ES2859873T3 - Composición de cuidado de las articulaciones - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina para su uso en la prevención y/o el tratamiento de osteoartritis.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de cuidado de las articulaciones
La presente invención se refiere a una composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina para su uso en la prevención o el tratamiento de la osteoartritis. También se refiere a un método de prevención o tratamiento de la osteoartritis en mamíferos, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina.
El deterioro del cartílago se puede provocar por varios motivos, tales como ejercicio reiterado, inestabilidad de la articulación, etc., que pueden dar como resultado la inflamación de las articulaciones. Mientras que la mayor parte de los seres humanos con artritis tienen artritis reumatoide, la mayoría de las artritis que ocurren en los animales de compañía es la osteoartritis.
Hoy en día, no existe una cura para la osteoartritis, y el tratamiento farmacológico se limita a aliviar los síntomas. Los más populares son fármacos antiinflamatorios no esteroideos, pero estos están asociados con efectos adversos. Se desea un tratamiento más seguro.
El documento de patente PCT WO 2010/106191 desvela composiciones que presentan propiedades antiinflamatorias que comprenden curcumina. La solicitud de patente coreana KR20120033633 desvela composiciones que comprenden curcumina para los efectos promotores del crecimiento óseo. El documento de patente PCT WO 00/74662 desvela el uso de catequinas en el tratamiento de diversas formas de artritis. Katiyar et al. (2011, Arthritis Research & Therapy, Vol. 13 : 121) sugieren el uso de té verde para la prevención o el control de osteoartritis. La solicitud de patente de EE. UU. US 2006/0172012 desvela composiciones de suplementos antiinflamatorios para reducir los riesgos de la enfermedad cardiovascular, comprendiendo la composición del Ejemplo 1 notablemente curcumina y extracto de té verde. Bello et al. (2006, Current Medical Research and Opinion, Vol. 22(11) : 2221-2232) desvelan el uso de hidrolizado de colágeno para el tratamiento de la osteoartritis. Benito-Ruiz et al. (2009, International Journal of Food Sciences and Nutrition, Vol. 60(S2) : 99-113) desvela un ensayo controlado aleatorizado sobre la eficacia y la seguridad de un ingrediente alimentario, el hidrolizado de colágeno, para mejorar el bienestar articular. Trc et al. (2011, International Orthopaedics (SICOT), Vol. 35 : 341-348) desvelan el uso de colágeno hidrolizado enzimático en el tratamiento de osteoartritis de rodilla (OAR).
El primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina para su uso en la prevención y/o el tratamiento de osteoartritis. El tratamiento de la osteoartritis incluye mejorar los síntomas de la osteoartritis.
La presente invención se refiere, para todos los aspectos, a cualquier mamífero, que incluye un humano. En particular, la presente invención se refiere a un animal de compañía, tal como un perro, un gato o un animal equino (por ejemplo, un caballo) o cualquier otro animal de este tipo que padece o tiene tendencia a padecer osteoartritis.
La composición de la presente divulgación comprende curcuminoide. El curcuminoide es curcumina o un derivado de la curcumina. Las estructuras químicas de los curcuminoides se diferencian en sus grupos funcionales.
El curcuminoide incluye curcumina, demetoxicurcumina, bis-metoxicurcumina y/o polifenol de té verdea.
Los curcuminoides son fenoles naturales que están presentes, en particular, en la especia india cúrcuma. La cúrcuma deriva de las raíces de la planta Curcuma longa. También se han encontrado curcuminoides en las raíces de otras especies en la familia de plantas Zingiberaceae del género Curcuma. Los curcuminoides tienen un sabor a pimienta, amargo, perceptiblemente terroso, y un olor a la mostaza.
En particular, la cúrcuma contiene 60-80 % de curcumina, 15-30 % de demetoxicurcumina y 2-6 % de bisdemetoxicurcumina.
El curcuminoide en la composición de la divulgación puede ser de cualquier formato, que incluye un polvo o extracto lipídico.
En algunas realizaciones, el curcuminoide se puede mezclar con fosfolípidos y/o celulosa, almidón o derivados de los mismos para formar complejos. Esto puede ayudar en la estabilidad y/o para aumentar aún más la solubilidad y la biodisponibilidad del curcuminoide.
El curcuminoide se puede mezclar con aceites esenciales, piperina o bromelaína. El curcuminoide se puede mezclar con fosfatidilcolina, por ejemplo, lecitina.
Preferentemente, el curcuminoide de la presente invención es curcumina, que es el curcuminoide más activo. La curcumina según la presente invención incluye demetoxicurcumina, b/'s-demetoxicurcumina y/o polifenol de té verde.
La composición de la divulgación comprende curcuminoide y polifenol de té verde.
El té (Camellia sinensis), en particular el té verde, tiene un alto contenido de flavonoides, que incluye polifenoles, en particular catequinas. Las catequinas en el té incluyen 3-galato de epigalocatequina (EGCG), epicatequina (EC), 3-galato de epicatequina (ECG), epigalocatequina (EGC), catequina y galocatequina (GC).
Preferentemente, los polifenoles de té verde incluyen catequina. Preferentemente, la catequina incluye EGCG. El extracto de té verde contiene normalmente al menos aproximadamente 25 % de polifenoles, aproximadamente 12,5 % de catequinas y aproximadamente 9,3 % de EGCG.
El galato de epigalocatequina (EGCG) es el éster de epigalocatequina y ácido gálico. El EGCG es la catequina más abundante en el té y es un potente antioxidante. Se encuentra particularmente en el té verde. La EGCG es un polifenol de té verde importante y presenta actividades antioxidantes, antitumorales y antimutagénicas.
La composición de la divulgación comprende curcumina y una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina.
Una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina representa 50 % del contenido total de aminoácidos del colágeno hidrolizado. Preferentemente, una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado. La composición de aminoácidos del colágeno hidrolizado es como se expone en la siguiente tabla:
Tabla 1
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El colágeno hirolizado se obtiene por la hidrólisis enzimática de tejidos colagenosos encontrados en los huesos, la piel y el tejido conjuntivo de animales, tales como ganado vacuno, peces, caballos, cerdos y conejos. El colágeno hidrolizado se digiere bien y se acumula preferentemente en el cartílago.
Una composición preferida incluye curcuminoide, polifenol de té verde y una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina. Preferentemente, esta composición incluye curcumina, polifenol de té verde y colágeno hidrolizado.
La composición es preferentemente un alimento. Puede ser cualquier alimento, tal como un producto alimenticio seco, semihúmedo o mojado. En particular, el alimento puede ser un producto alimenticio para mascotas.
El producto alimenticio para mascotas es preferentemente un producto alimenticio para mascotas comercial. Dicho producto se vende preferentemente como un producto para alimentar a una mascota, en particular un gato o un perro.
Un alimento para mascotas típico contiene aproximadamente 20-30 % de proteína cruda y aproximadamente 10-20 % de grasa, siendo el resto hidrato de carbono, que incluye fibra vegetal y ceniza. Un producto mojado o húmedo típico contiene (en una base de materia seca) aproximadamente 40 % de grasa, 50 % de proteína y siendo el resto fibra y ceniza. El alimento de la divulgación puede ser un producto seco (con aproximadamente 5 a aproximadamente 15 % de humedad), un producto semihúmedo (con aproximadamente 15 a aproximadamente 70 % de humedad) o un producto mojado (con aproximadamente 70 a aproximadamente 90 % de humedad).
Los componentes restantes del alimento no son esenciales para la invención y se pueden incluir productos comunes típicos. Los ingredientes combinados del alimento según la divulgación pueden proporcionar todas las vitaminas y minerales recomendados para el animal particular en cuestión (un alimento completo y equilibrado).
El alimento según la presente divulgación engloba cualquier producto que consuma una mascota en su dieta. Así, la divulgación cubre productos alimenticios comunes que incluyen líquidos, así como snacks para mascotas (por ejemplo, barritas, masticables para mascotas, golosinas crujientes, barritas de cereales, snacks, galletas y productos dulces) y suplementos.
El alimento se puede proporcionar como un suplemento alimenticio. El suplemento alimenticio puede ser un polvo, salsa, aderezo, galleta, croqueta, bolsa o pastilla que se puede administrar con o sin un alimento adicional. Si el suplemento alimenticio se administra con un alimento adicional, el suplemento alimenticio se puede administrar uno detrás del otro simultáneamente o por separado. El suplemento alimenticio se puede mezclar con el alimento, rociar sobre el alimento o servir por separado. Alternativamente, el suplemento alimenticio se puede añadir a un líquido proporcionado para beber, tal como agua o leche.
El alimento es preferentemente un producto cocinado. Puede incorporar carne o material derivado de animal (tal como ternera, pollo, pavo, cordero, pescado, plasma sanguíneo, hueso para masticar, etc., o uno o más de los mismos). El producto puede estar alternativamente libre de carne (que incluye preferentemente un sustituto cárnico tal como soja, gluten de maíz o un producto de soja) para proporcionar una fuente de proteína. El alimento puede contener fuentes de proteína adicionales tales como concentrado de proteína de soja, proteínas de la leche, gluten etc. El alimento también puede contener una fuente de almidón, tal como uno o más granos (por ejemplo, trigo, maíz, arroz, avena, cebada, etc.), o puede estar libre de almidón.
El alimento de la divulgación se produce preferentemente como un producto seco que contiene de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 % de humedad. El alimento seco preferido se presenta más preferentemente como una galleta pequeña - como croquetas.
La tabla siguiente detalla la cantidad de la composición según la presente divulgación y la cantidad de la composición para que los perros la tomen según la presente invención:
Figure imgf000004_0001
La composición en el primer aspecto de la divulgación puede comprender curcuminoide en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,005 hasta 1,1 % en peso de curcuminoide en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de curcuminoide puede ser cualquier cantidad desde 0,005 hasta 1,1 % (tal cual). La cantidad de curcuminoide puede ser cualquier cantidad desde 0,1 hasta 1 % (tal cual). La cantidad de curcuminoide puede ser cualquier cantidad desde 0,1 hasta 0,6 % (tal cual). La cantidad de curcuminoide puede ser cualquier cantidad desde 0,3 hasta 0,6 % (tal cual).
La composición en el primer aspecto de la divulgación puede comprender curcuminoide en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,005 hasta 0,15 % en peso de curcuminoide en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de curcuminoide puede ser cualquier cantidad desde 0,005 hasta 0,15 % (tal cual) (7 a 99 mg/400 kcal).
Cuando la dieta es seca el peso "tal cual" es el mismo que el "peso de materia seca".
Preferentemente, la cantidad de curcuminoide en la composición varía desde aproximadamente 0,01 hasta 0,07 % (tal cual) (14 a 46 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de curcuminoide es 0,035 % (tal cual) (36 mg/400 kcal).
En algunas realizaciones, el curcuminoide en la composición es curcumina en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,005 hasta 0,15 % en peso de curcumina en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de curcumina puede ser cualquier cantidad desde 0,005 hasta 0,15 % (tal cual) (7 a 99 mg/400 kcal). Preferentemente, la cantidad de curcumina varía desde aproximadamente 0,01 hasta 0,05 % (tal cual) (14 a 32 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de curcumina es 0,026 % (tal cual) (27 mg/400 kcal).
La composición en el primer aspecto de la divulgación puede comprender polifenol de té verde en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,01 hasta 1,1 % en peso de polifenol de té verde en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de polifenol de té verde puede ser cualquier cantidad desde 0,01 hasta 1 ,1 % (tal cual). La cantidad de polifenol de té verde puede ser cualquier cantidad desde 0,1 hasta 1 % (tal cual). La cantidad de polifenol de té verde puede ser cualquier cantidad desde 0,1 hasta 0,6 % (tal cual). La cantidad de polifenol de té verde puede ser cualquier cantidad desde 0,3 hasta 0,6 % (tal cual).
La composición en el primer aspecto de la divulgación puede comprender polifenol de té verde en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,01 hasta 0,3 % en peso de polifenol de té verde en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de polifenol de té verde puede ser cualquier cantidad desde 0,01 hasta 0,3 % (tal cual) (14 a 197 mg/400 kcal). Preferentemente, la cantidad de polifenol de té verde varía desde aproximadamente 0,03 hasta 0,17 % (tal cual) (43 a 113 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de polifenol de té verde es 0,085 % (tal cual) (87 mg/400 kcal).
En algunas realizaciones, el polifenol de té verde es EGCG en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,005 hasta 0,2 % en peso de EGCG en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento (7 to 131 mg/400 kcal). La cantidad de EGCG puede ser cualquier cantidad desde 0,01 hasta 0,06 % (tal cual) (14 a 39 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de EGCG es 0,032 % (tal cual) (33 mg/400 kcal).
La composición en el primer aspecto de la divulgación puede comprender una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,5 hasta 10 % en peso de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas puede ser cualquier cantidad desde 0,5 hasta 10 % (tal cual) (720 a 6591 mg/400 kcal). Preferentemente, la cantidad de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas varía desde aproximadamente 1,2 hasta 5 % (tal cual) (1736 a 3295 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas es 2,7 % (tal cual) (2780 mg/400 kcal).
En alguna realización, la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado en una cantidad que varía desde aproximadamente 0,5 hasta 5 % en peso de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas en un porcentaje en peso "tal cual" del alimento. La cantidad de colágeno hidrolizado puede ser cualquier cantidad desde 0,5 hasta 5 % (tal cual) (720 a 3295 mg/400 kcal). Preferentemente, la cantidad de colágeno hidrolizado varía desde aproximadamente 0,7 hasta 3,2 % (tal cual) (1016 a 2138 mg/400 kcal). Lo más preferentemente, la cantidad de colágeno hidrolizado es 1,7 % (tal cual) (1750 mg/400 kcal).
En otras realizaciones, la composición puede comprender curcumina en una cantidad de aproximadamente 27 mg/400 kcal (35 mg/400 kcal de curcuminoides) con aproximadamente 87 mg/400 kcal de polifenol de té verde y con aproximadamente 2757 mg/400 kcal de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado. Preferentemente, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado y está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1747 mg/400kcal.
En otras realizaciones, la composición puede comprender curcumina en una cantidad de aproximadamente 33 mg/400 kcal (43 mg/400 kcal de curcuminoides) con aproximadamente 106 mg/400 kcal de polifenol de té verde y con aproximadamente 3295 mg/400 kcal de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado. Preferentemente, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado y está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 2108 mg/400kcal.
En otras realizaciones, la composición puede comprender curcumina en una cantidad de aproximadamente 15 mg/400 kcal (22 mg/400 kcal de curcuminoides) con aproximadamente 51 mg/400 kcal de polifenol de té verde y con aproximadamente 1736 mg/400 kcal de glicina, prolina e hidroxiprolina combinadas, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado. Preferentemente, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado y está presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1016 mg/400kcal.
Estos valores se aplican a una composición para alimentar a un mamífero, en particular un animal de compañía.
El segundo aspecto de la divulgación se refiere a un método de prevención o tratamiento de la osteoartritis en mamíferos.
La osteoartritis (OA) es una afección degenerativa e inflamatoria que afecta a las articulaciones en los mamíferos. También se conoce como artritis degenerativa o artrosis. La osteoartritis es un grupo de anomalías que implica la degradación de articulaciones, que incluyen cartílago articular y hueso subcondral.
La osteoartritis es la consecuencia de un desequilibrio del catabolismo y el anabolismo, en donde el catabolismo es elevado; el anabolismo disminuye causando la inflamación de condrocitos. Los condrocitos son las únicas células encontradas en el cartílago sano. Producen y mantienen la matriz cartilaginosa, que consiste principalmente en colágeno y proteoglicanos. La composición de la divulgación ha demostrado que proporciona, entre otras cosas, una disminución en la inflamación, una disminución en el catabolismo y un aumento en el anabolismo en los condrocitos inducidos por inflamación in vitro y en los condrocitos sanos in vitro. Así, la composición de la divulgación previene y/o trata la osteoartritis en animales.
La presente divulgación se refiere, para todos los aspectos, a cualquier mamífero, que incluye un ser humano. En particular, la presente divulgación se refiere a un animal de compañía tal como un perro, un gato o un animal equino (por ejemplo, un caballo) o a cualquier otro animal de este tipo que sufra o tenga tendencia a padecer osteoartritis.
En particular, es un deseo en el área del alimento para mascotas y la salud de los animales de compañía proporcionar un alimento que incluya suplementos adecuados para reforzar la salud de los animales de compañía. En particular, es un deseo proporcionar dietas adecuadas para promover o mantener la salud de los animales de compañía ya sanos.
En particular, el segundo aspecto de la divulgación proporciona un método de prevención y tratamiento de la osteoartritis en los mamíferos, que incluye mejorar los síntomas de la osteoartritis, en particular de animales de compañía. El método comprende administrar a dicho animal una composición que comprende curcumina con polifenol de té verde o con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina. El animal puede estar en necesidad del mismo. Puesto que un número significativo de perros sufre osteoartritis de por vida, todos los perros se pueden considerar en necesidad de prevención.
En realizaciones particulares, el método comprende administrar a dicho animal una composición que comprende curcumina, polifenol de té verde y una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina. Lo más preferentemente, la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado.
Además, el método se administra preferentemente a un animal, en particular un animal de compañía, que sufre osteoartritis y está en necesidad de mejorar los síntomas de la osteoartritis o en necesidad de prevenir síntomas adicionales de la osteoartritis, o en necesidad de tratamiento de la osteoartritis. Esto puede ser para, por ejemplo, una mascota joven, tal como un cachorro, o para un animal de compañía anciano. Si la composición es un alimento, el alimento se puede administrar en un régimen alimentario según el régimen alimentario usual del animal de compañía. El alimento puede comprender 100 % de la dieta del animal de compañía o una menor proporción, dependiendo del nivel de prevención o tratamiento requerido. El alimento permite que la composición se administre con facilidad, evitando así una necesidad de suplementar la comida del animal de compañía. Además, el propietario del animal puede alimentar el alimento, evitando así la constante supervisión del veterinario. El producto alimenticio puede estar disponible en cualquier punto de venta de productos alimenticios para mascotas o puede estar disponible de un veterinario. El alimento puede ser como se ha descrito anteriormente según el primer aspecto de la divulgación.
Como se usa en el presente documento, el término "administración" también incluye la alimentación o cualquier otro método de administración por vía oral. Otros medios de administración pueden incluir comprimidos, cápsulas, inyección, supositorios o cualquier otro medio adecuado.
Las características preferidas del segundo aspecto de la divulgación se aplican como para el primer aspecto cambiando lo que haya que cambiar.
La presente descripción incluye un método de preparación de la composición del primer aspecto de la divulgación.
El alimento se puede preparar según cualquier método conocido en la técnica, tal como en Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, capítulo por A. Rainbird, titulado "A Balanced Diet" en las páginas 57 a 74 Pergamon Press Oxford
Por ejemplo, un proceso para la fabricación de un alimento como se define en el presente documento comprende mezclar juntos los ingredientes con la composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde o con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina, y formar un alimento, en particular un alimento para mascotas. Se puede aplicar calor / cocción a uno cualquiera o más de los ingredientes antes, durante o después de la mezcla.
La composición se puede pulverizar sobre el alimento, mezclar con el alimento o incorporar en el alimento en una matriz. Se conocen en la técnica los métodos de inclusión de la composición.
La importancia de la presente invención es las propiedades beneficiosas de curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina (opcionalmente como colágeno hidrolizado). En particular, se observa un efecto que es superior al efecto acumulado.
Se observa un beneficio adicional con la combinación triple de ingredientes de: curcuminoide, polifenol de té verde y glicina, prolina e hidroxiprolina (opcionalmente como colágeno hidrolizado).
La combinación de los compuestos de la composición de la presente divulgación puede proporcionar un efecto sinérgico en términos de uno o más de disminuir la inflamación, disminuir el catabolismo y aumentar el anabolismo.
La invención se describirá ahora aún más a modo de referencia de los siguientes ejemplos, que se proporcionan con el fin de ilustración solo y no se deben interpretar como que son limitantes de la invención.
Ejemplo 1: Cribado individual de compuestos
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar el efecto de varios compuestos sobre el cultivo primario de condrocitos bovinos, en el que los procesos inflamatorios y catabólicos se inducen por la interleucina-1 beta para imitar el efecto de condrocitos artríticos.
La siguiente tabla detalla los biomarcadores que se midieron durante los experimentos para mostrar el efecto de los compuestos de las tres vías metabólicas sobre los condrocitos.
Tabla 3: Biomarcadores probados
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Cultivo primario de condrocitos bovinos en monocapa
Se obtuvo cartílago articular bovino normal de la articulación metacarpiana-falángica de cabestros de 1 a 2 años poco después de la muerte. Se extirpó el cartílago articular de profundidad completa y se sumergió en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (con rojo de fenol y 4,5 g/L de glucosa) complementado con ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) 10 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml) (todos de Lonza, Verviers, Bélgica). Después de tres lavados, los condrocitos se liberaron del cartílago por digestiones enzimáticas secuenciales con 0,5 mg/mL de hialuronidasa tipo IV S (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) durante 30 min a 37 °C, 1 mg/mL de pronasa E (Merck, Leuven, Bélgica) durante 1 h a 37 °C y 0,5 mg/mL de colagenasa clostridial IA (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) durante 16 a 20 h a 37 °C. Entonces se filtraron las células enzimáticamente aisladas a través de una malla de nailon (70 pr|r|), se lavaron tres veces, se contaron y se llenaron hasta la densidad de 0,25 x 106 células/mL de DMEM (con rojo de fenol y 4,5 g/L de glucosa) complementado con 10 % de suero bovino fetal, HEPES 10 mM, 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, glutamina 2 mM (todos de Lonza, Verviers, Bélgica) y 20 pg/mL de prolina (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica). Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 0,5 X 106 células/pocillo añadiendo 2 mL del medio de cultivo previamente descrito/pocillo y se cultivaron en monocapa durante 5 días. Entonces se cultivaron en monocapa los condrocitos hasta la confluencia (durante aproximadamente 2 días) en DMEM (libre de rojo de fenol y que contiene solo 1 g/L de glucosa) (Lonza, Verviers, Bélgica) complementado con 1 % de suero bovino fetal, HEpES 10 mM, 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, glutamina 2 mM y 20 pg/mL de prolina. Solo se usaron cultivos primarios para garantizar la estabilidad del fenotipo de los condrocitos.
Cuando las células alcanzaron la confluencia, se retiró el medio de cultivo y se sustituyó por medio de cultivo fresco (DMEM libre de rojo de fenol y que contiene solo 1 g/L de glucosa complementado con 1 % de suero bovino fetal, HEPES 10 mM, 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, glutamina 2 mM y 20 pg/mL de prolina) que contiene algunos nutricéuticos (12,5 pg/mL de cada uno de ellos) y en ausencia o presencia de IL-1 p porcina recombinante (10"11 M) (RD Systems, Abingdon, RU).
Se probó la potencia antiinflamatoria de los compuestos (en primer lugar individualmente y luego en combinación) midiendo la viabilidad de los condrocitos y la producción de PGE2 y NO.
Los compuestos se añadieron al medio de cultivo o bien antes de la inflamación (medición del efecto de prevención), o bien simultáneamente con la inflamación (medición del efecto de tratamiento).
Lista de compuestos cribados:
1) Aceite de pescado: 18 % de EPA 10 % de DHA (DSM)
2) EPA 99 % (Sigma):
3) DHA 99 % (Sigma):
4) Aloe vera (Naturex)
5) Extracto de hoja de ortiga (Naturex)
6) Resvida: 99 % de resveratrol (DSM)
7) Extracto de té verde: 25 % de polifenoles de los que 12,5 % son catequinas y 8 % es EGCG: (Naturex) 8) Extracto de corteza de pino: Picnogenol: 65-75 % de procianidinas (Biolandes)
9) Premezcla de vitaminas que incluyen vitamina D3
10) GLM (AromaNZ)
11) Hidrolizado de colágeno (Fortigel de Gelita [3,3 kDa]: colágeno de cerdo hidrolizado)
12) ASU (Sochim)
13) Polvo de cúrcuma: 85 % de curcuminoides (Naturex)
Los resultados mostraron que los 3 compuestos a usar fueron extracto de cúrcuma, colágeno hidrolizado y extracto de té verde, que mostraron efectos significativos sobre los diferentes parámetros. Después de eso, se probaron estos 3 compuestos en respuesta-dosis.
Ejemplo 2: Dosis-respuestas
Se siguió la metodología del Ejemplo 1. Se probaron cuatro concentraciones diferentes para cubrir el rango de concentraciones correspondiente a 10"5, dependiendo del peso molecular: 0,5 pg mL, 2,5 pg mL, 12,5 pg mL y 62,5 pg mL.
Los resultados mostraron que la concentración que dio los mejores efectos sin dar efectos tóxicos fue 12Ag/mL para cada compuesto. Esto es por lo que se usó la concentración de 12Ag/mL para probar los compuestos en combinación entre sí.
Ejemplo 3: Combinaciones particulares de prueba de los compuestos y los efectos sinérgicos
Se siguió el método del Ejemplo 1.
Suplementación con compuestos
Cuando las células alcanzaron la confluencia, se retiró el medio de cultivo y se sustituyó por medio de cultivo recién preparado (DMEM libre de rojo fenol y que solo contiene 1 g/L de glucosa complementada con 1 % de suero bovino fetal, HEPES 10 mM, 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, glutamina 2 mM y 20 pg mL de prolina) que contiene algunos compuestos (12,5 pg mL de cada uno de ellos) y en ausencia o presencia de IL-1 p porcina recombinante (10"11 M) (RD Systems, Abingdon, RU).
Se probaron los tres compuestos, concretamente, extracto de cúrcuma (Naturex, Avignon, Francia), colágeno hidrolizado (Gelita, Eberbach, Alemania) y extracto de té verde (Naturex, Avignon, Francia). El extracto de cúrcuma se preparó como una disolución de 12,5 mg/mL en tetrahidrofurano (Merck, Leuven, Bélgica) y luego se diluyó 1000 veces más en medio de cultivo celular. Se disolvieron el colágeno hidrolizado y el extracto de té verde en agua a la concentración de 12,5 mg/mL, se filtraron a través de una malla estéril (0,20 pnn) y luego se diluyó 1000 veces más en medio de cultivo celular. Los compuestos se probaron solo a la concentración final de 12,5 pg/mL o en combinación (12,5 pg/mL de extracto de cúrcuma 12,5 pg/mL de colágeno hidrolizado; 12,5 pg/mL de extracto de cúrcuma 12,5 pg/mL de extracto de té verde; 12,5 pg/mL de extracto de cúrcuma 12,5 pg/mL de colágeno hidrolizado 12,5 pg/mL de extracto de té verde) en ausencia o presencia de IL-1 p porcina recombinante (10"11 M). Los efectos de los compuestos se compararon con controles: DMEM solo o DMEM IL-1 p.
Parada del cultivo
Después de 24 h en estas condiciones, se recogió medio de cultivo acondicionado de tres pocilios de cada condición y se guardó a -202C. Se rasparon las células de estos pocillos correspondientes, se hizo una extracción de ARN usando el minikit RNeasy (Qiagen, Venlo, Países Bajos), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa y entonces se realizó una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, usando LightCycler 480 (Roche, Vilvoorde, Bélgica) para analizar la expresión génica.
Después de 48 h en estas condiciones, se recogió el medio de cultivo acondicionado de los pocillos restantes (3 de cada condición) (ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa) y se guardó a - 20 °C hasta el análisis (ensayos de nitrito y prostaglandina E2). Se rasparon las células y se homogeneizaron en 500 pL de tampón Tris-HCI por disociación ultrasónica durante 20 s a 4 °C, para medir el contenido de ADN.
Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa
Se estimó la viabilidad celular cuantificando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante de cultivo. Se mezcló una muestra de 100 pL del sobrenadante o diluciones de disolución patrón (LDH de músculo de conejo) con 50 pL de tampón Tris (Tris-HCI 10 mM (pH 8,5), 0,1 % de albúmina de suero bovino) que contenía lactato 800 mM. Entonces, se añadieron 50 pL de reactivo colorimétrico, 1 ,6 mg/mL de cloruro de yodonitrotetrazolio (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica), 4 mg/mL de nicotinamida adenina dinucleótido (Roche Diagnostics, Bruselas, Bélgica) y 0,4 mg/mL de metosulfato de fenazina (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica), y se leyó la absorbancia a 492 nm después de 10 min de incubación a temperatura ambiente.
Ensayo de ADN
Se homogeneizaron los condrocitos en 500 pL de tampón T ris-HCI por disociación ultrasónica durante 15 s a 4 °C. Se midió el contenido de ADN en los extractos de células usando el método fluorimétrico de Hoechst.
Ensayo de nitrito
Se determinó la producción de óxido nítrico (NO) cuantificando su producto derivado, el nitrito, en el sobrenadante de cultivo usando un método espectrofotométrico basado en la reacción de Griess. Brevemente, se mezclaron disoluciones patrón de 100 pL del sobrenadante o nitrito de sodio (NaNO2) con 100 pL de reactivo de Griess (0,5 % de sulfanilamida, 0,05 % de diclorhidrato de naftiletilendiamina, 2,5 % de H3PO4). La absorción se midió a 540 nm. La producción de NO se expresó por microgramo de ADN.
Ensayo de PGE2
Se midió la producción de prostaglandina E2 (PGE2) en el sobrenadante de cultivo usando el kit de inmunoensayo de alta sensibilidad de PGE2 DetectX (Arbor Assays, Michigan, EE. UU.). Brevemente, se pipetearon 100 pL del sobrenadante o diluciones patrón de PGE2 en una placa de microtitulación clara recubierta con un anticuerpo para capturar IgG de ratón. Se añade un conjugado de PGE2-peroxidasa (25 pL) a los patrones y sobrenadantes en los pocillos. La reacción de unión se inicia mediante la adición de 25 pL de un anticuerpo monoclonal a PGE2. Después de una incubación durante la noche a 4 °C, la placa se lava y se añaden 100 pL de sustrato. El sustrato reacciona con el conjugado de PGE2-peroxidasa unido. Después de una corta incubación, la reacción se detiene y se detecta la intensidad del color generado a 450 nm de longitud de onda. Se expresó la producción de PGE2 por microgramo de ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Se aisló ARN de células de 3 pocillos de cada condición usando el minikit RNeasy (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Entonces, se retrotranscribió el ARN. Se realizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real usando SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Westburg, Leusden, Países Bajos). La fuente del molde de PCR fue o ADNc de la primera cadena o patrón de ADN purificado. Las secuencias de cebador usadas para amplificar el ADNc deseado fueron las siguientes: cebadores directos e inversos de HPRT bovino: 5'-AGTTTGGAAATACCTGGCG-3' y 5'-AGTCTTTAGGCTCGTAGTGC-3'; cebadores directos e inversos de interleucina (IL)-6 bovina: 5'-TGGTGATGACTTCTGCTTTCC-3' y 5'-TGCCAGTGTCTCCTTGC-3'; cebadores directos e inversos de ciclooxigenasa (COX)2 bovina: 5'-GTCTGATGATGTATGCCACC-3' y 5'-ACGTAGTCTTCAATCACAATCT-3'; cebadores directos e inversos de óxido nítrico sintasa inducida (iNOS) bovina: 5'-GGCAAGCACCACATTGAGA-3' y 5'-TGCGGCTGGATTTCGGA-3'; cebadores directos e inversos de agrecanos (AGG) bovinos: 5'-TGCCTTTGACGTGAGC-3' y 5'-GCATTGTTGTTGACAAACT-3'; cebadores directos e inversos de colágeno de tipo II (COL2) bovino: 5'-CTGCGTCTACCCCAAC-3' y 5'-GGGTGCAATGTCAATGAT-3'; cebadores directos e inversos de metaloproteinasa (MMP)-3 bovina: 5'-TCTAT G AAG G AG AAG CTG AC AT AAT-3' y 5'-TT C ATG G G C AG C AAC AAG-3'; cebadores directos e inversos de una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS) 4 bovina: 5'-CTTTCAATGTCCCACAGGC-3' y 5'-CAGGAACGGAAGCGGGTA-3'; cebadores directos e inversos de ADAMTS 5 bovina: 5'-GACACCCTGGGAATGGCA-3' y 5'-C AC AG AACTT G G AAT C GT C A-3'.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende curcuminoide con polifenol de té verde y con una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina para su uso en la prevención y/o el tratamiento de osteoartritis.
2. Una composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la prevención y/o el tratamiento es para un humano o un animal de compañía tal como un gato, un perro o un caballo.
3. Una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado.
4. Una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el curcuminoide es curcumina.
5. Una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición está en forma de un alimento.
6. Una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el curcuminoide está presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 % a 1,1 % en una base en materia seca.
7. Una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polifenol de té verde está presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a 1,1 % en una base en materia seca.
8. Una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina está presente en una cantidad de aproximadamente 0,5 % a 10 % en una base en materia seca.
9. Una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el curcuminoide es curcumina y está presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 % a 0,15 % en una base en materia seca.
10. Una composición que comprende curcuminoide, polifenol de té verde y una combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina.
11. Una composición según la reivindicación 10, en donde la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina es colágeno hidrolizado.
12. Una composición según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el curcuminoide es curcumina.
13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la composición está en forma de un alimento.
14. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde
el curcuminoide está presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 % a 1,1 % en una base en materia seca y/o,
el polifenol de té verde está presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a 1,1 % en una base en materia seca y/o
la combinación de glicina, prolina e hidroxiprolina está presente en una cantidad de aproximadamente 0,5 % a 10 % en una base en materia seca y/o
(iv) el curcuminoide es curcumina y está presente en una cantidad de aproximadamente 0,005 % a 0,15 % en una base en materia seca.
15. Un proceso para la preparación de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 que comprende mezclar juntos los ingredientes y opcionalmente presentar la mezcla en una forma adecuada para la composición y administración, opcionalmente, en donde la composición se añade a la mezcla en forma de un espray, recubriendo o en una matriz de bolsa de almidón.
16. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para su uso en medicina.
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