JP2016511405A - 結合性タンパク質相互作用及び結合性分子の選択及び多様化のための細胞に基づく方法 - Google Patents

結合性タンパク質相互作用及び結合性分子の選択及び多様化のための細胞に基づく方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、その全てが同一の細胞において発現される結合性分子、例えば抗体、及びそれらが結合する標的分子を多様化し、発現させ、選択するための、細胞に基づく方法を提供する。標的分子は、細胞内で相互作用する、細胞表面に発現したリガンド結合性受容体分子及びその同族リガンドを含む、リガンド結合対のメンバーであり得る。本方法は、抗体又はその標的を、結合及び相互作用の部位としての細胞オルガネラにおいて保持することを提供する。本方法を行うことによって、抗体の、細胞内でのその標的分子への結合又は非結合が、ハイスループットアッセイ、例えばフローサイトメトリーを介して細胞表面で検出可能な細胞表現型をもたらす。本方法は、潜在的な治療的使用のための、最適な標的分子結合特性又は活性を有する抗体を生成、回収、及び提供するために特に有用である。このような抗体について遺伝的多様性及び結合特性の増大を生じさせるための方法もまた提供される。

Description

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、且つ参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１４年２月２８日に作成された配列表のＡＳＣＩＩコピーは、14116-105012PCT_SL.txtという名であり、２３８８４バイトのサイズである。
優先権
本願は、２０１３年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７７１，５６２号の利益を主張し、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、全体として、細胞環境においてリガンド結合性タンパク質又はその同族リガンドなどの標的分子に特異的に結合する、抗体などの結合性分子を選択する方法と、特定の標的分子、例えばタンパク質又は抗原に対する特異性を有し、結合的及び／又は機能的特性又は活性が向上している可能性がある、抗体又はその機能的部分などの１又は２以上の結合性分子において、遺伝的多様性を生じさせる方法とに関する。
１９７５年のハイブリドーマ技術の発見、及びその後の組換えＤＮＡ技術の開発以来、結合性タンパク質、特に抗体をコードする遺伝子は、結合性タンパク質又は抗体を何らかの形で操作するように改変されており、それは例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、single-chain variable fragment）、又は抗体軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変断片などのサイズの低減、多価高親和力試薬への最構築、並びに様々な分子（例えば、酵素、毒素）との融合である。さらに、いくつかの選択方法及び実験的アプローチが、親和性及び特異性がより高いモノクローナル抗体（ｍＡｂ、monoclonal antibody）を選択するために開発されている。
抗体ライブラリーを用いる抗体選択技術は、細胞の形質転換を要しないインビトロで、又は、抗体ライブラリーをコードするベクターを例えば用いて細胞が形質転換され得るインビボで、完全に行われ得る。インビトロでの抗体の選択には、リボソーム、ＲＮＡ、及びＤＮＡディスプレイなどの技術が含まれ、一方、インビボでの抗体の選択には、例えば細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞における、ファージディスプレイ、２ハイブリッド系、細胞ディスプレイなどの技術、及びタンパク質断片相補性アッセイ（ＰＣＡ、protein fragment complementation assay）が含まれる。ファージディスプレイは、その単純性、多用途性、及び多くの特異的条件に適用される能力に起因して、広く使用されている。酵母細胞、細菌細胞、及び哺乳動物細胞のディスプレイプラットフォームは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ、fluorescence activated cell sorting）を細胞表面抗体ディスプレイと組み合わせることで、細胞表面での抗体の発現と、その抗体のその標的への結合の能力との両方をモニタリングすることが可能になり得るという点で、ファージディスプレイよりも利点がある。他方で、リボソームディスプレイ技術は、より大きなライブラリーのスクリーニングを可能にし、インビトロでの多様性及び効率的な抗体の成熟を容易にする。
多数の抗体が様々な技術によって選択されているが、その方法のほとんどは、親和性が向上又は増強される必要がある。抗体の親和性、及び特異的抗体のその後の選択における、このような向上は、１又は２以上の方法、系、又は技術、例えば、抗体の多量体化；大腸菌（E.coli）突然変異誘発株；Ｂ細胞株、例えば、ＲＡＭＯＳ細胞、ＤＴ−４０細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び活性化誘発型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ、activation-induced cytidine deaminase）；レトロウイルスディスプレイ系；エラープローンＰＣＲ；免疫グロブリン鎖又はＣＤＲシャッフリング；定方向突然変異誘発の使用を介して典型的には達成される。
親和性及びその後の抗体の選択を向上させるために開発された様々な方法論にもかかわらず、重大な問題が広く見られる。検出及び報告されている問題の例には、単離された抗体の有効性／親和性、発現、正確なフォールディング、及び翻訳後修飾が含まれる。したがって、特異的且つ機能的な抗体を選択し、それらを最適化するための、向上した新規なプロセス、及び、特に治療的利用のための、他のタイプの結合性分子が必要である。したがって、抗体などの結合性分子をコードする遺伝子又は核酸配列内に多様化を導入するための向上した有用な方法に関する新規な戦略を開発すること、及び、特に、新規な、向上した、有用な治療的生物学的産物を生成するための、発現した分子を選択するための新規で効率的な方法を提供することが重要である。
本発明は、細胞の環境内での、結合性分子、例えば、抗体若しくは免疫グロブリン分子、抗体模倣体、又は、標的タンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドなどの特異的標的分子に結合する他のタイプの認識／結合性分子の効果的な発現及び選択のための、細胞内プラットフォームの技術及び方法を提供する。本発明の技術及び方法は、さらに、結合性分子又はその断片若しくは部分、例えば抗体の、遺伝的多様化のための、及び、単一細胞の環境内での標的分子への結合の後のその選択のための手段を提供する。本明細書において用いられる用語「細胞」は、１つの細胞、又は細胞集団若しくは細胞株における単一細胞を包含し得るか、或いは、「細胞」は、プール、集団、又は複数の細胞、例えば、複数の個別の細胞を含む細胞株を包含し得ることが理解される。
本発明はさらに、結合性分子の標的、例えば、一方のメンバーが例えばリガンド結合性タンパク質であり他方のメンバーがその同族リガンドであるリガンド結合対のメンバーを、細胞内で局在化させるための、組換え技術、細胞機構、及び細胞メカニズムを用いることによって、抗体などの結合性分子を選択するための方法を提供する。本発明の方法に従って、抗体などの結合性分子は、リガンド結合性タンパク質、例えば受容体タンパク質、又は相互作用するリガンド結合対の同族リガンドであり得る、その標的に特異的に結合する。１つの実施形態において、標的は、小胞体（ＥＲ、endoplasmic reticulum）又はゴルジ体などの細胞オルガネラにおいて保持されている同族リガンドである。１つの実施形態において、標的は、受容体タンパク質である。１つの実施形態において、結合性分子又はその結合性部分は、細胞オルガネラ、例えばＥＲ又はゴルジ体において保持されている。１つの実施形態において、抗体などの結合性分子又はその結合性部分の、その標的への結合は、リガンド結合性タンパク質とその同族リガンドとの間の結合又は相互作用を妨害、中和、又はブロックして、その結果、細胞において保持も局在化もされていない結合対のメンバーを細胞表面に出現させる。細胞表面への結合対メンバーの結合及び出現の妨害又はブロックは、抗体などの結合性分子又はその結合性部分の、その標的への特異的結合活性を示し、細胞において保持も局在化もされていない結合対メンバーの検出に基づいて、細胞から結合性分子を妨害、中和、又はブロック活性のエフェクターとして選択することが可能になる。
態様の１つにおいて、本発明は、抗体、若しくは抗体ライブラリーのメンバー、若しくはその機能的部分による、又は遺伝的に多様化された抗体、若しくはその全てが同一の細胞において共発現し得る遺伝的に多様化された抗体ライブラリーのメンバーによる、細胞受容体タンパク質、細胞表面膜結合タンパク質、抗原、又はリガンドタンパク質のノックダウン発現を用いる選択方法を提供する。発現した細胞受容体タンパク質、細胞表面膜結合タンパク質、又はリガンドタンパク質は、保持シグナル配列又はタグを有し、発現するように、分子的に改変されており、これによって、これらのタンパク質は、例えば保持シグナルを有する融合タンパク質のように発現すること、及び、ＥＲ又はゴルジ体などの細胞オルガネラにおいて選択的に保持されることが可能になる。１つの実施形態において、抗体ライブラリーの１つのメンバー、又はリガンド結合性分子ライブラリーの１つのメンバーは、細胞において、その標的分子、例えば、細胞受容体タンパク質、細胞表面膜結合タンパク質、又は細胞における抗原と共発現し得る。
別の態様において、本発明は、特異的な、また天然であってよい、細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用を利用する選択方法を提供する。タンパク質は、抗体などの結合性分子又はその結合性断片若しくは部分によって認識される標的抗原であり得る。このような標的抗原の相互作用には、限定はしないが、特定の細胞受容体タンパク質、又は原形質膜表面上で発現し得る受容体タンパク質と、その同族リガンド又はタンパク質（「結合対メンバー」）との間の相互作用が含まれる。細胞の環境において、標的抗原は、抗体などの結合性分子によって、又は、その全てが同一の細胞において共発現され得る、抗体ライブラリー若しくは他の結合性分子のライブラリーのメンバーによって、結合され得る。１つの実施形態において、細胞内で、結合性分子、例えば抗体又はその結合性部分は、細胞受容体タンパク質、若しくは標的として原形質膜表面上で発現し得る受容体タンパク質に、又は標的としての同族リガンド若しくはタンパク質に結合する。結合性分子又は抗体によるこの結合は、細胞受容体タンパク質、又は原形質膜表面上で発現し得る受容体タンパク質と、その同族リガンド又はタンパク質との間で典型的に生じる結合相互作用を妨害、ブロック、中和、又は阻害する。１つの実施形態において、結合性分子、抗体、又はその結合性部分は、同族リガンドを結合する。１つの実施形態において、結合性分子、抗体、又はその結合性部分は、細胞受容体タンパク質又は受容体タンパク質を結合する。
別の態様において、本発明は、受容体タンパク質とその同族リガンドの相互作用に続く、その同族リガンドによる、細胞表面で通常は発現するリガンド結合性タンパク質又は受容体タンパク質の細胞内保持と、細胞表面での受容体タンパク質の出現及び検出をもたらす、結合性分子又はその結合性断片若しくは部分による、受容体タンパク質とその同族リガンドとの間の相互作用の阻害とを伴う、選択方法を提供する。結合性分子又はその結合性断片若しくは部分は、抗体ライブラリーなどの結合性分子ライブラリーのメンバー、又は多様化された抗体ライブラリーなどの遺伝的に多様化された結合性分子ライブラリーのメンバーであり得る。細胞内で、抗体、又はライブラリーのメンバーは、その全てが同一の細胞において共発現するリガンド結合性タンパク質又はその同族リガンドを認識し、結合する。本発明の態様において、リガンド結合性タンパク質又は同族リガンドは、細胞の小胞体（ＥＲ）保持シグナル配列への機能可能な連結又は融合によって、ＥＲにおいて保持される。
別の態様において、本発明は、遺伝的変動性及び多様化を、結合性分子、特に抗体、又はその結合性断片若しくは機能的部分、又はそのライブラリー内に分子的に導入する方法を提供する。多様化された結合性分子、抗体、又はそのライブラリーは、細胞表面で発現した受容体タンパク質又はこのような受容体タンパク質のリガンドなどの標的分子の結合及び／又は標的分子に対する活性が潜在的に向上しているか又は最適な結合性分子、又は結合性分子のライブラリーのメンバーを選択及び同定するために、本明細書において記載される発明的な選択方法において用いられ得る。本方法は、多様性が増大し、且つ、標的特異性、結合、及び／又は機能的特性などの特性又は活性の向上又は最適化についてスクリーニング又は選択され得る、結合性分子、例えば抗体の集団を生成させ得る。
本発明によれば、標的分子の結合についての特異性を有する結合性分子を選択する方法は、本明細書において記載される遺伝的に多様化された抗体の１又は２以上の選択に寄与する。１つの態様において、抗体である結合性分子の遺伝的変動性及び多様化は、ジンクフィンガータンパク質認識部位を、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域、すなわちそれぞれＶＨ及び／又はＶＬの、相補性決定領域（ＣＤＲ、complementarity determining region）、例えばＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３に導入して、修飾された又は非天然のＣＤＲを生じさせることによって達成される。遺伝子の妨害は、ＣＤＲの１又は２以上内の分子的に改変された認識配列のターゲティングによって誘発され、また、新たなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、zinc finger nuclease）及びそれらの関連する切断活性を生じさせることによって達成される。１つの実施形態において、また本明細書において記載されるように、ＣＤＲの１又は２以上は、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質認識配列をターゲティング部位配列として含むように、分子的に改変されている。１つの実施形態において、２つのＺＦＮ切断部位は、ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインにおける各ＣＤＲを含む。例えば、ＶＬ領域が修飾されたＣＤＲを含む場合、そのＣＤＲは、２つのジンクフィンガー認識標的部位を含有するように分子的に改変されており、その結果、本発明に従って生成されたＺＦＮの対は、ＣＤＲ内の２つの認識部位で、又はその近傍で切断する。１つの実施形態において、抗体などの結合性分子又はその結合性部分などの、リガンド又は抗原の認識及び結合能力を向上及び／又は増大させ得る、さらなる遺伝的ばらつきの生成は、ＣＤＲ修飾抗体である結合性分子及び本明細書において記載される適切なＺＦヌクレアーゼを発現するように改変されている細胞における、Ｔａｘ及びＴｄｔ酵素タンパク質の共発現を介して、突然変異生成の頻度及び遺伝的多様性を増大及び向上させることによってもたらされる。１つの実施形態において、Ｔａｘタンパク質、又は類似の機能を有するタンパク質のみが、ＣＤＲ修飾結合性分子及びＺＦヌクレアーゼも発現する細胞において発現する。１つの実施形態において、ＴｄＴタンパク質のみが、ＣＤＲ修飾結合性分子及びＺＦヌクレアーゼも発現する細胞において発現する。他の実施形態において、本明細書において記載されるような、ＡＴＭキナーゼの化学的阻害剤は、本発明の方法に従って、さらなる遺伝的多様性、及び抗体である結合性タンパク質におけるばらつきを誘発するために用いられ得る。
別の態様において、本発明は、細胞内での、細胞表面に発現した受容体タンパク質とその同族リガンドとの間の相互作用をブロック又は妨害する結合性分子を選択する方法であって、同一の細胞において、細胞の表面で発現可能な受容体タンパク質を発現させるステップ、この細胞において、受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、細胞内オルガネラにおけるリガンドの保持、及びオルガネラにおける受容体タンパク質と同族リガンドの相互作用を可能にし、その結果、受容体タンパク質も、タグ付けされたリガンドに結合した場合に細胞オルガネラ内に保持されるようになる条件下で、同族リガンドが、リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされている、ステップ、細胞内オルガネラにおいてその標的抗原として保持されている受容体タンパク質又はリガンドタンパク質のいずれかを特異的に結合する結合性分子を細胞に導入するステップ、及び細胞表面で発現した受容体タンパク質のレベルを検出するステップを含み、結合性分子が受容体タンパク質又はリガンドに結合し、オルガネラにおけるそれらの相互作用をブロック又は妨害する場合、受容体タンパク質は、それによって、オルガネラを通過し、細胞表面で発現及び検出可能である、方法を提供する。したがって、その標的抗原に結合した結合性分子は、受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック又は妨害し、例えば、検出可能な標識の結合、フローサイトメトリー、及び細胞の成長増殖によって、細胞表面での受容体タンパク質の存在の検出の後に細胞から選択可能である。実施形態において、保持は、ＥＲ又はゴルジ体において生じる。
別の態様において、本発明は、結合性分子、又はその結合性断片若しくは部分、例えば抗体又はその結合性部分が、細胞内で細胞表面に発現した標的タンパク質に特異的に結合するかどうかを検出する方法であって、細胞において、細胞の表面で発現可能な標的タンパク質を発現させるステップ、細胞において、細胞内オルガネラ、例えばＥＲ又はゴルジ体において結合性分子を保持するための配列に分子的に融合又は結合している結合性分子又はその結合性断片若しくは部分を発現させるステップを含む方法を提供する。したがって、結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、細胞において標的タンパク質に特異的に結合する場合、標的タンパク質は、保持シグナルに融合することによってオルガネラにおいて保持されている結合性分子又はその結合性断片若しくは部分によって結合されることを介して、細胞内オルガネラにおいて保持され、それによって、細胞表面での前記標的タンパク質の発現を防ぐ。細胞表面に発現した標的タンパク質のレベル又は量は、例えばフローサイトメトリーのような適切な検出方法を介して検出可能であり、その結果、細胞表面で検出される標的タンパク質が、適切な対照と比較して事実上検出不可能なレベル又は低いレベルであることは、細胞内部での、標的分子への結合性タンパク質、又は結合性断片、又はその部分の結合を示す。
上記の方法の１つの実施形態において、選択される結合性分子又はその結合性部分は、細胞から回収又は単離され得る。別の実施形態において、結合性分子は、抗体又はその結合性断片若しくは部分、抗体ライブラリーのメンバー、或いは単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、例えば、ＶＬ及び／又はＶＨドメインから選択される。このような抗体又はライブラリーは、遺伝的に多様化され得る。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体（Ｆｖ）、又はダイアボディから選択される。別の実施形態において、結合性断片又は部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ、domain antibody）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される。１つの実施形態において、結合性分子は、リガンド結合性受容体分子又は受容体タンパク質、例えば、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｈＴＮＦ−α受容体１、human tumor necrosis factor alpha）受容体タンパク質に対する抗体又はその結合性断片若しくは部分である。１つの実施形態において、リガンド結合性受容体分子又は受容体タンパク質は、細胞の表面で発現可能であり、及び／又は発現する。１つの実施形態において、結合性分子は、リガンド結合性受容体タンパク質又は受容体タンパク質、例えばヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｈＴＮＦ−α）の同族リガンド（又はリガンドタンパク質）に対する抗体又はその結合性断片若しくは部分である。別の実施形態において、結合性分子は、非抗体分子である。別の実施形態において、受容体タンパク質又は標的分子は、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、代謝酵素受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、腫瘍抑制因子抗原受容体（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｋ−Ｒｅｖ、ＤＣＣ受容体）、多剤耐性タンパク質受容体、凝固因子受容体、第VII因子受容体、第VIII因子受容体、第IX因子受容体、栄養因子受容体、細胞認識分子若しくは刺激分子受容体、アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ（α）、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ、insulin-like growth factor receptor）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィン受容体、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、ＴＯＬＬ様受容体から選択されるヒト受容体タンパク質；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体から選択されるホルモン受容体；アドレナリン受容体；アミリン、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンの受容体から選択されるペプチド受容体；ＧＰ１３０又はＩＬ６受容体である。典型的な実施形態において、受容体タンパク質は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ受容体１（ｈＴＮＦ−α受容体１）である。別の実施形態において、リガンドタンパク質又は標的分子は、前述のタイプの受容体分子の１つに対する同族リガンドであるヒトリガンドタンパク質である。別の典型的な実施形態において、リガンドタンパク質又は標的タンパク質は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｈＴＮＦ−α）である。別の実施形態において、結合性分子は、受容体タンパク質の１つ、又は標的タンパク質としての同族リガンドに結合する。別の実施形態において、細胞内オルガネラは、小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である。別の実施形態において、同族リガンドは、小胞体（ＥＲ）においてリガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされている。別の実施形態において、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号１）である。
別の態様において、本発明は、抗体又はその結合性断片若しくは部分が、細胞内で、細胞表面に発現した標的分子に特異的に結合するかどうかを検出する方法であって、細胞の表面で発現可能な標的分子を細胞内で発現させること、ＥＲ又はゴルジ体保持配列に融合した抗体又はその結合性断片若しくは部分を細胞内で発現させるステップであって、抗体、又はその結合性断片若しくは部分が、細胞において標的タンパク質に特異的に結合する場合、標的タンパク質が、抗体又はその結合性断片若しくは部分に結合することを介してＥＲ又はゴルジ体において保持され、それによって、細胞表面での標的タンパク質の発現を防ぐ、ステップ、及び細胞表面で発現した標的タンパク質のレベルを検出し、その結果、細胞表面で検出される標的タンパク質が、適切な対照と比較して検出不可能なレベル又は低いレベルであることが、細胞内での、抗体又はその結合性断片若しくは部分の標的分子への結合を示すステップを含む方法を提供する。抗体又はその結合性断片は、当業者に知られている方法を介して、細胞内から選択可能である。
別の態様において、本発明は、細胞の表面で発現した標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその結合性断片若しくは部分を選択する方法であって、細胞表面で標的タンパク質を発現する細胞株を確立するステップであって細胞表面に発現した標的タンパク質が、検出可能に標識された結合性分子によって検出され得る、ステップ、標的タンパク質への結合について選択するために、この細胞株において抗体、又はその結合性断片若しくは部分を発現させるステップであって、抗体、又はその結合性断片若しくは部分は、オルガネラ内部での、抗体、又はその結合性断片若しくは部分と標的タンパク質の相互作用及び結合を可能にする条件下で、抗体又はその結合性断片若しくは部分を細胞内オルガネラにおいて保持するためのシグナル配列に融合している、ステップ、及び細胞表面で発現した標的タンパク質のレベルを、検出可能に標識された結合性分子で検出するステップを含み、抗体又はその結合性断片若しくは部分が、オルガネラにおいて標的タンパク質に特異的に結合する場合、標的タンパク質はオルガネラにおいて結合可能に保持され、それによって、細胞表面での標的タンパク質の発現のレベルが減少するか又は事実上排除され、細胞における、標的タンパク質に特異的に結合する選択可能な抗体又はその結合性断片の保持が示される、方法を提供する。
上記で直接説明された方法の実施形態において、本方法はさらに、従来の方法によって、細胞から、標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその結合性断片若しくは部分を回収することを含む。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、抗体又はその結合性断片若しくは部分を小胞体（ＥＲ）細胞内オルガネラにおいて保持するためのシグナル配列に融合している。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、抗体又はその結合性断片若しくは部分をＥＲにおいて保持するＫＤＥＬシグナル配列（配列番号１）に融合している。別の実施形態において、標的タンパク質は、細胞表面で発現した、原形質膜で発現可能なタンパク質、例えば、ｈＴＮＦ−αタンパク質である。別の実施形態において、細胞株は、抗体又はその結合性断片若しくは部分をコードする核酸配列をコードするレンチウイルス粒子に感染しているか又はそれを形質導入されている。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、抗体ライブラリーのメンバー、又は多様化され得る抗体の結合性断片若しくは部分を含むライブラリーのメンバーである。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインである。典型的な実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、ｈＴＮＦ−αを結合するＶＬ及び／又はＶＨドメインである。別の実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、ＶＬ及び／又はＶＨドメインライブラリーのメンバーである。典型的な実施形態において、細胞表面で発現した標的タンパク質のレベルは、フローサイトメトリー及び検出可能に標識された抗ｈＴＮＦ−α抗体によって検出される。
別の態様において、本発明は、複数の結合性分子から、細胞表面に発現した受容体結合性タンパク質及びその同族リガンドを含む相互作用対のメンバーである標的抗原を結合する結合性分子を選択する方法を提供する。したがって、本方法は、（ａ）複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸を、細胞内オルガネラにおいて同族リガンドを保持する保持シグナルに融合している受容体結合性タンパク質及び同族リガンドを発現する細胞に導入するステップ、（ｂ）細胞において（ａ）の核酸を発現させるステップであって、発現した結合性分子が、オルガネラにおいて保持されている受容体結合性タンパク質又は同族リガンド標的抗原に結合し、受容体結合性タンパク質と同族リガンドとの間の相互作用を妨害又はブロックする、ステップ、及び（ｃ）細胞表面で発現した受容体結合性タンパク質のレベルを検出するステップを含み、ここで、結合性分子が、オルガネラにおいて受容体結合性タンパク質又は同族リガンドのいずれかに結合し、それらの相互作用を妨害又はブロックする場合、受容体結合性タンパク質が細胞表面で発現し、検出可能であり、相互作用を妨害又はブロックする結合性分子が選択可能である。１つの実施形態において、複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸は、その核酸を有するレンチウイルス粒子によって細胞内に導入される。１つの実施形態において、本方法はさらに、選択された結合性分子を細胞から回収又は単離することを含む。本方法の１つの実施形態において、複数の結合性分子が、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬライブラリー、遺伝的に多様化されたＶＬライブラリー、ＶＨライブラリー、又は遺伝的に多様化されたＶＨライブラリーから選択される。具体的な実施形態において、複数の結合性分子は、例えば、ｈＴＮＦ−α ＶＬ結合ドメインによって本明細書において例示されるように、ＶＬライブラリー、遺伝的に多様化されたＶＬライブラリーである。１つの実施形態において、結合性分子又はその結合性部分は、抗体又はその結合性断片若しくは部分から選択される。１つの実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又は一本鎖抗体から選択される。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又は部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又はその部分は、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化されたＶＬドメインである。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又はその部分は、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化されたＶＨドメインである。様々な実施形態において、細胞内オルガネラは、ＥＲ又はゴルジ体であり、同族リガンドは、リガンドをＥＲにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされており、ＥＲ保持配列はＫＤＥＬ（配列番号１）である。
さらに別の態様において、本発明は、複数の結合性分子から、細胞表面に発現した標的抗原を結合する結合性分子又はその結合性部分を選択する方法を提供する。したがって、本方法は、細胞内オルガネラ保持シグナルをコードする核酸に作動可能に連結している複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸配列を細胞に導入するステップであって、同一の細胞が、細胞表面で発現可能な標的抗原を発現する、ステップ、細胞において、保持シグナルを含む複数の結合性分子を発現させるステップであって、複数の結合性分子のうちの１つが、標的タンパク質に特異的に結合する結合性分子又はその結合性部分を含む場合、標的タンパク質が、その発現した保持シグナルを介して細胞内オルガネラにおいて保持されている結合性分子、又はその結合性部分に結合することを介して、細胞オルガネラにおいて保持され、それによって、オルガネラからの標的タンパク質の排出と、細胞表面での標的タンパク質の発現との両方を防ぐ、ステップ、及び細胞表面で発現した標的タンパク質のレベルを検出するステップを含む。本方法に従うと、適切な対照と比較して検出不可能レベル又は低いレベルの標的タンパク質が、細胞表面で検出される場合、このことは、細胞における結合性分子、又はその結合性部分の標的分子への特異的結合を示し、結合性分子、又はその結合性部分は、本方法によって選択され、従来の方法を介して細胞から単離又は回収され得る。１つの実施形態において、複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸は、その核酸を有するレンチウイルス粒子によって細胞内に導入される。１つの実施形態において、本方法はさらに、選択された結合性分子を細胞から回収又は単離することを含む。１つの実施形態において、複数の結合性分子は、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化されたＶＬライブラリー、ＶＨドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化されたＶＨライブラリーから選択される。１つの実施形態において、結合性分子又はその結合性部分は、抗体又はその結合性断片若しくは部分から選択される。１つの実施形態において、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又は一本鎖抗体から選択される。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又は部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される。１つの実施形態において、複数の結合性分子は、抗体ＶＬライブラリー又は遺伝的に多様化されたＶＬライブラリーである。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又はその部分は、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化されたＶＬドメインである。１つの実施形態において、複数の結合性分子は、抗体ＶＨライブラリー又は遺伝的に多様化されたＶＨライブラリーである。１つの実施形態において、抗体の結合性断片又はその部分は、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化されたＶＨドメインである。１つの実施形態において、細胞内オルガネラ保持シグナルは、小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体保持シグナルである。１つの実施形態において、ＥＲ保持配列はＫＤＥＬ（配列番号１）である。
別の態様において、本発明は、複数の結合性分子から、細胞表面に発現した受容体結合性タンパク質及び同族リガンドを含む相互作用対のメンバーである標的抗原を結合する結合性分子を選択する方法であって、（ａ）受容体結合性タンパク質を発現する単一細胞において、（ｉ）複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸配列、及び（ii）受容体結合性タンパク質の同族リガンドをコードする核酸配列を共発現させるステップであって、細胞内オルガネラにおける発現した結合性分子又は発現した同族リガンドの保持を可能にする条件下で、結合性分子又は同族リガンドのいずれかが、細胞における（ｉ）又は（ii）の発現の後に細胞内オルガネラにおいて（ｉ）又は（ii）のいずれかを保持するための保持シグナルをコードする核酸配列に作動可能に結合しており、発現した結合性分子が、標的抗原としての受容体結合性タンパク質又は同族リガンドに結合している場合、このような結合が、受容体結合性タンパク質と同族リガンドとの間の天然の相互作用を妨害、中和、又はブロックし、細胞表面での受容体結合性タンパク質の発現のために、受容体結合性タンパク質を、同族リガンドとのその相互作用から解放する、ステップ、並びに（ｂ）細胞表面で発現した受容体結合タンパクのレベルを検出し、その結果、細胞表面での高レベルの受容体結合性タンパク質の発現が、細胞内で標的抗原を結合する特異的結合性分子の発現及び選択を示す、ステップを含む方法を提供する。本方法の１つの実施形態において、複数の結合性分子は、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化された単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬドメインライブラリー、遺伝的に多様化されたＶＬドメインライブラリー、ＶＨドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化されたＶＨドメインライブラリーから選択される。１つの実施形態において、結合性分子は、抗体又はその結合性断片若しくは部分、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、遺伝的に多様化された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、遺伝的に多様化された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）である。実施形態において、結合性分子は、ＶＬドメイン、遺伝的に多様化されたＶＬドメイン、ＶＨドメイン、又は遺伝的に多様化されたＶＨドメインである。実施形態において、結合性分子は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む完全長抗体、例えば、ＩｇＧ抗体又はそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１抗体である。実施形態において、細胞内オルガネラは、小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体であり、細胞内オルガネラ保持シグナルは、ＫＤＥＬアミノ酸配列（配列番号１）である。実施形態において、標的抗原は、本明細書において記載される受容体タンパク質又は同族リガンドのタイプであり得る。
さらに別の態様において、本発明は、リガンド結合性受容体タンパク質の細胞表面での発現を防ぐか、又は「ノックダウン」する方法であって、細胞において、リガンド結合性受容体タンパク質を発現させるステップ、細胞において、リガンド結合性受容体タンパク質によって結合され得るリガンドタンパク質を発現させるステップであって、オルガネラにおけるリガンド結合性受容体タンパク質とリガンドタンパク質の相互作用を可能にする条件下で、リガンドタンパク質が、細胞内オルガネラにおいてリガンドタンパク質を保持するための外因性シグナル配列に融合している、ステップ、細胞表面で発現したリガンド結合性受容体タンパク質のレベルを測定するステップを含み、オルガネラにおいて保持されているリガンドタンパク質へのリガンド結合性受容体タンパク質の結合が、オルガネラにおいてリガンドタンパク質に結合しているリガンド結合性受容体タンパク質を同時に保持し、それによって、リガンド結合性受容体タンパク質の細胞表面発現を防ぐか、又は「ノックダウン」する、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）を修飾することによって、抗体などの結合性分子又はその結合性部分において遺伝的多様性又は変動性を生じさせる方法であって、（ａ）１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列に、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン認識配列を導入し、それによって、１又は２以上の非同一のターゲティング部位を１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列内で生じさせて、１又は２以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を結合し、修飾されたＣＤＲコード核酸配列を生成するステップ、（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列に、IIS型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結している（ａ）の１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン認識配列のターゲティング部位の少なくとも１つを導入するステップであって、ＺＦＮによるＤＮＡ切断が、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列内のターゲティング部位によって決定される、ステップ、並びに（ｃ）発現したＺＦＮがターゲティング部位配列内の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を結合し、切断する条件下で、（ｂ）の核酸配列を、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を含む少なくとも抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は少なくとも抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸を含む細胞において発現させるステップを伴う方法を提供する。１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、抗体可変領域をコードする核酸配列のＣＤＲ領域の１又は２以上をコードする核酸配列内に導入されることが理解されよう。
この方法によれば、細胞内で、修飾されたＣＤＲコード核酸配列内の切断されたＤＮＡの組換え、修復、及び再結合のプロセスは、ターゲティング部位配列、又はＺＦＮがＣＤＲ内のＤＮＡを結合及び切断する場所である「ホットスポット」における、及び／又はその周辺での超変異をもたらす。細胞において発現した少なくともＶＨ及び／又はＶＬ領域内での、結果として生じるＣＤＲの発現は、標的抗原への向上した又は最適な結合を示す可能性がある遺伝的に多様化された結合性分子又は抗体産物を最終的に提供する。（ａ）における１つの実施形態において、ＣＤＲコード核酸配列は、分子生物学的技術及び遺伝子操作を実行するために適切な核酸ベクター又はカセット、例えばＤＮＡベクター内に含まれる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合認識配列は、１又は２以上の修飾されたＣＤＲ、例えば、抗体軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３、及び／又は抗体重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３を産生させるために、ベクター又はカセット内に存在するＣＤＲコード核酸配列内に導入される。１つの実施形態において、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含む核酸ベクター又はカセットは、その後、ＶＬ及び／又はＶＨドメインをコードする核酸配列内に導入され、その結果、発現したＣＤＲの結果的な位置は、それらが重鎖又は軽鎖可変領域において通常発現する方向にある。本方法の（ａ）における１つの実施形態において、ＣＤＲコード核酸配列は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列がＣＤＲコード核酸配列内に導入される時に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードする核酸配列及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列内に含まれる。（ｃ）における１つの実施形態において、修飾されたＣＤＲコード核酸配列は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列を含み、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含む、完全長抗体内に含まれ、ここで、結果として生じる核酸配列は、修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及びＶＬドメインを含む完全長抗体をコードする。１つの実施形態において、本方法はさらに、ＶＨ及び／又はＶＬドメインタンパク質をコードする核酸配列を細胞から増幅し、最適にはクローニングすることを含む。
別の態様において、本発明は、修飾された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む遺伝的に多様な抗体又はその結合性断片若しくは部分を生じさせる方法を提供し、ここで、本方法は、抗体ＶＨ及び／又はＶＬドメインの１又は２以上の個別のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内に、１又は２以上のジンクフィンガー結合ドメインターゲティング部位を含有するように改変されている、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を結合するための１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン核酸認識配列（又はターゲティング部位）を、Ｆｏｋ１などのIIＳ型エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインに共有結合したＣＤＲコード核酸配列内に導入されたように、導入することによって、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを産生させることを含み、ここで、ＺＦＮは、（ａ）のＣＤＲ含有ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン核酸認識配列の特異性によって決定されるように、ＣＤＲ内で切断する。１若しくは２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及び／若しくはＶＬドメインをコードするか又は１若しくは２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及び／若しくはＶＬドメインをコードする完全長免疫グロブリン分子をコードする、核酸配列は、ＺＦＮがＣＤＲにおける特異的ターゲティング配列部位内で切断するため、並びに、細胞組換え及び修復タンパク質が、ＣＤＲ内ホットスポット又はＺＦＮによって結合及び切断されるＣＤＲ内の部位から生じる、ＣＤＲ配列内での切断、及びＣＤＲ内での配列の再結合、及び結果として生じる元の配列における変異に起因して、遺伝的に多様化された結合領域を含むＶＨ及び／又はＶＬドメインを生じさせるための、適切な条件下及び時間で、細胞において発現する。この手段において、発現したＶＨ及び／若しくはＶＬドメインの結合領域を含む遺伝的に多様なＣＤＲ配列セット、又はこのようなドメインを含む抗体が得られる。このような多様性によって、標的抗原に対する結合特性が向上しているか又は最適化されている可能性のある、抗体、又は抗体分子の集団が得られる。さらなる実施形態は、結合領域、特に、記載されるような１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含む領域の遺伝的多様性の増大に寄与する他の酵素、又は化学的作用物質などの作用物質の発現を包含する。このような酵素又は作用物質には、Ｔａｘ、ＴｄＴ、又は本明細書において記載されるようなＡＴＭキナーゼの化学的阻害剤が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴａｘとＴｄＴとの両方が共発現し、いくつかの実施形態において、Ｔａｘ又は類似の機能を有する酵素のみが発現し、いくつかの実施形態において、ＴｄＴ又は類似の機能を有する酵素のみが発現し、いくつかの実施形態において、Ｔａｘ、ＴｄＴ、及びＡＴＭキナーゼの化学的阻害剤が共発現する。
記載された方法において、１又は２以上のＣＤＲをコードする核酸配列は、既知の抗原を結合する抗体に由来し得るか若しくはそれから得られ得るか、又は、それらは、様々な結合特異性若しくは未知の標的結合特異性を有する抗体分子をコードするライブラリーに由来し得るか若しくはそれから得られ得る。ＣＤＲは、例えば哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタなどを含む異なる動物種の免疫グロブリンに由来し得るか又はそれから得られ得る。１つの実施形態において、ＣＤＲは、ヒトＣＤＲである。１つの実施形態において、ＣＤＲは、非ヒトＣＤＲ、例えば、ウサギＣＤＲ、又はマウスＣＤＲ、又はラットＣＤＲである。
本方法の実施形態において、組換え及び遺伝子修飾及び遺伝的ばらつきに寄与するか又はそれをもたらす、修飾されたＣＤＲ及びＺＦＮ、及び場合によって他の酵素、例えばＴａｘ及び／又はＴｄＴの核酸配列が、ＺＦＮが、導入されたジンクフィンガー結合認識部位内の修飾されたＣＤＲをターゲティング及び切断する条件下で、並びに、遺伝的に多様な、すなわち変異を含む抗体産物又はその結合性部分を産生するための条件下で、宿主細胞内に導入される。本発明の遺伝的多様化方法の実施の結果生じる変異は、例えば、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ超可変領域内のヌクレオチド（塩基対）の挿入、欠失、又は置換の形態であり得る。このような変異は、すなわち、標的抗原に対するより良好な結合特異性及び／又は親和性を提供することによって、抗体産物の発現の後、得られた、発現した結合領域の、標的抗原への結合に対して正の影響を与え得る。本方法の１つの実施形態において、ＣＤＲコード核酸配列は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインの外側で、例えば核酸ベクター及び／又はカセット内で、遺伝子修飾され、その後、ＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列内に導入される。１つの実施形態において、ＣＤＲコード核酸配列は、それらが存在するＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のＣＤＲ遺伝子座において遺伝子修飾される。本方法の１つの実施形態において、修飾されたＣＤＲコード核酸配列は、抗体タンパク質のＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列内に導入される。１つの実施形態において、遺伝子修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列は、次いで、分子的にクローニングされて、抗体重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖をコードする核酸配列と作動可能に発現し、ここで、得られた核酸配列は、ＶＨ及びＶＬドメイン内の異なるＺＦＮ認識部位を含む修飾されたＣＤＲ領域を含む抗体タンパク質をコードする。
１つの実施形態において、修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列、又は修飾されたＣＤＲが導入されているＶＨ及び／若しくはＶＬドメインをコードする核酸配列、又は修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及び／若しくはＶＬドメインを含む完全長抗体をコードする核酸配列は、１又は２以上の適切な発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターを用いて、適切な宿主細胞において発現する。修飾されたＣＤＲを含む得られたＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又は、修飾されたＣＤＲを含むＶＨ及び／若しくはＶＬドメインを含む１若しくは２以上の抗体は、本明細書において記載された方法に従って同一細胞内での標的抗原への結合についてスクリーニング又は選択され得る。１つの実施形態において、選択方法は、ＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン又は抗体が、同一細胞内で、標的抗原、すなわち、受容体結合性タンパク質又はその同族リガンドを含む結合対の一方のメンバーに結合する、本明細書において記載される発明の方法を含む。本明細書において詳細に記載されるように、同族リガンドは、ＥＲなどのオルガネラにおいてリガンドを保持する保持シグナルに典型的には融合又は結合される。ＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又はこのようなＶＨ及び／若しくはＶＬドメインを含む抗体が、ＥＲの環境において受容体結合性タンパク質又はそのリガンドを結合する場合、受容体タンパク質と同族リガンドとの間の結合相互作用は、妨害、中和、又はブロックされる。リガンドは、その保持シグナルによってオルガネラ内に保持されるが、そのリガンドとのその相互作用から解放された受容体タンパク質は、ＥＲを通過し得、細胞表面に発現し得る。「解放された」受容体のこのような細胞表面での発現は、特異的抗体の結合、及び例えばフローサイトメトリーによるその検出によって、検出可能（及び定量可能）である。対照と比較したシグナルの検出は、細胞が、細胞内で標的分子を結合するＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン又は抗体を含むこと、並びに、このような結合事象が受容体−リガンド相互作用を効果的に妨害、中和、又はブロックしたことを示す。
他の実施形態において、本方法はさらに、細胞において産生された、結合性分子又はその結合性部分、例えば抗体又はその結合性部分をコードする核酸配列を単離又は回収すること、例えばＰＣＲによって、コード核酸配列を増幅すること、及び、結合性分子又はその結合性部分、例えば抗体又はその結合性部分をコードする核酸配列、又はその遺伝的に多様な形態を細胞からクローニングすることを含む。
本明細書において記載される１又は２以上の修飾されたＣＤＲ及びＺＦヌクレアーゼを含む、抗体又はその結合性断片若しくは部分などの、遺伝的に多様な結合性タンパク質を細胞内で生成する方法において、ＺＦＮ活性に加えて、結合性分子による結合能力、活性、又は機能の向上又は増大をもたらすさらなる遺伝的多様性及び変動性が、Ｔａｘタンパク質、若しくはＴａｘに類似の機能を有するタンパク質を、末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と共に細胞において発現させることによって、又はＴａｘタンパク質のみを発現させることによって、達成される。本発明の方法によると、細胞内で遺伝子修飾及び遺伝的に多様化された結合性タンパク質（抗体又はその結合性部分）は、従来の検出方法を用いて、標識され検出可能な抗原へのその結合を介して、細胞表面で検出され得る。修飾されたＣＤＲ領域を含み、本明細書において記載される本発明の方法を介して細胞において遺伝的に多様化された、抗体又はその結合性部分の、細胞表面での発現は、既知の、並びに分子分野において用いられる、並びに本明細書において記載及び例示される（例えば実施例６）、抗体の結合領域及び適切な膜貫通（ＴＭ、transmembrane）ドメイン及びリーダー配列を少なくとも含む融合分子を例えば生成することによって、達成される。
別の態様において、本発明は、細胞内で細胞表面に発現した結合性タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用をブロック、阻害、又は妨害する低分子をスクリーニング又は選択する方法であって、ｉ）同一の細胞において、細胞の表面で発現可能な結合性タンパク質、及び結合性タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、同族リガンドが、オルガネラにおけるリガンドの保持、及びオルガネラにおける結合性タンパク質と同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、細胞内オルガネラにおいてリガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされているか、又はそれと融合しており、その結果、結合性タンパク質が、タグ付けされたリガンドに結合すると、細胞オルガネラ内に保持される、ステップ、ii）それが細胞内オルガネラにおいて保持されている結合性タンパク質又はリガンドタンパク質のいずれかと結合、会合、又は相互作用するかどうかを決定するための低分子を細胞に導入するステップ、並びにiii）細胞表面で発現した結合性タンパク質のレベルを検出するステップを含み、低分子が細胞内で結合性タンパク質又はリガンドのいずれかに結合し、オルガネラにおける結合性タンパク質とそのリガンドの相互作用をブロック、阻害、又は妨害する場合、結合性タンパク質はもはやリガンドとのその相互作用を介してオルガネラにおいて保持されることはなく、それによって、オルガネラを通過し、細胞表面で発現し、検出可能となる、方法を提供する。結合性タンパク質は、本明細書において記載される受容体タンパク質であり得る。リガンドは、本明細書において記載されるタンパク質であり得る。低分子は、限定はしないが、低分子の化学的化合物、低分子量の有機化合物、薬剤、又は化学的作用物質であり得る。低分子量の有機化合物の分子量は、典型的には、５００ダルトン以下であるか、又は９００ダルトン未満である。本方法に従うと、リガンドは、ＥＲ又はゴルジ体などの細胞内オルガネラにおける保持のための保持配列と融合しているか、又はそれでタグ付けされている。ＥＲにおける保持のために、保持配列（タグ配列）は、KDEL（配列番号１）を含む。本方法に従うと、結合性タンパク質及び／又はそのリガンドの一方又は両方と結合、会合、又は相互作用している低分子は、それによって、結合性タンパク質とリガンドの相互作用を阻害、ブロック、遮断、又は妨害して、そのリガンドともはや相互作用し得ない、細胞表面に発現可能な結合性タンパク質が、細胞内オルガネラから移動し、細胞表面で発現するようになって、そこで、例えば、検出可能な標識結合若しくはフローサイトメトリー、及び／又は細胞の成長増殖によって、検出可能となり得ることを可能にする。本方法は、候補低分子のプール若しくは集団と共に使用するため、並びに／又は候補低分子のセット、例えば化学的ライブラリー及び他の低分子収集物をスクリーニング若しくは選択するために適している。さらに、本方法は、特定の低分子化合物の誘導体又は類似体のセットをスクリーニング又は選択するために用いられ得る。
本明細書に記載の、本発明の態様であるＫＤＥＬ（配列番号１）でタグ付けされたリガンドタンパク質が細胞の小胞体に保持されている態様を示す模式図を示す。簡単に示されており、図１Ａ〜１Ｄはリガンド結合性受容体タンパク質ｈＴＮＦ−α受容体Ｉ又はその同種であるリガンドタンパク質ｈＴＮＦ−αに対する組換え抗体を用いて試験された、本発明の技術及び方法の証明を示し、両タイプの抗体はリガンド結合性受容体タンパク質ｈＴＮＦ−α受容体Ｉ及びその同種であるリガンドタンパク質ｈＴＮＦ−α間の相互作用をブロック又は妨害することができることを示している。示されるように、代表的な受容体タンパク質、すなわちｈＴＮＦ−α受容体Ｉを細胞表面に発現させるJurkat細胞株は、本発明に従って、いくつかの発現させたタンパク質を発現及び保持するために分子的に改変された。細胞表面の受容体の存在は、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉに対する検出可能に標識された（例えば蛍光標識）抗体により検出することができる。略語：ＥＲ、小胞体（endoplasmic reticulum）；ｈＴＮＦ−α、ヒト腫瘍壊死因子α（human tumor necrosis factor alpha）；ＫＤＥＬ（配列番号１）、ＥＲへの保持シグナル；ＶＬ、抗ｈＴＮＦ−α受容体Ｉ抗体からの抗体軽鎖可変領域。 ＥＲに抗体を保持するＫＤＥＬ配列（配列番号１）でタグ付けされた抗体（ＶＬドメイン）の模式図を示す。図２Ａで示されるように、細胞表面で発現させたｈＴＮＦ−αタンパク質は、細胞表面で発現させたｈＴＮＦ−αタンパク質を特異的に認識し結合する検出可能な抗体によって、細胞表面で検出される。図２Ｂにおいて、細胞はＶＬ抗体−ＫＤＥＬ分子（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として表される）を形質導入されるので、ｈＴＮＦ−αタンパク質と特異的に結合するＶＬ抗体はこの標的タンパク質をＥＲに保持し、ｈＴＮＦ−αタンパク質はもはや検出可能な抗体によって細胞表面で検出されない。略語：ＥＲ、小胞体（endoplasmic reticulum）；ｈＴＮＦ−α、ヒト腫瘍壊死因子α（human tumor necrosis factor alpha）；ＫＤＥＬ（配列番号１）、ＥＲへの保持シグナル；ＶＬ、ｈＴＮＦ−α抗体からの抗体軽鎖可変領域；「ＴＮＦ−α−ｔｍｄ−ＴＥＶ」、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ, transmembane domain）を含み、細胞質性ドメインとしてＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス（ＴＥＶ, tobacco etch virus）によってコードされた核封入体ａ（ＮＩａ, Nuclear Inclusion a）の触媒ドメイン）に融合されたＴＮＦ−α標的タンパク質。 ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）及びヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ、例えばＣＤＲ１及びＣＤＲ３、に導入されたジンクフィンガー標的配列の局在を示す図を示す。ジンクフィンガー標的タンパク質はフレームシフト及び抗体産生の必然的な不足を抑制するための３つの異なる配列で、ＣＤＲ領域に導入された。得られたヒト可変領域はヒトイムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１, human immunoglobulin type G1）に再導入され、その結果、異なるジンクフィンガー認識部位を含む分子的に改変されたＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域を有する完全な抗体が得られた。各ＣＤＲにおいて、２つの異なるジンクフィンガー認識部位があり、２つの異なるジンクフィンガーヌクレアーゼで認識することができる。ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、これらの部位内で特異的な切断を導入するために本戦略によって標的とされ、得られた抗体の遺伝的多様化を導いた。所望の可変性に依存して、ＣＤＲ２を変化させない、又はＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域で達したことと同様にジンクフィンガー標的に供することもできる。インタクトなＩｇＧイムノグロブリンタンパク質において、ヒト重鎖可変領域（ｈＶＨ）の、合計４つの別個のジンクフィンガーの「ホットスポット」、すなわちジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸制限配列は、本明細書に記載の特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ, zinc finger nuclease）によって、標的となるＣＤＲに導入され、ヒト軽鎖可変領域（ｈＶＬ）の４つの別個のジンクフィンガーのホットスポットは本発明に従って、抗体結合性領域の多様性及び可変性を生み出すために導入された。 すべての３つのリーディングフレームを包含するため、ヒトＶＨ及びＶＬ領域のジンクフィンガー標的配列部位の局在を示す図を示す。各ジンクフィンガーのホットスポットは、ランダム挿入及び核酸欠失の補償のため、フレーム＋１、＋２及び＋３に配置された。すべてのフレームに配置された異なるジンクフィンガーのホットスポットの組み合わせ因子は各可変鎖で８１の異なる構築物である。したがって、ＩｇＧＶＨ及びＶＬ領域のジンクフィンガーのホットスポットで合計６５６１の異なるバリアントが生じうる。ＣＤＲ内のジンクフィンガー部位を含む、記載された可変領域を含む構築物は、多様性及び可変性のある、結合特異性を有する異なる抗体クラスを生じさせるために、分子技術によってＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４イムノグロブリン主鎖に導入されることができる。 レンチウイルスベクターFugWの主鎖で直列にすべてのジンクフィンガーヌクレアーゼ１〜４を発現させるために構築されたプラスミドの模式図を示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼのプラスミドは各遺伝子を分離する２Ａ配列を使用したオーバーラップＰＣＲ（overlap PCR）によってクローニングされた。ＺＦＮ１ＶＨ及びＺＦＮ２ＶＨは、重鎖可変領域ＣＤＲ１を標的とし；ＺＦＮ３ＶＨ及びＺＦＮ４ＶＨは、重鎖可変領域のＣＤＲ３を標的とし；ＺＦＮ１ＶＬ及びＺＦＮ２ＶＬは、軽鎖可変領域のＣＤＲ１を標的とし；ＺＦＮ３ＶＬ及びＺＦＮ４ＶＬは、軽鎖可変領域のＣＤＲ３を標的とする。ＶＨを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼのレンチウイルスベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を含み；ＶＬを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼのレンチウイルスベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含む。略語：ＺＦＮ１、ＺＦＮ２、ＺＦＮ３、ＺＦＮ４、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc Finger Nuclease）１〜４；ＩＲＥＳ、内部リボソーム伸長配列（Internal Ribosome Elongation Sequence）。当業者によって理解されるように、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ, internal ribosome entry site）は哺乳動物細胞でのキャップ非依存性タンパク質合成を高レベルで開始する能力を有する非コーディングＲＮＡフラグメントである。ＩＲＥＳ配列は発現構築物又はトランスジェニック構築物（transgenic construct）の単一プロモーターから２つのタンパク質を発現させるために使用される。単一ＲＮＡが産生されるが、ＩＲＥＳの存在によって二次翻訳は同じＲＮＡで開始され得る。記載されたベクターで利用されたとおり、ＩＲＥＳ配列によって細胞株の構築物に対する選択マーカーと共にＺＦＮの発現が許可される。 本発明の方法を実証及び実行するため、細胞株の構築に使用される様々なプラスミドの模式図を示す。（Ａ）pVL18-IRES-DsRed、（Ｂ）pVL18KDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１に表される）、（Ｃ）pTNFKDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１に表される）、（Ｄ）pTNF-TEV、及び（Ｅ）pTAX-IRES-DsRed。BamHI：制限酵素；ｃ−Ｍｙｃ：ｃ−Ｍｙｃタグ；DsRed：赤色蛍光タンパク質；EcoRI：制限酵素；ＨＡ：ヘマグルチニンタグ（hemagglutinin tag）；Ｔａｘ：ＨＴＬＶ−Ｉのトランス活性化因子；His6（配列番号４８）：ヒスチジンタグ；HpaI：制限酵素；ｈＴＮＦ−α：ヒト腫瘍壊死因子α（human tumor necrosis factor alpha）；ＰＤＧＦＲ ｔｍｄ：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ, platelet derived growth factor receptor）の膜貫通領域；ｈＵｂｃ：ヒトユビキチンＣプロモーター；ＩｇＧκ鎖リーダー：マウスＩｇ−κ鎖リーダー配列；ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位；KDEL（配列番号１）：小胞体への保持シグナル；NheI：制限酵素；SfiI：制限酵素；及び、ＴＥＶ：タバコエッチウイルスプロテアーゼ。 本明細書に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ法を用いて多様化させた抗ｈＴＮＦ−α抗体ライブラリーのフローサイトメトリースクリーニング解析によって決定された、本発明の選択方法の検証結果を示す。（７Ａ）：多様化させていない抗体ライブラリー；（７Ｂ）：多様化させた抗体ライブラリー。細胞集団を産生し、これらはジンクフィンガーのホットスポットの非存在下で抗体を発現させ、多様化を誘導した（７Ａ）。他の細胞集団を産生し、これらはジンクフィンガーのホットスポットを含有するように改変された抗体を発現させ、遺伝的多様化を誘導し、ジンクフィンガータンパク質及びＴａｘも発現させた（７Ｂ）。細胞表面での抗原（ｈＴＮＦ−α）の発現を減少させる本発明の方法によって選択された細胞を、フローサイトメトリーによって選別することを数回行った後、標的分子に結合し細胞表面でのｈＴＮＦ−αの発現が減少している抗体及びそのクローン集団を単離した。 本発明の選択方法由来の抗体フラグメントをpT7発現ベクター（Sigma-Aldrich社 St. Louis, MO）にクローニングして、発現させ、ＥＬＩＳＡによるｈＴＮＦ−αとの結合をアッセイし、そのＥＬＩＳＡアッセイ（「Ａｂ−ＫＤＥＬ」（配列番号１）の結果を示す。選択された抗体／クローンはオートインダクション培地で育てた。１６時間後、細胞を溶解し、上澄みをＥＬＩＳＡでの発現及び結合アッセイに使用した（２００ｎｇのｈＴＮＦ−αを使用）。ＢＬ２１：抗体をコードするＤＮＡを含むベクターによる形質転換に使用された細菌（陰性対照として使用）；ｈＦ６３：ＨＩＶ−１ｇｐ４１抗原に対するファージディスプレイを介して選択された単一ドメイン抗体ＶＬ（無関係対照として使用）；ＶＬ１８、ｈＴＮＦ−αに対する単一ドメイン抗体ＶＬ；ＶＨＨ：ｈＴＮＦ−αに対するラクダ単一ドメイン抗体（Ablynx社）；♯１−１４ＶＬ１８成熟：形質転換させた細胞でのＶＬ１８抗体成熟後に選ばれたクローン；♯１−１４ｈＦ６３成熟：形質転換させた細胞でのｈＦ６３抗体成熟後に選択されたクローン。結果は、本発明による多様化方法で産生されたｈＴＮＦ−α（ＶＬ１８）と結合する軽鎖抗体フラグメント（ＶＬ）の成熟を示す。ｈＴＮＦ−αと結合しない無関係抗体（Ｆ６３）は並列して行われたアッセイでの対照として用いられた。グラフに示すように、いくつかのＶＬ１８由来のモノクローナルＶＬ抗体はｈＴＮＦ−αと強く結合し、抗体の成熟が示唆される。同様に、Ｆ６３由来の抗体でも強い結合が見られ、これらの抗体は異なる抗原を認識するように進化したと示唆される。 本明細書の実施例６に記載のとおり、多様化させた抗体を細胞表面に発現させ、検出可能に標識及び精製した抗体への結合をアッセイした実験の結果を示す。共発現させたｔａｘタンパク質（Ｔａｘ）及び末端転移酵素（ＴｄＴ）タンパク質が存在／非存在の２９３Ｔ細胞で発現させた抗体を産生した。図９Ａ（ＶＨＨ抗ＩｇＧ（ＺＦＮ））は、ＺＦ認識部位が導入され、２９３Ｔ細胞表面に発現させ、ＩｇＧ抗原と特異的に結合するものとして同定された単一ＶＨＨ抗体のクローンを示す。図９Ａの２９３Ｔ細胞はＶＨＨ抗体をコードする核酸構築物及びＺＦヌクレアーゼをトランスフェクトされ、Ｔａｘ及び末端転移酵素（ＴｄＴ）タンパク質は発現していない。図９Ｂ（ＶＨＨ抗ＩｇＧ（ＺＦＮ＋Ｔａｘ／ＴｄＴ））は、ＺＦ認識部位が導入され、２９３Ｔ細胞表面に発現させ、ＩｇＧ抗原と特異的に結合するものとして同定された単一ＶＨＨ抗体のクローンを示す。図９Ｂの２９３Ｔ細胞はＶＨＨ抗体をコードする核酸構築物及びＺＦヌクレアーゼをトランスフェクトされ、Ｔａｘ及び末端転移酵素（ＴｄＴ）タンパク質も共発現していた。 図１０ＡはＨＴＬＶ−１（GenBank：ＡＢ０３８２３９．１）のＴａｘ遺伝子の核酸配列（配列番号４６）を示す図である。図１０Ｂはヒト（Homo sapiens）末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ, terminal deoxynucleotidyltransferase）（GenBank：ＡＢ０４６３７８．１）の核酸配列（ｍＲＮＡ）（配列番号４７）を示す図である。
本明細書において、細胞内で、標的分子、好ましくはタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを特異的に認識及び結合する結合性分子、例えば抗体又はその結合性部分を選択するためのプラットフォーム技術及び方法が記載される。本方法は、（ｉ）結合性分子、（ii）本発明の態様において、細胞表面に発現可能な受容体タンパク質−同族リガンド結合対の同族リガンドメンバーであり得る、その標的、及び（iii）同族リガンドが相互作用する、細胞表面に発現可能な受容体タンパク質の、細胞における共発現を伴う。同族リガンドは、細胞内オルガネラ保持シグナル（例えば、小胞体（ＥＲ）保持シグナル）に融合し得、その結果、同族リガンドが細胞において受容体タンパク質と結合及び相互作用すると、リガンドが保持シグナルを有することに起因して、その両方が細胞オルガネラにおいて保持及び局在化される。結合性分子が同一細胞内でその標的として存在することによって、同族リガンドは、結合性分子が細胞内でその標的を結合し、それによって同族リガンド標的とその受容体タンパク質との間の典型的な結合相互作用を妨害、中和、又はブロックすることを可能にする。結合性分子によるリガンド結合対間の相互作用のこの妨害によって、受容体タンパク質がオルガネラから排出され、細胞表面に移動し、そして細胞表面で発現する一方で、同族リガンドが細胞オルガネラにおいて保持されることが可能になる。細胞表面で提示された受容体タンパク質は、特異的な検出可能物質及び検出方法によって検出可能であり、細胞内での結合性分子の存在を示す。結合性分子の、その標的（リガンド結合対の同族リガンドメンバー）への結合活性によって、受容体タンパク質は、同族リガンドとのその結合相互作用、並びに細胞表面でのその発現及び検出から解放される。結合性分子は、それが本発明の方法によって選択された場所である細胞から単離され得る。本発明の技術及び方法についての変型は、本明細書においてさらに記載される。
本発明の技術及び方法は、（ｉ）組換え技術及び増幅技術に起因する望ましくない変動を低減させるため、（ii）抗体などの結合性分子の親和性及び発現の成熟を組み合わせるため、（iii）細胞における固有の位置での標的タンパク質についての結合性分子又は抗体の選択を促進するため、並びに（iv）ハイスループットスクリーニング又は選択方法を用いて前述の特徴を組み込むために有用及び有利である。したがって、本発明は、抗体などの結合性分子の効果的な選択、発現、及び成熟の態様と、結合と標的分子との両方が位置決定され発現する細胞環境における標的タンパク質又は抗原へのそれらの結合とを組み合わせる、新規なプラットフォーム技術及び方法を包含する。
１つの実施形態において、結合性分子は、本明細書において記載される標的分子又は抗原を特異的に結合する、抗体又はその結合性断片若しくは部分である。１つの実施形態において、結合性分子は、抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメイン部分である。１つの実施形態において、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、又は抗体、又はその結合性断片若しくは部分は、本明細書において記載されるように遺伝的に多様化されている。１つの実施形態において、結合性分子のライブラリーが、本発明の方法に従って標的分子又は抗原を特異的に結合するメンバー分子を選択又はスクリーニングするために用いられる。１つの実施形態において、構築されたか又は他の方法で得られた抗体ライブラリーが、標的分子又は抗原を特異的に結合する抗体を選択又はスクリーニングするために用いられる。１つの実施形態において、抗体又はその結合性部分は、本明細書において記載される方法によって遺伝的に多様化され、本明細書において記載される細胞選択方法を利用して標的抗原への結合について選択又はスクリーニングされる。
１つの実施形態において、標的分子は、リガンド結合性分子、例えばリガンド結合性受容体タンパク質、すなわち細胞表面で発現する「受容体タンパク質」である。１つの実施形態において、受容体タンパク質は、特異的抗体によって認識及び結合され得る細胞外ドメインを含む、膜貫通受容体タンパク質である。１つの実施形態において、標的分子は、タンパク質又は抗原、例えばリガンド結合性分子と結合及び相互作用する同族リガンド、例えばリガンド結合性受容体タンパク質である。同族リガンドは、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである。１つの実施形態において、同族リガンド又はリガンド結合性タンパク質は、細胞の原形質膜において発現し得るか、又は、発現するように分子的に改変され得る。
細胞膜におけるリガンド結合性分子、又は受容体タンパク質、又は同族リガンドの発現は、リガンド結合性分子又は同族リガンドが適切な検出アッセイにおいて抗体などの検出可能な分子によって認識及び特異的に結合される能力に関連する。したがって、リガンド結合性分子又は同族リガンドの結合可能な部分は細胞外環境に晒されており、その結果、それ（及びその関連するエピトープ）は、検出可能な分子又は抗体によって特異的に認識及び結合され得る。１つの実施形態において、検出可能な分子又は抗体、例えば「一次」抗体は、従来の方法によって検出、測定、又は定量され得る検出可能な標識で直接的に標識され得る。１つの実施形態において、検出可能な分子又は抗体は、直接的に標識されないが、その代わりに、検出可能に標識され、検出、測定、又は定量され得る二次結合性分子又は二次抗体によって、特異的に結合される。検出可能な二次結合性分子又は二次抗体は、一次抗体の間接的な標識として働き、これは、フローサイトメトリー検出方法などにおいて、より高い又はより最適なシグナルをもたらし得る。
本明細書において用いられる場合、「結合性分子」は、標的分子又は抗原に結合する分子、又はその結合性断片若しくは部分を指す。結合性分子は、好ましくは、標的分子又は抗原を認識及び結合し得るタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである。標的分子又は抗原は、好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドである。結合性分子は、抗体若しくは免疫グロブリン、又はその結合性断片若しくは機能的断片若しくは部分であり得る。抗体又は免疫グロブリンの機能的断片又は部分は、標的分子に特異的に結合するＶＬ及び／又はＶＨドメインなどの、その結合性断片又は部分を包含する。結合性分子はまた、非抗体分子又はその機能的断片若しくは部分であり得る。
結合性分子又は抗体によって結合される標的分子又は抗原は、同族リガンド又はリガンドタンパク質を典型的に結合する、リガンド結合性タンパク質（又はリガンド結合性受容体タンパク質）、ポリペプチド、又はペプチド、例えば受容体タンパク質、例えば、細胞表面に発現した受容体タンパク質であり得る。「同族リガンド」又は「リガンドタンパク質」は、リガンド結合性タンパク質が典型的に相互作用及び／又は結合する相手である、リガンド／タンパク質／ペプチドなどを指す。同族リガンドは、修飾、誘導体化、又は他の配列又はドメインに融合され得るが、これは依然として、そのリガンド結合性タンパク質又は受容体タンパク質と相互作用し得る。或いは、結合性分子又は抗体によって結合される標的分子又は抗原は、そのリガンド結合性タンパク質と相互作用して、及び／又はその結合性タンパク質に結合して、本明細書において「結合対」とも呼ばれる相互作用リガンド結合性タンパク質／同族リガンド対を形成する、同族リガンドであり得る。リガンド結合性受容体タンパク質の非限定的な例は、ヒトＴＮＦ−α受容体１（ｈＴＮＦ−α受容体１）であるが、その同族リガンドの非限定的な例は、ヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）である。実例として、ヒトＴＮＦ−α受容体１は、ヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）と相互作用及び結合し、それらは共に結合対を形成し、その際、各タンパク質は結合対のメンバーである。本願の全体を通して、ヒトＴＮＦ−α受容体１（ｈＴＮＦ−α受容体１）は、同族リガンドの非限定的な例であるヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）と相互作用及び結合するリガンド結合性受容体タンパク質の非限定的な例であることが理解されよう。したがって、例えば本明細書の実施例において説明されるような、このようなリガンド結合性タンパク質−同族リガンド対を用いる本発明の選択及び多様化方法の検証は、決して、本発明の様々な実施形態を限定することを意図したものではない。
用語「抗体」には、ジスルフィド結合によって連結されている４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を有する無傷の免疫グロブリンが含まれる。用語「抗体」は、用語「免疫グロブリン」と同義であり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体、及び、特定の標的、タンパク質、又は抗原に結合する機能性を有する分子を包含する。用語「抗体」はまた、抗体断片又はその部分を包含し、実例としては、限定はしないが、断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、及びドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれる。「抗体」はまた、抗体によって特異的にターゲティング、認識、及び結合される抗原又は標的分子上のエピトープと典型的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域を含む、抗体のＨ及びＬ鎖の可変（Ｖ）領域、すなわち、それぞれＶＨ及びＶＬを包含する。好ましくは、抗体並びにその断片及び部分は、それらが本発明の態様に従って標的抗原又は標的タンパク質、例えばリガンド結合性タンパク質又は同族リガンドタンパク質をターゲティング及び特異的に結合するという点で、機能的断片及び部分である。抗体は、あらゆる種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタなどに由来し得るか、又はそれから誘導可能である。１つの実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。１つの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。さらに、抗体又はその結合性断片若しくは部分は、あらゆるクラス、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＥ、又はそのあらゆるサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４のものであり得る。１つの実施形態において、抗体又はその結合性断片は、ＩｇＧ１抗体である。抗体軽鎖、又はその断片若しくは部分は、カッパ又はラムダタイプのものであり得る。本明細書において用いられる場合、用語抗体は、結合性断片及び／又は機能的断片及びその部分を包含することを意味することが理解されよう。
いくつかの実施形態において、本方法は、抗体ライブラリー、例えば、免疫グロブリンのクローニングされたライブラリー、又は抗体の機能的断片若しくは部分のライブラリー、例えば、単一ドメイン抗体（ＳＤＡ、single domain antibody）ライブラリー、例えば、ＶＬ領域のライブラリーの使用を包含する。多様化された抗体ライブラリーを含む抗体ライブラリーは、本明細書においてさらに記載されるように、本発明の方法に従って所与の標的タンパク質を結合するための高い又は最適な親和性又は特異性を有する抗体を選択するために特に有用である。本明細書において記載される方法によって遺伝的に多様化されている抗体ライブラリーから誘導又は産生される抗体又はその部分もまた、本発明の方法に従って細胞内での所与の標的抗原／標的タンパク質に対するそれらの結合能力について選択するために有用である。
抗体及び抗原結合抗体断片、並びに、例えば従来の分子技術を用いる、それらの生成方法は、当技術分野において知られており、例えば、Antibody Engineering, Kontermann, R. and Dubel, S. (Eds.), Springer, 2001; Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002; J. D. Pound (Ed.) Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press; 2nd ed., 1998; B. K. C. Lo (Ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; 及びKohler, G. and Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975) [1]においてさらに詳細に記載されている。
他の実施形態において、本発明によって包含される結合性分子には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、その修飾及び誘導体化された形態；抗体模倣体、例えば、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ、designed ankyrin repeat protein）、アフィリン、アフィチン、アビマー、アンチカリン、モノボディ、アフィボディ分子；又は細胞膜と相互作用し、タンパク質を結合するか若しくは結合され得る分子若しくは物質、例えば、ハプトマー、アプタマーなどが含まれる。
１つの実施形態において、組換え技術によって細胞内に導入されており、細胞において発現及び産生され、且つ本明細書において記載されるように標的分子に結合することが実証されている、結合性分子、例えば抗体は、当技術分野における従来の方法を用いて細胞から回収又は単離され得る。例えば、ゲノムＤＮＡが単離され得、特異的断片が、本発明の方法において記載されるように、特定の標的分子を結合する抗体の発現について選択されている細胞から、プライマーオリゴヌクレオチドを用いて増幅される。増幅されたＤＮＡ断片を有するように構築されたプラスミドベクターを用いて、細菌を形質転換することができ、抗体をコードするＤＮＡを含むクローニングされたセグメントを発現するコロニーが、特異的結合特性を有する抗体の発現について結合分析によってアッセイされる。例えば、本明細書における実施例４を参照されたい。抗体は、再クローニングを要することなく、単離された細胞クローンから直接的に発現し得る。さらに、細胞クローンが単離され得、抗体をコードする遺伝子、例えば、ＩｇＧ抗体をコードする遺伝子が、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）によって増幅され得、そして、例えば哺乳動物発現プラスミドにおいて、発現及びその後の精製のためにクローニングされ得る。場合によって、結合性分子、例えば抗体は、治療的使用のために、当業者に知られている方法を用いて、さらに修飾、成長、又は精製され得る。１つの実施形態において、リガンド結合性受容体タンパク質又はリガンドタンパク質に結合する結合性分子、例えば抗体は、さらなる使用のために細胞から同定、回収、又は単離され、また、精製されてもよい。
本発明に従うと、記載された方法によって生成及び／又は選択された抗体は、治療用生物学的作用物質として用いられ得る。例えば、記載された方法を用いて選択された抗体は、既知の又は使用されている抗体と比較して向上した、さらに望ましい、及び／又は最適な構造的及び機能的特性を実証し得る。本発明の遺伝的多様化及び選択方法を介して、そのいずれかが、治療を必要とするヒト患者などの対象における疾患、病理、又は状態に関連し得る、細胞受容体タンパク質又はその同族リガンドへの、向上した、望ましい、及び／又は最適な結合を示し得る結合性分子が提供される。このような結合性分子、例えば抗体は、治療物質として用いられると、リガンドの、その細胞表面に発現した受容体への結合をブロック、阻害、又は妨害し得、細胞の形質転換、制御されていない細胞増殖、又は癌をもたらす細胞内シグナル伝達事象の活性化を防ぐ。結合性分子が抗体である場合、抗体は、細胞表面リガンド結合性受容体タンパク質に対するものであり得、結合及び／又は機能的特性の増強を示し得る。結合性分子としての抗体は、或いは、リガンド結合性タンパク質に対するものであり得、結合及び／又は機能的特性の増強を示し得る。
選択された抗体がヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）受容体に対するものである典型的な実施形態において、このような抗体は、例えば、対象、好ましくはヒト対象における、ｈＴＮＦ−α発現、例えば異常な発現又は過剰発現に関連する、疾患又は状態を治療するための、ｈＴＮＦ−αの、その受容体への結合のブロック又は拮抗において用いられ得るが、他の非ヒト種の治療が、本明細書において記載される方法の結合性分子産物について包含される。同様に、ｈＴＮＦ−α受容体のｈＴＮＦ−αリガンドに対する抗体もまた、リガンドの、その受容体への結合をブロックし、それによって、受容体−リガンド相互作用に拮抗し、ｈＴＮＦ−αに関連する疾患又は状態を治療するために役立ち得る。例えば、ヒトＴＮＦ（ＴＮＦ−αなど）結合性分子又はアンタゴニスト、例えば抗体及び融合タンパク質は、いくつかの免疫介在性の、例えば、自己免疫、炎症性疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ、rheumatoid arthritis）、若年性リウマチ及び乾癬性関節炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎、並びに炎症性腸疾患（ＩＢＤ、inflammatory bowel disease）の治療において有用である。本発明にはまた、本明細書において記載される細胞的方法によって選択、又は多様化及び選択される抗体などの結合性分子が包含され、ここで、結合性分子又は抗体は、細胞表面で発現する他のタイプの受容体、又はそれらの同族リガンドを結合する。リガンド結合性受容体タンパク質又は同族リガンドに結合することによって、このような抗体は、受容体−リガンド相互作用をブロック、妨害、阻害、又は排除し得る。
本方法の実施形態に含まれる抗体、結合性分子、又は結合性タンパク質は、検出可能な標識を含み得るか、又は検出可能な標識を用いて検出可能であり得る。検出可能な標識はまた、例えば、検出可能に標識された抗体（又はレポーター分子）が細胞表面に発現したタンパク質を結合するために用いられるフローサイトメトリー方法による、結合性分子又は抗体を含む細胞内に発現したタンパク質の存在の検出及び確認のために、記載された方法の様々な態様及び実施形態において用いられ得る。検出可能な標識の実例には、限定はしないが、蛍光標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、fluorescein isothiocyanate）、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、green fluorescent protein）、ＤｓＲｅｄ；放射性標識、例えば、１３Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ；化学発光標識、例えば、ルミノール；酵素標識、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ；ＦＲＥＴ標識、例えば、検出可能な標識が、所与の基質内に組み込まれたＦＲＥＴ受容体とＦＲＥＴを介して相互作用するＦＲＥＴドナーである、ユーロピウム；ビオチン又はストレプトアビジンが分子の結合対の一方の又は他方のメンバー上に存在する、ビオチン及びストレプトアビジンのその後の結合についてのビオチン標識及びストレプトアビジン標識が含まれる。酵素が標識物質として用いられる場合、検出は、用いられる酵素に応じて適切な基質を用いて行われる。例えば、ペルオキシダーゼが酵素標識として用いられる場合、基質ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ、o-phenylenediamine）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、tetramethyl benzidine）などが用いられる。アルカリホスファターゼが酵素標識として用いられる場合、基質ｐ−ニトロフェニルリン酸塩（ＰＮＰＰ、p-nitrophenyl phosphate）などが用いられる。
１つの実施形態において、蛍光標識が用いられ、フローサイトメトリー方法によって検出可能及び定量可能である。別の実施形態において、細胞表面に発現した標的分子又はタンパク質に対する抗体は、蛍光標識で検出可能に標識され、細胞表面に発現した標的分子又はタンパク質への抗体の結合又は非結合が決定され、それによって、次いで、細胞表面の標的分子又はタンパク質のレベルの検出及び定量が可能になる。別の実施形態において、細胞表面に発現した標的分子に結合する抗体に特異的に結合する、標識された二次抗体が用いられる。
本明細書において言及されるリガンド結合性タンパク質又は受容体タンパク質の例には、限定はしないが、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、代謝酵素受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、腫瘍抑制因子抗原受容体（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｋ−Ｒｅｖ、ＤＣＣ受容体）、多剤耐性タンパク質受容体、凝固因子受容体（例えば、第VII因子、第VIII因子、第IX因子受容体）、栄養因子受容体、細胞認識又は刺激分子受容体、アポリポタンパク質受容体などが含まれる。特定の結合性タンパク質又は受容体には、限定はしないが、受容体ファミリーの受容体、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ（α）、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィン受容体、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、ＴＯＬＬ様受容体；ホルモン受容体、例えば、ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体；ペプチド受容体、例えば、アミリン、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンの受容体；又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体が含まれる。同様に、ウイルスタンパク質及びペプチドと結合及び／又は相互作用する細胞表面分子も含まれる。前述のものは網羅的な列挙というわけではなく、本発明において利用され得る他の受容体は、当業者によって有用であると理解されよう。リガンド結合性分子又は受容体タンパク質は、好ましくは細胞表面で発現し、膜受容体又は膜貫通受容体であり得る。リガンド結合性タンパク質は、修飾されていても、翻訳後修飾されていても、又は翻訳後修飾されていなくても、グリコシル化されていても、又はグリコシル化されていなくてもよい。１つの実施形態において、本明細書において記載される結合性分子又は抗体は、リガンド結合性タンパク質又は受容体タンパク質を特異的に認識及び結合する。本明細書に包含されるものは、結合性分子、受容体タンパク質、又はその断片若しくは部分をコードする核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）及び遺伝子である。
リガンド結合性タンパク質又は受容体タンパク質によって認識及び結合される、好ましくは特異的に認識及び結合される同族リガンド（リガンドタンパク質又は抗原）の例には、限定はしないが、上記に列挙した典型的な受容体それぞれの、同族リガンドパートナーが含まれる。例えば、リガンド、例えば、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、脂質移入タンパク質、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍関連抗原、腫瘍抑制因子抗原（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｋ−Ｒｅｖ、ＤＣＣ）、多剤耐性タンパク質、凝固因子（例えば、第VII因子、第VIII因子、第IX因子）、細胞認識分子、細胞刺激分子など。さらに具体的には、リガンドタンパク質（又はペプチド）の非限定的な例には、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、ＮＧＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、insulin-like growth factor）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンが含まれる。このような同族リガンドは、可溶性又は膜結合型であり得る。リガンドタンパク質は、修飾されていても、翻訳後修飾されていても、又は翻訳後修飾されていなくても、グリコシル化されていても、又はグリコシル化されていなくてもよい。１つの実施形態において、本明細書において記載される結合性分子又は抗体は、同族リガンド（タンパク質）を特異的に認識及び結合する。典型的な実施形態において、リガンドタンパク質は、ヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）である。同様に、細胞表面分子と結合及び／又は相互作用するウイルスタンパク質及びペプチドもまた含まれる。本明細書に包含されるものは、同族リガンド、リガンドタンパク質、又は抗原、又はその断片若しくは部分をコードする核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）及び遺伝子である。
抗体、リガンド結合性タンパク質、受容体、リガンドタンパク質、又は本発明に従ったあらゆる標的タンパク質などの結合性分子をコードする単離された核酸（遺伝子）は、特に細胞におけるその後の発現のために、当業者に知られている方法を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトする、形質導入する、又は感染させるために用いられる、適切なベクター内に挿入され得ることが理解されよう。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、deoxyribonucleic acid）又はリボ核酸（ＲＮＡ、ribonucleic acid）であり得、天然配列、及び合成又は人工由来の配列を含み得る。適切な核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列、合成若しくは人工配列、又は半合成若しくは半人工配列が含まれ得る。核酸配列は、真核生物又は哺乳動物のものであり得、ヒト由来又は非ヒト由来のもの、例えば動物又は植物のものであり得る。いくつかのケースにおいて、核酸配列は、細菌、ウイルス、酵母などのものであり得る。
標的タンパク質又は結合性分子又は抗体をコードするこのような核酸は、当業者によって実施される従来から既知の技術及び方法によって得られ得る。実例として、目的のタンパク質をコードする核酸配列は、化学合成によって核酸／配列ライブラリー若しくは遺伝子バンクをスクリーニングすることによって、又は、核酸／配列ライブラリー、クローニングされた核酸（ＤＮＡ）、若しくは遺伝子バンクをスクリーニングすることによって得られた配列の化学的若しくは酵素的修飾を含む方法の組み合わせによって、得られ得る。リガンド結合性分子（細胞−膜会合型）、リガンド、及び免疫グロブリンを含む、膨大な数の目的のタンパク質をコードする核酸配列と、コードされたタンパク質配列とは、ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov）を介してアクセス可能な、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを介して、並びにGenBank、RefSeq、又はUniProtKB/Swiss-Protなどのヌクレオチド及びタンパク質データベースを介して、実施者が入手可能である。さらに、完全長免疫グロブリンライブラリー、例えばヒトＩｇＧ、及び免疫グロブリンドメインライブラリーは、当業者に市販されている。
適切なベクターには、宿主細胞としての哺乳動物細胞又は真核細胞において発現可能な発現ベクターが含まれる。このようなベクターは、適切な発現、細胞プロセシング、及びタンパク質結合対のメンバー（例えば、リガンド結合性分子及びその同族リガンド）の産生を可能にする。通常、発現ベクターは、適切な宿主における挿入された核酸の転写を発現及び制御することを可能にし得る適切な制御配列に作動可能に連結している、発現される核酸配列を含む、あらゆるＤＮＡクローニングベクター組換え構築物を包含する。このようなベクター又はプラスミドは、例えば大腸菌、Ｓｆ９（バキュロウイルスについて）、酵母、及び哺乳動物細胞宿主を含む様々な宿主生物において所望の配列を産生する構築物発現ベクターに、容易に修飾され得る。
ベクターはまた、構築物を自律的に複製する組換えＤＮＡクローニングベクターに関連し、これには、限定はしないが、１又は２以上のさらなる核酸が付加されているＤＮＡ分子を含むプラスミド、ファージ、及びウイルスが含まれ得る。
ベクターの非限定的な例には、ウイルスベクター（例えば、細胞に感染させるか又は形質導入するための、レンチウイルス、ＨＩＶ−１の修飾型形態、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター）、ファージ粒子、プラスミドベクター、真核生物発現ベクター、原核生物ベクターが含まれ、ここで、目的のタンパク質をコードする異種配列を含む核酸は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれても組み込まれなくてもよい。ベクター内で、細胞において発現及び産生される核酸配列又は遺伝子は、発現、例えば、宿主細胞における核酸配列又は遺伝子の転写及び翻訳を可能にする様式で、制御配列に作動可能に連結している。制御配列は、当業者に知られており、目的のタンパク質、例えば、リガンド結合性タンパク質若しくは受容体、リガンドタンパク質、又は結合性分子、例えば本発明に従った抗体をコードする核酸を発現するように、及び転写を制御するように、選択される。このような制御配列には、限定はしないが、ポリアデニル化シグナル、プロモーター（天然又は合成プロモーター）、例えば遺伝子プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＬＰ、Ｅ１Ａなど、又は転写をもたらすためのエンハンサー、転写を制御するための最適なオペレーター配列、組織特異的転写を可能にする遺伝子座制御領域又はサイレンサー、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ｍＲＮＡを安定化させるための配列、転写及び翻訳の終結を制御する配列が含まれる。
当業者には理解されるであろうが、検出可能な又は選択可能なバイオマーカー配列、タグ配列、選択可能マーカー配列、例えば、抗生物質耐性配列など、又は細胞シグナル配列（例えば、目的の遺伝子の上流に位置する、また、宿主細胞の分泌経路内に合成された遺伝子産物に対する、遺伝子産物に天然の、又は人工のもの）などの、他の配列が、ベクターにおいて発現される核酸又は遺伝子に含まれ得るか、又は作動可能に連結している。さらに、発現したタンパク質は、活性化配列、調節配列、オルガネラ保持シグナル配列などを含めることによって、さらに修飾され得る。
本明細書において記載される技術及び方法は、本方法の構成要素の発現、活性、及び機能のための、哺乳動物又は真核細胞発現系、及び哺乳動物又は真核生物宿主細胞又は細胞株に適用可能である。選択された又は所望のリガンド結合性タンパク質、又は受容体、又はリガンド、又は標的タンパク質を細胞表面で発現させる能力を有する細胞株を用いることは、当業者に自明であろう。本明細書において記載されるように、所与のリガンドタンパク質は、細胞膜内及び／又は細胞表面で発現するように改変され得る。真核生物発現系は、特定の宿主細胞における使用に限定されない。様々な真核生物宿主細胞が、例えば、バージニア州、マナッサスにあるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）などの受託機関から入手可能であり、様々なベクターと共に用いられ得る。宿主細胞の選択は、用いられる発現ベクターの特徴に関連し、当業者に知られていよう。本発明の方法における使用に適した真核細胞又は哺乳動物細胞及び細胞株の非限定的な例には、Ｔ細胞株、例えば、本明細書において記載されるＪｕｒｋａｔ細胞及びＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞；ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂリンパ球系、Ｔリンパ球系などが含まれる。培養された細胞集団又は細胞株は、組織若しくは器官の外植片又は不死化細胞から成長又は確立され得る。１つの実施形態において、細胞株は、ヒト又はヒト由来細胞株である。１つの実施形態において、細胞株は、非ヒト霊長類細胞株又は非ヒト霊長類由来細胞株である。１つの実施形態において、細胞株は、非ヒト種又は非ヒト霊長類種に由来するか、又はそれから誘導される。
組換え技術による、アミノ酸からなるタンパク質配列の発現及び産生は周知であり、従来の及び標準的な方法を用いて当業者によって行われ得る。（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual and later editions, e.g., 1991, 2001 and 2012 (J. Sambrook)を参照されたい）。通常、保持シグナル又はタグなどのさらなる配列を有する、タンパク質又は融合タンパク質の組換え調製は、所望の非変性核酸配列、例えばＤＮＡ配列を選択することによって、又は、ＤＮＡ配列を適切な宿主に形質転換し、非変性若しくは修飾されたＤＮＡ配列を発現させて、所望のタンパク質配列を形成させることによって、非変性ＤＮＡ配列を修飾することによって、行われる。タンパク質を発現させるためのベクターは、あらゆる適切な方法、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、若しくは他の物質を用いるトランスフェクション、微粒子銃、衝撃、リポフェクション、感染、又は形質導入を用いて、宿主細胞内に導入され得る。前述のプロセスの１つによってＤＮＡを宿主細胞に導入するための方法は、例えば、上記のSambrook, J., 1989において見られる。
所望のタンパク質の回収又は単離は、必要であれば細胞を妨害した後に、遠心分離又は濾過によって宿主細胞を培地から分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いて上清からタンパク性成分を沈殿させ、その後、多くのクロマトグラフィー技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は類似の既知の手順を用いて精製することを含む、当技術分野において標準的な方法及び手順を用いて行われ得る。
結合性分子の細胞内選択及びスクリーニングのための方法
本明細書において、細胞内で、結合性分子、又は遺伝的に多様化された結合性分子を選択及びスクリーニングするための方法が提供される。細胞内で標的分子と結合又は相互作用する結合性分子は、標的分子に対する最適な結合特性及び／又は活性を有し得る。本方法には、細胞内オルガネラ又は細胞における区画内で標的分子に特異的に結合する結合性分子のその後の選択を可能にする、結合性分子及び標的分子の細胞内局在化及び保持が包含される。適切な結合性分子の好ましいが非限定的な例は、抗体又はその結合性断片若しくは部分、抗体ドメイン、例えばＶＬ及びＶＨ、並びにそのライブラリーである。
本発明の実施形態において、標的分子に対する特異的結合活性を有する、抗体、又は遺伝的に多様化された抗体集団のメンバー、又はその結合性断片若しくは部分は、その標的分子を同様に有する細胞環境において効果的に発現し、成熟し、選択され、それによって、１つの細胞内での結合性分子としての抗体とその標的抗原との共発現に基づく、抗体の検出、選択、及び回収のための都合の良い技術を提供する。したがって、本選択方法の利点は、単一細胞のみが、抗原結合性分子、例えば抗体、又は、抗原結合性分子若しくは抗体の多様化されたライブラリー若しくは集団のメンバー、及びその標的抗原を発現するため、並びに、その標的に特異的に及び／又は最適に結合する結合性分子又は抗体を選択するために、必要であるということである。さらに、多様化された抗体集団から抗体を生成及び選択するこのような単一細胞方法は、有利に、リボソーム若しくは核酸ディスプレイ、又はファージ若しくは細胞ディスプレイ系を伴わず、ＡＩＤなどの酵素を有する特定のＢ細胞株の使用を要さず、また、従来の親和性成熟、受容体編集、又は体細胞超変異技術も伴わない。細胞に基づく本発明の方法は、全てが同一の細胞内で発現する所与の標的分子又は抗原との結合及び／又は相互作用の最適な特性を示す抗体又は多様化された抗体を選択するために用いられ得、ここで、その同一細胞は、発現した抗体の結合特性を決定するためにアッセイされ得、所望の抗体を回収するために選択され得る。
分泌経路内のいくつかの区画は、タンパク質を保持し得る。各区画について、特定のアミノ酸配列が、特異的な細胞位置においてタンパク質を保持するために、タンパク質（又は「シグナル配列」）に融合又は結合し得る。実例として、ＥＲにおけるタンパク質の保持のために、ＫＤＥＬ（配列番号１）アミノ酸配列が用いられ得、トランスゴルジネットワークにおけるタンパク質の保持のために、ＹＱＲＬ（配列番号２）アミノ酸配列が用いられ得、ペルオキシソームにおけるタンパク質の保持のために、ＳＫＬアミノ酸配列が用いられ得、細胞の原形質膜におけるタンパク質の保持のために、Ｈ−Ｒａｓ又はＫ−Ｒａｓ ＣＡＡＸ（配列番号３）アミノ酸配列が用いられ得、ミトコンドリアにおけるタンパク質の保持のために、ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫ（配列番号４）アミノ酸配列が用いられ得、そして核におけるタンパク質の保持のために、ＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）アミノ酸配列が用いられ得る。ＥＲとその管構造は、分泌経路を介するタンパク質の正確なチャネリング及びＥＲにあるシャペロンの存在と組み合わされることによって、このオルガネラがタンパク質の保持のための最適な細胞内位置となる。翻訳後修飾された、例えばグリコシル化された、又はグリカンを含有するタンパク質は、このようなタンパク質がＹＱＲＬ（配列番号２）などのゴルジ体保持配列を含む場合、典型的にはゴルジ体において保持され、一方、グリコシル化されていないタンパク質は、このようなタンパク質がＫＤＥＬアミノ酸配列（配列番号１）などのＥＲ保持シグナルを含む場合、典型的にはＥＲにおいて保持されることが理解されよう。
１つの実施形態において、本発明の選択方法に従って選択するための、細胞内で、結合性分子、例えば抗体によって認識及び結合される標的タンパク質を捕捉又は保持するための方法が提供される。関連する実施形態において、リガンド結合性受容体とその同族リガンドとの間の相互作用を中和、遮断、ブロック、妨害、又は排除する１又は２以上の抗体を特異的に選択するための方法が提供され、ここで、リガンド結合性受容体又はリガンドは、抗体によって特異的に認識及び結合される標的タンパク質であり、標的タンパク質は細胞内に保持され、それによって、標的タンパク質を細胞に局在化させ、細胞内での抗体による結合アクセスを可能にする。
１つの実施形態において、結合性分子、例えば抗体又はその結合性部分は、細胞表面で発現可能な受容体タンパク質を特異的にターゲティング及び結合する。１つの実施形態において、結合性分子、例えば抗体又はその結合性部分は、同族リガンドタンパク質を特異的にターゲティング及び結合する。１つの実施形態において、同族リガンドタンパク質は、細胞表面で発現可能となるように分子的に改変されている。本明細書において記載される様々な実施形態において、結合性分子、例えば抗体、又は標的タンパク質のいずれかは、シスゴルジ体からの逆行輸送を誘発することによって、タンパク質が正常な分泌経路に従うことを防ぎ、それによってタンパク質をオルガネラにおいて効果的に保持する、カルボキシ末端配列ＫＤＥＬ（配列番号１）であるＥＲ保持シグナルを含む。結合性分子、例えば抗体、又は標的タンパク質はまた、それらを発現するように改変すること、又はそれらを他のシグナル配列、例えば、ゴルジ体における保持のためのＹＱＲＬ（配列番号２）配列、ペルオキシソームにおける保持のためのＳＫＬ配列、若しくは原形質膜における保持のためのＣＡＡＸ（配列番号３）配列に分子的に融合することによって、他の細胞内オルガネラ又は区画において保持され得る。
受容体陰性細胞表現型に基づく選択方法
本発明の１つの実施形態は、細胞の受容体陰性表現型を生じる、本発明の選択方法に関する。かかる実施形態において、細胞株は、ＥＲにおいて同族リガンドタンパク質を保持するためのＫＤＥＬ保持シグナル配列（配列番号１）に融合している、細胞表面に発現した受容体タンパク質とその同族リガンドタンパク質の両方を発現させるように分子的に改変される。同族リガンドタンパク質は発現され、ＥＲにおいてＫＤＥＬ配列（配列番号１）によって保持される。ＥＲ内で、同族リガンドタンパク質は、その発現された受容体タンパク質と相互作用する。同族リガンドタンパク質はＥＲにおいて保持されたので、受容体タンパク質も、ＥＲに保持された同族リガンドとのその相互作用を通じて、細胞においてＥＲ内に結果として保持される。従って、受容体タンパク質は、保持シグナルを典型的に欠いているようには、ＥＲから輸送されず、細胞表面で発現されず、又は提示されない。細胞オルガネラにおいて保持されているので、受容体タンパク質は、検出可能に標識された、受容体タンパク質に特異的な分子により検出可能ではなく、それによって、細胞の受容体陰性表現型を生じる。同族リガンドに結合し、ＥＲにおいて保持されたリガンド結合性受容体タンパク質を含有する細胞の受容体陰性表現型は、検出可能な、細胞表面リガンド結合性受容体タンパク質に対する抗体を利用したフローサイトメトリーにより、評価され得る。この態様は、図１Ａ及び１Ｂにおいて図式で描写される通り、リガンド結合性受容体、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉとその同族リガンド、ｈＴＮＦ−αの相互作用を通じて、有利に視覚化され、例示され得る。
本明細書に例示される通り、Jurkat細胞株は、細胞の表面に提示される代表的な受容体タンパク質、すなわち、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉを発現する。本明細書において実施例１に記載される通り、ＪＬＴＲＧ Ｒ５細胞はｈＴＮＦ−α受容体Ｉを発現し、本発明に従い、ある種のタンパク質を細胞内で発現し、保持するように容易に形質導入され得る。例えば、ＪＬＴＲＧ Ｒ５細胞株は、ＫＤＥＬ配列（配列番号１）に融合しているリガンドタンパク質ｈＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α−ＫＤＥＬ（配列番号１））を発現するように形質導入され得る。ｈＴＮＦ−α−ＫＤＥＬ融合タンパク質（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として開示される）は、そのｈＴＮＦ−α受容体Ｉタンパク質結合パートナーに細胞内で結合し、両方のタンパク質が、ＥＲにおいて保持される。リガンドタンパク質の存在及び発現は、例えば、細胞の内側で検出可能な標識、例えば、ＤｓＲｅｄの発現により、さらに効率的に検出され得る。ＥＲにおいてまた保持された受容体タンパク質は、その同族リガンドへの結合を介したＥＲにおけるその保持に起因して、フローサイトメトリー及び標識された抗ｈＴＮＦ−α受容体Ｉ抗体を用いて細胞の表面で検出されず（図１Ａ及び１Ｂ）、それによって、受容体陰性選択細胞表現型を生じる。
受容体陽性細胞表現型に基づく選択方法
本発明の別の実施形態は、細胞の受容体陽性表現型を生じる、選択方法に関する。この実施形態は、標的抗原／タンパク質を特異的に結合する結合性分子の選択に関する。この実施形態により結合性分子を選択するために、結合性分子をコードする核酸が、細胞株、例えば、上述の、細胞表面に発現した受容体タンパク質を発現する細胞株に導入される。実施形態において、細胞は、標的抗原を認識し、これに結合する結合性分子、すなわち、特異的抗体、又はその結合性部分、例えば、ＶＬドメインを含むレンチウイルス粒子で形質導入される。実施形態において、粒子は、細胞に、複数の結合性分子、例えば、遺伝的に多様化した結合性分子又は抗体のうち１つを導入し、そして結合性分子の１又は２以上は、最適な結合特性を有し、標的抗原／タンパク質に対して高い特異性又は親和性で結合し、これについて選択されるように遺伝的に修飾されていてもよい。結合性分子又は抗体の標的抗原は、細胞表面に発現した受容体タンパク質、又はＥＲにおける保持のためのＥＲ保持配列に融合しているこの受容体タンパク質のリガンドのいずれかであり得る。細胞のＥＲにおいて、受容体タンパク質又はリガンドタンパク質標的のいずれかに結合する際、発現された抗体が、受容体タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用をブロック及び妨害する。
ＥＲにおける結合性分子又は抗体の存在及び結合に起因した受容体タンパク質のその同族リガンドへの結合のブロックは、受容体タンパク質のＥＲからの通過及び放出を生じ、細胞の表面でのその発現を可能にする。得られた受容体陽性細胞表現型は、検出可能な、細胞の表面で発現された細胞表面リガンド結合性受容体タンパク質に対する抗体を利用したフローサイトメトリーにより、評価され得る。細胞は、細胞をフローサイトメトリーを介して選択し、選別するのに有用である検出可能な標識、例えば、ＤｓＲｅｄを含有するようにさらに改変されてもよい。この態様は、図１Ｃ及び１Ｄにおいて図式で描写される。受容体陽性細胞表現型は、定量可能なレベルの細胞表面の受容体タンパク質を、検出可能に標識された抗体によりそれが結合されることによって測定することにより、決定される。結合性分子、例えば、抗体は、細胞から回収され得るか、又は単離され得、場合によっては、標準的な技術及び方法を使用することにより、使用のためにさらに精製されてもよい。例えば、蛍光検出及び平均蛍光強度に基づき、抗受容体抗体及び／又は細胞染色により結合について陽性であるとして選別された細胞が、播種され、成長が増殖され得る。かかる細胞は、標的抗原に結合した結合性分子又は抗体を有する。ＤＮＡは増殖された細胞集団から抽出され得、結合性分子又は抗体が、当業者により実施される従来の方法を用いて、単離され、さらに特徴付けられ得る。
代表的な例示される標的抗原を用いて図１Ｃ及び１Ｄにおいて具体的に示される通り、ＪＬＴＲＧ Ｒ５細胞株は、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉを標的とし、結合する抗体のＶＬドメイン（又は領域）をコードするレンチウイルス粒子で形質導入される。形質導入されたＶＬ抗体ドメインの１又は２以上の結合は、リガンド結合性受容体とその同族リガンドの間の相互作用をブロック又は妨害し、それによって、受容体をＥＲから放出し、細胞の表面でのその発現を可能にする。図１Ｃにおいて、ＶＬ抗体、すなわち、ＶＬ結合ドメインは、ｈＴＮＦ−α−ＫＤＥＬリガンド融合タンパク質（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として開示される）のｈＴＮＦ−αリガンドタンパク質部分に結合し、それによって、ＥＲにおいてｈＴＮＦ−αのｈＴＮＦ−α受容体Ｉの相互作用をブロックし、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉタンパク質が、細胞表面に輸送され、ここで発現されることを可能にすることが示されている。図１Ｄにおいて、ＶＬ抗体は、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉタンパク質に結合し、それによって、ＥＲにおいてｈＴＮＦ−αのｈＴＮＦ−α受容体Ｉの相互作用をブロックし、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉタンパク質が、細胞表面に輸送され、ここで発現されることを可能にすることが示されている。かかる細胞表面で提示された受容体は、検出可能な結合剤、例えば、受容体特異的抗体を用いて検出可能である。抗体、又は結合性分子が、受容体タンパク質にその標的として特異的に結合する場合、受容体タンパク質の、細胞オルガネラにおいて保持されているその同族リガンドへの結合の妨害又は中和に起因して、受容体タンパク質がＥＲを通過し、細胞の形質膜において発現されることを可能にし、抗体、又は結合性分子の受容体タンパク質への結合は、細胞膜において、受容体タンパク質の発現を同時に、最適には、邪魔又はブロックしないことは理解されるであろう。
結合性分子、例えば、抗体、例えば、ＶＬ抗原結合ドメインが、細胞オルガネラにおいて受容体又はリガンドに特異的に結合することにより受容体と同族リガンドの相互作用をブロック、阻害、中和、又は妨害したかを決定するために、細胞は、検出可能に標識された、発現された受容体タンパク質、例えば、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉに指向された抗体に暴露され、フローサイトメトリー（細胞選別機）において選別され得る。典型的には、蛍光検出が用いられる。加えて、細胞はまた、選別を促進するための検出可能な標識、例えば、ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰなどを含有するように構築され得る。実例として、細胞表面でリガンド結合性受容体タンパク質に結合した、標識された抗体のレベルの測定は、特異的な結合性分子、例えば、抗体又はＶＬドメインが、細胞内で、リガンド結合性受容体、又はその同族リガンドのいずれかを結合し、オルガネラ、例えば、ＥＲにおいてリガンド結合性受容体のその同族リガンドへの相互作用を防ぎ、妨害、中和、又はブロックしたことを示す。受容体とリガンドの相互作用のブロックは、受容体がＥＲを出ること、及び受容体が検出可能に標識された特異的結合性分子により検出され得る細胞表面に発現されることを可能にする。ＦＡＣＳ及びフローサイトメトリー分析、並びにそのバリエーションを含む、細胞の分析は、ハイスループットアッセイに寄与する。
１つの例示される実施形態において、特異的抗体、又はその結合性断片若しくは部分、細胞表面で発現可能なリガンド結合性受容体タンパク質、及びＥＲ保持シグナルに融合しているその同族リガンドが、同一の細胞において共発現される。３種類のタンパク質がＥＲに存在するとき、この実施形態において、同族リガンドに指向された抗体が、ＥＲにおいて保持された同族リガンドを特異的に標的にし、これに結合する。結果として、ＥＲ内での受容体タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用が、同族リガンドに標的として結合した抗体により、ブロック、中和、又は妨害され、それによって、同族リガンドをＥＲにおける受容体タンパク質とのその相互作用から有効に放出し、受容体タンパク質を自由にし、受容体タンパク質が細胞表面に発現した細胞の細胞膜への、ＥＲからの受容体タンパク質の通過を可能にする。検出可能に標識された、細胞表面に発現した受容体タンパク質に対する抗体は、細胞表面の受容体タンパク質を結合することができ、発現された受容体タンパク質のレベルを定量するのに役立つ。細胞表面で発現された受容体の検出は、細胞において発現された結合性分子、例えば、抗体、又はその結合性断片若しくは部分の存在の指標である。従来の方法を使用して、結合性分子、又は抗体が回収され、単離され、その発現が増幅され得る。従って、特異的結合特性を有する結合性分子が、本発明の方法を通じて選択される。
別の例示される実施形態において、特異的抗体、又はその結合性断片若しくは部分、細胞表面で発現可能なリガンド結合性受容体タンパク質、及びＥＲ保持シグナルに融合しているその同族リガンドは、同一の細胞において共発現される。３種類のタンパク質がＥＲに存在するとき、抗体は、ＥＲにおいて保持された同族リガンドには結合しないが、代わりに、リガンド結合性受容体タンパク質に指向され、これを特異的に標的にする。この場合において、受容体タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用は、抗体結合により、依然ブロック、中和、又は妨害される。この実施形態において、受容体タンパク質は、同様に、ＥＲにおいて保持されたその同族リガンドとのその相互作用から有効に放出される。従って、受容体タンパク質は、ＥＲから通過し、記載される通り検出され得る細胞表面で発現され得る。これらの実施形態のそれぞれについて、検出可能に標識された、細胞表面受容体タンパク質の細胞外で発現される部分に対する抗体が結合し、これを用いて、細胞表面に発現した受容体タンパク質のレベルが定量され得る。次に、選択方法に従い、細胞内で受容体タンパク質又は同族リガンドのいずれかに結合した結合性分子又は抗体をコードする遺伝子が、所望される通り細胞から単離されるか、又は回収され得る。例えば、本明細書における実施例４を参照。例えば、遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応により単離されるか、又は対象の遺伝子を囲む切断部位を認識する適切な制限酵素を用いた切断により、細胞のＤＮＡから単離され得る。加えて、対象の結合性分子又は抗体をコードするＤＮＡが、コードＤＮＡを発現する細胞のプールから回収され得るだけでなく、ＤＮＡを発現する単一クローンがＦＡＣＳ分析により検出され得、コードＤＮＡが単一クローンから抽出され得る。
別の実施形態において、細胞内で特異的標的に結合する抗体を選択する方法が提供される。かかる抗体は、特異的標的への最適な結合を好ましくは示し、高い親和性又は結合特異性を好ましくは有する。方法の代表的な例として、細胞の表面で発現される能力がある所望される標的分子（タンパク質）を発現する細胞株が構築される。この目的のため、細胞株は、標的タンパク質を発現し、産生するように改変され、そして標的タンパク質は、順に、必要に応じて細胞の形質膜で発現されるよう分子的に改変される。例えば、標的タンパク質は、膜貫通型ドメイン及び細胞質ドメイン、並びに形質膜における適切な発現（及び検出）のためのその細胞外ドメインを含有するか、又は含有するよう構築され得る。抗体をコードする核酸配列は、細胞株に、例えば、レンチウイルス粒子による形質導入を介して導入される。従って、細胞は、ＥＲにおける保持のためＫＤＥＬシグナル配列（配列番号１）に融合している、抗体（例えば、ＶＬ結合ドメイン及び／又はＶＨ結合ドメイン）をコードする核酸配列を含有するレンチウイルス粒子で形質導入される。抗体及び標的タンパク質が、ＥＲにおいて発現され、存在するとき、抗体は、その標的分子（タンパク質）に特異的に結合することができる。方法に従い、標的タンパク質は、ＥＲにおいて保持された抗体によりそれが結合されることによって、ＥＲにおいて保持される。結果として、抗体により結合された標的分子（タンパク質）は、ＥＲから通過することができず、細胞の表面での標的分子（タンパク質）の発現レベルは、低減されるか、又は皆無である。従って、細胞表面で発現可能な標的タンパク質の視覚的な検出を生じない。
細胞表面での標的分子（タンパク質）の発現の低減は、陽性対照、例えば、標的分子を表面に発現する細胞と比較して、又は標的分子（タンパク質）を発現するが、ＥＲ保持シグナルを有する、標的分子（タンパク質）特異的抗体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されていない細胞と比較して、決定することができる。対照細胞でのかかる発現される抗体の非存在において、細胞表面で発現可能な標的分子（タンパク質）は、ＥＲにおいて保持されず、形質膜に輸送され、ここで発現され、検出可能に標識された剤により細胞の表面で検出され得る。或いは、無関係のタンパク質又は非特異的タンパク質、例えば、抗体、又はその結合性部分をコードする核酸配列を有するレンチウイルスベクターを並行して用いて、比較の目的で細胞が形質導入され得る対照が含まれていてもよい。本明細書に記載される他の実施形態のものと同様の方法で、表面受容体陽性表現型又は表面受容体陰性表現型が、例えば、フローサイトメトリーを介して、検出可能な、標的分子（タンパク質）に特異的な抗体を使用することにより、検出され得、その後、所望される抗体を発現する細胞が選択され、抗体が回収され得る。
図２Ａ及び２Ｂは、本発明の選択方法の実施形態を実証し、例示する。描写され、例示される通り、細胞株は、膜貫通型ドメインに融合している細胞外ドメイン、及び細胞膜におけるタンパク質の適切な繋留のための代表的な細胞質ドメインであるＴＥＶ配列を有する、代表的な細胞表面に発現した標的タンパク質であるｈＴＮＦ−αを発現するように構築される。図において、発現されたｈＴＮＦ−αは、標識された、ｈＴＮＦ−αに対する抗体を用いて、細胞の表面で検出可能である（図２Ａ）。本明細書において実施例に記載される通り、細胞は、ＥＲにおける抗体保持を生じる、ＫＤＥＬ配列（配列番号１）に融合している抗ｈＴＮＦ−α抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（抗体）−ＫＤＥＬ（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として開示される））を発現するレンチウイルス粒子で形質導入される。ＶＬ抗体が、ＥＲにおいて標的タンパク質に特異的に結合する、及び／又は高い親和性で結合する場合、ｈＴＮＦ−α標的タンパク質に結合した抗体を含む複合体が、ＥＲにおいて保持され、ｈＴＮＦ−α標的タンパク質は、細胞の表面でもはや検出されないか、又は検出可能でない（図２Ｂ）。得られた細胞の表現型、すなわち、細胞表面での標的タンパク質の存在又は非存在は、検出可能に標識された、標的タンパク質に対する抗体を利用したフローサイトメトリーにより、検出される。図２Ａに示される通り、細胞表面に発現したｈＴＮＦ−αタンパク質は、細胞の表面で発現したタンパク質を特異的に認識し、結合する抗体により、細胞の表面で検出される。図２Ｂにおいて、細胞は、抗体−ＫＤＥＬ分子（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として開示される）で形質導入されるので、ｈＴＮＦ−αタンパク質に結合する抗体は、ＥＲにおいてこの標的タンパク質を保持し、ｈＴＮＦ−αタンパク質は、細胞の表面でもはや検出されない。
本発明のプラットフォーム技術及び方法は特に、ハイスループットスクリーニング又は検出フォーマットに従う。例えば、フローサイトメトリーは、所定のタンパク質、例えば、標的タンパク質、例えば、リガンド結合性受容体タンパク質又はリガンドを、細胞表面で発現するか、又は発現しない、抗体、又は対象の抗体を発現するか、又は細胞オルガネラにおいて保持されているタンパク質を含有する、改変された細胞を検出し、スクリーニングするのに適切である。使用に適切な他のスクリーニング方法又は検出方法は、イムノアッセイ方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、均一な時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、発光アッセイ（「白熱光」型シグナル）、エバネッセント光分析などを含み、当業者により知られた従来の方法により行うことができる。
抗体である結合性分子の細胞内の遺伝的多様化方法
ジンクフィンガー、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、酵母からヒトまでの範囲に渡る生物において最も一般的な転写因子ファミリーを含む。ある種のＤＮＡ結合特異性を含有するように設計された、又は意図的に再設計されたジンクフィンガータンパク質は、種々の細胞型において機能ドメインを対象の遺伝子に対して標的にするのに適切な技術を提供する。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、様々な細胞型内で、標的にされた遺伝子操作を行うための強力なツールを提供する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合された、改変されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインを含有する合成タンパク質である。詳細には、ＺＦＮは、FokI制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインに融合している、改変されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインを含有してもよい。ＺＦＮは、遺伝子操作を行うために利用され得る相同組換えプロセスと非相同組換えプロセスの両方を刺激し、遺伝的多様性及び遺伝的バリエーションを生じる二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入し得る。これらの細胞のプロセスを利用して、正確に標的にされた、標的にされた遺伝子欠失、すなわち、ノックアウト、組込み、又は他の修飾でのインビトロ又はインビボでのゲノム編集を生じることができる。ＺＦＮで二重鎖切断をゲノムにおける特異的部位に標的にすることを用いて、様々な真核生物において、不完全なＤＮＡ修復を介して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、ＺＦＮ標的部位を囲むゲノム配列が永久的に妨害されている（Ho M, Pastan I (2009), Methods Mol Biol., 525: 337-352, xiv）。遺伝子ターゲティングは、対象のいかなる所望される遺伝子を修復するか、又は不活性化し得る方法である。遺伝子ターゲティングストラテジーは、組換えの効率を、例えば、外因的に導入された相同なＤＮＡ「修復鋳型」で増強するために、ＤＳＢのゲノム遺伝子座への導入を用いる。ＤＳＢは、遺伝子ターゲティング頻度を５０％もの高さに近づけ、組換え効率を数千倍刺激し得る。
本発明に従い、ＺＦＮ及びこれと関連する分子プロセスの使用は、特異的相互作用の多様性、及び標的タンパク質及び抗原との結合能を有する多様化した抗体、すなわち、抗体、又はその結合性断片若しくは部分の１又は２以上、例えば、集団を生じるための遺伝的アプローチとして用いられる。抗体分子のＣＤＲをコードするＤＮＡ内での指向された切断及び修復から生じる多様性及び変動性は、特異的かつ最適な結合特性を有する１又は２以上の多様化した抗体を生じ得、ここで、多様化した抗体は、これらの標的分子／タンパク質及び標的抗原と相互作用及び結合する際に、より高い特異性、親和性、結合活性などを有する可能性を有する。一般的に、本明細書に記載される通り、多様化した抗体若しくは多様化した抗体の集団由来の最適な結合抗体、又はその部分は、当該技術分野で公知の方法、例えば、リボソーム又は核酸ディスプレイ、ファージ又は細胞ディスプレイシステムを用いるため、又は酵素、例えば、ＡＩＤを有する特定のＢ細胞株を用いるため、スクリーニングされるか、又は選択されてもよい。或いは、多様化した抗体若しくは多様化した抗体の集団由来の最適な結合抗体、又はその部分は、本明細書に記載される単一細胞選択方法を用いるため、便宜的又は有利にスクリーニングされるか、又は選択され得る。
従って、この態様の別のものにおいて、本発明は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列、及び認識配列に結合するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、結合性分子、例えば、抗体の結合ドメインの特定の位置において変動性を誘導する方法を提供する。実施形態において、ジンクフィンガー認識部位、すなわち、核酸配列は、免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン、例えば、ヒト可変重鎖ドメイン（ｈＶＨ）、及び／又は免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン、例えば、ヒト可変軽鎖ドメイン（ｈＶＬ）の確立された免疫グロブリンＣＤＲ構造に導入される。所望される変動性の程度に依存して、ジンクフィンガー認識配列は、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨドメインとＶＬドメインのいずれか又は両方、例えば、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインにおける１つ、２つ、又は全３つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に導入され得る。
ジンクフィンガー認識部位のＣＤＲ遺伝子座への導入は、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより誘導される、標的にされた遺伝子妨害を可能にする。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３〜６つの個々のジンクフィンガー反復を典型的に含有し、それぞれが、約９〜約１８塩基対を認識し得る。ジンクフィンガードメインが、これらの意図される標的部位に完全に特異的であるなら、次に実に、合計１８塩基対を認識する１対の３フィンガーＺＦＮが、哺乳類のゲノムにおいて単一遺伝子座を標的にすることができる。ジンクフィンガータンパク質標的部位を見出すこと、及びこれを標的にするタンパク質、例えば、ＺＦＮを設計することを含む、適切なＺＦＮ認識部位の決定は、当該技術分野で利用可能な情報により、例えば、刊行物、及び公的に利用可能かつ双方向性インターネットウェブサイト、例えば、The Scripps Research Institute (TSRI)、Carlos F. Barbas III, Ph.D.の研究室、La Jolla, CA. (worldwideweb.zincfingers.org)、及びジンクフィンガー設計についての公的に利用可能な情報を提供する、The Zinc Finger Consortium（worldwideweb.zincfingers.org）のメンバーである、Daniel Voytasの研究室から、当業者による使用のために提供されるものを通じて、促進され得る。
「zincfingertools」ウェブサイトにおいて示される通り、ＤＮＡ配列の特異的３塩基を認識するモジュラータンパク質ドメインの開発において、有意な進歩がこれまでになされている。これらのドメインは、選ばれたＤＮＡ配列に結合し得るタンパク質を作製するために一緒に融合され得る。最初にＤＮＡ及びＲＮＡ結合転写因子ＴＦＩＩＩＡにおいて同定された、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフは、配列特異的タンパク質が構築され得る、恐らく同一の構造足場である。単一のジンクフィンガー結合ドメインは、疎水性相互作用及び単一の亜鉛イオンのキレート化により安定化された単純なββα折畳みを有する約３０個のアミノ酸からなる。このドメインのα−ヘリックスの、ＤＮＡの主要な溝への提示は、配列特異的塩基接触を可能にする。それぞれのジンクフィンガードメインは、ＤＮＡの３塩基対を典型的に認識するが、ヘリックスの提示のバリエーションが、より拡大された部位の認識を可能にし得る。タンパク質とＤＮＡとの接触をより長いＤＮＡ配列又は配置に拡大することについてタンパク質ドメインの二量体形成に頼る大部分の転写因子と対照的に、ジンクフィンガードメインの単純な共有結合タンデム反復が、このモチーフによるＤＮＡのより長い非対称な配列の認識を可能にする。それぞれのジンクフィンガードメインは、配列の３塩基対を典型的には結合するので、完全な認識アルファベットは、６４ドメインの特徴決定を必要とする。ＴＳＲＩは、この６４メンバー認識コードの5'-GNN-3'、5'-ANN-3'、及び5'-CNN-3'サブセットを表すジンクフィンガードメインを調製するためのファージディスプレイによる選択及び部位指向変異誘発による緻密化を用いた、モジュラー認識アルファベットの生成に向けた系統的アプローチを取る。さらに、Barbas Laboratoryによる刊行物は、いくつかの5'-TNN-3'ドメイン、及びこの認識アルファベットについての情報を提供した。
当業者により理解されるように、ＺＦＰを設計するとき最適化するための主要なパラメーターは、典型的には、ＤＮＡ結合についての特異性及び親和性である。実例として、１８ｂｐの標的部位を認識することが意図され、基準ＴＧＥＫＰリンカー（配列番号４９）を用いて構築された６フィンガータンパク質は、内在性遺伝子制御についての模範的な解決を提供する。１０ｎＭ又はそれ以上の親和性で標的に結合するタンパク質は、生産的制御因子であり、１ｎＭ又はそれ以上の親和性を有するＺＦＰは、最適な活性を有する。ＺＦＰについての親和性は、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）を行うことにより決定され得る。ジンクフィンガー結合性タンパク質に関する公的にアクセス可能な双方向性の情報が、特定の認識部位の決定を促進する。本発明に従った、形態（ＸＸＸ）３Ｎ６（ＸＸＸ）３（ここで、「ＸＸＸ」は、ジンクフィンガーが存在する３塩基であり、「Ｎ」はいかなるヌクレオチドでもよい）の認識部位。本明細書に記載されるＺＦＮ１〜ＺＦＮ４ジンクフィンガーヌクレアーゼは、この方法論により作製された。
かかる方法の実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれか又は両方における３つのＣＤＲのうち１つに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれか又は両方におけるいかなる組合せの３つのＣＤＲうち２つに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれか又は両方におけるいかなる組合せのＣＤＲの全３つに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のいずれか又は両方における少なくとも１つのＣＤＲに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のそれぞれに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。実施形態において、ジンクフィンガー認識配列は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲのそれぞれ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３に導入される。実施形態において、少なくとも１つの認識配列が、所定のＣＤＲに導入される。実施形態において、２つ又は３つ以上の認識配列が、所定のＣＤＲに導入される。実施形態において、２つの認識配列が、所定のＣＤＲに導入される。実施形態において、２つの認識配列が、２つの所定のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３に導入される。
特定の実施形態において、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン内のＣＤＲ１配列及びＣＤＲ３配列は、異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質認識配列を含有する。より詳細には、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれは、２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質認識配列を含有する。それぞれのＣＤＲにおける異なる標的部位について、それぞれが４つのジンクフィンガーモチーフを含有する（合計２４塩基対を認識する）、２つのジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、すなわち、核酸認識配列が、公開された方法、例えば、Moore, M., Choo, Y. & Klug, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1432-1436 (2001)、Jamieson, A.C., Miller, J.C. and Pabo, C.O., Nat. Rev. Drug Discov., 2, 361-368 (2003)に従い、インビトロでアセンブリされる。合計で、４つの認識配列がＶＨドメインに導入され、４つの認識配列がＶＬドメインに導入される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質認識配列は、IIS型制限酵素、FokIのＤＮＡ切断ドメインに結合されて、ＤＮＡ切断の位置が、改変されたＺＦＰドメインのＤＮＡ結合特異性により決定される、新規ＺＦＮを産生する（例えば、Urnov, F.D. et al., Nature 435, 646-651 (2005)、Moore, M., Choo, Y. and Klug, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1432-1436 (2001)、Smith, J. et al., Nucleic Acids Res. 28,3361-3369 (2000)）。
代表的な例において、導入されたジンクフィンガー標的配列を含むＶＨ領域及びＶＬ領域ＣＤＲ１及びＣＤＲ３が、図３に示される。ＣＤＲ１領域とＣＤＲ３領域の間の四角形の範囲はＣＤＲ２を表し、この例ではジンクフィンガー標的配列を含有しない。５’から３’方向において、連続する「Ｎ」により表される２つのジンクフィンガー標的配列、すなわち、５’tactcaNNNNNNNNNNNNctgatNNNNNNNNNNNNttactca３’（配列番号６）を有するＣＤＲ領域（例えば、ＣＤＲ１とＣＤＲ３の両方）の代表的な配列が続く。ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ領域のそれぞれにおけるアミノ酸の総数は、特異的ＣＤＲ、特異的抗体又は抗体の種類、及びＣＤＲが抗体のＬ鎖又はＨ鎖内に存在するかどうかに依存して、異なる。一般的な表現において、ＣＤＲは、約６〜約１０又は１５のアミノ酸を含み、しかしながら、抗体分子のＣＤＲは十分に確立され、例えば、Wu, T. and Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med., 132:211-250、及びHood, L. et al., 1975, Ann. Rev. Genetics, 9:305-353により記載される、フレームワーク配列情報を含む、配列情報に基づき同定され得る。
ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列が、それらが典型的には存在する、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの外側のＣＤＲに導入され得ることは、十分に理解されるだろう。例えば、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインから単離することのできる、ＣＤＲをコードする核酸配列は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列を、例えば、当該技術分野で公知の適切なプラスミド若しくはベクター構築物、又は核酸発現カセットと関連して含有するように分子的に改変され得る。核酸構築物又はカセットは、ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は全て、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含み得る。ＣＤＲは、構築物又はカセット内で直線的に又は並列的に位置し得る。ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列を含有するように修飾された、１又は２以上のＣＤＲは、その後、当業者に公知の従来の分子技術を用いて、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、すなわち、かかるドメインをコードする核酸配列に導入され得る。或いは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列は、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン内で天然に存在するように、ＣＤＲに導入され得る。従って、ＣＤＲをコードする核酸配列を含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン核酸配列は、ＣＤＲをコードする核酸配列の１又は２以上の内で、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の核酸認識配列を含有するように、従来の分子生物学技術を用いて改変され、それによって、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを産生する。当業者により理解されるように、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、適切な免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖定常領域で作動可能に発現されて、修飾されたＣＤＲを含む全長抗体を産生するように、所望の通り分子的に改変され得る。
実施形態において、ジンクフィンガー標的配列を、３つの異なる配列フレームを有するＣＤＲ領域に導入して、フレームシフト、及び結果として生じる抗体産生の欠如を抑制する。得られた改変されたヒト可変ドメインは、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、例えば、ＩｇＧ１に再導入され、これが、異なるジンクフィンガー認識配列又はターゲティング部位を含むように改変された人工ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を含有する可変領域を有する全長抗体タンパク質を産生する（図３及び４）。実施形態において、それぞれのＣＤＲにおいて、２つの異なるジンクフィンガー認識部位が２つの異なるジンクフィンガーヌクレアーゼにより認識されるように、２つの異なるジンクフィンガー認識部位が配置される。従って、この代表的な場合において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、特異的な切断を３つのＣＤＲ内配列部位で誘導するためのこのストラテジーにより標的にされる。所望される変動性の程度に依存して、ＣＤＲ２は、その天然の配列に残存し得るか、又はＣＤＲ１及びＣＤＲ３について記載されたものと同様の方法でジンクフィンガーターゲティングにかけられ得る。全長ＩｇＧについて合計で、可変重鎖における合計４つの異なるジンクフィンガーホットスポット、及び可変軽鎖における合計４つの異なるジンクフィンガーホットスポットが導入され得る（例えば、図３を参照）。
このアプローチの有効性及び妥当性は、記載される通り、ＣＤＲ１領域及びＣＤＲ３領域内で免疫グロブリン遺伝子に変動性を導入することにより、及びJurkat T細胞においてＶＨ配列及びＶＬ配列を標的にするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質を発現させることにより、実験的に評価された。ＺＮＦにより誘導された変異を検出するために用いられる、Surveyorヌクレアーゼアッセイ（例えば、Transgenomic社、米国／Transgenomic社、欧州から入手可能である）を使用した、それぞれの細胞型から単離されたＤＮＡの分析は、ＩｇＧ１遺伝子の有効な変異を示した。Surveyorヌクレアーゼアッセイは、公知の変異と未知の変異の両方の発見及びマッピングのための単純かつ柔軟な変異検出技術である。この技術は、植物ＤＮＡエンドヌクレアーゼのＣＥＬヌクレアーゼファミリーのメンバーである、セロリのSurveyorヌクレアーゼ由来のミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼに基づく。Surveyorヌクレアーゼは、最大で少なくとも１２のヌクレオチドの全ての塩基置換、及び挿入／欠損を含む、両方のＤＮＡ鎖におけるいかなるミスマッチ部位の３’側で高い特異性で切断する。Surveyorヌクレアーゼ技術は、４つのステップ、（ｉ）変異体と野生型参照ＤＮＡの両方に由来する標的ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ、（ii）変異体と野生型参照ＤＮＡの間でヘテロ二本鎖を形成させるためのハイブリダイゼーション、（iii）ヘテロ二本鎖を切断するためのSurveyorヌクレアーゼでアニーリングされたＤＮＡの処理、及び（iv）選択の検出／分離プラットフォームを用いた消化されたＤＮＡ産物の分析を含む。技術は非常に高感度である。Jurkat T細胞から増幅された、クローン化された免疫グロブリン遺伝子の配列分析を使用して、対応する遺伝子におけるＺＦＮにより誘導された挿入及び欠失の存在が確認された。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＺＦＮにより仲介される遺伝子変異及び多様性に加えて、ＣＤＲ内での変異誘発効率がさらに増大され得る。これは、結合性分子、例えば、抗体、又はその結合性部分にさらなる遺伝的多様性を提供し得る。変異誘発頻度及び遺伝子多様性を増大すること、及び改善することは、修飾されたＣＤＲ、及び結合性分子により結合可能なリガンド受容体と同族リガンド対、ウイルス由来のＴａｘ制御タンパク質（図１０Ａ、（配列番号４６））、（Lemoine, F. et al., 2000, AIDS Research and Human Retroviruses, 16(16):1623-1627、Chandhasin, C. et al., 2008, J. Virology, 82(14):6954-6961、Ishikawa, C., et al., 2011, Carcinogeneis, 32(1):110-119、及びBaydoun, H. et al., 2012, PLOS One, 7(8):e42226）、ウイルス由来のp30（Baydoun, H. et al., 2011, Blood, 117(22):5897-5906）、ターミナルトランスフェラーゼ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＴｄＴ）、（Bollum, J, 1974, Terminal deoxynucleotidyl transferase, The Enzymes, the third edition (Boyer, P.D., ed.3, Academic Press, New York, vol.10), pp. 145-171）、（図１０Ｂ、配列番号４７））を含むが、これらに限定されない、ＤＮＡ及び組換え現象に関与する他の制御タンパク質の１又は２以上のメンバーを含む、１又は２以上の結合性分子、例えば、抗体、又はその結合性部分を発現させた細胞における共発現により、又は化学処理により達成され得る。かかる実施形態に従い、細胞におけるＡＴＭ依存性の二重鎖切断（ＤＳＢ）応答（ＤＳＢＲ）は、ＤＮＡ ＤＳＢを認識し、クロマチン関連複合体を、ＤＳＢ修復をＣ−ＮＨＥＪを介して促進するＤＳＢ周囲で生じる。この目的のため、ＤＮＡ−ＰＫｃ及びＡＴＭを含む、いくつかのホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ様セリン／スレオニンキナーゼの活性化が必要とされる。ＡＴＭ依存性ＤＳＢ応答は、ＤＳＢに隣接する広範な（例えば、２つ又は３つ以上のメガベース）クロマチン領域に渡る巨大分子集中のアセンブリを導く。これらの集中は、ＤＳＢ末端を安定化し、さらなる修復及びチェックポイントのシグナル伝達因子の要件を促進するための足場として役に立つと考えられる。例えば、ＤＮＡ−ＰＫｃ欠損細胞は、ＲＳ末端の修復のためＡＴＭを必要とし、これは、ＤＮＡ−ＰＫｃ及びＡＴＭが、免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えと関連して重複した役割を有することを示す。それ故、Ｃ−ＮＨＥＪを増大するため、ＡＴＭキナーゼ阻害剤、例えば、（２−モルホリン−４−イル−６−チアントレン−１−イル−ピラン−４−オン）、又はＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、例えば、（２−（モルホリン−４−イル）−ベンゾ［ｈ］クロメン−４−オン、ＬＹ２９３６４６）の使用は、本発明の方法に従い、ＣＤＲ多様化の変動性を増大し得る。
本発明の方法の特定の実施形態において、リガンド又は抗原認識及び結合性分子、例えば、抗体、又はその結合性部分の結合能の改善及び／又は増大を生じ得る、さらなる遺伝的バリエーションの生成は、本明細書に記載される通り、変異誘発頻度及び遺伝的多様性を、ＣＤＲ修飾結合性分子、例えば、抗体又はその結合性部分、及び活性がまた遺伝的多様性を生じる適切なＺＦヌクレアーゼを発現するように改変された細胞における、Ｔａｘ（図１０Ａ、配列番号４６）及び／又はＴｄＴ（図１０Ｂ、配列番号４７）酵素タンパク質の共発現を通じて、増大させること、及び改善することにより、提供される。実施形態において、Ｔａｘタンパク質、又は同様の機能を有するタンパク質のみが、ＣＤＲ修飾結合性分子及びＺＦヌクレアーゼも発現された細胞において発現される。他の実施形態において、上で示された、ＡＴＭキナーゼの化学阻害剤を用いて、結合性タンパク質、例えば、本発明の方法による抗体におけるさらなる遺伝的バリエーション及び多様性が誘導され得る。
本明細書に記載される通り、ジンクフィンガーヌクレアーゼの配列は、１又は２以上の抗体分子において多様性、詳細には、標的抗原結合活性における多様性を生じる、記載の方法に従い、ＶＨ及び／又はＶＬＣＤＲに挿入されたジンクフィンガータンパク質ターゲティング配列と一緒に用いられる。本明細書における方法で用いられるＺＦＮは、少なくとも１つ、例えば、２つのジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合認識配列（「ターゲティング領域」）を含有するよう設計され、発現されたＺＦＮが、ＣＤＲに導入された認識配列又はターゲティング領域に結合するよう指向する。実例として、だが本発明を制限することなく、図５は、１又は２以上の抗体（又は１つ若しくは２つ以上の多様化した抗体）及び標的タンパク質も本発明の方法に従い共発現される細胞において、ジンクフィンガーヌクレアーゼを発現させるよう設計された代表的な構築物を提示する。
本発明は、免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）を修飾することにより、抗体遺伝的多様性又は変動性を生じさせる方法を包含する。従って、方法は、（ａ）１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列に、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン認識配列を導入して、１又は２以上の非同一のターゲティング部位をＣＤＲコード核酸配列内で生じさせて、１又は２以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を結し、それによって、修飾されたＣＤＲコード核酸配列を生成するステップ、（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列に、IIS型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結している（ａ）のジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインターゲティング部位配列を導入するステップであって、ＺＦＮによるＤＮＡ切断が、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列内のターゲティング部位配列により決定される、ステップ、並びに（ｃ）発現したＺＦＮが、ターゲティング部位配列内の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を結合し、切断する条件下で、（ｂ）の核酸配列を、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を含む少なくとも抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は少なくとも抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸を含有する細胞において発現させるステップを含む。
上記の、遺伝的に多様な結合性分子を生じる方法の実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上に導入されるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、異なる認識配列を含む。種々の実施形態において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の１又は２以上に導入され、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入され、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。種々の実施形態において、１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上に導入され、少なくとも２つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上に導入されるか、又は２つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上に導入される。種々の他の実施形態において、１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入され、少なくとも２つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入されるか、又は２つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。実施形態において、導入されるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は異なる。実施形態において、２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。
上述の方法のさらに他の実施形態において、２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の１又は２以上、又は３つのＣＤＲのそれぞれに導入される。実施形態において、ＣＤＲのそれぞれに導入される２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、配列番号６を含む。実施形態において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、配列番号６を含む。別の実施形態において、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、合計２４塩基対を含む。別の実施形態において、上記方法の（ｂ）において、II型制限酵素はFokIである。実施形態において、方法の（ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列は、ＶＨドメインのＣＤＲ１内に切断のための第１のＺＦＮ配列、ＶＨドメインのＣＤＲ１内に切断のための第２のＺＦＮ配列、並びにＶＨドメインのＣＤＲ３内に切断のための第１のＺＦＮ配列、及びＶＨドメインのＣＤＲ３内に切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される。実施形態において、方法は、（ｉ）配列番号７に示されるターゲティング配列及び配列番号８に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列、並びに配列番号９に示されるターゲティング配列及び配列番号１０に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列、及び（ii）配列番号１１に示されるターゲティング配列及び配列番号１２に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列、並びに配列番号１３に示されるターゲティング配列及び配列番号１４に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列を包含する。実施形態において、方法の（ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列は、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断のための第１のＺＦＮ配列、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断のための第２のＺＦＮ配列、並びにＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第１のＺＦＮ配列、及びＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される。実施形態において、方法は、（ｉ）配列番号１５に示されるターゲティング配列及び配列番号１６に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列、並びに配列番号１７に示されるターゲティング配列及び配列番号１８に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列、及び（ii）配列番号１９に示されるターゲティング配列及び配列番号２０に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列、並びに配列番号２１に示されるターゲティング配列及び配列番号２２に示されるＺＦＰ認識配列を含むＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列を包含する。実施形態において、構築物はレンチウイルスベクターを含む。種々の実施形態において、全長抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、又はＩｇＥ抗体から選択され、全長抗体はＩｇＧ抗体であり、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体であるか、又は抗体はＩｇＧ１抗体である。実施形態において、方法の（ｃ）において、細胞は、Ｔ細胞株又はJurkat T細胞株である。実施形態において、方法は、（ｄ）細胞において、細胞表面で発現可能であり、（ｃ）の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインにより結合可能な可能性のある標的である受容体タンパク質を発現させるステップ、（ｅ）細胞において、受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、オルガネラにおけるリガンドの保持、及びオルガネラにおける受容体タンパク質と同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、同族リガンドが、リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされており、同族リガンドが、（ｃ）のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインによって結合可能な可能性のある標的である、ステップ、及び（ｆ）細胞表面で発現した受容体タンパク質のレベルを検出するステップをさらに含み、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、受容体タンパク質又は同族リガンドのいずれかに結合し、オルガネラにおいてそれらの結合する相互作用をブロック又は妨害する場合、受容体タンパク質が、オルガネラを通過し、細胞表面で発現され、検出可能であり、受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック又は妨害するＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、細胞から回収可能である。方法の種々の実施形態において、細胞内オルガネラ保持配列は、ＥＲ又はゴルジ保持配列であり、ＥＲ保持配列はＫＤＥＬアミノ酸配列（配列番号１）である。
実施形態において、上記方法の（ａ）において、ＣＤＲをコードする核酸配列は、核酸構築物又はカセット内に含有される。実施形態において、ＣＤＲをコードする核酸配列は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードする核酸配列及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列内に含有される。実施形態において、上記方法の（ｃ）において、修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列を含み、かつ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含む全長抗体内に含有され、ここで、得られた核酸配列は、修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む全長抗体をコードする。実施形態において、上記方法は、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインタンパク質をコードする核酸配列を増幅するステップ、及びＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインタンパク質を細胞からクローニングするステップをさらに含む。
別の実施形態において、上記方法の（ｂ）において、II型制限酵素はFokIである。実施形態において、上記方法の（ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列は、ＶＨドメインのＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列、ＶＨドメインのＣＤＲ１内の切断のため第２のＺＦＮ配列、並びにＶＨドメインのＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列、及びＶＨドメインのＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される。実施形態において、上記方法は以下を包含する、（ｉ）ＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列は、配列番号７に示されるターゲティング配列及び配列番号８に示されるＺＦＰ認識配列を含み、並びにＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列は、配列番号９に示されるターゲティング配列及び配列番号１０に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及び（ii）ＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列は、配列番号１１に示されるターゲティング配列及び配列番号１２に示されるＺＦＰ認識配列を含み、並びにＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列は、配列番号１３に示されるターゲティング配列及び配列番号１４に示されるＺＦＰ認識配列を含む。実施形態において、上記方法の（ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列は、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断ための第１のＺＦＮ配列、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断のための第２のＺＦＮ配列、並びにＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第１のＺＦＮ配列、及びＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される。
実施形態において、上記方法は、以下を包含する、（ｉ）ＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列は、配列番号１５に示されるターゲティング配列及び配列番号１６に示されるＺＦＰ認識配列を含み、並びにＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列は、配列番号１７に示されるターゲティング配列及び配列番号１８に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及び（ii）ＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列は、配列番号１９に示されるターゲティング配列及び配列番号２０に示されるＺＦＰ認識配列を含み、並びにＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列は、配列番号２１に示されるターゲティング配列及び配列番号２２に示されるＺＦＰ認識配列を含む。実施形態において、構築物はレンチウイルスベクターを含む。上述の方法の種々の実施形態において、全長抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、又はＩｇＥ抗体から選択され、全長抗体はＩｇＧ抗体であり、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体であるか、又は抗体はＩｇＧ１抗体である。実施形態において、上記方法の（ｃ）において、細胞は、Ｔ細胞株又はJurkat T細胞株である。
実施形態において、上記方法は、（ｄ）細胞において、細胞表面で発現可能であり、（ｃ）の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインにより結合可能な可能性のある標的である受容体タンパク質を発現させるステップ、（ｅ）細胞において、受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、オルガネラにおけるリガンドの保持、及びオルガネラにおける受容体タンパク質と同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、同族リガンドが、リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされており、同族リガンドが、（ｃ）のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインによって結合可能な可能性のある標的である、ステップ、及び（ｆ）細胞表面で発現した受容体タンパク質のレベルを検出するステップをさらに含み、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、受容体タンパク質又は同族リガンドのいずれかに結合し、オルガネラにおいてそれらの結合する相互作用をブロック又は妨害する場合、受容体タンパク質は、オルガネラを出て、細胞表面で発現され、検出可能であり、受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック又は妨害するＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、細胞から回収可能である。方法の種々の実施形態において、細胞内オルガネラ保持配列は、小胞体（ＥＲ）又はゴルジ保持配列であり、ＥＲ保持配列はＫＤＥＬ（配列番号１）である。
別の実施形態において、本発明は、修飾された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、遺伝的に多様な抗体、又はその結合性断片若しくは部分を生じさせる方法であって、（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質（ＺＦＮ）により認識される、抗体ＶＨドメイン及びＶＬドメインのＣＤＲ遺伝子座内の１又は２以上の個々のＣＤＲをコードする核酸配列に１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列を導入することにより、修飾されたＣＤＲを調製し、それによって、ＺＦＮの特異的結合のため、ＶＨ及びＶＬＣＤＲをコードする核酸配列において１又は２以上の非同一の標的部位を生成するステップ、（ｂ）（ａ）のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列を含有するＣＤＲに対する特異性を有し、かつこれを標的にし、及びII型制限エンドヌクレアーゼ由来の切断ドメインに結合されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする単離された核酸配列を調製するステップであって、ＺＦＮによる切断が、（ａ）の修飾されたＣＤＲ内のＤＮＡ結合性タンパク質認識配列により決定される、ステップ、（ｃ）（ａ）の修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列認識を、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列に導入し、それによって、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを産生するステップ、（ｄ）場合によって、（ｃ）のＶＨ及び／又はＶＬを、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を含む抗体タンパク質をコードする単離された核酸配列に導入するステップであって、得られた核酸配列が、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に異なるＺＦＰ認識部位を含む修飾されたＣＤＲ領域を含む全長抗体タンパク質をコードする、ステップ、及び（ｅ）適切な宿主細胞において（ｂ）及び（ｃ）の核酸配列を発現させるステップを含み、発現されたＺＦＮは、発現されたＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、又は発現された抗体のＣＤＲ領域において変異及び遺伝的多様性を生成する条件下で、抗体タンパク質のＶＨ配列及びＶＬ配列内の修飾されたＣＤＲを標的にし、それによって、標的抗原結合特性の改善又は最適な標的抗原結合特性を有し得る、遺伝的に多様な抗体、又はその結合性部分を生じさせる方法を提供する。
上記方法の実施形態において、方法は、産生された抗体をコードする核酸配列を単離するステップをさらに含む。別の実施形態において、方法は、遺伝的に多様な抗体タンパク質をコードする核酸配列をそれらが発現される宿主細胞から増幅するステップ、及び続いてクローニングするステップをさらに含む。実施形態において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上に導入され、例えば、ベクター又はカセット内のＶＨ抗体ドメイン及び／又はＶＬ抗体ドメインから単離され、続いて、従来の分子生物技術により、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン又は全長抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインに再導入される。別の実施形態において、方法の（ａ）において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。別の実施形態において、方法の（ａ）において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。別の実施形態において、方法の（ａ）において、２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される。方法の実施形態において、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入された２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、配列番号６を含む。方法の実施形態において、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入された２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、合計２４塩基対を含む。別の実施形態において、方法の（ｂ）において、ＺＦＮは、II型制限酵素FokIの切断ドメインに結合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列を含む。
本発明により示される通り、ジンクフィンガー結合ドメインホットスポット、すなわち、ジンクフィンガータンパク質結合及び活性、並びにＺＦＮによる認識のため導入されたターゲティング配列を含有するように改変された、免疫グロブリン遺伝子、又はその結合性部分の、Ｔ細胞株におけるＤＮＡターゲティング配列、及び標的タンパク質又は抗原を結合するように改変されたＺＦＮをコードする遺伝子と一緒の共発現は、結合性分子／抗体多様性と同時選択を便宜的に結び付ける新規細胞システムをもたらす。本発明の方法に従い、標的抗原についての結合特異性を有する、ライブラリー、多様化したライブラリー、又は多様化した抗体の集団由来の抗体、又はその結合性部分は、細胞が、適切な標的抗原、例えば、受容体タンパク質又はその同族リガンド、並びに特異的な、発現された抗体、又はその結合性部分の結合及び細胞の環境内で適切な相互作用分子の保持を可能にするための保持シグナルを含有し、発現するよう構築することにより、選択され、同定され、特徴付けられ得る。
本発明のＣＤＲ修飾方法により生じ得る抗体の多様性は、約１０６〜１０１８、又は１０６〜１０１４、又は１０６〜１０１２の異なる抗体結合性部位である。当業者により十分に理解される通り、例えば、ＺＦＮにより標的にされるＣＤＲ１とＣＤＲ３の組合せにおいて、本発明の方法に従い達成される抗体における変動性及びその結合特異性は、それぞれのＣＤＲにおける、又は両方のＣＤＲ一緒におけるヌクレアーゼ活性の効率に依存するであろう。
結合性分子、例えば、抗体又はその結合性部分の結合領域における遺伝的多様性又は変動性を生じさせる上述の方法の態様は、これらのタンパク質を共発現する宿主細胞においてＺＦヌクレアーゼにより作用されるジンクフィンガー（ＺＦ）ホットスポットを含む修飾されたＣＤＲを含有し、以下で、及び本明細書において実施例６においてより詳細にさらに例示される。本明細書において例示の目的のため、結合性分子は、抗体又はその結合性部分である。この態様において、方法は、ＣＤＲ修飾された抗体についての遺伝的多様化の増大及び改善をもたらすための細胞における上述のＴａｘ及び／又はＴｄＴタンパク質の１つ又は両方の発現を含む。適切な発現構築物が形質移入され、形質導入され、又はそうでなければ導入されている細胞の表面で抗体が発現された後、かかる抗体は、ＺＦヌクレアーゼを含む、本明細書に記載されるＣＤＲ多様化方法により同定され、選択され得る。方法のこの態様に従い、多様化した抗体により認識され、結合可能である検出可能な抗原を用いて、抗原に結合する、細胞表面に発現した抗体が同定され、選択される。有利には、かかる抗原は、例えば、他のタンパク質又は混入している成分から実質的に又は完全に取り出された、精製された形態又は単離された形態であり得る。発現されるＣＤＲ修飾された抗体に結合し、抗体の同定、検出及び選択のために用いられ得る抗原の非限定的な例は、タンパク質、例えば、糖タンパク質及び受容体タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、免疫グロブリン及びその断片など、並びに非タンパク質、例えば、核酸、脂質、糖脂質などを含む。抗原、特に、タンパク質抗原及びペプチド抗原は、上述の通り、当該技術分野で公知の多数の手段により、検出のために適切に標識され得る。簡単に言うと、適切な検出可能な標識は、蛍光標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、放射性標識、例えば、１３Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、化学発光標識、例えば、ルミノール、酵素標識、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、ＦＲＥＴ標識、例えば、ユーロピウム、ビオチンとストレプトアビジンの連続結合のためのビオチン標識及びストレプトアビジン標識を含むが、これらに限定されない。酵素が標識物質として用いられるとき、用いられた酵素に依存して適切な基質を用いて検出が行われる。
上述の、及び実施例６において例示される方法により、本明細書において記載され、例示される通り、ＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３の１又は２以上においてジンクフィンガーホットスポットを含有するように改変された抗体をコードする核酸配列（遺伝子）を有するプラスミド発現構築物が、宿主細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）に、そこでの発現のために導入される。宿主細胞はまた、上述され、及び本発明の他の実施形態における対応するＺＦヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を発現させる構築物を含有するように改変される。細胞膜における表面発現を可能にするために、発現される抗体は、細胞膜に局在化させ、位置し、かかるＴＭドメインを含有するタンパク質由来の膜貫通型（ＴＭ）ドメイン、すなわち、ＴＭドメインに好ましくは分子的に融合される。ＴＭを含有するタンパク質の非限定的な例は、成長因子及びその受容体、例えば、本明細書に記載されるＰＤＧＦ ＴＭドメインを含む。配列が方法における使用に適切であるＴＭドメインを含有する多くのタンパク質が、公知であり、当業者により用いられる。加えて、抗体は、細胞、詳細には、細胞膜におけるタンパク質発現に適切な、リーダー配列、例として及び限定することなく、ＩＬ−２タンパク質のリーダー配列を含有するか、又は含有するよう分子的に設計される。方法における使用に適切なリーダー配列を含有する多くのタンパク質が公知であり、当業者により用いられる。
加えて、及び上述の通り、発現される抗体の修飾されたＣＤＲ内での変異誘発効率は、ウイルス由来のＴａｘ制御タンパク質、ウイルス由来のｐ３０、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、又はその組合せを含むが、これらに限定されない、ＤＮＡ及び組換え現象に関与する他の制御タンパク質を細胞において共発現させることにより、さらに増大される。好ましくは、細胞において発現されるＴａｘとターミナルトランスフェラーゼタンパク質の組合せ、例えば、Ｔａｘ／ＴｄＴは、抗原についての結合特性の改善を導き得る、抗体のＣＤＲ結合領域のさらなる遺伝的多様化、並びにその修飾されたＣＤＲにおける遺伝子変動性の増大を有する抗体の生成を提供する。Ｔａｘタンパク質が好ましい一方で、同様の機能を有する他のタンパク質が、使用に適切である。Ｔａｘ及びターミナルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に、いずれかの、１つのプラスミド構築物にて一緒に、又は個別のプラスミド構築物にて別々に導入され得る。従って、Ｔａｘ／ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）タンパク質は、細胞において１つのプラスミドから共発現されるか、又はこれらは、別々のタンパク質として個々のプラスミドから発現され得る。いくつかの場合において、Ｔａｘタンパク質のみが、ＴｄＴの存在なしに、宿主細胞にて発現される。いくつかの場合において、ＴｄＴ酵素のみが、Ｔａｘタンパク質の存在なしに、宿主細胞で発現される。
抗原を結合する、ＣＤＲが修飾された多様化した抗体の同定及び選択は、細胞表面で便宜的に発現される、標識された抗原の抗体への結合について評価することにより達成され得る。結合が、適切な対照、例えば、その表面で抗原に特異的な抗体を発現させるように設計されたか、又は発現することが公知の細胞への標識された抗原の結合と比較して検出されないなら、多様化した抗体は抗原についての特異性を有さないと決定される。多様化した抗体による標識された抗原の特異的かつ検出可能な結合は、抗体が、抗原への結合についての特異性（又は特異性の増大）を有することを示す。特異的結合のレベルは、当該技術分野で従来用いられる方法、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡにより測定される。陽性対照による抗原結合と比較して、多様化した抗体の結合のレベルの増大は、抗原について多様化した抗体の結合能の改善又は増加の指標であり得る。抗体をコードする遺伝子が、ＣＤＲが修飾された抗体、ＺＦヌクレアーゼ、Ｔａｘ及び／又はＴｄＴが、発現されるか、又は共発現され、抗原を高い特異性及び／又は結合活性で結合する能力を有する、より遺伝的に多様な、修飾された抗原特異的抗体を生じる環境を提供する、細胞から単離され、クローン化され、配列決定され得る。
この態様の別のものにおいて、本発明は、細胞内で細胞表面に発現した受容体タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用、又は細胞内での結合性タンパク質とそのリガンドの間の相互作用をブロック又は妨害する低分子、例えば、低分子化学化合物、低分子量有機化合物（例えば、典型的には、分子量９００ダルトン未満）、薬物、又は化学剤をスクリーニングする方法、同定する方法、又は選択する方法を提供する。加えて、低分子は、結合性タンパク質及び／又はそのリガンドの機能に影響し得る。種々の実施形態において、低分子は、結合性タンパク質、例えば、受容体タンパク質、及び／又はリガンドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである。好ましくは、低分子は、細胞膜を横切って迅速に拡散して、細胞内の部位に達する。実施形態において、方法は、同一の細胞において、細胞の表面で発現可能な受容体タンパク質を発現させるステップ、細胞において、受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、オルガネラにおけるリガンドの保持、及びオルガネラにおける受容体タンパク質と同族リガンドの相互作用を可能にし、その結果、受容体タンパク質も、タグ付けされたリガンドに結合した場合に細胞オルガネラ内に保持されるようになる条件下で、同族リガンドが、リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされている、ステップ、及び細胞を、低分子化学化合物、低分子量有機化合物（例えば、典型的には、分子量９００ダルトン未満、又は分子量５００ダルトン以下）、薬物、又は化学剤に暴露するステップ、及び／又はこれを細胞に導入するステップを含む。態様において、低分子は、結合性タンパク質及び／又はリガンドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである。本発明の他の実施形態にあるように、リガンドは、ＥＲにおける保持のため、オルガネラ保持配列、例えば、ＫＤＥＬ（配列番号１）に融合される。代わりの実施形態において、結合性タンパク質は、好ましくは、リガンドが、細胞膜、すなわち、細胞表面で天然に発現されるか、又は発現されるように改変されているなら、オルガネラ、例えば、ＥＲにおける保持のためのオルガネラ保持配列に融合される。態様において、細胞表面に発現した受容体タンパク質（又はリガンド）のレベルは、低分子に暴露された後、検出されて、決定される。態様において、結合性タンパク質、例えば、受容体タンパク質又はリガンドの機能は、低分子が細胞に導入された後、当該技術分野で公知の方法を用いて評価されるか、又は測定される。
この方法の態様に従い、低分子が、受容体タンパク質及び／又はリガンドのいずれか（又は両方）の部分に結合し、相互作用し、又は関連し、オルガネラにおけるそれらの相互作用をブロック、阻害、又は妨害する場合、受容体タンパク質は、そのリガンドと相互作用せず、細胞内に保持されず、それによって、オルガネラを通過し、細胞表面で発現され、検出可能である。従って、受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック、阻害、又は妨害した低分子が、細胞表面の受容体タンパク質の存在の検出に基づき、例えば、検出可能な標識結合、フローサイトメトリー、及び細胞の成長増殖により同定され、選択される。実施形態において、保持はＥＲ又はゴルジ体において生じ、ＥＲ保持タグはＫＤＥＬ（配列番号１）である。
実施形態において、受容体タンパク質を標的にする外因性リガンドが、リガンドへの結合について競合する低分子の能力を評価するため、並びに低分子の特異性を評価するための対照として、細胞に加えられる。リガンドの添加後、例えば、約１時間後、受容体機能が評価され、測定される。従って、結合性分子が受容体分子であるとき、低分子は、測定可能な方法で受容体機能に影響し得、受容体の機能が、低分子化合物の添加後に測定され得る。
従って、本発明は、細胞において受容体とリガンドの相互作用と干渉する非タンパク質剤、例えば、低分子化合物、化学化合物又は化学分子、薬物などを選択する方法も提供する。本発明の方法は、タンパク質とタンパク質の相互作用、及び受容体タンパク質機能に影響する低分子薬物開発候補をスクリーニングする方法、及び同定する方法を提供し得る。加えて、同定された低分子は、生物学的機能を探索するための研究ツールとして、及び新規治療剤、詳細には、多機能のタンパク質の特定の機能を阻害し得るものか、又はタンパク質とタンパク質の相互作用を妨害し得るものの開発におけるリードとしても用いられ得る。
本発明において、低分子、薬物、化学剤、及び他の化合物が、細胞環境に導入されるか、又は別のタンパク質、例えば、細胞表面に発現されるか、又は細胞表面で発現させたリガンド又は結合対メンバーと相互作用する（結合する）能力がある保持されるタンパク質を発現する細胞に直接的に導入される。保持される相互作用するタンパク質を発現する細胞に導入され、内在化される低分子、薬物、化学剤、及び他の化合物が、リガンドとその認識タンパク質、例えば、受容体タンパク質とそのリガンドの結合を妨害、阻害、ブロックし、これと干渉するか、又はそうでなければ防ぐか、及び／又は受容体タンパク質の機能に影響するかどうかを決定する適切なアッセイが行われる。実例として、方法を実施した後、導入された低分子、薬物、化学剤、又は他の化合物が、相互作用するタンパク質の１つ又は両方を結合するか、又はそうでなければ細胞内で相互作用するか、若しくは関連する場合、これらのうち１つが、ＥＲにおいて保持され、例えば、これらのタンパク質の相互作用を妨害、阻害、ブロックし、又はそうでなければ防ぎ、次に、保持されたタンパク質の相互作用を通じてＥＲにおいて保持されないタンパク質が、例えば、細胞表面で、又は細胞において、本明細書において詳細に記載された検出方法を使用することにより、検出され得る。
本発明のこの態様の別の実施形態において、相互作用するタンパク質上で、かつ低分子により占拠される結合部位が、決定され、同定され、研究され得るように、低分子は、当該技術分野で従来用いられる方法及び試薬を用いて、検出可能に標識されるか、又はタグ付けされ得る。実施形態において、相互作用するタンパク質の１つ又は両方を、例えば、タンパク質の部位を変化させ、ブロックし、修飾し、又は誘導体化することにより修飾して、低分子による結合又は干渉が影響されるかどうかが決定され得る。或いは、低分子自体を、誘導体化するか、又は修飾して、修飾された低分子が、タンパク質とタンパク質の相互作用に影響するかどうかが本発明の方法を通じて決定され得る。方法の他の同様の利点は、当業者により十分に理解されるであろう。
以下の実施例は、本発明を制限することを意味しないが、本発明をその種々の実施形態及び態様で示し、説明するために提示される。
［実施例］
材料及び方法
プラスミド及び細菌細胞
ウサギＶＬ単一ドメイン抗体（ＳＤＡ、Single Domain Antibody）ライブラリーの、ｈＴＮＦ−αに対する３０９の抗体及びウサギＶＬＳＤＡ１８（ＶＬ１８）をpT7ベクターにクローニングした（例えば、２０１２年９月１９日に出願された国際出願番号：ＰＣＴ／ＰＴ２０１２／００００３５、F. Aires Da Silva et al.、「Anti-tumor necrosis factor-alpha agents and uses thereof」、TechnoPhage社, Lisbon, Portugal、２０１１年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／５３８，５４８号に記載の通りであり、その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる）。抗ｈＴＮＦ−αＶＬ二量体ライブラリーは以前に報告されている制限／ライゲーション戦略を用いて構築した。（Oliveira SS, Aires da Silva F, Lourenco S, Freitas-Vieira A, Santos ACC, et al. (2012), Biotechnology and Applied Biochemistry 59: 193-204）。pComb3XベクターにクローニングしたウサギＶＬＳＤＡＦ６３は、ｇｐ４１に対するファージディスプレイによって選択され、脱免疫化された（例えば、その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年９月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＰＴ２０１２／００００３５、F. Aires Da Silva et al.、「Anti-tumor necrosis factor-alpha agents and uses thereof」、TechnoPhage社, Lisbon, Portugal、２０１１年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／５３８，５４８号；及びSantos, A. S., Oliveira, S. S., and Goncalves, J.、結果未公表に記載の通りである）。プラスミドpHEF-VSVG（AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, from Dr. Lung-Ji Chang）、pGagPol（Amendola M, Venneri MA, Biffi A, Vigna E, Naldini L (2005), Nat Biotechnol 23: 108-116）、pRev（Amendola M, et al. (2005), Nat Biotechnol 23: 108-116）、及びpFugW（Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D (2002), Science (New York, NY)）295: 868-872はレンチウイルス粒子を産生するために使用した。
細胞株及び培養条件
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, Manassas, VA, USA）は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Scientific社）を追加したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０）で培養した。Jurkat細胞（ＡＴＣＣ）及び細胞株、例えば、ＪＬＴＲＧ−Ｒ５（Ochsenbauer-Jambor C. et al., 2006, BioTechniques, 40(1):91-100）は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Scientific社）を追加したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ, Roswell Park Memorial Institute medium）−１６４０（ＲＰＭＩ−１０）で成長させた。すべての細胞培養物は５％ＣＯ２中３７℃で維持された。細胞培養培地及び試薬は、他に指定がない限り、Lonza社（Basel, Switzerland）から購入した。
プラスミド／ベクター構築物
抗体ベクター
通常、すべての発現プラスミドは、校正活性を有するポリメラーゼ（Phusion High-Fidelity DNA polymerase, Finnzymes, Thermo Fisher Scientific社, Vantaa, Finland）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ, polymerase chain reaction）により構築した。
小胞体（ＥＲ, endoplasmic reticulum）への保持シグナル、例えばＫＤＥＬ（配列番号１）を有する及び有さない抗体を発現させるために、２つの基本ベクター（base vector）を構築した：pVL18-IRES-DsRed及びpVL18KDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）、（各図６Ａ及び６Ｂ）。pVL18-IRES-DsRedに対し、２つのフラグメントがＰＣＲによって増幅された。第一のフラグメントは、表１に示されるオリゴヌクレオチドプライマー「Leader-Ab-F1」及び「Ab-HA-IRES-R1」を用いて、pT7ベクターからＳＤＡＶＬ１８を増幅することによって作製された。フォワードプライマー「Leader-Ab-F1」は、マウスＩｇ−κ鎖リーダー配列、すなわちタンパク質を分泌経路に導く(NH2)-METDTLLLWVLLLWVPGSTGD（配列番号２３）-(COOH)（Coloma, MJ et al., 1992, J. Immunol. Meths., 152:89-104）を加え、一方リバースプライマー「Ab-HA-IRES-R1」は、ポリヒスチジン（His6（配列番号４８））及び発現させたタンパク質をウェスタンブロットで検出するための血球凝集素（ＨＡ, hemagglutinin）タグを加えた。第２のフラグメントであるIRES-DsRedは、表１に示されるオリゴヌクレオチドプライマー「HA-IRES-Red-F2」及び「IRES-Red-R2」を用いて、pIRES2-DsRed 2ベクター（Clontech, Takara Bio Company社, CA, USA）から増幅された。精製後、これら２つのフラグメントのオーバーラップＰＣＲ（PCR overlap）は、従来技術及び表１に示されるオリゴヌクレオチドプライマー「Leader-Ab-F1」及び「IRES-Red-R2」を用いて行った。得られたフラグメントはゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼBamHI及びEcoRIで消化され、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にあるFugWベクターにクローニングされた。
基本ベクターであるpVL18KDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）を構築するために、ＳＤＡＶＬ１８は表１に示されるオリゴヌクレオチドプライマー「Leader-Ab-F1」及び「Ab-HA-KDEL-R1」（「KDEL」は配列番号１として表される）で増幅させた。フォワードプライマーは上記と同じであり、リバースプライマーは上記のHis6（配列番号４８）及びＨＡタグに加えて、ＥＲ保持シグナルである5’ aaggatgagctc 3’（配列番号２４）、(NH2)-KDEL-(COOH)（配列番号１）を導入した。ゲル精製後、ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼBamHI及びNheIで消化し、既に構築されさらにこれらの酵素で消化されたpVL18-IRES-DsRedにクローニングした。抗体のクローニングを容易にするため、ＳＤＡＶＬ１８遺伝子の両端には、両方のベクターのSfiIエンドヌクレアーゼの２つの制限部位を隣接させた（図６Ａ及び６Ｂ）。本発明を例示する実施例で使用するために構築された基本ベクターは図６Ａ〜６Ｅに模式的に示されている。
細胞株構築用のベクター
保持シグナルＫＤＥＬ（配列番号１）と融合するｈＴＮＦ−αタンパク質を発現させる細胞株の作製のために、ベクターpTNFKDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）を構築した（図６Ｃ）。ｈＴＮＦ−α（GenBank受託番号Ｐ０１３７５）をコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマー「TNF-KDEL-F」（「KDEL」は配列番号１として表される）及び「TNF-KDEL-R」（「KDEL」は配列番号１として表される）（表１）を用いてＰＣＲによって増幅した。ゲル精製後、核酸フラグメントを制限エンドヌクレアーゼSfiIで消化し、既に構築されＳＤＡＶＬ１８核酸配列を置換したプラスミドpVL18KDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）にクローニングした。
ｈＴＮＦ−αを発現させる細胞株を構築するため、ベクターpTNF-TEV（図６Ｄ）を改変した。ｈＴＮＦ−α遺伝子を、オリゴヌクレオチド「Leader-TNF-F」及び「TNF-TEV-R」（表１）を使用したＰＣＲによって増幅した。増幅された核酸フラグメントは制限エンドヌクレアーゼEcoRV及びEcoRIで消化し、BamHI及びEcoRIで消化されたFugWベクターにクローニングされた。合成した遺伝子はマウスＩｇκ鎖リーダー配列、及びウェスタンブロット検出のため、ｈＴＮＦ−α遺伝子上流にｃ−Ｍｙｃタグを有するように設計された。
Ｔａｘポリペプチドを発現させる細胞株の開発のため、ベクターpTax-IRES-DsRed（図６Ｅ）を構築した。それに応じて、Ｔａｘ遺伝子（Genbank受託番号Ｐ０３４０９）を、オリゴヌクレオチドプライマー「Tax-F」及び「Tax-R」（表１）を用いて増幅した。精製後、増幅された核酸フラグメントはBamHI及びNheIエンドヌクレアーゼで消化し、既に構築されたベクターpVL18-IRES-DsRedプラスミドにクローニングされた。このクローニングでマウスＩｇＧリーダー配列、His6（配列番号４８）及びＨＡタグを除去した。
本明細書で別段の定めがない限り、実施例で使用したすべての酵素はFermentas（Thermo Fisher Scientific社, Waltham, MA, USA）から得られた。各構築されたベクターは、ベクターの増殖、ＤＮＡ抽出及び所望の核酸の単離を可能にするため、大腸菌株ＪＭ１０９（Life Technologies社, Regensburg, Germany）に、エレクトロポレーション（２００Ω、２５μＦＤ、１．８ｋＶ、Bio-Rad Pulse Controller; Bio-Rad社, CA, USA）により形質転換した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのプラスミド構築物の発現
プラスミド構築物の発現を評価するために、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、各プラスミドに対して５μｇのプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞をリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ, phosphate buffer solution）で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Roche Diagnostics GmbH社）を追加したＨＢＳ緩衝液［５０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール；０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸；１％（ｖ／ｖ）triton X-100］で溶解した。この混合物は氷上で３０分インキュベートし、４℃で３０分間１２，０００×ｇで遠心分離した。回収した可溶性画分はウェスタンブロット解析に使用した。タンパク質濃縮物はブランフォード比色定量アッセイ（Bradford colorimetric assay）（BioRad社, CA, USA）を用いて定量した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析について、等量のタンパク質をLaemmli緩衝液（Laemmli, 1970）中で煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。タンパク質は電気泳動（Mini-Protean TM tetra electrophoresis system; Bio-Rad社）で分離し、ニトロセルロース膜Hybond-C Extra（Amersham Bioscience社 UK, Buckinghamshire, UK）にブロットした。ニトロセルロース膜はブロッキング溶液（５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含む、０．１％のTween20を加えたトリス緩衝食塩水（TBS, Tris-buffered saline）（ＴＢＳ−Ｔ））に室温で１時間浸した。ブロッキング後、抗体構築物から発現させた抗体タンパク質及びＴＮＦ−α構築物から発現させたｈＴＮＦ−αタンパク質がブロットされたニトロセルロース膜をそれぞれ、３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔで１：５，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡモノクローナル抗体（clone 3F10; Roche Diagnostics GmbH社）又はＨＲＰコンジュゲートｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（clone 9E10; Roche Diagnostics GmdH社）と共に、室温で１時間インキュベートした。
レンチウイルス粒子の産生及び細胞株の構築
JLTRG-R5 TNFKDEL（「KDEL」は配列番号１として表される）細胞株
TNF-KDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）を安定して発現させる細胞株を作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞６×１０６個）に、従来のリン酸カルシウム法によって、pTNFKDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）、pVSVG、pRev、及びpGagPolを１．５：０．２：１：２の割合で同時にトランスフェクトして、TNFKDEL-IRES-DsRed（「KDEL」は配列番号１として表される）をコードするレンチウイルス粒子を産生した。pVSVG、pRev、及びpGagPolプラスミド、すなわち従来技術として知られているレンチウイルスパッケージングプラスミドは、形質導入された細胞でのレンチウイルス産生のために必要なタンパク質を提供するために使用される。より具体的には、ＶＳＶはエンベロープベクターとして使用され、ウイルスエンドサイトーシスを可能にする。ＨＩＶ−１タンパク質であるＲｅｖは、感染後期でスプライシングされていない（gag/pol）及び不完全にスプライシングされた（env）ＨＩＶ−１ｍＲＮＡからウイルス構造タンパク質を発現させるのに必須である核トランス活性化因子である。ＧａｇＰｏｌはＨＩＶ−１遺伝子であり；ＧａｇはＨＩＶ−１Ｇａｇポリタンパク質をコードし、ウイルス成熟中に、マトリックスタンパク質（ＭＡ, matrix protein）（p17）、キャプシドタンパク質（ＣＡ, capsid protein）（p24）、スペーサーペプチド１（ＳＰ１, spacer peptide 1）（p2）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ, nucleocapsid protein）（p7）、スペーサーペプチド２（ＳＰ２, spacer peptide 2）（p1）及びp6にプロセシングされる。Ｐｏｌはウイルス酵素である、逆転写酵素、インテグラーゼ及びＨＩＶプロテアーゼをコードする。レンチウイルス粒子はプラスミド構築物を保有する。細胞の形質導入後、ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込み、他の宿主細胞の遺伝子と共に発現させる。
４８時間後、レンチウイルス粒子を回収し、ＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞の形質導入に使用した。ＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞はｈＴＮＦ−α受容体を発現させ、細胞がＨＩＶウイルスによって感染したとき、若しくは、Ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ−１転写活性化因子のようなＨＩＶ活性化タンパク質をコードするプラスミドによって細胞が形質導入又はトランスフェクトされたときのみに活性化される、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ, green fluorescent protein）の発現を制御するHIV LTRプロモーターも含まれる。細胞をポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含むレンチウイルス調製物に再懸濁し、３２℃で９０分間、９３０×ｇで遠心接種（spinoculation）した。レンチウイルスはフローサイトメトリーで観察されたとおり、約６０％〜８０％の形質転換効率を産生するために十分な量が使用された。遠心接種は２４ウェルプレートで行われ、プレートの各ウェルには７５０μＬのレンチウイルス粒子を加えた２５０μＬのＲＰＭＩ＋ＦＢＳに細胞約２．５×１０５個が含まれる。６時間後、細胞を洗浄し、培地を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに置換した。形質導入後７２時間で、細胞を回収し、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ, Bovine Serum Albumin）画分Ｖを追加したＰＢＳで２回洗浄し、BD FACS ARIA III cell sorter（Beckton Dickinson Bioscience社, CA, USA）でＤｓＲｅｄ陽性細胞を選別し、一般的に５００μＬ当たり細胞５×１０６個の濃度で２４ウェルプレートに播種した。形質導入されていない細胞は陰性対照として使用した。このようにして、ＤｓＲｅｄ陽性細胞を選別したとき、選択された細胞はｈＴＮＦ−α−ＫＤＥＬ（配列番号１）及びその受容体を発現させる。６日後、選別された細胞について、発現させたｈＴＮＦ−α受容体Ｉを、１２５ｎｇの抗ｈＴＮＦ−αＲＩに対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ, allophycocyanin）コンジュゲートマウスモノクローナル抗体で染色し、これらの細胞は上述したＴＮＦＫＤＥＬタンパク質リガンド（「ＫＤＥＬ」は配列番号１として表される）の発現によりＥＲで受容体を保持することができるかを検証した。FACS ARIA III装置は各試料から少なくとも１０，０００回の事象（10,000-gated events）を得るために使用され、データはFlowJoソフトウェア（Tree Star社, OR, USA）を用いて解析した。
ＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ発現細胞株
ｈＴＮＦ−αリガンドタンパク質を発現させるＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ細胞株を構築するためのＴＮＦ及びＴＥＶをコードしているレンチウイルス粒子を産生するために、従来のリン酸カルシウム法によって、pTNF-TEV、pVSVG、pRev、及びpGagPolを１．５：０．２：１：２の割合で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクトした。４８時間後、レンチウイルス粒子を採取し、ＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞の形質導入に使用された。細胞をポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含むレンチウイルス調製物に再懸濁し、３２℃で９０分間、９３０×ｇで遠心接種した。６時間後、細胞を洗浄し、培地を置換した。形質導入の７２時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ−ＢＳＡ０．５％で２回洗浄し、４℃で３０分間、２．５μｇのエタネルセプト（Enbrel（登録商標））で表面に発現しているｈＴＮＦ−αを染色した。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、ｈＴＮＦ−αに結合しているエタネルセプト（Enbrel（登録商標））を、二次抗体［alexafluor（登録商標）647コンジュゲートAffiniPure抗ヒトＩｇＧ（alexafluor（登録商標））］（１：５００）で３０分間、４℃で染色することによって検出した。染色後、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁し、エタネルセプト−alexafluor（登録商標）647陽性細胞をBD FACS ARIA III（BD Bioscience社, CA, USA）で選別した。標識されたトランスフェクトされていない細胞及び二次抗体でのみ標識された細胞を陰性対照として使用した。すべてのデータは、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。
ＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ及びＴａｘ発現細胞株
ｈＴＮＦ−α及びＴａｘポリペプチドを発現させるＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞株を作製するために、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用した。Tax-IRES-DsRedをコードするレンチウイルス粒子は、上述のpTax-IRES-DsRed、pVSVG、pRev及びpGagPol（１．５：０．２：１：２の割合）とＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクトすることにより産生した。４８時間後、レンチウイルス粒子を回収し、ｈＴＮＦ−αタンパク質を発現させるＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ細胞の形質導入に用いられた。細胞をポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含むレンチウイルス調製物に再懸濁し、３２℃で９０分間、９３０×ｇで遠心接種した。６時間後、細胞を洗浄し、培地を置換した。形質導入の７２時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ−ＢＳＡ０．５％で２回洗浄し、細胞表面に発現させたｈＴＮＦ−αを２．５μｇのエタネルセプト（Enbrel（登録商標））で３０分間、４℃で染色した。細胞はＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄し、４℃で３０分間、二次抗体であるalexafluor（登録商標）647（１：５００）で染色した。染色後、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁し、ＤｓＲｅｄ及びエタネルセプト−alexafluor（登録商標）647陽性細胞をBD FACS ARIA IIIで選別した。標識されたトランスフェクトされていない細胞及び二次抗体でのみ標識された細胞を陰性対照として使用した。BD FACS ARIA IIIから得られたデータはFlowJoソフトウェアを用いて解析した。
ＥＲに標的分子／リガンドを保持する抗体を選択及び進化させるための細胞アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、抗体をコードするレンチウイルス粒子、特にＥＲ保持シグナルＫＤＥＬ（配列番号１）と結合している抗体（抗体−ＫＤＥＬ（配列番号１））を発現及び産生させるために使用した。そのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、pVL18-IRES-DsRed、pVSVG、pREV及びpGagPolを１．５：０．２：１：２の割合でそれぞれ同時にトランスフェクトした。４８時間後、レンチウイルス粒子を採取し、細胞株ＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ又はＪＬＴＲＧ−Ｒ５−ＴＮＦ−ＴＥＶ−Ｔａｘの形質導入に使用した。細胞をポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含むレンチウイルス調製物に再懸濁し、３２℃で９０分間、９３０×ｇで遠心接種した。形質導入された細胞の百分率の対照として、等量のＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞に、上述の細胞株の形質導入に使用される等量のレンチウイルス粒子をさらに遠心接種によって形質導入した。６時間後、細胞を洗浄し、新しい培地（１０％ＦＢＳを含有させるように追加したＲＰＭＩ）を加えた。形質導入の７２時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ−ＢＳＡ０．５％で２回洗浄し、２．５μｇのエタネルセプトでｈＴＮＦ−αを染色し、１：５００で二次抗体であるalexafluor（登録商標）647で染色した。染色した、ＤｓＲｅｄ発現に対して陽性であり、ｈＴＮＦ−α表面発現に対して陰性の細胞は、BD FACS ARIA IIIで選別、播種し、１〜２週間の培養で成長した。選択された細胞はｈＴＮＦ−αを効率よく認識する抗体を発現させ、ＥＲに標的タンパク質を保持した。既に決定された表現型を支持するため、細胞を回収、洗浄し、別の回のBD FACS ARIA IIIでの細胞選別のために調製した。選別された細胞を播種し、５日後にすべてのSorted細胞からQuickExtract（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Epicenter（登録商標）, Illumina（登録商標）company社, WI, USA）でゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝子をコードする抗体を細胞から回収した。
リガンド対結合相互作用を中和／妨害する抗体を選択するための細胞アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は抗体をコードしているレンチウイルス粒子の産生に使用された。したがって、細胞にpVL18-IRES-DsRed、pVSVG、pREV、pGagPolを同時にトランスフェクトした。４８時間後、レンチウイルス粒子は回収され、細胞株JLTRG-R5-TNFKDEL（「KDEL」は配列番号１として表される）の形質導入に使用された。レンチウイルス粒子は一般的に、形質導入効率が約６０％〜８０％得られるような量で用いられ；一般的に、２４ウェルプレートの各ウェルに、７５０μＬのレンチウイルス粒子を加えた２５０μＬのＲＰＭＩ＋ＦＢＳに細胞２．５×１０５個が含まれる。ＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞をポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含むレンチウイルス調製物に再懸濁し、３２℃で９０分間、９３０×ｇで遠心接種した。形質導入された細胞の百分率の対照として、等量のＪＬＴＲＧ−Ｒ５細胞に、JLTRG-R5-TNFKDEL（「KDEL」は配列番号１として表される）細胞の形質導入に用いられる量と同量のレンチウイルス粒子をさらに遠心接種によって形質導入した。６時間後、形質導入された細胞を洗浄し、新しい培地に加えた。形質導入の７２時間後、細胞を回収し、ＰＢＳ−ＢＳＡ０．５％で２回洗浄し、ｈＴＮＦ−α受容体Ｉを１２５ｎｇのＡＰＣコンジュゲートマウスノクローナル抗体抗ｈＴＮＦ−αＲＩで染色し、ＤｓＲｅｄ及びＡＰＣ陽性細胞をBD FACS ARIA IIIで選別した。このようにして、陽性であった選別された細胞はｈＴＮＦ−α及びその受容体間の相互作用を中和又は妨害することができる抗体を発現させることができることが実証され、受容体は細胞表面で発現し、抗ｈＴＮＦ−αＲＩ抗体による検出が可能となった。選別された細胞は播種し、１〜２週間で成長することができた。検出された表現型を確証するため、細胞を再度洗浄し、別の回のBD FACS ARIA IIIでの細胞選別のために調製した。ＤｓＲｅｄに対して陽性であり、ｈＴＮＦ−αＲＩを発現していた選別された細胞を播種した。通常どおり、細胞を２４ウェルプレートで５００μＬ当たり細胞５×１０６個の濃度で培養した。５日後、QuickExtract（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Epicenter（登録商標）, Illumina（登録商標）company社, WI, USA）でゲノムＤＮＡを抽出することにより、表現型の原因となる抗体をフローサイトメトリーで特徴づけることができた。（例えば、図７Ａ及び７Ｂ参照）。
単一ドメイン抗体（ＳＤＡ）のクローニング、発現及びＥＬＩＳＡによる結合解析
異なる細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマー「Seq-Leader-F」及び「Seq-HA-R」（表１）を用いてＰＣＲによって増幅した。増幅させたフラグメント（抗体）は制限エンドヌクレアーゼSfiIで消化し、pT7ベクター（TechnoPhage社から快く提供された）にクローニングされ、エレクトロポレーション（２００Ω、２５μＦＤ、１．８ｋＶ, Bio-Rad Pulse Controller）によって大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ）３に形質転換された。形質転換された細菌のいくつかの希釈物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したLuria broth（ＬＢ）寒天培地に播いた。選別した抗体をスクリーニングするため、各クローニングからの細菌コロニーを単離し、９６ウェルプレートにおいて２００μＬのautoinduction培地（例えば、Overnight Express Autoinduction System, Novagen社, San Diego, CA、ロボットのような自動化システム用）で希釈し、３７℃で１６時間、１５０ｒｐｍで成長させた。各選別された細胞集団、例えば、抗体−ＫＤＥＬ（配列番号１）アッセイに対してＤｓＲｅｄ＋alexafluor（登録商標）647陰性である集団、又はｈＴＮＦ−α−ＫＤＥＬ（配列番号１）アッセイに対してＤｓＲｅｄ＋ＡＰＣ陽性である集団、をゲノムＤＮＡの抽出に使用した。これらのＤＮＡ試料から、抗体遺伝子を増幅し、本明細書に記載のpT7ベクターにクローニングされた。その後、ＢＬ２１（ＤＥ）３細菌をベクターで形質転換した。細菌の形質転換によって得られた単離されたコロニーを採集した。各使用された異なる抗体及び抗体ライブラリーに対して、クローニングが行われた。続いて、９００×ｇで１５分間遠心分離した細胞培養物から得られた細菌ペレットは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ, phosphate buffer solution）及びBugBuster Master Mix（Novagen社, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を１：２の割合で加え、プロテアーゼ阻害剤（Roche Diagnostics GmbH社, Mannheim, Germany）のカクテルを追加して溶解した。この混合物を、撹拌しているプレートで、４℃で４時間インキュベートし、９００×ｇで１５分間遠心分離後に可溶性ペリプラスム抽出物を回収した。回収した可溶性画分はＥＬＩＳＡに用いられた。
発現アッセイにおいて、５５μＬの細菌クローン可溶性画分で９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間コーティングした。プレートのウェルはＰＢＳで洗浄し、３７℃で１時間、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡモノクローナル抗体（clone 3F10, Roche Diagnostics GmbH社）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション期間後、プレートのウェルをＰＢＳで洗浄し、０．２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素（Calbiochem社; Merck KGaA）と結合したＨＲＰ基質ＡＢＴＳ発色団（Calbiochem社; Merck KGaA）を加えることによって、ＥＬＩＳＡ検出を行った。３７℃で３０分後、吸光度は４０５ｎｍにてTecan Infinite M200（Tecan社, Mannedorf, Switzerland）で測定した（参照として４９２ｎｍを使用）。
ｈＴＮＦ−αへの抗体の結合を評価するため、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを２００ｎｇのｈＴＮＦ−α（Prospec社, NJ USA）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、プレートのウェルを３７℃で１時間、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングした。次に５５μＬの各細菌クローンの可溶性画分をウェルに加え、プレートを３７℃でさらに１時間インキュベートした。インキュベーション期間後、プレートはＰＢＳで洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１：１０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲート抗ＨＡモノクローナル抗体を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、プレートのウェルをＰＢＳで洗浄した。０．２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素と結合したＨＲＰ基質ＡＢＴＳ発色団を加えることによってＥＬＩＳＡ検出を行った。３７℃で３０分後、吸光度は４０５ｎｍにてTecan Infinite M200（Tecan社, US及びGermany）で測定した（参照として４９２ｎｍを使用）。
ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質の制限配列を含むＣＤＲを特異的に標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ, zinc finger nuclease）を含むプラスミドの産生
FugWレンチウイルスベクターの主鎖を含むプラスミドベクターにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、各遺伝子を分離する２Ａ（オングストローム）配列でオーバーラップＰＣＲによってクローニングした。図５でＺＦＮ１ＶＨと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは重鎖（ＶＨ）可変領域のＣＤＲ１を標的にするように設計された。ＺＦＮ１ＶＨは、核酸配列gtcgaaaagcca（配列番号７）及びジンクフィンガーアミノ酸配列LEPGEKPYKCPECGKSFSTSHSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGKKTS（配列番号８）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ２ＶＨと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは重鎖可変領域のＣＤＲ１を標的にする。ＺＦＮ２ＶＨは、核酸配列caaaaatcgagct（配列番号９）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSTSGELVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGNLTEHQRTHTGKKTS（配列番号１０）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ３ＶＨと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは重鎖可変領域のＣＤＲ３を標的にする。ＺＦＮ３ＶＨは、核酸配列actcagcgaacg（配列番号１１）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSRTDTLRDHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRADNLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTHLDLIRHQRTHTGKKTS（配列番号１２）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ４ＶＨと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは重鎖可変領域のＣＤＲ３を標的にする。ＺＦＮ４ＶＨは、核酸配列caatgtcggtaca（配列番号１３）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSSPADLTRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGNLTEHQRTHTGKKTS（配列番号１４）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ１ＶＬと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を標的にする。ＺＦＮ１ＶＬは、核酸配列gctcaacgtctg（配列番号１５）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSRNDALTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSRRTCRAHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGNLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGELVRHQRTHTGKKTS（配列番号１６）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ２ＶＬと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を標的にする。ＺＦＮ２ＶＬは、核酸配列aagagaggccca（配列番号１７）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSTSHSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQLAHLRAHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHTGKKTS（配列番号１８）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ３ＶＬと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を標的にする。ＺＦＮ３ＶＬは、核酸配列gttgccgagcga（配列番号１９）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGSLVRHQRTHTGKKTS（配列番号２０）を含む標的領域を含む。ＺＦＮ４ＶＬと称されるジンクフィンガーヌクレアーゼは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を標的にする。ＺＦＮ４ＶＬは、核酸配列cgcatggttaag（配列番号２１）及びジンクフィンガーアミノ酸制限配列LEPGEKPYKCPECGKSFSRKDNLKNHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGSLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRRDELNVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSHTGHLLEHQRTHTGKKTS（配列番号２２）を含む標的領域を含む。本実施例の構築物において、ＶＨを標的にするジンクフィンガー−ヌクレアーゼに対するレンチウイルスベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を含み、ＶＬを標的にするジンクフィンガー−ヌクレアーゼに対するレンチウイルスベクターはＩＲＥＳ配列と共に、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。
本発明による、ジンクフィンガーのホットスポット、Ｔａｘ及びＴｄＴにより多様化され、標的抗原に対して特異性を有する抗体の選択
supraと記載される抗体ＶＨＨをコードし、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３にも記載されているジンクフィンガーのホットスポットを含む核酸配列は、ＰＤＧＦの膜貫通ドメイン及びＩＬ−２タンパク質のリーダー配列をコードする核酸配列と融合してクローニングされた。このキメラ遺伝子（「ＶＨＨ−ＺＦＮ」と呼ばれる）は真核生物プラスミドベクターpcDNA3.1（Invitrogen社）にクローニングされ、対応するジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び／又はＴａｘ並びに末端転移酵素をコードしている核酸配列、すなわち本明細書に記載のＴａｘ／ＴｄＴ遺伝子の存在下で宿主細胞に発現させた。Ｔａｘ：図１０Ａ、（配列番号４６）；ＴｄＴ：図１０Ｂ、（配列番号４７）。Ｔａｘ（ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスタイプ１プロウイルスＴａｘ、Human T-cell lymphotropic virus type 1 proviral Tax）の核酸及びアミノ酸配列はGenBank受託番号ＡＢ０３８２３９．１で確認することができる；ヒトＴｄＴの核酸（ｍＲＮＡ）配列はGenBank受託番号ＡＢ０４６３７８．１で確認することができる。
キメラ融合プラスミドの発現は２９３Ｔ細胞で行った。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の表面での抗体の発現は、抗ＨＡ抗体を用いて抗体に存在するＨＡエピトープを検出することにより評価した。ＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧを、発現させた抗体と結合する、検出可能であり精製された抗原として使用した。ＶＨＨ−ＺＦＮ抗体のみを発現させ、ＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧへの結合をアッセイしたとき、細胞表面に標識された抗原（ＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧ）の結合は検出されず、この結果は細胞表面に発現させた抗体は抗原に対して特性を有さないことを示している。しかしながら、ＶＨＨ−ＺＦＮをＺＦヌクレアーゼと共に共発現させたとき、細胞表面へのＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧ抗原の特異的結合が観察され、この結果は抗体が進化して多様化したことを示している。ＺＦヌクレアーゼの標的である遺伝子をコードしているＶＨＨ−ＺＦＮ抗体の配列決定により、本明細書に記載の可変性と同様のパターンが確認され、この結果は、特異的な抗体のクローンは、ＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧ抗原に結合したＣＤＲが変化した抗体を発現している可能性があることを示している。
ＶＨＨ−ＺＦＮ抗体をＺＦ−ヌクレアーゼ及びＴａｘ／ＴｄＴをコードする核酸（遺伝子）と共発現させたとき、細胞表面へのＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧの特異的な結合が強いシグナルで観察され、この結果は、抗体が進化し、高親和性のＶＨＨ抗体が細胞表面に発現されたことを示している。ＺＦヌクレアーゼの標的である遺伝子をコードしているＶＨＨ−ＺＦＮ抗体の配列決定により、本明細書に記載の可変性と同様のパターンが確認された。超変異（hypermutation）である特異的な核酸のシグネチャは見られなかった（図９Ａ参照）。
標識されたＩｇＧ抗原（すなわち、抗ＩｇＧ陽性細胞）と特異的に結合するＶＨＨ−ＺＦＮ抗体が表面に発現している細胞集団を選別し、ＶＨＨ抗体のＤＮＡを単離し、細菌発現ベクターpT7にクローニングした。単離されたＶＨＨ抗体はＥＬＩＳＡによってＩｇＧへの結合をアッセイした。その結果、抗体の抗原への強い結合が確認され、本方法を用いて抗原に特異的に結合する抗体が作製及び選択されたことを示している（図９Ｂ参照）。
受容体とリガンドの相互作用を阻害する小分子のスクリーニング
受容体及びリガンド−ＫＤＥＬ（配列番号１）を発現させる細胞をＲＰＭＩで培養した。小分子化合物を１０μＭ、１００μＭ又は指示された濃度（用量反応）で細胞に加えた。６時間のベースライン測定後、細胞表面での受容体タンパク質の発現をさらに測定した。抗受容体抗体を使用したＦＡＣＳ分析による測定を１２時間及び２４時間で行った。受容体タンパク質を標的とし、相互作用するリガンドを単一点化合物スクリーニングの間、化合物特異性を制御するために加えた。リガンドを加えてから約１時間後、受容体機能を特定の化合物の存在下で測定した。被検小分子化合物（例えばアゴニスト）に対するパーセント機能は最大読み出しから最小記録を引いて計算した。統計解析は小胞体から細胞表面へ細胞受容体を放出した統計学的に有意である阻害化合物を同定するために行った。有意な阻害剤に対して、用量反応フォーマットでアッセイを繰り返した。
本明細書で参照又は引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例及び本明細書に記載の実施形態は例示目的にすぎず、それに照らして様々な改変又は変更が当業者に示唆され、それらは本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。

Claims (190)

  1. 細胞内で細胞表面に発現した受容体タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用をブロック又は妨害する結合性分子を選択する方法であって、
    前記細胞において、前記細胞の表面で発現可能な受容体タンパク質を発現させるステップ、
    前記細胞において、前記受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、細胞内オルガネラにおける前記リガンドの保持、及び前記オルガネラにおける前記受容体タンパク質と前記同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、前記同族リガンドが、前記リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされているステップ、
    前記細胞内オルガネラにおいて保持されている前記受容体タンパク質又は前記リガンドタンパク質のいずれかを特異的に結合する結合性分子又はその結合性断片若しくは部分を前記細胞に導入するステップ、及び
    前記細胞表面で発現した前記受容体タンパク質のレベルを検出するステップを含み、
    前記結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、前記オルガネラにおいて前記受容体と前記同族リガンドの結合をブロック又は妨害する場合、前記受容体タンパク質が、前記細胞表面で発現及び検出可能であり、前記受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック又は妨害する前記結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が選択可能である、前記方法。
  2. 選択された結合性分子又はその結合性断片若しくは部分を、細胞から回収又は単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、抗体又はその結合性断片若しくは部分、遺伝的に多様化した抗体又はその結合性断片若しくは部分、抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、遺伝的に多様化した抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、ＶＨドメイン、遺伝的に多様化したＶＨドメイン、ＶＬドメイン若しくは遺伝的に多様化したＶＬドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項６に記載の方法。
  8. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項７に記載の方法。
  9. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項８に記載の方法。
  10. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、又はドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択される、請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項３に記載の方法。
  12. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項３に記載の方法。
  13. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分であり、ヒト腫瘍壊死因子α受容体タンパク質（ｈＴＮＦ−α受容体１）に対する抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分であり、ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）リガンドタンパク質に対する抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  15. 結合性分子が抗体ではない分子である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  16. 抗体ではない結合性分子が、抗体模倣物、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アフィリン、アフィチン、アビマー、アンチカリン、モノボディ、アフィボディ分子、ハプトマー、又はアプタマーから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 受容体タンパク質が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、代謝酵素受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、腫瘍抑制抗原受容体（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｋ−Ｒｅｖ、ＤＣＣ受容体）、多剤耐性タンパク質受容体、凝固因子受容体、第VII因子受容体、第VIII因子受容体、第IX因子受容体、栄養因子受容体、細胞認識分子若しくは刺激性分子受容体、アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、及びＴＯＬＬ様受容体から選択されるヒト受容体タンパク質；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びメラトニン受容体から選択されるホルモン受容体；アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンの受容体から選択されるペプチド受容体；ＧＰ１３０又はＩＬ６受容体である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  18. 受容体タンパク質が、ヒト腫瘍壊死因子α受容体１（ｈＴＮＦ−α受容体１）である、請求項１７に記載の方法。
  19. リガンドタンパク質が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、及びＴＯＬＬ様タンパク質から選択されるヒトリガンドタンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、及びメラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、及びチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０、又はＩＬ６である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. リガンドタンパク質が、ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 結合性分子が受容体タンパク質に結合する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 結合性分子が同族リガンドに結合する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  23. 細胞内オルガネラが小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 同族リガンドが、小胞体（ＥＲ）においてリガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされる、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. ＥＲ保持配列がＫＤＥＬ（配列番号１）である、請求項２４に記載の方法。
  26. 結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、細胞内で細胞表面に発現した標的タンパク質に特異的に結合するかどうかを決定する方法であって、
    細胞において、前記細胞の表面で発現可能な標的タンパク質を発現させるステップ、
    前記細胞において、細胞内オルガネラにおいて結合性分子を保持するための配列に融合している前記結合性分子又はその結合性断片若しくは部分を発現させるステップであって、
    前記結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、前記細胞において前記標的タンパク質に特異的に結合する場合、前記標的タンパク質が、前記細胞内オルガネラにおいて前記結合性分子又はその前記結合性断片若しくは部分に結合して保持され、それによって、前記細胞表面での前記標的タンパク質の発現を防ぐステップ、及び
    前記細胞表面に発現した前記標的タンパク質のレベルを検出し、その結果、前記細胞表面で検出された前記標的タンパク質が、適切な対照と比較して、検出不可能なレベル又は低いレベルであることが、前記細胞における前記結合性タンパク質又はその結合性断片若しくは部分の前記標的分子への結合を示すステップを含む、前記方法。
  27. 結合性分子又はその結合性断片若しくは部分を、細胞から回収又は単離するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、抗体又はその結合性断片若しくは部分、遺伝的に多様化した抗体又はその結合性断片若しくは部分、抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、遺伝的に多様化した抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、ＶＨドメイン、遺伝的に多様化したＶＨドメイン、ＶＬドメイン若しくは遺伝的に多様化したＶＬドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
  32. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
  33. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項２８〜３２のいずれかに記載の方法。
  34. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、又はドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択される、請求項２８〜３４のいずれかに記載の方法。
  36. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項２８〜３５のいずれかに記載の方法。
  37. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項２８〜３５のいずれかに記載の方法。
  38. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分であり、ヒト腫瘍壊死因子α受容体タンパク質（ｈＴＮＦ−α受容体１）に対する抗体である、請求項２６〜３７のいずれかに記載の方法。
  39. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分であり、ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）リガンドタンパク質に対する抗体である、請求項２６〜３７のいずれかに記載の方法。
  40. 結合性分子が抗体ではない分子である、請求項２６又は２７に記載の方法。
  41. 抗体ではない結合性分子が、抗体模倣物、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アフィリン、アフィチン、アビマー、アンチカリン、モノボディ、アフィボディ分子、ハプトマー、又はアプタマーから選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 標的タンパク質が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、代謝酵素受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、腫瘍抑制抗原受容体（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｋ−Ｒｅｖ、ＤＣＣ受容体）、多剤耐性タンパク質受容体、凝固因子受容体、第VII因子受容体、第VIII因子受容体、第IX因子受容体、栄養因子受容体、細胞認識分子若しくは刺激性分子受容体、アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、及びＴＯＬＬ様受容体から選択されるヒト受容体タンパク質；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びメラトニン受容体から選択されるホルモン受容体；アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンの受容体から選択されるペプチド受容体；ＧＰ１３０受容体、又はＩＬ６受容体である、請求項２６〜４１のいずれかに記載の方法。
  43. 標的タンパク質がヒト腫瘍壊死因子α受容体１（ｈＴＮＦ−α受容体１）である、請求項４２に記載の方法。
  44. 標的タンパク質が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、及びメラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、及びチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０、又はＩＬ６から選択される、細胞表面に発現され得るヒトリガンドタンパク質である、請求項２６〜４１のいずれかに記載の方法。
  45. 標的タンパク質がヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）である、請求項４４に記載の方法。
  46. 細胞内オルガネラが小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である、請求項２６〜４５のいずれかに記載の方法。
  47. 結合性分子又はその結合性断片若しくは部分が、小胞体（ＥＲ）においてリガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされる、請求項２６〜４６のいずれかに記載の方法。
  48. ＥＲ保持配列がＫＤＥＬ（配列番号１）である、請求項４７に記載の方法。
  49. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、細胞内で細胞表面に発現した標的分子に特異的に結合するか否かを決定する方法であって、
    細胞において、前記細胞の表面で発現可能な標的分子を発現させるステップ、
    前記細胞において、小胞体（ＥＲ）又はゴルジ保持配列に融合している、抗体又はその結合性断片若しくは部分を発現させるステップであって、
    前記抗体又はその結合性断片若しくは部分が、前記細胞において標的タンパク質に特異的に結合する場合、前記標的タンパク質が、前記ＥＲ又はゴルジ体において前記抗体又はその結合性断片若しくは部分に結合して保持され、それによって、前記細胞表面での前記標的タンパク質の発現を防ぐステップ、及び
    前記細胞表面で発現した前記標的タンパク質のレベルを検出し、その結果、前記細胞表面で検出された前記標的タンパク質が、適切な対照と比較して、検出不可能なレベル又は低レベルであることが、前記細胞における前記抗体又はその前記結合性断片若しくは部分の前記標的分子への結合を示すステップを含み、かつ前記抗体が前記細胞において選択可能である、前記方法。
  50. 抗体又はその結合性断片若しくは部分を、細胞から回収又は単離するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、遺伝的に多様化した抗体又はその結合性断片若しくは部分、抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、遺伝的に多様化した抗体ライブラリーのメンバー又はその結合性断片若しくは部分、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリーのメンバー、ＶＨドメイン、遺伝的に多様化したＶＨドメイン、ＶＬドメイン若しくは遺伝的に多様化したＶＬドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
  53. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項４９〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項４９〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項４９〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項４９〜５５のいずれかに記載の方法。
  57. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項５６に記載の方法。
  58. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、又はドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択される、請求項４９〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
  60. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
  61. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体、アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドに対する受容体；又はＧＰ１３０受容体若しくはＩＬ６受容体から選択されるヒト受容体タンパク質から選択される標的タンパク質に対する抗体である、請求項４９〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、及びＴＯＬＬ様タンパク質から選択されるヒト標的タンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン、アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、及びチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０又はＩＬ６に対する抗体である、請求項４９〜６０のいずれかに記載の方法。
  63. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、標的タンパク質としてヒト腫瘍壊死因子α受容体タンパク質（ｈＴＮＦ−α受容体１）に対する抗体である、請求項４９に記載の方法。
  64. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、標的タンパク質としてヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）タンパク質に対する抗体である、請求項４９に記載の方法。
  65. 抗体タンパク質又はその結合性断片若しくは部分が、小胞体（ＥＲ）保持配列に融合される、請求項４９〜６４のいずれかに記載の方法。
  66. ＥＲ保持配列がＫＤＥＬ（配列番号１）である、請求項６５に記載の方法。
  67. 細胞の表面で発現した標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその結合性断片若しくは部分を選択する方法であって、
    細胞表面で標的タンパク質を発現する細胞株を確立するステップであって、前記細胞表面に発現した標的タンパク質が、検出可能に標識された結合性分子により検出され得るステップ、
    前記標的タンパク質への結合について選択するために、前記細胞株において抗体又はその結合性断片若しくは部分を発現させるステップであって、前記抗体又はその結合性断片若しくは部分が、オルガネラ内部での、前記抗体又はその結合性断片若しくは部分と前記標的タンパク質の相互作用及び結合を可能にする条件下で、細胞内オルガネラにおいて前記抗体又はその結合性断片若しくは部分を保持するためのシグナル配列に融合しているステップ、及び
    前記細胞表面で発現した前記標的タンパク質のレベルを、前記検出可能に標識された結合性分子で検出するステップを含み、
    前記抗体又はその結合性断片若しくは部分が、前記オルガネラにおいて前記標的タンパク質に特異的に結合する場合、前記標的タンパク質がオルガネラにおいて結合可能に保持され、それによって、前記細胞表面での前記標的タンパク質の発現のレベルが減少するか、又は排除され、前記細胞における選択可能な抗体又はその結合性断片の保持が示される、前記方法。
  68. 標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその結合性断片若しくは部分を細胞から回収するステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、小胞体（ＥＲ）細胞内オルガネラにおいて、抗体又はその結合性断片若しくは部分を保持するためのシグナル配列に融合される、請求項６７又は６８に記載の方法。
  70. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ＥＲにおいて抗体、又はその結合性断片若しくは部分を保持するＫＤＥＬシグナル配列（配列番号１）に融合される、請求項６７〜６９のいずれかに記載の方法。
  71. 標的タンパク質が、受容体タンパク質又は膜で発現可能なリガンドタンパク質である、請求項６７〜７０のいずれかに記載の方法。
  72. 細胞株が、抗体又はその結合性断片若しくは部分の核酸配列をコードするレンチウイルス粒子で形質導入される、請求項６７〜７１のいずれかに記載の方法。
  73. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、抗体ライブラリーのメンバー、遺伝的に多様化した抗体ライブラリーのメンバー、抗体単一ドメインライブラリーのメンバー、又は遺伝的に多様化した抗体単一ドメインライブラリーのメンバーから選択される、請求項６７〜７２のいずれかに記載の方法。
  74. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、抗体ＶＬドメイン、遺伝的に多様化した抗体ＶＬドメイン、抗体ＶＨドメイン、又は遺伝的に多様化した抗体ＶＨドメインである、請求項６７〜７３のいずれかに記載の方法。
  75. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項６７〜７４のいずれかに記載の方法。
  76. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項６７〜７５のいずれかに記載の方法。
  77. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項６７〜７６のいずれかに記載の方法。
  78. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項６７〜７７のいずれかに記載の方法。
  79. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項６７〜７８のいずれかに記載の方法。
  80. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項７９に記載の方法。
  81. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、又はドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択される、請求項６７〜８０のいずれかに記載の方法。
  82. 細胞表面に発現した標的タンパク質のレベルが、フローサイトメトリー及び検出可能に標識された抗体により検出される、請求項６７〜８１のいずれかに記載の方法。
  83. 複数の結合性分子から、細胞表面に発現した受容体結合性タンパク質及び同族リガンドを含む相互作用対のメンバーである標的抗原を結合する結合性分子を選択する方法であって、
    （ａ）複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸を、細胞内オルガネラにおいて同族リガンドを保持する保持シグナルに融合している受容体結合性タンパク質及び同族リガンドを発現する細胞に導入するステップ、
    （ｂ）前記細胞において（ａ）の前記核酸を発現させるステップであって、発現した結合性分子が、前記オルガネラにおいて保持されている前記受容体結合性タンパク質又は前記同族リガンド標的抗原に結合し、前記受容体結合性タンパク質と前記同族リガンドの間の相互作用を妨害又はブロックするステップ、及び
    （ｃ）細胞表面で発現した受容体結合性タンパク質のレベルを検出するステップを含み、前記結合性分子が、前記オルガネラにおいて前記受容体結合性タンパク質又は前記同族リガンドのいずれかに結合し、それらの相互作用を妨害又はブロックする場合、前記受容体結合性タンパク質が、前記細胞表面で発現し、かつ検出可能であり、前記相互作用を妨害又はブロックする前記結合性分子が選択可能である、前記方法。
  84. 複数の結合性分子をコードする核酸が、細胞に、前記核酸を組み込んだレンチウイルス粒子により導入される、請求項８３に記載の方法。
  85. 選択された結合性分子を細胞から回収又は単離するステップをさらに含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
  86. 複数の結合性分子が、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬドメインライブラリー、遺伝的に多様化したＶＬドメインライブラリー、ＶＨドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化したＶＨドメインライブラリーから選択される、請求項８３〜８５のいずれかに記載の方法。
  87. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分である、請求項８３〜８６のいずれかに記載の方法。
  88. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項８７に記載の方法。
  89. 抗体の結合性断片又は部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、遺伝的に多様化した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、遺伝的に多様化した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. 複数の結合性分子が、抗体ＶＬライブラリー又は遺伝的に多様化したＶＬライブラリーである、請求項８３〜８９のいずれかに記載の方法。
  91. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項８７〜９０のいずれかに記載の方法。
  92. 複数の結合性分子が、抗体ＶＨライブラリー又は遺伝的に多様化したＶＨライブラリーである、請求項８３〜８９のいずれかに記載の方法。
  93. 抗体の結合性断片又はその部分が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項８７〜９０のいずれかに記載の方法。
  94. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項８７又は８８に記載の方法。
  95. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項８７〜９４のいずれかに記載の方法。
  96. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項８７〜９４のいずれかに記載の方法。
  97. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項８７〜９４のいずれかに記載の方法。
  98. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項９７に記載の方法。
  99. 細胞内オルガネラが小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である、請求項８３〜９８のいずれかに記載の方法。
  100. 同族リガンドが、小胞体（ＥＲ）においてリガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされる、請求項８３〜９９のいずれかに記載の方法。
  101. ＥＲ保持配列がＫＤＥＬ（配列番号１）である、請求項１００に記載の方法。
  102. 発現された結合性分子が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体；アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体；アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドに対する受容体；又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体から選択される受容体結合性タンパク質標的抗原に結合する、請求項８３〜１０１のいずれかに記載の方法。
  103. 発現された結合性分子が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質から選択される同族リガンド標的抗原；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０又はＩＬ６を結合する、請求項８３〜１０１のいずれかに記載の方法。
  104. 複数の結合性分子から、細胞表面に発現した標的抗原を結合する結合性分子又はその結合性部分を選択する方法であって、
    細胞内オルガネラ保持シグナルをコードする核酸に作動可能に連結している複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記細胞が、細胞表面で発現可能な標的抗原を発現するステップ、
    前記細胞において、前記保持シグナルを含む複数の結合性分子のうちの１つを発現させるステップであって、前記複数の結合性分子が、前記標的タンパク質に特異的に結合する結合性分子又はその結合性部分を含む場合、前記標的タンパク質が、前記細胞オルガネラにおいて保持されている前記結合性分子又はその結合性部分に結合することを介して前記細胞内オルガネラにおいて保持され、それによって、前記オルガネラからの前記標的タンパク質の排出と、前記細胞表面での前記標的タンパク質の発現との両方を防ぐステップ、及び
    前記細胞表面で発現した前記標的タンパク質のレベルを検出するステップを含み、その結果、前記細胞表面で検出された前記標的タンパク質が、適切な対照と比較して、検出不可能なレベル又は低いレベルであることが、前記細胞における前記結合性分子又はその前記結合性部分の前記標的分子への特異的結合を示し、前記結合性分子又はその前記結合性部分が、前記細胞から選択可能である、前記方法。
  105. 複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸が、細胞に前記核酸を組み込んだレンチウイルス粒子により導入される、請求項１０４に記載の方法。
  106. 選択された結合性分子を細胞から回収又は単離するステップをさらに含む、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  107. 複数の結合性分子が、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬドメインライブラリー、遺伝的に多様化したＶＬドメインライブラリー、ＶＨドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化したＶＨドメインライブラリーから選択される、請求項１０４〜１０６のいずれかに記載の方法。
  108. 結合性分子又はその結合性部分が、抗体又はその結合性断片若しくは部分である、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
  109. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体から選択される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 抗体の結合性断片又は部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、遺伝的に多様化した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、遺伝的に多様化した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 複数の結合性分子が、抗体ＶＬライブラリー又は遺伝的に多様化したＶＬライブラリーである、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
  112. 複数の結合性分子が、抗体ＶＨライブラリー又は遺伝的に多様化したＶＨライブラリーである、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
  113. 結合性分子又はその結合性部分が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
  114. 結合性分子又はその結合性部分が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
  115. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
  116. 抗体が、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、若しくはＩｇＤ抗体、又はそのサブクラスである、請求項１０７〜１１５のいずれかに記載の方法。
  117. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項１０７〜１１６のいずれかに記載の方法。
  118. 抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項１０７〜１１７のいずれかに記載の方法。
  119. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１１８に記載の方法。
  120. 細胞内オルガネラが小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である、請求項１０４〜１１９のいずれかに記載の方法。
  121. 細胞内オルガネラ保持シグナルがＫＤＥＬアミノ酸配列（配列番号１）である、請求項１０４〜１２０のいずれかに記載の方法。
  122. 標的抗原が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体；アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドの受容体；又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体から選択される、請求項１０４〜１２２のいずれかに記載の方法。
  123. 標的抗原が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０又はＩＬ６から選択される、請求項１０４〜１２２のいずれかに記載の方法。
  124. 免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）を修飾することによって、抗体遺伝的多様性又は変動性を生成する方法であって、
    （ａ）１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列に、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列を導入して、１又は２以上の非同一のターゲティング部位配列を前記１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列内で生じさせて、１又は２以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を結合し、それによって、修飾された核酸配列を含むＣＤＲを生成するステップ、及び
    （ｂ）発現したＺＦＮが前記ターゲティング部位配列内の前記修飾されたＣＤＲコード核酸配列を結合し、切断する条件下で、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を含む少なくとも抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は少なくとも抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸を細胞において発現させるステップを含み、前記細胞が、IIS型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結している（ａ）のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインターゲティング部位配列が導入されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列を発現し、前記ＺＦＮによるＤＮＡ切断が、（ａ）の前記修飾されたＣＤＲコード核酸配列内の前記ターゲティング部位配列により決定される、前記方法。
  125. （ａ）において、ＣＤＲをコードする核酸配列が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインから単離され、適切なＤＮＡ構築物に組み込まれる、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡプラスミド、ベクター、又は核酸発現カセットから選択される、請求項１２５に記載の方法。
  127. ＤＮＡ構築物が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、又はその組合せをコードする核酸を含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. １又は２以上の修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列に導入されて、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを産生する、請求項１２４〜１２７のいずれかに記載の方法。
  129. （ａ）において、ＣＤＲをコードする核酸配列が、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードする核酸配列及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列内で含有される、請求項１２４〜１２８のいずれかに記載の方法。
  130. （ｂ）において、修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列を含み、並びに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含む全長抗体内で含有され、かつ得られた核酸配列が、修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む全長抗体をコードする、請求項１２４〜１２９のいずれかに記載の方法。
  131. ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインタンパク質をコードする核酸配列を増幅するステップ、及び前記ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインタンパク質を細胞からクローニングするステップをさらに含む、請求項１２４〜１３０のいずれかに記載の方法。
  132. （ａ）において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１又は２以上、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される、請求項１２４〜１３１のいずれかに記載の方法。
  133. （ａ）において、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される、請求項１２４〜１３２のいずれかに記載の方法。
  134. （ａ）において、２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入される、請求項１２４〜１３３のいずれかに記載の方法。
  135. ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入された２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、配列番号６を含む、請求項１３４に記載の方法。
  136. ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のそれぞれに導入された２つの異なるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列が、合計２４塩基対を含む、請求項１３４又は１３５に記載の方法。
  137. （ｂ）において、II型制限酵素がFokIである、請求項１２４〜１３６のいずれかに記載の方法。
  138. （ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列が、ＶＨドメインのＣＤＲ１内に切断のための第１のＺＦＮ配列、ＶＨドメインのＣＤＲ１内に切断のための第２のＺＦＮ配列、並びにＶＨドメインのＣＤＲ３内に切断のための第１のＺＦＮ配列及びＶＨドメインのＣＤＲ３内に切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される、請求項１２４〜１３７のいずれかに記載の方法。
  139. （ｉ）ＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列が、配列番号７に示されるターゲティング配列及び配列番号８に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及びＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列が、配列番号９に示されるターゲティング配列及び配列番号１０に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及び（ii）ＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列が、配列番号１１に示されるターゲティング配列及び配列番号１２に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及びＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列が、配列番号１３に示されるターゲティング配列及び配列番号１４に示されるＺＦＰ認識配列を含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 構築物がレンチウイルスベクターを含む、請求項１３８に記載の方法。
  141. （ｂ）において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列が、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断のための第１のＺＦＮ配列、ＶＬドメインのＣＤＲ１内に切断のための第２のＺＦＮ配列、並びにＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第１のＺＦＮ配列及びＶＬドメインのＣＤＲ３内に切断のための第２のＺＦＮ配列を含む構築物に導入される、請求項１２４〜１３７のいずれかに記載の方法。
  142. （ｉ）ＣＤＲ１内の切断のための第１のＺＦＮ配列が、配列番号１５に示されるターゲティング配列及び配列番号１６に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及びＣＤＲ１内の切断のための第２のＺＦＮ配列が、配列番号１７に示されるターゲティング配列及び配列番号１８に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及び（ii）ＣＤＲ３内の切断のための第１のＺＦＮ配列が、配列番号１９に示されるターゲティング配列及び配列番号２０に示されるＺＦＰ認識配列を含み、及びＣＤＲ３内の切断のための第２のＺＦＮ配列が、配列番号２１に示されるターゲティング配列及び配列番号２２に示されるＺＦＰ認識配列を含む、請求項１４１に記載の方法。
  143. 構築物がレンチウイルスベクターを含む、請求項１４１に記載の方法。
  144. 全長抗体が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、又はＩｇＥ抗体である、請求項１３０に記載の方法。
  145. 全長抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項１４４に記載の方法。
  146. ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である、請求項１４４又は１４５に記載の方法。
  147. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１４６に記載の方法。
  148. （ｂ）において、細胞がＴ細胞株である、請求項１２４〜１４７のいずれかに記載の方法。
  149. （ｂ）において、細胞がJurkat T細胞株である、請求項１２４〜１４７のいずれかに記載の方法。
  150. （ｃ）細胞において、細胞表面で発現可能であり、（ｂ）の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインにより結合可能な可能性のある標的である受容体タンパク質を発現させるステップ、
    （ｄ）前記細胞において、前記受容体タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、オルガネラにおける前記リガンドの保持、及び前記オルガネラにおける前記受容体タンパク質と前記同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、前記同族リガンドが、リガンドを細胞内オルガネラにおいて保持するための配列で分子的にタグ付けされており、前記同族リガンドが、（ｂ）のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインにより結合可能な可能性のある標的であるステップ、及び
    （ｅ）前記細胞表面で発現した前記受容体タンパク質のレベルを検出するステップをさらに含み、
    前記ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、前記受容体タンパク質又は前記同族リガンドのいずれかに結合し、前記オルガネラにおいてそれらの結合相互作用をブロック又は妨害する場合、前記受容体タンパク質が、前記オルガネラを出て、前記細胞表面で発現され、かつ検出可能であり、及び前記受容体タンパク質とリガンドの相互作用をブロック又は妨害する前記ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインが、前記細胞から回収可能である、請求項１２４〜１４９のいずれかに記載の方法。
  151. 細胞内オルガネラ保持配列が小胞体（ＥＲ）又はゴルジ保持配列である、請求項１５０に記載の方法。
  152. 細胞内オルガネラ保持配列が小胞体（ＥＲ）保持配列である、請求項１５０又は１５１に記載の方法。
  153. ＥＲ保持配列がＫＤＥＬ（配列番号１）である、請求項１５０〜１５２のいずれかに記載の方法。
  154. 細胞表面で発現可能な受容体タンパク質が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体；アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体；アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドの受容体、又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体から選択される、請求項１５０〜１５３のいずれかに記載の方法。
  155. 受容体タンパク質の同族リガンドが、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド、ＧＰ１３０又はＩＬ６から選択される、請求項１５０〜１５４のいずれかに記載の方法。
  156. 細胞において、Ｔａｘ酵素タンパク質及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素タンパク質の１つ又は両方を発現させるステップをさらに含む、請求項１２４〜１５５のいずれかに記載の方法。
  157. リガンド結合性受容体タンパク質の細胞表面での発現を防ぐか、又はノックダウンする方法であって、
    細胞において、リガンド結合性受容体タンパク質を発現させるステップ、
    前記細胞において、前記リガンド結合性受容体タンパク質によって結合され得るリガンドタンパク質を発現させるステップであって、オルガネラにおける前記リガンド結合性受容体タンパク質と前記リガンドタンパク質の相互作用を可能にする条件下で、前記リガンドタンパク質が、細胞内オルガネラにおいて前記リガンドタンパク質を保持するための外因性シグナル配列に融合しているステップ、及び
    細胞表面で発現した前記リガンド結合性受容体タンパク質のレベルを測定するステップを含み、
    前記オルガネラにおいて保持されている前記リガンドタンパク質への前記リガンド結合性受容体タンパク質の結合が、前記オルガネラにおいて前記リガンドタンパク質に結合している前記リガンド結合性受容体タンパク質を同時に保持し、それによって、前記リガンド結合性受容体タンパク質の前記細胞表面発現を防ぐか、又はノックダウンする、方法。
  158. 複数の結合性分子から、細胞表面に発現した受容体結合性タンパク質及び同族リガンドを含む相互作用対のメンバーである標的抗原を結合する結合性分子を選択する方法であって、
    （ａ）前記受容体結合性タンパク質を発現する単一細胞において、
    （ｉ）複数の結合性分子のうちの１つをコードする核酸配列、及び
    （ii）前記受容体結合性タンパク質の同族リガンドをコードする核酸配列
    を共発現させるステップであって、
    細胞内オルガネラにおける発現した結合性分子又は発現した同族リガンドの保持を可能にする条件下で、結合性分子又は前記同族リガンドのいずれかが、前記細胞における（ｉ）又は（ii）の発現の後に細胞内オルガネラにおいて（ｉ）又は（ii）のいずれかを保持するための保持シグナルをコードする核酸配列に作動可能に結合しており、発現した結合性分子が、標的抗原としての前記受容体結合性タンパク質又は前記同族リガンドに結合している場合、このような結合が、前記受容体結合性タンパク質と前記同族リガンドの間の天然の相互作用を妨害、中和、又はブロックし、前記細胞表面での前記受容体結合性タンパク質の発現のために、前記受容体結合性タンパク質を、前記同族リガンドとのその相互作用から開放するステップ、並びに
    （ｂ）前記細胞表面で発現した受容体結合性タンパク質のレベルを検出し、その結果、前記細胞表面での高レベルの受容体結合性タンパク質の発現が、前記細胞内で標的抗原に結合する結合性分子の発現及び選択を示すステップを含む、前記方法。
  159. 複数の結合性分子が、抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した抗体ライブラリー、単一ドメイン抗体ライブラリー、遺伝的に多様化した単一ドメイン抗体ライブラリー、ＶＬドメインライブラリー、遺伝的に多様化したＶＬドメインライブラリー、ＶＨドメインライブラリー、又は遺伝的に多様化したＶＨドメインライブラリーから選択される、請求項１５８に記載の方法。
  160. 結合性分子が、抗体又はその結合性断片若しくは部分である、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
  161. 抗体又はその結合性断片若しくは部分が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、遺伝的に多様化した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、遺伝的に多様化した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）から選択される、請求項１６０に記載の方法。
  162. 結合性分子が、ＶＬドメイン又は遺伝的に多様化したＶＬドメインである、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
  163. 結合性分子が、ＶＨドメイン又は遺伝的に多様化したＶＨドメインである、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
  164. 抗体が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメイン、並びに重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む全長抗体である、請求項１６０に記載の方法。
  165. 抗体がＩｇＧ抗体又はそのサブクラスである、請求項１６４に記載の方法。
  166. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１６５に記載の方法。
  167. 細胞内オルガネラが小胞体（ＥＲ）又はゴルジ体である、請求項１５８〜１６６のいずれかに記載の方法。
  168. 細胞内オルガネラ保持シグナルがＫＤＥＬアミノ酸配列（配列番号１）である、請求項１５８〜１６７のいずれかに記載の方法。
  169. 標的抗原が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体；アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドの受容体；又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体から選択される、請求項１５８〜１６８のいずれかに記載の方法。
  170. 標的抗原が、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０又はＩＬ６から選択される、請求項１５８〜１６８のいずれかに記載の方法。
  171. 修飾された又は非天然に存在する免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む遺伝的多様性又は可動性の抗体を産生する方法であって、
    （ａ）１又は２以上のＣＤＲをコードする核酸配列に、１又は２以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン認識配列を導入して、１又は２以上の非同一のターゲティング部位配列を前記１又は２以上のＣＤＲコード核酸配列内に生じさせて、１又は２以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を結合し、それによって、修飾された核酸配列を含むＣＤＲを生成するステップ、及び
    （ｂ）発現したＺＦＮが前記ターゲティング部位配列内の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を結合し、切断する条件下で、（ａ）の修飾されたＣＤＲコード核酸配列を含む少なくとも抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は少なくとも抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸を細胞において発現させるステップを含み、前記細胞が、IIS型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結している（ａ）のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインターゲティング部位配列が導入されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列を発現し、前記ＺＦＮによるＤＮＡ切断が、（ａ）の前記修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列内の前記ターゲティング部位配列により決定され、前記細胞が、Ｔａｘタンパク質及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）タンパク質の１つ又は両方をコードする核酸をさらに含有する、前記方法。
  172. （ａ）において、ＣＤＲをコードする核酸配列が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインから単離され、適切なＤＮＡ構築物に組み込まれる、請求項１７１に記載の方法。
  173. ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡプラスミド、ベクター、又は核酸発現カセットから選択される、請求項１７２に記載の方法。
  174. ＤＮＡ構築物が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、又はその組合せをコードする核酸を含む、請求項１２３に記載の方法。
  175. １又は２以上の修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする核酸配列に導入されて、１又は２以上の修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを産生する、請求項１７１〜１７４のいずれかに記載の方法。
  176. （ａ）において、ＣＤＲをコードする核酸配列が、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードする核酸配列及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列内で含有される、請求項１７１〜１７５のいずれかに記載の方法。
  177. （ｂ）において、修飾されたＣＤＲをコードする核酸配列が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列を含み、かつ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含む全長抗体内で含有され、得られた核酸配列が、修飾されたＣＤＲを含むＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む全長抗体をコードする、請求項１７１〜１７６のいずれかに記載の方法。
  178. （ｂ）において、Ｔａｘ及びＴｄＴをコードする核酸配列が、適切なＤＮＡ構築物に組み込まれ、そこから共発現される、請求項１７１〜１７７のいずれかに記載の方法。
  179. （ｂ）において、Ｔａｘ及びＴｄＴをコードする核酸配列が、別々の適切なＤＮＡ構築物に組み込まれ、そこから発現される、請求項１７１〜１７７のいずれかに記載の方法。
  180. 細胞内で細胞表面に発現した結合性タンパク質とその同族リガンドの間の相互作用をブロック、阻害、又は妨害する低分子をスクリーニング又は選択する方法であって、
    同一の細胞において、前記細胞の表面で発現可能な結合性タンパク質、及び前記結合性タンパク質の同族リガンドを発現させるステップであって、前記同族リガンドが、前記オルガネラにおける前記リガンドの保持、及び前記オルガネラにおける前記結合性タンパク質と前記同族リガンドの相互作用を可能にする条件下で、細胞内オルガネラにおいて前記リガンドを保持するための配列で分子的にタグ付けされているか、又はそれと融合しており、その結果、前記結合性タンパク質が、タグ付けされたリガンドに結合すると、細胞オルガネラ内に保持されるステップ、
    それが前記細胞内オルガネラにおいて保持されている前記結合性タンパク質又は前記リガンドタンパク質のいずれかを結合、会合、又は相互作用するかどうかを決定するための低分子を前記細胞に導入するステップ、並びに
    前記細胞表面で発現した前記結合性タンパク質のレベルを検出するステップを含み、前記低分子が前記結合性タンパク質又は前記リガンドのいずれかに結合し、前記オルガネラにおける前記結合性タンパク質とそのリガンドの相互作用をブロック、阻害、又は妨害する場合、それによって、前記結合性タンパク質が、前記オルガネラを通過し、前記細胞表面で発現し、検出可能となり、前記低分子が、前記結合性タンパク質と同族リガンドの相互作用をブロック、阻害、又は妨害する分子として選択される、前記方法。
  181. 低分子が、低分子化学化合物、低分子量有機化合物、薬物、又は化学剤から選択される、請求項１８０に記載の方法。
  182. 低分子が、結合性タンパク質及び／又はリガンドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
  183. 低分子量有機化合物の分子量が、５００ダルトン以下であるか、又は９００ダルトン未満である、請求項１８０〜１８２のいずれかに記載の方法。
  184. リガンドが、ＥＲ又はゴルジ体における保持のための保持配列で融合されるか、又はタグ付けされる、請求項１８０〜１８３のいずれかに記載の方法。
  185. 保持配列が、ＥＲにおける保持のためＫＤＥＬ（配列番号１）を含む、請求項１８０〜１８４のいずれかに記載の方法。
  186. 結合性タンパク質が細胞表面で発現可能な受容体タンパク質である、請求項１８０〜１８５のいずれかに記載の方法。
  187. 結合性タンパク質が、成長因子受容体、ホルモン受容体、酵素受容体、Ｆｃ受容体、神経伝達物質受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、リンホカイン受容体、インターロイキン受容体、腫瘍抗原受容体、細胞認識受容体若しくは刺激性受容体；アポリポタンパク質受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１Ｒ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦＲ、ｂＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦｌｔＲ、ＴＧＦＲ、ＴＧＦＲ−α−１、ＴＧＦＲ−β、ＴＮＦＲ−α、ＢＤＮＦＲ、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫＲ、ＢＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＧＭＦＲ、ＮＴ３Ｒ、ＮＴ５Ｒ、ＨＡＲＰＲ／プレイオトロフィンＲ、ＴＩＥ受容体、Ｅｐｈ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＯＲ受容体、ＬＴＫ受容体、ＡＸＬ受容体、ＲＥＴ受容体、又はＴＯＬＬ様受容体から選択される受容体ファミリーの受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、メラトニン受容体、アドレナリン受容体、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、又はチロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチドの受容体；又はＧＰ１３０若しくはＩＬ６受容体から選択される細胞表面で発現可能な受容体タンパク質である、請求項１８０〜１８６のいずれかに記載の方法。
  188. 受容体タンパク質のリガンドが、成長因子、ホルモン、酵素、代謝酵素、神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍抗原、腫瘍抑制抗原、多剤耐性タンパク質、凝固因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、栄養因子、細胞認識分子若しくは刺激性分子、アポリポタンパク質、ＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＢＤＮＦ、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＲＫ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＭＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、ＴＩＥタンパク質、Ｅｐｈタンパク質、ＤＤＲタンパク質、ＲＯＲタンパク質、ＬＴＫタンパク質、ＡＸＬタンパク質、ＲＥＴタンパク質、ＴＯＬＬ様タンパク質；ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、メラトニンから選択されるホルモン；アドレナリンタンパク質、アミリン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コルチコトロピン、エリスロポエチン、エンドセリン、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン、レプチン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レンニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモンから選択されるペプチド；ＧＰ１３０又はＩＬ６から選択される、請求項１８０〜１８７のいずれかに記載の方法。
  189. 結合性分子が受容体分子であり、低分子が受容体機能に影響する、請求項１８０〜１８８のいずれかに記載の方法。
  190. 結合性分子が受容体タンパク質であり、受容体の機能が低分子化合物の添加後に測定される、請求項１８０〜１８９のいずれかに記載の方法。
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