ES2872048T3

ES2872048T3 - Métodos celulares para acoplar interacciones de proteínas y selección y diversificación de moléculas de unión

Info

Publication number: ES2872048T3
Application number: ES19020049T
Authority: ES
Inventors: Aires Da Silva Frederico Nuno Castanheira; Côrte-Real Sofia Volker; Gonçalves João Manuel Braz; De Oliveira Soraia Rafaela Santiago
Original assignee: Technophage Investigacao e Desenvolvimento em Biotecnologia SA
Current assignee: Technophage Investigacao e Desenvolvimento em Biotecnologia SA
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: WO2014133405A3; PT3588089T; US20140249044A1; JP2016511405A; US9487773B2; EP3588089B1; EP2962103A2; EP3588089A1; WO2014133405A2

Abstract

Un método para producir diversidad o variabilidad genética en anticuerpos mediante la modificación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las inmunoglobulinas, comprendiendo el método: (a) introducir en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican CDR, una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc para generar una o más secuencias de sitios diana no idénticos dentro de la una o más secuencias de ácido nucleico que codifican CDR para unir una o más nucleasas de dedos de cinc (ZFN), produciendo así CDR que comprenden secuencias de ácido nucleico modificadas, y (b) expresar en una célula, un ácido nucleico que codifica al menos un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o al menos un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada de (a) en condiciones en las que la ZFN expresada se une y escinde la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada dentro de la secuencia del sitio de destino, expresando dicha célula una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) en la que se introducen las secuencias de sitio diana del dominio de unión al ADN de dedo de cinc de (a) operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de escisión del ADN para una enzima de restricción de tipo IIS, en la que la escisión del ADN realizada por la ZFN viene determinada por las secuencias de sitio diana dentro de la secuencia de ácido nucleico modificada que codifica la CDR de (a).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos celulares para acoplar interacciones de proteínas y selección y diversificación de moléculas de unión

LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. La copia ASCII del listado de secuencias, creada el 28 de febrero de 2014, se denomina 14116-105012_SL.txtytiene un tamaño de 19.349 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para seleccionar una molécula de unión, tal como un anticuerpo, en un entorno celular, en donde la molécula de unión se une específicamente a una molécula diana, tal como una proteína de unión a ligando o su ligando afín, así como a métodos para generar diversidad genética en una o más moléculas de unión, tales como anticuerpos o partes funcionales de los mismos, que tienen especificidad por una molécula diana particular, por ejemplo, una proteína o antígeno, y que tienen el potencial de mejorar las propiedades o actividades de unión y/o funcionales.

Antecedentes de la invención

Desde el descubrimiento de la tecnología del hibridoma en 1975 y con el posterior desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante, los genes que codifican proteínas de unión, en particular los anticuerpos, se han alterado mediante ingeniería genética para manipular la proteína de unión o el anticuerpo de alguna manera, por ejemplo, reducción de tamaño, tal como un fragmento variable monocatenario (scFv) o fragmentos variables de la cadena ligera (VL) y de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo; reconstruidos para obtener reactivos multivalentes de elevada avidez; y fusión con una variedad de moléculas (por ejemplo, enzimas, toxinas). Además, se han desarrollado varios métodos de selección y enfoques experimentales para seleccionar anticuerpos monoclonales (mAbs) con mayor afinidad y especificidad.

Las técnicas de selección de anticuerpos que utilizan una biblioteca de anticuerpos pueden realizarse totalmente in vitro, sin necesidad de transformación en células, o bien in vivo, donde las células pueden transformarse, por ejemplo, utilizando vectores que codifican una biblioteca de anticuerpos. La selección de anticuerpos in vitro incluye técnicas tales como la expresión de ARN y ADN en ribosomas, mientras que la selección de anticuerpos in vivo incluye técnicas como la expresión en fagos, los sistemas de dos híbridos, la expresión en células, por ejemplo, en células de bacterias, levaduras o mamíferos y los ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA). La expresión en fagos se utiliza ampliamente debido a su simplicidad, versatilidad y capacidad de adaptación a muchas condiciones específicas. Las plataformas de expresión en células de levaduras, bacterias y mamíferos ofrecen una ventaja sobre la expresión en fagos en el sentido de que la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) puede combinarse con la expresión del anticuerpo en la superficie celular para permitir la supervisión tanto de la expresión de del anticuerpo sobre la superficie celular como de la capacidad de dicho anticuerpo para unirse a su diana. Por otro lado, la tecnología de expresión ribosómica permite el cribado de bibliotecas más grandes y facilita la diversidad y la maduración eficaz de anticuerpos in vitro.

Aunque se han seleccionado grandes cantidades de anticuerpos mediante diversas tecnologías, se debe mejorar o potenciar la afinidad de la mayoría de ellos. Dicha mejora en la afinidad de los anticuerpos y la posterior selección del anticuerpo específico se consiguen normalmente mediante el uso de uno o más métodos, sistemas o tecnologías tales como la multimerización de anticuerpos; cepas mutantes de E. coli; líneas de linfocitos B, por ejemplo, células RAMOS, DT-40 o HEK293T y citidina desaminasa inducida por activación (AID); sistemas de presentación en retrovirus; PCR propensa a errores; barajado de cadenas de inmunoglobulina o CDR; mutagénesis dirigida.

El documento WO2010/135558 divulga métodos para diversificar una parte de un polipéptido mediante la inserción de una secuencia diversificada de origen sintético o natural sin necesidad de modificar la secuencia polipeptídica original. El documento WO2010/135558 no divulga las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc ni las nucleasas en dedo de cinc. Tomoyuki Igawa et al. (2011) divulga la genomanipulación de las regiones variables de anticuerpos de IgG terapéuticos para mejorar la heterogeneidad. Tomoyuki Igawa et al. (2011) no divulga las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc ni las nucleasas en dedo de cinc. El documento US5830721 divulga un método para generar bibliotecas de anticuerpos expresados FER adecuados para el cribado según interacciones de afinidad. El documento US5830721 no divulga las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc ni las nucleasas en dedo de cinc. Katrin Voigt et al. (2012) divulga un método de redireccionamiento de inserciones de transposones inactivos mediante dominios de unión al ADN en dedo de cinc genomanipulados. Katrin Voigt et al. (2012) no divulga la diversidad genética de los anticuerpos ni la producción de variabilidad. Katrin Voigt et al. (2012) no divulga las CDR. Wu J. et al. (2007) divulga nucleasas de dedos de cinc diseñadas a medida. Wu J. et al. (2007) no divulga la diversidad genética de los anticuerpos ni la producción de variabilidad. Wu J. et al. (2007) no divulga las CDR.

A pesar de las diversas metodologías desarrolladas para mejorar la afinidad y la posterior selección de los anticuerpos, siguen existiendo problemas importantes. Algunos ejemplos de problemas que se han detectado y notificado incluyen la potencia/afinidad, la expresión, el plegado correcto y las modificaciones posteriores a la traducción de los anticuerpos aislados. Por lo tanto, se necesitan procesos mejorados y nuevos para seleccionar anticuerpos específicos y funcionales y optimizarlos, así como otros tipos de moléculas de unión, en particular para su utilidad terapéutica. Por lo tanto, es importante desarrollar nuevas estrategias relacionadas con métodos mejorados y útiles para introducir diversificación en los genes o secuencias de ácidos nucleicos que codifican moléculas de unión, tales como anticuerpos, y proporcionar métodos novedosos y eficaces para seleccionar las moléculas expresadas, en particular para generar productos biológicos terapéuticos nuevos, mejorados y útiles.

Resumen de la invención

La invención proporciona una tecnología de plataforma intracelular y métodos para la expresión y selección eficaz de una molécula de unión, tal como una molécula de anticuerpo o inmunoglobulina, un mimético de anticuerpo u otro tipo de molécula de reconocimiento/unión, que se une a una molécula específica de la diana, tal como una proteína, polipéptido o péptido diana, dentro del entorno de una célula. La tecnología y los métodos de la invención proporcionan además un medio para la diversificación genética de la molécula de unión, o un fragmento o porción de la misma, tal como un anticuerpo, y la selección tras su unión a una molécula diana dentro del entorno de una sola célula. Debe entenderse que el término "una célula", tal como se usa en el presente documento, puede abarcar una célula, o una sola célula, en una población de células o una línea celular, o puede abarcar un conjunto, población o pluralidad de células, tal ER como una línea celular que comprende una pluralidad de células individuales.

La invención proporciona además métodos para seleccionar una molécula de unión, tal como un anticuerpo, mediante el uso de tecnología recombinante, maquinaria celular y mecanismos celulares para localizar dentro de la célula la diana de la molécula de unión, por ejemplo, un elemento de una pareja de unión a ligando en donde un elemento es, por ejemplo, una proteína de unión a ligando y el otro elemento es su ligando afín. De acuerdo con los métodos de la invención, la molécula de unión, tal como un anticuerpo, se une específicamente a su diana, que puede ser la proteína de unión a ligando, por ejemplo, una proteína del receptor, o el ligando afín de la pareja de unión a ligando que interactúa. En una realización, la diana es el ligando afín que queda retenido en un orgánulo celular como el retículo endoplásmico (RE) o el aparato de Golgi. En una realización, la diana es la proteína del receptor. En una realización, la molécula de unión, o una parte de unión de la misma, queda retenida en el orgánulo celular, por ejemplo, el RE o el aparato de Golgi. En una realización, la unión de la molécula de unión, tal como un anticuerpo, o una parte de unión del mismo, a su diana altera, neutraliza o bloquea la unión o la interacción entre la proteína de unión a ligando y su ligando afín, dando como resultado la aparición en la superficie celular del elemento de la pareja de unión no retenido o localizado en la célula. La alteración o bloqueo de la unión y la aparición del elemento de la pareja de unión en la superficie de la célula es indicativa de la actividad de unión específica de la molécula de unión, tal como un anticuerpo, o una parte de unión de la misma, a su diana y permite seleccionar la célula de la molécula de unión como el efector de la actividad de alteración, neutralización o bloqueo, basándose en la detección del elemento de la pareja de unión no retenido o localizado en la célula.

En uno de sus aspectos, la invención proporciona un método de selección que emplea la inactivación genética de la expresión de proteínas receptoras celulares, proteínas unidas a la superficie de la membrana celular, antígenos o proteínas ligando mediante un anticuerpo, o un elemento de una biblioteca de anticuerpos, o una parte funcional de los mismos, o mediante un anticuerpo genéticamente diversificado, o un elemento de una biblioteca de anticuerpos genéticamente diversificados, todos los cuales se pueden expresar simultáneamente en la misma célula. Las proteínas expresadas del receptor de la célula, las proteínas unidas a la superficie de la membrana celular o las proteínas ligando están diseñadas molecularmente mediante ingeniería genética para contener y expresar secuencias o etiquetas de señal de retención, que permiten que estas proteínas se expresen, por ejemplo, como proteínas de fusión que tienen una señal de retención y que quedan selectivamente retenidas en un orgánulo celular, como el RE o el aparato de Golgi. En una realización, un elemento de una biblioteca de anticuerpos o un elemento de una biblioteca de moléculas de unión a ligando puede expresarse simultáneamente en la célula junto con su molécula diana, por ejemplo, una proteína del receptor celular, una proteína unida a la superficie de la membrana celular o un antígeno en una célula.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona métodos de selección que aprovechan las interacciones específicas entre proteínas y, opcionalmente, interacciones naturales entre proteínas en el interior de una célula. Las proteínas pueden ser antígenos diana que son reconocidos por una molécula de unión, tal como un anticuerpo, o un fragmento de unión o una parte del mismo. Dichas interacciones con antígenos diana incluyen, sin limitación, la interacción entre una proteína del receptor celular concreta, o una proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la membrana plasmática, con su ligando o proteína afín ("elemento de la pareja de unión"). En el entorno de la célula, un antígeno diana puede estar unido mediante una molécula de unión, tal como un anticuerpo, o mediante un elemento de una biblioteca de anticuerpos o una biblioteca de otras moléculas de unión, todas las cuales se pueden expresar simultáneamente en la misma célula. En una realización, dentro de una célula, la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo o una parte de unión del mismo, se une bien a la proteína del receptor celular o bien a la proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la membrana plasmática como diana, o al ligando o proteína afín como diana. Esta unión de la molécula de unión o anticuerpo altera, bloquea, neutraliza o inhibe la interacción de unión que se produce de forma típica entre la proteína del receptor celular o la proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la membrana plasmática y su ligando o proteína afín. En una realización, la molécula de unión, el anticuerpo o una parte de unión del mismo se unen al ligando afín. En una realización, la molécula de unión, el anticuerpo o una parte de unión del mismo se unen a la proteína del receptor celular o a la proteína del receptor.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método de selección que implica la retención intracelular de una proteína de unión a ligando, o receptor, que se expresa normalmente en la superficie celular, por su ligando afín tras la interacción de la proteína del receptor con su ligando afín, y la inhibición de la interacción entre la proteína del receptor con su ligando afín mediante una molécula de unión, o un fragmento de unión o una parte de la misma, dando como resultado la aparición y detección de la proteína del receptor en la superficie celular. La molécula de unión, o un fragmento de unión o una parte de la misma, puede ser un elemento de una biblioteca de moléculas de unión, como una biblioteca de anticuerpos, o un elemento de una biblioteca de moléculas de unión genéticamente diversificada, como una biblioteca de anticuerpos diversificada. Dentro de una célula, el anticuerpo, o elemento de la biblioteca, reconoce y se une a la proteína de unión al ligando o a su ligando afín, todos ellos expresados simultáneamente en la misma célula. En un aspecto de la invención, la proteína de unión al ligando o el ligando afín queda retenido en el retículo endoplásmico (RE) de la célula debido a la unión operativa o fusión con una secuencia de señalización de retención en el RE.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para introducir variabilidad y diversificación genética de forma molecular una molécula de unión, en particular, un anticuerpo, o un fragmento de unión o parte funcional del mismo, o una biblioteca de los mismos. La molécula de unión, el anticuerpo o la biblioteca de los mismos diversificada se puede utilizar en los métodos de selección de la invención descritos en el presente documento para seleccionar e identificar una molécula de unión, o un elemento de una biblioteca de moléculas de unión, que tenga una unión y/o actividad potencialmente mejorada u óptima hacia una molécula diana, como una proteína del receptor expresada en la superficie celular, o el ligando de dicha proteína del receptor. Los métodos pueden generar poblaciones de moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, que tengan mayor diversidad y que se puedan cribar o seleccionar según propiedades mejoradas u optimizadas, tales como la especificidad de la diana, la unión y/o las propiedades funcionales.

Los métodos de selección de moléculas de unión que tienen especificidad para unirse a moléculas diana de acuerdo con la invención son especialmente adecuados para seleccionar uno o más de los anticuerpos genéticamente diversificados que se describen en el presente documento. En un aspecto, la variabilidad genética y la diversificación de una molécula de unión a anticuerpo se lleva a cabo mediante la introducción de sitios de reconocimiento de los dedos de cinc de la proteína las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), por ejemplo, CDR1 y/o CDR3, de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, es decir, VH y/o VL, respectivamente, para generar CDR modificadas. La alteración genética se induce mediante el direccionamiento de secuencias de reconocimiento diseñadas molecularmente mediante ingeniería genética al interior de una o más de las CDR y se lleva a cabo mediante la creación de novedosas nucleasas de dedos de cinc (ZFN) y su actividad de escisión asociada. En una realización y como se describe en el presente documento, una o más de las CDR está diseñada molecularmente mediante ingeniería genética para contener una o más secuencias de reconocimiento de los dedos de cinc de la proteína de unión al ADN como secuencias del sitio diana. En una realización, dos sitios de escisión ZFN comprenden cada CDR en un dominio de anticuerpo VH o VL. Por ejemplo, si una región VL comprende una CDR modificada, dicha CDR se diseña molecularmente mediante ingeniería genética para que contenga dos sitios de reconocimiento de dedos de cinc diana, de manera que un par de ZFN generados de acuerdo con la invención se escindan en o cerca de los dos sitios de reconocimiento dentro de la CDR.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para seleccionar una molécula de unión que bloquea o altera pe una interacción entre una proteína del receptor expresada en la superficie celular y su ligando afín dentro de una célula, en donde el método comprende expresar en la misma célula una proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la célula; expresar en la célula un ligando afín a la proteína del receptor, en donde el ligando afín está marcado molecularmente con una secuencia para retener el ligando en un orgánulo intracelular en condiciones que permitan la retención del ligando en el orgánulo y la interacción de la proteína del receptor y el ligando afín en el orgánulo de manera que la proteína del receptor también quede retenida dentro del orgánulo celular cuando se una al ligando marcado; introducir en la célula una molécula de unión que se une específicamente bien a la proteína del receptor o bien a la proteína ligando retenida en el orgánulo intracelular como su antígeno diana; y detectar el nivel de la proteína del receptor expresada en la superficie celular; en donde, si la molécula de unión se une bien a la proteína del receptor o bien al ligando y bloquea o altera su interacción en el orgánulo, la proteína del receptor pasa de esta manera por el orgánulo y se expresa y se puede detectar sobre la superficie celular. En consecuencia, la molécula de unión, que se ha unido a su antígeno diana, bloquea o altera la interacción entre la proteína del receptor y el ligando se puede seleccionar de la célula tras la detección de la presencia de la proteína del receptor sobre la superficie celular, por ejemplo, mediante la unión de una etiqueta detectable, citometría de flujo y expansión de las células por cultivo. En realizaciones, la retención se produce en el RE o el aparato de Golgi.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para detectar si una molécula de unión, o un fragmento o parte de unión de la misma, por ejemplo un anticuerpo, o una parte de unión del mismo, se une específicamente a una proteína diana expresada en la superficie celular dentro de una célula, en donde el método comprende expresar en una célula una proteína diana que se puede expresar en la superficie de la célula; expresar en la célula la molécula de unión, o un fragmento o parte de unión de la misma, que está molecularmente fusionado o acoplado a una secuencia para retener la molécula de unión en un orgánulo intracelular, por ejemplo, el RE o el aparato de Golgi. Por consiguiente, si la molécula de unión, o un fragmento o parte de unión de la misma, se une específicamente a la proteína diana en la célula, la proteína diana queda retenida en el orgánulo intracelular por su enlace a la molécula de unión, o el fragmento o parte de unión de la misma, que queda retenida en el orgánulo debido a su fusión con la señal de retención, impidiendo así la expresión de la proteína diana en la superficie celular. El nivel o cantidad de la proteína diana expresada en la superficie de la célula se puede detectar, por ejemplo, por métodos de detección adecuados como la citometría de flujo, de manera que un nivel bajo o prácticamente no detectable de la proteína diana detectado en la superficie de la célula con respecto a un control adecuado indica la unión de la proteína de unión, o un fragmento o parte de unión de la misma, a la molécula diana dentro de la célula.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la molécula de unión seleccionada, o una parte de unión de la misma, se puede recuperar o aislar de la célula. En otra realización, la molécula de unión se selecciona entre un anticuerpo, o un fragmento de unión o una parte del mismo, un elemento de una biblioteca de anticuerpos o un elemento de una biblioteca de anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo, dominios VL y/o VH. Dichos anticuerpos o bibliotecas pueden estar diversificados genéticamente. En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se selecciona entre un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo de cadena simple (Fv) o un diacuerpo. En otra realización, el fragmento o parte de unión se selecciona entre un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento variable monocatenario (scFv), un anticuerpo de dominio (dAb), un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) o una región determinante de la complementariedad (CDR). En una realización, la molécula de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión o parte del mismo, dirigido contra una molécula receptora de unión a ligando o una proteína del receptor, por ejemplo, la proteína del receptor del factor de necrosis tumoral alfa humano (receptor 1 del hTNF-a). En una realización, la molécula del receptor de unión al ligando o la proteína del receptor se puede expresar y/o se expresa en la superficie de una célula. En una realización, la molécula de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión o una parte del mismo, dirigido contra un ligando afín (o proteína del ligando) de la proteína del receptor de unión a ligando o proteína del receptor, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF-a). En otra realización, la molécula de unión es una molécula que no es un anticuerpo. En otra realización, la proteína del receptor o molécula diana es una proteína de un receptor humano seleccionado entre receptores de factores de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de enzimas, receptores de Fc, receptores de enzimas metabólicas, receptores de neurotransmisores, receptores de quimiocinas, receptores de citocinas, receptores de linfocinas, receptores de interleucinas, receptores de antígenos tumorales, receptores de antígenos supresores de tumores (por ejemplo, receptores de p53, Rb, k-Rev, DCC), receptores de proteínas de resistencia multifármaco, receptores de factores de coagulación, receptor del Factor VII, receptor del Factor VIII, receptor del Factor IX, receptores de factores tróficos, receptores de moléculas de reconocimiento o estimulación celular, receptores de apolipoproteínas, EGFR, ErbB-1R, HERI, HER2, aFGFR, bFGFR, NGFR, VEGFR, FltR, TGFR, TGFR-a-1, TGFR-p, TNFR (a), BDNFR, receptor de insulina, receptor del factor de crecimiento análogo a insulina (IGFR), PDGFR, HGFR, TRKR, BDNFR, CNTFR, GMFR, NT3R, NT5R, HARPR/pleiotrofinaR, receptores TIE, receptores Eph, receptores DDR, receptores ROR, receptores LTK, receptores AXL, receptores RET, receptores de tipo TOLL; receptores de hormonas seleccionados entre receptores de hormonas esteroides, receptores de hormonas tiroideas, receptores de melatonina; receptores adrenérgicos; receptores peptídicos seleccionados entre receptores de amilina, angiotensinógeno, angiotensina, péptido natriurético auricular, péptido natriurético cerebral, calcitonina, corticotropina, eritropoyetina, endotelina, encefalina, hormona estimulante del folículo, gastrina, grelina, glucagón, gonadotropina coriónica humana, inhibina, leptina, hormona luteinizante, hormona estimulante de los melanocitos, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, renina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides, hormona liberadora de tirotropina; receptores GP130 o IL6. En un ejemplo de realización, la proteína del receptor es el receptor 1 del factor de necrosis tumoral humano (receptor 1 del hTNF-a). En otra realización, la proteína ligando o molécula diana es una proteína ligando humana que es un ligando afín de uno de los tipos de moléculas receptoras mencionadas anteriormente. En otro ejemplo de realización, la proteína ligando o proteína diana es el factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF-a). En otra realización, la molécula de unión se une a una de las proteínas receptoras, o al ligando afín como proteína diana. En otra realización, el orgánulo intracelular es el retículo endoplásmico (RE) o el aparato de Golgi. En otra realización, el ligando afín está marcado molecularmente con una secuencia para retener el ligando en el retículo endoplásmico (RE). En otra realización, la secuencia de retención de ER es KDEL (SEQ ID NO:1).

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar si un anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se une específicamente a una molécula diana expresada en la superficie celular dentro de una célula, en donde el método comprende expresar en una célula una molécula diana que se puede expresar en la superficie de la célula; expresar en la célula un anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, fusionado a una secuencia de retención en el RE o aparato de Golgi; en donde, si el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se une específicamente a la proteína diana en la célula, la proteína diana queda retenida en el RE o aparato de Golgi por estar unida al anticuerpo, o a un fragmento o parte de unión del mismo, impidiendo así la expresión de la proteína diana en la superficie celular; y detectar el nivel de la proteína diana expresada en la superficie celular, de manera que un bajo o no detectable de la proteína diana detectado en la superficie celular, respecto de un control adecuado, indica la unión del anticuerpo, o del fragmento o parte de unión del mismo, a la molécula diana en la célula. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo se puede seleccionar desde el interior de la célula por métodos conocidos del experto en la técnica.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para seleccionar un anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, que se une específicamente a una proteína diana expresada en la superficie de una célula, en donde el método comprende establecer una línea celular que expresa la proteína diana en la superficie celular; en donde la proteína diana expresada en la superficie celular se puede detectar mediante una molécula de unión marcada de forma detectable; expresar en la línea celular un anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, para su selección según la unión a la proteína diana, en donde el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, está fusionado a una secuencia de señalización para retener el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, en un orgánulo intracelular en condiciones que permitan la interacción y la unión entre el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, y la proteína diana dentro del orgánulo y detectar el nivel de la proteína diana expresada en la superficie de la célula con la molécula de unión marcada de forma detectable; en donde si el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se une específicamente a la proteína diana en el orgánulo, la proteína diana queda retenida de forma vinculante en el mismo, disminuyendo o eliminando prácticamente de esta manera el nivel de expresión de la proteína diana en la superficie de la célula; e indicar la retención de un anticuerpo seleccionable, o un fragmento de unión del mismo, que se une específicamente a la proteína diana en la célula.

En una realización del método anteriormente definido, el método comprende además recuperar de las células el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, que se une específicamente a la proteína diana por métodos convencionales. En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, está fusionado a una secuencia de señalización para retener el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, en el orgánulo intracelular denominado retículo endoplásmico (RE). En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, está fusionado a la secuencia de señalización de KDEL (SEQ ID NO:1) que retiene el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, en el RE. En otra realización, la proteína diana es una proteína que se puede expresar en la membrana plasmática expresada en la superficie celular, por ejemplo, una proteína hTNF-a. En otra realización, la línea celular se infecta o transduce con una partícula lentivírica que codifica la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o un fragmento de unión o parte del mismo. En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, es un elemento de una biblioteca de anticuerpos o un elemento de una biblioteca que comprende fragmentos o partes de unión de anticuerpos, que pueden estar diversificados. En otra realización, el anticuerpo o un fragmento o parte de unión del mismo, es un dominio VL y/o VH del anticuerpo. En un ejemplo de realización, el anticuerpo o un fragmento o parte de unión del mismo, es un dominio VL y/o VH que se une a hTNF-a.

En otra realización, el anticuerpo o un fragmento o parte de unión del mismo, es un elemento de una biblioteca de dominios VL y/o VH. En un ejemplo de realización, el nivel de la proteína diana expresada en la superficie celular se detecta mediante citometría de flujo y un anticuerpo anti-hTNF-a marcado de forma detectable.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para seleccionar entre una pluralidad de moléculas de unión, una molécula de unión que se una a un antígeno diana que forma parte de un par de interacción que comprende una proteína de unión a receptor expresada en la superficie celular y su ligando afín. En consecuencia, el método comprende (a) introducir ácido nucleico que codifica una de una pluralidad de moléculas de unión en células que expresan la proteína de unión al receptor y el ligando afín, que está fusionado a una señal de retención que retiene el ligando afín en un orgánulo intracelular; (b) expresar en las células el ácido nucleico de (a), en donde una molécula de unión expresada se une a la proteína de unión al receptor o al antígeno diana del ligando afín retenido en el orgánulo y altera o bloquea la interacción entre la proteína de unión al receptor y el ligando afín; y (c) detectar el nivel de la proteína de unión al receptor expresada en la superficie celular; en donde, si la molécula de unión se une bien a la proteína de unión al receptor o bien al ligando afín en el orgánulo y altera o bloquea su interacción, la proteína de unión al receptor se expresa y se detecta en la superficie celular, y en donde la molécula de unión que altera o bloquea la interacción se puede seleccionar. En una realización, el ácido nucleico que codifica una de una pluralidad de moléculas de unión se introduce en las células mediante partículas de lentivirus que contienen el ácido nucleico. En una realización, el método comprende además recuperar o aislar la molécula de unión seleccionada de la célula. En una realización del método, la pluralidad de moléculas de unión se selecciona de una biblioteca de anticuerpos, una biblioteca de anticuerpos genéticamente diversificada, una biblioteca de anticuerpos de dominio único, una biblioteca de anticuerpos de dominio único genéticamente diversificada, una biblioteca VL, una biblioteca VL genéticamente diversificada, una biblioteca VH o una biblioteca VH genéticamente diversificada. En una realización específica, la pluralidad de moléculas de unión es una biblioteca VL, una biblioteca VL genéticamente diversificada, por ejemplo, como se ilustra en el presente documento por los dominios de unión VL del hTNF-a. En una realización, la molécula de unión o parte de unión de la misma se selecciona entre un anticuerpo o un fragmento o parte de unión del mismo. En una realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se selecciona entre un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano o un anticuerpo monocatenario. En una realización, el fragmento de unión o parte de anticuerpo se selecciona entre un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo de dominio (dAb), un diacuerpo, un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) o una región determinante de la complementariedad (CDR). En una realización, el fragmento de unión a anticuerpo o una porción del mismo es un dominio VL o un dominio VL genéticamente diversificado. En una realización, el fragmento de unión a anticuerpo o una porción del mismo es un dominio VH o un dominio VH genéticamente diversificado. En varias realizaciones, el orgánulo intracelular es el RE o el aparato de Golgi; el ligando afín está marcado molecularmente con una secuencia para retener el ligando en el RE; y la secuencia de retención del RE es KDEL (SEQ ID NO:1).

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para seleccionar entre una pluralidad de moléculas de unión, una molécula de unión o una parte de unión de la misma, que se une a un antígeno diana expresado en la superficie celular. En consecuencia, el método comprende introducir en células secuencias de ácido nucleico que codifican una de una pluralidad de moléculas de unión operativamente unidas a un ácido nucleico que codifica una señal de retención en el orgánulo intracelular, en donde las propias células expresan el antígeno diana que se puede expresar en la superficie celular; expresar en las células la pluralidad de moléculas de unión que comprenden la señal de retención; en donde, si una de la pluralidad de moléculas de unión comprende una molécula de unión, o una parte de unión de la misma, que se une específicamente a la proteína diana, la proteína diana queda retenida en el orgánulo celular por su unión a la molécula de unión, o una parte de unión de la misma, que está retenida en el orgánulo intracelular mediante su señal de retención expresada, impidiendo así tanto la salida de la proteína diana del orgánulo como la expresión de la proteína diana en la superficie celular; y detectar el nivel de la proteína diana expresada en la superficie celular. De acuerdo con el método, si se detecta un nivel bajo o no detectable de la proteína diana en la superficie de la célula con respecto a un control adecuado, esto indica la unión específica de la molécula de unión, o la parte de unión de la misma, a la molécula diana en la célula, en donde la molécula de unión, o la parte de unión de la misma, se selecciona según método y se puede aislar o recuperar de las células por métodos convencionales. En una realización, el ácido nucleico que codifica una de la pluralidad de moléculas de unión se introduce en las células mediante partículas de lentivirus que contienen el ácido nucleico. En una realización, el método comprende además recuperar o aislar la molécula de unión seleccionada de la célula. En una realización, la pluralidad de moléculas de unión se selecciona de una biblioteca de anticuerpos, una biblioteca de anticuerpos genéticamente diversificada, una biblioteca de anticuerpos de dominio único, una biblioteca de anticuerpos de dominio único genéticamente diversificada, una biblioteca VL, una biblioteca VL genéticamente diversificada, una biblioteca de dominios VH o una biblioteca VH genéticamente diversificada. En una realización la molécula de unión o parte de unión de la misma se selecciona entre un anticuerpo o un fragmento o parte de unión del mismo. En una realización, el anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, se selecciona entre un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano o un anticuerpo monocatenario. En una realización, el fragmento de unión o parte de anticuerpo se selecciona entre un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento de anticuerpo monocatenario (Fv), un anticuerpo de dominio (dAb), un diacuerpo, un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) o una región determinante de la complementariedad (CDR). En una realización, la pluralidad de moléculas de unión es una biblioteca VL de anticuerpos o una biblioteca VL genéticamente diversificada. En una realización, el fragmento de unión a anticuerpo o una porción del mismo es un dominio VL o un dominio VL genéticamente diversificado. En una realización, la pluralidad de moléculas de unión es una biblioteca VH de anticuerpos o una biblioteca VH genéticamente diversificada. En una realización, el fragmento de unión a anticuerpo o una porción del mismo es un dominio VH o un dominio VH genéticamente diversificado. En una realización, la señal de retención en los orgánulos intracelulares es una señal de retención en el retículo endoplásmico (RE) o en el aparato de Golgi. En una realización, la secuencia de retención de ER es KDEL (SEQ ID NO:1).

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para seleccionar entre una pluralidad de moléculas de unión, una molécula de unión que se una a un antígeno diana que forma parte de un par de interacción que comprende una proteína de unión a receptor expresada en la superficie celular y un ligando afín, comprendiendo el método: (a) coexpresión en una sola célula que expresa la proteína de unión al receptor: (i) secuencia de ácido nucleico que codifica una de una pluralidad de moléculas de unión, y (ii) secuencia de ácido nucleico que codifica un ligando afín de la proteína de unión al receptor, en donde la molécula de unión o el ligando afín se acopla operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de retención para retener (i) o (ii) en un orgánulo intracelular tras la expresión de (i) o (ii) en la célula; en condiciones que permitan la retención de la molécula de unión expresada o del ligando afín expresado en el orgánulo intracelular; en donde, si una molécula de unión expresada se une a la proteína de unión al receptor o al ligando afín como antígeno diana, dicha unión altera, neutraliza o bloquea la interacción natural entre la proteína de unión al receptor y el ligando afín y libera la proteína de unión al receptor de su interacción con el ligando afín para la expresión de la proteína de unión al receptor en la superficie celular y (b) detectar el nivel de la proteína de unión al receptor expresada en la superficie celular, de manera que un nivel de expresión de la proteína de unión al receptor de la superficie celular elevada indica la expresión y selección de una molécula de unión específica que se une al antígeno diana dentro de la célula. En una realización del método, la pluralidad de moléculas de unión se selecciona de una biblioteca de anticuerpos, una biblioteca de anticuerpos genéticamente diversificada, una biblioteca de anticuerpos de dominio único, una biblioteca de anticuerpos de dominio único genéticamente diversificada, una biblioteca de dominio VH, una biblioteca de dominio VH genéticamente diversificada, una biblioteca de dominio VH o una biblioteca de dominio VH genéticamente diversificada. En una realización, la molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión o parte del mismo, tal como un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento variable monocatenario (scFv), un diacuerpo, un anticuerpo de dominio (dAb), un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena pesada (VH) genéticamente diversificado, un dominio variable de cadena ligera (VL), un dominio variable de cadena ligera (VL) genéticamente diversificado o una región determinante de la complementariedad (CDR). En realizaciones, la molécula de unión es un dominio VL, un dominio VL genéticamente diversificado, un dominio VH o un dominio VH genéticamente diversificado. En realizaciones, la molécula de unión es un anticuerpo de longitud completa que comprende dominios variables de cadena ligera y dominios constantes de cadena ligera, y dominios variables de cadena pesada y dominios constantes de cadena pesada, tal como un anticuerpo de IgG o una subclase del mismo, por ejemplo, un anticuerpo de IgG1. En realizaciones, el orgánulo intracelular es el retículo endoplásmico (RE) o el aparato de Golgi y la señal de retención del orgánulo intracelular es una secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO:1). En realizaciones, el antígeno diana puede ser del tipo de proteínas receptoras o ligandos afines descritos en el presente documento.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método para prevenir o "desactivar" la expresión en la superficie celular de una proteína del receptor de unión a ligando, en donde el método comprende expresar en una célula la proteína del receptor de unión a ligando; expresar en la célula una proteína ligando que puede unirse a la proteína del receptor de unión a ligando, en donde la proteína ligando está fusionada a una secuencia de señalización exógena para retener la proteína ligando en un orgánulo intracelular en condiciones que permitan la interacción entre la proteína del receptor de unión a ligando y la proteína ligando en el orgánulo, medir el nivel de la proteína del receptor de unión a ligando expresada en la superficie celular; en donde la unión de la proteína del receptor de unión a ligando a la proteína ligando retenida en el orgánulo retiene paralelamente en el orgánulo la proteína del receptor de unión a ligando unida a la proteína ligando, impidiendo así o "desactivando" la expresión en la superficie celular de la proteína del receptor de unión a ligando.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para generar diversidad o variabilidad genética en una molécula de unión, o una parte de unión de la misma, tal como un anticuerpo, mediante la modificación de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las inmunoglobulinas, en donde el método comprende (a) introducir en una o más secuencias de ácido nucleico codificantes de CDR una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc, produciendo así uno o más sitios diana no idénticos dentro de la una o más secuencias de ácido nucleico codificantes de CDR para la unión de una o más nucleasas de dedos de cinc (ZFN) y produciendo una secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada; (b) introducir en una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) al menos uno de los sitios diana de la secuencia de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc de (a), cuyas secuencias están operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de escisión del ADN de una enzima de restricción de tipo IIS, en donde la escisión del ADN por la ZFN está determinada por el sitio diana dentro de la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada de (a); y (c) expresar las secuencias de ácido nucleico de (b) en una célula que contenga ácido nucleico que codifica al menos un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o al menos un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) que contenga la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada de (a) en condiciones en las que la ZFN expresada se une y escinde la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada dentro de la secuencia del sitio diana. Se apreciará que las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en las secuencias de ácido nucleico que codifican una o más de las regiones CDR de una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de anticuerpo.

De acuerdo con este método, dentro de la célula, los procesos de recombinación, reparación y reagrupación del ADN escindido dentro de las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR modificadas proporcionan hipermutación en y/o alrededor de las secuencias del sitio diana, o "puntos calientes" donde la ZFN se une y escinde el ADN dentro de las CDR. La expresión de las CDR resultantes dentro de, al menos, las regiones VH y/o VL expresadas en la célula proporciona, en última instancia, productos de moléculas de unión o anticuerpos genéticamente diversificados que tienen el potencial de mostrar una unión mejorada u óptima a un antígeno diana. En una realización, en (a), las secuencias de ácido nucleico que codifican una CDR están incluidas dentro de un vector o casete de ácido nucleico, por ejemplo, un vector de ADN, adecuado para llevar a cabo técnicas de biología molecular y manipulación genética. Las secuencias de reconocimiento de la unión al ADN en dedo de cinc se introducen en las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR y que se introducen en el vector o casete para producir la una o más CDR modificadas, por ejemplo, la CDR1, la CDR2 o la CDR3 de una cadena ligera de anticuerpo y/o la CDR1, la CDR2 o la CDR3 de una cadena pesada de anticuerpo. En una realización, el vector o casete de ácido nucleico que comprende la una o más CDR modificadas se introduce posteriormente en la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio VL y/o VH de manera que las ubicaciones resultantes de las CDR expresadas están en la orientación en la que se expresan normalmente en la región variable de la cadena pesada o ligera. En una realización, en (a) del método, las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR están incluidas en de secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) en el momento en que las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR. En una realización, en (c), la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada está incluida dentro de un anticuerpo de longitud completa que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH), y que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde las secuencias de ácido nucleico resultantes codifican anticuerpos de longitud completa que comprenden dominios VH y VL que comprenden CDR modificadas. En una realización, el método comprende además la amplificación y, óptimamente, la clonación de las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de dominio VH y/o VL de la célula.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para generar un anticuerpo genéticamente diverso, o un fragmento de unión o parte del mismo, que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) modificadas, en donde el método comprende producir una o más CDR modificadas introduciendo en las secuencias de nucleótidos que codifican la una o más c Dr individuales de los dominios VH y/o VL del anticuerpo una o más secuencias de reconocimiento de ácido nucleico del dominio de unión al ADN en dedo de cinc (o sitios diana) para la unión de nucleasas de dedos de cinc (ZFN) que se han diseñado mediante ingeniería genética para incluir el uno o más sitios diana del dominio de unión en dedo de cinc, tal como se ha introducido en las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR, unidas covalentemente al dominio de escisión del ADN de una endonucleasa de tipo IIS, tal como Fok1; en donde las ZFN escinden dentro de las CDR según se determina por la especificidad de las secuencias de reconocimiento de ácido nucleico del dominio de unión al ADN en dedo de cinc que contienen las CDR de (a). Las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL que contienen la una o más CDR modificadas o que codifican moléculas de inmunoglobulina de longitud completa que codifican los dominios VH y/o VL que contienen la una o más CDR modificadas, se expresan en células en las condiciones y tiempo adecuados para que las ZFN escindan en los sitios específicos de las secuencias diana dentro de las CDR y para que las proteínas de recombinación y reparación de la célula generen dominios VH y/o VL que comprendan regiones de unión genéticamente diversificadas debido a la escisión realizada dentro de la secuencia de la CDR y la reagrupación de secuencias dentro de las CDR con las posteriores mutaciones en la secuencia original resultado de los puntos calientes internos en las CDR o en los sitios dentro de las CDR que se han unido y escindido mediante las ZFN. De este modo, se obtiene un conjunto genéticamente diverso de secuencias CDR que comprende las regiones de unión de los dominios VH y/o VL expresados, o los anticuerpos que comprenden dichos dominios. Esta diversidad proporciona un anticuerpo o una población de moléculas de anticuerpo que pueden tener propiedades de unión mejoradas u optimizadas para el antígeno diana.

En los métodos descritos, las secuencias de ácido nucleico que codifican la una o más CDR pueden originarse u obtenerse de un anticuerpo o anticuerpos que se unen a un antígeno conocido, o pueden originarse u obtenerse de una biblioteca que codifica moléculas de anticuerpo que tienen una variedad de especificidades de unión, o especificidades de unión a dianas desconocidas. Las CDR pueden originarse o derivarse de inmunoglobulinas de diferentes especies animales, incluyendo, por ejemplo, mamíferos como humanos, ratones, ratas, conejos, cobayas, perros, ovejas, vacas, caballos, cerdos y similares. En una realización, las CDR son CDR humanas. En una realización, las CDR son CDR no humanas, tales como CDR de conejo, o CDR de ratón o CDR de rata.

En realizaciones de los métodos, las secuencias de ácido nucleico de las CDR modificadas y las ZFN se introducen en una célula hospedadora en condiciones en las que las ZFN se dirigen y escinden las CDR modificadas dentro de los sitios de reconocimiento de unión de los dedos de cinc introducidos y en condiciones para producir productos de anticuerpos, o partes es de unión de los mismos, genéticamente diversos, es decir, que contienen mutaciones. Las mutaciones resultantes de la práctica de los métodos de diversificación genética de la invención pueden ser en forma de, por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos (pares de bases) dentro de las regiones hipervariables CDR de los dominios VH y/o VL. Dichas mutaciones pueden, tras la expresión de los productos de anticuerpos, afectar positivamente a la unión de las regiones de unión expresadas resultantes al antígeno diana, es decir, proporcionar una mejor especificidad y/o afinidad de unión por el antígeno diana. En una realización de los métodos, las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR se modifican genéticamente fuera de los dominios VH y/o VL, por ejemplo, dentro de un vector y/o casete de ácido nucleico, y se introducen posteriormente en las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL. En una realización, las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR se modifican genéticamente en el locus CDR dentro de los dominios VH y/o VL en los que residen. En una realización de los métodos, las secuencias de ácido nucleico modificadas que codifican la CDR se introducen en las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL de una proteína de anticuerpo. En una realización, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL que comprenden las CDR modificadas genéticamente, a su vez, se clonan molecularmente para expresarse de forma operativa con secuencias de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas (H) y ligeras (L) de anticuerpos, en donde la secuencia de ácido nucleico resultante codifica una proteína de anticuerpo que comprende regiones CDR modificadas que comprenden diferentes sitios de reconocimiento de ZFN dentro de los dominios VH y VL.

En una realización, las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR modificadas; o las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL en los que se han introducido las CDR modificadas; o las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de longitud completa que comprende dominios VH y/o VL que comprenden CDR modificadas, se expresan en una célula hospedadora adecuada utilizando uno o más vectores de expresión adecuados, por ejemplo, vectores lentivíricos. Los dominios VH y/o VL resultantes que comprenden las CDR modificadas, o uno o más anticuerpos que comprenden dominios VH y/o VL que comprenden las CDR modificadas, se pueden cribar o seleccionar por su unión a un antígeno diana dentro de la misma célula de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En una realización, el método de selección comprende los métodos de la invención descritos en el presente documento en los que el dominio VH y/o VL o el anticuerpo se unen al antígeno diana, es decir, un elemento de una pareja de unión que comprende una proteína de unión al receptor o su ligando afín, dentro de la misma célula. Como se describe en detalle en el presente documento, el ligando afín suele estar fusionado o acoplado a una señal de retención que retiene el ligando en un orgánulo como el RE. Si el dominio VH y/o VL o el anticuerpo que comprende dichos dominios VH y/o VL se une a la proteína de unión al receptor o a su ligando dentro del entorno del RE, la interacción de unión entre la proteína del receptor y el ligando afín se altera, neutraliza o bloquea. El ligando queda retenido en el orgánulo debido a la señal de retención; sin embargo, la proteína del receptor, liberada de su interacción con su ligando, puede transitar por el RE y expresarse en la superficie celular. Dicha expresión en la superficie celular del receptor "liberado" se puede detectar (y cuantificar) mediante la unión de anticuerpos específicos y detección de los mismos, por ejemplo, por citometría de flujo. La detección de la señal, respecto de los controles, indica que la célula contiene un dominio VH y/o VL o un anticuerpo que se une a la molécula diana dentro de la célula, y que dicho evento de unión ha alterado, neutralizado o bloqueado eficazmente la interacción receptor-ligando.

En otras realizaciones, los métodos comprenden además aislar o recuperar la secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de unión, o una parte de unión de la misma, por ejemplo, un anticuerpo o una parte de unión al mismo, producida en las células, amplificar las secuencias de ácido nucleico codificantes, por ejemplo, mediante PCR, y clonar las secuencias de ácido nucleico que codifican la molécula de unión, o una parte de unión de la misma, por ejemplo, un anticuerpo o una parte de unión del mismo, o una forma genéticamente diversa del mismo desde la célula.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1A-1D muestran una representación esquemática de un aspecto de la invención como se describe en el presente documento en el que una proteína ligando marcada con KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1) se retiene en el retículo endoplásmico de la célula. En resumen, como se muestra, las Figs. 1A-1D presentan una demostración de la tecnología y el método de la invención tal como se ha probado utilizando anticuerpos recombinantes dirigidos bien a la proteína del receptor de unión al ligando, el receptor I de hTNF-a, o bien a su proteína ligando afín hTNF-a y comprobando que ambos tipos de anticuerpo pueden bloquear o alterar la interacción entre la proteína del receptor de ligando, el receptor I de hTNF-a, y su ligando afín hTNF-a. Como se ha representado, una línea de células Jurkat que expresa una proteína del receptor representativa, es decir, el receptor I del hTNF-a, en la superficie de la célula fue diseñada molecularmente mediante ingeniería genética para expresar y retener ciertas proteínas expresadas de acuerdo con la invención. La presencia del receptor en la superficie de la célula puede detectarse mediante un anticuerpo dirigido contra el receptor I del hTNF-a marcado de forma detectable, por ejemplo, fluorescente. Abreviaturas: ER, retículo endoplásmico; hTNF-a, factor de necrosis tumoral alfa humano; KDEL (SEQ ID NO:1), señal de retención para el ER; VL, región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-receptor I de hTNF-a.

Las Figs. 2A y 2B muestran una representación esquemática de un anticuerpo (dominio VL) marcado con la secuencia KDEL (SEQ ID NO:1) para retener el anticuerpo en el RE. Como se muestra en la Fig. 2A, la proteína hTNF-a expresada en la superficie celular se detecta en la superficie de la célula mediante un anticuerpo detectable que reconoce y se une específicamente a la proteína hTNF-a expresada en la superficie celular. En la Fig. 2B, como las células se han transducido con moléculas de anticuerpo VL-KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1), el anticuerpo de VL que se une específicamente a la proteína hTNF-a retiene esta proteína diana en el RE, y la proteína hTNF-a ya no se detecta en la superficie de la célula con el anticuerpo detectable. Abreviaturas: ER, retículo endoplásmico; hTNF-a, factor de necrosis tumoral alfa humano; KDEL (SEQ ID NO:1), señal de retención para el RE; VL, región variable de la cadena ligera de un anticuerpo de hTNF-a; "TNF-a-tmd-TEV", proteína diana del TNF-a que comprende un dominio transmembrana (tmd) y fusionada con la proteasa TEV (dominio catalítico de la proteína de inclusión nuclear a (Nla) codificada por el virus del mosaico del tabaco (TEV)) como dominio citoplásmico.

La Fig. 3 muestra la localización de las secuencias en dedo de cinc diana introducidas en las regiones CDR, por ejemplo, CDR1 y CDR3, del dominio variable de la cadena pesada humana (VH) y del dominio variable de la cadena ligera humana (VL). Las secuencias en dedo de cinc diana se introdujeron en la región CDR con tres marcos de secuencia diferentes para suprimir el desplazamiento de marco y la consiguiente falta de producción de anticuerpos. Los dominios variables humanos resultantes se reintrodujeron en la inmunoglobulina humana de tipo G1 (IgG1), dando como resultado una proteína de anticuerpo completa con regiones CDR1 y CDR3 modificadas molecularmente mediante ingeniería genética que contienen diferentes sitios de reconocimiento de dedos de cinc. En cada CDR se colocaron dos sitios de reconocimiento de dedos de cinc diferentes y se pudieron reconocer por dos nucleasas de dedos de cinc diferentes. Las CDR1 y CDR3 fueron el objetivo de esta estrategia para inducir una escisión específica dentro de estos sitios, lo que llevó a la diversificación genética de los anticuerpos resultantes. Dependiendo de la variabilidad deseada, la c DR2 puede permanecer inalterada, o también se puede someter a un direccionamiento en los dedos de cinc similar a la lograda para las regiones CDR1 y CDR3. En una proteína de inmunoglobulina IgG intacta, se introdujeron un total de cuatro "puntos calientes" de dedos de cinc distintos, es decir, secuencias de reconocimiento de ácido nucleico de las proteínas de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en las CDR para su direccionamiento por nucleasas de dedos de cinc (ZFN) específicas, como se describe en el presente documento, en el dominio variable de la cadena pesada humana (hVH) y cuatro puntos calientes de dedos de cinc distintos en el dominio variable de la cadena ligera humana (hVL) para generar diversidad y variabilidad en las regiones de unión del anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

La Fig. 4 muestra la localización de los sitios de las secuencias en dedo de cinc diana en las regiones VH y VL humanas que abarcan los tres marcos de lectura. Cada punto caliente de dedos de cinc se colocó en los marcos 1, 2 y 3 para compensar la inserción y eliminación aleatoria de nucleótidos. El factor combinatorio de diferentes puntos calientes de dedos de cinc colocados en todos los marcos es de 81 construcciones diferentes en cada cadena variable. Así, se pueden generar un total de 6561 variantes de puntos calientes de dedos de cinc diferentes en las regiones VH y VL de la IgG. Las construcciones que incluyen las regiones variables descritas que contienen sitios de dedos de cinc dentro de las CDR pueden introducirse en las cadenas principales de las inmunoglobulinas IgG1, IgG2 o IgG4 mediante técnicas moleculares para generar diferentes clases de anticuerpos con especificidades de unión diversas y variables.

La Fig. 5 muestra una representación esquemática de los plásmidos construidos para expresar todas las nucleasas de dedos de cinc 1-4 en tándem en la cadena principal del vector lentivírico FugW. En un plásmido se clonó la nucleasa de dedos de cinc mediante PCR de solapamiento con una secuencia 2 A que separa cada gen. ZFN1VH y ZFN2VH se dirigen a la CDR1 en la región variable de la cadena pesada; ZFN3VH y ZFN4VH se dirigen a la CDR3 en la región variable de la cadena pesada; ZFN1VL y ZFN2VL se dirigen a la CDR1 en la región variable de la cadena ligera; y ZFN3VL y ZFN4VL se dirigen a la CDR3 en la región variable de la cadena ligera. El vector lentivírico de las nucleasas de dedos de cinc dirigidas a VH contiene un gen de resistencia a la puromicina; y el vector lentivírico de las nucleasas de dedos de cinc dirigidas a VL contiene un gen de resistencia a la neomicina. Abreviaturas: ZFN1, ZFN2, ZFN3, ZFN4, nucleasas de dedos de cinc 1-4; IRES, secuencia interna de alargamiento del ribosoma. Como entiende el experto en la materia, el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) es un fragmento de ARN no codificante con la capacidad de iniciar altos niveles de síntesis de proteínas independientes del extremo en células de mamíferos. Las secuencias IRES se utilizan para expresar dos proteínas a partir de un único promotor en una construcción de expresión o una construcción transgénica. Se produce un único ARN, pero debido a la presencia de IRES, es posible un segundo inicio de traducción en el mismo ARN. Según se usa en los vectores descritos, las secuencias IRES permiten la expresión de la ZFN junto con un marcador de selección para la construcción de líneas celulares.

Las Figs. 6A-6E muestran representaciones esquemáticas de varios plásmidos utilizados para construir líneas celulares para demostrar y llevar a cabo los métodos de la presente invención. (A) pVL18-IRES-DsRed, (B) pVL18 KDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1), (C) pTNFKDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1), (D) pTNF-TEV, y (E) pTAX-IRES-DsRed. BamHI: enzima de restricción; c-Myc: etiqueta c-Myc; DsRed: proteína de fluorescencia roja; EcoRI: enzima de restricción; HA: etiqueta de hemaglutinina; Tax: transactivador de HTLV-I; His6 (SEQ ID NO:46): etiqueta de histidina; Hpal: enzima de restricción; hTNF-a, factor de necrosis tumoral alfa humano; PDGFR tmd: región transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR); hUbc: promotor de la ubiquitina C humana; líder de la cadena IgGK: secuencia líder de la cadena Ig-K murina; IRES: sitio interno de entrada al ribosoma; KDEL (SEQ ID NO:1): señal de retención para el retículo endoplásmico; Nhel: enzima de restricción; Sfil: enzima de restricción; y TEV: proteasa del virus del mosaico del tabaco.

Las Figs. 7A y 7B muestran los resultados de verificación de los métodos de selección de la invención, tal como se determina mediante el análisis de cribado por citometría de flujo de bibliotecas de anticuerpos anti-hTNF-a diversificadas utilizando la metodología de nucleasas de dedos de cinc descrita en el presente documento. (7A): Biblioteca de anticuerpos sin diversificación; (7B): Biblioteca de anticuerpos con diversificación. Se produjeron poblaciones de células que expresaban el anticuerpo en ausencia de puntos calientes de dedos de cinc y se indujo la diversificación (7A). Se produjeron otras poblaciones de células que expresaban el anticuerpo diseñado mediante ingeniería genética para contener puntos calientes de dedos de cinc y que indujeron diversificación genética y que también expresaban proteínas de dedos de cinc y Tax. (7B). Después de varios ciclos de clasificación por citometría de flujo, las células seleccionadas se aislaron según los métodos de la invención por tener una expresión reducida del antígeno (hTNF-a) en la superficie celular, anticuerpos y poblaciones clonales de los mismos, que se unen a una molécula diana y reducen la expresión de hTNF-a en la superficie celular.

La Fig. 8 muestra los resultados de un ensayo ELISA en donde se clonaron fragmentos de anticuerpos derivados según los métodos de selección de la invención en el vector de expresión pT7 (Sigma-Aldrich. Louis, Mo.), expresado y analizado por ELISA según la unión al hTNF-a. Un anticuerpo/clon seleccionado se cultivó en medio de autoinducción. Después de 16 horas, las células se lisaron y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de expresión y unión en ELISA (utilizando 200 ng de hTNF-a). BL21: bacterias utilizadas para la transformación por los vectores que incluyen el ADN que codifica el anticuerpo (utilizado como control negativo); hF63: anticuerpo de dominio único VL seleccionado mediante expresión en fago contra el antígeno gp41 del VIH-1 (utilizado como control irrelevante); VL18, anticuerpo de dominio único VL contra el hTNF-a; VHH: anticuerpo de dominio único contra el hTNF-a (Ablynx); VL18 maduración n.° 1-14: clones seleccionados después de la maduración del anticuerpo VL18 en células transformadas; hF63 maduración n.° 1-14: clones seleccionados después de la maduración del anticuerpo hF63 en células transformadas. Los resultados mostrados indican la maduración de un fragmento de anticuerpo de cadena ligera (VL) que se une al hTNF-a (VL18) producido según los métodos de diversificación de acuerdo con la invención. El anticuerpo irrelevante (F63) que no se une al hTNF-a se utilizó como control en los ensayos realizados en paralelo. Como se muestra en el gráfico, varios anticuerpos monoclonales VL derivados de VL18 mostraron una mayor unión al hTNF-a indicando la maduración del anticuerpo. Del mismo modo, los anticuerpos derivados de F63 también mostraron una mayor unión, lo que indica que estos anticuerpos han evolucionado para reconocer un antígeno diferente. La FIG. 8. divulga "KDEL" como SEQ ID NO:1.

Descripción detallada de las realizaciones

En el presente documento se describen una tecnología de plataforma y métodos para seleccionar una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o una parte de unión del mismo, que reconoce y se une específicamente a una molécula diana, preferiblemente una proteína, polipéptido o péptido, dentro de una célula. Los métodos implican la coexpresión en una célula de (i) la molécula de unión, (ii) su diana que, en un aspecto de la invención, puede ser un elemento del ligando afín de una pareja de unión de proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la célula y ligando afín, y (iii) la proteína del receptor que se puede expresar en la superficie de la célula con la que interactúa el ligando afín. El ligando afín puede fusionarse con una señal de retención en un orgánulo intracelular (por ejemplo, una señal de retención en el retículo endoplásmico (RE)), de manera que cuando el ligando afín se une e interactúa con la proteína del receptor en la célula, ambos quedan retenidos y localizados en el orgánulo celular debido a que el ligando tiene la señal de retención. La presencia de la molécula de unión dentro de la misma célula que su diana, el ligando afín, permite que la molécula de unión se una a su diana dentro de la célula, alterando, neutralizando o bloqueando así la interacción de unión típica entre la diana del ligando afín y la proteína de su receptor. Esta alteración de la interacción entre la pareja de unión a ligando realizada por de la molécula de unión permite que la proteína del receptor salga del orgánulo, se desplace hasta la superficie celular y se exprese en la misma, mientras que el ligando afín queda retenido en el orgánulo celular. La proteína del receptor, que se expresa en la superficie de la célula, se puede detectar mediante un agente detectable y métodos de detección específicos, e indica la presencia de la molécula de unión dentro de la célula. La actividad de unión de la molécula de unión a su diana (el elemento de la pareja de unión a ligando afín) da lugar a la liberación de la proteína del receptor de su interacción de unión con el ligando afín y a su expresión y detección en la superficie celular. La molécula de unión se puede aislar de la célula en la que se ha seleccionado con los métodos de la invención. En el presente documento se describen variaciones de la tecnología y de los métodos de la invención.

La tecnología y los métodos de la invención son útiles y ventajosos para (i) reducir las variables indeseables debidas a las técnicas de recombinación y amplificación; (ii) combinar la afinidad y la maduración de la expresión de las moléculas de unión, como los anticuerpos; (iii) fomentar la selección de moléculas de unión o anticuerpos a las proteínas diana en la ubicación natural de la célula; y (iv) integrar las características anteriores utilizando métodos de cribado o selección de alto rendimiento. En consecuencia, la invención abarca una nueva tecnología de plataforma y métodos que acoplan los aspectos de la selección, expresión y maduración eficaces de moléculas de unión, como los anticuerpos, para su unión a proteínas o antígenos diana en un entorno celular, en donde se localizan y expresan las moléculas de unión como las moléculas diana.

En una realización, la molécula de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión o parte del mismo, que se une específicamente a una molécula o antígeno diana, como se describe en el presente documento. En una realización, la molécula de unión es una parte del dominio VL y/o VH de un anticuerpo. En una realización, el dominio VL y/o VH, o el anticuerpo, o un fragmento de unión o parte del mismo, está diversificado genéticamente como se describe en el presente documento. En una realización, se utiliza una biblioteca de moléculas de unión para seleccionar o cribar aquellas moléculas que se unen específicamente a una molécula diana o antígeno de acuerdo con los métodos de la invención. En una realización, una biblioteca de anticuerpos ya sea construida u obtenida de otra manera, se utiliza para seleccionar o cribar aquellos anticuerpos que se unen específicamente a una molécula o antígeno diana. En una realización, los anticuerpos, o las partes de unión de los mismos, se diversifican genéticamente mediante los métodos descritos en el presente documento y se seleccionan o criban por su unión a un antígeno diana utilizando los métodos de selección celular descritos en el presente documento.

En una realización, la molécula diana es una molécula de unión a ligando, por ejemplo, una proteína del receptor de unión a ligando, es decir, "proteína del receptor", que se expresa en la superficie celular. En una realización, la proteína del receptor es una proteína del receptor que se extiende a la membrana que comprende un dominio extracelular que un anticuerpo específico puede reconocer y al que se puede unir. En una realización, la molécula diana es una proteína o antígeno, por ejemplo, un ligando afín, que se une e interactúa con una molécula de unión a ligando, por ejemplo, una proteína del receptor de unión a ligando. El ligando afín es preferiblemente una proteína, polipéptido o péptido. En una realización, el ligando afín o la proteína de unión al ligando se pueden expresar, o se pueden modificar molecularmente mediante ingeniería genética para su expresión en la membrana plasmática de la célula.

La expresión de la molécula de unión al ligando, o de la proteína del receptor, o del ligando afín en la membrana celular se refiere a la capacidad de la molécula de unión al ligando o del ligando afín para reconocer y unirse específicamente a una molécula detectable, tal como un anticuerpo, en un ensayo de detección adecuado. En consecuencia, una porción de enlace de la molécula de unión al ligando o del ligando afín se expone al entorno extracelular de manera que esta (y sus epítopos pertinentes) pueda reconocer y unirse específicamente a la molécula o el anticuerpo detectables. En una realización, la molécula o el anticuerpo detectable, por ejemplo, un "primer" anticuerpo, se puede marcar directamente con una etiqueta detectable, que se puede detectar, medir o cuantificar por métodos convencionales. En una realización, la molécula o el anticuerpo detectable no se marca directamente, sino que se une específicamente a una molécula de unión o anticuerpo secundario, que se marca de forma detectable y que se puede detectar, medir o cuantificar. La molécula de unión o anticuerpo secundario detectable sirve como etiqueta indirecta del primer anticuerpo, que puede proporcionar una señal más alta o más óptima, tal como en los métodos de detección por citometría de flujo.

Como se utiliza en el presente documento, una "molécula de unión" se refiere a una molécula, o a un fragmento de unión o a una parte de la misma, que se une a una molécula o antígeno diana. Una molécula de unión es preferiblemente una proteína, polipéptido o péptido que puede reconocer y unirse a una molécula o antígeno diana. La molécula o antígeno diana es preferiblemente una proteína, una glicoproteína, un polipéptido o un péptido. La molécula de unión puede ser un anticuerpo o una inmunoglobulina, o un fragmento o parte de unión o funcional del mismo. Un fragmento o parte funcional de un anticuerpo o inmunoglobulina abarca un fragmento o parte de unión del mismo, tal como un dominio VL y/o VH, que se une específicamente a una molécula diana. La molécula de unión también puede ser una molécula que no sea un anticuerpo o un fragmento funcional o una parte del mismo.

La molécula o antígeno diana que se une a una molécula o anticuerpo de unión puede ser una proteína de unión al ligando (o proteína del receptor de unión al ligando), un polipéptido o un péptido, como una proteína del receptor, por ejemplo, una proteína del receptor expresada en la superficie de la célula, que típicamente se une a un ligando o proteína de unión afín. Un "ligando afín" o "proteína del ligando" se refiere al ligando/proteína/péptido, etc. con el que la proteína de unión al ligando suele interactuar y/o unirse. El ligando afín puede estar modificado, derivado o fusionado a otras secuencias o dominios; sin embargo, puede seguir interactuando con su proteína de unión al ligando o con la proteína del receptor. Alternativamente, la molécula diana o el antígeno que se une a una molécula de unión o a un anticuerpo puede ser un ligando afín que interactúa y/o se une a su proteína de unión al ligando para formar una pareja de interacción de proteína de unión al ligando afín/ligando afín, también denominado "pareja de unión" en el presente documento. Un ejemplo no limitativo de una proteína del receptor de unión a un ligando es el receptor 1 del TNF-a humano (receptor 1 del hTNF-a), mientras que un ejemplo no limitativo de su ligando afín es el TNF-a humano (hTNF-a). Ilustrativamente, el receptor 1 del TNF-a humano interactúa y se une al TNF-a humano (hTNF-a), y conjuntamente forman una pareja de unión, siendo cada proteína un elemento de la pareja de unión. Se entenderá que, a lo largo de la presente solicitud, el receptor 1 del TNF-a humano (receptor 1 del hTNF-a) representa un ejemplo no limitativo de una proteína del receptor de unión a un ligando que interactúa y se une al TNF-a humano (hTNF-a), lo que representa un ejemplo no limitativo de un ligando afín. En consecuencia, la comprobación de los métodos de selección y diversificación de la invención utilizando una pareja ligando-proteína afín de este tipo, por ejemplo, como se define en los Ejemplos del presente documento, no pretende limitar las diversas realizaciones de la invención en forma alguna.

El término "anticuerpo" incluye una inmunoglobulina intacta que tiene cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" es sinónimo del término "inmunoglobulina" y abarca anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos monocatenarios y moléculas que tienen funcionalidad para unirse a una diana, proteína o antígeno específico. El término "anticuerpo" también abarca fragmentos de anticuerpos o partes s de los mismos, incluyendo ilustrativamente, aunque no de forma limitativa, fragmentos tales como un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento variable monocatenario (scFv), un diacuerpo y un anticuerpo de dominio (dAb). El término "anticuerpo" también abarca las regiones variables (V) de las cadenas H y L del anticuerpo, es decir, VH y VL respectivamente, que contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones de hipervariabilidad que suelen interactuar con epítopos de los antígenos o moléculas diana a los que se dirigen, reconocen y unen específicamente los anticuerpos. Preferiblemente, los anticuerpos y los fragmentos y partes de los mismos son fragmentos y partes funcionales en el sentido de que se dirigen y se unen específicamente a un antígeno diana o a una proteína diana, tales como una proteína de unión a ligando o una proteína de ligando afín de acuerdo con aspectos de la invención. Los anticuerpos pueden ser de cualquier especie o derivados a partir de las mismas, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, ovejas, cabras, ratones, ratas, conejos, perros, vacas, cerdos y similares. En una realización, los anticuerpos son anticuerpos humanos. En una realización, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Además, los anticuerpos, o fragmentos o partes de unión de los mismos, pueden ser de cualquier clase, por ejemplo, IgM, IgA, IgD, IgG o IgE, o de cualquier subclase de los mismos, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4. En una realización, el anticuerpo, o un fragmento de unión del mismo, es un anticuerpo IgG1. Las cadenas ligeras de anticuerpos, o fragmentos o partes de las mismas, pueden ser del tipo kappa o lambda. Se entenderá que, tal como se usa en el presente documento, el término anticuerpo pretende abarcar un fragmento de unión y/o funcional y una parte del mismo.

En algunas realizaciones, los métodos abarcan el uso de una biblioteca de anticuerpos, por ejemplo, una biblioteca de inmunoglobulinas clonada, o una biblioteca de fragmentos funcionales o partes de anticuerpos, como una biblioteca de anticuerpos de dominio único (SDA), por ejemplo, una biblioteca de regiones VL. Las bibliotecas de anticuerpos, incluidas las bibliotecas de anticuerpos diversificadas, son particularmente útiles para seleccionar anticuerpos con una afinidad o especificidad alta u óptima de unión a una proteína diana determinada de acuerdo con los métodos de la invención como se describe más adelante. Los anticuerpos o partes de los mismos que se derivan o producen a partir de bibliotecas de anticuerpos que se han diversificado genéticamente por los métodos descritos en el presente documento también son útiles para seleccionar un antígeno/proteína diana determinado dentro de una célula, dependiendo de su capacidad de unión, de acuerdo con los métodos de la invención.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y los métodos para su generación empleando, por ejemplo, técnicas moleculares convencionales, son conocidos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en Antibody Engineering, Kontermann, R. y Dubel, S. (Eds.), Springer, 2001; Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ; Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002 ; J. D. Pound (Ed.) Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press; 2nd ed., 1998 ; B. K. C. Lo (Ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003 ; and Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975 ) [1].

En otras realizaciones, las moléculas de unión abarcadas por la invención incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, formas modificadas y derivadas de los mismos, miméticos de anticuerpos, por ejemplo proteínas diseñadas con repeticiones de anquirina (DARPin), afilinas, afitinas, avímeros, anticalinas, monocuerpos, moléculas de aficuerpos; o una molécula o sustancia que interactúa con la membrana celular y se une o puede unirse a una proteína, por ejemplo, haptómeros, aptámeros, etc.

En una realización, la molécula de unión por ejemplo, un anticuerpo, que se ha introducido en una célula mediante técnicas recombinantes, se ha expresado y producido en la célula y se ha demostrado que se une a una molécula diana como se describe en el presente documento, puede recuperarse o aislarse de las células utilizando métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, se puede aislar el ADN genómico y amplificar fragmentos específicos utilizando oligonucleótidos cebadores a partir de una célula que se ha seleccionado según la expresión de un anticuerpo que se une a una molécula diana particular como se describe en los métodos de la invención. Un vector plasmídico construido para incluir los fragmentos de ADN amplificados se puede utilizar para transformar bacterias y las colonias que expresan segmentos clonados que contienen ADN codificante de anticuerpos se someten a ensayo mediante análisis de unión según la expresión de anticuerpos con propiedades de unión específicas. Véase, por ejemplo, el ejemplo 4 del presente documento. Los anticuerpos se pueden expresar directamente a partir de los clones celulares aislados, sin necesidad de reclonación. Además, los clones celulares se pueden aislar, y los genes que codifican anticuerpos, por ejemplo, los genes que codifican anticuerpos IgG se pueden amplificar, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y reclonarse, por ejemplo, en un plásmido de expresión en mamífero para su expresión y posterior purificación. Opcionalmente, la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, puede modificarse, desarrollarse o purificarse aún más para su uso terapéutico utilizando métodos conocidos del experto en la técnica. En una realización, la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a una proteína del receptor de unión al ligando o a una proteína del ligando se identifica, recupera o aísla de las células y, opcionalmente, se purifica, para su uso posterior.

Según la invención, los anticuerpos generados y/o seleccionados por los métodos descritos pueden emplearse como agentes biológicos terapéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos seleccionados usando los métodos descritos pueden demostrar propiedades estructurales y funcionales mejoradas, más deseables y/u óptimas en comparación con los anticuerpos conocidos o utilizados. Con los métodos de diversificación y selección genética de la invención se proporcionan moléculas de unión que pueden mostrar una unión mejorada, deseable y/u óptima a una proteína del receptor celular o a su ligando afín, cualquiera de los cuales puede estar asociado a una enfermedad, patología o dolencia en un sujeto, tal como un paciente humano, que necesita tratamiento. Dichas moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos, cuando se emplean como agentes terapéuticos, pueden por ejemplo bloquear, inhibir o alterar la unión de un ligando a su receptor expresado en la superficie de la célula y evitar la activación de los eventos de señalización intracelular que conducen a la transformación de la célula, la proliferación celular incontrolada o el cáncer. Si la molécula de unión es un anticuerpo, el anticuerpo puede estar dirigido contra una proteína del receptor de unión al ligando de la superficie celular y puede presentar propiedades de unión y/o funcionales mejoradas. Un anticuerpo como molécula de unión puede dirigirse alternativamente contra una proteína de unión al ligando y puede presentar propiedades de unión y/o funcionales mejoradas.

En un ejemplo de realización en la que el anticuerpo seleccionado se dirige contra el receptor del factor de necrosis tumoral humano (hTNF-a), dicho anticuerpo se puede utilizar, por ejemplo, para bloquear o antagonizar la unión del hTNF-a a su receptor con el fin de tratar una enfermedad o dolencia asociada con la expresión del hTNF-a, por ejemplo, expresión anómala o expresión en exceso, en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, aunque el tratamiento de otras especies no humanas está abarcado para las moléculas de unión que son resultado de los métodos descritos en el presente documento. Del mismo modo, un anticuerpo dirigido contra el ligando del receptor del hTNF-a también puede servir para bloquear la unión del ligando a su receptor, antagonizando así la interacción receptor-ligando y tratando una enfermedad o dolencia asociada al hTNF-a. Por ejemplo, las moléculas de unión al TNF humano (como el TNF-a) o los antagonistas, por ejemplo, los anticuerpos y las proteínas de fusión, son útiles en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias inmunomediadas, por ejemplo, autoinmunitarias, tales como la artritis reumatoide (AR), la artritis reumatoide y psoriásica juvenil, la psoriasis en placas, la espondilitis anquilosante o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). También se incluyen en la invención moléculas de unión, tales como los anticuerpos, que se seleccionan, o se diversifican y seleccionan, por los métodos celulares descritos en el presente documento, en los que las moléculas de unión o los anticuerpos se unen a otros tipos de receptores expresados en la superficie celular, o a sus ligandos afines. Al unirse a la proteína del receptor de unión al ligando o al ligando afín, dichos anticuerpos pueden bloquear, alterar, inhibir o eliminar la interacción receptor-ligando.

Un anticuerpo, una molécula de unión o una proteína de unión incluidos en las realizaciones de los presentes métodos pueden incluir, o detectarse utilizando, una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables también pueden utilizarse en varios aspectos y realizaciones de los métodos descritos, por ejemplo, para la detección y confirmación de la presencia de proteínas expresadas intracelularmente, incluyendo moléculas de unión o anticuerpos, por métodos de citometría de flujo en los que se utiliza un anticuerpo marcado de manera detectable (o molécula indicadora) para unir proteínas expresadas en la superficie celular. Ejemplos ilustrativos de etiquetas detectables incluyen, sin limitación, etiquetas fluorescentes, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, proteína verde fluorescente (GFP), DsRed; etiquetas radiactivas, por ejemplo, <13>C, <131>I, <125>I, <3>H; etiquetas quimioluminiscentes, por ejemplo, luminol; etiquetas enzimáticas, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa; etiquetas FREt , por ejemplo europio, en las que la etiqueta detectable es un donante de FRET que interactúa mediante FRET con un aceptor de FRET incorporado a un sustrato dado; etiqueta de biotina y etiqueta de estreptavidina para la unión posterior de biotina y estreptavidina, en donde la biotina o la estreptavidina están presentes en uno u otro elemento del par de moléculas de unión. Cuando se utiliza una enzima como sustancia de marcado, la detección se realiza utilizando un sustrato adecuado en función de la enzima utilizada. Por ejemplo, si se utiliza la peroxidasa como etiqueta enzimática, se utiliza el sustrato o-fenilendiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), o similares. Si se utiliza la fosfatasa alcalina como etiqueta enzimática, se utiliza el sustrato p-nitrofenil fosfato (PNPP), o similar.

En una realización, se utiliza una etiqueta fluorescente que se puede detectar y cuantificar por métodos de citometría de flujo. En otra realización, un anticuerpo contra una molécula o proteína diana expresada en la superficie celular se marca de forma detectable con una etiqueta de fluorescencia y se determina la unión o no unión del anticuerpo a la molécula o proteína diana expresada en la superficie celular, permitiendo así, a su vez, la detección y cuantificación del nivel de la molécula o proteína diana en la superficie celular. En otra realización, se utiliza un anticuerpo secundario marcado, que se une específicamente al anticuerpo que se une a la molécula diana expresada en la superficie celular.

Los ejemplos de proteínas de unión a ligando o proteínas receptoras a las que se hace referencia en el presente documento incluyen, sin limitación, receptores de factores de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de enzimas, receptores Fc, receptores de enzimas metabólicas, receptores de neurotransmisores, receptores de quimiocinas, receptores de citocinas, receptores de linfocinas, receptores de interleucinas, receptores de antígenos tumorales, receptores de antígenos supresores de tumores (por ejemplo, p53, Rb, k-Rev, receptores DCC), receptores de proteínas de resistencia a múltiples fármacos, receptores de factores de coagulación (por ejemplo, receptores del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX), receptores de factores tróficos, receptores de moléculas de reconocimiento celular o estimulantes, receptores de apolipoproteínas, y similares. Las proteínas o receptores de unión particulares incluyen, sin limitación, receptores de familias de receptores tales como EGFR, ErbB-1R, HER1, HER2, aFGFR, bFGFR, NGFR, VEGFR, FltR, TGFR, TGFR-a-1, TGFR-p, TNFR (a), BDNFR, receptor de insulina receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), PDGFR, HGFR, TRKR, BDNFR, CNTFR, GMFR, NT3R, NT5R, HARPR/pleiotrofinaR, receptores TIE, receptores Eph, receptores DDR, receptores ROR, receptores LTK, receptores AXL, receptores RET, receptores de tipo TOLL; receptores hormonales, como receptores de hormonas esteroides, receptores de hormonas tiroideas, receptores de melatonina, receptores adrenérgicos; receptores peptídicos, por ejemplo, receptores para amilina, angiotensinógeno, angiotensina, péptido natriurético auricular, péptido natriurético cerebral, calcitonina, corticotropina, eritropoyetina, endotelina, encefalina, hormona estimulante del folículo, gastrina, grelina, glucagón, gonadotropina coriónica humana, inhibina, leptina, hormona luteinizante, hormona estimulante de los melanocitos, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, renina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides, hormona liberadora de tirotropina; o los receptores GP130 o IL6. También se incluyen las moléculas de la superficie celular que se unen y/o interactúan con las proteínas y péptidos de virus. Lo anterior no pretende ser una lista exhaustiva; los expertos en la materia entenderán otros receptores que pueden ser de utilidad en la invención. Las moléculas de unión al ligando, o proteínas receptoras, se expresan preferiblemente en la superficie celular y pueden ser receptores de membrana o transmembrana. Las proteínas de unión al ligando pueden estar modificadas, modificadas después de la traducción o no después de la traducción, glicosiladas o no glicosiladas. En una realización, una molécula de unión o un anticuerpo como se describen en el presente documento reconocen específicamente y se unen a la proteína de unión al ligando, o a la proteína del receptor. En el presente documento se abarcan las secuencias de ácido nucleico (ADN y ARN) y los genes que codifican las moléculas de unión, las proteínas receptoras o los fragmentos o partes de las mismas.

Los ejemplos de ligandos afines (proteínas o antígenos ligando), que reconocen y se unen, preferiblemente reconocen y se unen específicamente, a proteínas de unión a ligando o proteínas receptoras incluyen, sin limitación, el uno o más ligandos análogos afines de cada uno de los ejemplos de receptores enumerados anteriormente. Por ejemplo, ligandos tales como factores de crecimiento, hormonas, enzimas, enzimas metabólicas, proteínas de transferencia de lípidos, neurotransmisores, quimiocinas, citocinas, linfocinas, antígenos asociados a tumores, antígenos supresores de tumores (por ejemplo, p53, Rb, k-Rev, DCC), proteínas de resistencia a múltiples fármacos, factores de coagulación (por ejemplo, Factor VII, Factor VIII, Factor IX), moléculas de reconocimiento celular, moléculas estimuladoras de células y similares. Más específicamente, los ejemplos no limitativos de proteínas ligando (o péptidos) incluyen EGF, aFGF, bFGF, VEGF, Fit, t Gf-P, TNF (TNF-a, TNF-p), NGF, insulina, factor de crecimiento análogo a la insulina (IGF), PDGF, HGF, TRK, BDNF, CNTF, GMF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina. Dichos ligandos afines pueden ser solubles o estar unidos a membrana. Las proteínas ligando pueden estar modificadas, modificadas después de la traducción o no después de la traducción, glicosiladas o no glicosiladas. En una realización, una molécula de unión o un anticuerpo como se describen en el presente documento reconocen específicamente y se unen a un ligando afín (proteína). En un ejemplo de realización, la proteína ligando es el factor de necrosis tumoral-a humano (hTNF-a). También se incluyen proteínas y péptidos víricos que se unen y/o interactúan con las moléculas de la superficie celular. En el presente documento se abarcan las secuencias de ácido nucleico (ADN y ARN) y los genes que codifican sus ligandos afines, proteínas ligando o antígenos, o fragmentos o partes de los mismos.

Se entenderá que los ácidos nucleicos aislados (genes) que codifican moléculas de unión tales como anticuerpos, proteínas de unión a ligando, receptores, proteínas ligandos, o cualquier proteína diana de acuerdo con la invención, pueden insertarse en vectores adecuados, que se utilizan para transfectar, transducir o infectar células hospedadoras adecuadas, en particular para su posterior expresión en las células, utilizando métodos conocidos del experto en la materia. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y pueden comprender secuencias de origen natural y secuencias de origen sintético o artificial. Los ácidos nucleicos adecuados pueden incluir ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, secuencias híbridas, secuencias sintéticas o artificiales o secuencias semisintéticas o semiartificiales. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser de eucariotas o de mamífero, y de origen humano o no humano, por ejemplo, animal o vegetal. En algunos casos, las secuencias de ácido nucleico pueden ser bacterianas, víricas, de levadura, etc.

Dichos ácidos nucleicos que codifican una proteína diana, o una molécula de unión, o un anticuerpo, se pueden obtener por técnicas y métodos conocidos y convencionalmente usados por los expertos en la materia. Como ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de interés pueden obtenerse por cribado de bibliotecas de ácidos nucleicos/secuencias o bancos de genes, por síntesis química, o por una combinación de métodos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas mediante el cribado de bibliotecas de ácidos nucleicos/secuencias, ácidos nucleicos clonados (ADN) o bancos de genes. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un gran número de proteínas de interés, incluidas las moléculas de unión a ligando (asociadas a la membrana celular), ligandos e inmunoglobulinas, junto con las secuencias de proteínas codificadas, están a disposición del experto en bases de datos públicas, como la del National Center for Biotechnology Information (NCBI), a la que se puede acceder a través del sitio web mundial (ncbi.nlm.nih.gov), y en bases de datos de nucleótidos y proteínas como GenBank, RefSeq o UniProtKB/Swiss-Prot. Además, las bibliotecas de inmunoglobulinas de longitud completa, por ejemplo, IgG humana, y las bibliotecas de dominios de inmunoglobulina están comercialmente disponibles para el experto en la materia.

Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión que se pueden expresar en células de mamíferos o eucariotas como células hospedadoras. Dichos vectores permiten la expresión adecuada, el procesamiento celular y la producción de los elementos de una pareja de unión de proteínas (por ejemplo, una molécula de unión a un ligando y su ligando afín). En general, un vector de expresión engloba cualquier construcción recombinante como vector de clonación de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar operativamente unida a una secuencia de control adecuada que puede permitir la expresión y controlar la transcripción del ácido nucleico insertado en un hospedador adecuado. Dichos vectores, o plásmidos, se pueden modificar fácilmente para construir vectores de expresión que produzcan la secuencia deseada en una variedad de organismos hospedadores entre los que se incluyen, por ejemplo, E. coli, Sf9 (para baculovirus), levadura y células de mamífero.

Los vectores también se refieren a los vectores de clonación de ADN recombinante, que son construcciones de replicación autónoma que pueden incluir, sin limitación, plásmidos, fagos y virus, que comprenden una molécula de a Dn a la que se ha añadido uno o más ácidos nucleicos adicionales.

Los ejemplos no limitantes de vectores incluyen vectores víricos (por ejemplo, lentivirus, forma modificada de VIH-1, adenovirus, vectores de virus adenoasociados para infectar o transducir células), partículas de fagos, vectores plasmídicos, vectores de expresión en eucariotas, vectores procarióticos, en donde el ácido nucleico, incluidas una o más secuencias heterólogas que codifican una proteína de interés, pueden integrarse o no en el genoma de la célula hospedadora. Dentro de los vectores, la secuencia de ácido nucleico o el gen que debe expresarse y producirse en una célula está vinculado de forma operativa a una secuencia de control de manera que permita la expresión, por ejemplo, la transcripción y la traducción, de la secuencia de ácido nucleico o del gen en una célula hospedadora. Los expertos en la materia conocen secuencias de control, que se seleccionan para expresar el ácido nucleico que codifica la proteína de interés, por ejemplo, una proteína de unión a ligando o receptor, una proteína de ligando o una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invención, y para controlar la transcripción. Dichas secuencias de control incluyen, aunque no de forma limitativa, una señal de poliadenilación, un promotor (un promotor natural o sintético), por ejemplo, promotores de genes como CMV, RSV, MLP, E1A, etc., o un potenciador para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una región de control de locus o silenciadora para permitir la transcripción específica de tejido, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosoma adecuados en el ARNm, secuencia(s) para estabilizar el ARNm, secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.

Pueden incluirse otras secuencias, o unirse operativamente a las mismas, del ácido nucleico o el gen que se va a expresar en un vector, tal como apreciará un experto en la materia, como secuencias de biomarcadores detectables o seleccionables, secuencias de etiquetas, secuencias de marcadores seleccionables, por ejemplo, secuencias de resistencia a antibióticos, etc., o secuencias de señales celulares (por ejemplo, naturales para el producto génico o artificiales, situadas antes del gen de interés y que dirigen el producto génico sintetizado a las rutas de secreción de la célula hospedadora). Además, las proteínas expresadas se pueden modificar adicionalmente mediante la inclusión de secuencias de activación, secuencias de regulación, secuencias de señalización de la retención en orgánulos, etc.

La tecnología y los métodos descritos en el presente documento son aplicables a los sistemas de expresión en células de mamíferos o eucariotas y a las células o líneas de células hospedadoras de mamíferos o eucariotas para expresión, actividad y función de los componentes de los métodos. Será evidente para el experto en la materia usar una línea celular que tenga la capacidad de expresar una proteína o receptor de unión a ligando seleccionado o deseado, o un ligando, o una proteína diana en la superficie celular. Como se describe en el presente documento, una proteína ligando determinada se puede modificar mediante ingeniería genética para expresarse dentro de la membrana celular y/o en la superficie celular. Los sistemas de expresión en eucariotas no están limitados a su uso en una célula hospedadora concreta. Existe una variedad de células hospedadoras eucariotas disponibles, por ejemplo, en depósitos como la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va., y se pueden utilizar con diversos vectores. La selección de una célula hospedadora está relacionada con el carácter del vector de expresión utilizado y es algo conocido del experto en la materia. Los ejemplos no limitativos de células eucariotas o de mamífero y de líneas celulares adecuadas para usar en los métodos de la invención incluyen líneas de linfocitos T, por ejemplo, células Jurkat y células JLTRG-R5 descritas en el presente documento; células HEK293, células COS, células CHO, líneas de linfocitos B, líneas de linfocitos T, etc. Las poblaciones de células cultivadas o las líneas celulares pueden desarrollarse o establecerse a partir de explantes de tejidos u órganos o de células inmortalizadas. En una realización, la línea celular es una línea de células humanas o derivada de seres humanos. En una realización, la línea celular es una línea de células de primates no humanos o una línea celular derivada de primates no humanos. En una realización, la línea celular procede o se deriva de una especie no humana o de una especie de primate no humano.

La expresión y producción de secuencias de proteínas compuestas de aminoácidos por técnicas recombinantes es bien conocida y el experto en la materia puede llevarlas a cabo usando métodos convencionales y normalizados. (Véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual y ediciones posteriores, por ejemplo, 1991, 2001 y 2012 (J. Sambrook)). En general, la preparación recombinante de una proteína, o una proteína de fusión que incluye una secuencia adicional, tal como una señal retención o una etiqueta, se lleva a cabo seleccionando la secuencia de ácido nucleico natural deseada, por ejemplo, una secuencia de ADN, o modificando una secuencia de ADN natural mediante la transformación de la secuencia de ADN en un hospedador adecuado y la expresión de la secuencia de ADN natural o modificada para formar la secuencia de proteína deseada. Un vector para expresar una proteína puede introducirse en una célula hospedadora utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, transformación, electroporación, transfección utilizando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, dextrano DEAE u otras sustancias, bombardeo de microproyectiles, lipofección, infección o transducción. Los métodos para introducir ADN en una célula hospedadora mediante uno de los procesos anteriores se encuentran, por ejemplo, en Sambrook, J., 1989, supra.

La recuperación o aislamiento de la proteína deseada puede realizarse utilizando métodos y procedimientos convencionales en la técnica, incluyendo la separación de las células hospedadoras del medio por centrifugación o filtración, si es necesario después de la disrupción de las células, precipitando los componentes proteínicos del sobrenadante utilizando una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, seguido de la purificación utilizando una serie de técnicas cromatográficas, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o procedimientos similares conocidos.

Métodos para la selección y cribado intracelular de moléculas de unión

Se proporcionan en el presente documento métodos para la selección y cribado de moléculas de unión, o moléculas de unión genéticamente diversificadas, dentro de una célula. Las moléculas de unión, que se unen o interactúan con una molécula diana dentro de una célula, pueden tener propiedades de unión y/o actividad óptimas hacia la molécula diana. Los métodos incluyen la localización y retención intracelular de las moléculas de unión, así como de las moléculas diana, lo que permite la posterior selección de una molécula de unión que se une específicamente a una molécula diana dentro de un orgánulo o compartimento intracelular de la célula. Ejemplos preferidos pero no limitantes de moléculas de unión adecuadas son los anticuerpos, o un fragmento o parte de unión de los mismos, dominios de anticuerpos, por ejemplo, VL y VH, y bibliotecas de los mismos.

En una realización de la invención, un anticuerpo o un elemento de una población de anticuerpos genéticamente diversificada, o un fragmento de unión o parte del mismo, que tiene una actividad de unión específica para una molécula diana se expresa, madura y selecciona eficazmente en un entorno celular que también alberga su molécula diana, proporcionando así una técnica conveniente para la detección, selección y recuperación de anticuerpos basada en la coexpresión del anticuerpo como molécula de unión y su antígeno diana dentro de una célula. Así, una ventaja de los presentes métodos de selección es que sólo se necesita una única célula para expresar una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, o un elemento de una biblioteca o población diversificada de moléculas de unión a antígeno o anticuerpos, así como su antígeno diana, y para seleccionar la molécula de unión o el anticuerpo que se une específica y/o óptimamente a su diana. Además, estos métodos unicelulares de generación y selección de un anticuerpo a partir de una población diversificada de anticuerpos no implican ventajosamente la visualización de ácidos ribosómicos o nucleicos, ni sistemas de expresión en fagos o células, y no requieren el uso de líneas particulares de linfocitos B que alberguen enzimas como el AID; tampoco implican técnicas convencionales de maduración por afinidad, edición de receptores o hipermutación somática. Los métodos basados en células de la invención pueden utilizarse para seleccionar aquellos anticuerpos o anticuerpos diversificados que muestren propiedades óptimas de unión y/o interacción con una determinada molécula diana o antígeno, todo ello expresado dentro de la misma célula, en la que esa misma célula puede ensayarse para determinar las propiedades de unión de un anticuerpo expresado, y seleccionarse para recuperar un anticuerpo deseado.

Varios compartimentos dentro de la vía secretora son capaces de retener una proteína. Para cada compartimento, puede ser fusionada o acoplada una secuencia particular de aminoácidos a una proteína (o "secuencia de señalización") para retener la proteína en la localización celular específica. A título ilustrativo, para la retención de una proteína en el RE, puede emplearse la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO:1); para la retención de una proteína en la red trans-Golgi, se puede utilizar la secuencia de aminoácidos YQRL (SEQ ID NO:2); para la retención de una proteína en los peroxisomas, se puede utilizar la secuencia de aminoácidos SKL; para la retención de una proteína en la membrana plasmática de una célula, se puede utilizar una secuencia de aminoácidos H-Ras o K-Ras CAAX (SEQ ID NO:3); para la retención de una proteína en las mitocondrias, la secuencia de aminoácidos MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAK (SEQ ID NO:4); y para la retención de una proteína en el núcleo, la secuencia de aminoácidos PPKKRKV (SEQ ID NO:5). El RE, con su arquitectura tubular, combinado con la canalización precisa de las proteínas a través de la vía secretora y con la presencia de chaperonas residentes en el RE, hace que este orgánulo sea una ubicación intracelular óptima para la retención de proteínas. Se apreciará que las proteínas modificadas después de la traducción, por ejemplo, glicosiladas, o que contienen glicanos, serán típicamente retenidas en el aparato de Golgi si dichas proteínas comprenden una secuencia de retención del aparato de Golgi como YQRL (SEQ ID NO:2), mientras que las proteínas no glicosiladas serán típicamente retenidas en el RE, si dichas proteínas comprenden una señal de retención del RE como la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO:1).

En una realización, se proporciona un método para capturar o retener dentro de una célula una proteína diana que es reconocida y unida por una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, para su selección, de acuerdo con los métodos de selección de la invención. En una realización relacionada, se proporciona un método para seleccionar específicamente uno o más anticuerpos que neutralicen, interrumpan, bloqueen, perturben o eliminen una interacción entre un receptor de unión a ligando y su ligando afín, en donde el receptor de unión a ligando o el ligando es la proteína diana que es reconocida y unida específicamente por el anticuerpo, y en donde la proteína diana es retenida con la célula, localizando así la proteína diana intracelularmente y permitiendo el acceso de unión por el anticuerpo dentro de la célula.

En una realización, la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o una parte de unión del mismo, se dirige específicamente y se une a la proteína del receptor, que se puede expresar en la superficie celular. En una realización, la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o una parte de unión del mismo, se dirige específicamente y se une a la proteína ligando afín. En una realización, la proteína ligando afín está diseñada molecularmente para ser que se puede expresar en la superficie celular. En varias realizaciones como las descritas en el presente documento, la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o la proteína diana, comprende una señal de retención del RE, que es la secuencia del extremo carboxilo KDEL (SEQ ID NO:1), que impide que las proteínas sigan la vía de secreción normal induciendo el transporte retrógrado desde cis-Golgi, con lo que se retiene eficazmente la proteína en el orgánulo. La molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o la proteína diana también pueden retenerse en otros orgánulos o compartimentos intracelulares mediante la ingeniería para que expresen, o la fusión molecular con, otras secuencias de señalización, por ejemplo, la secuencia YQRL (SEQ ID NO:2) para la retención en el aparato de Golgi, la secuencia SKL para la retención en los peroxisomas, o la secuencia CAAX (SEQ ID NO:3) para la retención en la membrana plasmática.

Métodos de selección basados en un fenotipo celular receptor-negativo

Una realización de la invención se refiere a un método de selección de la invención en donde se genera un fenotipo receptor-negativo de una célula. En una realización de este tipo, una línea celular se diseña molecularmente mediante ingeniería genética para expresar tanto una proteína del receptor expresada en la superficie celular como su proteína ligando afín, que se fusiona con la secuencia de señalización de retención KDEL (SEQ ID NO:1) para retener la proteína ligando afín en el RE. La proteína ligando afín se expresa y se retiene en el RE en virtud de la secuencia KDEL (SEQ ID NO:1). En el interior del RE, la proteína ligando conocida interactúa con su proteína del receptor expresada. Debido a que la proteína del ligando afín fue retenida en el RE, la proteína del receptor, a través de su interacción con el ligando afín retenido en el RE, también es consecuentemente retenida dentro del RE en las células. En consecuencia, la proteína del receptor no es transportada desde el RE y expresada o mostrada en la superficie celular, como habría sido típicamente en ausencia de una señal de retención. Retenida en el orgánulo celular, la proteína del receptor no es detectable por una molécula marcada detectablemente específica para la proteína del receptor, creando así un fenotipo receptor-negativo para la célula. El fenotipo receptor-negativo de las células que contienen la proteína del receptor de unión al ligando unida a su ligando afín y retenida en el RE puede evaluarse mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo detectable dirigido contra la proteína del receptor de unión al ligando de la superficie celular. Este aspecto puede visualizarse y ejemplificarse ventajosamente a través de la interacción del receptor de unión al ligando, el receptor I del hTNF-a, y su ligando afín, el hTNF-a, como se representa esquemáticamente en las Figs. 1Ay 1B.

Como se ilustra en el presente documento, una línea de células Jurkat expresa una proteína del receptor representativa, es decir, el receptor I del hTNF-a, que se muestra en la superficie de la célula. Como se describe en el Ejemplo 1 del presente documento, las células j Lt RG R5 expresan el receptor I del hTNF-a y se pueden transducir fácilmente para expresar y retener ciertas proteínas intracelularmente de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la línea celular JLTRG R5 puede transducirse para expresar la proteína ligando hTNF-a, fusionada a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:1) (hTNF-a-KDEL) ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1). La proteína de fusión hTNF-a-KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1) se une a su ligando de unión de la proteína del receptor I del hTNF-a intracelularmente, y ambas proteínas quedan retenidas en el RE. La presencia y la expresión de la proteína ligando pueden detectarse de forma más eficaz, por ejemplo, mediante la expresión de una etiqueta detectable, por ejemplo, DsRed, dentro de la célula. La proteína del receptor, debido a su retención en el RE a través de la unión a su ligando afín, que también está retenido en el RE, no se detecta en la superficie de la célula utilizando citometría de flujo y un anticuerpo anti-hTNF-a receptor I marcado. (Figs. 1A y 1B ), creando así un fenotipo de células de selección negativas para el receptor.

Métodos de selección basados en un fenotipo celular positivo para el receptor

Otra realización de la invención se refiere a un método de selección en el que se genera un fenotipo positivo para el receptor de una célula. Esta realización se refiere a la selección de una molécula de unión que se une específicamente a un antígeno/proteína diana. Para seleccionar una molécula de unión según esta realización, el ácido nucleico que codifica una molécula de unión se introduce en una línea celular, como la línea celular descrita anteriormente que expresa una proteína del receptor expresada en la superficie celular. En una realización, las células se transducen con partículas lentivíricas que comprenden una molécula de unión, es decir, un anticuerpo específico, o una parte de unión del mismo, por ejemplo, un dominio VL, que reconoce y se une a un antígeno diana. En una realización, las partículas introducen en las células una de una pluralidad de moléculas de unión, tales como moléculas de unión genéticamente diversificadas o anticuerpos, uno o más de los cuales pueden haber sido modificados genéticamente para tener propiedades de unión óptimas y para unirse con alta especificidad o afinidad a un antígeno/proteína diana y ser seleccionados. El antígeno diana de la molécula de unión o del anticuerpo puede ser la proteína del receptor expresada en la superficie celular o el ligando de esta proteína del receptor fusionado a la secuencia de retención del r E para su retención en el RE. Tras la unión tanto a la proteína del receptor como a la proteína ligando en el RE de la célula, el anticuerpo expresado bloquea e interrumpe la interacción entre la proteína del receptor y su ligando afín.

El bloqueo de la unión de la proteína del receptor a su ligando afín debido a la presencia y unión de la molécula de unión o anticuerpo en el RE da como resultado el tránsito y liberación de la proteína del receptor del RE y permite su expresión en la superficie de la célula. El fenotipo celular positivo para el receptor resultante puede evaluarse mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo detectable dirigido contra la proteína del receptor de unión al ligando de la superficie celular expresada en la superficie de la célula. La célula puede modificarse mediante ingeniería genética adicionalmente para contener una etiqueta detectable, como DsRed, que es útil para seleccionar y clasificar las células mediante citometría de flujo. Este aspecto se representa esquemáticamente en la Figs. 1C y iD. Un fenotipo celular positivo para el receptor se determina midiendo un nivel cuantificable de proteína del receptor en la superficie de la célula en virtud de su unión a un anticuerpo marcado de forma detectable. La molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo, puede recuperarse o aislarse de la célula y, opcionalmente, purificarse aún más para su uso empleando técnicas y métodos convencionales. Por ejemplo, las células que han sido clasificadas como positivas para la unión mediante el anticuerpo contra el receptor y/o la tinción celular, basándose en la detección de la fluorescencia y la intensidad media de la misma, pueden sembrarse y expandirse su crecimiento. Dichas células albergarán la molécula de unión o el anticuerpo que se unió al antígeno diana. El ADN puede ser extraído de la población celular expandida, y la molécula de unión o el anticuerpo pueden ser aislados y caracterizados adicionalmente utilizando métodos convencionales practicados por los expertos en la materia.

Como se demostró específicamente en las Figs. 1C y 1D utilizando un antígeno diana representativo e ilustrado, la línea celular JLTRG r 5 se transduce con partículas lentivíricas que codifican el dominio (o región) VL de anticuerpos que se dirigen y unen al receptor I del hTNF-a. La unión de uno o más de los dominios de anticuerpos VLtransducidos bloquea o interrumpe la interacción entre el receptor de unión al ligando y su ligando afín, liberando así el receptor del RE y permitiendo su expresión en la superficie de la célula. En la Fig. iC, se muestra que el anticuerpo VL, es decir, el dominio de unión a VL, se une a la parte de proteína del ligando de hTNF-a de la proteína de fusión del ligando de hTNF-a-KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1), bloqueando así la interacción de hTNF-a con el receptor I de hTNF-a en el RE y permitiendo que la proteína del receptor I de hTNF-a sea transportada y expresada en la superficie celular. En la Fig. 1D, se muestra que el anticuerpo VL se une a la proteína del receptor I del hTNF-a, bloqueando así la interacción del hTNF-a con el receptor I del hTNF-a en el RE y permitiendo que la proteína del receptor I del hTNF-a sea transportada y expresada en la superficie celular. Dicho receptor expresado por la superficie celular es detectable mediante un agente de unión detectable, tal como un anticuerpo específico del receptor. Se apreciará que en un caso en el que el anticuerpo, o una molécula de unión, se une específicamente a una proteína del receptor como su diana y permite que la proteína del receptor transite por el RE y se exprese en la membrana plasmática de la célula debido a la interrupción o neutralización de la unión de la proteína del receptor a su ligando afín que se retiene en el orgánulo celular, la unión del anticuerpo, o de la molécula de unión, a la proteína del receptor de forma óptima no impide o bloquea en paralelo la expresión de la proteína del receptor en la membrana celular.

Para determinar si una molécula de unión, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un dominio de unión a antígenos VL, ha bloqueado, inhibido, neutralizado o interrumpido la interacción receptor-ligando afín mediante la unión específica al receptor o al ligando en el orgánulo celular, las células se exponen a un anticuerpo marcado detectablemente dirigido a la proteína del receptor expresada, por ejemplo, el receptor I de hTNF-a, y pueden clasificarse en un citómetro de flujo (clasificador celular). Normalmente, se utiliza la detección por fluorescencia. Además, las células también pueden construirse para contener una etiqueta detectable para facilitar la clasificación, como DsRed, GFP y similares. De forma ilustrativa, la medición del nivel de anticuerpo marcado unido a la proteína del receptor de unión al ligando en la superficie celular indica que una molécula de unión específica, por ejemplo, un anticuerpo o un dominio VL, dentro de la célula se ha unido tanto al receptor de unión al ligando, como a su ligando afín, y ha impedido, interrumpido, neutralizado o bloqueado la interacción del receptor de unión al ligando con su ligando afín en el orgánulo, como el RE. El bloqueo de la interacción receptor-ligando permite que el receptor salga del RE y se exprese en la superficie celular, donde puede ser detectado por una molécula de unión específica marcada de forma detectable. El análisis de las células es adecuado para los ensayos de alto rendimiento, incluidos los análisis FACS y de citometría de flujo y sus variaciones.

En una realización ilustrada, el anticuerpo específico, o un fragmento de unión o parte del mismo, una proteína del receptor de unión al ligando que se puede expresar en la superficie celular y su ligando afín fusionado a una señal de retención de RE se coexpresan en la misma célula. En el momento en que los tres tipos de proteínas están presentes en el RE, el anticuerpo, que, en esta realización, está dirigido al ligando afín, se dirige específicamente y se une al ligando afín retenido en el RE. Por lo tanto, la interacción entre la proteína del receptor y su ligando afín dentro del RE es bloqueada, neutralizada o interrumpida por el anticuerpo unido al ligando afín como diana, liberando así eficazmente el ligando afín de su interacción con la proteína del receptor en el RE y liberando la proteína del receptor, permitiendo su tránsito desde el RE a la membrana plasmática de la célula donde se expresa en la superficie celular. Un anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra la proteína del receptor expresada en la superficie celular es capaz de unirse a la proteína del receptor en la superficie celular y sirve para cuantificar el nivel de proteína del receptor expresada. La detección del receptor expresado en la superficie celular es indicativa de la presencia de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o un fragmento o parte de unión del mismo, expresado en la célula. Se pueden emplear métodos convencionales para recuperar y aislar la molécula de unión, o anticuerpo, y amplificar su expresión. Así, la molécula de unión que tiene propiedades de unión específicas se selecciona con el método de la invención.

En otra realización ilustrada, el anticuerpo específico, o un fragmento de unión o parte del mismo, una proteína del receptor de unión al ligando que se puede expresar en la superficie celular y su ligando afín fusionado a una señal de retención de RE se coexpresan en la misma célula. En el momento en donde los tres tipos de proteínas están presentes en el RE, el anticuerpo no se une al ligando afín retenido en el RE, sino que se dirige a la proteína del receptor de unión al ligando y se dirige específicamente a ella. En este caso, la interacción entre la proteína del receptor y su ligando afín sigue siendo bloqueada, neutralizada o interrumpida por la unión del anticuerpo. En esta realización, la proteína del receptor se libera de forma similar y efectiva de su interacción con su ligando afín retenido en el RE. En consecuencia, la proteína del receptor puede transitar desde el RE y expresarse en la superficie celular, donde puede ser detectada como se ha descrito. Para cada una de estas realizaciones, un anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra la porción expresada extracelularmente de la proteína del receptor de la superficie celular puede unirse y utilizarse para cuantificar el nivel de proteína del receptor expresada en la superficie celular. De acuerdo con el método de selección, el gen que codifica una molécula de unión o un anticuerpo que se ha unido a la proteína del receptor o al ligando afín dentro de la célula puede entonces aislarse o recuperarse de la célula según se desee. Véase, por ejemplo, el ejemplo 4 del presente documento. Por ejemplo, los genes se pueden aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa o aislarse del ADN celular por escisión utilizando enzimas de restricción adecuadas que reconozcan los sitios de escisión que rodean al gen de interés. Además, no solo se puede recuperar el ADN que codifica la molécula de unión o el anticuerpo de interés a partir de un conjunto de células que expresan el ADN codificante, sino que se pueden detectar clones individuales que expresan el a Dn mediante análisis FACS, y el ADN codificante se puede extraer de un solo clon.

En otra realización, se proporciona un método para seleccionar anticuerpos que se unen a un objetivo específico dentro de una célula. Dichos anticuerpos muestran preferiblemente una unión óptima a una diana específica y tienen preferiblemente una alta afinidad o especificidad de unión. Como ejemplo representativo del método, se construye una línea celular que expresa una molécula diana deseada (proteína) que se puede expresar en la superficie de la célula. Para ello, la línea celular se diseña para que exprese y produzca la proteína diana, que, a su vez, se diseña molecularmente mediante ingeniería genética según sea necesario, para que se exprese en la membrana plasmática de la célula. Por ejemplo, la proteína diana puede contener, o construirse para que contenga, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, así como su dominio extracelular, para una adecuada expresión (y detección) en la membrana plasmática. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos se introducen en la línea celular, por ejemplo, mediante la transducción por partículas de lentivirus. En consecuencia, las células se transducen con partículas lentivíricas que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos (por ejemplo, dominios de unión VL y/o VH) fusionados a la secuencia de señalización KDEL (SEQ ID NO:1) para su retención en el RE. Cuando el anticuerpo y la proteína diana se expresan y están presentes en el RE, el anticuerpo es capaz de unirse específicamente a su molécula diana (proteína). De acuerdo con el método, la proteína diana es retenida en el RE en virtud de su unión al anticuerpo retenido en el RE. Como consecuencia, la molécula diana (proteína) unida al anticuerpo no puede transitar desde el RE, y el nivel de expresión de la molécula diana (proteína) en la superficie de la célula disminuye o es nulo. En consecuencia, prácticamente no se detecta la proteína diana que se puede expresar en la superficie celular.

La disminución de la expresión de una molécula (proteína) diana en la superficie celular puede determinarse en relación con un control positivo, por ejemplo, las células que expresan la molécula diana en la superficie, o en relación con las células que expresan la molécula (proteína) diana, pero que no se transducen con vectores lentivíricos que codifican los anticuerpos específicos de la molécula (proteína) diana que albergan una señal de retención de RE. En ausencia de dicho anticuerpo expresado en las células de control, la molécula diana que se puede expresar en la superficie celular (proteína) no queda retenida en el RE, es transportada y expresada en la membrana plasmática, y puede ser detectada por agentes marcados detectables en la superficie de la célula. Alternativamente, puede incluirse un control en donde los vectores lentivíricos que pueden llevar secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína irrelevante o inespecífica, por ejemplo, un anticuerpo, o una parte de unión del mismo, pueden utilizarse en paralelo para transducir células con fines comparativos. De manera similar a las otras realizaciones descritas en el presente documento, el fenotipo positivo o negativo del receptor de superficie puede detectarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo, empleando un anticuerpo específico detectable para la molécula diana (proteína), y posteriormente, las células que expresan el anticuerpo deseado pueden seleccionarse y recuperarse el anticuerpo.

Las Figs. 2A y 2B demuestran y ejemplifican una realización de los métodos de selección de la invención. Como se representa e ilustra, se construye una línea celular para expresar hTNF-a, una proteína diana representativa expresada en la superficie celular, que tiene un dominio extracelular fusionado con un dominio transmembrana y una secuencia TEV, un dominio citoplásmico representativo para el anclaje adecuado de la proteína en la membrana celular. En la figura, el hTNF-a expresado se puede detectar en la superficie de la célula utilizando un anticuerpo marcado dirigido contra el hTNF-a. (Fig. 2A). La célula se transduce con partículas lentivíricas que expresan las regiones variables (VL) de la cadena L de los anticuerpos anti-hTNF-a fusionadas con la secuencia KDEL (SEQ ID NO:1) (VL (anticuerpo)-KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1)) dando como resultado la retención del anticuerpo en el RE, como se describe en los Ejemplos del presente documento. Si un anticuerpo VL se une específicamente y/o se une con alta afinidad a la proteína diana en el RE, el complejo que comprende el anticuerpo unido a la proteína diana hTNF-a queda retenido en el RE, y la proteína diana hTNF-a ya no se detecta ni es detectable en la superficie de la célula. (Fig. 2B ) El fenotipo celular resultante, es decir, la presencia o ausencia de la proteína diana en la superficie celular, se detecta mediante citometría de flujo empleando un anticuerpo marcado de forma detectable dirigido contra la proteína diana. Como se muestra en la Fig. 2A, la proteína hTNF-a expresada en la superficie celular es detectada en la superficie de la célula por un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a la proteína expresada en la superficie celular. En la Fig. 2B, debido a que las células son transducidas con moléculas de anticuerpo-KDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1), el anticuerpo que se une a la proteína hTNF-a retiene esta proteína diana en el RE, y la proteína hTNF-a ya no se detecta en la superficie de la célula.

La tecnología de la plataforma y los métodos de la invención son particularmente aptos para un formato de cribado o detección de alto rendimiento. Por ejemplo, la citometría de flujo es adecuada para detectar y cribar células diseñadas mediante ingeniería que expresan o no expresan una proteína determinada, por ejemplo, una proteína diana como una proteína del receptor de unión a ligandos o un ligando, en la superficie celular; que expresan un anticuerpo o anticuerpos de interés; o que contienen proteínas retenidas en un orgánulo celular. Otros métodos de cribado o detección adecuados para su uso son los métodos de inmunoensayo, como los enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), fluoroinmunoensayo (FIA), inmunoensayo quimioluminiscente (CIA), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF), ensayo luminiscente (señales de tipo "brillo"), análisis de ondas evanescentes, etc., que pueden llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Métodos intracelulares para la diversificación genética de moléculas de unión a anticuerpos

Los dedos de cinc, por ejemplo, los dedos de cinc Cys2His2, comprenden la familia de factores de transcripción más común en organismos que van desde la levadura hasta los seres humanos. Las proteínas de dedo de cinc diseñadas o rediseñadas a propósito para contener determinadas especificidades de unión al ADN proporcionan una tecnología adecuada para dirigir dominios funcionales a un gen de interés en varios tipos de células. Las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) constituyen una poderosa herramienta para llevara cabo la manipulación genómica dirigida dentro de una variedad de tipos celulares.

Las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) son proteínas sintéticas que contienen un dominio de dedo de cinc de unión al ADN unido a un dominio de endonucleasa no específico. En particular, las ZFN pueden contener un dominio de dedo de cinc de unión al ADN fusionado con el dominio de corte del ADN de la endonucleasa de restricción Fokl. Los ZFN pueden introducir roturas bicatenarias (DSB) que estimulan procesos de recombinación homóloga y no homóloga que pueden aprovecharse para realizar manipulaciones genómicas y dar lugar a diversidad y variación genéticas. Estos procesos celulares pueden aprovecharse para generar ediciones genómicas in vitro o in vivo dirigidas con precisión, con supresiones de genes específicas, es decir, inactivaciones génicas, integraciones u otras modificaciones. Se ha utilizado una rotura de doble cadena en un sitio específico del genoma con ZFN para interrumpir permanentemente la secuencia genómica que rodea el sitio diana de ZFN en una variedad de organismos eucariotas a través de la reparación imperfecta del ADN mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), ( Ho M, Pastan I (2009), Methods Mol. Biol., 525: 337-352, xiv). El direccionamiento génico es un método que puede reparar o inactivar cualquier gen de interés. Las estrategias de direccionamiento génico utilizan la introducción de un DSB en un locus genómico para mejorar la eficacia de la recombinación, por ejemplo, con un "molde de reparación" de ADN homólogo introducido exógenamente. Los DSB pueden estimular la eficacia de la recombinación varios miles de veces, acercándose a frecuencias de direccionamiento génico tan altas como del 50%.

De acuerdo con la invención, el uso de ZFN y los procesos moleculares relacionados con ellos se utilizan como una estrategia genética para generar uno o más, por ejemplo, una población de anticuerpos diversificados, es decir, anticuerpos, o fragmentos de unión o partes de los mismos, que tienen diversidad en sus interacciones específicas y capacidades de unión con proteínas y antígenos diana. La diversidad o variabilidad resultante de la escisión y reparación dirigidas dentro del ADN que codifica las CDR de una molécula de anticuerpo puede generar uno o más anticuerpos diversificados con propiedades de unión específicas y óptimas, en las que los anticuerpos diversificados tienen el potencial de poseer una mayor especificidad, afinidad, avidez, y similares, en la interacción y unión con sus moléculas/proteínas diana y antígenos diana. En general, un anticuerpo diversificado o un anticuerpo de unión óptima de una población de anticuerpos diversificados, o partes de los mismos, tal como se describe en el presente documento, puede cribarse o seleccionarse utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, visualización de ácidos ribosómicos o nucleicos, sistemas de expresión en fagos o células, o utilizando líneas de linfocitos B concretas que incluyen enzimas como AID. Alternativamente, un anticuerpo diversificado o un anticuerpo de unión óptima de una población de anticuerpos diversificados, o partes de los mismos, puede ser conveniente y ventajosamente cribado o seleccionado utilizando los métodos de selección de células individuales descritos en el presente documento.

En consecuencia, en otro de sus aspectos, la invención proporciona métodos para inducir la variabilidad en localizaciones específicas de dominios de unión de moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, utilizando secuencias de reconocimiento de ácido nucleico de proteínas de unión a ADN de dedos de cinc y nucleasas de dedos de cinc diseñadas para unirse a las secuencias de reconocimiento. En una realización, los sitios de reconocimiento de dedos de cinc, es decir, las secuencias de ácido nucleico, se introducen en la arquitectura de la CDR de la inmunoglobulina establecida del dominio variable de cadenas pesadas de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada humana (hVH), y/o el dominio variable de cadenas ligeras de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera humana (hVL). Dependiendo del grado de variabilidad deseado, las secuencias de reconocimiento de dedos de cinc pueden introducirse en uno, dos o las tres CDR, es decir, CDR1, CDR2, CDR3, en uno o ambos dominios VH y VL de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, por ejemplo, los dominios VH y/o VL.

La introducción de sitios de reconocimiento de dedos de cinc en el locus CDR permite la alteración génica dirigida inducida por nucleasas de dedos de cinc. Los dominios de unión al ADN de las ZFN individuales suelen contener entre tres y seis repeticiones individuales de dedos de cinc y cada uno puede reconocer entre unos 9 y unos 18 pares de bases. Si los dominios de los dedos de cinc son perfectamente específicos para su sitio diana, entonces incluso un par de ZFN de 3 dedos que reconocen un total de 18 pares de bases pueden dirigirse a un solo locus en el genoma de un mamífero. La determinación de los sitios de reconocimiento de ZFN adecuados, incluida la búsqueda de los sitios diana de la proteína dedo de cinc y el diseño de proteínas, por ejemplo, ZFN, que se dirigen a ellos, puede ser facilitada por la información disponible en la técnica, por ejemplo, a través de publicaciones y sitios web de Internet disponibles públicamente e interactivos, como los que se proporcionan para su uso por el profesional experto, por ejemplo, desde el Laboratorio de Carlos F. Barbas III, Memoria de Tesis doctoral, The Scripps Research Institute (TSR1), La Jolla, Calif. (worldwideweb.cincfingertools.org ) y el Laboratorio de Daniel Voytas, miembro de The Zinc Finger Consortium, que proporciona información disponible al público sobre el diseño de dedos de cinc (worldwideweb.cincfingers.org).

Como se indica en el sitio web "cincfingertools", hasta la fecha se han realizado avances significativos en el desarrollo de dominios proteicos modulares que reconocen tripletes específicos de la secuencia de ADN. Estos dominios pueden fusionarse para crear proteínas que puedan unirse a una secuencia de ADN seleccionada. El motivo del dedo de cinc Cys2-His2, identificado por primera vez en el factor de transcripción TFIIIA que se une al ADN y al ARN, es quizás el andamiaje estructural ideal sobre el que podría construirse una proteína de secuencia específica. Un único dominio de unión de dedos de cinc consta aproximadamente de 30 aminoácidos con un simple pliegue ppa estabilizado por interacciones hidrófobas y la quelación de un único ion de cinc. La presentación de la hélice a de este dominio en el surco principal del ADN permite los contactos de base específicos de la secuencia. Cada dominio de dedo de cinc suele reconocer normalmente tres pares de bases de ADN, aunque la variación en la presentación helicoidal puede permitir el reconocimiento de un sitio más extenso. A diferencia de la mayoría de factores de transcripción que dependen de la dimerización de los dominios proteicos para extender los contactos proteína-ADN a secuencias o direcciones de ADN más largas, las simples repeticiones covalentes en tándem del dominio del dedo de cinc permiten el reconocimiento de secuencias asimétricas más largas de ADN por este motivo. Dado que cada dominio de dedo de cinc suele unirse a tres pares de bases de la secuencia, un alfabeto de reconocimiento completo requiere la caracterización de 64 dominios. El TSRI ha adoptado una estrategia sistemática para generar un alfabeto de reconocimiento modular utilizando la selección por expresión en fagos y el refinamiento por mutagénesis dirigida al sitio para preparar los dominios de dedos de cinc que representan los subconjuntos 5'-GNN-3',5'-ANN-3' y 5-CNN-3' de este código de reconocimiento de 64 elementos. Además, las publicaciones del Laboratorio Barbas han proporcionado varios dominios 5'-TNN-3' e información sobre este alfabeto de reconocimiento.

Como comprenderá el profesional experto, los principales parámetros a optimizar cuando se diseña una ZFP son típicamente la especificidad y la afinidad de unión al ADN. A modo de ejemplo, una proteína de 6 dedos destinada a reconocer un sitio diana de 18 pb y construida con el enlazador convencional TGEKP (SEQ ID NO: 47) proporciona una solución ilustrativa para la regulación genética endógena. Las proteínas que se unen a su objetivo con una afinidad de 10 nM o más son reguladores productivos; las ZFP con una afinidad de 1 nM o más tienen una actividad óptima. La afinidad por una ZFP puede determinarse realizando un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA). La información interactiva de acceso público sobre las proteínas de unión a dedos de cinc facilita la determinación de sitios de reconocimiento concretos. De acuerdo con la presente invención, los sitios de reconocimiento de la forma (XXX)3N6(XXX)3, donde "XXX" son tripletes para los que existen dedos de cinc y "N" es cualquier nucleótido. Las nucleasas de dedos de cinc ZFN1 a ZFN4 descritas en este documento se crearon mediante esta metodología.

En una realización de tales métodos, se introducen secuencias de reconocimiento de dedos de cinc en una de lastres CDR en uno o ambos dominios VH y VL. En una realización, las secuencias de reconocimiento de dedos de cinc se introducen en dos de las tres CDR, en cualquier combinación, en uno o ambos dominios VH y VL. En una realización, las secuencias de reconocimiento de dedos de cinc se introducen en las tres CDR, en cualquier combinación, en uno o ambos dominios VH y VL. En una realización, se introducen secuencias de reconocimiento de dedos de cinc en al menos una CDR en una o ambas regiones VH y VL de las cadenas de anticuerpos pesada y ligera, respectivamente. En una realización, se introducen secuencias de reconocimiento de dedos de cinc en cada una de las CDR1 y CDR2 de las regiones VH y VL de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, respectivamente. En una realización, se introducen secuencias de reconocimiento de dedos de cinc en cada una de las CDR2 y CDR3 de las regiones VH y VL de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, respectivamente. En una realización, se introducen secuencias de reconocimiento de dedos de cinc en cada una de las CDR1 y CDR3 de las regiones VH y VL de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, respectivamente. En una realización, las secuencias de reconocimiento de dedos de cinc se introducen en cada una de las CDR, a saber, CDR1, CDR2 o CDR3, de las regiones VH y VL de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos, respectivamente. En una realización, se introduce al menos una secuencia de reconocimiento en una CDR determinada. En una realización, se introducen dos o más secuencias de reconocimiento en una CDR dada. En una realización, se introducen dos secuencias de reconocimiento en una CDR dada. En una realización, se introducen dos secuencias de reconocimiento en dos CDR dadas, tales como, por ejemplo, CDR1 y CDR3.

En una realización específica, las secuencias CDR1 y CDR3 dentro de los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada contienen diferentes secuencias de reconocimiento de proteínas de unión al ADN en dedo de cinc. Más concretamente, cada una de las CDR1 y CDR3 contiene dos secuencias diferentes de reconocimiento de la proteína de unión al ADN de tipo dedo cinc. Para los diferentes sitios diana de cada CDR, se ensamblan in vitro dos dominios de unión al ADN de la proteína de dedos de cinc (ZFP), es decir, secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos, que contienen cada una cuatro motivos de dedos de cinc (que reconocen un total de 24 pares de bases), de acuerdo con los métodos publicados, por ejemplo, Moore, M., Choo, Y. & Klug, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1432-1436 (2001); Jamieson, A. C., Miller, J. C. y Pabo, C. O., Nat. Rev. Drug Discov., 2, 361-368 (2003). En total, se introducen cuatro secuencias de reconocimiento en el dominio VH y cuatro secuencias de reconocimiento en el dominio VL. Las secuencias de reconocimiento de la proteína de unión al ADN en dedo de cinc están acopladas al dominio de escisión del ADN de la enzima de restricción de tipo IIS, Fokl, para producir nuevos ZFN en los que la localización de la escisión del ADN está determinada por la especificidad de unión al ADN de los dominios ZFP diseñados (por ejemplo, Urnov, F. D. et al., Nature 435, 646-651 (2005 ); Moore, M., Choo, Y. y Klug, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1432-1436 (2001); Smith, J. etal., NucleicAcids Res. 28, 3361-3369 (2000)).

En un ejemplo representativo, las regiones CDR1 y CDR3 de VH y VL que comprenden secuencias de direccionamiento de dedos de cinc introducidas se muestran en la Fig. 3. El área rectangular entre las regiones CDR1 y CDR3 representa la CDR2, que no contiene secuencias diana de dedos de cinc en este caso. En la dirección 5' a 3', la siguiente es una secuencia representativa de la región CDR (por ejemplo, tanto la CDR1 como la CDR3) con dos secuencias de direccionamiento de dedos de cinc representadas por "Ns" contiguas: 5' tactcaNNNNNNNNNNNNctgatNNNNNNNNNNNNttactca 3' (SEQ ID NO:6). El número total de aminoácidos en cada una de las regiones CDR de VH y VL difiere según la CDR específica, el anticuerpo específico o el tipo de anticuerpo, y si la CDR reside dentro de la cadena L o H de un anticuerpo. En términos generales, una CDR comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 o 15 aminoácidos; sin embargo, las CDR de las moléculas de anticuerpos están bien establecidas y pueden identificarse basándose en la información de la secuencia, incluida la información de la secuencia marco, como se describe, por ejemplo, en Wu, T. y Kabat, E. A., 1970, J. Exp. Med., 132:211-250; y Hood, L. et al., 1975, Ann. Rev. Genetics, 9:305-353.

Se apreciará que las secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos de las proteínas de unión a ADN de dedos de cinc pueden introducirse en las CDR fuera de los dominios VH y/o VL en los que típicamente residen. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las CDR, que pueden ser aisladas de un dominio VH y/o Vl , pueden modificarse molecularmente mediante ingeniería genética para contener las secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos de las proteínas de unión al ADN en dedo de cinc en el contexto de, por ejemplo, un plásmido o construcción vectorial adecuada, o un casete de expresión de ácido nucleico, como se conoce en la técnica. Una construcción de ácido nucleico o un casete pueden comprender uno, dos o todas las CDR, a saber, CDR1, CDR2 y/o CDR3. Las CDR pueden estar situadas de forma lineal o en tándem dentro de la construcción o casete. Las una o más CDR, que han sido modificadas para contener secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos de proteínas de unión a ADN de dedos de cinc, pueden ser introducidas posteriormente en los dominios VH y/o VL, es decir, en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos dominios, utilizando técnicas moleculares convencionales conocidas por los expertos en la materia. Alternativamente, las secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos de las proteínas de unión al ADN de tipo dedo de cinc pueden introducirse en las CDR, ya que residen naturalmente dentro de los dominios VH y/o VL. En consecuencia, las secuencias de ácidos nucleicos del dominio VH y/o VL que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la CDR se diseñan mediante ingeniería genética usando técnicas convencionales de biología molecular para contener las secuencias de reconocimiento de ácidos nucleicos de las proteínas de unión al ADN en dedo de cinc dentro de una o más de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la CDR, produciendo así una o más CDR modificadas. Como comprenderá el experto, los dominios VH y/o VL que comprenden la una o más CDR modificadas se pueden modificar molecularmente mediante ingeniería genética como se desee, de manera que se expresen de forma operable con regiones constantes de cadenas H y L de inmunoglobulina adecuadas para producir un anticuerpo de longitud completa que comprenda CDR modificadas.

En una realización, las secuencias diana de dedos de cinc se introducen en la región CDR con tres marcos de secuencia diferentes para suprimir el desplazamiento de marco y la consiguiente falta de producción de anticuerpos. Los dominios variables humanos diseñados mediante ingeniería genética resultantes se reintroducen en la inmunoglobulina G (IgG) humana, por ejemplo, la IgG1, produciendo una proteína de anticuerpo de longitud completa con regiones variables que contienen CDR1 y CDR3 artificiales diseñadas para incluir diferentes secuencias de reconocimiento de dedos de cinc o sitios de orientación. (Figs. 3 y 4 ). En una realización, en cada CDR, dos sitios de reconocimiento de dedos de cinc diferentes se colocan de tal manera que los dos sitios de reconocimiento de dedos de cinc diferentes son reconocidos por dos nucleasas de dedos de cinc diferentes. En este caso representativo, las CDR1 y CDR3 son, por tanto, el objetivo de esta estrategia para inducir la escisión específica en estos sitios de la secuencia intra-CDR. Dependiendo del grado de variabilidad que se desee, la CDR2 puede permanecer en su secuencia nativa, o puede ser sometida a un direccionamiento de dedos de cinc, de manera similar a la descrita para la CDR1 y la CDR3. En total, para una IgG de longitud completa, se pueden introducir un total de cuatro puntos calientes de dedos de cinc diferentes en la cadena pesada variable y cuatro puntos calientes de dedos de cinc diferentes en la cadena ligera variable. (Véase, por ejemplo, la Fig. 3).

La eficacia y validez de este enfoque se evaluó empíricamente introduciendo variabilidad en los genes de la inmunoglobulina dentro de las regiones CDR1 y CDR3, como se ha descrito, y expresando proteínas nucleasas de dedos de cinc (ZFN) dirigidas a las secuencias Vh y VL en linfocitos T de Jurkat. El análisis del ADN aislado de cada tipo de célula empleando el ensayo de nucleasas Surveyor (como el que está disponible en Transgenomic Inc, USA/Transgenomic, Ltd., Europa), tal como se utiliza para detectar las mutaciones inducidas por el ZNF, mostró una mutación eficiente del gen IgG1. El ensayo de nucleasas Surveyor es una tecnología de detección de mutaciones sencilla y flexible para el descubrimiento y el cartografiado de mutaciones tanto conocidas como desconocidas. Esta tecnología se basa en una endonucleasa específica de ADN emparejado incorrectamente del apio, la nucleasa Surveyor, que es un miembro de la familia de nucleasas CEL de endonucleasas de ADN vegetal. La nucleasa Surveyor escinde con alta especificidad en el lado 3' de cualquier sitio de emparejamiento incorrecto en ambas cadenas de ADN, incluyendo todas las sustituciones de bases y las inserciones/deleciones de hasta al menos 12 nucleótidos. La tecnología de las nucleasas Surveyor implica cuatro pasos: (i) PCR para amplificar el ADN diana a partir del ADN de referencia mutante y natural; (ii) hibridación para formar heterodupletes entre el ADN de referencia mutante y el natural; (iii) tratamiento del ADN hibridado con la nucleasa Surveyor para escindir los heterodupletes; y (iv) análisis de los productos de ADN digeridos utilizando la plataforma de detección/separación elegida. La tecnología es muy sensible. Se empleó el análisis de la secuencia de los genes de la inmunoglobulina clonados y amplificados a partir de linfocitos T de Jurkat para confirmar la presencia de inserciones y deleciones inducidas por ZFN en el gen correspondiente.

En algunas realizaciones, además de la mutación genética mediada por ZFN y la diversidad descrita en el presente documento, la eficacia de la mutagénesis dentro de las CDR puede aumentarse aún más. Esto puede lograrse mediante la coexpresión en células que expresan una o más moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o partes de unión de los mismos, que comprenden CDR modificadas y uno o más elementos de un par ligando-receptor-ligando afín por la(s) molécula(s) de unión, otras proteínas reguladoras involucradas en eventos de ADN y recombinación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la proteína reguladora Tax derivada de virus ( Lemoine, F. et al., 2000, AIDS Research and Human Retroviruses, 16(16):1623-1627; Chandhasin, C. et al., 2008, J. Virology, 82(14):6954-6961; Ishikawa, C., et al., 2011, Carcinogenesis, 32(1):110-119; y Baydoun, H. etal., 2012, PLOS One, 7(8):e42226 ); p30 derivado de virus ( Baydoun, H. et al., 2011, Blood, 117(22):5897-5906 ); transferasa terminal; o por tratamiento químico. De acuerdo con dichas realizaciones, la respuesta (DSBR) a la rotura bicatenaria (DSB) dependiente de ATM en las células reconoce las DSB del ADN y genera complejos asociados a la cromatina alrededor de las DSB que promueven la reparación de las DSB a través de C-Nh Ej . Para este proceso, se requiere la activación de varias serina/treonina quinasas similares a la fosfatidilinositol-3, incluyendo las DNA-PKc y la ATM. La respuesta a la DSB dependiente de la ATM conduce al ensamblaje de focos macromoleculares en regiones de cromatina de gran tamaño (por ejemplo, dos megabases o más) que flanquean la DSB. Se cree que estos focos sirven como andamios para estabilizar los extremos de las DSB y facilitar el reclutamiento de factores adicionales de reparación y señalización del punto de control. Por ejemplo, las células deficientes en DNA-PKc requieren de ATM para la reparación de los extremos de las RS, lo que indica que DNA-PKc y ATM tienen funciones superpuestas en el contexto de la recombinación de inmunoglobulina V(D)J. Por lo tanto, para aumentar la C-NHEJ, el uso de inhibidores de la cinasa ATM, por ejemplo, (2-Morfolina-4-il-6-tiantena-1-il-pirano-4-ona), o inhibidores de la DNA-PK, por ejemplo, (2-(Morfolina-4-il)-benzo[h]cromen-4-ona, LY293646) puede aumentar la variabilidad de la diversificación de CDR de acuerdo con los métodos de la invención.

Como se describe en el presente documento, las secuencias de nucleasas de dedos de cinc se utilizan junto con las secuencias de orientación de proteínas de dedos de cinc insertadas en las CDR de VH y/o VL de acuerdo con los métodos descritos para generar diversidad, en particular, diversidad en la actividad de unión al antígeno diana, en una o más moléculas de anticuerpos. Las ZFN utilizadas en los métodos del presente documento están diseñadas para contener al menos una, por ejemplo dos, secuencias de reconocimiento de la unión al ADN de la proteína de dedo de cinc ("región de direccionamiento"), que dirige las ZFN expresadas para unirse a las secuencias de reconocimiento o regiones de orientación introducidas en las CDR. A título ilustrativo, pero sin limitar la invención, la Fig. 5 presenta construcciones representativas diseñadas para expresar nucleasas de dedo de cinc en las células en las que también se coexpresan uno o más anticuerpos (o uno o más anticuerpos diversificados) y proteínas diana de acuerdo con los métodos de la invención.

La invención abarca un método para generar diversidad o variabilidad genética de anticuerpos mediante la modificación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las inmunoglobulinas. En consecuencia, el método comprende (a) introducir en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc para generar uno o más sitios diana no idénticos dentro de las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR para unir una o más nucleasas de dedos de cinc (ZFN), produciendo así secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR modificadas; (b) introducir en una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) las secuencias de sitio diana del dominio de unión de ADN de dedo de cinc de (a) enlazadas operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de escisión del ADN de una enzima de restricción de tipo IIS, en la que el corte de ADN por la ZFN está determinado por las secuencias de sitio diana dentro de la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada de (a); y (c) expresar las secuencias de ácido nucleico de (b) en una célula que contenga ácido nucleico que codifique al menos un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o al menos un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) que comprenda la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada de (a) en condiciones en las que la ZFN expresada se une y escinde la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada dentro de la secuencia del sitio diana.

En una realización del método anterior para generar moléculas de unión genéticamente diversas, las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc que se introducen en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden diferentes secuencias de reconocimiento. En diversas realizaciones, las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3; las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3; las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en cada una de la CDR1 y CDR3. En diversas realizaciones, se introduce una secuencia de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3; se introducen al menos dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3; o se introducen dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3. En otras diversas realizaciones, se introduce una secuencia de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3; se introducen al menos dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3; o se introducen dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3. En una realización, las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN del dedo de cinc introducidas son diferentes. En una realización, se introducen dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en cada una de las CDR1 y CDR3.

En otras realizaciones del método descrito anteriormente, se introducen dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3 o en cada una de las tres CDR. En una realización, las dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en cada una de las CDR comprenden la SEQ ID NO:6. En una realización, las dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 comprenden la SEQ ID NO:6. En otra realización, las dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL comprenden un total de 24 pares de bases. En otra realización, en (b) del método anterior, la enzima de restricción de tipo II es Fok I. En una realización, en (b) del método, las secuencias de ácido nucleico que codifican las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) se introducen en una construcción que comprende una primera secuencia de ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VH, una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VH, y una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VH y una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VH. En una realización, el método comprende (i) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:7 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:8, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:9 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:10; y (ii) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:11 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:12, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:13 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:14. En una realización, en (b) del método, las secuencias de ácido nucleico que codifican las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) se introducen en una construcción que comprende una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 de un dominio VL, una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 de un dominio VL; y una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR3 de un dominio VL y una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR3 de un dominio VL. En una realización, el método comprende (i) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:15 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:16, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:17 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:18; y (ii) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:19 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:20, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:21 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:22. En algunas realizaciones, la construcción comprende un vector lentivírico. En varias realizaciones, el anticuerpo de longitud completa se selecciona entre un anticuerpo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo IgG; el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4; o el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, en (c) del método, la célula es una línea de linfocitos T o una línea de linfocitos T de Jurkat. En una realización, el método comprende además (d) expresar en la célula una proteína del receptor que se puede expresar en la superficie celular y que es una diana potencial que se puede unir por el dominio VH y/o VL que comprende CDR modificadas de (c); (e) expresar en la célula un ligando afín a la proteína del receptor, estando el ligando afín marcado molecularmente con una secuencia para retener el ligando en un orgánulo intracelular en condiciones que permitan la retención del ligando en el orgánulo y la interacción de la proteína del receptor y el ligando afín en el orgánulo, siendo el ligando afín una diana potencial que se puede unir por el dominio VH y/o VL de (c); y (f) detectar el nivel de la proteína del receptor expresada en la superficie celular; donde, si el dominio Vh y/o VL se une a la proteína del receptor o al ligando afín y bloquea o interrumpe su interacción de unión en el orgánulo, la proteína del receptor transita por el orgánulo y se expresa y detecta en la superficie celular, y donde el dominio VH y/o VL que bloquea o interrumpe la interacción de la proteína del receptor y el ligando es recuperable de la célula. En varias realizaciones del método, la secuencia de retención de orgánulos intracelulares es una secuencia de retención del RE o de Golgi; y la secuencia de retención del RE es la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO:1).

En una realización, en (a) del método anterior, las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR están contenidas dentro de una construcción o un casete de ácido nucleico. En una realización, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la CDR están incluidas dentro de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o secuencias de ácido nucleicos que codifican un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL). En una realización, en (c) del método anterior, la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada está incluida dentro de un anticuerpo de longitud completa que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH), y que comprende secuencias de ácido nucleicos que codifican un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL), donde las secuencias de ácido nucleicos resultantes codifican anticuerpos de longitud completa que comprenden dominios VH y VL que comprenden CDR modificadas. En una realización, el método anterior comprende además amplificar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de dominio VH y/o VL y clonar las proteínas del dominio VH y/o VL de la célula.

En otra realización, en (b) del método anterior, la enzima de restricción de tipo II Fok I. En una realización, en (b) del método anterior, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) se introducen en una construcción que comprende una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VH, una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VH, y una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VH y una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VH. En una realización, el método anterior comprende (i) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:7 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:8, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:9 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:10; y (ii) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:11 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:12, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:13 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:14. En una realización, en (b) del método anterior, las secuencias de ácido nucleico que codifican las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) se introducen en una construcción que comprende una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VL, una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR1 de un dominio VL; y una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VL y una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 de un dominio VL.

En una realización, el método anterior comprende (i) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:15 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:16, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:17 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:18; y (ii) la primera secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:19 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:20, y la segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de CDR3 comprende una secuencia diana como se establece en la SEQ ID NO:21 y una secuencia de reconocimiento de ZFP como se establece en la SEQ ID NO:22. En algunas realizaciones, la construcción comprende un vector lentivírico. En varias realizaciones del método anterior, el anticuerpo de longitud completa se selecciona entre un anticuerpo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo IgG; el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4; o el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, en (c) del método anterior, la célula es una línea de linfocitos T o una línea de linfocitos T de Jurkat.

En una realización, el método anterior comprende además (d) expresar en la célula una proteína del receptor que se puede expresar en la superficie celular y que es una diana potencial que se puede unir por el dominio VH y/o VL que comprende las CDR modificadas de (c); (e) expresar en la célula un ligando afín a la proteína del receptor, estando el ligando afín marcado molecularmente con una secuencia para retener el ligando en un orgánulo intracelular en condiciones que permitan la retención del ligando en el orgánulo y la interacción de la proteína del receptor y el ligando afín en el orgánulo, siendo el ligando afín una diana potencial que se puede unir por el dominio VH y/o VL de (c) y (f) detectar el nivel de la proteína del receptor expresada en la superficie celular; donde, si el dominio Vh y/o VL se une a la proteína del receptor o al ligando afín y bloquea o interrumpe su interacción de unión en el orgánulo, la proteína del receptor sale del orgánulo y se expresa y es detectable en la superficie celular, y donde el dominio VH y/o VL que bloquea o interrumpe la interacción de la proteína del receptor y el ligando es recuperable de la célula. En varias realizaciones del método, la secuencia de retención de orgánulos intracelulares es una secuencia de retención del retículo endoplásmico (RE) o del aparato de Golgi; y la secuencia de retención del RE es KDEL (SEQ ID NO:1).

En otra realización, la invención proporciona un método para generar un anticuerpo genéticamente diverso, o un fragmento de unión o parte del mismo, que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) modificadas, en donde el método comprende: (a) preparar CDR modificadas introduciendo en una o más secuencias individuales de ácido nucleico que codifican la CDR dentro del locus CDR de los dominios VH y VL del anticuerpo una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc, que son reconocidas por las proteínas nucleasas de dedos de cinc (ZFN), produciendo así uno o más sitios diana no idénticos en las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR VH y VL para la unión específica de las ZFN (b) preparar secuencias aisladas de ácido nucleico que codifiquen nucleasas de dedos de cinc (ZFN) que tengan especificidad para las secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc que contienen CDR de (a) y que estén vinculadas a un dominio de escisión derivado de una endonucleasa de restricción Tipo II, en donde la escisión por las ZFN esté determinada por las secuencias de reconocimiento de la proteína de unión al ADN dentro de las CDR modificadas de (a) (c) introducir las regiones de secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR modificadas de (a) en secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL, produciendo así dominios VH y/o VL que comprenden una o más CDR modificadas (d) opcionalmente, introducir la VH y/o VL de (c) en secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de anticuerpo que comprende cadenas pesadas (H) y ligeras (L), en las que las secuencias de ácido nucleico resultantes codifican una proteína de anticuerpo de longitud completa que comprende regiones CDR modificadas que comprenden diferentes sitios de reconocimiento de ZFP dentro de sus dominios VH y VL y (e) expresar las secuencias de ácido nucleico de (b) y (c) en una célula hospedadora adecuada en la que las ZFN expresadas se dirigen a las CDR modificadas dentro de las secuencias VH y VL de la proteína del anticuerpo en condiciones para producir mutaciones y diversidad genética en las regiones CDR de los dominios VH y/o VL expresados, o el anticuerpo expresado, generando así anticuerpos genéticamente diversos, o partes de unión de los mismos, que pueden poseer propiedades de unión al antígeno diana mejoradas u óptimas.

En una realización del método anterior, el método comprende además aislar la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido. En otra realización, el método comprende además amplificar y posteriormente clonar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína del anticuerpo genéticamente diversa de la célula hospedadora en la que se expresan. En una realización, se introducen una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN de dedo de cinc en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3, que se aíslan de los dominios VH y/o VL del anticuerpo, por ejemplo, dentro de un vector o casete, y que posteriormente se reintroducen en los dominios VH y/o VL o en los dominios VH y VL de anticuerpos de longitud completa mediante técnicas convencionales de biología molecular. En otra realización, en (a) del método, la una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN de dedo de cinc se introducen en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL. En otra realización, en (a) del método, la una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN de dedo de cinc se introducen en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL.

En otra realización, en (a) del método, se introducen dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL. En una realización del método, las dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL comprenden la SEQ ID NO:6. En una realización del método, las dos secuencias diferentes de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL comprenden un total de 24 pares de bases. En otra realización, en (b) del método, las ZFN comprenden secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc acopladas a un dominio de corte de la enzima de restricción de tipo II Fok I.

Como muestra la presente invención, la coexpresión de genes de inmunoglobulina, o partes de unión de los mismos, diseñados para contener puntos calientes del dominio de unión a dedos de cinc, es decir, las secuencias de direccionamiento introducidas para la unión y la actividad de la proteína de dedos de cinc y el reconocimiento por parte de las ZFN, junto con los genes que codifican ZFN diseñados para unirse a las secuencias de direccionamiento del ADN, y una proteína o antígeno diana en una línea de linfocitos T da como resultado un sistema celular novedoso que acopla convenientemente la diversidad de moléculas de unión/anticuerpos y la selección simultánea. De acuerdo con los métodos de la invención, puede seleccionarse, identificarse y caracterizarse un anticuerpo, o una parte de unión del mismo, de una biblioteca, una biblioteca diversificada, o una población de anticuerpos diversificados, que tenga especificidad de unión por un antígeno diana, construyendo células o líneas celulares que contengan y expresen el antígeno diana apropiado, por ejemplo, una proteína del receptor o su ligando afín, y señales de retención para permitir la unión de un anticuerpo específico expresado, o una parte de unión del mismo, y la retención de las moléculas de interacción apropiadas dentro del entorno de la célula.

La diversidad de anticuerpos que puede generarse mediante los métodos de modificación de la CDR de la invención es del orden de 10<6 >a 10<18>, o 10<6 >a 10<14>, o 10<6 >a 10<12 >sitios de unión de anticuerpos diferentes. Como apreciará el experto, la variabilidad en los anticuerpos y sus especificidades de unión que se logran de acuerdo con los métodos de la invención, por ejemplo, en la combinación de CDR1 y CDR3 dirigidos por ZFN, dependerá de la eficacia de la actividad de la nucleasa en cada CDR, o en ambas CDR juntas.

Los siguientes ejemplos no pretenden limitar la invención, sino que se presentan para demostrar e ilustrar la invención en sus diversas realizaciones y aspectos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Plásmidos y células bacterianas

La biblioteca de anticuerpos de dominio único (SDA) de VL de conejo de 309 anticuerpos contra el hTNF-a y el VL SDA 18 de conejo (VL18) clonados en el vector pT7 (por ejemplo, como se describe en PCT/PT2012/000035, F. Aires Da Silva y otros, "Anti-tumor necrosis factor-alpha agents and uses thereof", presentados el 19 de septiembre de 2012, TechnoPhage, Lisboa, Portugal, y la solicitud provisional estadounidense n.° 61/538.548, presentada el 23 de septiembre de 2011 ). La biblioteca de dímeros VL anti-hTNF-a se construyó utilizando la estrategia de restricción/ligadura descrita previamente ( Oliveira S, Aires da Silva F, Lourenco S, Freitas-Vieira A, Santos A C, et al. (2012), Biotechnology and Applied Biochemistry 59: 193-204). El VL SDA F63 de conejo clonado en el vector pComb3X se seleccionó mediante expresión en fago contra gp41 y se desinmunizó (por ejemplo, como se describe en PCT/PT2012/000035, F. Aires Da Silva et al. ,"Anti-tumor necrosis factor-alpha agents and uses thereof", presentado el 19 de septiembre de 2012, TechnoPhage, Lisboa, Portugal, y la solicitud provisional estadounidense n.° 61/538.548, presentada el 23 de septiembre de 2011; y Santos, A. S., Oliveira, S. S., y Gonsalves, J., resultados no publicados). Los plásmidos pHEF-VSVG (AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, del Dr. Lung-Ji Chang), pGagPol ( Amendola M, Venneri M A, Biffi A, Vigna E, Naldini L (2005), Nat Biotechnol 23: 108-116 ), pRev ( Amendola M, et al. (2005), Nat Biotechnol 23: 108-116 ), y pFugW ( Lois C, Hong E J, Pease S, Brown E J, Baltimore D (2002), Science (Nueva York, N.Y.)) 295: 868-872 se utilizaron para producir partículas lentivíricas.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Se cultivaron células HEK293T (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va., USA) en DMEM suplementado con 10% de FBS (DMEM-10), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina (Thermo Scientific). Las células Jurkat (ATCC) y las líneas celulares, por ejemplo, JLTRG-R5 ( Ochsenbauer-Jambor C. et al., 2006, BioTechniques, 40(1):91-100 ), se cultivaron en el medio de Roswell del Park Memorial Institute (RPMI)-1640, complementado con un 10% de FBS (RPMI-10), 2 mM de L-glutamina y un 1% de penicilina/estreptomicina. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37° C. en CO2 al 5%. Los medios de cultivo celular y los reactivos, a menos que se indique lo contrario, se adquirieron de Lonza (Basilea, Suiza).

Construcciones de plásmidos/vectores

Vectores de anticuerpos

En general, todos los plásmidos de expresión se construyeron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una polimerasa con actividad de corrección (Phusion High-Fidelity DNA polymerase, Finnzymes, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia).

Para expresar los anticuerpos con y sin una señal de retención para el retículo endoplásmico (RE), por ejemplo, KDEL (SEQ iD NO:1), se construyeron dos vectores base: pVL18-IRES-DsRed y pVL18 KDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1) ( Figs. 6A y 6B, respectivamente). Para pVL18-IRES-DsRed, se amplificaron dos fragmentos mediante la PCR. El primer fragmento se generó mediante la amplificación del SDA VL18 a partir del vector pT7 utilizando los cebadores oligonucleótidos "Leader-Ab-F1" y "Ab-HA-IRES-R1", como se presenta en la Tabla 1. El cebador "Leader-Ab-F1" añadió una secuencia líder de la cadena Ig-K de murino, es decir, (NH2)-METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID NO:23)-(COOH), que dirige la proteína a la vía secretora ( Coloma, M J et al., 1992, J. Immunol. Meths., 152:89-104 ), mientras que el cebador inverso "Ab-HA-IRES-RI" añadía una polihistidina (His6 (SEQ ID NO:46)) y una etiqueta de hemaglutinina (HA) para la detección de la proteína expresada mediante transferencia Western. El segundo fragmento, IRES-DsRed, se amplificó a partir del vector pIRES2-DsRed 2 (Clontech, Takara Bio Company, CA, EE.UU.) utilizando los cebadores de oligonucleótidos "HA-IRES-Red-F2" e "IRES-Red-R2", tal como se presentan en la Tabla 1. Tras la purificación, se realizó una superposición mediante PCR de estos dos fragmentos utilizando técnicas convencionales y los cebadores de oligonucleótidos "Leader-Ab-F1" e "IRES-Red-R2", tal como se presenta en la Tabla 1. El fragmento resultante se purificó en gel, se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI y se clonó en el vector FugW bajo el control del promotor de la ubiquitina C humana.

Para construir el vector base pVL18 KDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1), se amplificó el SDA VL18 con los cebadores de oligonucleótidos "Leader-Ab-F1" y "Ab-HA-KDEL-R1" ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1) como se presenta en la Tabla 1. El cebador directo fue el mismo que el descrito anteriormente, y el cebador inverso introdujo la señal de retención del RE, 5' aaggatgagctc 3', (SEQ ID NO:24) (NH2)-KDEL-(COOH) (SEQ ID NO:1), además de añadir las etiquetas His6 (SEQ ID NO:46) y HA como se ha descrito. Tras la purificación en gel, el fragmento de la PCR se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI y Nhel y se clonó en el vector pVL18-IRES-DsRed construido previamente, que también fue digerido por estas enzimas. Para facilitar la clonación del anticuerpo, el gen SDA v L18 fue flanqueado por dos sitios de restricción para la endonucleasa Sfil en ambos vectores ( Figs. 6A y 6B). Los vectores base construidos para su uso en los ejemplos que ilustran la invención se representan esquemáticamente en las Figs. 6A-6E.

TABLA 1 - O ligonucleótidos

Nombre Sentido Secuencia 5'-3'

Leader-Ab-F1 Directo aaaggatccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccag

gt

tccactggtgacacggcccaggcggccgagGt (BamHI) (SEQ ID NO: 25) Ab-HA-IRES-R1 Inverso itagg gg gg ggg g a 33 gag agg gg cg cta gccia ag aag cgtagtcogga acgt

cgtacgg (SEQ ID NO: 26)

HA-IRES-Red-F2 Directo g actaog cttcttaggcla gcgcccctctccct cccccccccclaacglla ctg gccg a

a (SEQ ID NO: 27)

IRES-Red-R2 Inverso tttgaattcctactggaacaggtggtggcg (EcoRI) (SEQ ID NO: 28)

Ab-HA-KDEL-R1 Inverso ttag gg gg ggg gg agg g a g ag gg gcgctag cctag ag ctcatccttctog cía ga a ("KDEL"

divulgado como

SEQ ID NO: 1) ggcgtagtccggaacgicgta (Nhel) (SEQ ID NO- 29)

pComb-1F Directo gttggccgattcattaatgcag (SEQ ID NO: 30)

pComb-1R Inverso aatgaaaccatcgatagcagcac (SEQ ID NO: 31)

pComb-3F Directo agcgcaacgcaattaatgtgag (SEQ ID NO: 32)

pComb-3R Inverso ggtcatagcccccttattagcg (SEQ ID NO: 33)

CDR1-Lib Directo gt g accatta aatg c ag cgg cg gcgg cag cSH R SH R S H R SH R SH R SH R

SHRSHRSHRSH RSH RSH Rag cg gcggcgg ca gclg gtatcag c ag a a

aocg (SEQ ID NO: 34)

CDR1-R Inverso gctgccgccgccgctgcatttaatggtcacggtgcc (SEQ ID NO: 35)

CDR3-Lib Directo aceta ttattg cagcggcgg cgg cagc SH RSH R SHR S H R£ H RSH RSH

RSH R S H R S H R S HR S H R agcgg cg gcgg cag oggcggcgg caccga a c

Iggaa (SEQ ID NO: 36)

CDR3-R Inverso gctgccgccgccgctgcaataataggtcgccgcatccgc (SEQ ID NO: 37)

(continuación)

Nombre Sentido Secuencia 5'-3'

Líder-TNF-F Directo gacgatatcatggagacagacacactc (EcoRV) (SEQ ID NO: 38)

TNF-TEV-R Inverso tttgaattcctactggctgtagactagctc (EcoRI) (SEQ ID NO: 39)

TNF-KDEL-F Directo gacacggcccaggcggcccctgtagcccatgttgtagcaaac (Sfil) (SEQ ID NO: 40) ("KDEL"

divulgado como

SEQ ID NO: 1)

TNF-KDEL-R Inverso atggtgctggccggcctgcccagggcaatgatccc (Sfil) (SEQ ID NO: 41)

("KDEL"

divulgado como

SEQ ID NO: 1)

Tax-F Directo ctaggatccatggacagcctcttgatgaac (BamHI) (SEQ ID NO: 42)

Tax-R Inverso tttgctagctcaaagtcccaaagtacg (Nhel) (SEQ ID NO: 43)

Sec-Líder -F Directo atggagacagacacactcctgctatgg (SEQ ID NO: 44)

Sec-HA-R Inverso gtagtccggaacgtcgtacgggta (SEQ ID NO: 45)

Los nucleótidos subrayados indican los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción utilizadas. El doble subrayado indica una región CDR con bases oscilantes, según el código UIB de ThermoScientific o de los códigos de una sola letra para los nucleótidos proporcionados por el NCBI a través de su sitio web en www.ncbi.nlm.nih.gov/staff/tao/tools/tool lettercode.html.

Vectores para la construcción de líneas celulares

Para la generación de una línea celular que exprese la proteína hTNF-a en fusión con la señal de retención KDEL (SEQ ID NO:1), se construyó el vector pTNFKDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1). (Fig. 6C). El gen que codifica el hTNF-a (número de acceso del GenBank P01375) se amplificó mediante la PCR utilizando los cebadores de oligonucleótidos "TNF-KDEL-F ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1)" y "TNF-KDEL-R ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1)" (Tabla 1). Tras la purificación en gel, el fragmento de ácido nucleico se digirió con la endonucleasa de restricción Sfil y se clonó en el plásmido pVL18KDEL-IRES-DsRed ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1), sustituyendo la secuencia de ácido nucleico SDA VL18.

Para construir la línea celular que expresa hTNF-a, se utilizó el vector pTNF-TEV ( Fig. 6D) diseñado mediante ingeniería genética. El gen hTNF-a se amplificó mediante la PCR con los oligonucleótidos "Leader-TNF-F" y "TNF-TEV-R" (Tabla 1). El fragmento de ácido nucleico amplificado se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRV y EcoRI y se clonó en el vector FugW, que se digirió con BamHI y EcoRI. El gen sintetizado fue diseñado para tener una secuencia líder de la cadena Ig-K de murino y una etiqueta c-Myc en la dirección 5' del gen hTNF-a para la detección mediante western.

Para el desarrollo de la línea celular que expresa un polipéptido Tax, se construyó el vector pTax-IRES-DsRed (Fig. 6E). En consecuencia, se amplificó el gen Tax (número de acceso al Genbank P03409) utilizando los cebadores de oligonucleótidos "Tax-F" y "Tax-R" (Tabla 1). Tras la purificación, el fragmento de ácido nucleico amplificado se digirió con las endonucleasas BamHI y Nhel y se clonó en el plásmido pVL18-IRES-DsRed del vector construido previamente. Esta clonación eliminó la secuencia líder de la IgG de murino y las etiquetas His6 (SEQ ID NO:46) y HA.

A menos que se indique lo contrario, todas las enzimas utilizadas en los Ejemplos eran de Fermentas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA). Cada uno de los vectores construidos se transformó en la cepa de E. coli JM109 (Life Technologies, Regensburg, Alemania) mediante electroporación (2000, 25 jFD, 1,8 kV, Bio-Rad Pulse Controller; Bio-Rad, CA, EE.UU.) para permitir la propagación del vector y la extracción del ADN y el aislamiento de los ácidos nucleicos deseados.

Expresión de las construcciones plasmídicas en células HEK 293T

Para evaluar la expresión de las construcciones plasmídicas, se transfectaron células HEK293T con 5 jg de ADN plasmídico para cada plásmido mediante el método convencional de transfección con fosfato de calcio. Después de 48 horas, las células se lavaron con una solución tampón de fosfato (PBS) y se lisaron con un tampón HBS [HEPES 50 mM; NaCl150 mM; EDTA 2 mM; 10% (v/v) de glicerol; 0,5% (p/v) de ácido desoxicólico; 1% (v/v) de tritón X-100] complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics GmbH). Esta mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos y luego se centrifugó a 12.000xg durante 30 minutos a 4° C. La fracción soluble recuperada se utilizó para el análisis de la transferencia Western. La concentración de proteínas se cuantificó mediante el ensayo colorimétrico de Bradford (BioRad, CA, USA).

Análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia

Para el análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia, se hirvieron cantidades iguales de proteínas en el tampón Laemmli (Laemmli, 1970) y se cargaron en geles de SDS-PAGE al 10%. Las proteínas se separaron por electroforesis (sistema de tetraelectroforesis Mini-Protean™; Bio-Rad) y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa Hybond-C Extra (Amersham Bioscience Reino Unido, Buckinghamshire, Reino Unido). Las membranas de nitrocelulosa se sumergieron en una solución de bloqueo (5% (p/v) de leche descremada en solución salina tamponada con Tris más 0,1% de Tween20 (TBS-T)) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, las membranas de nitrocelulosa transferidas con la proteína del anticuerpo expresada a partir de las construcciones de anticuerpos y con la proteína del hTNF-a expresada a partir de la construcción del TNF-a se incubaron con el anticuerpo monoclonal dirigido contra HA conjugado con HRP (clon 3F10; Roche Diagnostics GmbH) o con el anticuerpo monoclonal anti-c-myc conjugado con HRP (clon 9E10; Roche Diagnostics GmdH), respectivamente, diluidos 1:5000 en leche descremada al 3% (p/v) en TBS-T a temperatura ambiente durante 1 hora.

Producción de partículas lentivíricas y construcción de líneas celulares

JLTRG-R5TNFKDEL ("KDEL"; divulgada como SEQ ID NO:1) Línea celular

Para la generación de líneas celulares que expresan de forma estable TNF-KDEL-IRES-DsRed ("KDEL"; divulgada como SEQ ID NO:1), los células HEK293T (6x10<6 >células) se cotransfectaron mediante el método convencional de fosfato de calcio con pTNFKDEL-IRES-DsRed ("KDEL"; divulgado como SEQ ID NO:1), pVSVG, pRev, y pGagPol en las proporciones de 1,5:0,2:1:2 para producir partículas lentivíricas que codifican TNFKDEL-IRES-DsRed ("KDEL"; divulgada como SEQ ID NO:1). Los plásmidos pVSVG, pRevy pGagPol, es decir, los plásmidos de empaquetamiento lentivírico como se conocen en la técnica, se utilizan para proporcionar las proteínas necesarias para la producción de lentivirus en las células transducidas. Más concretamente, el VSV se utiliza como vector de envoltura y permite la endocitosis del virus. Rev, una proteína del VIH-1, es un transactivador nuclear que es esencial para la expresión de las proteínas estructurales víricas a partir de los ARNm del VIH-1 (env) sin cortar y empalmar (gag/pol) y cortados y empalmados de forma incompleta (env) en las fases finales de la infección. GagPol son genes del VIH-1; Gag codifica la poliproteína Gag del VIH-1, que se procesa durante la maduración del virus en proteína de la matriz (MA, p17), proteína de la cápsida (CA, p24), péptido espaciador 1 (SP1, p2), proteína de la nucleocápsida (NC, p7), péptido espaciador 2 (SP2, p1) y p6. Pol codifica las enzimas víricas transcriptasa inversa, integrasa y proteasa del VIH. Las partículas de lentivirus llevan la construcción del plásmido. Tras la transducción de las células, el ADN se integra en el genoma de la célula hospedadora y se expresa junto con otros genes de la célula hospedadora.

Después de 48 horas, se recogieron las partículas lentivíricas y se utilizaron para transducir las células JLTRG-R5. Las células JLTRG-R5 expresan el receptor del hTNF-a y también contienen un promotor LTR del VIH que controla la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP), que sólo se activa cuando las células son infectadas por un virus VIH, o cuando las células son transducidas o transfectadas por plásmidos que codifican proteínas activadoras del VIH, como la proteína Tat, el activador de la transcripción del VIH-1. Las células se resuspendieron en una preparación de lentivirus con polibreno (8 pg/ml) y se sometieron a espinoculación a 930xg durante 90 minutos a 32° C. El lentivirus se utilizó en una cantidad suficiente para producir una eficacia de transducción de aproximadamente el 60%-80%, según se observó por citometría de flujo. La espinoculación se realizó en una placa de 24 pocillos, con aproximadamente 2,5x10<5 >células en 250 pl de RPMI+FBS más 750 pl de partículas lentivíricas en cada pocillo de la placa. Después de 6 horas, se lavaron las células y se sustituyó el medio por RPMI con un 10% de FBS. A las 72 horas después de la transducción, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS suplementado con 0,5% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA) fracción V, se clasificaron para las células positivas a DsRed en un clasificador celular BD FACS ARIA III (Beckton Dickinson Bioscience, CA, EE.UU.) y se sembraron en placas de 24 pocillos, normalmente a una densidad de 5x10<6 >células por 500 pl. Las células no inducidas se utilizaron como control negativo. De este modo, cuando se clasifican las células positivas para DsRed, las células seleccionadas expresan tanto hTNF-a-KDEL ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1) como su receptor. Después de 6 días, las células clasificadas se tiñeron para la expresión del receptor I de hTNF-a con 125 ng de un anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con aloficocianina (APC) dirigido contra el anti-hTNF-a R1 para validar que estas células eran capaces de retener este receptor en el RE debido a la expresión del ligando de la proteína TNFKDEL ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1), tal como se ha descrito. Se utilizó el aparato FACS ARIA III para adquirir al menos 10.000 eventos clasificados de cada muestra y los datos se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Oreg., EE.UU.).

Línea celular que expresa JLTRG-R5-TNF-TEV

Para producir partículas lentivíricas que codifican TNF-TEV para la construcción de la línea celular JLTRG-R5-TNF-TEV que expresa la proteína ligando hTNF-a, los células HEK293T se cotransfectaron por el método convencional de fosfato de calcio con pTNF-TEV, pVSVG, pRev, y pGagPol en las proporciones de 1,5:0,2:1:2. Tras 48 horas, se recogieron las partículas lentivíricas y se utilizaron para transducir las células JLTRG-R5. Las células se resuspendieron en una preparación lentivírica con polibreno (8 pg/ml) y se sometieron a espinoculación a 930xg durante 90 minutos a 32° C. Después de 6 horas, se lavaron las células y se sustituyó el medio. A las 72 horas después de la transducción, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS-BSA al 0,5% y se tiñeron para detectar la expresión superficial del hTNF-a con 2,5 pg de etanercept (Enbrel®) durante 30 minutos a 4° C. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA, y la unión del etanercept (Enbrel®) al hTNF-a se detectó tiñendo las células con un anticuerpo secundario [AffiniPure conjugado con Alexaflluor® 647 dirigido contra IgG humana (Alexaflluor®)] (1:500) durante 30 minutos a 4° C. Tras la tinción, las células se resuspendieron en PBS-BSA y se clasificaron en busca de células positivas al etanercept-Alexafluor® 647 en un BD FACS ARIA III (BD Bioscience, CA, EE.UU.). Como controles negativos se utilizaron células no transfectadas y células marcadas sólo con el anticuerpo secundario. Todos los datos se analizaron con el software FlowJo.

Línea celular que expresa JLTRG-R5-TNF-TEV y Tax

Para generar una línea de células JLTRG-R5 que exprese los polipéptidos hTNF-a y Tax, se utilizó un método convencional de transfección con fosfato de calcio. Las partículas lentivíricas que codifican Tax-IRES-DsRed se produjeron mediante la cotransfección de células HEK293T con pTax-IRES-DsRed, pVSVG, pRevy pGagPol, tal como se ha descrito anteriormente (en las proporciones de 1,5:0,2:1:2). Tras 48 horas, se recogieron las partículas lentivíricas y se utilizaron para transducir las células JLTRG-R5-TNF-TEV que expresaban la proteína hTNF-a. Las células se resuspendieron en una preparación lentivírica con polibreno (8 pg/ml) y se sometieron a espinoculación a 930xg durante 90 minutos a 32° C. Después de 6 horas, se lavaron las células y se sustituyó el medio. A las 72 horas después de la transducción, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS-BSA al 0,5% y se tiñeron para determinar la expresión superficial de hTNF-a con 2,5 pg de etanercept (Enbrel®) durante 30 minutos a 4° C. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA y se tiñeron durante 30 minutos a 4° C con el anticuerpo secundario, Alexaflluor® 647 (1:500). Tras la tinción, las células se resuspendieron en PBS-BSA y se clasificaron para detectar las células positivas al DsRed y al etanercept-Alexaflluor® 647 en un BD FACS ARIA III. Como controles negativos se utilizaron células marcadas, no transfectadas, y células marcadas sólo con el anticuerpo secundario. Los datos de BD FACS ARIA III se analizaron con el software FlowJo.

Ejemplo 2

Ensayo basado en células para seleccionar y evolucionar anticuerpos que retienen moléculas/ligandos diana en el RE

Se utilizaron células HEK293T para la expresión y producción de partículas lentivíricas que codifican anticuerpos, en particular, anticuerpos acoplados a la señal de retención del RE KDEL (SEQ ID NO:1) (anticuerpo-KDEL ("KDEL" divulgado como s Eq ID NO:1)). Para ello, las células HEK293T se cotransfectaron con pVL18-IRES-DsRed y con pVSVG, pREV y pGagPol en las proporciones de 1,5:0,2:1:2, respectivamente. Tras 48 horas, se recogieron las partículas lentivíricas y se utilizaron para transducir las líneas celulares JLTRG-R5-TNF-TEV o JLTRG-R5-TNF-TEV-Tax. Las células se resuspendieron en una preparación lentivírica con polibreno (8 pg/ml) y se sometieron a espinoculación a 930xg durante 90 minutos a 32° C. Como control del porcentaje de células transducidas, se transdujeron cantidades iguales de células JLTRG-R5, también por espinoculación, con una cantidad igual de partículas lentivíricas utilizadas para transducir las líneas celulares mencionadas. Tras 6 horas, se lavaron las células y se añadió medio nuevo (RPMI complementado con un 10% de FBS). A las 72 horas después de la traducción, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS-BSA al 0,5%, se tiñeron para determinar el hTNF-a con 2,5 pg de etanercept y 1:500 de anticuerpo secundario Alexaflluor® 647. Las células con tinción positiva para la expresión de DsRed y negativa para la expresión superficial de hTNF-a se clasificaron en un BD FACS ARIA III, se sembraron y se dejaron crecer en cultivo durante una o dos semanas. Las células seleccionadas expresaban anticuerpos que reconocían eficazmente el hTNF-a y retenían esta proteína diana en el RE. Para respaldar el fenotipo previamente determinado, las células se recuperaron, se lavaron y se prepararon para otra ronda de clasificación celular en el BD FACS ARIA III. Se sembraron las células clasificadas y, cinco días después, se extrajo el ADN genómico de todas las células clasificadas con la solución de extracción de ADN QuickExtract™ (Epicenter®, una empresa de Illumina®, WI, Estados Unidos). Los genes que codifican los anticuerpos se recuperaron de las células.

Ejemplo 3

Ensayo basado en células para seleccionar anticuerpos que neutralizan/alteran la interacción de unión de pares de ligandos

Se utilizaron células HEK293T para producir partículas lentivíricas que codifican anticuerpos. Por lo tanto, las células se cotransfectaron con pVL18-IRES-DsRed, y pVSVG, pREV, pGagPol. Después de 48 horas, se recogieron las partículas lentivíricas y se utilizaron para transducir la línea celular JLTRG-R5-TNFKDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1). Las partículas lentivíricas se utilizaron típicamente en una cantidad que producía aproximadamente un 60%-80% de eficacia de transducción; en general, 2,5x10<5 >células en 250 pl de RPMI+FBS más 750 pl de partículas lentivíricas en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las células JLTRG-R5 se resuspendieron en la preparación lentivírica con polibreno (8 pg/ml) y se sometieron a espinoculación a 930xg durante 90 minutos a 32° C. Como control del porcentaje de células transducidas, se transdujeron cantidades iguales de células JLTRG-R5, también por espinoculación, con una cantidad de partículas lentivíricas igual a la utilizada para transducir las células JLTRG-R5-TNFKDEL ("KDEL" divulgada como SEQ ID NO:1). Después de 6 horas, se lavaron las células transducidas y se añadió medio nuevo. 72 horas después de la transducción, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS-BSA al 0,5%, se tiñeron para determinar el Receptor I del hTNF-a con 125 ng de anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con APC dirigido contra hTNF-a RI, y se clasificaron según las células positivas para DsRed y APC en BD FACs ARIA III. De este modo, se demostró que las células clasificadas positivas expresaban anticuerpos capaces de neutralizar o alterar la interacción entre el hTNF-a y su receptor, permitiendo así que el receptor se expresara en la superficie celular y fuera detectado por el anticuerpo anti-hTNF-a RI. Las células clasificadas se sembraron y se dejaron crecer durante una o dos semanas. Para corroborar el fenotipo detectado, las células se lavaron de nuevo y se prepararon para otra ronda de clasificación celular en el BD FACS ARIA III. Las células clasificadas que fueron positivas para la expresión de DsRed y hTNF-a RI se sembraron. Normalmente, las células se cultivaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5x10<6 >células por 500 pl. Después de cinco días, se extrajo el ADN genómico con QuickExtract™ DNA Extraction Solution (Epicenter®, una empresa de Illumina®, WI, EE.UU.) para poder caracterizar los anticuerpos responsables de este fenotipo en la citometría de flujo. (Véase, por ejemplo, las Figs. 7A y 7B).

Ejemplo 4

Análisis de la clonación, expresión y unión de anticuerpos de dom inio único (SDA) mediante ELISA

El ADN genómico extraído de las diferentes células se amplificó por PCR utilizando los cebadores oligonucleótidos "Seq-Leader-F" y "Seq-HA-R" (Tabla 1). Los fragmentos amplificados (anticuerpos) se digirieron con la endonucleasa de restricción Sfil, se clonaron en el vector pT7 (amablemente proporcionado por TechnoPhage) y se transformaron mediante electroporación (2000, 25 pFD, 1,8 kV, Bio-Rad Pulse Controller) en la cepa E. coli BL21 (DE)3. Se sembraron varias diluciones de bacterias transformadas en placas de agar caldo Luria (LB) suplementadas con 100 pg/ml de ampicilina. Para el cribado de los anticuerpos clasificados, se aislaron las colonias bacterianas de cada clonación, se diluyeron en 200 pl de medio de autoinducción (por ejemplo, Overnight Express Autoinduction System, Novagen, San Diego, California, para un sistema automatizado tal como un robot) en una placa de 96 pocillos, y se dejaron crecer durante 16 horas a 37° C y 150 rpm. Cada población celular clasificada, por ejemplo, la DsRed+Alexaflluor® 647-con resultado negativo en el ensayo de anticuerpos-KDEL ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1), o DsRed+APC-con resultado positivo en el ensayo de hTNF-a-KDEL ("KDEL" divulgado como SEQ ID NO:1), se utilizó para extraer ADN genómico. A partir de estas muestras de ADN, se amplificaron los genes de los anticuerpos, que se clonaron en el vector pT7, tal como se describe en el presente documento. A continuación, las bacterias BL21(DE)3 se transformaron con el vector. Se recogieron las colonias aisladas resultantes de la transformación bacteriana. Para cada uno de los diferentes anticuerpos y bibliotecas de anticuerpos utilizados, se realizó una clonación. Posteriormente, los aglomerados de bacterias procedentes de los cultivos celulares centrifugados durante 15 minutos a 900xg se lisaron con la adición de solución amortiguadora de fosfato (PBS) y BugBuster Master Mix (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) (en una proporción de 1:2) complementada con un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Esta mezcla se incubó durante 4 horas a 4° C en una placa agitadora y el extracto periplásmico soluble se recogió tras centrifugarse a 900xg durante 15 minutos. La fracción soluble recuperada se utilizó para el ELISA.

En el ensayo de expresión, una placa ELISA de 96 pocillos se recubrió con 55 pl de la fracción soluble del clon bacteriano durante 1 hora a 37° C. Los pocillos de la placa se lavaron con PBS y se bloquearon durante 1 hora a 37° C con 3% (p/v) de BSA. Tras el lavado con PBS, se añadió a cada pocillo un anticuerpo monoclonal dirigido contra HA conjugado con HRP (clon 3F10, Roche Diagnostics GmbH) diluido 1:1000 en BSA al 1% (p/v), y la placa se incubó a 37° C durante 1 hora. Después del tiempo de incubación, los pocillos de la placa se lavaron con p Bs , y la detección del ELISA se realizó mediante la adición del sustrato HRP ABTS Chromophore (Calbiochem; Merck KGaA) combinado con un 0,2% (v/v) de peróxido de hidrógeno (Calbiochem; Merck KGaA). La absorbancia se midió a 405 nm (utilizando 492 nm como referencia) en Tecan Infinite M200 (Tecan, Mannedorf, Suiza) después de 30 minutos a 37° C.

Para evaluar la unión de los anticuerpos al hTNF-a, se recubrió una placa ELISA de 96 pocillos con 200 ng de hTNF-a (Prospec, N.J. EE.UU.) y se incubó durante la noche a 4° C. Tras lavar con PBS, los pocillos de la placa se bloquearon durante 1 hora a 37° C. con BSA al 3% (p/v). A continuación, se añadieron 55 pl de fracción soluble de cada clon bacteriano a los pocillos y se incubó la placa durante otra hora a 37 °C. Tras este tiempo de incubación, se lavaron los pocillos de la placa con PBS y se añadió a cada pocillo un anticuerpo monoclonal dirigido contra HA conjugado con HRP y diluido 1:1000 en BSA al 1% (p/v). La placa se incubó durante 1 hora a 37° C. y a continuación se lavaron los pocillos de la placa con PBS. La detección del ELISA se realizó mediante la adición del sustrato HRP ABTS Chromophore combinado con un 0,2% (v/v) de peróxido de hidrógeno. La absorbancia se midió a 405 nm (utilizando 492 nm como referencia) en un Tecan Infinite M200 (Tecan Systems Ltd., EE.UU. y Alemania) después de 30 minutos a 37° C.

Ejemplo 5

Producción de plásmidos que contienen nucleasas de dedo de cinc (ZFN) que se dirigen específicamente a las CDR que contienen secuencias de reconocimiento de la proteína de unión al ADN de dedo de cinc

En los vectores plasmídicos que comprenden la cadena principal del vector lentivírico FugW, las nucleasas de dedo de cinc se clonaron mediante PCR de solapamiento con una secuencia de 2 A (Angstrom) que separa cada gen. La nucleasa de dedos de cinc, denominada ZFN1VH en la Fig. 5, fue diseñada para dirigirse a la CDR1 en la región variable de la cadena pesada (VH). ZFN1VH comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico gtcgaaaagcca (SEQ ID NO:7) y una secuencia de aminoácidos de dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSTSHSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSQSSNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGKTS SEQ ID NO:8). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN2VH, se dirige a la CDR1 en la región variable de la cadena pesada. ZFN2VH comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico caaaaatcgagct (SEQ ID NO:9) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSTSGELVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGNLTEHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:10). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN3VH, se dirige a la CDR3 en la región variable de la cadena pesada. ZFN3VH comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico actcagcgaacg (SEQ ID NO:11) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSRTDTLRDHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSRADNLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTHLDLIRHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:12). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN4VH, se dirige a la CDR3 en la región variable de la cadena pesada. ZFN4VH comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico caatgtcggtaca (SEQ ID NO:13) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSSPADLTRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGNLTEHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:14). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN1VL, se dirige a la CDR1 en la región variable de la cadena ligera. ZFN1VL comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico gctcaacgtctg (SEQ ID NO:15) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSRNDALTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSRTCRAHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSQSGNLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGELVRHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:16). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN2VL, se dirige a la CDR1 en la región variable de la cadena ligera. ZFN2VL comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico aagaggccca (SEQ ID NO:17) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSTSHSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGHLVRHQRTHTG EKPYKCPECGKSFSQLAHLRAHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:18). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN3VL, se dirige a la CDR3 en la región variable de la cadena ligera. ZFN3VL comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico gttgccgagcga (SEQ ID NO:19) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDNLVRHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGSLVRHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:20). La nucleasa de dedo de cinc, denominada ZFN4VL, se dirige a la CDR3 en la región variable de la cadena ligera. ZFN4VL comprende una región de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico cgcatggttaag (SEQ ID NO:21) y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos dedo de cinc LEPGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGSLVRHQRTHT GEKPYKCPECGKSFSRRDELNVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSHTGHLLEHQRTHTGK TS (SEQ ID NO:22). En las construcciones de este Ejemplo, el vector lentivírico para la nucleasa de dedo de cinc dirigida a VH contenía un gen de resistencia a la puromicina, y el vector lentivírico para la nucleasa de dedo de cinc dirigida a VL contenía un gen de resistencia a la neomicina, así como una secuencia IRES.

Se entiende que las realizaciones y los ejemplos descritos en el presente documento tienen fines ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán una sugerencia para los expertos en la técnica pertinente y en el ámbito de esta solicitud y de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir diversidad o variabilidad genética en anticuerpos mediante la modificación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las inmunoglobulinas, comprendiendo el método:

(a) introducir en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican CDR, una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc para generar una o más secuencias de sitios diana no idénticos dentro de la una o más secuencias de ácido nucleico que codifican CDR para unir una o más nucleasas de dedos de cinc (ZFN), produciendo así CDR que comprenden secuencias de ácido nucleico modificadas, y (b) expresar en una célula, un ácido nucleico que codifica al menos un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o al menos un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada de (a) en condiciones en las que la ZFN expresada se une y escinde la secuencia de ácido nucleico codificante de CDR modificada dentro de la secuencia del sitio de destino, expresando dicha célula una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) en la que se introducen las secuencias de sitio diana del dominio de unión al ADN de dedo de cinc de (a) operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de escisión del ADN para una enzima de restricción de tipo IIS, en la que la escisión del ADN realizada por la ZFN viene determinada por las secuencias de sitio diana dentro de la secuencia de ácido nucleico modificada que codifica la CDR de (a).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en (a), las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR se aíslan de un dominio VH y/o VL y se incluyen en una construcción de ADN adecuada.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la construcción de ADN se selecciona entre un ADN de plásmido, un vector o un casete de expresión de ácido nucleico.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la construcción de ADN comprende ácido nucleico que codifica CDR1, CDR2, CDR3, o una combinación de los mismos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las secuencias de ácido nucleico que codifican las una o más CDR modificadas se introducen en secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio VH y/o VL para producir dominios VH y/o VL que comprenden una o más CDR modificadas.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en (a) las secuencias de ácido nucleico que codifican la CDR están incluidas dentro de secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL).

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (b), la secuencia de ácido nucleico que codifica la CDR modificada está incluida dentro de un anticuerpo de longitud completa que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH), y que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL), en donde las secuencias de ácido nucleico resultantes codifican anticuerpos de longitud completa que comprenden dominios VH y VL que comprenden CDR modificadas.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además amplificar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de dominio VH y/o VL y clonar las proteínas de dominio VH y/o VL de la célula.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (a), las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3, o en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (a), las una o más secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc se introducen en cada una de las CDR1 y CDR3.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (a), se introducen dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc diferentes en cada una de las CDR1 y CDR3.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc diferentes introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 comprenden la SEQ ID NO:6.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 en donde, las dos secuencias de reconocimiento del dominio de unión al ADN en dedo de cinc diferentes introducidas en cada una de las CDR1 y CDR3 de los dominios de anticuerpos VH y VL comprenden un total de 24 pares de bases.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (b), la enzima de restricción de tipo II Fok I.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde, en (b), las secuencias de ácido nucleico que codifican las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) se introducen en una construcción que comprende una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 de un dominio VH, una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR1 de un dominio VH, y una primera secuencia ZFN para la escisión dentro de la CDR3 de un dominio VH y una segunda secuencia ZFN para la escisión dentro de la c DR3 de un dominio VH.