ES2863473T3

ES2863473T3 - Acido hialurónico funcionalizado

Info

Publication number: ES2863473T3
Application number: ES17761924T
Authority: ES
Inventors: Agnese Magnani; Cristina Nativi; Gemma Leone; Stefania Lamponi; Marco Consumi; Marco Fragai; Veronica Baldoneschi; Barbara Richichi; Oscar Francesconi
Original assignee: CONSORZIO INTERUNIVERSITARIO NAZ PER LA SCIENZA E TECNOLOGIA DEI MATERIALI; Degli Studi Di Siena, University of; Universita degli Studi di Siena; Universita degli Studi di Firenze
Current assignee: CONSORZIO INTERUNIVERSITARIO NAZ PER LA SCIENZA E TECNOLOGIA DEI MATERIALI; Degli Studi Di Siena, University of; Universita degli Studi di Siena; Universita degli Studi di Firenze
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2021-10-11
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: EP3496761B1; WO2018029588A1; IT201600083975A1; EP3496761A1

Abstract

Compuesto, derivado del AH, con la fórmula (I): **(Ver fórmula)** donde n es entre 450 y 2500; R es **(Ver fórmula)** donde R1 es H, O-Alk, OH, F, Ph, para-C6H4-F, OPh, CH2Ph; R2 es H, CH2OH, CH2SH, CH2CH2SMe, CH(CH3)2, CH(CH3)OH; cuando R2 ≠ H, el estereocentro tiene configuración absoluta (R); X es una cadena de alquilo con un número de átomos de entre 3 y 12 conteniendo opcionalmete un triple enlace C≡C o uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, S, O.

Description

DESCRIPCIÓN

Ácido hialurónico funcionalizado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere al campo de los derivados del ácido hialurónico (AH). En concreto, se refiere a moléculas derivadas del ácido hialurónico por conjugación con moléculas pequeñas inhibidoras de metaloproteinasas de matriz (MMP). Los conjugados de la invención resultan útiles para fines médicos y cosméticos.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] El ácido hialurónico (AH) es un polisacárido lineal que consiste en la repetición del disacárido compuesto por ácido D-glucurónico (GLCA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc).

[0003] Este forma parte, junto con otros similares, de un grupo de polisacáridos que se denominan polisacáridos del tejido conectivo, mucopolisacáridos o glicosaminoglicanos. El AH es ubicuo entre los vertebrados, y se expresa abundantemente en la matriz extracelular de todos los tejidos, así como en la superficie de las células e incluso dentro de estas. Sus concentraciones oscilan entre 0,01-0,1 pg g-1 en sangre y 1400-3600 pg g-1 en el líquido sinovial. La cantidad de AH en los tejidos conectivos blandos oscila entre 8,5-18 pg g-1 en la linfa del conducto torácico y 140-338 pg g-1 en el humor vitreo. Sus peculiares propiedades físicas y mecánicas contribuyen a mantener la hidratación de los tejidos (por ejemplo, en el estroma de la córnea), a su lubricación (articulaciones) y a la mediación de la difusión de solutos a través del espacio extracelular. A pesar de su estructura química simple, el AH realiza numerosas funciones moleculares que no solo contribuyen a la caracterización estructural y fisiológica de los tejidos, sino también a la modulación del comportamiento celular durante la morfogénesis, la remodelación tisular y la inflamación. Las diversas funciones biológicas del AH se manifiestan a través de interacciones complejas con los componentes de la matriz que contribuyen a la organización y al mantenimiento de la integridad estructural de la matriz extracelular y pericelular. Además, la interacción del AH con receptores específicos presentes en la superficie celular permite la activación de muchas funciones celulares que contribuyen al desarrollo y reparación de los tejidos, a la modulación de la inflamación y al avance de la metástasis tumoral. La biocompatibilidad y la capacidad de biodegradación inherentes, junto con la susceptibilidad a modificaciones químicas, han hecho que el AH resulte especialmente atractivo para el desarrollo de biomateriales con un amplio y prometedor potencial clínico. La función particular de lubricante natural y las excelentes propiedades de retención de agua hacen que el AH sea un compuesto adecuado para su uso en productos oftálmicos y musculoesqueléticos, y también como relleno para la reducción de pequeñas arrugas provocadas por la degradación local del colágeno.

[0004] En el ojo, el AH se puede encontrar en el cristalino, en las glándulas lagrimales, en el epitelio de la córnea, en el humor vítreo y en la conjuntiva. El AH tiene la función de estimular la migración de células epiteliales y, por lo tanto, desempeña un papel en la curación de heridas en la córnea. De hecho, el AH se ha desarrollado tanto para la recuperación del cristalino como para la protección del endotelio corneal frente a lesiones mecánicas durante operaciones de cataratas. Además, se ha demostrado cómo se asocia también el AH a un efecto protector frente a daños oxidativos a través de la inhibición de radicales libres. Por último, el AH incrementa la humectabilidad de la córnea debido a sus propiedades higroscópicas, resultando útil, por lo tanto, en las lágrimas artificiales para el tratamiento de síntomas del ojo seco. El tratamiento del síndrome del ojo seco también puede estar asociado al uso de lentes de contacto terapéuticas. Estas, que consisten principalmente en hidrogeles, pueden prepararse de tal manera que se posibilite la liberación controlada de AH a lo largo del tiempo.

[0005] La osteoartritis, según la OMS (Organización Mundial de la Salud), afecta al 25 % de los adultos mayores de 25 años. Se trata de una enfermedad crónica degenerativa y discapacitante, que afecta gravemente a la calidad de vida, a la posibilidad de relacionarse de aquellos que se ven afectados por esta y a los costes sanitarios del sistema nacional de salud. La osteoartritis deriva en la alteración progresiva de los componentes anatómicos que forman las articulaciones, puede afectar a las vértebras (columna vertebral) y a las articulaciones de las extremidades, y se caracteriza por una pérdida del cartílago articular, que se sustituye por tejido óseo (no elástico) nuevo; esto causa dolor y limitación del movimiento. Actualmente, es bien sabido que, en pacientes con osteoartritis, existe una notable reducción de las capacidades viscoelásticas del líquido sinovial. La terapia intraarticular con AH ha tenido un gran éxito durante la última década, y muchos pacientes tratados de este modo afirman sentir un alivio significativo en sus problemas de huesos y articulaciones. El éxito de esta terapia de infiltración radica principalmente en las destacadas propiedades viscoelásticas del ácido hialurónico, que reemplaza la lubricación y amortiguación del líquido sinovial.

[0006] Para fines cosméticos, el uso de AH depende de su estructura química, que permite una elevada solvatación (formación de puentes de hidrógeno con muchas moléculas de agua). Debido a esta característica, si se aplica en la piel, es capaz de mantener el nivel correcto de hidratación incluso en presencia de una humedad externa muy baja. Esta acción humectante influye positivamente en las propiedades de la queratina, que se vuelve más flexible y elástica.

[0007] El AH lineal aplicado sobre la piel o inyectado (en el caso de rellenos), o bien infiltrado de manera intraarticular, como sucede en el que está presente naturalmente en la dermis y en las articulaciones, se degrada enzimáticamente en un corto período de tiempo (horas/días). En concreto, la degradación del AH se produce por la enzima hialuronidasa. Para ralentizar este proceso fisiológico, el AH suele estar modificado químicamente por reticulación mediante un tratamiento con diversos tipos de compuestos (divinilsulfona, BDDE, epóxidos, etc.). En estos casos, hablamos de AH reticulado. En esta forma, los enlaces glicosídicos p-1,4, cuya ruptura está mediada por hialuronidasas, son menos accesibles, por lo que se ralentiza el proceso de degradación de la cadena de polisacáridos. Los tiempos de degradación en estos casos son de hasta unas cuantas semanas. Evidentemente, cuanto mayor sea la reticulación del AH, mayor será el tiempo para su completa degradación. La estabilidad en la hialuronidasa también se ha obtenido funcionalizando posiciones concretas de la unidad repetitiva del AH también con resultados satisfactorios, pero a menudo acompañados por la alteración de las características físicas (p. ej., reológicas) y de hidratación del producto funcionalizado. [T. Segura et al. Biomaterials, 2005, 26, 359].

[0008] Entre las causas de las enfermedades anteriormente mencionadas (oculares, osteoarticulares) y también del envejecimiento de la piel hay estados «inflamatorios» que, aunque pueden tener las más diversas etiologías, todos ellos están acompañados por la activación anormal de metaloenzimas específicas, las metaloproteinasas de matriz (MMP). Las MMP son una familia de 25 peptidasas de Zn, muy similares desde el punto de vista estructural y funcional, que, en caso de estar hiperexpresadas, derivan en la degradación descontrolada de sustratos proteicos específicos. Entre estas MMP, la MMP-1, MMP-9 y MMP-13 atacan y rompen los enlaces peptídicos de colágeno y gelatina (MMP-9) presentes en el tejido conectivo, a nivel ocular y en los huesos. De hecho, se hallan concentraciones elevadas de estas MMP en sujetos con artritis reumatoide (M. Takeshita et al. Arthritis Res Ther 2016, 18, 112, doi: 10.1186/s13075-016-1013-2), osteoartritis (P. Li et al. Mol Med Rep, 2016, doi: 10.3892/mmr.2016.5419) y enfermedades oculares (N.L. Lanza et al. Ocul Surf, 2016 14, 189, doi: 10.1016/j.jtos.2015.10.004; F. Bian et al. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2015, 56, 4908, doi: 10.1167/iovs.15-16631). Los procesos «inflamatorios», que están acompañados por una concentración elevada y descontrolada de MMP, provocan la degradación sin control de sustratos proteicos tales como el colágeno, pero también provocan una mayor degradación del AH.

[0009] En este contexto, en los últimos treinta años, se han sintetizado y probado inhibidores de MMP con una elevada afinidad hacia estas metaloenzimas. No obstante, solo unos pocos de estos han pasado a ensayos clínicos, y con escaso éxito. Las principales limitaciones de estos inhibidores son, de hecho, su escasa solubilidad en agua (y, por lo tanto, su baja biodisponibilidad) y su baja selectividad. (J.M. Cathcart y J. Cao Front Biosci, 2015, 20, 116) Recientemente, se ha desarrollado un grupo de inhibidores nanomolares para algunas MMP, perfectamente solubles en agua y, por lo tanto, con una biodisponibilidad mucho mejor en comparación con los que se conocían anteriormente. (C. Nativi et al. en Carbohydrate in Drug Design and Discovery, 2015, pág. 242-252, Eds. JJ Barber, F.J. Canada, S. Martin-Santamaria, Royal Society of Chemistry; B. Richichi et al. Chemistry Eur J 2016, 22, 1714; Bartoloni et al. Chem. Eur. J. 2013, 19, 1896 - 1902). Estas son pequeñas moléculas con actividad inhibidora demostrada frente a MMP implicadas en el síndrome del ojo seco (MMP-2, Mm P-9), en procesos inflamatorios a nivel osteoarticular (MMP-3, MMP-12, MMP-13) y en la formación de arrugas (MMP-1).

[0010] El documento EP1082963 da a conocer conjugados de ácido hialurónico con inhibidores de MMP a base de triptófano.

[0011] Por consiguiente, resulta evidente la necesidad de tener un AH que sea estable a la hialuronidasa y mantenga la fluidez necesaria para garantizar su inyectabilidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0012] La presente invención soluciona los problemas anteriormente expuestos con un derivado del AH funcionalizado con inhibidores de MMP específicos, soluble en agua.

[0013] El objeto de la presente invención es un compuesto, derivado del AH, con la fórmula (I):

donde

n es entre 450 y 2500;

R es:

donde

Ri es H, O-Alk, OH, F, Ph, para-CsH4-F, OPh, CH²Ph;

R²es H, CH²OH, CH²SH, CH²CH²SMe, CH(CH3)2, CH(CH3)OH;

cuando R²^ H, el estereocentro tiene configuración absoluta (R);

X es una cadena de alquilo con un número de átomos de entre 3 y 12 que contiene opcionalmete un triple enlace CeC o uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, S, O.

[0014] Este nuevo derivado del AH, al mismo tiempo que conserva todas las características del AH no funcionalizado (viscosidad, inyectabilidad, no toxicidad), es más estable a las hialuronidasas y es capaz de inhibir MMP específicas hiperexpresadas en enfermedades o imperfecciones para las que el uso del AH está ya muy extendido.

[0015] Por lo tanto, el hecho de controlar/reducir estados inflamatorios en los que hay MMP específicas sobreexpresadas en enfermedades o imperfecciones para las que el uso del AH está ya muy extendido tiene una doble ventaja: 1) reducir el evento inflamatorio (causa de la degradación del colágeno) y 2) ralentizar la degradación tanto del AH natural como del AH administrado mediante infiltración. Puesto que la rotura del AH produce fragmentos del mismo polisacárido con un menor peso molecular y que, a su vez, son proinflamatorios, el hecho de reducir la degradación del Ah infiltrado tendría a su vez el efecto beneficioso de eliminar una causa adicional de inflamación en el sujeto tratado. Un objeto de la presente invención es también un compuesto según se ha descrito arriba para su uso como un medicamento; en concreto, para el tratamiento del síndrome del ojo seco y de procesos inflamatorios a nivel osteoarticular.

[0016] Un objeto de la presente invención también es el uso cosmético de un compuesto según se ha descrito arriba, estando destinado dicho uso en particular para imperfecciones de la piel provocadas por el envejecimiento, tales como arrugas.

[0017] Un objeto de la presente invención es también una composición farmacéutica o cosmético inyectable, comprendiendo dicha composición un compuesto según se ha descrito arriba y al menos otro ingrediente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o cosmético.

[0018] Un objeto de la presente invención es también un método para la preparación de un compuesto según se ha descrito anteriormente, comprendiendo dicho método la puesta en contacto del ácido hialurónico con un compuesto con la fórmula (II)

donde R i, R ²y X son según se ha descrito anteriormente

en presencia de reactivos de acoplamiento adecuados para la formación de un enlace amida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0019] Alk hace referencia a un residuo alquilo que contiene de 1 a 4 átomos de C saturado lineal o ramificado; preferiblemente, Alk es Me, Et, Pr.

[0020] Para los fines de la presente invención, es preferible utilizar un AH que tenga un peso molecular medio de 180 200 KDa o 1000 KDa.

[0021] Un compuesto de acuerdo con la invención puede mostrar un grado de funcionalización de entre un 1 % y un 100 % de las unidades repetitivas totales del mismo.

[0022] La cadena de alquilo/heteroalquilo X puede ser lineal o ramificada, saturada o insaturada; preferiblemente, es lineal.

[0023] Preferiblemente, de acuerdo con la presente invención, X es -(CH²V ; -(OCH²CH²)m-O-, -(NHCH²CH²)m-NH-; -(CH²)m-CEC-(CH²)m- donde n es un número entero de entre 3 y 12 y m es un número entero de entre 1 y 3. Más preferiblemente, X es -(CH²)s-, -OCH²CH²O-, -NHCH²CH²NH-; -(CH²)²-CeC-(CH²)²-.

[0024] Preferiblemente, R¹es OMe.

[0025] Preferiblemente, R²es H o CH²OH.

[0026] Preferiblemente, de acuerdo con la presente invención, R es

[0027] Preferiblemente, el proceso de preparación de un compuesto de acuerdo con la invención tiene lugar en fase homogénea.

[0028] Preferiblemente, en el proceso de preparación de un compuesto de acuerdo con la invención, el compuesto con la fórmula (II) se utiliza en una relación molar de 1:1 con respecto a las unidades repetitivas de AH (AH^ur).

[0029] Preferiblemente, en el proceso de preparación de un compuesto de acuerdo con la invención, los reactivos de acoplamiento se utilizan en una relación molar de 10:1 con respecto a las unidades repetitivas de AH (AH^ur).

[0030] Preferiblemente, en el proceso de preparación de un compuesto de acuerdo con la invención, se utilizan clorhidrato de 1-etil-3-3(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivos de acoplamiento.

[0031] Preferiblemente, los compuestos con la fórmula (II) utilizados en el proceso de acuerdo con la invención son:

[0032] La presente invención se entenderá mejor a la luz de las siguientes formas de realización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0033]

FIG. 1 - Espectros IR de: A) AH (gris); b) conjugado inhibidor de MMP-AH (negro);

FIG. 2 - muestra el porcentaje de fibroblastos NIH3T3 vitales 24 horas después del contacto con las muestras de ensayo. Los resultados son el promedio de tres experimentos repetidos en cinco réplicas;

FIG. 3 - Valores de absorbancia medidos para inhibidor de MMP-AH y AH para un tiempo de digestión de 3 horas con la enzima hialuronidasa;

FIG. 4 - Viabilidad de células corneales primarias humanas tras el contacto con las muestras de ensayo y sometidas a flujo de aire continuo durante 0 y 30 minutos. Cada muestra se analizó por triplicado. Medio: células no sometidas a flujo de aire; PBS: células en contacto con PBS durante 20 minutos y expuestas después a flujo de aire durante 0 y 30 minutos; OPTOyal®A: células en contacto con la lágrima artificial durante 20 minutos y expuestas después a flujo de aire durante 0 y 30 minutos; inhibidor de MMP-AH: células en contacto con ácido hialurónico funcionalizado con inhibidor de MMP durante 20 minutos y expuestas después a flujo de aire durante 0 y 30 minutos.

PARTE EXPERIMENTAL EJEMPLO 1 - Preparación del inhibidor 2

[0034]

[0035] A una solución de clorhidrato de H-D-Ser(tBu)-OMe (2 g, 9,45 mmol) en CH²Cl²(20,0 ml) se le añadió trietilamina (3,95 ml, 28,35 mmol) a 0 0C. Tras 30' a temperatura ambiente, la mezcla se volvió a enfriar a 0 0C y se añadieron DMAP (0,115 g, 0,94 mmol) y cloruro de 4-metoxibencenosulfonil (1,950 g, 9,45 mmol). Tras 4 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con CH²Cl²(300 ml) y se lavó con una solución saturada de Na²SO⁴(3 x 30 ml) y con una solución saturada de NaCl (2 x 30 ml). La fase orgánica se secó sobre Na²SO⁴, se filtró y se concentró para obtener el compuesto 3 como un sólido amarillo (3,210 g, 99 %). M.p.: 65-670C; ESI-MS 344,14 [M-H] ^-; RMN ¹H (500 MHz, CDCL): 57,79-7,76 (parte AA' de un sistema AA'MM', J^am = 4,7 Hz, 2H), 6,96-6,93 (parte MM' de un sistema AA'MM', J^ma = 4,7 Hz, 2H), 5,39-5,38 (bs, 1H), 4,08-4,05 (m, 1H, CHCH²OtBu), 3,85 (s, 3H, PhOCH^a), 3,68 (parte A de un sistema ABX, J^ab = 8,9 Hz, J^ax = 3,2 Hz, CHCH ^rOtBu), 3,55 (s, 3H, COOCH³), 3,52 (parte B de un sistema ABX, J^ba = 8,9 Hz, J^bx = 3,6 Hz, CHCH²OtBu), 1,07 (s, 9H, tBu). RMN ¹³C (125 MHz, CDCl^s): 5170,3 (Cq), 162,9 (Cq), 131,9 (Cq), 129,3 (CH Ar), 114,1 (CH Ar), 73,6 (Cq), 63,0 (CHCH²OtBu), 56,3 (CHCH²OtBu), 55,6 (PhOCH^s), 52,4 (COOCH³), 27,2 (tBu).

[0036] A una solución de 3 (0,700 g, 2,03 mmol), 6-(Boc-amino)-1-hexanol (0,530 g, 2,44 mmol) y PPh³(0,640 g, 2,44 mmol) en THF anhidro (36 ml) se le añadió lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (0,480 ml, 2,44 mmol). Tras 18 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró y el producto crudo se dispersó en una mezcla 8:1 entre éter de petróleo y acetato de etilo. La dispersión se filtró y el sólido se purificó mediante cromatografía flash sobre gel de sílice (proporción 40:1 entre CH²Cl²y acetona) para obtener 4 como un sólido blanco vitreo (0,922 g, 83 %). [a]^D25+15,17 (c 0,6, CHCl³); ESI-MS 567,20 [M+Na]⁺; RMN ¹H (500 MHz, CDCL): 57,81-7,78 (parte AA' de un sistema AA'MM', J^am = 9,0 Hz, 2H), 6,97-6,93 (parte MM' de un sistema AA'MM', J^ma = 9,0 Hz, 2H), 4,67 (t, J2,ⁱ = 5,3 Hz, 1H, H-2), 4,56-4,50 (bs, 1H, NH), 3,88 (s, 3H, PhOCH³), 3,77 (d, J ⁱ,2 = 5,4 Hz, 2H, H-1), 3,61 (s, 3H, COOCH³), 3,30-3,19 (m, 2H, CH²N), 3,11-3,09 (m, 2H, CH²N), 1,73-1,56 (m, 2H, CH²CH²N), 1,46 (s, 11H, tBu, CH²CH²N), 1,34-1,20 (m, 4H, H-5, H-6), 1,14 (s, 9H, Boc). RMN ¹³C (125 MHz, CDCl³): 5 170,1 (Cq), 162,7 (Cq), 156,0 (Cq), 132,1 (Cq), 129,6 (CH Ar), 113,8 (CH Ar), 61,5 (C-1), 60,2 (C-2), 55,6 (PhOCH^a), 52,0 (COOCH³), 46,8 (CH²N), 40,5 (CH²N), 30,5 (CH²CH²N), 30,0 (CH²CH²N), 28,4 (tBu), 27,3 (Boc), 26,6-26,5 (C-5, C-6).

Compuesto 5

[0037] A una solución de 4 (0,700 g, 1,29 mmol) en THF (15 ml) se le añadió una solución acuosa de LÍOH-H²O 1 M (3,87 ml). Tras 2 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se acidificó con ácido acético glacial hasta pH 5 y se concentró. El producto crudo (0,676 g) se utilizó en la reacción posterior. A una solución en bruto de DMF anhidro (1,5 ml) se le añadió una solución de t Bt U (0,405 g, 1,26 mmol) y NMM (0,153 ml, 1,39 mmol) en DMA anhidro (1 ml). Tras 15’ a temperatura ambiente, se añadió una suspensión de BnONH²-HCl (0,302 g, 1,89 mmol) y NMM (0,228 ml, 2,08 mmol) en DMF anhidro (1 ml). Tras 18 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía flash sobre gel de sílice (proporción 38:1 entre CH²Cl²y acetona) para obtener 5 como un sólido blanco vitreo (0,227 g, 58 %). ESI-MS 658,23 [M+Na]⁺; RMN ¹H (500 MHz, CDCl^s): 5 7,82-7,79 (parte AA' de un sistema AA'MM', J^am = 8,9 Hz, 2H), 7,44-7,35 (m, 5H, Bn), 6,97-6,93 (parte MM' de un sistema AA'MM', J^ma = 8,9 Hz, 2H), 4,94 4,89 (m, 2H, CH²Ph), 4,58-4,49 (bs, 1H, NH), 4,35 (at, 1H, H-2), 3,86 (s, 3H, PhOCH^s), 3,68 (parte A de un sistema ABX, J^ab = 9,8 Hz, J^ax = 6,4 Hz, 1H, H-1), 3,57 (parte B de un sistema ABX, J^ba = 9,8 Hz, J^bx = 7,7 Hz, 1H, H-1), 3,22 3,12 (m, 2H, CH²N), 3,11 -3,04 (m, 2H, CH²N), 1,66-1,51 (m, 2H, CH²CH²N), 1,45-1,32 (m, 11H, tBu, CH²CH²N), 1,32-1,21 (m, 4H, H-5, H-6), 1,02 (s, 9H, Boc). RMN ¹³C (125 MHz, CDCl^s): 5167,4 (Cq), 162,9 (Cq), 156,0 (Cq), 135,2 (Cq), 129,7 (CH Ar), 129,1 (CH Ar), 128,7 (CH Ar), 128,6 (CH Ar), 113,9 (CH Ar), 59,0 (C-1), 58,4 (C-2), 55,7 (PhOCH^s), 45,5 (CH²N), 40,4 (CH²N), 30,0 (CH²CH²N), 29,9 (CH²CH²N), 28,5 (tBu), 27,4 (Boc), 26,5-26,2 (C-5, C-6).

A una solución de 5 (0,105 g, 0,165 mmol) en una proporción 70:1 entre THF y H²O (6 ml) se le añadió entre un 10 % y un 50% de Pd/C en H²O (0,070 g, 0,03 mmol). Tras 10 ciclos de vacío/H², la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 4 h. Tras 4 h, la mezcla de reacción se filtró sobre algodón para obtener 6 como un sólido marrón vitreo (0,080 g, 94 %). ESI-MS 544,27 [M-H]^-; RMN ¹H (500 MHz, CD³OD): 57,81-7,80 (parte AA' de un sistema AA'MM', J^am= 8,7 Hz, 2H), 7,08-7,06 (parte MM' de un sistema AA'MM', J^ma = 8,7 Hz, 2H), 4,58-4,49 (bs, 1H, NH), 4,33 (at, 1H, H-2), 3,89 (s, 3H, PhOCH³), 3,69 (at, 1H, H-1), 3,46-3,40 (m, 2H, H-1, H-3), 3,26-3,20 (m, 1H, H-3), 3,03 (t, J^s,^j = 6,9 Hz, 2H, H-8), 1,73 1,58 (m, 2H, H-4), 1,45 (as, 11H, tBu, H-7), 1,35-1,23 (m, 4H, H-5, H-6), 1,10 (s, 9H, Boc). RMN ¹³C (125 MHz, CD³OD): 5 167,1 (Cq), 162,2 (Cq), 157,2 (Cq), 131,8 (Cq), 129,3 (CH Ar), 113,8 (CH Ar), 59,6 (C-1), 57,7 (C-2), 54,8 (PhOCH³), 45,2 (C-3), 39,8 (C-8), 30,2 (C-4), 29,5 (C-7), 27,4 (tBu), 26,2 (Boc), 26,2-26,1 (C-5, C-6).

Compuesto 2

[0038] A una solución de 6 (0,070 g, 0,13 mmol) en CH²Cl²(2 ml) se le añadió TFA (0,392 ml, 5,12 mmol). Tras 18 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró hasta obtener la sal trifluoroacética de 2 como un sólido marrón vitreo (0,064 g, 99 %). ESI-MS 390,83 [M+H]⁺; RMN ¹H (500 MHz, CD³OD): 5 7,82-7,80 (parte AA' de un sistema AA'MM', J^am = 8,9 Hz, 2H), 7,09-7,07 (parte MM' de un sistema AA'MM', J^ma = 8,9 Hz, 2H), 4,30 (t, J21 = 7,1 Hz, 1H, H-2), 3,89 (s, 3H, PhOCH³), 3,88-3,83 (m, 1H, H-1), 3,60-3,56 (m, 1H, H-1), 3,48-3,42 (m, 1H, H-3), 3,27-3,21 (m, 1H, H-3), 2,93 (t, J^b,7 = 7,6 Hz, 2H, H-8), 1,73-1,64 (m, 4H, H-4, H-7), 1,44-1,28 (m, 4H, H-5, H-6). RMN ¹³C (125 MHz, CD³OD): 5163,3 (Cq), 131,6 (Cq), 129,2 (CH Ar), 113,9 (CH Ar), 59,6 (C-1), 58,5 (C-2), 54,8 (PhOCH^s), 44,9 (C-3), 39,2 (C-8), 29,9 (C-4), 26,9 (C-7), 25,7-25,3 (C-5, C-6).

EJEMPLO 2 - Funcionalización de hialuronato de sodio en fase homogénea con moléculas pequeñas inhibidoras de MMP [0039] Se solubilizaron 0,1 g de sal sódica de ácido hialurónico (MW^{u r}= 401) en 100 ml de agua destilada, la solución se mezcló con agitación. Tras 3 minutos de agitación enérgica, se añadieron los siguientes reactivos: clorhidrato de 1 -etil-3-3(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (478 mg) y N-hidroxi-succinimida (NHS) (287 mg) y molécula inhibidora de MMP 2 (90 mg).

[0040] La Tabla 1 muestra las relaciones molares entre los reactivos utilizados.

[0041] La reacción se dejó a 25 0C con agitación durante 2 h; después, se añadió etanol absoluto (400 ml) y la solución se dejó a 4 0C O/N. El precipitado se recubrió y se disolvió en 100 ml de agua destilada; la solución resultante se dializó durante 48 h, después se congeló y se liofilizó.

Tabla 1. Relaciones molares del polisacárido y los reactivos utilizados

EJEMPLO 3 - Caracterización química del conjugado inhibidor de MMP-AH obtenido a partir del ejemplo 2 Análisis de IR

[0042] El compuesto obtenido de acuerdo con el ejemplo 2, purificado y secado, se analizó mediante espectroscopia infrarroja utilizando un espectrómetro FT-IR (modelo Thermo Nicolet 5700) equipado con un accesorio de ATR (reflectancia total atenuada) con cristal de germanio como elemento de reflexión interna.

[0043] Las condiciones experimentales de adquisición de espectros IR fueron las siguientes:

número de exploraciones: 256;

resolución: 4,0 cm-1;

energía láser: 0,46 W;

apodización: Happ-Genzel;

corrección de fondo: no.

[0044] Los espectros infrarrojos del AH (gris) y del AH funcionalizado con inhibidor de MMP-AH (negro) se muestran en la figura 1. Los principales números de onda observados en los espectros se indican en la Tabla 2 junto con sus asignaciones.

Tabla 2. Principales números de onda observados en los espectros IR del polisacárido AH nativo y funcionalizado y su asignación relativa.

EJEMPLO 4 - Caracterización biológica

Ensayo de citotoxicidad

Cultivos de fibroblastos

[0045] La citotoxicidad del derivado inhibidor de MMP-AH de acuerdo con la invención se analizó utilizando fibroblastos inmortalizados de ratón (NIH3T3) cultivados en matraces de poliestireno con DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementado con suero fetal bovino al 10 % (v/v) (Sigma Chemicals Co., EE. UU.), L-glutamina 200 mM (Sigma Chemicals Co., EE. UU.) y 5 mg/ml de penicilina-estreptomicina (Sigma Chemicals Co., EE. UU.). Los fibroblastos se incubaron a 37 0C en una atmósfera que contenía un 5 % de CO²hasta alcanzar un 80 % de confluencia celular. Posteriormente, las células se desprendieron del matraz y se separaron entre sí utilizando una solución al 0,25 % v/v de tripsina estéril en EDTA al 0,05 % (Sigma Chemicals Co., EE. UU.) y se volvieron a suspender en medio completo. Ejecución del ensayo

[0046] En cada pocillo de una placa de 24 pocillos para cultivo celular se colocó 1 ml de una suspensión que contenía 8x104 células/ml. A continuación, la placa se incubó durante 24 h a 37 0C en una atmósfera enriquecida con un 5 % de CO².

[0047] Tras la incubación, se retiró el medio de cultivo de cada pocillo y se sustituyó por 1,0 ml de DMEM que contenía 1,3x10-7 M del compuesto de ensayo. Cada solución se esterilizó mediante filtración (filtros Corning de 0,22 micras). Las placas se incubaron en una incubadora durante 24 h. La superficie de poliestireno de las placas de cultivo era el control negativo, mientras que los discos de PVC estabilizados con estaño se utilizaron como control positivo, según lo indicado en los estándares ISO (ISO-10993-5). Tras la incubación, se evaluó la viabilidad celular analizando la incorporación de rojo neutro, una tinción vital que es absorbida únicamente por células vivas.

[0048] El ensayo consiste en añadir la tinción rojo neutro (C^HmClN, clorhidrato de 3-amino-2-dimetilamino-7-metilfenazina) al medio de cultivo, que se acumula posteriormente en los lisosomas presentes en el citoplasma de células vivas. Después de incubar las muestras con la tinción, esta se extrae de las células, obteniendo una solución cuya densidad óptica es el número de células vivas presentes. Puesto que la acumulación de la tinción es un proceso activo, tendrá lugar principalmente en células sanas o menos dañadas.

[0049] Antes de llevar a cabo el ensayo, se prepararon las siguientes soluciones:

• medio con rojo neutro: 1,0 ml de solución madre de rojo neutro 99,0 ml de medio de cultivo precalentado a 37 0C;

• solución madre de rojo neutro (RN): 0,33 g RN en 100 ml de H²O estéril;

• solución de extracción de rojo neutro: ácido acético glacial al 1 % (v/v) H²O al 49 % (v/v) etanol al 50 % (v/v).

[0050] Tras 24 h de incubación, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS precalentado a 37 0C. Por último, se añadió 1,0 ml de medio que contenía el rojo neutro a cada pocillo y se incubó durante 3 h a 37 0C en atmósfera húmeda con un 5 % de CO². Durante la incubación, las células se monitorizaron mediante un microscopio óptico para determinar la posible presencia de cristales de tinción que podrían alterar los resultados del ensayo, ya que impedían que las células absorbieran la tinción. Tras la incubación, el medio de cultivo se retiró de los pocillos y las células se lavaron dos veces con PBS precalentado a 37 0C. A continuación, se añadió en cada pocillo 1,0 ml de solución de extracción de tinción, y las muestras se volvieron a incubar a 37 0C en una atmósfera sin CO²durante 20-25 minutos. Por último, la absorbancia de las soluciones de extracción se leyó a 540 nm mediante un espectrofotómetro UV-Vis (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, Suecia).

[0051] Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la figura 2. Para cada muestra, se repitieron 5 réplicas para tres experimentos distintos. Como se puede observar a partir de los resultados expuestos, el compuesto inhibidor de MMP-AH no es citotóxico hacia fibroblastos NIH3T3.

Degradación enzimática

[0052] La degradación enzimática se analizó basándose en el método de Ola M. Saad et al., aplicando ligeras variaciones en el mismo [Saad, or. M., et al. Analytical Biochemistry, 2005, 344, 232-239]. Brevemente, en un tampón de acetato de amonio con pH fisiológico, se preparó una solución 1,3x10-7 M del inhibidor de MMP conjugado con ácido hialurónico (inhibidor de MMP-AH). A continuación, la solución se colocó en un baño configurado a 37 0C. Posteriormente, se le añadió a la solución una cantidad conocida de hialuronidasa (Sigma) para digerir el ácido hialurónico y obtener el ácido urónico. La sal sódica de ácido hialurónico se utilizó como control positivo, y la solución tampón de acetato de amonio como control negativo.

[0053] Para cada muestra se añadió un exceso de enzima hialuronidasa, y la cantidad de ácido urónico, producido en función del tiempo de digestión, se determinó mediante un espectrofotómetro, a través del ensayo de carbazol [Bitter, T., y Muir, H. M. Analytical Biochemistry, 1962, 4, 330-334 Hedberg, E. L., et al Journal of Controlled Release, 2004, 100, 257-266]. Brevemente, se añadieron 100 pl de la solución de la degradación a una solución que contenía ácido sulfúrico concentrado y tetraborato de sodio decahidratado. La solución resultante se calentó hasta 100 0C durante 10 minutos. A continuación se añadió una solución de carbazol al 0,125 % p/v en etanol absoluto, y la mezcla se calentó durante 15 minutos adicionales a 100 0C. La absorbancia de la solución final a 530 nm se determinó mediante un espectrofotómetro UV-visible (Perkin-Elmer modelo Lambda 25).

[0054] Para cada muestra, se realizaron 3 réplicas.

[0055] La figura 3 muestra los valores de absorbancia para el ensayo de carbazol para un tiempo de contacto de tres horas. La susceptibilidad a la degradación enzimática del compuesto inhibidor de MMP-AH se comparó con el hialuronato de sodio (control positivo) y con la solución tampón de acetato de amonio (control negativo).

[0056] Como se muestra en la figura 3, el inhibidor de MMP-AH presenta una resistencia considerable a la hidrólisis, en términos de producción de ácido urónico, por hialuronidasa. El control positivo, esto es, el ácido hialurónico no modificado (AH), se degrada significativamente tras 3 horas de digestión. Suponemos que durante las primeras horas, la digestión está casi completa, según confirma la literatura y las especificaciones técnicas proporcionadas por el fabricante de la enzima.

EJEMPLO 5 - Evaluación in vitro de la prevención de la deshidratación en células corneales humanas Cultivos de células corneales humanas y evaluación de su viabilidad tras el contacto con el inhibidor de MMP-AH

[0057] Se aislaron células humanas corneales obtenidas de donantes que habían sido sometidos a cirugía de corrección de miopía y se cultivaron in vitro a 37 0C en una atmósfera que contenía un 5 % de CO²hasta alcanzar la confluencia en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementado con suero fetal bovino al 10 % (v/v) (Sigma Chemicals Co., EE. UU.), 200 mm de L-glutamina (Sigma Chemicals Co., EE. UU.) y 5 mg/ml de penicilina-estreptomicina (Sigma Chemicals Co., EE. UU.). Una vez alcanzada una confluencia del 80 %, tras retirar el medio de cultivo, las células se lavaron 3 veces con 100 pl de PBS (1x) y se añadieron en cada pocillo 30 pl (concentración de solución inicial 0,150 g/100 ml) de la solución de molécula inhibidora de MMP conjugada con ácido hialurónico (inhibidor de MMP-AH) en PBS tamponado a aproximadamente pH = 7,2.

[0058] Se utilizó el PBS tamponado a pH = 7,2 como control negativo, y la lágrima artificial comercial OPTOyal ®A como control positivo (SOOFT Italia S.p.A., Fermo, Italia, que consiste en una solución oftálmica con un 0,15 % de hialuronato de sodio y aminoácidos). Las células en contacto con las muestras de ensayo se incubaron a continuación durante 20 minutos a 37 0C en una atmósfera que contenía un 5 % de CO². Tras la incubación, las soluciones de ensayo se retiraron, las células se lavaron con 100 pl de PBS (1 x) y se sometieron a flujo de aire continuo durante 0 y 30 minutos a temperatura ambiente. Por último, las células se incubaron durante 3 horas a 37 0C en una atmósfera que contenía un 5 % de CO²en presencia de un medio que contenía la tinción vital rojo neutro. Se realizó el ensayo de rojo neutro de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito (véase el párrafo del ensayo de citotoxicidad). Cada muestra se analizó por triplicado.

[0059] Como se muestra en el esquema de la figura 4, se observa que el tratamiento de las células con la lágrima artificial comercial y la molécula inhibidora de MMP-AH reduce el número de células viables tras una exposición de la monocapa de células a 30 minutos de flujo de aire continuo con respecto a las células sin tratar (medio), pero significativamente menor que en el caso de las tratadas con PBS. Además, la viabilidad celular tras 30 minutos de contacto con OPTOyal®A no es estadísticamente diferente de la que se observa tras el contacto con la molécula inhibidora de MMP-AH. Este hecho resulta especialmente importante teniendo en cuenta que el producto comercial que contiene, además de ácido hialurónico, aminoácidos que contribuyen a aumentar el efecto lubricante del ácido hialurónico demuestra tener la misma efectividad que la molécula inhibidora de MMP-AH.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto, derivado del AH, con la fórmula (I):

donde

n es entre 450 y 2500;

R es

donde

Ri es H, O-Alk, OH, F, Ph, para-CsH4-F, OPh, CH²Ph;

R²es H, CH²OH, CH²SH, CH²CH²SMe, CH(CH3)2, CH(CH3)OH;

cuando R²t H, el estereocentro tiene configuración absoluta (R);

X es una cadena de alquilo con un número de átomos de entre 3 y 12 conteniendo opcionalmete un triple enlace CeC o uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, S, O.

2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, donde X es -(CH²V ; -(OCH²CH²)m-O-, -(NHCH²CH²)m-NH-; -(CH²)m-CEC-(CH²)m- donde n es un número entero de entre 3 y 12 y m es un número entero de entre 1 y 3.

3. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde R¹es OMe.

4. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde R²es H o CH²OH.

5. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde R es

6. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como un medicamento.

7. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento del síndrome del ojo seco y de procesos inflamatorios a nivel osteoarticular.

8. Uso cosmético de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

9. Composición farmacéutica o cosmética, siendo dicha composición inyectable, comprendiendo dicha composición un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos otro ingrediente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o cosmético.

10. Método para preparar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprendiendo dicho mé todo la puesta en contacto de ácido hialurónico con un compuesto con la fórmula (II)

donde R¹, R²y X son según lo anteriormente descrito.