ES2860748T3

ES2860748T3 - Anticuerpos selectivos para células que presentan EGFR con alta densidad

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Publication number: ES2860748T3
Application number: ES12738907T
Authority: ES
Inventors: Ilia Alexandre Tikhomirov; Maria L Jaramillo; Maureen D O'connor-Mccourt; Traian Sulea; Renald Gilbert; Bruno Gaillet; Jason Baardsnes; Myriam Banville; Suzanne Grothe
Original assignee: National Research Council of Canada; Gilead Sciences Inc
Current assignee: National Research Council of Canada; Gilead Sciences Inc
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2021-10-05
Anticipated expiration: 2032-01-20
Also published as: EP2668209B8; RU2013138177A; US20130295086A1; SI2668209T1; CA2825255C; EP2668209B1; EP2668209A1; US20200325243A1; PL2668209T3; CA3115406A1; AU2012211014A1; US10570211B2; CA2825255A1; WO2012100346A1; PT2668209T; EP2668209A4

Abstract

Un anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une preferentemente a células patológicas que tienen una densidad de EGFR mayor que una densidad de EGFR normal, en donde las células patológicas se presentan con más de 10.000 moléculas de EGFR por célula y las células normales se presentan con no más de 10.000 moléculas de EGFR por célula, comprendiendo el anticuerpo EGFR una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo cada cadena una región constante y una región variable, comprendiendo cada región variable secuencias de región marco conservada de cetuximab y regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en donde las CDR tienen una secuencia de aminoácidos expuesta a continuación: Para la cadena pesada: CDR1 NYGVH (SEQ ID No. 1) CDR2 VIWSGGNTD58YNTPFTS (SEQ ID No. 2) CDR3 ALTY101Y102D103YE105FAY (SEQ ID No. 3) Para la cadena ligera: CDR1 RASQSIGTNIH (SEQ ID No. 4) CDR2 ASE53SIS (SEQ ID No. 5) CDR3 QQNNNW94PTT (SEQ ID No. 6) en donde al menos uno de E53 está sustituido con K53; D58 está sustituido con N58; W94 está sustituido con A94; Y101 está sustituido con A101; Y102 está sustituido con A102; D103 está sustituido con N103; E105 está sustituido con Q105, en donde el aminoácido sustituido confiere a dicho anticuerpo una afinidad de unión a EGFR reducida (Kd) que es de 1,0 nM o más débil, en donde cuando D58 está sustituido con N58, esto se realiza en combinación con D103 que está sustituido con N103 y cuando E105 está sustituido con Q105, esto se realiza en combinación con D58 estando sustituido con N58 y D103 estando sustituido con N103.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos selectivos para células que presentan EGFR con alta densidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que tienen utilidad terapéutica y diagnóstica. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen selectivamente a células que presentan EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) con una densidad anormalmente alta. Los anticuerpos tienen utilidad terapéutica y diagnóstica en los campos de la oncología y otras enfermedades.

Antecedentes de la invención

Los fármacos para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades tienen una denominada "ventana terapéutica". En el caso del cáncer, la ventana terapéutica define la dosificación farmacológica que puede destruir las células cancerosas preferentemente sobre las células normales, estableciendo así un rango de seguridad para el uso del fármaco. La ventana terapéutica de los productos quimioterápicos convencionales es estrecha con, en muchos casos, efectos adversos significativos que coinciden con una ralentización marginal del crecimiento tumoral. Se necesitan urgentemente tratamientos dirigidos que preserven las células normales.

Los anticuerpos terapéuticos constituyen una nueva clase de terapias contra el cáncer que se dirigen específicamente a un antígeno presentado en la superficie de las células cancerosas. Cuando la proteína de superficie diana es exclusiva de la célula cancerosa, se pueden evitar los efectos adversos de los anticuerpos sobre las células normales. No obstante, para la mayoría de los antígenos, la expresión de la diana no se limita completamente a las células tumorales, algunas células normales también expresan el antígeno. En estos casos, el anticuerpo puede tener un efecto sobre las células normales además de las células tumorales, dando lugar a eventos adversos "específicos, de tejido inespecífico". En el caso del antígeno EGFR, debido a su presencia ubicua en la superficie de las células normales, tales como los queratinocitos, así como en las células cancerosas, el uso clínico de las terapias dirigidas al EGFR se asocia con eventos adversos que incluyen erupción grave.

Teniendo en cuenta la eficacia de las terapias anti-EGFR en el tratamiento de pacientes que sobreexpresan EGFR, el riesgo asociado a una reacción cutánea grave se considera actualmente aceptable si se gestiona adecuadamente. El riesgo de toxicidad asociada a terapia anti-EGFR puede reducirse mediante la administración previa de antihistamínicos, o administrando el anticuerpo anti-EGFR a una dosis reducida y menos eficaz.

Los esfuerzos por mejorar los anticuerpos EGFR van encaminados a generar anticuerpos que tengan una afinidad aún mayor por el antígeno diana. En el documento WO 2006/009694 publicado el 26 de enero de 2006, Kussie et al describen la estructura cristalina de la interacción entre EGFR y un fragmento Fab de cetuximab e identifican los residuos que pueden modificarse a fin de mejorar la eficacia de cetuximab como antagonista de EGFR.

Tikhomirov et al., (Cancer Clinical Trails and Personalized Medicine, (01-08-2008), XP055197559) describe el nimotuzumab, un anticuerpo EGFR que se une preferentemente a células tumorales que expresan niveles moderados o altos de EGFR sobre células que tienen una baja densidad de EGFR.

Sería deseable proporcionar un anticuerpo EGFR que sea útil para tratar a los sujetos que presentan células patológicas que sobreexpresan EGFR, evitando al mismo tiempo una interacción significativa con los tejidos, incluyendo la piel y particularmente los queratinocitos y otras células que también presentan el antígeno EGFR con niveles normales.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos terapéuticos, y fragmentos y conjugados de los mismos que se unen eficazmente a una diana determinada solo cuando dicha diana se presenta con una densidad relativamente más alta característica de un estado patológico.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar dichos anticuerpos, fragmentos y conjugados en composiciones farmacéuticas, particularmente para uso terapéutico y de diagnóstico.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un método útil, en un sujeto que lo necesita, para controlar el crecimiento de las células patológicas que presentan EGFR con una densidad superior a la normal, mientras evita o minimiza al mismo tiempo los efectos adversos en células normales.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo EGFR aislado o fragmento bivalente del mismo que se une preferentemente a células diana que presentan EGFR con una densidad superior a la densidad normal de EGFR. Las células que presentan EGFR con una densidad superior a la densidad normal de EGFR son células patológicas, incluyendo células cancerosas tales como las células cancerosas colorrectales y otras, que sobreexpresan el gen EGFR y manifiestan en su superficie un mayor número de proteínas EGFR que las células que expresan el gen EGFR a niveles normales.

Los anticuerpos de la presente invención y sus fragmentos bivalentes, manifiestan una preferencia por unirse a las células patológicas que tienen la mayor densidad de EGFR y muestran una unión reducida y deseablemente mínima o nimia, es decir, insignificante, a las células normales que tienen una densidad normal de EGFR. Los presentes anticuerpos y sus fragmentos de unión bivalentes son, por tanto, muy adecuados para su uso en la reducción o erradicación de las células patológicas con alta densidad de EGFR, mientras se minimiza o evita al mismo tiempo los efectos en las células normales, reduciendo así el número o la gravedad de los eventos adversos en los sujetos que reciben la terapia con anticuerpos EGFR.

El anticuerpo EGFR de la invención comprende una cadena pesada y una cadena ligera, cada cadena teniendo una región constante y una región variable, cada región variable comprendiendo regiones marco conservadas y regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en donde las CDR tienen una secuencia de aminoácidos expuesta a continuación:

Para la cadena pesada:

CDR1 NYGVH (SEQ ID No. 1)

CDR2 VIWSGGNTD58YNTPFTS (SEQ ID No. 2)

CDR3 ALTY101 y 102D103YE105FAY (SEQ ID No. 3)

Para la cadena ligera:

CDR1 RASQSIGTNIH (SEQ ID No. 4)

CDR2 ASE53 SIS (SEQ ID No. 5)

CDR3 QQNNNW94PTT (SEQ ID No. 6)

en donde al menos uno de E53 está sustituido con K53, D58 está sustituido con N58, W94 está sustituido con A94, Y101 está sustituido con A101, Y102 está sustituido con A102, D103 está sustituido con N103 y E105 está sustituido con Q105, en donde el aminoácido sustituido confiere a dicho anticuerpo una afinidad de unión a EGFR reducida (Kd) que es de 1,0 nM o más débil, en donde cuando D58 está sustituido con N58, esto se realiza en combinación con D103 estando sustituido con N103 y cuando E105 está sustituido con Q105, esto se realiza en combinación con D58 estando sustituido con N58 y D103 estando sustituido con N103.

En unas realizaciones, el(los) aminoácido(s) sustituyente(s) se selecciona(n) para conferir al anticuerpo una afinidad de unión a EGFR (Kd) que es aproximadamente 10 veces o más débil que la afinidad de unión a EGFR de cetuximab.

En unas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo EGFR que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, cada cadena teniendo una región constante y una región variable, en donde la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de la SEQ ID No. 8 y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de la SEQ ID No. 7, en donde al menos uno de E53 está sustituido con K53, D58 está sustituido con N58, W94 está sustituido con A94, Y101 está sustituido con A101, Y102 está sustituido con A102, D103 está sustituido con N103 y E105 está sustituido con Q105, en donde el aminoácido sustituido confiere a dicho anticuerpo una afinidad de unión a EGFR reducida (Kd) que es de 1,0 nM o más débil, en donde cuando D58 está sustituido con N58, esto se realiza en combinación con D103 estando sustituido con N103 y cuando E105 está sustituido con Q105, esto se realiza en combinación con D58 estando sustituido con N58 y D103 estando sustituido con N103.

En otras realizaciones, el aminoácido sustituyente se selecciona para reducir la afinidad de unión a EGFR del anticuerpo o del fragmento bivalente a un nivel que elimine sustancialmente la unión a células que presentan EGFR con una densidad normal de EGFR y retenga la unión efectiva a las células patológicas diana que presentan EGFR con una densidad mayor en relación con la densidad normal de EGFR.

En todavía otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento bivalente es una variante de cetuximab que tiene una o más sustituciones en los residuos identificados en el presente documento. En realizaciones particulares, las sustituciones son sustituciones de aminoácidos no conservativas.

En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona conjugados, es decir, inmunoconjugados, que comprenden un anticuerpo o fragmento bivalente del mismo de acuerdo con la presente invención y, conjugado con el mismo, un agente útil para tratar o detectar células que presentan EGFR con una densidad característica de las células patológicas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones médicamente útiles que comprenden un anticuerpo, fragmento bivalente del mismo o inmunoconjugado del mismo de acuerdo con la presente invención, en combinación con un vehículo médicamente aceptable, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable o un vehículo diagnósticamente útil.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene células patológicas que presentan EGFR con una densidad superior a la densidad de EGFR en células normales, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento bivalente del mismo o un inmunoconjugado de la presente invención. Los sujetos así tratados manifestarán eventos adversos que son menores en número y/o gravedad dada la afinidad reducida de los presentes anticuerpos por las células y tejido normales.

Estos y otros aspectos de la presente invención se describen ahora con mayor detalle con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Referencia a las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra la unión de anticuerpos a EGFR de superficie celular presente en la superficie de (A) células U87MG parentales, (B) U87MGwtEGFR, células U87 modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar EGFR de tipo salvaje (wt), (C) U87MG-EGFRvIII, células U87 modificadas por ingeniería genética para sobreexpresar EGFR-vIII y (D) queratinocitos epidérmicos humanos primarios (HEK), con 1 y 10 pg/ml de mAb (A-C) o 0,1 y 1 pg/ml de mAb (D). Estos pueden compararse con el mAb de tipo salvaje (wt) (HC/LC) que se fijó arbitrariamente al 100 %. De manera similar, La Figura 1-1 (A-B) muestra los resultados de estos mismos experimentos más experimentos adicionales, aunque usando un enfoque de presentación de datos diferente, es decir, la totalidad de la unión se divide por la unión de fondo, (es decir, se expresa como un cambio múltiplo sobre la unión de fondo) en lugar de restar la unión de fondo de todos los valores de unión (como se hizo en la Figura 1). Estos resultados demuestran una mayor reducción de la unión de algunas variantes de mAb anti-EGFR respecto a las células que expresan niveles más bajos de EGFR (células U87 parentales o HEK) en comparación con la reducción observada en las células U87 que sobreexpresan EGFR.

La Figura 2 es un gráfico que representa la selectividad de unión de los anticuerpos. Se calculó la relación de la unión del anticuerpo (con el fondo restado) a las células que sobreexpresan EGFR [células U87MGwtEGFR o A431 (que sobreexpresan de forma natural EGFR wt)] en relación con la unión del anticuerpo a las células HEK normales y se comparó con la observada con el anticuerpo de tipo salvaje (relación fijada arbitrariamente en 1 para un anticuerpo wt). En la Figura 2-1, los mismos resultados que en la Figura 2 se muestran usando un enfoque de presentación de datos diferente, es decir, la totalidad de la unión se divide por el fondo. Nota - todas las figuras adicionales presentan datos analizados de esta manera. Estos resultados muestran claramente que algunos de los mAbs EGFR presentan una mejor unión a células tumorales que sobreexpresan EGFR en relación con las células HEK normales (p. ej., un mutante HC-2 exhibe una relación de unión 20 veces (Fig. 2) o 6 veces (Fig. 2-1) mejor y un mutante 3-1 exhibe una relación de unión al tumor 40 veces (Fig. 2) o 9 veces (Fig. 2-1) mejor que las células normales). El patrón de especificidad de unión fue similar entre las líneas celulares tumorales analizadas (U87MGwt EGFR y A431), lo que sugiere que la selectividad de unión es universalmente alta para las células tumorales que sobreexpresan EGFR (~2 millones de receptores por célula o más).

La Figura 3 representa gráficos que muestran la unión de anticuerpos mutados de 1 pg/ml (6,7 nM) a (A) U87MGwtEGFR, células U87 que sobreexpresan EGFR wt y (B) células U87MG parentales.

La Figura 4 es un gráfico que ilustra la selectividad de unión de los anticuerpos, en función de los datos de la Figura 3. Se calculó la relación de unión del anticuerpo a las células que sobreexpresan EGFR (U87MGwtEGFR) en relación con la unión del anticuerpo a las células U87MG parentales. Esto da como resultado una relación de 11 para la unión del anticuerpo de tipo salvaje a las células U87MGwtEGFR versus las células parentales; y en relaciones de hasta 35 para ciertos anticuerpos mutados, p. ej., mutante 7-LC y 4-LC. En otras palabras, estos anticuerpos mutantes muestran una relación (selectividad) 3-4 veces mejor de unión.

La Figura 5 ilustra la capacidad de los mAb EGFR para unirse a las células y liberar una toxina proteica, saporina. Específicamente, 1 nM de mAb EGFR se incubó con 2 nM de anticuerpo secundario antihumano que se conjugó químicamente con la toxina saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA), una enzima inactivadora de ribosomas que necesita ser internalizada para causar muerte celular. A continuación, se añadió el complejo de anticuerpos a los tipos celulares indicados (sembrados en placas por triplicado) y se midieron sus efectos sobre la viabilidad celular tras 72 h de incubación a 37 °C. La citotoxicidad dirigida por EGFR puede cuantificarse tras la evaluación con controles de citotoxicidad no específica [en los que no se usó ningún anticuerpo primario o un anticuerpo primario irrelevante (IgG humana de control)].

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas

Como se usa en el presente documento, el término "EGFR" se refiere a cualquier proteína que comprende el producto expresado y procesado del gen her-1, en donde la proteína se designa como UniProtKB/Swiss-Prot P04626-1, incluyendo variantes de unión a anticuerpos de la misma.

La presente invención se refiere a anticuerpos EGFR y fragmentos bivalentes de los mismos que manifiestan una preferencia por unirse a células patológicas que presentan EGFR con una densidad superior a las células normales. En las células que presentan EGFR, la densidad normal de EGFR es generalmente inferior a aproximadamente 10.000 moléculas de EGFR por célula y suele ser inferior a aproximadamente 1000 moléculas de EGFR por célula. Las células patológicas que presentan EGFR, por otro lado, presentan EGFR con una densidad generalmente superior a 10.000 moléculas de EGFR por célula y suele ser superior a aproximadamente 100.000 moléculas de EGFR por célula. En general, la densidad de EGFR es, por tanto, de aproximadamente 103 * o menos en las células normales y de aproximadamente 105 o más en las células patológicas. El número real de moléculas de EGFR en cualquier célula dada puede determinarse mediante métodos establecidos, incluyendo la unión radiomarcada basada en anticuerpos o la unión por citometría de flujo a células vivas ejemplificada en el presente documento. La avidez de unión de los presentes anticuerpos es mayor para las células patológicas con mayor densidad de EGFR que para las células normales con menor densidad de EGFR. Esta mayor avidez se revela convenientemente usando técnicas establecidas para determinar las constantes de afinidad por las interacciones anticuerpo-diana, también como se ejemplifica en el presente documento.

En unas realizaciones, los presentes anticuerpos EGFR que tienen una afinidad de unión por EGFR que es aproximadamente 10 veces o más débil que la afinidad de unión a EGFR de cetuximab. De manera deseable, la afinidad de unión del anticuerpo por EGFR es de aproximadamente 15 veces, 20 veces, 25 veces y preferentemente 30 veces o más débil que la afinidad de unión a EGFR de cetuximab. En términos absolutos y dada una afinidad de unión a EGFR de aproximadamente 0,3 nM para cetuximab, los presentes anticuerpos incorporan una sustitución o sustituciones de aminoácidos que reducen su afinidad de unión a EGFR (Kd) a aproximadamente 1,0 nM y más débil, más deseablemente aproximadamente 10 nM y más débil, p. ej., a una afinidad de unión a EGFR que está en el intervalo de 1 nM a 1 pM, más deseablemente de 2 nM a 500 nM, tal como de 10 nM a 500 nM o de 10 nM a 100 nM.

En unas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende características comunes a todos los anticuerpos naturales y, por tanto, comprende una cadena pesada y una cadena ligera, cada cadena teniendo una región constante y una región variable, cada región variable comprendiendo regiones marco conservadas (FRs) y regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Como alternativa, el anticuerpo se proporciona como un fragmento bivalente, es decir, un fragmento de anticuerpo que comprende ambos "brazos" de un anticuerpo intacto, unidos a través de un enlazador que puede estar representado por la región bisagra del anticuerpo o cualquier otro equivalente. Tales fragmentos bivalentes incluyen fragmentos F(ab)²y cualquier otro fragmento bivalente que conserve la preferencia por EGFR con alta densidad. En realizaciones particulares, el fragmento bivalente es un fragmento F(ab')², generado, por ejemplo, mediante la digestión basada en papaína del anticuerpo parental usando procedimientos convencionales de digestión y posterior aislamiento de fragmentos. Como alternativa, el fragmento bivalente puede ser un denominado Fv de cadena sencilla (scFv), que consiste en los dominios ligeros variables y pesados variables de anticuerpo unidos por un enlazador de aminoácidos o una forma bivalente de un denominado diacuerpo preparado usando un enlazador de 5 aminoácidos, tal como SGGGG entre los dominios variables de cadena ligera y pesada y una modificación de cisteína C-terminal en GGC para dar un producto de diacuerpo final, tal como VL-SGGG-VH-GGC. Todavía pueden prepararse otros fragmentos bivalentes acoplando los dominios variables de cadena ligera y pesada mediante enlaces tioéter, tales como bis-maleimidometil éter (BMME), N,N'-p-fenileno dimaleimida (p Dm y N,N'-bismaleimidohexano BMH), para estabilizar los fragmentos F(ab')2.

En el anticuerpo intacto o fragmento bivalente, las CDR comprenden o consisten en las siguientes secuencias de aminoácidos:

Para la cadena pesada:

CDR1 NYGVH (SEQ ID No. 1)

CDR2 VIWSGGNTD58YNTPFTS (SEQ ID No. 2)

CDR3 ALTY101 y 102D103YE105FAY (SEQ ID No. 3)

Para la cadena ligera:

CDR1 RASQSIGTNIH (SEQ ID No. 4)

CDR2 ASE53 SIS (SEQ ID No. 5)

CDR3 QQNNNW94PTT (SEQ ID No. 6)

Los aminoácidos sustituyentes son aminoácidos codificados genéticamente más adecuados que se seleccionan deseablemente, pero no esencialmente, de una clase de aminoácidos que es diferente de la clase de aminoácidos a la que pertenece el aminoácido parental. Por ejemplo, en el caso de Y101 y Y102, los aminoácidos sustituyentes adecuados son aquellos que no son aminoácidos polares/neutrales/grandes. El proceso de selección puede llevarse a cabo mediante la aplicación de herramientas asistidas por ordenador que combinan motores de mutagénesis virtual por saturación con algoritmos de puntuación in silico de afinidades de unión y/o tasas de asociación. Las selecciones de aminoácidos también pueden realizarse basándose en la siguiente Tabla 1:

Tamaño de aminoácidos* 3 letras 1 letra ( cadena lateral) Polaridad (pH 7,4) Carga Alanina Ala A no polar neutra minúscula Arginina Arg R polar positiva grande Asparagina Asn N polar neutra pequeña Ácido aspártico Asp D polar negativa pequeña Cisteína Cys C no polar neutra pequeña Ácido glutámico Glu E polar negativa pequeña Glutamina Gln Q polar neutra pequeña Glicina Gly G no polar neutra minúscula Histidina His H polar neutra (90 %) grande Isoleucina Ile I no polar neutra grande Leucina Leu L no polar neutra grande Lisina Lys K polar positiva grande Metionina Met M no polar neutra grande Fenilalanina Phe F no polar neutra grande Prolina Pro P no polar neutra pequeña Serina Ser S polar neutra minúscula Treonina Thr T polar neutra pequeña Triptófano Trp W no polar neutra voluminosa Tirosina Tyr Y polar neutra grande Valina Val V no polar neutra pequeña * en función del volumen en A3, donde 50-100 es minúsculo, 100-150 es pequeño, 150-200 es grande y >200 es voluminoso

Se apreciará que las familias de aminoácidos conservativos incluyan (i) G, A, V, L e I; (ii) D y E; (iii) A, S y T; (iv) H, K y R; (v) N y Q; y (vi) F, Y y W.

En unas realizaciones, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento bivalente incorpora al menos una sustitución en D58, Y101, Y102, D103 o E105. En otras realizaciones, la región variable de la cadena pesada incorpora sustituciones en al menos dos de dichos residuos, tales como en D58 y D103 o tres de dichos residuos, tales como en D58, d 103 y E105 En una realización alternativa, la región variable de la cadena pesada es de tipo salvaje y no incorpora dichas sustituciones, siempre que haya al menos una sustitución en la región variable de la cadena ligera.

En unas realizaciones, en las CDR de la cadena pesada, Y101 y/o Y102, independientemente, se reemplaza con un aminoácido sustituyente que tiene una cadena lateral que no es polar y/o una cadena lateral que no es neutra y/o una cadena lateral que no es grande. De manera deseable, Y101 y/o Y102 se reemplaza con un aminoácido seleccionado independientemente de A, C, G, I, L, M, F, W y V; preferentemente de A, G, I, L y V; y más preferentemente de A, V, I y L. En una realización específica, la tirosina que se encuentra en una o ambas posiciones 101 y 102 se reemplaza con alanina, dando así lugar a las sustituciones designadas Y101A y Y102A.

En otras realizaciones, D58 en CDR2 de cadena pesada y/o D103 en CDR3 de cadena pesada se reemplaza, independientemente, con un aminoácido sustituyente que tenga una cadena lateral que no es polar y/o es una carga neutra o positiva y/o no es pequeña. De manera deseable, D58 y/o D103 se reemplaza con un aminoácido que tiene una cadena lateral que es una carga neutra o positiva, así como polar, así como pequeña, y se selecciona deseablemente entre N y Q. En una realización específica, D58 está reemplazado con N58, dando así lugar a la sustitución designada D58N. En otra realización específica, D103 está reemplazado con N103, dando así lugar a la sustitución designada D103N.

En otras realizaciones, E105 en la CDR3 de cadena pesada se reemplaza con un aminoácido sustituyente que tenga una cadena lateral que no es polar y/o es una carga neutra o positiva y/o no es pequeña. De manera deseable, E105 se reemplaza con un aminoácido que tiene una cadena lateral que es una carga neutra o positiva, así como polar, así como pequeña, y se selecciona deseablemente entre N y Q. En una realización específica, E105 está reemplazado con Q105, dando así lugar a la sustitución designada E105Q.

En unas realizaciones, la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento bivalente incorpora al menos una sustitución en E53 o en W94 En una realización específica, la región variable de la cadena ligera comprende sustituciones tanto en E53 como en W94. En otra realización específica, la región variable de la cadena ligera incorpora una sustitución solo en E53 o solo en W94. En una realización alternativa, la región variable de la cadena ligera es de tipo salvaje y no incorpora dichas sustituciones, siempre que haya al menos una sustitución en la región variable de la cadena pesada.

Cuando está sustituido, E53 se reemplaza con un aminoácido sustituyente que tenga una cadena lateral que no es polar y/o es una carga neutra o positiva y/o puede no ser pequeña. En unas realizaciones, E53 está sustituido con un aminoácido seleccionado entre R, D, E, H o K. En una realización preferida, E53 está sustituido con K, dando lugar a la sustitución designada E53K.

Cuando está sustituido, W 94 se reemplaza con un aminoácido sustituyente que tenga una cadena lateral que es polar y/o es una carga positiva o negativa y/o no es voluminosa. En unas realizaciones, W 94 está reemplazado con R, N, D, E, Q, H, K, A, S, T o Y. En realizaciones particulares, W94 está reemplazado con N, Q, H, S, T, A o Y. En una realización preferida, W94 está reemplazado con A, dando lugar a la sustitución designada W 94A.

El anticuerpo o fragmento bivalente del mismo comprende al menos una sustitución en un lugar indicado anteriormente. La al menos una sustitución puede producirse en la región variable de la cadena ligera o en la región variable de la cadena pesada. En realizaciones específicas, los anticuerpos que comprenden sustituciones de sitio único incluyen:

Un anticuerpo que comprende una sustitución E53K en la CDR2 de la cadena ligera, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena ligera es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 7 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [E53K]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende una sustitución W 94A en la CDR3 de la cadena ligera, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena ligera es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 7 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [W94A]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende una sustitución D58N en la CDR2 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [D58N]cetuximab

Un anticuerpo que comprende una sustitución Y101A en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [Y101A]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende una sustitución Y102A en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [Y102A]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende una sustitución D103N en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [D103N]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende una sustitución E105Q en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [E105Q]cetuximab.

En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende al menos dos de estas sustituciones, bien en la región variable de la cadena ligera, en la región variable de la cadena pesada o al menos una sustitución en cada una de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En realizaciones específicas, los anticuerpos que incluyen al menos dos de estas sustituciones incluyen:

Un anticuerpo que comprende tanto una sustitución E53K en la CDR2 de la cadena ligera como una sustitución Y101A en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [E53K, Y101A]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende tanto una sustitución E53K en la CDR2 de la cadena ligera como una sustitución Y102A en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [E53K, Y102A]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende tanto una sustitución D58N en la CDR2 de la cadena pesada como una sustitución D103N en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [D58N, D103N]cetuximab.

Un anticuerpo que comprende al menos tres sustituciones, que incluye una sustitución D58N en la CDR2 de la cadena pesada, una sustitución D103N en la CDR3 de la cadena pesada y una sustitución E105Q en la CDR3 de la cadena pesada, en donde las CDR son, por lo demás, las versiones de tipo salvaje especificadas anteriormente; o en donde la cadena pesada es, por lo demás, la versión de tipo silvestre que se establece en la SEQ ID No. 8 o en donde el anticuerpo es, por lo demás, cetuximab, es decir, [D58N, D103N, E105Q]cetuximab.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo es uno de [E53K, Y102A]cetuximab, [D58N, D103N]cetuximab o [D58N, D103N, E105Q]cetuximab.

Además de las tres CDR enumeradas presentes en cada una de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, las cadenas pesada y ligera del anticuerpo intacto comprenden cuatro regiones marco conservadas intermedias que presentan las CDR en una conformación adecuada para la unión a EGFR y regiones constantes que confieren la función efectora del anticuerpo. Las CDR pueden integrarse en cualquier anticuerpo aceptor adecuado, injertando las presentes CDR en el anticuerpo aceptor, de acuerdo con las prácticas y técnicas bien establecidas para la producción de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.

Los anticuerpos aceptores particularmente adecuados son anticuerpos que ya se sabe que tienen afinidad de unión a EGFR. Dichos anticuerpos donantes son más deseablemente de origen humano, aunque también pueden derivarse de anticuerpos aceptores de origen no humano, incluyendo ratón, rata, conejo, cabra, oveja, primate y similares. Se apreciará que pueden identificarse y usarse secuencias aceptoras de anticuerpos humanos diferentes de las ejemplificadas en el presente documento para adaptar las CDR actualmente deseadas. Esto se consigue modelando la estructura de un anticuerpo preferido usando, por ejemplo, Swiss-Model [http://swiss-model.expasy.org/repository] o un software similar y seleccionando, de entre las numerosas secuencias de anticuerpos humanos disponibles en bases de datos públicas, una secuencia de anticuerpo aceptor humano que, con las secuencias CDR alteradas como se prefiere en el presente documento, se aproxime a la misma conformación estructural que los anticuerpos preferidos. En unas realizaciones, los anticuerpos aceptores y los presentes anticuerpos resultantes, son del isotipo IgG1, aunque también pueden ser IgG2 o IgG4. Por otra parte, el isotipo del anticuerpo, como dicta la región constante, puede manipularse para alterar o eliminar la función efectora del anticuerpo resultante. Es decir, la región constante de los presentes anticuerpos es la región constante del anticuerpo humano de tipo salvaje o una variante del mismo que incorpora modificaciones de aminoácidos, es decir, adiciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos que alteran la función efectora de la región constante, tal como para mejorar una semivida de suero, reducir la fijación al complemento, reducir la citotoxicidad celular dependiente del antígeno y mejorar la estabilidad del anticuerpo. El número de modificaciones de aminoácidos en la región constante no suele ser superior a 20, tal como, 1-10, p. ej., 1 5 modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas.

En unas realizaciones, la semivida del anticuerpo se mejora incorporando una modificación de aminoácidos más, normalmente en forma de sustituciones de aminoácidos, por ejemplo en el residuo 252, p. ej., para introducir Thr, en el residuo 254, p. ej., para introducir Ser y/o en el residuo 256, p. ej., para introducir Phe. Se pueden realizar todavía otras modificaciones para mejorar la semivida, tales como, por ejemplo, alterar la región CHI o CL para introducir un motivo receptor viable, tal como el que se encuentra en los dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG. Tales alteraciones se describen, por ejemplo, en los documentos US 5869046 y US 6121022.

La unión a C1q alterada o citotoxicidad dependiente de complemento reducida, puede introducirse alterando los aminoácidos de la región constante en las posiciones 329, 331 y 322, como se describe en el documento US 6194551. La capacidad del anticuerpo para fijar el complemento puede alterarse aún más introduciendo sustituciones en las posiciones 231 y 239 de la región constante, como se describe en el documento WO94/029351.

Las regiones marco conservadas de las cadenas ligeras y pesadas de los presentes anticuerpos y fragmentos tienen también, de forma deseable, la secuencia de una región variable de anticuerpo humano, pero incorporando las CDR especificadas en el presente documento. En unas realizaciones, la región variable de la cadena pesada es lgG4 de origen humano. En realizaciones específicas, la región variable de la cadena pesada es la de IgG humana, tal como la variante del anticuerpo lgG1 humana que tiene la secuencia designada Genbank gi 2414502. Como alternativa, y preferentemente, la región variable de la cadena pesada es la de la especie de anticuerpo lgG4 humana designada Genbank gi 2414502.

Las regiones marco conservadas de las cadenas pesadas y ligeras de los presentes anticuerpos también pueden incorporar modificaciones de aminoácidos, es decir, deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, que mejoran aún más las propiedades del anticuerpo o fragmento, de acuerdo con las técnicas establecidas para la humanización de anticuerpos. Dichas modificaciones de la región marco conservada pueden modelarse a partir de las regiones marco conservadas de las secuencias de anticuerpos proporcionadas en las bases de datos públicas, y de las regiones marco conservadas de los anticuerpos que se sabe que se unen a EGFR, tales como los anticuerpos a los que se hace referencia en la sección de antecedentes de este documento. Las sustituciones de región marco conservada preferidas son las que dan lugar a anticuerpos que tienen una mayor preferencia por la unión a EGFR con la mayor densidad asociada a las células patológicas, en relación con las células normales.

Las modificaciones de la región marco conservada también pueden realizarse para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo o para reducir o eliminar los epítopos de células T que residen en el mismo, según lo descrito, por ejemplo, por Carr et al en el documento US2003/0153043.

De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se modelan en el anticuerpo cetuximab y comprenden una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID No. 8 y/o una región variable de la cadena ligera que tiene la SEQ ID No.7, como sigue:

Región variable de la cadena ligera (VL): dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyase53sisgipsrfsgsgsgtd FTLSINSVESEDIADYYCQQNNNW94PTTFGAGTKLELK [SEQ ID No. 7];

en donde E53 o W94 son como se ha definido anteriormente en el presente documento;

Región variable de la cadena pesada (VH):

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTD58YNTPFTSRLSIN

KDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTY101Y102D103YE105FAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID No.

8 ];

en donde D58, Y101, Y102, D103 o E105 son como se ha definido anteriormente en el presente documento.

En realizaciones más específicas y preferidas, las cadenas ligeras y pesadas completas del anticuerpo intacto se establecen a continuación como s Eq ID Nos. 9 y 10, respectivamente:

Cadena ligera entera:

dil ltqs pvils vspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyase53sisgipsrfsgsgsgtd ftl sinsvesediadyycqqnnnw94ptt fgag tkle l k rt vaa psv f i f pps deql ksg t aswcl l nnf y

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG

E [SEQ ID No. 9];

en donde E53 y W94 son como se ha definido anteriormente en el presente documento;

Cadena pesada entera:

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTD58YNTPFTSRLSIN

kdnsksqvffkmnslqsndtaiyycaralty101y 102d103ye105faywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapss

KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNH

KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID No. 10];

Como se ha indicado, la selección final de un anticuerpo o fragmento de unión se realiza basándose en la preferencia de unión mostrada por el anticuerpo o fragmento bivalente deseado por las células que presentan EGFR con una densidad superior a la normal. Las células diana son, por tanto, células patológicas que presentan una densidad de EGFR superior a la normal, como marca distintiva. La identificación selectiva puede realizarse in vitro, como se ejemplifica en el presente documento, usando como células de referencia una primera célula patológica conocida por el análisis que presenta EGFR con una densidad superior a la normal, tal como U87wtEGFR o líneas relacionadas que incorporan un EGFR alterado tal como U87EGFRvIII o la línea A431, y una segunda, célula normal conocida por los análisis que presenta EGFR con una densidad normal, tal como queratinocitos epidérmicos humanos primarios (~ 20.000 EGFR/célula). La elección de los queratinocitos epidérmicos como célula normal de referencia es prudente, dado que los anticuerpos EGFR comercializados, tales como cetuximab, son conocidos por provocar graves efectos secundarios de erupción cutánea a través de su interacción con estas células. Puede usarse cualquier otra línea celular humana que presente EGFR con densidad normal, como alternativa.

El ensayo basado en células puede usar citometría de flujo con un anticuerpo EGFR apropiado y el anticuerpo secundario marcado para informar y medir la afinidad y avidez de unión, como se ejemplifica en el presente documento. Como alternativa, la selección del anticuerpo deseado puede realizarse basándose en afinidades de unión absolutas obtenidas, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial, también como se ejemplifica en el presente documento.

Con el fin de identificar las células patológicas a las que pueden dirigirse los presentes anticuerpos EGFR y los fragmentos bivalentes, se puede usar convenientemente la prueba comercial EGFR pharmDx™ (DAKO). Se trata de un ensayo inmunohistoquímico semicuantitativo para determinar la sobreexpresión de la proteína EGFR en los tejidos colorrectales. Los resultados positivos o negativos ayudan a clasificar las células/tejidos anormales y proporcionan una base para el tratamiento con un anticuerpo EGFR.

Así pues, los anticuerpos y los fragmentos de unión son útiles tanto para fines de diagnóstico, incluyendo el análisis de muestras y la formación de imágenes in vivo como con fines terapéuticos para tratar enfermedades en las que la densidad de EGFR está aumentada en las células patológicas.

Para cualquiera de los dos fines, el anticuerpo o fragmento de unión puede conjugarse con un agente apropiado, para formar un inmunoconjugado. Los agentes apropiados para el tratamiento de una enfermedad incluyen agentes citotóxicos, incluyen quimioterapéuticos y radioterapéuticos. Para fines diagnósticos, son agentes apropiados marcadores detectables que incluyen radioisótopos, para obtener imágenes de todo el cuerpo, y radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares para análisis de muestras.

Para la terapia, la citotoxina puede conjugarse con el anticuerpo o fragmento de unión bivalente mediante una interacción no covalente, pero más deseablemente, se acoplan mediante enlace covalente, ya sea directamente o, más preferentemente, a través de un enlazador adecuado. En una realización preferida, el conjugado comprende una citotoxina y un anticuerpo. Pueden prepararse inmunoconjugados del anticuerpo y citotoxina usando diversos agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato, iminotiolano, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como dimetil adipimidato HCL, ésteres activos tales como disuccinimidil suberato, aldehídos tales como glutaraldehído, compuestos de bis-azido tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de tolueno y compuestos de bis-fluorina activa (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante adecuado para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo.

El componente de citotoxina del inmunoconjugado puede ser un agente quimioterapéutico, una toxina tal como una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de la misma o una toxina de molécula pequeña o un isótopo radiactivo tal como 212Bi, 131I, 131In, 111In, 90Y y 186Re o cualquier otro agente que actúe para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula cancerosa.

Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados incluyen adriamicina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluoroouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, p. ej., paclitaxel y docetaxel, taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosgamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas, 5-FU, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucilo, melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como tamoxifeno y onapristona. Las toxinas y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, toxina colérica, toxina botulínica, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, saporina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Toxinas de molécula pequeña incluyen, por ejemplo, calicheamicinas, maitansinoides, palitoxina y CC1065.

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo, fragmento bivalente o el conjugado, se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo o conjugado que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes y/o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como de suero, albúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol (PEG).

Los principios activos que se van a usar para su administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), polilactidas (patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilvinilacetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden desarrollar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr estabilización modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración de los agentes anticancerosos, p. ej., anticuerpos o conjugados, de la presente invención. Por ejemplo, el paciente que va a ser tratado con dichos agentes anticancerosos también puede recibir terapia con radiación, tal como radiación externa. Como alternativa, o además, un agente quimioterapéutico puede administrarse al paciente. Los esquemas de preparación y dosificación de dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determine empíricamente el facultativo experto en la técnica. La preparación y los programas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams y Wilkins, Baltimore, Md. (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración del agente antitumoral, p. ej., anticuerpo o puede administrarse simultáneamente con el mismo. El anticuerpo puede combinarse con cualquiera de las toxinas descritas anteriormente con referencia a los conjugados o cualquier otro fármaco adecuado, particularmente incluyen irinotecán (CPT-11), cisplatino, ciclofosfamida, melfalán, dacarbazina, doxorrubicina, daunorrubicina y topotecán, así como inhibidores de tirosina cinasa.

Puede ser deseable administrar también anticuerpos o conjugados contra otros antígenos asociados al tumor o sus ligandos, tales como anticuerpos que se unen a ErbB2, ErbB3, ErbB4 o el factor endotelial vascular (VEGF), y/o anticuerpos que se unen a EGF o a TGFa. Como alternativa, o además, dos o más anticuerpos que se unen a ese mismo antígeno o a dos o más antígenos diferentes desvelados en el presente documento pueden coadministrarse al paciente. A veces puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, los anticuerpos en el presente documento se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero, seguido de un anticuerpo de la presente invención. No obstante, también se contempla en primer lugar la administración simultánea o la administración del anticuerpo de la presente invención. Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son las usadas en la actualidad y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del anticuerpo en el presente documento.

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos en el presente documento. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase aloja una composición que es eficaz para el tratamiento de la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta en, o asociada con, el envase indica que la composición se usa para tratar la afección de cáncer. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquetes con instrucciones de uso.

Un terapéutico anticanceroso de acuerdo con la invención puede administrarse con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en una forma de dosificación unitaria. -Se puede emplear cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, administración parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intramedular, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol u oral.

Para el tratamiento de sujetos que presenten células cancerosas que presentan EGFR con mayor densidad que las células normales, la dosificación apropiada de un agente antitumoral, p. ej., un anticuerpo, fragmento o conjugado, dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, como se ha definido anteriormente, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico de los pacientes y de la respuesta al agente y del criterio del médico a cargo del tratamiento. El agente se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Por ejemplo, dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, entre aproximadamente 1 pg/kg y 15 mg/kg (p. ej., 0,1-20 mg/kg) del anticuerpo o conjugado es una dosificación candidata para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, administración mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la afección, se continuará el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. No obstante, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Por tanto, se apreciará que una cantidad eficaz del anticuerpo, fragmento o inmunoconjugado es una cantidad eficaz sola o como parte de un régimen de tratamiento que retrasa o inhibe el crecimiento o la proliferación de las células patológicas que presentan una densidad de EGFR superior a la normal.

En unas realizaciones, los presentes anticuerpos se administran por infusión intravenosa, tal como a una dosis inicial de 4 mg/kg durante 90 minutos, luego 2 mg/kg durante 30 minutos, una vez por semana durante 52 semanas, con un seguimiento según sea necesario.

El anticuerpo y fragmentos bivalentes son útiles en el tratamiento de varios cánceres, para inhibir el crecimiento o la proliferación de las células cancerosas y los tumores que las componen, incluyendo cánceres de células hematopoyéticas y tumores sólidos. Las afecciones o trastornos a tratar incluyen tumores benignos o malignos (p. ej., tumores renales, hepáticos, de riñón, vejiga, mama, gástrico, ovárico, colorrectal, próstata, pancreático, pulmón, de vulva y tiroides); carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello; leucemias y neoplasias malignas. En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento bivalente se usa en el tratamiento de dichas células cancerosas que expresan EGFR con alta densidad, según lo determinado en los ensayos de identificación sistemática descritos en el presente documento. En realizaciones particulares, las células cancerosas son células cancerosas que presentan EGFR que incluyen cánceres de cabeza y cuello y especialmente carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cánceres colorrectales, cánceres gastrointestinales, tumores cerebrales, incluyendo glioblastomas y tumores de pulmón, incluyendo carcinoma pulmonar de células no pequeñas, y de mama, páncreas, esófago, riñón, ovario, cuello de útero y próstata.

Se apreciará que los sujetos que podrían beneficiarse del presente método incluyen mamíferos, incluyendo seres humanos así como ganado y mascotas.

Los anticuerpos y fragmentos bivalentes de los mismos que se unen selectivamente al antígeno diana, p. ej., EGFR, se han usado, de acuerdo con un aspecto de la invención, para identificar selectivamente las células cancerosas con el fin de detectar aquellas que presentan el antígeno EGFR con alta densidad. En una realización preferida, la identificación selectiva se aplica a una muestra de células cancerosas tomada de un sujeto que es candidato a la terapia con anticuerpos EGFr . Los sujetos que dan positivo a células cancerosas que presentan el antígeno EGFR con alta densidad pueden entonces ser programados para la terapia con el presente anticuerpo o fragmento o un inmunoconjugado del mismo. Las técnicas convencionales, combinadas con los anticuerpos u otros agentes de unión descritos en el presente documento, se pueden usar para identificar selectivamente células cancerosas. De manera deseable, los anticuerpos incorporan un marcador detectable. El marcador puede ser detectable por sí mismo, (p. ej., marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable. Los radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, 1-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109.

Se puede realizar la detección in situ de la unión a células cancerosas con EGFR con alta densidad, usando el presente anticuerpo o fragmento, mediante inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica. Para este fin, se extrae un espécimen histológico del paciente y se le aplica una forma marcada del presente anticuerpo, preferentemente superponiendo el anticuerpo a una muestra biológica. Este procedimiento también permite examinar la distribución del antígeno EGFR dentro del tejido tumoral biopsiado, para revelar solo aquellos sitios en los que el antígeno se presenta a una densidad superior a la normal. Será evidente para los expertos en la materia que existe una amplia variedad de métodos histológicos para la detección in situ.

Más particularmente, los anticuerpos EGFR o fragmentos de unión de la presente invención pueden usarse para controlar la presencia o ausencia de reactividad de anticuerpos en una muestra biológica (p. ej., una biopsia de tejido, una célula o fluido) usando ensayos de detección convencional. Los ensayos inmunológicos pueden implicar la detección directa y son particularmente adecuados para la identificación selectiva de grandes cantidades de muestras para la presencia de células cancerosas que sobreexpresan EGFR. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse en cualquier formato de inmunoensayo convencional (p. ej., ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, citometría de flujo o ensayo RIA) para medir la formación de complejos. En estos ensayos de detección puede usarse cualquier marcador apropiado que pueda visualizarse directa o indirectamente, incluyendo, aunque no de forma limitativa, cualquier marcador radiactivo, fluorescente, cromogénico (p. ej., fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) o quimioluminiscente, o hapteno (por ejemplo, digoxigenina o biotina) que pueda visualizarse usando un anticuerpo específico de hapteno marcado, u otro ligando (p. ej., avidina). Se describen inmunoensayos ilustrativos, p. ej., en Ausubel et al., supra, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988) y Moynagh y Schimmel, Nature 400:105, 1999. Por ejemplo, usando los anticuerpos descritos en el presente documento, el EGFr con alta densidad se detecta fácilmente en la superficie celular usando métodos convencionales de citometría de flujo. Las muestras que contienen el complejo marcado en comparación con las muestras de control apropiadas se consideran indicativas de la presencia de Eg Fr con alta densidad y, por tanto, son indicativas de un cáncer u otra enfermedad susceptible de tratamiento con los presentes anticuerpos.

El presente anticuerpo se produce adecuadamente por medios de ADN recombinante, como se ejemplifica en el presente documento. Para la producción, se proporciona una molécula de ADN que codifica la cadena pesada del presente anticuerpo y una molécula de ADN que codifica la cadena ligera del mismo. El ADN codifica además cualquier péptido señal adecuado para la expresión de un precursor de cadena secretable que permite la externalización adecuada con el plegado y la formación de disulfuro para elaborar el anticuerpo deseado como una proteína secretada, dimerizada y procesada. Con este fin, la presente invención proporciona, en una realización, un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo EGFR actualmente preferido, como se establece en la SEQ ID No. 9 que aparece al final de la divulgación. También se proporciona, en otra realización, un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo EGFR actualmente preferido, como se establece en la SEQ ID No. 10 que aparece al final de la divulgación.

En realizaciones más específicas, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica toda la cadena ligera (SEQ ID No. 11) y toda la cadena pesada (SEQ ID No. 14) de un anticuerpo Eg Fr preferido de la presente invención. Estas secuencias también se proporcionan al final de la presente divulgación.

Se apreciará que pueden usarse equivalentes polinucleotídicos, en los que se reemplazan codones sinónimos dentro de las secuencias proporcionadas, para producir los presentes anticuerpos.

En unas realizaciones, también se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos que codifican la cadena pesada o la región variable de la misma y que codifican la cadena ligera o la región variable de la misma. Para expresar los anticuerpos, los polinucleótidos se incorporan operativamente dentro de vectores de expresión, es decir, vinculados operativamente a secuencias de control transcripcional y traslacional. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos y similares. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula de expresión hospedadora usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una realización preferida, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos se pueden insertar en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., unión de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y en el vector o unión de extremos romos si no hay sitios de restricción).

Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia CH o CL de inmunoglobulina humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados modificados por ingeniería genética, de tal forma que puede insertarse y expresarse fácilmente cualquier secuencia de VH o VL, como se ha descrito anteriormente. En dichos vectores, el corte y empalme normalmente se produce entre el sitio donador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana y también en las regiones de corte y empalme que se producen en los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido señal se une en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no de inmunoglobulina).

Los polinucleótidos que codifican la cadena pesada y/o la cadena ligera y los vectores que los comprenden, pueden usarse para la transformación de una célula hospedadora de mamífero adecuada. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o de los polinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, los polinucleótidos pueden introducirse en células de mamífero mediante vectores víricos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de polinucleótidos que codifican un anticuerpo pueden incluir muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS, células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células A549, células 3T3 y varias otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células de seres humanos, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovino, caballo y hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células S19, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando vectores de expresión recombinante que codifican la cadena pesada o porción de unión al antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos tengan una glicosilación diferente entre sí. No obstante, todos los anticuerpos codificados por los polinucleótidos proporcionados en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento son parte de la divulgación. Las realizaciones se describen ahora en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

La estructura del cetuximab unido a EGFR [1] se usó como punto de partida para el diseño de mutantes. Las mutaciones se introdujeron únicamente en las regiones CDR de la cadena ligera y pesada. En primer lugar, se generaron mutaciones de un solo punto y se evaluaron computacionalmente. La mutagénesis virtual se llevó a cabo con una relajación conformacional opcional tras la mutación mediante algoritmos de muestreo conformacional, tales como minimización de Monte-Carlo [2]. La predicción de las afinidades relativas de unión al antígeno-anticuerpo entre los anticuerpos parentales y mutantes se llevó a cabo con funciones de puntuación de afinidad de unión, tales como la función de energía de interacción solvatada (SIE) [3]. La predicción de las tasas relativas de asociación antígenoanticuerpo (kon) entre anticuerpos parentales y mutantes se llevó a cabo con métodos que evalúan las interacciones electrostáticas de largo alcance, tales como HyPARE [4]. Los mutantes candidatos de un solo punto se ensamblaron en mutantes de puntos múltiples y se volvieron a puntuar para la afinidad de unión relativa.

Los mutantes de puntos múltiples se generaron combinando mutantes de un solo punto entre las cadenas ligeras y pesadas para conseguir el cambio de afinidad deseado. Un requisito era usar el menor número posible de mutantes de un solo punto y maximizar el número de anticuerpos ensamblados generados. Otra característica deseable era generar un conjunto de mutantes con afinidades reducidas debido a un aumento de las tasas de disociación (k-off) o a una disminución de las tasas de asociación (k-on). Entre las mutaciones candidatas adecuadas de un solo punto, aquellas que se dirigen a distintos lugares de la interfaz anticuerpo-antígeno, preferentemente en su periferia, se les dio mayor prioridad.

Preparación de plásmidos

Todos los ADNc que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos se pidieron a GeneArt (Regensburg, Alemania). Los ADNc se extrajeron del plásmido proporcionado por GeneArt mediante digestión con HindIII y se clonaron en el sitio HindIII del plásmido pKCR5 previamente desfosforilado con fosfatasa intestinal de ternero (NEB) para evitar la recirculación. En pKCR5, la transcripción del ADNc está bajo el control del potente promotor CR5, que forma parte del interruptor del gen cumato. El plásmido pKCR5 está disponible en el Biotechnology Research Institute, Montreal, Canadá y está descrito por Mullick et al [6]. Este plásmido de 3,9 kb incorpora un HindIII en el contexto adecuado con el promotor CR5 y una poliA b-globina de conejo, junto con un gen de la B-lactamasa para la selección y orígenes de replicación col Eland f1. Para la transfección de células CHO, todos los plásmidos se aislaron de un gran cultivo de E. coli usando el kit Plasmid Maxi (Qiagen Inc, Mississauga, ON) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se inocularon 200 ml de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina con una sola colonia fresca de E. coli y se incubaron durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa (250 rpm). Las bacterias se sedimentaron por centrifugación a 6000 x g, durante 15 min, a 4 °C y se aisló el plásmido usando los protocolos, tampones y las columnas proporcionadas por el kit. Los plásmidos puros se resuspendieron en TRIS 50 mM estéril, pH 8 y se cuantificaron midiendo la densidad óptica a 260 nm.

Línea celular (CHO-cTA; clon 5F1) y condiciones de crecimiento

La línea celular CHO-cTA (Gaillet et al [5]; Mullick et al. [6]) usada para la transfección transitoria es una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) adaptada para crecer en suspensión y en medio libre de proteínas. La línea celular expresa de forma estable el transactivador cumato (cTA) que activa la transcripción uniéndose al promotor CR5. Las CHO-cTA se mantienen en medio CD-CHO (Invitrogen, CDCHO 10743), suplementado con glutamina 4 mM, 50 pg/ml y sulfato de dextrano (Amersham Pharmacia Biotech) a 37 °C bajo una atmósfera de 5 % de CO². Cuando las células alcanzan una concentración de 1,0 X 106 células/ml (una media de tres veces a la semana) se pasan diluyéndolas hasta una concentración de 5,0 x 104 células/ml usando un medio fresco.

Transfección transitoria de CHO-cTA

Antes de la transfección, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron a una concentración de 2,5 X 106 células/ml en medio de crecimiento sin sulfato de dextrano durante 3 h en un cultivo en suspensión. Se transfectaron 50 ml de células añadiendo lentamente 2,5 ml de un medio CDCHO suplementado con 1 pg/ml de plásmido y 5 pg/ml de polietilenimina (PEI Max; Polysciences). Después de 2 h, las células se transfirieron a 30 °C. En los días siguientes, se añadieron 50 pg/ml de sulfato de dextrano a las células y se incubaron a 30 °C durante un total de 4 días. El sobrenadante se clarificó por centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0,22 pM y se transfirió a -80 °C hasta su posterior análisis.

Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Se resuspendieron cantidades conocidas de sobrenadante en un volumen igual de Laemmli 2X y se calentaron a 95 °C durante 5 min y se enfriaron en hielo. A continuación, las muestras se separaron en un gel de poliacrilamida Tris-Glicina al 10 % de Novex (Invitrogen Canadá Inc, Burlington, ON). Se realizó una curva estándar añadiendo una cantidad conocida de IgG humana purificada. A continuación, se tiñó el gel usando una solución de Coomassie Fluor™-Orange (Molecular Probes, Eugene OR) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La señal se visualizó y cuantificó usando el escáner Typhoon.

Análisis de transferencia Western

Se separaron cantidades conocidas de sobrenadante en SDS-PAGE como se ha descrito anteriormente y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond-N (Amersham Bioscience Corp., Baie d'Urfe, QC) durante 1 h a 275 mA. La membrana se bloqueó durante 1 h en Tween 20 al 0,15 %, leche desnatada al 5 % en PBS y se incubó durante 1 h con una IgG antihumana conjugada con Cy5 (Jackson, Cat. n.° 109-176-099). La señal se reveló mediante el escaneo con el Typhoon Trio+ (Amersham Biosciences, GE Healthcare).

ELISA

Se recubrieron 96 pocillos/placas con 50 pl de IgG de anticabra de humano AffiniPure, (Jackson Immuno Research) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 min a 37 °C con 100 pl de BSA al 1 % en PBS a 37 °C. Se añadieron a los pocillos 25 pl de muestras diluidas con BSA al 1 % en PBS, que se incubaron durante 2 h a 37 °C. Los pocillos se lavaron con Tween 20 al 0,05 % en PBS y se incubaron con una IgG anticabra de humano AffiniPure (H+L) conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research) durante 1 h a 37 °C. Los pocillos se lavaron con Tween 20 al 0,05 % en PBS, seguido de PBS. La señal se reveló mediante la incubación con PNPP durante 30 min a 37 °C. La intensidad de la señal se midió a 405 nm. Se realizó una curva convencional usando una cantidad conocida de anticuerpo purificado (IgG1, kappa del plasma de mieloma (Athens Research Technology).

Purificación del anticuerpo

El sobrenadante se concentró con un Amicon Ultra (Ultracel-50K) a 1500 rpm hasta un volumen de 500 pl. Los anticuerpos de tipo salvaje y mutantes, se purificaron usando las minicolumnas de centrifugado de proteína A ProPur (Nunc) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se desalaron y resuspendieron en PBS usando la columna de desalación PD-10 (GE Healthcare). A continuación, los anticuerpos se concentraron por centrifugación en una membrana Amica Ultra de 100.000 MWCO. Los anticuerpos purificados se cuantificaron mediante la lectura de la densidad óptica a 280 nm usando el espectrofotómetro Nanodrop. Los anticuerpos purificados se mantuvieron congelados a -20 °C en glicerol al 50 %.

Unión in vitro por resonancia de plasmón superficial

El análisis cinético y de afinidad se llevó a cabo usando un instrumento de resonancia de plasmón superficial BioRad Proteon. El tampón de corrida para todas las etapas fue HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM y Tween20 al 0,05 % a pH 7,4. Se preparó un chip sensor de captura de anticuerpos inyectando 6,5 pg/ml de Fc antihumano (Jackson Immunochemicals Inc.) en acetato de sodio 10 mM pH 4,5 a un caudal de 25 pl/min sobre un chip sensor GLM (BioRad Inc.) que había sido previamente activado con una dilución 1/10 de sNHS/EDC (BioRad Inc.) hasta que la superficie se saturó (aproximadamente 5000 UR). Este procedimiento se llevó a cabo en la dirección del analito para asegurar que todas las intermanchas para la referenciación tuvieran Fc antirratón inmovilizado. El cetuximab de tipo salvaje y las variantes se capturaron en la dirección del ligando inyectando 100 pl de sobrenadantes de cultivo al 4 % o muestras purificadas en tampón de corrida a un caudal de 25 pl/min hasta que se capturaron entre 400 y 800 unidades de resonancia. A esto le siguieron inmediatamente dos pulsos de tampón de corrida en la dirección del analito, 50 pl cada uno a un caudal de 100 pl/min para estabilizar el valor inicial. A continuación, se llevó a cabo la inyección simultánea de 100 pl de cinco concentraciones de ectodominio del EGFR (EGFRed) (diluciones de 3 veces de EGFR 20 nM a 1000 nM en función de la afinidad de la variante de cetuximab) y el blanco de tampón a un caudal de 50 pl/min con una disociación de 600 s para analizar la interacción EGFRed-anticuerpo. Se generaron constantes de tasa cinética (tasas de asociación y disociación) y constantes de afinidad a partir de los sensorgramas alineados y con doble referencia con el modelo de unión de Langmuir usando el software BioRad Proteon Manager v3.1. Los mutantes con tasas rápidas de asociación y disociación tuvieron sus constantes de afinidad determinadas usando el modelo de ajuste de equilibrio que usa los valores de meseta de los sensorgramas para generar una isoterma de unión para la determinación de la constante Kd.

Cultivo celular

La línea celular de glioblastoma U87MG se obtuvo de la ATCC (HTB-14). Un EGFR wt de longitud completa transfectado de forma estable o una versión delecionada de variantes de la línea celular que sobreexpresa EGFR vIII fueron regalos de W. Cavanee, Ludwig Institute for Cancer Research, Universidad de California, San Diego). La línea celular epidermoide humana A431 se obtuvo de la ATCC (CRL-1555). Las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (Gibco) con un 10 % de suero bovino fetal (Gibco). Los queratinocitos epiteliales de humanos adultos primarios se obtuvieron de ScienCell (Catálogo n.° 2110) y se cultivaron usando el medio de queratinocitos recomendado por el fabricante (KM, Cat. n.° 2101). En general, las células se pasaban una o dos veces por semana y se usaban en un plazo de 4 a 6 semanas para todos los experimentos.

Detección de la unión del anticuerpo al nivel de EGFR superficial mediante citometría de flujo

Antes del análisis, las células se sembraron en placas de forma que no superaran el 80 % de confluencia el día del análisis. Las células tumorales (derivados de U87 MG, A431) o normal (queratinocitos epidérmicos humanos) se lavaron en PBS y se cosecharon mediante la adición de tampón de disociación celular (Sigma.). Una suspensión celular que contenía 2,5 x 105 células (en 500 pl de medio de cultivo celular correspondiente) se incubó con varias concentraciones (0,01-100 ug/ml) de anticuerpos anti-EGFR durante 2 h a 4 °C (para evitar la internalización). Tras 1 lavado con medio de cultivo celular, el anticuerpo primario se incubó con 2 pg de anticuerpo secundario Alexa 488 de IgG anticabra humano AffiniPure conjugado con Dylight 488 (Jackson Immuno Research 109-487-003) en 100 pl de medio durante 1 h a 4 °C. A continuación, las células se sedimentaron y se almacenaron en hielo hasta que estuvieron listas para ser analizadas por citometría de flujo. Antes del análisis, los sedimentos celulares se resuspendieron en 300-500 pl de medio y se filtraron a través de un filtro de malla de nylon de 50 pm para eliminar los agregados celulares. Los análisis de citometría de flujo se realizaron con 10.000 células viables separadas en parámetros de dispersión hacia adelante, dispersión lateral y exclusión de tinte de yoduro de propidio usando un citómetro de flujo b D LSRII (Becton-Dickinson Biosciences, c A, EE.UU.) y un conjunto de filtros convencional usando el software de adquisición BD FACSDiva™, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La unión específica de anticuerpos se calculó como la intensidad fluorescente media de la unión a cada anticuerpo tras la sustracción del nivel de fondo de la intensidad fluorescente media de la unión en ausencia del anticuerpo primario (pero conteniendo el anticuerpo secundario de detección). Se usó un enfoque alternativo para calcular la unión específica del anticuerpo a las células, es decir, se calculó como el pliegue de unión sobre el fondo dividiendo la intensidad fluorescente media en presencia del anticuerpo primario por la intensidad fluorescente media obtenida en ausencia del anticuerpo primario (pero conteniendo el anticuerpo secundario). Para examinar la selectividad de unión de los anticuerpos, el valor de la unión del anticuerpo al tumor (que sobreexpresa EGFR) se dividió por la unión observada con las células que no sobreexpresan EGFR. Este parámetro, denominado relación de unión, se calculó y se comparó con el observado con el anticuerpo de tipo salvaje. Se usó una fuente comercial de cetuximab (Merck KGaA) como referencia para fines de comparación.

Evaluación de la citotoxicidad mediada por anticuerpos como conjugados anticuerpo-fármaco

En este conjunto de experimentos, los anticuerpos primarios (normalmente 1 nM en concentración) se incubaron con 2 nM de anticuerpo secundario antihumano que se conjugó químicamente con la toxina saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA), una enzima inactivadora de ribosomas que necesita ser internalizada para causar muerte celular. A continuación, se añadió el complejo de anticuerpos a los tipos celulares indicados (sembrados en placas por triplicado) y se midieron sus efectos sobre la viabilidad celular tras 72 h de incubación a 37 °C. La citotoxicidad dirigida por EGFR puede cuantificarse tras la evaluación con controles de citotoxicidad no específica (sin anticuerpo primario o un anticuerpo primario irrelevante (IgG humana de control) para evaluar la citotoxicidad no específica). La viabilidad celular puede medirse mediante técnicas convencionales, incluyendo el uso de sulforhodamina B.

Resultados:

1. Producción y purificación de anticuerpos EGFR

Se sintetizaron nueve ADNcs correspondientes a la secuencia de codificación de los anticuerpos EGFR (GeneArt). Todos los ADNc fueron clonados en el sitio HindlII de pKCR5, un vector de expresión regulado por el transactivador cumato (vector pKCR5, para cada anticuerpo, se transfectaron 50 ml de CHOcTA (que expresa el transactivador cumato, cTA) con varias combinaciones de cadena pesada y ligera. Cuatro días después de la transfección, se analizó el sobrenadante por SDS-PAGE, transferencia Western y ELISA.

La Tabla 3 resume a continuación la cuantificación de los anticuerpos producidos por la transfección transitoria en las células CHOcTA, realizada por ELISA y por transferencia Western usando una IgG1 humana purificada como patrón.

Tabla 3

Las 2 cadenas de tipo salvaje y las 7 cadenas imitantes se purificaron por cromatografía usando una proteína A. Las proteínas purificadas se cuantificaron por DO²⁸⁰(NanoDrop). Los anticuerpos purificados se analizaron por SDS-PAGE no desnaturalizante y desnaturalizante.

2. Determinación de la afinidad de unión de los anticuerpos EGFR por SPR

Los resultados de SPR se muestran en la Tabla 4 y en la Tabla 4-1 a continuación:

Tabla 4

(continuación)

Tabla 4-1

La Tabla 4-1 proporciona determinaciones de afinidad basadas en SPR que han sido refinadas o son adicionales a las proporcionadas en la Tabla 4.

Los resultados indicaron que aproximadamente el 50 % de las variantes de cetuximab no tenían ninguna actividad detectable a los 100 nM de EGFR analizado (datos no mostrados). De las que mostraron actividad de unión (Tabla 4), solo la de tipo salvaje (HC/LC) y la mutante HC-1 tuvieron una tasa de disociación moderadamente lenta. Todas las demás variantes con actividad (3-LC, 4-LC, 4-1, 5-LC, 6-C, 7-LC, 3-1 y HC-2) tuvieron tanto una rápida asociación como disociación del EGFRed que fluye. Las constantes de afinidad (Kd) se determinaron a partir de la relación de las tasas cinéticas (kd s-1/ka s-1M-1) usando un modelo de unión de Langmuir 1:1 cuando era posible, en caso contrario, las constantes de afinidad se determinaron a partir de un ajuste de equilibrio usando únicamente los valores de unión de la meseta. Los mutantes 6-2 y 7-2 mostraron una unión muy débil a 1000 nM de EGFR pero no fueron cuantificables.

3. La unión de los anticuerpos EGFR a varias líneas celulares se determinó mediante citometría de flujo indirecta

La Figura 1 representa un gráfico que muestra la unión de anticuerpos a EGFR de superficie celular presente en la superficie de (A) células U87MG parentales, (B) células U87 que sobreexpresan EGFR wt, (C) células U87 que sobreexpresan EGFR vlII y (D) queratinocitos epidérmicos humanos primarios (HEK), con 1 y 10 pg/ml de mAb (A-C) o 0,1 y 1 pg/ml de mAb (D). Se compararon con el mAb wt (HC-LC, fijado arbitrariamente en el 100 %). En la Figura 1-1 (A y B), los mismos resultados más los adicionales se presentan de forma diferente, es decir, toda la unión se divide por la unión de fondo (es decir, se expresa como un cambio múltiplo sobre la unión de fondo) en lugar de restar la unión de fondo de todos los valores de unión (como en la Figura 1). Este enfoque de análisis de datos resta importancia a las variaciones causadas por pequeños cambios en la unión de fondo. Como cabía esperar, estos resultados demuestran una menor unión de los mAbs anti-EGFR a las células U87 parentales o a las células HEK en comparación con las células tumorales que sobreexpresan EGFR. De manera importante, estos resultados demuestran una mayor reducción de la unión de algunas variantes de mAb anti-EGFR respecto a las células que expresan niveles más bajos de EGFR (células U87 parentales o HEK) en comparación con las células U87 que sobreexpresan EGFR.

4. Evaluación de la unión del anticuerpo a líneas celulares tumorales y normales

La Figura 2 es un gráfico que representa la selectividad de unión de los anticuerpos. Se calculó la relación de la unión del anticuerpo (con el fondo restado) a las células que sobreexpresan EGFR [células U87MGwtEGFR o A431 (que sobreexpresan de forma natural EGFR wt)] en relación con la unión del anticuerpo a las células HEK normales y se comparó con la observada con el anticuerpo de tipo salvaje (relación fijada arbitrariamente en 1 para un anticuerpo wt). Este resultado muestra claramente que algunos de los mAbs EGFr presentan una mejor relación de unión al tumor en relación con las células HEK normales (p. ej., el mutante HC-2 exhibe una relación 20 veces mejor, y el mutante 3-1 exhibe una relación 40-50 veces mejor de unión al tumor versus células normales). En la Figura 2-1, los mismos resultados que en la Figura 2 se muestran usando un enfoque de presentación de datos diferente, es decir, la totalidad de la unión se divide por el fondo. Estos resultados también muestran claramente que algunos de los mAbs EGFR exhiben una mejor relación de unión a las células tumorales que sobreexpresan EGFR en relación con las células HEK normales (p. ej., el mutante HC-2 exhibe una unión diferencial de 80-100 veces, y el mutante 3-1 exhibe una unión diferencial de 120-140 veces a las células tumorales versus las células normales, mientras que el anticuerpo wt (HC-LC) exhibe una unión diferencial de 12-15 veces a las células tumorales versus las células normales. En otras palabras, HC-2 presenta una relación de unión ~6 veces mejor, y el mutante 3-1 exhibe una relación de unión ~9 veces mejor a las células tumorales que a las células normales. El patrón de especificidad de unión fue similar entre las líneas celulares tumorales analizadas (U87MGwt EGFR y a 431), lo que sugiere que la selectividad de unión es universalmente alta para las células tumorales que sobreexpresan EGFR (~2 millones de receptores por célula o más).

Se apreciará además a partir de los resultados mostrados en la Figura 3 que hay una mayor reducción en la unión de algunas variantes de mAb anti-EGFR a las células que expresan (A) niveles más bajos de EGFR (U87 parental) en comparación con (B) las células U87 que sobreexpresan EGFR.

También, como se muestra en la Figura 4, queda claro que la relación de unión del anticuerpo a las células que sobreexpresan EGFR (U87MGwtEGFR) en relación con la unión del anticuerpo a las células U87Mg parentales mejoró en la mayoría de los casos entre 2-4 veces. Es decir, un relación de 11 para la unión del anticuerpo de tipo salvaje a las células U87MGwtEGFR versus las células parentales, y relaciones de hasta 35 para ciertos anticuerpos mutados, p. ej., mutante 7-LC y 4-LC, fueron observadas. Los anticuerpos 6-2 y 7-2 no exhibieron una unión detectable al EGFR en ninguno de los dos tipos de células a las concentraciones usadas (1 pg/ml).

Finalmente, en la Figura 5 se muestra y confirma que algunos anticuerpos mutantes pueden unirse al EGFR y liberar una toxina proteica, en este caso saporina. Los anticuerpos mutantes 6-2 y 7-2 exhibieron una citotoxicidad similar a la observada con los controles no específicos, lo cual no es inesperado ya que no se unen al EGFR de forma detectable en la superficie de estas células (Figura 3). Particularmente, en comparación con el perfil de citotoxicidad observado para el MAb EGFR wt (HC/LC), los anticuerpos 6-LC, 7-LC y 4-1 exhibieron una menor citotoxicidad en células con niveles bajos de EGFR [queratinocitos epidérmicos humanos (HEK) y células U87 parentales] con poca disminución de la citotoxicidad en las células U87 que sobreexpresan EGFR de tipo salvaje.

En síntesis, estos datos indican que se pueden generar anticuerpos mutantes que se unen de forma altamente selectiva a las células que presentan EGFR con una densidad anormalmente alta, y que estos anticuerpos pueden ser útiles en oncología y otras enfermedades como conjugados anticuerpo-fármaco con amplias ventanas terapéuticas, y/o como agentes de diagnóstico para la detección de células que sobreexpresan EGFR.

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4. Selzer T, Albeck S, Schreiber G (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-541.

5. Gaillet, B., R. Gilbert, R. Amziani, C. Guilbault, C. Gadoury, A. W. Caron, A. Mullick, A. Garnier y B. Massie.

2007. High-Level Recombinant Protein Production in CHO Cells Using an Adenoviral Vector and the Cumate Gene-Switch. Biotechnol. Prog. 23-200-209

6. Mullick, A., Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, A. W. Caron, A. Pilotte y B. Massie. 2006. The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 6,43

A continuación se presentan los polinucleótidos que codifican las diversas cadenas de anticuerpos mutantes. Los codones sustituidos están sombreados y los sitios HindIII están resaltados:

Tipo salvaje de cadena ligera (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No. 11]:

GTTTAAACGAATTCGCCCTTGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGTGCTGCAGACCCAGGT GTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGACATCCTGCTGACCCAGTC CCCCGTGATCCTGTCCGTGTCCCCTGGCGAGCGGGTGTCCTTCTCTTGCCGGGCCTCCCA GTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCTCCCCTCGGCTGCT GATCAAGTACGCCTCCGAGTCTATCTCCGGCATCCCTTCCCGGTTCTCCGGCTCTGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAGTCCGAGGATATCGCCGACTACTA CTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCTACCACCTTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTGAA GCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTC CGGCACCGCCTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCA GTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGA CTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGA GAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAA GTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAAGCTTGAGCTCAGTAAGGGCGAATTCGCGGCCGC

Mutante E58K de cadena ligera (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No. 12]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGTGCTGCAG ACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGACATCCTGCTG ACCCAGTCCCCCGTGATCCTGTCCGTGTCCCCTGGCGAGCGGGTGTCCTTCTCTTGCCGG GCCTCCCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCTCCCCT

c g g c t g c t g a t c a a g t a c g c c t c c O [ t c t a t c t c c g g c a t c c c t t c c c g g t t c t c c g g c TCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAGTCCGAGGATATCGCC GACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCTACCACCTTCGGCGCTGGCACCAAGCTG GAACTGAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAG CTGAAGTCCGGCACCGCCTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCC AAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACC GAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCC GACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCT GTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGC CTTGACGGCCTTCCG

Mutante W94A de cadena ligera (mostrado en este caso con el péptido señal): [SEQ ID No.13]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGTGCTGCAG ACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGACATCCTGCTG ACCCAGTCCCCCGTGATCCTGTCCGTGTCCCCTGGCGAGCGGGTGTCCTTCTCTTGCCGG GCCTCCCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCTCCCCT CGGCTGCTGATCAAGTACGCCTCCGAGTCTATCTCCGGCATCCCTTCCCGGTTCTCCGGC TCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAGTCCGAGGATATCGCC GACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACUCCTACCACCTTCGGCGCTGGCACCAAGCTG GAACTGAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAG CTGAAGTCCGGCACCGCCTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCC AAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACC GAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCC GACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCT

GTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGC CTTGACGGCCTTCCG

Tipo salvaje de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No. 14]: CGAATTGAAGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCC CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG CAGTCCAACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGGGCTCTGACCTACTACGACTACGAG TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCCTGGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCC

Mutante Y101A de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No.15]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCC CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG CAG T C CAAC GACAC CGC CAT CTACTACTGCGC CAG GGCTCT GAC C ^ ^ T A C GAC TAC GAG TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGCCTTGACGGCCTTCCG

Mutante Y102A de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) SEQ ID No.16:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCC CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG

c a g t c c a a c g a c a c c g c c a t c t a c t a c t g c g c c a g g g c t c t g a c c t a c U g a c t a c g a g TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGCCTTGACGGCCTTCCG

Mutante D103N de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No.17]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCC CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG CAG T C CAAC GACAC CGC CAT CTACTACTGCGC CAG GGCTCT GAC CTAC T A C (^ T A C GAG TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGCCTTGACGGCCTTCCG

Mutante D58N/D103N de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No.18]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACC§jjjj|[TACAACACCCCTTTCACCTCC CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG CAG T C CAAC GACAC CGC CAT CTACTACTGCGC CAG GGCTCT GAC CTAC T A C ^ T A C GAG TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGCCTTGACGGCCTTCCG

Mutante D58N/D103N/E105Q de cadena pesada (mostrado en este caso con el péptido señal) [SEQ ID No. 19]:

CGGAAGGCCCATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCAAGCTTGCCACCATGGACTGGACC

TGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTGAAG

CAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGCAGCCTTCCCAGTCCCTGTCCATCACCTGTACCGTGTCC

GGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTGCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTG

GAATGGCTGGGAGTGATTTGGTCCGGCGGCAACACC! ACAACACCCCTTTCACCTCC

CGGCTGTCCATCAACAAGGACAACTCCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTG

C AG T C C AAC GAC AC C G C C AT C T AC TAC T G C G C C AG G G C T C T G AC C T AC T AC| I^{t a}

TTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCGCCGCTTCCACCAAGGGCCCT

AGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGCACCGCTGCTCTGGGC

TGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTG

ACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC

TCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACCTACATCTGCAACGTGAAC

CACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACC

CACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC

CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG

GTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG

GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTG

TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTC

TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCT

CGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTG

TCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT

AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCC

TTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC

TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTG

TCCCCTGGCAAGTGAAAGCTTGAGCTCATGGCGCGCCTAGGCCTTGACGGCCTTCCG

Las secuencias de aminoácidos que constituyen las cadenas de tipo salvaje y mutante de anticuerpos se proporcionan a continuación. El péptido señal se indica usando letras minúsculas y no se incluye en la numeración de los residuos. Las posiciones mutadas están en negrita en las secuencias mutantes.

Tipo salvaje de cadena ligera [SEQ ID n° 20]:

mvlqtqvfislllwisgaygDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRT

NGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGA

GTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Mutante E58K de cadena ligera [SEQ ID n° 21]:

mvlqtqvfi sillwisgaygDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRT

NGSPRLLIKYASKSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGA

GTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Mutante W94A de cadena ligera [SEQ ID n° 22]:

mvlqtqvfisillwisgaygDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTM

GSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNAPTTFGAGT

KLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV

TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Tipo salvaje de cadena pesada [SEQ ID No. 23]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSP

GKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTY

YDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS

CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Mutante Y101A de cadena pesada [SEQ ID No. 24]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPG

KGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTAYD

YEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE

PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEMNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK

Mutante Y102A de cadena pesada [SEQ ID No. 25]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGK

GLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYADYE

FAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR

EEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Mutante D103N de cadena pesada [SEQ ID No. 26]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGL

EWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYNYEFAYW

GQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHMHYTQKSLSLSPGK

Mutante D58N/D103N de cadena pesada [SEQ ID No. 27]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLE

WLGVIWSGGNTNYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYNYEFAYWGQ

GTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK

Mutante D58N/D103N/E105Q de cadena pesada [SEQ ID No. 28]:

mdwtwrilfIvaaatgthaQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLE

WLGVIWSGGNTNYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYNYQFAYWGQ

GTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que se une preferentemente a células patológicas que tienen una densidad de EGFR mayor que una densidad de EGFR normal, en donde las células patológicas se presentan con más de 10.000 moléculas de EGFR por célula y las células normales se presentan con no más de 10.000 moléculas de EGFR por célula, comprendiendo el anticuerpo EGFR una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo cada cadena una región constante y una región variable, comprendiendo cada región variable secuencias de región marco conservada de cetuximab y regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en donde las CDR tienen una secuencia de aminoácidos expuesta a continuación:

Para la cadena pesada:

CDR1 NYGVH (SEQ ID No. 1)

CDR2 VIWSGGNTD58YNTPFTS (SEQ ID No.2)

CDR3 ALTY101Y102D103YE105FAY (SEQ ID No.3)

Para la cadena ligera:

CDR1 RASQSIGTNIH (SEQ ID No. 4)

CDR2 ASE53SIS (SEQ ID No. 5)

CDR3 QQNNNW94PTT (SEQ ID No. 6)

en donde al menos uno de E53 está sustituido con K53; D58 está sustituido con N58; W94 está sustituido con A94; Y101 está sustituido con A101; Y102 está sustituido con A102; D103 está sustituido con N103; E105 está sustituido con Q105, en donde el aminoácido sustituido confiere a dicho anticuerpo una afinidad de unión a EGFR reducida (Kd) que es de 1,0 nM o más débil, en donde cuando D58 está sustituido con N58, esto se realiza en combinación con D103 que está sustituido con N103 y cuando E105 está sustituido con Q105, esto se realiza en combinación con D58 estando sustituido con N58 y D103 estando sustituido con N103.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Y101 está sustituido con A101, Y102 está sustituido con A102 o D103 está sustituido con N103.

3. El anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde E53 y Y102 están ambos sustituidos.

4. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde E53 está sustituido con K53 y Y102 está sustituido con A102.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde E53 está sustituido con K53.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde W 94 está sustituido con A94.

7. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, teniendo el anticuerpo la secuencia de región constante de cetuximab.

8. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que es [D58N,D103N]cetuximab.

9. Un fragmento bivalente de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 que se une preferentemente a las células patológicas que tienen una densidad de EGFR superior a una densidad de EGFR normal.

10. Un conjugado que comprende una citotoxina o un marcador detectable y, conjugado al mismo, un anticuerpo o un fragmento bivalente del mismo como se define de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo EGFR, un fragmento bivalente del mismo y/o un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 o un anticuerpo EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un fragmento bivalente de acuerdo con la reivindicación 9 y/o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 o un anticuerpo EGFR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un fragmento bivalente de acuerdo con la reivindicación 9 y/o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de un cáncer.14*

14. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cáncer son cánceres que presentan EGFR que incluyen cánceres de cabeza y cuello, especialmente carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cánceres colorrectales, cánceres gastrointestinales, tumores cerebrales, incluyendo glioblastomas y tumores de pulmón, incluyendo carcinoma pulmonar de células no pequeñas, y de mama, páncreas, esófago, riñón, ovario, cuello de útero y próstata.