru s d e te c ta d o d e sp u é s de la c o n ce n tra c ió n fu e a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 ~ 1 x 108 U /m l.
Ejem plo 12. L infocitos T infectados por lentivirus recom binante
S e o b tu v ie ro n le u co c ito s m o n o m o rfo n u c le a re s en la sa n g re p e rifé rica h u m a n o s de sa n g re p e rifé rica h u m a n a sa n a p o r ce n tr ifu g a c ió n en g ra d ie n te de d e n s id a d (a p o rta d o p o r S ha n g h a i B lood C e n te r) y se a ñ a d ie ro n en m e d io de lin fo c ito s A IM -V (a d q u ir id o en Inv itro ge n ) a u n a d e n s id a d de a p ro x im a d a m e n te 2 x 106/m l y se a ñ a d ie ro n . Las m ic ro e s fe ra s m a g n é tica s re cu b ie rta s con a n ticu e rp o s a n ti-C D 3 y C D 28 (In v itro g e n ) se a ña d ie ro n en u n a re lac ió n de 1: 1 de cé lu la s a m ic ro e s fe ra s m a g n é tica s , y se a ñ a d ió IL-2 h u m a n a re co m b in a n te (a d q u ir id a en S h a n g h a i H ua x in B io te ch n o lo g y Co., Ltd. ) a u n a c o n ce n tra c ió n fin a l de 300 U /m l p a ra e s tim u la c ió n y c u ltivo d u ra n te 48 h. Y d e sp u é s los lin fo c ito s T se in fe c ta ro n con el le n tiv iru s re co m b in a n te a n te r io r (M O I = 15). Los lin fo c ito s T in fe c ta do s se d e te c ta ro n p o r c ito m e tría de flu jo en e l d ía 8 de cu ltivo p a ra la e xp re s ió n de d ife re n te s re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s . C om o e G F P se c o e x p re s a b a con C A R , las c é lu la s e G F P -p o s itiv a s d e te c ta d a s e ran c é lu la s p o s itiva s q ue e xp re sa b a n re ce p to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s . U sa nd o lin fo c ito s T sin in fe c ta r co m o co n tro l n eg a tivo , las ta sa s p o s itiva s de lin fo c ito s T in fe c ta d o s con v iru s q u e e xp re sa n d ife re n te s re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s se m u es tra n en la ta b la 10. Los re su lta d o s de ta s a p o s itiva m u e s tra n q u e u na d e te rm in a d a ta s a p o s itiva de lin fo c ito s C A R T p ue de o b te n e rse p o r in fe cc ió n con len tiv irus .
Figure imgf000030_0001
Los lin fo c ito s T se in fe c ta ro n con v iru s q u e te n ía n d ife re n te s re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s e m p a q u e ta d o s , re sp e c tiva m e n te , y d e sp u é s se su b cu ltiva ro n a u n a d e n s id a d c e lu la r de 5 x 105/m l en d ía s a lte rn os , se co n ta ro n y se co m p le m e n ta ro n con IL-2 (co n ce n tra c ió n f in a l de 300 U /m l). En el 11.° d ía de cu ltivo , se o b tu v ie ro n a p ro x im a d a m e n te 100 ~ 1000 v e ce s de a m p lifica c ió n , lo q u e ind ica q ue los lin fo c ito s T q u e e xp re sa n d ife re n te s re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s p ue de n e xp a n d irse en u na d e te rm in a d a ca n tid a d in vitro, q u e g a ra n tiz a p o s te rio re s e n sa yo s de to x ic id a d in vitro y e xp e rim e n to s in vivo.
Ejem plo 13. A ctividad antitum oral in vitro de CAR-Y022
Los e xp e rim e n to s de to x ic id a d in vitro u sa ro n los s ig u ie n te s m a te ria le s :
Las c é lu la s d ia n a fu e ro n c é lu la s U 87, U 87 -E G F R , U 87 -E G F R v III, A 431 , C A L 27, M D A -M B -468 , R W PE-1 y q u e ra tin o c ito p rim a rio h u m a n o K 2 co m o se m u e s tra en la ta b la 5, re s p e c tiv a m e n te . Las c é lu la s e fe c to ra s fue ro n lin fo c ito s T ( lin fo c ito s C A R T) c u ltiv a d o s d u ra n te 12 d ía s in vitro, q u e e ran p o s itivo s al re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s d e te c ta d o p o r F A C S .
Las re la c io n e s de e fe c to r a d ia n a fu e ro n 3: 1, 1: 1 y 1: 3, re sp e c tiva m e n te . El n úm e ro de c é lu la s d ia n a fu e 10000 /p oc illo , y c a d a g ru p o te n ía 5 p o c illo s re p lica do s. El t ie m p o de d e te cc ió n fu e 18 h.
C a d a g ru p o e xp e rim e n ta l y ca d a g ru p o de co n tro l se e n u m e ra n co m o s igu e :
C a d a g ru p o e xp e rim e n ta l: ca d a c é lu la d ia n a lin fo c ito s C A R T q u e e xp re sa n d ife re n te s re cep to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s ;
G ru p o de co n tro l 1: c é lu la s d ia n a con lib e ra c ió n m á x im a de LDH;
G ru p o de co n tro l 2: c é lu la s d ia n a con lib e ra c ió n e sp o n tá n e a de LD H ;
G ru p o de co n tro l 3: c é lu la s e fe c to ra s con lib e ra c ió n e sp o n tá n e a de LDH.
M é to do de d e te cc ió n : Se u sa e n s a y o de c ito to x ic id a d no ra d ia c tiva C y to T o x 96 ® (P ro m e g a ), q u e es un e n sa yo de b ase co lo rim é tr ic a q u e p u e d e re m p la z a r e l e n sa yo de lib e ra c ió n de 51C r. El e n sa yo C y to T o x 96 ® m ide la lac ta to d e s h id ro g e n a s a (L D H ) cu a n tita tiva m e n te . LDH es u na e n z im a c ito s ó lic a e s ta b le q ue se libe ra tra s la lis is de las cé lu las y se libe ra de la m ism a m a n e ra en q ue se lib e ra e l 51 C r ra d ia c tivo . El so b re n a d a n te con m e d io de LDH lib e ra d a p uede d e te c ta rs e m e d ia n te u n a re acc ión e n z im á tic a a co p la d a de 30 m in u to s en q u e LDH co n v ie rte u n a sal de te tra z o lio (IN T) en un fo rm a z a n o ro jo. La ca n tid a d de p ro d u c to ro jo p ro d u c id o es p ro p o rc io n a l al n úm e ro de c é lu la s lisad as . Los d e ta lle s p u e d e n e n co n tra rse en las in s tru cc io n e s d e l k it de d e te cc ió n de c ito to x ic id a d no ra d ia c tiva C y to T o x 96.
La c ito to x ic id a d se ca lc u la com o :
% d e r i t o x í c i d a d = [ ( g r u p o e x p e r i m e n t a l - g r u p o d e c o n t r o l 2 - g r u p o d e c o n t r o l 3 ) /
(grupo de control I - grupo de control 2 )]x'IÜÜ
E sp e c ífica m e n te , com o se m u e s tra en la ta b la 11 y la ta b la 12, en c o m p a ra c ió n con 806 -C A R T, Y 022 -28 Z C A R T e Y 022 -28 B B Z C A R T q ue e xp re sa n re ce p to re s q u im é ric o s de a n tíg e n o s de la p re se n te inve n c ió n a d ife re n te s re lac io ne s de e fe c to r a d ia n a m o stra ro n e fe c to s d e s tru c tivo s s ig n ifica tivo s sob re c é lu la s q u e e xp re sa n e le va d a m e n te E G F R y E G F R vIII y u n a d e p e n d e n c ia de l g ra d ie n te de la re lac ió n de e fe c to r a d ia n a , es d ec ir, cu a n to m a yo r sea la re lac ió n de e fe c to r a d ia n a , m ás fu e rte s se rán los e fe c to s c ito tó x ico s . Los d a to s de d e p e n d e n c ia de la re lac ió n de e fe c to r a d ia n a d e m u e s tra n a d ic io n a lm e n te los e fe c to s c ito tó x ico s e sp e c ífico s de lin fo c ito s C A R T q u e e xp re sa n re ce p to re s q u im é rico s de a n tíg e n o s de la inve nc ión sob re c é lu la s q ue e xp re sa n e le v a d a m e n te E G F R y sus va ria n te s .
Es d e s ta c a b le q ue Y 022 -C A R T no tie n e cas i e fe c to d e s tru c tiv o sob re c é lu la s R W PE-1 q ue e xp re sa n n o rm a lm e n te E G F R y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h u m a n o s K2. A la re lac ió n de e fe c to r a d ia n a de 3: 1, la c ito to x ic id a d de l lin fo c ito con re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s Y 022 -28 B B Z C A R T co n tra c é lu la s R W PE-1 y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h um a n o s K2 fu e de un 12 % y un 2 % , re sp e c tiva m e n te . La c ito to x ic id a d de los lin fo c ito s Y 022 -28 Z C A R T c o n tra c é lu la s RW PE-1 y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h u m a n o s K2 fu e de un 8 % y un 3 % . P o r e l co n tra r io , 806 -C A R T te n ía g ra d o s d ife re n te s de c ito to x ic id a d en e s ta s d o s cé lu la s . La c ito to x ic id a d de los lin fo c ito s 806 -28 B B Z C A R T co n tra c é lu la s R W PE-1 y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h um a n o s K2 fu e de un 25 % y un 22 % , re sp e c tiva m e n te , y la c ito to x ic id a d de los lin fo c ito s 806 -28 Z C A R T c o n tra c é lu la s R W PE-1 y q u e ra tin o c ito s p rim a rio s h u m a n o s K2 fu e de un 15 % y un 13 %, re sp e c tiva m e n te .
A d e m á s, C A R T, co m o co n tro l n eg a tivo , tra n s fe c ta d o con un v iru s q ue c o n tie n e el p lá sm id o s im u la d o (que p o rta scF v-Y 022 -5 Z ) m o stró e fe c to s c ito tó x ico s m u y b a jos sob re las líne as c e lu la re s a n te rio res .
Los re su lta d o s a n te r io re s ind ican q u e e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s Y 022 -C A R T, q u e se co n s tru ye a p a rtir de un a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio c o n tra E G F R y sus va r ia n te s , p u e d e d e s tru ir se le c tiv a m e n te las c é lu la s tu m o ra le s que e xp re sa n e le v a d a m e n te E G FR y su v a r ia n te (E G F R vIII), m ie n tra s q u e a p e n a s d e s tru ye cé lu la s q u e e xp re sa n n o rm a lm e n te EG F R . A d e m á s, a p a rtir de los d a to s de c ito to x ic id a d , e l C A R T de la te rce ra g e n e ra c ió n (Y 022 -28 B B Z ) e ra m ás c ito tó x ic o s co n tra las c é lu la s d ia n a q u e e l C A R T de s e g u n d a g e n e ra c ió n (Y 022 -28Z ).

Claims (17)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un a n ticu e rp o q ue re co n o ce e sp e c ífica m e n te E G F R vIlI e xp re sa d o o E G F R so b re e xp re sa d o p o r c é lu la s tu m o ra le s , en e l q ue e l a n ticu e rp o co m p re n d e u n a reg ión va r ia b le de la c a d e n a lig e ra y u na reg ión va r ia b le de la ca d e n a p esad a , y
la CDR1 de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u n a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o que c o n s is te en S E Q ID N O : 41, S E Q ID N O : 47, S E Q ID N O : 55;
la C D R 2 de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u n a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o que c o n s is te en S E Q ID N O : 42, S E Q ID N O : 53;
la C D R 3 de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra tie n e u n a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g ru p o que c o n s is te en S E Q ID N O : 43, S E Q ID N O : 48, S E Q ID N O : 54, S E Q ID N O : 56, S E Q ID N O : 57;
la CDR1 de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a tie n e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 44;
la C D R 2 de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a tie n e u na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g rup o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 45, S E Q ID N O : 49, S E Q ID NO : 51, S E Q ID N O : 52;
la C D R 3 de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a tie n e u na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se le cc io n a d a de un g rup o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 46, S E Q ID N O : 50;
p re fe rib le m e n te , e l a n ticu e rp o inc lu ye :
a n ticu e rp o (a), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 46,
a n ticu e rp o (b), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 47, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 48, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 49, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (c), en el q u e la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 48, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (d), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (e), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 43, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (f), en el q u e la re g ión v a r ia b le de la c a d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 53, C D R 3 de S E Q ID N O : 54, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (g), en el q ue la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID NO : 42, C d R3 de S E Q ID N O : 54, y la reg ión va r ia b le de la c a d e n a p e sa d a d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 51, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (h), en el q ue la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 55, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 45, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (i), en el q ue la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 53, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50,
a n ticu e rp o (j), en el q ue la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra de l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 56, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50, o
a n ticu e rp o (k), en el q u e la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra d e l m ism o tie n e CDR1 de S E Q ID N O : 41, C D R 2 de S E Q ID N O : 42, C D R 3 de S E Q ID N O : 57, y la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l m ism o tie n e C D R 1 de S E Q ID N O : 44, C D R 2 de S E Q ID N O : 52, C D R 3 de S E Q ID N O : 50.
m á s p re fe rib le m e n te , la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a del a n ticu e rp o se m u es tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 13; y la se c u e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lig e ra de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 13;
La se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 59; y la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 59;
La se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p os ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 61; y la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 61;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 63; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 63;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 65; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 65;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 67; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 67;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 69; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 69;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 71; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 71;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 73; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 73;
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 75; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 75; o
La s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la re g ión v a r ia b le de la ca d e n a p e sa d a de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 77; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la c a d e n a lige ra d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID N O : 77.
2. El a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1, en el q ue e l a n ticu e rp o es a n ticu e rp o (a); m ás p re fe rib le m e n te , la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p e sa d a d e l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 124 a 239 de S E Q ID N O : 13; y la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión v a r ia b le de la ca d e n a lige ra de l a n ticu e rp o se m u e s tra en las p o s ic io n e s 1 -108 de S E Q ID NO : 13.
3. U n á c id o n u c le ico q u e co d ific a el a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2.
4. U n v e c to r de e xp re s ió n q u e co m p re n d e el á c id o n u c le ico de la re iv in d ica c ió n 3.
5. U na cé lu la h o sp e d a d o ra , q ue co m p re n d e el v e c to r de e xp re s ió n de la re iv in d ica c ió n 4 o q u e tie n e e l á c ido n uc le ico de la re iv in d ica c ió n 3 in te g ra d o en su g en om a .
6. U so d e l a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2 p a ra la fa b ric a c ió n de un fá rm a c o de d ire cc ió n , c o n ju g a d o de a n ticu e rp o y fá rm a c o o a n ticu e rp o m u ltifu n c io n a l q ue se d ir ig e e sp e c ífica m e n te a c é lu la s tu m o ra le s q ue e xp re sa n E G F R vIII o q ue so b re e xp re sa n E G F R ; o
p a ra la fa b ric a c ió n de un a g e n te p a ra e l d ia g n ó s tic o de tu m o re s q ue e xp re sa n E G F R vIII o so b re e xp re sa n E G F R ; o p a ra la fa b rica c ió n de un in m u n o c ito m o d ifica d o con re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s ; p re fe rib le m e n te , e l inm un oc ito inc lu ye : lin fo c ito T, lin fo c ito N K o lin fo c ito NKT.
7. Un in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l, q u e co m p re n d e :
e l a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2; y
u na m o lé cu la fu n c io n a l liga d a al m ism o ; y la m o lé cu la fu n c io n a l se s e le cc io n a de un g ru p o q u e co n s is te u n a m o lécu la q u e se d ir ige a un m a rc a d o r de s u p e rfic ie tu m o ra l, u n a m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l, u na m o lé cu la q ue se d ir ig e a un m a rc a d o r de su p e rfic ie de un inm un oc ito , un m a rc a d o r d e te c ta b le ;
p re fe rib le m e n te , la m o lé cu la q u e se d ir ig e al m a rc a d o r de s u p e rfic ie tu m o ra l es un a n ticu e rp o o liga n do q ue se u ne a un m a rc a d o r de su p e rfic ie tu m o ra l; o
la m o lé cu la de su p re s ió n tu m o ra l es u n a c ito c in a a n titu m o ra l o u n a to x in a a n titu m o ra l; p re fe rib le m e n te , las c ito c in a s inc lu ye n , a u n q u e sin lim itac ió n : IL-12, IL-15, IF N -be ta , T N F -a lfa ; o
el m a rc a d o r d e te c ta b le inc lu ye un m a rc a d o r flu o re sc e n te y un m a rc a d o r c ro m o g é n ico ; o
la m o lé cu la q ue se d ir ige al m a rc a d o r de su p e rfic ie d e l in m u n o c ito es un a n ticu e rp o o ligando q u e se u ne a un m a rc a d o r de su p e rfic ie de in m u n o c ito ; p re fe rib le m e n te , los m a rca d o re s de su p e rfic ie de in m u n o c ito s in c lu ye n : C D 3, C D 16, C D 28; o
el in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l es un p o lip é p tid o de fu s ió n , y co m p re n d e a d e m á s un p é p tid o c o n e c to r e n tre el a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2 y la m o lé cu la fu n c io n a l liga d a al m ism o;
m á s p re fe rib le m e n te , en el q ue la m o lé cu la q u e se d ir ig e al m a rc a d o r de su p e rfic ie de l in m u n o c ito es un a n ticu e rp o q u e se u ne a un m a rc a d o r de su p e rfic ie de lin fo c ito s T, q u e fo rm a un a n ticu e rp o b ifu n c io n a l de a co p la m ie n to a lin fo c ito s T con el a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2;
m á s p re fe rib le m e n te , e l a n ticu e rp o q ue se une al m a rc a d o r de su p e rfic ie de in m u n o c ito s es un a n ticu e rp o a n ti-C D 3.
8. Un á c ido n uc le ico q ue co d ific a e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l de la re iv in d ica c ió n 7.
9. U so d e l in m u n o co n ju g a d o m u ltifu n c io n a l de la re iv in d ica c ió n 7 p a ra la p re p a ra c ió n de un a g e n te a n tin e o p lá s ico , o p a ra la p re p a ra c ió n de un a g e n te p a ra e l d ia g n ó s tico de tu m o re s q u e e xp re sa n E G F R vIII o s o b re e xp re sa n E G F R ; o p a ra la p re p a ra c ió n de in m u n o c ito s m o d ifica d o s con re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s ; p re fe rib le m e n te , los in m u n o c ito s inc lu ye n lin fo c ito T, lin fo c ito NK o lin fo c ito N KT.
10. Un re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s e xp re sa d o en la su p e rfic ie de un in m u n o c ito , q ue co m p re n d e e l a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2, en e l q ue e l re c e p to r q u im é rico de a n tíg e n o s c o m p re n d e : e l a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2, u n a re g ión tra n s m e m b ra n a r ia y u n a reg ión de señ a l in trace lu la r, q u e se ligan se cu e n c ia lm e n te ;
p re fe rib le m e n te , la re g ión de se ñ a l in tra c e lu la r se s e le cc io n a de un g ru p o q ue c o n s is te en se cu e n c ia s de reg ión de señ a l in tra c e lu la r de CD3Z, FceR Iy , C D 27, C D 28 , C D 137 y C D 134, o u n a c o m b in a c ió n de las m ism as ;
m á s p re fe rib le m e n te , la reg ión tra n s m e m b ra n a r ia co m p re n d e u na reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de C D 8 o C D 28 ; o los in m u n o c ito s inc lu ye n lin fo c ito T, lin fo c ito N K o lin fo c ito N K T ; o
el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e e l s ig u ie n te a n ticu e rp o , reg ión tra n s m e m b ra n a r ia y re g ión de señ a l in tra c e lu la r u n id o s s e cu e n c ia lm e n te :
a n ticu e rp o de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 -4, C D 8 y CD3Z;
a n ticu e rp o de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 -4, C D 8, C D 137 y CD3Z;
a n ticu e rp o de u na cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-4, u na reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de u n a m o lé cu la C D 28, u na re g ión de se ñ a l in tra c e lu la r de u n a m o lé cu la C D 28 , y CD3Z; o
a n ticu e rp o de u na cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-4, u na reg ión tra n s m e m b ra n a r ia de u n a m o lé cu la C D 28, u na re g ión de se ñ a l in tra c e lu la r de u n a m o lé cu la C D 28 , C D 137 y CD3Z; o
el a n ticu e rp o es un a n ticu e rp o m o n o ca te n a rio o un a n ticu e rp o de d o m in io ; o
el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s co m p re n d e :
S E Q ID N O : 36 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -601 ; o
S E Q ID N O : 37 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -702 ; o
S E Q ID N O : 38 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -744 ; o
S E Q ID N O : 39 o la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -749 ; o
S E Q ID N O : 40 o la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m o s tra d a en las p o s ic io n e s 285 -791.
11. Un á c ido n uc le ico q ue c o d ific a e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la re iv in d ica c ió n 10.
12. Un v e c to r de e xp re s ió n q u e co m p re n d e el á c id o n u c le ico de la re iv in d ica c ió n 11.
13. Un v iru s q ue co m p re n d e e l v e c to r de la re iv in d ica c ió n 12.
14. U so d e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la re iv in d ica c ió n 10 o e l á c id o n u c le ico de la re iv in d ica c ió n 11, o el v e c to r de e xp re s ió n de la re iv in d ica c ió n 12, o e l v iru s de la re iv in d ica c ió n 13, p a ra la p re p a ra c ió n de in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te q ue se d ir ig e n a c é lu la s tu m o ra le s q ue e xp re sa n E G F R vIII o s o b re e xp re sa n EG FR .
15. Un in m u n o c ito m o d ifica d o g e n é tica m e n te , en e l q u e se tra n s d u c e con el á c id o n u c le ico de la re iv in d ica c ió n 11, o e l v e c to r de e xp re s ió n de la re iv in d ica c ió n 12 o e l v iru s de la re iv in d ica c ió n 13; o
e xp re sa e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la re iv in d ica c ió n 10 en su su p e rfic ie ;
p re fe rib le m e n te , e l in m u n o c ito p o rta a d e m á s u na se cu e n c ia co d ific a n te e xó g e n a de c ito c in a ; p re fe rib le m e n te , la c ito c in a inc lu ye : IL-12, IL -15 o IL -21 ; o
el in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s o tro re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o q u e no c o n tie n e CD3Z, p e ro c o n tie n e e l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C D 28 , e l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C D 137 , o u n a c o m b in a c ió n de a m bo s; o
el in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s un re ce p to r de q u im io c in a s ; p re fe rib le m e n te , e l re ce p to r de q u im io c in a s inc lu ye C C R 2; o
el in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s A R N ip q u e p ue de re d u c ir la e xp re s ió n de PD-1 o u n a p ro te ín a q u e p ue de b lo q u e a r PD-L 1 ; o
el in m u n o c ito e xp re sa a d e m á s un c o n m u ta d o r de se g u rid a d ; p re fe rib le m e n te , el c o n m u ta d o r de se g u rid a d inc luye ica sp a sa -9 , E G F R tru n c a d o o R Q R 8.
16. U so de los in m u n o c ito s m o d ifica d o s g e n é tic a m e n te de la re iv in d ica c ió n 15 p a ra la p re p a ra c ió n de un fá rm a co s in h ib id o r de tu m o re s , y d ich o tu m o r es e l tu m o r q u e e xp re sa E G F R vIII o so b re e x p re s a EG FR.
17. U na co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica , q ue co m p re n d e :
el a n ticu e rp o de la re iv in d ica c ió n 1 o 2 o un á c id o n uc le ico q ue co d ific a e l a n ticu e rp o ; o
e l in m u n o co n ju g a d o de la re iv in d ica c ió n 7 o un á c ido n uc le ico q u e co d ific a e l c o n ju g a d o ; o
el re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s de la re iv in d ica c ió n 10 o un á c id o n u c le ico q u e co d ific a e l re ce p to r q u im é rico de a n tíg e n o s ; o
el in m u n o c ito m o d ifica d o g e n é tic a m e n te de la re iv in d ica c ió n 15.
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