CN110691604A - 水解胶原蛋白肽和共生微生物的组合物及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及药物和/或营养制品。更特别地，本发明提供了用于支持或促进关节、皮肤和/或骨骼健康的基于胶原蛋白的肽和具体消化道微生物的组合物及其制备和使用方法。本发明进一步提供了基于胶原蛋白的肽的组合物作为益生元用于调节肠道微生物组的用途。
Description
技术领域
本发明一般涉及药物和/或营养制品。更特别地，本发明提供了用于支持或促进关节、皮肤和/或骨骼健康的基于胶原蛋白的肽和具体消化道微生物的组合物及其制备和使用方法。本发明进一步提供了基于胶原蛋白的肽的组合物作为益生元用于调节肠道微生物组的用途。
背景技术
骨关节炎(OA)是世界上最流行的疾病之一，最近的估计预测全球有超过2.5亿人受到影响。在美国，OA困扰着3500万人，其中动关节和脊髓OA是最常见的疾病，超过了其后的导致残疾的四大病因(心脏、肺部、心理健康和糖尿病病状)。在最近的一项分析中，下肢OA的全球医疗费用超过了3500亿美元/年，OA患者的生活质量和身体功能降低，产生了超过500亿美元/年的额外隐性经济影响。(穆雷(Murray)等人，2010柳叶刀(Lancet)，2013；381(9871):997-102；劳伦斯(Lawrence)等人，2008关节炎与风湿病(Arthritis Rheum)，58(1):26-35；CDC，成人中残疾的患病率和最常见病因——美国(Prevalence and mostcommon causes of disability among adults--United States)，2005，MMWR发病率和死亡率周报(MorbMortalWklyRep)，2009；58(16):421-6；萨蒙(Salmon)等人，2016骨关节炎与软骨(Osteoarthritis Cartilage)，24(9):1500-8)
OA是多因素病因的关节疾病，其特征在于关节软骨和半月板的退变和缺失、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜增生。在退行性过程期间OA关节内的多个组织的病因复杂性和“全器官”参与代表了疾病修饰治疗策略的发展中的重大挑战。(布克沃特(Buckwalter)等人，2005教学课程讲座(InstrCourse Lect)，54:465-80；戈德林(Goldring)等人，2007细胞生理学杂志(J Cell Physiol)，213(3):626-34；勒泽尔(Loeser)等人，2012关节炎与风湿病，64(6):1697-707)
没有可用于OA的疾病修饰疗法。在过去的二十年中，已经进行了十多项人体临床试验以测试候选疾病修饰OA药物(DMOAD)，其中没有一种被接受为是一种真正的治疗剂。(克劳斯(Kraus)等人，2011骨关节炎与软骨，19(5):515-42；马非特(Malfait)等人，2015关节炎研究与治疗(Arthritis research&therapy)，17:225)
在终末期疾病的全关节置换术(TKA)之前，这些患者的唯一治疗选项是通过姑息护理和物理治疗减轻疼痛。OA的姑息管理主要涉及非类固醇抗炎药，关节内注射皮质类固醇或透明质酸，麻醉性镇痛(包含阿片类药物)和关节置换术。
皮肤干燥和真皮中胶原蛋白网络的加速碎裂是皮肤老化的标志。营养是影响皮肤健康并因此影响其外观的关键因素。提供多种膳食补充剂能够改善皮肤健康，但尚未存在被广泛确认为能够减轻老化作用并恢复皮肤结构的可接受试剂。营养美容行业试图解决对能够保持和保护皮肤健康(特别是在老化方面)的试剂的未被满足的需要。(舒斯特(Shuster)等人，1975英国皮肤病学杂志(The British journal of dermatology)，93(6):639-43；斯哈亨(Schagen)等人，2012皮肤内分泌学(Dermatoendocrinol)，4(3):298-307；瓦拉尼(Varani)等人，2006美国病理学杂志(The American journal of pathology)，168(6):1861-8；德拉罗斯(Draelos)等人，2010临床皮肤学(Clin Dermatol)，28(4):400-8)
骨骼健康不良、骨量缺失和骨质疏松症共同构成了重大的临床挑战和公共卫生负担。仅在美国，相关费用就达220亿美元。骨质疏松症可见于70％的老年人群，在绝经后妇女和两性老年人中尤为明显。它会导致骨折和延迟修复的风险增加。目前的治疗有严重的副作用。因此，新且更安全的治疗方法是重要的未被满足的需要。(布里格斯(Briggs)等人，2016老年学专家(Gerontologist)，56副刊2:S243-55；皮萨尼(Pisani)等人，2016世界骨科杂志(World J Orthop)，7(3):171-81；奥康纳(O'Connor)等人，2016北美医疗诊所(TheMedical clinics of North America)，100(4):807-26)
因此，开发提供保护和/或再生能力的治疗、营养和/或预防策略是解决关节、皮肤和骨骼健康的关键的未被满足的需要和核心追求。
发明内容
本发明部分基于意外的发现，即水解胶原蛋白肽对肠道微生物组具有作用，这与OA、关节健康、皮肤健康和骨骼健康中的积极作用相关。本发现使得能够开发健康支持或促进和疾病减轻方法，其将hCol1和/或hCol2组合为益生元，任选地具有微生物的益生混合物(包含来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的那些)。这些可以被配制成例如粉末或液体混合物，其可以加入到食物中；或被压制成片剂或胶囊，用于每日、每周三次、每周两次或每周直接口服。
因此，本发明可以从根本上改变OA、关节健康、皮肤健康和骨骼健康的治疗方案，并提供一种改善肠道微生物组的新方法。本发明实现了一种利用水解1型和/或2型胶原蛋白肽(hCol1/2)作为膳食补充剂的新方法，所述膳食补充剂具有源于常驻肠道微生物种群的不同和具体变化的生物学作用。肠道微生物组的这些变化继而影响许多组织，其在OA中具有有效的关节健康潜在和治疗功效以及在体表和骨骼系统中具有其它健康促进益处。本发明提供了一种在骨关节炎(OA)中具有优先保护和治疗功效的特定能力，以支持或促进皮肤健康、关节健康或骨骼健康。
在实验部分中示出了一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其通过改善受试者中的肠道微生物组，特别是通过增加所述受试者的肠道中的微生物多样性而起到益生元的作用。文献中普遍认为，更多样化的肠道微生物群是有益的。还示出了口服施用水解胶原蛋白肽减少肠道中的促炎物种，并增加抗炎物种。进一步示出了包括水解胶原蛋白肽的所述组合物减少了全身性炎症的标志物(特别是循环TNF-α)，这是在益生元施用后经常观察到的作用(德尔泽纳(Delzenne)等人，2011自然评论内分泌学(Nat Rev Endocrinol)，7:639-646；奥康纳等人，2017欧洲更年期杂志(Maturitas)，104:11-18)。此外，对于包括水解胶原蛋白肽的组合物，示出了有益的健康作用，包含关节组织中的关节保护作用和抗炎作用，进一步支持其作为益生元的用途。因此，一方面，本发明提供了一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为益生元的用途。本文还公开了水解胶原蛋白肽作为益生元的用途。在特定实施例中，组合物或水解胶原蛋白肽用于调节受试者中的肠道微生物组，更特别地用于增加肠道微生物组的多样性。一个相关方面涉及一种调节受试者中的肠道微生物组(更特别地，增加肠道微生物组的多样性)的方法，其包括向受试者施用有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。
在实施例中，以组合物的干质量计，组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。在实施例中，水解胶原蛋白肽是1型水解胶原蛋白肽(hCol1)和/或2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。在另外的实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。在另外的实施例中，hCol1来源于猪、牛或鱼，和/或hCol12来源于猪、牛或鱼。在实施例中，组合物被配制在食品或饲料产品或用于口服施用的食品或饲料成分中，或被配制成用于口服施用的膳食补充剂。在实施例中，每天向受试者施用组合物，持续至少7天，优选持续至少14天。在实施例中，以0.5g和15g之间的日剂量向受试者施用组合物。
另一方面，提供了一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗受试者中的关节炎症，特别是受试者中的滑膜炎症。一个相关方面涉及一种预防或治疗受试者中的关节炎症，特别是滑膜炎症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。在所述用途的组合物或所述方法的实施例中，以组合物的干质量计，组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。在实施例中，水解胶原蛋白肽是1型水解胶原蛋白肽(hCol1)和/或2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。在另外的实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。在另外的实施例中，hCol1来源于猪、牛或鱼，和/或hCol12来源于猪、牛或鱼。
另一方面涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗受试者中的骨关节炎，特别是创伤后骨关节炎或肥胖诱导的骨关节炎，其中水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽(hCol2)，其来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。一个相关方面涉及一种预防或治疗受试者中的骨关节炎，特别是创伤后骨关节炎或肥胖诱导的骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物，其中水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽(hCol2)，其来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。在所述用途的组合物或所述方法的实施例中，以组合物的干质量计，组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。在实施例中，hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
又一方面涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为软骨保护剂的用途，其中水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。一个相关方面涉及一种在受试者中提供软骨保护作用的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物，其中水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。在所述用途或所述方法的实施例中，以组合物的干质量计，组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的hCol2。在实施例中，hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。在实施例中，hCol12来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
附图说明
图1：hCol1的有效食团递送和实验时间线。将能多益(Nutella)用作媒剂以向小鼠递送每日食团剂量的hCol1，使得递送150mg混合物提供3.8mg(LD)或38mg(HD)hCol1(对照＝仅能多益)的每日食团剂量。将实验混合物置于可高压灭菌的瓷砖上(A)，并在每天的同一时间给予单独圈养的小鼠(B)。在仅用媒剂训练5-7天后，小鼠在2分钟内服用给予的全量。图(C)描绘了实验时间线。以食团喂养方案每天向小鼠给予能多益，持续1周的训练期，然后开始加入对照、LD和HD每日补充剂并继续进行实验的剩余部分。补充4周后，进行MLI(右膝)和假手术(Sham)(左膝)手术(t＝0)，然后在手术后3周和12周进行组织收获。(D和E)为了确认hCol1的成功递送，经由ELISA定量血清h脯氨酸水平。在小鼠服用补充剂后3小时，收获在手术前1周(-1)和手术后2周收集的血清样品(D)。在服用补充剂后1小时，收获手术后3周和12周收集的血清样品(E)。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识各组之间的显著差异(与对照相比，*p<0.05，**p<0.01，N＝6)。应当注意，一部分实验也包含hCol2的递送，每日剂量为3.8mg/天(相当于低剂量hCol1)(数据未示出)。
图2：hCol1喂养小鼠中的MLI后软骨缺失减少。图(A)呈现了在各种治疗条件下来自损伤后12周的假手术和MLI关节的内侧间室的多个代表性40x甲苯胺蓝/固绿染色矢状切面(对照＝媒剂，LD＝3.8mg hCol1/天，HD＝38mg hCol1/天)。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，并且黑色比例尺描绘了100μm。使用自动化方法(Visiopharm系统)，在这些代表性切面以及来自MLI后3周(B)和12周(C)的所有实验关节的一系列类似染色的连续切面中确定总胫骨软骨区域。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01；与对照MLI相比，xp<0.05，xxp<0.01，N＝6)。
图3：hCol1在鼠PTOA的早期阶段具有软骨保护作用。图(A)呈现了在各种治疗条件下来自损伤后3周的假手术和MLI关节的内侧间室的多个代表性40x番红O/固绿染色矢状切面(40x)(对照＝媒剂，LD＝3.8mg hCol1/天，HD＝38mg hCol1/天)。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，并且黑框表示缩放图像中示出的区域，其中潮标用虚线表示。黑色比例尺描绘了100μm。使用Osteomeasure系统评估软骨构造以确定胫骨未钙化软骨区域(B)，胫骨钙化软骨区域(C)，胫骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(D)，和胫骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的数量(E)和百分比(F)。还进行了通过组织形态计量分析的切面的OARSI评分(G)。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识组织形态计量数据(B-F)中的实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与对照MLI相比，xp<0.05，xxp<0.01，N＝6)。经由克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)测试以及测试后杜恩氏多重比较标识OARSI数据(G)中的实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，N＝6)。
图4：hCol1在中期到晚期鼠PTOA中对抗软骨缺失。图(A)呈现了在各种治疗条件下来自损伤后12周的假手术和MLI关节的内侧间室的多个代表性40x番红O/固绿染色矢状切面(对照＝媒剂，LD＝3.8mg hCol1/天，HD＝38mg hCol1/天)。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，并且在缩放图像中用潮线表示潮标。黑色比例尺描绘了100μm。使用Osteomeasure系统评估软骨构造以确定胫骨未钙化软骨区域(B)，胫骨钙化软骨(C)，胫骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(D)，和胫骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的数量(E)和百分比(F)。还进行了通过组织形态计量分析的切面的OARSI评分(G)。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识组织形态计量数据(B-F)中的实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与对照MLI相比，xp<0.05，xxp<0.01，N＝6)。经由克鲁斯卡尔-沃利斯测试以及测试后杜恩氏多重比较标识OARSI数据(G)中的实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01，N＝6)。
图5：hCol1降低MLI后小鼠的关节软骨中的MMP13水平。在损伤(假手术或MLI)后3周，从小鼠收获膝关节，并通过MMP13和ColX的免疫组织化学分析肥大软骨细胞。代表性矢状切面描绘了(A)MMP13和(B)ColX染色软骨细胞()，其中细胞核用苏木精()复染。虚线突出显示了潮标，将钙化软骨与未钙化软骨分开。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板)，并且黑色比例尺描绘了100μm。
图6：在hCol1补充小鼠中，MLI后软骨细胞凋亡减少。在损伤(假手术或MLI)后3周，从小鼠收获关节，并经由TUNEL染色标识凋亡细胞。代表性100x矢状切面(右图列)示出了细胞凋亡的整体范围(绿色)，其中所有细胞核以DAPI标记(蓝色)。黄色虚线描绘了关节软骨表面，并且红色虚线勾勒出半月板的前角和后角。用白色框划界的区域在右列放大(缩放)。白色比例尺描绘了100μm。
图7：在补充hCol1的小鼠中，滑膜增生减少。(A)使用用番红O/固绿染色的组织切面检查滑膜。描绘了来自损伤后3周和12周收获的补充对照(媒剂，能多益)、LD hCol1或HDhCol1的小鼠的假手术和MLI关节的代表性40x矢状切面。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，并且滑膜用黑色箭头划界。黑线突出显示了对照MLI切面中增生滑膜的厚度，并且黑色比例尺描绘了100μm。也采用滑膜评分方法来量化损伤后3周(B)和12周(C)的滑膜增生。经由克鲁斯卡尔-沃利斯测试以及测试后杜恩氏多重比较标识实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，N＝6)。
图8：在补充hCol1的小鼠中，滑膜中的TNF的损伤后上调减少。(A)示出了来自损伤后3周和12周收获的补充对照(媒剂，能多益)、LD hCol1或HD hCol1的小鼠的假手术和MLI关节的代表性TNF免疫染色矢状切面(100x)。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，滑膜用箭头划界，并且组织染色表明TNF表达的强度和位置。黑色比例尺描绘了100μm。损伤后3周(B)和12周(C)，从从不同的类似治疗小鼠组收集的滑膜组织纯化mRNA。进行qRTPCR以量化Tnf表达水平。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识各组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，与对照MLI相比，xxp<0.01，N＝6)。
图9：与hCol1一样，hCol2证明了MLI后3周的强大的软骨保护。MLI后3周膝关节的番红O/固绿染色表明hCol治疗组中的细胞周围蛋白多糖含量增强(A)。经由组织形态计量的对软骨组织参数的人工评估表明hCol1(P1)和hCol2(P2)治疗对假手术或损伤关节中的胫骨未钙化软骨区域或未钙化软骨中的总细胞(软骨细胞)计数(B和C)没有显著作用。然而，hCol1和hCol2喂养组示出了SafO+细胞的数量(D)和百分比(E)增加，表明蛋白多糖产量增加。(x,*＝p<0.05，2因素ANOVA以及邦费罗尼-杜恩(Bonferroni-Dunn)多重比较，N＝6；x表示每个实验组内的假手术和MLI之间的差异)。
图10：hCol1补充诱导肠道微生物组的显著变化。对从补充对照能多益、38mg/天hCol1或葡糖胺的瘦和肥胖小鼠收集的粪便样品进行微生物rDNA分析。应当注意，PCoA图表现出hCol1对瘦小鼠中的微生物多样性的显著作用(图10A-10C)，其特征在于无壁菌丰度的显著增加(图10B和10C)。图10A：来自肥胖对照能多益(1)、肥胖葡糖胺(2)、肥胖hCol1(3)、瘦hCol1(4)、瘦葡糖胺(5)和瘦对照能多益(6)小鼠的微生物丰度的主要坐标分析。图10C示出了小鼠中的相对微生物丰度：瘦对照小鼠(放线菌：19.6127％，拟杆菌：9.9887％，变形菌：0.0113％，无壁菌：1.6302％，厚壁菌：69％，疣微菌：0.0435％)，瘦hCol1小鼠(放线菌：1.2523％，拟杆菌：8.0434％，变形菌：0.0010％，无壁菌：6.998％，厚壁菌：83.6593％，疣微菌：0.0461％)，瘦葡糖胺小鼠(放线菌：12.07091％，拟杆菌：13.4103％，无壁菌：1.1749％，厚壁菌：72.6939％，疣微菌：0.0119％)，肥胖对照小鼠(放线菌：1.4051％，拟杆菌：7.9330％，变形菌：0.0249％，厚壁菌：90.5756％，疣微菌：0.0613％)，肥胖hCol1小鼠(放线菌：0.4546％，拟杆菌：13.7589％，变形菌：0.0053％，无壁菌：0.0206％，厚壁菌：85.6624％，疣微菌：0.0981％)和肥胖葡糖胺小鼠(放线菌：0.4928％，拟杆菌：11.2335％，变形菌：0.0005％，厚壁菌：88.0274％，疣微菌：0.2458％)。
图11：hCol1和葡糖胺对肠道微生物组引起不同的作用。来自补充对照能多益，38mg/天hCol1或葡糖胺的瘦和肥胖小鼠的微生物丰度的主要坐标分析。1：肥胖对照能多益，2：肥胖葡糖胺，3：肥胖Peptan 1，4：瘦Peptan 1，5：瘦葡糖胺，6：瘦对照能多益。各组之间比较示出了每种治疗对微生物组合物的明显差异作用。
图12：与hCol1(图1)一样，通过经由ELISA定量血清h脯氨酸证实了hCol2的成功递送。在小鼠服用补充剂(未示出)后3小时，收获在手术前1周(-1)和手术后2周收集的血清样品。在服用补充剂后1小时，收获手术后3周和12周收集的血清样品。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识各组之间的显著差异(与对照相比，*p<0.05，**p<0.01，N＝6)。
图13：在补充hCol2的小鼠中，滑膜增生也减少。(A)使用用番红O/固绿染色的组织切面检查滑膜。描绘了来自损伤后3周和12周收获的补充对照(媒剂，能多益)、LD hCol1或HD hCol1或hCol2的小鼠的假手术和MLI关节的代表性40x矢状切面。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，并且滑膜用黑色箭头划界。黑线突出显示了对照MLI切面种增生滑膜的厚度，并且黑色比例尺描绘了100μm。也采用滑膜评分方法来量化损伤后3周(B)和12周(C)的滑膜增生。经由克鲁斯卡尔-沃利斯测试以及测试后杜恩氏多重比较标识实验组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，N＝6)。
图14：在补充hCol1或hCol2的小鼠中，滑膜中TNF的损伤后上调减少。(A)示出了来自损伤后3周和12周收获的补充对照(媒剂，能多益)、LD hCol1或HD hCol1或hCol2的小鼠的假手术和MLI关节的代表性TNF免疫染色矢状切面(100x)。标记关节结构(F＝股骨，M＝半月板，T＝胫骨)，滑膜用箭头划界，并且组织染色表明TNF表达的强度和位置。黑色比例尺描绘了100μm。损伤后3周(B)和12周(C)，从从不同的类似治疗小鼠组收集的滑膜组织纯化mRNA。进行qRTPCR以量化Tnf表达水平。经由单因素ANOVA以及测试后图基多重比较标识各组之间的显著差异(与对照假手术相比，*p<0.05，与对照MLI相比，xxp<0.01，N＝6)。
图15：hCol1和hCol2补充诱导肠道微生物组的显著变化，并在创伤后骨关节炎中提供保护作用。(A)对从补充对照能多益、38mg/天hCol1或15mg/天hCol2(持续4周)的普通饮食喂养小鼠收集的粪便样品进行微生物rDNA分析。各个条示出了所示组中的相对微生物丰度。每个条代表平均3只小鼠。在普通饮食中，hCol 1和2趋于具有类似的作用：拟杆菌、乳杆菌、苏黎世杆菌和厌氧原体的丰度增加。这些增加是以hCol1和hCol2补充小鼠中的梭菌群落为代价的，但本作用是微不足道的，并且梭菌是所有三组的主要目。各图描绘了损伤后12周补充媒剂(能多益)(对照DMM)、hCol1(P1 DMM)或hCol2(P2 DMM)的假手术和DMM普通饮食喂养小鼠中的胫骨未钙化软骨区域(B)，胫骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(C)，胫骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的数量(D)和百分比(E)，股骨未钙化软骨区域(F)，和股骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(G)。
图16：(A)对从补充对照能多益、38mg/天hCol1或15mg/天hCol2的瘦饮食喂养小鼠收集的粪便样品进行微生物rDNA分析。各个条示出了所示组中的相对微生物丰度。在瘦饮食中，hCol1和2也趋于具有类似的作用：最引人注目的是双歧杆菌的缺失和厌氧原体的出现以及乳杆菌、苏黎世杆菌和厌氧原体的轻微减少。各图描绘了损伤后12周补充媒剂(能多益)(对照DMM)、hCol1(P1 DMM)或hCol2(P2 DMM)的假手术和DMM瘦饮食喂养小鼠中的胫骨软骨区域(B)，胫骨未钙化软骨区域(C)，胫骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(D)，和胫骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的百分比(E)。
图17：(A)对从补充对照能多益、38mg/天hCol1或15mg/天hCol2(持续4周)的高脂肪(HF)(60％的热量来自饱和脂肪)喂养小鼠收集的粪便样品进行微生物rDNA分析。各个条示出了所示组中的相对微生物丰度。在HF饮食中，hCol1和2再次趋于诱导相同的作用：红蝽杆菌的消融和乳杆菌的减少。乳杆菌群落的缺失与梭菌的丰度增加相关。各图描绘了损伤后3周补充媒剂(能多益)(对照DMM)、hCol1(P1 DMM)或hCol2(P2DMM)的假手术和DMM高脂肪饮食喂养小鼠中的胫骨软骨区域(B)，胫骨未钙化软骨区域(C)，胫骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(D)，胫骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的数量(E)，股骨未钙化软骨区域(F)，股骨未钙化软骨中的软骨细胞的数量(G)，和股骨未钙化软骨中的番红-O阳性(SafO+)软骨细胞的数量(H)。
图18：通过hCol1和hCol2校正血清TNF-α的肥胖相关增加。高脂肪(HF)饮食喂养3个月的小鼠每天补充hCol1(HF+P1)、hCol2(HF+P2)或媒剂(能多益)(HF)，持续12周。瘦饮食喂养一组小鼠作为对照。从所有小鼠收集血清，并进行ELISA测定以定量循环TNF-α的水平。示出了所示小鼠组中的测量血清TNF-α水平。
图19：hCol2改变肠道微生物组。普通饮食或高脂肪饮食喂养3个月的小鼠每天补充hCol2(HFD+hCol2)或媒剂(能多益)(HFD)，持续4周。收集粪便样品，并进行微生物rDNA分析。与普通饮食喂养小鼠相比，高脂肪饮食喂养小鼠中的一部分细菌物种被改变，并且hCol2补充改变了这些高脂肪饮食喂养小鼠的肠道微生物组。许多促炎物种，特别是消化球菌rc4-4种，在hCol2补充小鼠中减少(顶部热图)。相反，hCol2补充动物中增强了几种抗炎物种，包含假长双岐杆菌(底部热图)。
图20：hCol1和hCol2对骨参数的作用。非肥胖、代谢健康的小鼠每天喂养hCol1(P1)、hCol2(P2)或媒剂(能多益)(对照)补充剂。喂养补充剂12周后，进行显微CT分析以检查股骨和椎骨参数，并进行骨密度计量(DXA)以确定全身骨矿物质密度(BMD)。各图描绘了股骨远端中的骨体积分数(BV/TV，A)，小梁连接的密度(连接密度，B)和小梁数量(Tb.N.，C)，第四腰椎(L4)中的骨体积分数(BV/TV)(D)和全身骨矿物质密度(BMD)(E)。
图21：hCol1和hCol2补充与创伤性损伤后肥胖小鼠中的滑膜TNF表达降低相关。小鼠随意获取高脂肪饮食3个月。在本段时间后继续喂养小鼠所述饮食，但每天补充hCol1(P1)、hCol2(P2)或媒剂(能多益)。补充1周后，进行手术性半月板损伤(DMM)或对侧肢体切开(假手术对照)，并在三周后收获膝关节组织。示出了假手术和DMM关节组织上TNF免疫组织化学的代表性图像。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文使用，术语“水解胶原蛋白肽”是指由动物组织制备的胶原蛋白片段。水解胶原蛋白由在动物的骨骼、皮肤和结缔组织中可见的胶原蛋白产生。水解过程通常涉及使用物理、化学或生物学手段的组合来破坏各个胶原蛋白链和肽之间的分子键。
如本文使用，术语“1型水解胶原蛋白肽”或“hCol1”是指经由酶促消化从动物结缔组织提取的I型胶原蛋白而生成的不同分子量的I型胶原蛋白肽的混合物。1型胶原蛋白通常源自皮肤、肌腱、韧带、血管连系物、器官、骨骼(骨骼的有机部分的主要组分)。
如本文使用，术语“2型水解胶原蛋白肽”或“hCol2”是指经由酶消化富含2型胶原蛋白的动物结缔组织而制备的2型胶原蛋白肽的混合物。2型胶原蛋白通常源自软骨(软骨的主要胶原蛋白组分)。合适的1型胶原蛋白或2型胶原蛋白的来源可以是但不限于脊椎动物(包含但不限于猪、牛、马和鱼)或软体动物(包含但不限于水母)的皮、皮肤或软骨。水解胶原蛋白通常以其平均分子量来表示，表明混合物中存在的肽的平均分子量。
如本文使用，术语“无壁菌”是指驻于胃肠道中的具体细菌门，并且被水解胶原蛋白肽改变。
如本文使用，术语“厌氧原体”是指驻于胃肠道中的具体细菌目，并且被水解胶原蛋白肽改变。
如本文使用，术语“双歧杆菌”是指驻于胃肠道中的具体细菌属，并且被低聚果糖改变。双歧杆菌属中的物种包含两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、假长双岐杆菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌、假小链双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、双歧双歧杆菌和归类为双歧杆菌属的其它物种(包含迄今未标识的那些)。(法莫里(Famouri)等人，小儿胃肠病与营养(Pediatric Gastroenterology and Nutrition)，64(3):p.413-417；休斯(Hughes)等人，开放生物学(Open Bio)，2017.7(1)；孟(Meng)等人，胃肠和肝脏生理学(Gastrointestinal and Liver Physiology)，2016.311(4)；谢赫(Sheikhi)等人，药物研究(Drug Research)，2016.66(6):p.300-305；卡尼(Cani)等人，糖尿病学(Diabetologia)，2007.50(11):p.2374-83；贝尔尼尼(Bernini)等人，营养(Nutrition)，2016.32(6):p.716-719；赖希奥尔德(Reichold)等人，营养生物化学杂志(Journal of NutritionalBiochemistry)，2014.25(2):p.118-125；莫拉塔拉(Moratalla)等人，肝脏病学杂志(Journal of Hepatology)，2016.64(1):p.135-145；郭(Guo)等人，小儿胃肠病与营养杂志(Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition)，2017.64(3):p.404-412；帕伦博(Palumbo)等人，帕拉茨基大学医学院生物医学论文(Biomedical Papers of theMedical Faculty of the University Palacky)，2016.160(3):p.372-377。
如本文使用，术语活性剂的“有效量”是指足以引发所需生物反应的量。如本领域普通技术人员所理解，本发明的化合物的有效量可以取决于所需的生物学终点、化合物的药代动力学、所治疗的疾病、施用方式和患者等因素而不同。
如本文使用，术语“治疗(treatment/treating)”疾病或病症是指在病状发生之前或之后减少、延迟或改善此病状的方法。治疗可以针对疾病和/或潜在病理的一或多种作用或症状。治疗可以是疾病或疾病症状的任何减少，并且可以是但不限于疾病或疾病症状的完全消融。与等效的未治疗对照相比，此减少或预防程度为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％，如通过任何标准技术测量。
如本文使用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指用于排除、延迟、避免或停止疾病或病状的发作、发生、严重程度或复发的方法。例如，如果相较于未接受方法的受试者，疾病或病状或其一或多种症状的发作、发生、严重程度或复发在易患所述疾病或病状的受试者中有减少或延迟，则所述方法被认为是一种预防手段。如果相较于受试者在接受治疗之前的进展，骨质疏松症或疾病或病状的一或多种症状的发作、发生、严重程度或复发在接受所述方法之后在易患所述疾病或病状的受试者中有减少或延迟，则所公开的方法也被认为是一种预防手段。因此，骨质疏松症的发作、发生、严重程度或复发的减少或延迟可以是约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减少量。
如本文使用，术语“药学上可接受的”赋形剂、载剂或稀释剂是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将主体药剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。在与调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上，每种载剂必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包含：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；磷酸盐缓冲溶液；和药物调配物中采用的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂以及防腐剂也可以存在于组合物中。
如本文使用，术语“受试者”是指作为特定治疗的接受者的任何动物(例如，哺乳动物)，包含但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，用于指人类受试者。
如本文使用，术语“低剂量”是指比针对治疗任何人类疾病或病状的给定施用途径配制的特定化合物的最低标准推荐剂量少至少5％(例如，至少10％、20％、50％、80％、90％或甚至95％)。例如，配制用于通过吸入施用的试剂的低剂量将不同于配制用于口服施用的相同试剂的低剂量。
如本文使用，术语“高剂量”是指比治疗任何人类疾病或病状的特定化合物的最高标准推荐剂量多至少5％(例如，至少10％、20％、50％、100％、200％或甚至300％)。
可以采用任何合适的施用途径，例如直肠施用或口服施用。针对特定患者最合适的施用方式取决于所治疗的疾病或病状的性质和严重程度或所使用的治疗的性质并取决于活性化合物的性质。
用于口服施用的固体剂型包含胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此些固体剂型中，将本文所述的化合物和生物体或其衍生物与至少一种惰性常规赋形剂(或载剂)(例如，磷酸二钙)或(i)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(ii)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(iii)保湿剂，例如甘油，(iv)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(v)溶液缓凝剂，例如石蜡，(vi)吸收促进剂，例如季铵化合物，(vii)润湿剂，例如甘油单硬脂酸酯，(viii)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(ix)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇或其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物还可以用作使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。固体剂型(例如，片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣和本领域已知的其它包衣。
用于口服施用的液体剂型包含药学上可接受的乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它细菌相容的溶剂(例如油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯或这些物质的混合物等)。除了此些惰性稀释剂外，所述组合物还可以包含另外的试剂，例如润湿剂、混悬剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。
“益生元”通常是指宿主微生物选择性地利用以赋予宿主健康益处的底物(吉普森(Gibson)等人，2017自然评论胃肠病学和肝脏病学(Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology)，14:491–502)。
如本文使用，短语“改善肠道微生物组”是指对肠道微生物组的任何有益租用，并且可以包含但不限于增强肠道中的一或多种有益细菌，减少肠道中的有害细菌，抑制肠道中有害细菌的活性和/或增加肠道中的微生物多样性中的一或多种。
“膳食补充剂”也被称为“食品补充剂”或“营养补充剂”，是一种旨在补充饮食并提供可能缺少的或可能不会在人的饮食中服用足够量的营养素的制剂。
本文公开的材料、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物的产品，可以与其结合使用或可以用于其制备，或者是所公开的方法和组合物的产品。应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，尽管可能未明确公开这些化合物的每种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是本文具体地考虑和描述了每一种。例如，如果公开并讨论了一种方法，并且讨论了可以对包含在所述方法中的多个分子进行的多种修饰，则具体地考虑了所述方法的每个组合和排列以及可能的修饰，除非另有明确说明。同样地，还具体地考虑和公开了这些的任何子集或组合。本概念适用于本公开的所有方面，包含但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个可以利用所公开方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且具体地考虑了每个此种组合或组合的子集并且其应被认为是公开的。
具体实施方式
本发明提供了基于胶原蛋白的肽和关键消化道微生物(其被组合为双重口服混合物以支持关节、皮肤和/或骨骼健康)的新型组合物及其使用方法。本发明部分基于意外的发现，即水解胶原蛋白肽对肠道微生物组具有作用，这与OA、关节健康、皮肤健康和骨骼健康中的积极作用相关。
本发明能够实现了一种仅利用水解1型和/或2型胶原蛋白肽(hCol1/2)作为益生元或将其与益生元混合物(例如，来自无壁菌门、厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物)组合作为膳食补充剂(例如，每日、每周两次或每周口服)的新方法，所述膳食补充剂具有源于常驻肠道微生物种群的不同和具体变化的生物学作用。本发明的组合物可以被配制成可以加入食物中的混合物或被压制成片剂或胶囊。
水解胶原蛋白是由动物组织制备的胶原蛋白片段，用作食品添加剂或营养膳食补充剂。
hCol1是经由酶促消化从动物结缔组织提取的I型胶原蛋白而生成的不同分子量的I型胶原蛋白肽的混合物。hCol1被认为是一种安全的口服补充剂。含有大量羟基脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸的肽混合物在食团口服递送后剂量依赖性地被吸收，在人体内服用后一小时内，一系列二肽和三肽在循环中达到峰值。(GRAS物质挑选委员会(SCGRAS)意见书的FDA数据库：明胶(FDADatabase of Select Committee on GRAS Substances(SCGRAS)Opinion:Gelatin)1975[09/29/2015更新]，http://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/SCOGS/ucm261307.htm；茂村(Shigemura)等人，2014食品化学(Food Chem)，159:328-32；市川(Ichikawa)等人，2010国际食品科学与营养杂志(Int J Food Sci Nutr)，61(1):1-9)
hCol2由富含2型胶原蛋白的动物结缔组织制备。hCol2肽混合物含有丰富的羟基脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸以及糖胺聚糖。这些片段在食团口服递送后剂量依赖性地被吸收，在人体内服用后一小时内，一系列二肽和三肽在循环中达到峰值。(茂村等人，2014食品化学，159:328-32；市川等人，2010国际食品科学与营养杂志，61(1):1-9)
自20世纪80年代中期以来，人们一直在争论口服来自软骨和结缔组织的基质组分可以有效治疗关节炎病状这一概念。在这些试剂中，最被广泛认可、研究最多且最广泛可用的是葡糖胺和硫酸软骨素，已发表的证据表明它们基于动物模型和人类中的功用在OA中具有关节保护作用。(德帕尔(Deparle)等人，2005兽医药理学与治疗学杂志(J VetPharmacol Ther)，28(4):385-90；克里斯戈(Christgau)等人，2004临床与实验风湿病学(Clinical and experimental rheumatology)，22(1):36-42；布吕耶尔(Bruyere)等人，2006风湿病学年鉴(Annals of the Rheumatic Diseases)，65(8):1050-4；布吕耶尔等人，2007药物与老化(Drugs&aging)，24(7):573-80；布吕耶尔等人，2016关节炎和风湿病研讨会(Seminars in arthritis and rheumatism)，45(4副刊):S12-7)
推动功效争论的是，被广泛引用的葡糖胺/硫酸软骨素关节炎干预试验(又被称为GAIT)得出了这些试剂不能在人类OA中缓解症状或改良疾病的结论。尽管存在这些和其它相互矛盾的报道，并且没有明确的对关节组织作用的临床前研究，但葡糖胺和硫酸软骨素仍继续作为在各种类型的关节炎中具有关节保护和症状缓解作用的营养制品而广泛销售。(克莱格(Clegg)等人，2006新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)，354(8):795-808；迪尔(Deal)等人，1999北美风湿病门诊(Rheum Dis Clin North Am)，25(2):379-95；梅维尔(Mevel)等人，2014当代药物发现(Drug Discov Today)，19(10):1649-58；博泰戈尼(Bottegoni)等人，2014碳水化合物聚合物(Carbohydr Polym)，109:126-38)
如本文所证明，hCol1和hCol2肽的每日口服食团递送有效地对抗疾病损伤模型中的OA进展并且支持皮肤健康并在矿化骨骼组织中具有有益作用，这与对肠道微生物组的强烈作用相关，其特征主要在于无壁菌门和厌氧原体和梭菌目的微生物的增强(图10、15、16、17)。某些促炎物种，特别是消化球菌rc4-4种，在hCol2补充小鼠中减少，而抗炎物种，包含假长双歧杆菌，得到了增强(图19)。本文公开的证据不仅可靠地标识了hCol1和hCol2在创伤后OA和肥胖诱导的OA中的关节保护作用，而且它还标识了对肠道微生物组的显著作用，伴有无壁菌门和厌氧原体和梭菌目的微生物的具体种群扩展，促炎物种减少和抗炎物种增加，这些都与关节、皮肤和骨骼中发生的全身作用相关。
在本研究中进行实验方案，其涉及向小鼠每日口服递送hCol1和hCol2，所述小鼠经由手术施用半月板-韧带损伤而被诱导产生PTOA(图1)。选择两种剂量hCol1，其中较高剂量(38mg/天)被设置为与先前在临床研究中采用的人体剂量(7.4g/天)相当的体重。(蒋(Jiang)等人，2014农产品产业高新技术(Agro food industry Hi Tech)，25(2):19-23)
为了研究长期使用的假设的关节保护作用，给小鼠补充hCol1，持续一个月的治疗前期，然后施用MLI手术并随后对关节进行评定。使用自动化和人工组织形态计量方法对假手术和损伤膝关节的关节软骨进行的结构和细胞评估表明，尽管在OA发展的早期和晚期时间点假手术/正常关节中没有可辨别的软骨作用，但施用hCol1的小鼠得到了软骨保护，特别是在损伤后12周。保留未钙化胫骨关节软骨并维持关节软骨细胞群(图2、3、4)，其可能经由MMP13的减少和软骨细胞凋亡的抑制(分别为图5和6)。具体地关于细胞凋亡，其抑制作用在股骨髁上特别明显(图6)，其与对本区域的关节中的软骨缺失的完全保护相关(图4)。有趣的是，软骨细胞群不仅被保留，而且在两个时间点，hCol1治疗组中活性地产生番红O染色蛋白多糖基质的细胞的数量显著增加。
除了在补充hCol1的小鼠的退变膝盖中观察到显著的软骨和软骨细胞作用之外，在滑膜中也观察到显著变化。尽管在假手术关节中没有补充剂的可辨别的滑膜作用，但在损伤后的早期和晚期时间点(分别为3周和12周)滑膜增生明显，半定量评分表明了在补充hCol1的小鼠中对这种增生的显著保护(图7)。
这种保护伴随着TNF蛋白和mRNA表达的降低，表明hCol1对OA关节具有抗炎作用(图8)。这种保护似乎仅限于TNF；已知参与关节软骨退变的其它细胞因子和分解代谢因子的滑膜mRNA表达，包含Il1b、Mmp13和ADAMTS5，在hCol1补充组中没有受到影响(数据未示出)。
尽管hCol1和其它类似的基于胶原蛋白的补充剂尚未示出可对抗关节组织中炎症介质的产生，但有证据表明1型胶原蛋白水解物和肽在心血管疾病和溃疡性结肠炎中具有抗炎作用。应当注意，本文所述的口服hCol1在滑膜中的抗炎作用与已报道的葡糖胺、硫酸软骨素和糖胺聚糖的抗炎作用相当。总体而言，当与观察到的软骨结构修饰结合考虑时，每日口服补充hCol1在OA治疗中具有作为软骨保护和抗炎剂的显著潜力。(博泰戈尼等人，2014碳水化合物聚合物，109:126-38；张(Zhang)等人，2010营养科学与生命科学杂志(东京)(J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo))，56(3):208-10；罗马达斯(Ramadass)等人，2016欧洲药学杂志(Eur J Pharm Sci)，91:216-24；亨罗汀(Henrotin)等人，2014关节炎和风湿病研讨会，43(5):579-87)
本文进一步示出，口服施用hCol1和hCol2均改善了骨骼健康(图20)。
本文公开的关节结构的详细分析示出了hCol1对关节软骨构造和滑膜增生的积极作用，其清楚地建立了一种经由膳食补充剂解决OA关节退变的疾病修饰方法。许多先前研究中遗漏了对这些试剂对动物疾病模型中软骨构造、软骨细胞群和滑膜状态的影响的直接检查。
关于hCol1和其它营养制品(包含基于2型胶原蛋白的制剂和hCol1)的作用机制，并且不希望受理论束缚，假设这些试剂或其消化片段跨肠腔被吸收，进入血流并对关节软骨细胞或关节中的其它细胞产生直接影响和/或影响结肠中的微生物特征，这局部性地和全身性地预防了炎症，在关节、皮肤和骨骼中产生影响。
与本理论一致，在补充hCol1的小鼠中检测到血清羟基脯氨酸水平的显著剂量依赖性激增(图1)。当在服用1小时内采血时，血清羟基脯氨酸最高(图1E)，但是在高剂量hCol1组中3小时仍可检测到激增(图1D)。在被给予hCol2作为补充剂的小鼠中也观察到本作用，其对与hCol2作用相当的循环羟基脯氨酸水平具有显著影响(图12)。
一旦进入血清，这些肽片段可能会进入所有器官系统，一份报告证实了放射性标记的制剂分布于大鼠的骨骼单元、肌肉、皮肤和软骨中。在大鼠中进行的另一项研究提供了在摄入30分钟内在关节软骨和滑膜中存在放射性标记的脯氨酸-羟基脯氨酸二肽的自动射线照相术证据。(渡边-神山(Watanabe-Kamiyama)等人，2010农业与食品化学杂志(Journalof agricultural and food chemistry)，58(2):835-41；川口等人，2012生物医药公报(Biol Pharm Bull)，35(3):422-7)
令人惊讶地发现的是，口服施用水解胶原蛋白肽改变了肠道微生物组(图10、11、15-17、19)。为了进一步研究本作用，进行了一系列类似的实验，其中hCol1和hCol2并排比较(图12-18、20、21)。发现hCol1和hCol2补充均导致肠道微生物组改变，但两者都导致骨关节炎模型的改善，从而实现软骨退变减少、软骨细胞活力和基质产生活性改善。此外，hCol1和hCol2均证明了如通过滑膜增生减少(图13)和Tnf表达数据减少(图14)所证明的抗炎作用。
口服补充hCol1和hCol2改变肠道微生物组(具体是支持无壁菌群落和厌氧原体目微生物的扩展)这一发现已产生了一种使用口服试剂(例如，hCol1和hCol2)以经由它们提供的各种作用全身性地提供健康益处的新方法。所述新方法的实例为hCol1和hCol2补充剂(作为益生元)与无壁菌的菌种培养物和/或厌氧原体目的成员和/或双歧杆菌属(作为益生元)(特别是与假长双歧杆菌)的组合，其用于使关节中以及OA、关节、皮肤和骨骼中的治疗和健康促进作用最大化。
例如，典型剂量的hCol(0.8-15gm/天，hCol1或hCol2，或混合物)与107-1012菌落形成单位的无壁菌的混合培养物和/或厌氧原体目的成员和/或可以作为饮料中的混合物递送的双歧杆菌属可以组合成食品(例如，酸奶)，或者可以加工成片剂或胶囊形式。补充方案可以涵盖以一次/天、每周两次或每周一次等服用组合调配物。
一方面，本发明一般涉及一种用于预防或治疗有需要的受试者的疾病或病症或用于向有需要的受试者提供健康支持作用或健康益处的组合物，其中所述组合物包括水解胶原蛋白肽。在替代方面，本发明还涉及一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用包括水解胶原蛋白肽的组合物。本发明进一步涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物在制造用于有需要的受试者的药物中的用途。又一替代方面涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物用于提供健康支持作用或健康益处的用途。在优选实施例中，所述组合物用于为皮肤、关节或骨骼提供健康益处。
在本发明的一个优选实施例中，用于预防或治疗的组合物、治疗方法或药物用于预防或治疗关节、皮肤或骨骼的疾病或病症，优选其中所述疾病是骨关节炎或相关疾病，或用于在这些器官中提供健康作用。在另外的实施例中，所述用途的组合物、治疗方法或药物用于预防或治疗炎症，优选关节中炎症，或其中炎症与滑膜增生相关。
关节、皮肤或骨骼的疾病或病症是本领域技术人员已知的，并且可以涉及但不限于：Ambe、缺血性坏死或骨坏死、关节炎、骨刺(骨赘)、颅缝早闭、科-勒(Coffin–Lowry)综合征、进行性骨化性纤维发育不良、纤维性结构不良、方氏(Fong)病(或指甲-髌骨综合征)、骨折、骨巨细胞瘤、绿枝性骨折、痛风、低磷酸酯酶症、遗传性多发性骨软骨瘤、克-费(Klippel-Feil)综合征、代谢性骨病、多发性骨髓瘤、指甲-髌骨综合征、骨关节炎、变形性骨炎(或佩吉特氏骨病)、囊状纤维性骨炎(或纤维性骨炎或冯·雷克林豪森氏骨病)、耻骨骨炎、致密性骨炎(或致密骨炎)、剥脱性骨软骨炎、骨软骨瘤(骨肿瘤)、成骨不全症、软骨病、骨髓炎、骨量减少、骨硬化症、骨质疏松症、多孔性骨肥厚、原发性甲状旁腺功能亢进症、肾性骨营养不良、索-哈(Salter-Harris)骨折、脊柱侧弯。皮肤或骨骼的疾病或病症也可能与关节疾病或关节病相关，例如但不限于：关节炎、脊柱关节病、关节病、反应性关节病、肠病性关节病、结晶性关节病、糖尿病性关节病、神经性关节病。
骨关节炎(OA)是本领域技术人员已知的一种关节疾病，其由关节软骨和下面的骨骼的破坏引起。相关疾病可以是具有类似症状或类似潜在病因的疾病。相关疾病也可能是指继发性骨关节炎，其中骨关节炎是由其它因素引起的，例如黑尿症、先天性关节病症、糖尿病、爱-唐(Ehlers-Danlos)综合征、血色病和威尔逊氏病、炎性疾病、关节或韧带损伤、马凡(Marfan)综合征、肥胖、关节感染。在实施例中，骨关节炎是创伤后骨关节炎或肥胖诱导的骨关节炎。
炎症是本领域技术人员已知的，并且可以由皮肤或骨骼疾病或病症、骨关节炎或相关疾病引起，或者炎症可以是皮肤或骨骼疾病或病症、骨关节炎或相关疾病的病因。优选地，炎症由滑膜增生引起或引起滑膜增生。
一方面，本发明一般涉及一种用于治疗疾病或病症或提供健康益处的组合物，其中所述组合物包括水解胶原蛋白肽。
在所述组合物的某些实施例中，所述用途用于预防或治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症或者为皮肤、关节或骨骼提供健康益处。
在所述组合物的某些实施例中，所述用途用于预防或治疗炎症，优选其中所述疾病是骨关节炎，特别是创伤后骨关节炎或肥胖诱导的骨关节炎，或相关的疾病或病症。
在所述组合物的某些实施例中，所述炎症与滑膜增生相关。
可以使用任何合适的水解胶原蛋白肽。优选地，根据本发明的包括水解胶原蛋白的组合物包括hCol1或hCol2或其组合，优选hCol1或hCol2或两者均存在于根据本发明的组合物中，其平均分子量在本文提及的优选范围内。
在所述组合物的某些实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或其中hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。
在所述组合物的某些实施例中，hCol1来源于来自皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)的牛、猪或鱼胶原蛋白，即hCol1通过来自牛、猪或鱼皮肤或皮或骨骼的胶原蛋白的酶促水解产生，和/或hCol12来源于来自软骨的牛、猪或鱼胶原蛋白，即hCol2通过来自牛、猪或鱼软骨的胶原蛋白的酶促水解产生。
在所述组合物的某些实施例中，它适合于口服施用。
在所述组合物的某些实施例中，它适合于每日施用、每周三次施用、每周两次施用或每周施用。
另一方面，本发明一般涉及一种用于预防或治疗疾病或病症或提供健康益处的组合，其中所述组合包括上述组合物并且在相同的组合物中包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物作为水解胶原蛋白，或其中所述微生物存在于不同的组合物中。一个相关方面涉及包括水解胶原蛋白肽并且在相同的组合物中包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物作为水解胶原蛋白肽(或其中所述微生物存在于不同的组合物中)的所述组合用于提供健康益处的用途。
在所述组合的某些实施例中，来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的量以预防或治疗骨关节炎或相关疾病或病症的有效量存在。
在所述组合的某些实施例中，来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的量以预防或治疗炎症(特别是与滑膜增生相关的炎症)的有效量存在。
在所述组合的某些实施例中，所述微生物来自无壁菌门和/或双歧杆菌属。在所述组合的实施例中，所述微生物来自双歧杆菌属，优选假长双歧杆菌。
又一方面，本发明一般涉及一种包括水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。在所述组合物的实施例中，所述微生物来自双歧杆菌属，优选假长双歧杆菌。在所述组合物的某些实施例中，所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
在所述组合的某些实施例中，所述微生物来自无壁菌门和/或双歧杆菌属。
又一方面，本发明一般涉及一种包括本文公开的组合物的单位剂型，其中所述单位剂型是片剂、胶囊、粉末或液体。
又一方面，本发明一般涉及一种包括本文公开的组合的单位剂型，其中所述单位剂型是片剂、胶囊、粉末或液体。
更优选地，所述组合物包括单位剂量为约1.5克到约15，更优选2到12，更优选2.5到10，更优选3到8.5，更优选3.5到7.5，更优选4到6.5，最优选4.5到5.5的hCol1，和/或包括单位剂量为约0.9克到约7.5，更优选1.0到7.0，更优选1.2到6.5，更优选1.4到6.0，更优选1.6到5.5，更优选1.8到5.0，更优选2.0到4.5，更优选2.5到4.0，最优选3.0到3.5克的hCol2，和/或优选地包括单位剂量为约108CFU到约1011，更优选约109到1010CFU的来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
在所述单位剂量的某些实施例中，其包括约0.8克到约15克(例如，约1.5到约15，约2到约12，约2.5到约10，约3到约8.5，约3.5到约7.5，约4到约6.5，约4.5到约5.5，约1.0到约7.0，约1.2到约6.5，约1.4到约6.0，约1.6到约5.5，约1.8到约5.0，约2.0到约4.5，约2.5到约4.0，约3.0到约3.5克)的水解胶原蛋白肽和/或约107CFU到约1012CFU(例如，约107菌落形成单位(CFU)到约1011CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约1010CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约109CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约109菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约1010菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1011CFU)的来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
在所述单位剂量的某些实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或其中hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。
在所述单位剂量的某些实施例中，hCol1来源于来自皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)或来自水母的牛、猪或鱼胶原蛋白，和/或hCol12来源于来自软骨的牛、猪或鱼胶原蛋白。
在所述单位剂量的某些实施例中，所述微生物来自无壁菌门和/或双歧杆菌属。在所述单位剂量的实施例中，所述微生物来自双歧杆菌属，优选假长双歧杆菌。
又一方面，本发明一般涉及一种套装或试剂盒，其包括包括水解胶原蛋白肽的组合物和包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物，或包括包括水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
在所述套装或试剂盒的某些实施例中，所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
在所述套装或试剂盒的某些实施例中，其包括约0.8克到约15克(例如，约1.5到约15，约2到约12，约2.5到约10，约3到约8.5，约3.5到约7.5，约4到约6.5，约4.5到约5.5，约1.0到约7.0，约1.2到约6.5，约1.4到约6.0，约1.6到约5.5，约1.8到约5.0，约2.0到约4.5，约2.5到约4.0，约3.0到约3.5克)的水解胶原蛋白肽和/或约107CFU到约1012CFU(例如，约107菌落形成单位(CFU)到约1011CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约1010CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约109CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约109菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约1010菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1011CFU)的来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
在所述套装或试剂盒的某些实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或其中hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。
在所述套装或试剂盒的某些实施例中，hCol1来源于来自皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)或来自水母的猪、牛或鱼胶原蛋白，和/或hCol12来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
在所述套装或试剂盒的某些实施例中，所述微生物来自无壁菌门和/或双歧杆菌属。在所述套装或试剂盒的实施例中，所述微生物来自双歧杆菌属，优选假长双歧杆菌。
又一方面，本发明一般涉及一种包括水解胶原蛋白肽或基本由其组成的组合物用于调节或改善肠道微生物组(优选用于增加肠道中的微生物多样性)的用途。一个相关方面涉及一种调节或改善肠道微生物组(优选增加肠道中的微生物多样性)的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用改善肠道微生物组的有效量的包括水解胶原蛋白肽或基本由其组成的组合物。
在特定实施例中，包括水解胶原蛋白肽的组合物用于增强无壁菌门和厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。在实施例中，包括水解胶原蛋白肽的组合物用于增强双歧杆菌、乳杆菌和/或梭菌目的微生物。
又一方面，本发明一般涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为益生元的用途。一个相关方面涉及一种向受试者提供益生元的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用包括有效量的水解胶原蛋白肽的组合物。在所述用途的某些实施例中，所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
在所述用途的某些实施例中，其包括约0.8克到约15克(例如，约1.5到约15，约2到约12，约2.5到约10，约3到约8.5，约3.5到约7.5，约4到约6.5，约4.5到约5.5，约1.0到约7.0，约1.2到约6.5，约1.4到约6.0，约1.6到约5.5，约1.8到约5.0，约2.0到约4.5，约2.5到约4.0，约3.0到约3.5克)的水解胶原蛋白肽。
在所述用途的某些实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或其中hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。
在所述用途的某些实施例中，hCol1来源于来自皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)或来自水母的猪、牛或鱼胶原蛋白，和/或hCol12来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
又一方面，本发明一般涉及一种预防或治疗骨关节炎(特别是创伤后骨关节炎或肥胖诱发的骨关节炎或相关疾病或病症)的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用治疗骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。一个相关方面涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗骨关节炎或相关疾病或病症。
又一方面，本发明一般涉及一种预防或治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症或其相关疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。一个相关方面涉及一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症或其相关疾病或病症。
又一方面，本发明一般涉及一种改善关节健康、皮肤健康或骨骼健康的方法。所述方法包含：以单一组合物或不同组合物向有需要的受试者施用改善关节健康、皮肤健康或骨骼健康的有效量的水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。一个相关方面涉及在单一组合物或不同组合物中的水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的用途，其用于改善关节健康、皮肤健康或骨骼健康。
又一方面，本发明一般涉及一种提供软骨保护作用或保护受试者中的软骨的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用包括有效量的水解胶原蛋白肽的组合物。在实施例中，受试者被诊断患有骨关节炎，优选创伤后骨关节炎或肥胖诱导的骨关节炎。一个相关方面涉及如本文所述的包括水解胶原蛋白肽的组合物作为软骨保护剂的用途。
又一方面，本发明一般涉及一种改善肠道微生物组和/或治疗与其相关的疾病或病症的方法。所述方法包含：向有需要的受试者施用改善肠道微生物组和/或治疗与其相关的疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。
在所述方法的某些实施例中，所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
在所述方法的某些实施例中，其包括约0.8克到约15克(例如，约1.5到约15，约2到约12，约2.5到约10，约3到约8.5，约3.5到约7.5，约4到约6.5，约4.5到约5.5，约1.0到约7.0，约1.2到约6.5，约1.4到约6.0，约1.6到约5.5，约1.8到约5.0，约2.0到约4.5，约2.5到约4.0，约3.0到约3.5克)的水解胶原蛋白肽和/或约107CFU到约1012CFU(例如，约107菌落形成单位(CFU)到约1011CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约1010CFU，约107菌落形成单位(CFU)到约109CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约109菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约1010菌落形成单位(CFU)到约1012CFU，约108菌落形成单位(CFU)到约1011CFU)的来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
在所述方法的某些实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或其中hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。
在所述方法的某些实施例中，hCol1来源于来自皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)或来自水母的猪、牛或鱼胶原蛋白，和/或hCol12来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
在所述方法的某些实施例中，所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
在所述方法的某些实施例中，来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
在所述方法的某些实施例中，所述微生物来自无壁菌门和/或双歧杆菌属。在所述方法的实施例中，所述微生物来自双歧杆菌属，优选假长双歧杆菌。
在所述方法的某些实施例中，经由口服施用进行施用。
在本文公开的水解胶原蛋白肽的组合物中，水解胶原蛋白肽构成基本比例的组合物。因此，在特定实施例中，以组合物的干质量计，水解胶原蛋白肽的组合物包括至少50重量％，例如至少60重量％或70重量％，优选至少80重量％，更优选至少85重量％或90重量％，甚至更优选至少95重量％、96重量％或97重量％的水解胶原蛋白肽。
在本文公开的水解胶原蛋白肽的组合物中，水解胶原蛋白肽是1型水解胶原蛋白肽(hCol1)和/或2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。在实施例中，hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)，和/或hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间(例如，约600Da和约6000Da之间，约1000Da和约5000Da之间，约1300Da和约4500Da之间，约1600和约4000Da之间，约1800Da和约3500Da之间，约2000和约3000Da之间)。在另外的实施例中，hCol1通过酶促水解来自脊椎动物(特别是猪、牛或鱼)或来自软体动物(特别是水母)的胶原蛋白而产生，和/或hCol2通过酶促水解来自脊椎动物(特别是猪、牛或鱼)的胶原蛋白而产生。在另外的实施例中，hCol1通过酶促水解来自猪、牛或鱼皮肤或皮或骨骼(优选皮肤或皮)的胶原蛋白而产生，和/或hCol2通过酶促水解来自猪、牛或鱼软骨的胶原蛋白而产生。
在某些实施例中，水解胶原蛋白肽的组合物被掺入或配制成食品或饲料产品，优选用于口服施用的食品或饲料产品、食品或饲料成分。在一些实施例中，食物或饲料产品是饮料，优选用于口服施用的饮料。合适饮料的非限制性实例包含果汁、果饮、人工调味饮料、人工增甜饮料、碳酸饮料、运动饮料、液体奶制品、奶昔、酒精饮料、含咖啡因饮料、婴儿配方奶粉等等。在一些实施例中，食品或饲料产品是固体食品或饲料。固体食品的合适实例包含但不限于酸奶、食物棒、小吃棒等。在某些实施例中，水解胶原蛋白肽的组合物被配制为膳食补充剂。水解胶原蛋白肽可以以例如粉末、颗粒、溶液或混悬液的形式或以片剂、胶囊、丸剂、糖衣丸、囊片或小袋、糖浆、酏剂的形式存在，如果合适的话，其与本文其它地方描述的合适的添加剂或非活性成分组合。
本文公开的包括水解胶原蛋白肽的组合物可以施用至少1周，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周。组合物可以每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。优选地，包括水解胶原蛋白肽的组合物每日施用，持续至少1周，优选至少2周。
本文公开的包括水解胶原蛋白肽的组合物的每日口服摄入量优选为0.5g到15g组合物，优选1g到10g，更优选2g到10g，甚至更优选5g到10g，特别优选6.0g到8.0g，例如约7.5g。
以下实例旨在说明本发明的实践，而不是以任何方式进行限制。
实例
hCol的食团递送
使用在16周实验时间线(图1C)的过程中的hCol1和hCol2的每日食团递送来研究hCol1和hCol2的长期每日服用的关节保护作用。为了支持每日食团递送策略，将hCol1和hCol2掺入能多益中，使得150mg量的实验混合物将支持递送3.8mg(LD)或38mg(HD)的hCol1或3.8mg(LD)的hCol2。一旦制备，将对照(仅能多益媒剂)、LD和HD hCol1以及LD hCol2的150mg等分试样置于无菌瓷砖上(图1A)并且每天早晨将其同时给予每个单独圈养的小鼠(图1B)。小鼠通常在2分钟内服用整个补充剂，从而支持食团递送。为了确认hCol1补充剂成功吸收到循环中，在手术前1周和手术后2、3和12周从小鼠收集血液样品(假手术或MLI，图1C)。对于前两个时间点，在服用补充剂后3小时收集抽血，而后两个时间点涉及在服用后1小时的抽血。正如预期的那样，在递送hCol1补充剂后，h脯氨酸的血清水平增加。当在食团递送后3小时收集时，仅HD hCol1组表现出血清h脯氨酸水平的显著增加(图1D)。相比之下，当在食团递送后45分钟收集抽血时，LD和HD组均表现出血清h脯氨酸水平的显著增加，具有明显的剂量依赖性(图1E)。这些结果证实了食团递送方案是有效的，h脯氨酸的血清水平增加确认了在LD和HD hCol1补充后的hCol1的吸收增加。值得注意的是，对来自施用hCol2的小鼠的样品的类似分析基于测量的循环血清中的羟基脯氨酸水平证实了有效口服递送(图12)。
hCol1补充剂对软骨结构的影响
膝关节关节软骨的初步分析涉及用于在用甲苯胺蓝和固绿染色的矢状切面中确定总软骨区域的自动化组织形态计量。将染色切面数字化为图像，并在Visiopharm平台上开发“关节软骨应用”，以简化股骨髁和胫骨平台上的总软骨区域的确定。主要的软骨改变发生在胫骨平台上，其中在损伤后3周(图2B)和12周(图2A和2C)可检测到显著的总软骨缺失。在损伤后3或12周或在任何实验组中未检测到股骨髁关节软骨区域的变化(数据未示出)。表明hCol1补充的可能的软骨保护作用，在LD hCol1组中防止了MLI后3周的总胫骨软骨区域缺失，HD组趋于改善但缺少显著性(图2B)。在MLI后12周时间点，hCol1具有剂量依赖性保护作用，HD组中总胫骨软骨区域缺失显著减轻，并且LD组趋于显著(图2C)。应当注意，hCol1补充对基线(假手术)关节软骨区域没有可辨别的作用(数据未示出)。总体而言，这些结果首次表明，膳食补充hCol1可能在PTOA的发展和进展中具有保护作用。
尽管自动化组织形态计量方法可用于标识hCol1在PTOA中的保护作用，但使用本方法无法辨别软骨构造和细胞构成的潜在变化，所述软骨构造和细胞构成有助于整个胫骨软骨的整体保留。因此，使用人工组织形态计量方法(Osteomeasure系统)以及标准化的OARSI软骨评分，对番红O/固绿或阿尔新蓝苏木精/橙黄G染色切面进行另外的分析。在MLI后3周，实验组之间在软骨构造中存在可观察到的差异，包含在补充hCol1的小鼠中的本区域中的胫骨未钙化软骨和细胞构成的明显保留。与自动化分析一致(图2B)，通过hCol1补充显著减轻了MLI后胫骨未钙化软骨区域的减少，其中LD组示出了显著的作用并且HD趋于所述方向(图3B)。关于钙化软骨区域(到骨软骨交界处的潮标)，MLI没有作用，hCol1补充也没有作用(图3C)。来自MLI后胫骨未钙化区域的软骨细胞的缺失在LD和HD hCol1喂养动物中似乎有所减少(图3A)，但是本趋势未能达到统计学显著性(图3D)。表明hCol1在MLI后3周时间点支持软骨细胞蛋白多糖基质产生，LD hCol1补充小鼠中的番红O阳性软骨细胞陷窝的数量和百分比显著增加，HD组趋于所述方向(图3E和3F)。最后，基于OARSI评分，MLI对损伤后3周关节软骨的影响是显著的，但使用本评分系统对软骨含量的广义分析不足以标识hCol1补充组的任何改善(图3G)。应当注意，在进行的其它结构分析中，实验组之间没有显著差异，包含股骨髁上的未钙化和钙化软骨区域和肥大软骨细胞的数量，以及股骨髁和胫骨平台上的任何软骨区域(数据未示出)。同样应当注意，HD hCol1在MLI后3周保留未钙化软骨和番红O阳性软骨细胞群方面与LD hCol1的功效明显无法匹配，这可能是由于HD组中的两个异常样品，其造成了较大误差(图2B、2E和2F)。
为了比较，图9描绘了施用hCol2的小鼠的类似分析。与hCol1一样，在补充hCol2的小鼠中，在MLI后3周观察到软骨保护作用(图9A-9E)。这些hCol2作用在LD hCol2处，并且应当注意，其与HD hCol1引起的作用同等有效，表明hCol2引起了更有效的软骨保护作用。
在MLI后12周收获的番红O/固绿染色矢状关节切面中进行类似的一组人工组织形态计量分析。在本时间点，hCol1似乎提供比3周时更显著的保护，其中代表性切面描绘了关节软骨区域和细胞结构的明显保留(图4A)。Osteomeasure的使用再次促进了关键软骨结构要素的定量，在MLI后具有明确的未钙化胫骨软骨的hCol1剂量依赖性保留(图4B)。对本作用进行补充的是针对MLI诱导的胫骨钙化软骨区域的扩展的对抗，来自HD hCol1治疗的小鼠的关节示出了钙化软骨区域的显著减少(图4C)。关于细胞结构，12周时，MLI诱导了未钙化胫骨软骨中的软骨细胞的几乎完全缺失，hCol1剂量依赖性地对抗本作用(图4D)。值得注意的是，HD hCol1组中的软骨细胞数量与假手术对照组没有显著差异，表明补充剂在保留软骨细胞结构方面具有实质性的功效。关于胫骨未钙化软骨中番红O-阳性软骨细胞陷窝的数量和百分比，在补充hCol1的小鼠中，完全拯救了MLI后12周产生蛋白多糖基质的细胞的几乎完全缺失(图4E和4F)。事实上，表明软骨再生作用，LD和HD hCol1组表现出相较于对照假手术关节的更大数量和更高百分比的胫骨未钙化软骨中的番红O染色陷窝(图4E和4F)。尽管如所预期，OARSI评分在MLI后12周显著增加，但hCol1补充小鼠仅示出了评分的适度改善，LD组趋于显著性(图4G)。如在3周时间点对关节进行的分析所讨论，应当注意，实验组之间在股骨髁上的未钙化和钙化软骨区域以及股骨髁和胫骨平台上的任何软骨区域中的肥大软骨细胞的数量上没有显著差异。
PTOA诱导的MMP13上调被hCol1改善
软骨退变的一个重要步骤是关节软骨细胞向肥厚状态的异常转变，这一事件的标志在于分解代谢酶(例如，MMP13)和末端肥大标志物10型胶原蛋白(ColX)的表达。因此，图2-4中记录的hCol1的软骨保护作用可能与软骨细胞肥大的抑制相关。为了解决本问题，进行免疫组织化学以评估关节软骨中的MMP13和ColX蛋白水平。如所预期，并且表明软骨细胞肥大，对照MLI小鼠相较于3周时间点的对照假手术小鼠在未钙化软骨中具有升高的MMP13和ColX水平(图5A和5B)。补充HD hCol1的小鼠被保护免于在未钙化软骨中的MLI诱导的MMP13染色，表明本组中软骨构造的保留可能部分归因于基质退变的抑制(图5A)。相反，在补充hCol1的MLI小鼠中，ColX染色没有减少，表明hCol1不影响末端软骨细胞肥大(图5B)。总体而言，在钙化软骨中没有观察到差异，因为本区域中的软骨细胞都活跃地产生类似的MMP13和ColX水平(图5A和5B)。应当注意，在12周时间点，来自对照补充小鼠的MLI关节已经失去了大部分未钙化软骨和相关软骨细胞，使得与治疗组的比较没有信息(数据未示出)。总之，这些数据表明补充HD hCol1的小鼠可能已被保护免于软骨退变，部分原因是由于驻于未钙化软骨中的软骨细胞减少了MMP13产生。
hCol1补充剂对关节软骨细胞生命周期的影响
hCol1补充在鼠PTOA中对抗软骨细胞缺失的显著能力(图4D)可以通过设定使软骨细胞持续产生基质分子的阶段而成为其软骨保护作用的关键驱动因素(图4E和4F)。为了确定针对MLI诱导的软骨细胞缺失的对抗是否是由于刺激增殖或抑制细胞凋亡，经由PCNA和TUNEL染色分析代表性组织切面。尽管基于PCNA免疫检测在MLI后3周的实验组之间没有增殖软骨细胞的数量的可检测到的差异(数据未示出)，但在补充hCol1的小鼠中，MLI后3周减少了广泛软骨细胞凋亡的MLI诱导(图6)。代表性TUNEL染色切面示出了浅表-中层软骨区域中的凋亡软骨细胞数量的显著减少(图6中的缩放图)。应当注意，分析在12周时间点没有提供信息，因为对照补充小鼠中的MLI关节是TUNEL阴性的，这是由于在收获之前发生的软骨细胞的广泛凋亡缺失。总体而言，这些数据表明在MLI后12周，在hCol1补充小鼠的未钙化软骨中看到的显著更大数量的软骨细胞(图4D)可能是由于对疾病过程早期的细胞凋亡的保护。
口服递送hCol1对抗PTOA诱导的滑膜变化
在hCol1补充小鼠中，MLI后明显保留了产生基质的软骨细胞，这就需要随后对hCol1对炎性滑膜变化的影响进行研究，已知所述炎性滑膜变化会导致关节损伤后的软骨细胞死亡。(戈德林等人，2011风湿病学近期评述(Curr Opin Rheumatol)，23(5):471-8；戈德林等人，2011欧洲细胞与材料(European cells&materials)，21:202-20)
代表性番红O/固绿染色矢状位膝关节切面的比较表明，在被提供hCol1补充剂的小鼠中，滑膜增生的严重程度明显降低。在MLI后3周和12周，与对照假手术关节相比，滑膜厚度增加，而被提供hCol1的小鼠被保护免于MLI诱导的增生性滑膜改变(图7A)。使用滑膜评分方法进一步研究滑膜表型，表明了在被提供hCol1补充剂的小鼠中显著的作用与代表性组织学一致。如所预期，MLI在MLI后3周(图7B)和12周(图7C)诱导了滑膜评分的显著增加(即，更强大的滑膜增生)。在3周时，在补充hCol1的MLI组中，滑膜评分趋于减少(改善)(图7B)。相比之下，在MLI后12周，来自HD hCol1组的小鼠中的滑膜增生显著减少，表明hCol1补充剂有效地减少了PTOA中存在的滑膜/关节炎症。
在涉及动关节关节退变的几种细胞因子中，TNF被确认为中枢性炎症介质，其存在于滑液中并在PTOA中的增生性滑膜中上调，特别是在创伤后早期时间范围内。(戈德林MB，PTOA的潜在机制：炎症(Potential Mechanisms of PTOA:Inflammation)，收录于：奥尔森(Olson)等人编辑，创伤后关节炎：发病机制、诊断和治疗(Post-Traumatic Arthritis:Pathogenesis,Diagnosis and Treatment)，纽约：施普林格(Springer)；2015,p.201-8；格莱特利(Golightly)等人，PTA的生物标志物(Biomarkers of PTA)，收录于：奥尔森等人编辑，创伤后关节炎：发病机制、诊断和管理(Post-Traumatic Arthritis:Pathogenesis,Diagnosis and Management)，纽约：施普林格；2015,p.317-30)
为了研究hCol1补充对MLI后TNF表达的影响，进行免疫组织化学染色和滑膜的mRNA分析。代表性免疫染色矢状切面表明了在MLI后3周和12周的TNF表达增加，来自HDhCol1组的小鼠基本上被保护免于本作用(图8A)。经由从各个实验组收获的滑膜中的TnfmRNA水平的定量分析来证实了这一点。具体地，在损伤后3周，LD和HD hCol1补充均显著降低了来自假手术组和MLI组的滑膜中的Tnf水平(图8B)。尽管Tnf的总滑膜水平在损伤后12周较低，但hCol1仍然有效地降低了MLI关节中的滑膜Tnf，其中HD组达到统计学显著性(图8C)。应当注意，尽管其它基因(包含Il1β、Prg4和Mmp13)的滑膜表达在损伤后(特别是在MLI后12周)增加，但hCol1补充对表达水平没有显著影响(数据未示出)。总体而言，这些研究结果表明，在早期和中期PTOA中，具有hCol1膳食补充减少了滑膜增生并减轻了滑膜Tnf表达。
hCol1的递送方案支持小鼠肠道微生物组的变化
迄今提供的数据证实了hCol1能够在OA中提供强大的软骨保护的能力并且能够在骨骼和皮肤中提供另外的有益作用。现在要求，这些作用与肠道微生物组中的有重大影响的变化相关。支持本想法，从被提供hCol1的小鼠的粪便中提取的DNA的rDNA测序分析表明，肠腔中的微生物种群发生了变化，其中来自无壁菌门的微生物示出了丰度的显著增加。在图10A和图11A-11E中，示出了基于从各组被提供几种不同膳食补充剂的小鼠收集的数据的主要坐标分析(PCoA)，其中一种数据是用于研究图1-9中的软骨保护的hCol1的剂量。图11A中的PCoA图特别示出了肥胖和瘦能多益喂养小鼠彼此完全不同，各组之间的微生物多样性具有强烈差异。在图11E和11C中，hCol1喂养瘦小鼠与对照不同，表明hCol1补充剂正在改变微生物组。图10B中的相对丰度图和图10C中的百分比分解图表明，与瘦hCol1(1.2523％)和瘦葡糖胺(12.7091％)组相比，瘦能多益组具有更多的放线菌(19.6127％)。对于本申请中描述的技术的有重大影响的关键观察结果是，瘦小鼠具有较少的无壁菌种群(平均小于0.8％)，但是本种群在补充hCol1的小鼠中显著增加(6.998％)。无壁菌的这种hCol1诱导代表了表明无壁菌种群与hCol1肽对关节、皮肤和骨骼的生物学作用相关的基础。
对这些研究结果进行补充，进行了类似的实验以记录hCol2影响关节软骨构造并影响肠道微生物组的能力。确认hCol2的每日食团剂量的有效递送，被喂养本补充剂的小鼠表现出循环羟基脯氨酸的峰值，其与hCol1补充可见的作用相当(图12)。这与创伤后OA中的软骨保护相关，包含在疾病的损伤诱导后3周未钙化软骨层中的番红O阳性软骨细胞的数量的增加(图9)。这与hCol2补充小鼠中的滑膜增生的减少相关，其类似于在相同的3周时间点在hCol1补充动物中可见的作用(图13)。与滑膜增厚的这种减少相关的是基于免疫组织化学的滑膜中的TNF表达的减轻和基于关节囊组织的qPCR分析的Tnf转录物的减少(图14)。
进行另外的实验，旨在定量被喂养普通饮食、瘦饮食或高脂肪饮食的受损小鼠中的软骨保留和滑膜TNF表达。有显而易见的趋势表明普通饮食和瘦饮食喂养小鼠中损伤后12周以及高脂肪喂养小鼠中损伤后3周的软骨保留、软骨细胞数量和软骨细胞基质产生(图15-17)。TNF免疫组织化学表明了在损伤后3周补充hCol1或hCol2的肥胖小鼠中TNF表达降低的趋势(图21)。此外，与图10-11中所示的hCol1喂养小鼠中的肠道微生物组的初始研究一致，补充具有hCol1或hCol2普通、瘦和高脂肪实验饮食具有对肠道微生物群落的显著影响。在普通饮食中，hCol 1和2趋于具有类似的作用：拟杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、苏黎世杆菌和厌氧原体的丰度增加。这些增加是以hCol1和hCol2补充小鼠中的梭菌群落为代价的，但本作用是微不足道的，并且梭菌是所有三组的主要目(图15)。在瘦饮食中，hCol 1和2也趋于具有类似的作用：最引人注目的是双歧杆菌的缺失和厌氧原体的出现以及乳杆菌、苏黎世杆菌和厌氧原体的轻微减少(图16)。在HF饮食中，hCol 1和2再次趋于诱导相同的作用：红蝽杆菌的消融和乳杆菌的减少。乳杆菌群落的缺失与有益的梭菌的丰度增加相关，所述梭菌被称为丁酸盐生产者(图17)。
总体而言，在补充hCol1和hCol2的普通和HF饮食中观察到了微生物多样性增加(图15、17)。
在HF饮食中进一步观察到，hCol2补充减少了促炎细菌物种消化球菌rc4-4种、肠球菌种、乳杆菌ND、韦荣球菌种和安德克氏菌种，并且增加了抗炎细菌物种毛螺菌种、脱卤菌种、艰难杆菌种、多尔氏菌种、梭菌ND、颤螺菌ND和假长双歧杆菌(图19)。
在每种测试的背景饮食中，hCol 1和2均对肠道微生物组具有显著作用，支持它们作为益生剂的活性，其可以通过对肠道微生物组的作用影响宿主生物学。
口服递送hCol1或hCol2的抗炎作用
肥胖诱导的循环TNF-α的增加在hCol1和hCol2补充时大大逆转(图18)，表明抗炎作用在本背景下与相关的针对骨关节炎进展的对抗相当并且进一步支持使用hCol1和hCol2作为益生元。
口服递送hCol1或hCol2改善骨骼健康
非肥胖代谢健康的小鼠每天喂养hCol1、hCol2或媒剂对照(能多益)补充剂。喂养补充剂12周后，进行显微CT分析以检查股骨和椎骨参数，并进行骨密度计量(DEXA)以确定全身骨矿物质密度(BMD)。hCol1和hCol2补充增加了骨体积分数(BV/TV)、小梁连接的密度(连接密度)和小梁数量(Tb.N.)(图20A-C)。另外，在补充hCol1的小鼠中，第四腰椎(L4)中的骨体积分数(BV/TV)增加(图20D)。最后，全身骨矿物质密度的DXA分析表明了在补充hCol1或hCol2的小鼠中的积极作用(图20E)。总体而言，这些数据支持hCol1和hCol2改善骨质量。
实验
动物
在此报道的研究中进行的所有小鼠处理和体内实验程序由罗契斯特大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)(方案号UCAR-2005-226R)审查和批准。雄性C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)并以12小时光/暗循环单独圈养在微型隔离笼中。由于退变进展更快且更具时间可预测性的原因，在本研究中使用雄性小鼠。小鼠随意获取标准普通食物和淡水，并使用先前描述的递送每日剂量的雌二醇的方法向其补充牛源且平均分子量为2500Da的hCol1(罗赛洛)或平均分子量为2700Da的猪源hCol2。(英格伯格(Ingberg)等人，2012普通与比较内分泌学(General and comparative endocrinology)，175(1):188-93)
简言之，将hCol1和hCol2掺入能多益中，使得150mg的混合物在完全服用时将递送低剂量(LD，3.8mg)或高剂量(HD，38mg)的hCol1或低剂量(3.8mg)的hCol2。HD是体重调整的小鼠，相当于hCol1的7.4g/天推荐人体剂量。在实验时间线的开始(图1C)，向12周龄小鼠给予可高压灭菌的瓷砖，其载有能多益媒剂、LD hCol1、HD hCol1或hCol2的150mg等分试样(图1A)。这些实验补充剂每天(早晨)同时提供，并且一旦训练，小鼠在2分钟内服用整个提供的量(图1B)。对建议用于人类终身关节健康的每日服用方案进行建模，在整个实验方案期间每天向小鼠喂养补充剂，直到收集实验终点。
为了启动PTOA，我们采用了我们组开发并常规使用的一种方法，其被称为半月板韧带损伤(MLI)，(穆尼(Mooney)等人，2011关节炎研究与治疗，13(6):R198；桑普森(Sampson)等人，2011骨科研究杂志(J Orthop Res)，29(8):1145-51；桑普森等人，2011科学转化医学(Sci Transl Med)，3(101):101ra93；滨田(Hamada)等人，2014分子生物学方法(Methods Mol Biol)，1130:61-72)，或采用了一种内侧半月板失稳(DMM)损伤模型，其被广泛用于临床前OA领域。(格拉森(Glasson)等人，2007骨关节炎与软骨，15(9):1061-9)简言之，经由腹膜内注射60mg/kg氯胺酮和4mg/kg甲苯噻嗪麻醉实验方案中的小鼠(17周龄)。对于MLI模型，在右膝关节的前内侧面上形成3mm切口后，切断右膝内侧副韧带，并切除内侧半月板的一段前角。本损伤导致损伤后4周可检测到的PTOA关节变化并且进展超过4个月，类似于在创伤后OA的DMM模型可见。(桑普森等人，2011骨科研究杂志，29(8):1145-51；格拉森等人，2007骨关节炎与软骨，15(9):1061-9)对于DMM手术，进行类似的步骤以进入关节，并且切断内侧半月板胫骨韧带以使内侧半月板失稳。在两种情况下(MLI和DMM)，向对侧肢体提供假手术对照，手术仅由切口组成(未对关节结构进行推拿)。小鼠在手术时被提供丁丙诺啡镇痛(0.5mg/kg)，并且每12小时提供提供丁丙诺啡镇痛，持续3天。
组织固定和组织学制备
采用先前建立的用于制备、剖切和可视化小鼠膝关节关节软骨的系统方法来进行所有基于组织的测定。((桑普森等人，2011骨科研究杂志，29(8):1145-51)
在收获时(MLI后3或12周)，使用AMVA批准的方法处死小鼠，并且股骨和胫骨完整地切开膝关节以维持关节结构。将组织在4℃下在4％多聚甲醛中固定72小时，在5％甲酸中脱钙10天，使用微波处理器处理，并包埋在石蜡中。然后，在通过关节的内侧间室的正中矢状面对组织块进行连续剖切。在内侧间室内以三个不同水平切割一系列5μm厚的切面，安装在带正电荷的载玻片上，在60℃下烘烤过夜，在二甲苯中脱石蜡，并在递减浓度的乙醇中再水合。为了支持经由组织形态计量研究组织结构并且为了适应OARSI和滑膜评分方法，使用由罗契斯特大学肌肉骨骼研究中心的组织学、生物化学和分子成像核心建立的优化方案，用甲苯胺蓝/固绿(0.04％/0.02％)、阿尔新蓝苏木精/橙黄G或番红O/固绿(1％/0.02％)对安装的切面进行染色。未染色的切面用于下述各种分子和细胞分析。
软骨组织形态计量
使用两种不同的方法来量化软骨含量。修改了用于量化小鼠同种异体移植物愈合中的组织构造的自动化方法，并且使用所述自动化方法用甲苯胺蓝/固绿染色切面来确定总软骨区域(未钙化加钙化)。(张等人，2016骨骼研究(Bone Res)，4:15037)
在使用Olympus VS120虚拟载玻片显微镜/载玻片扫描仪系统扫描到高分辨率数字文件后，使用基于软件的应用对组织学图像进行分析，所述应用被开发成基于这些组织之间的对比染色差异而自动区分骨骼和软骨(甲苯胺蓝染色软骨和固绿染色软骨下骨)。连续分析实验图像文件以量化胫骨平台和股骨髁上的总软骨区域，应用分别返回关于每个区域的信息。为了对这一点进行补充，还使用先前公布的OsteoMetrics系统进行了人工组织形态计量。(穆尼等人，2011关节炎研究与治疗，13(6):R198；桑普森等人，2011骨科研究杂志，29(8):1145-51)
简言之，使用经由数码相机与OsteoMetrics系统接口连接的Olympus BH2光学显微镜单独观察番红O/固绿染色切面。OsteoMeasureXP软件促进了未钙化软骨、钙化软骨和软骨细胞群的定量。在胫骨平台和股骨髁上检查的关节软骨区域被限定为在半月板的前角和后角之间，从而对于所分析的所有切面使用限定尺寸的目标区域。
OARSI和滑膜评分
关于软骨，使用由OARSI组织病理学倡议建立的评分系统作为对小鼠软骨退变进行分级的标准方法，进行半定量组织病理学分级。(格拉森等人，2010骨关节炎与软骨，18副刊3:S17-23)
基于本系统，使用阿尔新蓝苏木精/橙黄G染色关节切面进行软骨分级，使用以下标度：0＝正常软骨，0.5＝蛋白多糖染色缺失而没有软骨损伤，1＝轻度浅表纤维性颤动，2＝纤维性颤动和/或裂隙延伸到浅表区域以下，3＝轻度(<25％)软骨缺失，4＝中度(25-50％)软骨缺失，5＝重度(50-75％)非钙化软骨缺失，6＝骨质象牙化，软骨缺失>75％。还从每个关节切面获得了滑膜评分，其中评分报告如先前进行的滑膜增生程度(即，滑膜的厚度和细胞构成)。(滨田等人，2015关节炎与风湿病(Arthritis&rheumatology)，doi:10.1002/art.39561)
简言之，采用0到2的主观评分系统：0＝滑膜衬里为几个(2-3个)细胞层厚或<10μm厚(正常)，1＝滑膜增厚，衬里细胞层在5个和10个细胞厚之间或10μm和20μm厚之间，2＝滑膜衬里严重增厚>10个细胞和/或>20μm厚。OARSI和滑膜评分由四名盲法观察者(QAD、EMS、RAM和MJZ)进行，并且经由使用弗莱斯-科恩(Fleiss-Cohen)权重计算加权κ系数，成对地评估每个评分的观察者一致性。(桑普森等人，2011骨科研究杂志，29(8):1145-51)
平均成对系数为0.90，表明观察者之间的一致性很强。对每个切面的四个评分(OARSI和滑膜)进行求平均，并将来自每组小鼠的数据组合。
组织的分子分析
通过免疫组织化学评估的小鼠膝关节切面如下处理：用BLOXALL(Vector)淬灭内源性过氧化物酶10分钟，然后用3％过氧化氢处理20分钟，并用1:20稀释的正常山羊血清处理30分钟。将载玻片在4℃下与兔抗小鼠TNF多克隆(1:200；Abcam#ab6671)或兔抗人Ki-67单克隆抗体(1:200；Abcam#ab66155)一起温育过夜。对于TNF检测，然后用含有0.5％吐温20的磷酸盐缓冲盐水冲洗载玻片，并在室温下与生物素化的山羊抗兔IgG(1:200；Vector)一起温育30分钟。在应用来自Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector)的ABC试剂30分钟并进行ImmPACT DAB过氧化物酶(HRP)底物(Vector)的5分钟应用5分钟后，检测到与TNF结合的抗体。使用迈耳氏苏木精(Biocare Medical)将细胞核复染20秒。对于Ki-67检测，在与一抗一起温育过夜后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗载玻片，并在室温下与Alexa Fluor 488-缀合的山羊抗兔IgG(1:250；Invitrogen#ab150077)一起温育30分钟。根据制造商的说明，使用TUNEL原位细胞死亡检测试剂盒(Roche，#11684795910)标识凋亡软骨细胞。在Ki-67和TUNEL的情况下，用DAPI对细胞核进行复染，并使用具有SPOT RT3彩色/滑块相机的ZeissAxioskop 40BF/DF/荧光显微镜对实验荧光成像。
显微CT分析
在组织学处理之前，使用具有55k-Vp源的Scanco vivaCT 40扫描仪(Scanco)经由显微CT评估膝关节和腰椎。以12μm的分辨率扫描组织样品，切片增量为10μm。来自每组的图像以相同的阈值重建，以允许每个解剖单元的3维结构渲染和各个结构参数的恢复，如前所述(穆尼等人，2011关节炎研究与治疗，13(6):R198)。
骨密度计量(DEXA)
使用PIXImus2小鼠密度计(General Electric)经由双能X射线吸收计量(DEXA)扫描确定全身骨矿物质密度。在处死以收获组织之前，经由腹膜内注射氯胺酮(60mg/kg)和甲苯噻嗪(4mg/kg)麻醉小鼠，并且使用先前描述的标准方法收集并分析扫描(阿克特-比克内尔(Ackert-Bicknell)等人，2012骨骼(Bone)，50(5):1188-95)。
滑膜TNF表达的qRTPCR分析
在处死时，借助手术环从实验关节收获滑膜囊。将恢复的滑膜组织保存在-80℃下直至提取总mRNA。使用制造商的说明，使用Qiagen RNeasy纤维组织迷你试剂盒(Qiagen)从各个胶中分离mRNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)，使用一μg总RNA来合成cDNA。然后，使用SYBR绿色实时PCR反映混合物(Qiagen)通过qRTPCR评定小鼠β-肌动蛋白、Tnf、Il1β、Mmp13和Prg4的丰度。使用Rotor Gene 6000PCR仪进行反应。表1中报告了这些基因转录物中每一种的正向和反向引物序列。
表1：qRTPCR引物序列
肠道微生物组的分析
在抓住颈背后从小鼠新鲜地收获粪粒，并立即在-80℃下冷冻。按照制造商的指示，使用ZR粪便DNA提取试剂盒(Zymo Research)提取DNA。用Phusion高保真聚合酶(ThermoScientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和对V3-V4高变区(319F:5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3'(SEQ ID NO:11)；806R:3'ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 5'(SEQ ID NO:12))68具有特异性的双索引引物扩增16S核糖体DNA(rDNA)。合并扩增子并在罗彻斯特大学基因组学研究中心的Illumina MiSeq(Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州)上进行成对末端测序。每个测序运行包含：由金黄色葡萄球菌、乳酸乳球菌、牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌和大肠杆菌的1:5混合物组成的阳性对照；和由无菌盐水组成的阴性对照。来自Illumina MiSeq的原始数据首先使用Illumina提供的bcl2fastq程序1.8.4版转换为FASTQ格式的2x300成对末端序列文件。在没有解复用的情况下执行格式转换，并且禁用EAMMS算法。所有其它设置均为默认值。使用微生物生态学定量研究(QIIME)软件包(卡波拉索(Caporaso)等人，2010自然方法(NatMethods)，7(5):335-6)版本1.9.1进行序列处理和微生物组成分析。使用先前描述的配置(法德罗什(Fadrosh)等人，2014微生物组(Microbiome)，2(1):6)复用读段。简言之，对于一对中的两个读段，前12个碱基是条形码，其后是引物，然后是异质性间隔子，然后是靶16SrRNA序列。使用自定义Python脚本，去除来自每个读段对的条形码，连结在一起，并存储在单独的文件中。使用来自ea-utils包的fastq-join组装读段对，需要至少40个碱基重叠并且允许最多10％的错配碱基。舍弃无法组装的读段对。将连结的条形码序列追加到相应的组装读段之前，并且将所得的序列从FASTQ转换为FASTA和QUAL文件以用于QIIME分析。在解复用期间去除条形码、正向引物、间隔子和反向引物序列。从随后的处理和分析排除含有多于四个与已知引物序列的错配或多于三个与所有条形码序列的错配的读段。组装的读段在平均Phred质量评分小于20的前30碱基窗口的开头处或在第一个模糊(ambiguous)碱基处(以在先者为准)被截断。舍弃短于300个碱基或含有长于六个碱基的均聚物的所得序列。使用GreenGenes 99％OTU数据库的2013年5月版本作为封闭参考，使用QIIME中基于参考的USEARCH(版本5.2)(埃德加(Edgar)等人，2011生物信息学(Bioinformatics)，27(16):2194-200)管道挑选操作分类单位(OTU)(德桑蒂斯(DeSantis)等人，2006应用与环境微生物学(Applied and environmental microbiology)，72(7):5069-72；麦克唐纳(McDonald)等人，2012ISME杂志(ISME J)，6(3):610-8。索引字长为128，其它默认参数与USEARCH一起使用。使用默认参数，利用UCHIME从头进行嵌合体检测(埃德加等人，2011生物信息学，27(16):2194-200)。去除具有少于四个序列的OTU簇，并且基于丰度选择针对每个簇进行分类任务所使用的代表性序列。使用最小置信度阈值0.85和其它默认参数，利用GreenGenes参考数据库，使用RDP朴素贝叶斯分类器进行分类学分类(王(Wang)等人，2007应用与环境微生物学，73(16):5261-7)。
统计分析
对于所有基于组织形态计量的软骨改造分析，包含软骨区域和软骨细胞群研究，进行单因素ANOVA以及测试后图基多重比较。在经由计算加权κ系数确认盲法观察者一致性后，使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试以及测试后杜恩氏多重比较来分析OARSI和滑膜评分研究。使用Graphpad Prism软件进行这些分析和所有数据绘图。当达到p值<0.05时，各组之间的差异被认为是显著的。
陈述
本文描述的组合物、组合、剂型和试剂盒及其方法和用途的优选陈述(特征)和实施例在下文中设定。除非明确地相反指出，否则如此定义的每个陈述和实施例可以与任何其它陈述和/或实施例组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与被指示为优选或有利的任何其它特征或陈述组合。
1.一种用于治疗疾病或病症或提供健康益处的组合物，其中所述组合物包括水解胶原蛋白肽。
2.根据陈述1所述的用途的组合物，其中所述用途用于治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症或为皮肤、关节或骨骼提供健康益处。
3.根据陈述1或2所述的用途的组合物，其中所述用途用于治疗炎症，优选其中所述疾病是骨关节炎或相关疾病或病症。
4.根据陈述3所述的用途的组合物，其中所述炎症与滑膜增生相关。
5.根据陈述1到4中任一项陈述所述的用途的组合物，其中所述水解胶原蛋白肽包括1型水解胶原蛋白肽(hCol1)，和/或其中所述水解胶原蛋白肽包括2型水解胶原蛋白肽(hCol2)。
6.根据陈述1到5中任一项陈述所述的用途的组合物，其中所述hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
7.根据陈述6所述的用途的组合物，其中所述hCol1和/或所述hCol12来源于牛、猪或鱼胶原蛋白。
8.根据陈述1到7中任一项陈述所述的用途的组合物，其适合于口服施用。
9.根据陈述8所述的用途的组合物，其适合于每日施用、每周三次施用、每周两次施用或每周施用。
10.一种用于治疗疾病或病症或提供健康益处的组合，其中所述组合包括根据陈述1到9中任一项陈述所述的组合物并且在相同的组合物中包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物作为水解胶原蛋白，或其中所述微生物存在于不同的组合物中。
11.根据陈述10所述的用途的组合，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的量以治疗骨关节炎或相关疾病或病症的有效量存在。
12.根据陈述10所述的用途的组合，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的量以治疗与滑膜增生相关的炎症的有效量存在。
13.一种组合物，其包括水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
14.根据陈述13所述的组合物，其中所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
15.一种单位剂型，其包括根据陈述1到9、13和14中任一项陈述所述的组合物，其中所述单位剂型是片剂、胶囊、粉末或液体。
16.一种单位剂型，其包括根据陈述10到12中任一项陈述所述的组合，其中所述单位剂型是片剂、胶囊、粉末或液体。
17.根据陈述15或16所述的单位剂型，其包括约0.8克到约15克的水解胶原蛋白肽和/或约107CFU到约1012CFU的来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
18.根据陈述15到17中任一项陈述所述的单位剂型，其中所述hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
19.根据陈述18所述的单位剂型，其中所述hCol1和/或所述hCol12来源于牛、猪或鱼胶原蛋白。
20.一种套装或试剂盒，其包括包括水解胶原蛋白肽的组合物和包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物，或包括包括水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
21.根据陈述20所述的套装或试剂盒，其中所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
22.根据陈述21所述的套装或试剂盒，其中所述hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
23.根据陈述21或22所述的套装或试剂盒，其中所述hCol1和/或所述hCol12来源于猪、牛或鱼胶原蛋白。
24.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物的用途，其用于改善肠道微生物组。
25.根据陈述24所述的用途，其中所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
26.根据陈述25所述的用途，其中所述hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
27.根据陈述25或26所述的用途，其中所述hCol1和/或所述hCol2来源于猪、牛或鱼胶原蛋白。
28.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为益生元的用途。
29.根据陈述28所述的用途，其中所述水解胶原蛋白肽是hCol1和/或hCol2。
30.根据陈述29所述的用途，其中所述hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
31.根据陈述29或30所述的用途，其中所述hCol1和/或所述hCol12来源于猪、牛或鱼胶原蛋白。
32.一种治疗骨关节炎或相关疾病或病症的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。
33.根据陈述32所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
34.根据陈述33或34所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
35.根据陈述32到34中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
36.根据陈述34或35所述的方法，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
37.根据陈述32到36中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
38.根据陈述32到37中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
39.根据陈述32到38中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
40.根据陈述32到39中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
41.一种治疗皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗其皮肤、关节或骨骼中的疾病或病症或相关疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。
42.根据陈述41所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
43.根据陈述41或42所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
44.根据陈述41到43中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
45.根据陈述43或44的方法，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
46.根据陈述41到45中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
47.根据陈述41到46中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
48.根据陈述41到47中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
49.根据陈述41到48中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
50.一种改善关节健康、皮肤健康、关节健康或骨骼健康的方法，其包括：
以单一组合物或不同组合物向有需要的受试者施用改善关节健康、皮肤健康、关节健康或骨骼健康的有效量的水解胶原蛋白肽和来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物。
51.根据陈述50所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
52.根据陈述50或51所述的方法，其中施用每日进行，每周进行三次，每周进行两次或每周进行。
53.根据陈述50到52中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
54.根据陈述50到53中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
55.根据陈述50到54中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
56.根据陈述50到55中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
57.一种向受试者提供益生元材料的方法，其包括向有需要的受试者施用包括有效量的水解胶原蛋白肽的组合物。
58.根据陈述57所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
59.根据陈述57或58所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
60.根据陈述57到59中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
61.根据陈述59或60所述的方法，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
62.根据陈述57到61中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
63.根据陈述57到62中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
64.根据陈述57到63中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
65.根据陈述57到64中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
66.一种提供软骨保护作用的方法，其包括：
向有需要的受试者施用包括有效量的水解胶原蛋白肽的组合物。
67.根据陈述66所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
68.根据陈述66或67所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
69.根据陈述66到68中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
70.根据陈述68或69的方法，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
71.根据陈述66到70中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
72.根据陈述66到71中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
73.根据陈述66到72中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
74.根据陈述66到73中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
75.一种改善肠道微生物组和/或治疗与其相关的疾病或病状的方法，其包括：
向有需要的受试者施用改善肠道微生物组和/或治疗与其相关的疾病或病症的有效量的包括水解胶原蛋白肽的组合物。
76.根据陈述75所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽包括hCol1和/或hCol2。
77.根据陈述75或76所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗其骨关节炎或其相关疾病或病症的有效量的包括来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的微生物的组合物。
78.根据陈述75到77中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
79.根据陈述77或78的方法，其中来自无壁菌门和/或厌氧原体目和/或双歧杆菌属的所述微生物每日施用，每周施用三次，每周施用两次或每周施用。
80.根据陈述77到79中任一项陈述所述的方法，其中经由口服施用进行施用。
81.根据陈述77到80中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约300Da到约7500Da。
82.根据陈述77到81中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约1000Da到约5000Da。
83.根据陈述77到82中任一项陈述所述的方法，其中所述水解胶原蛋白肽的特征在于平均分子量为约2000Da到约3000Da。
在本文中参考附图在优选实施例中描述了本申请人的公开，其中相似的数字表示相同或类似的元件。整个本说明书中对“一个实施例(one embodiment/an embodiment)”或类似语言的引用是指结合所述实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书中出现的短语“在一个实施例中(in one embodiment/inan embodiment)”和类似语言可以但并非必须全部是指相同的实施例。
本申请人的公开的所描述的特征、结构或特性可以在一或多个实施例中以任何合适的方式组合。在本文的描述中，叙述了许多具体细节以提供对本发明的实施例的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，本申请人的组合物和/或方法可以在没有一或多个具体细节的情况下实践，或利用其它方法、组件、材料等实践。在其它情况下，并未详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免模糊本公开的各方面。
在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包含复数形式，除非上下文另有明确说明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的特定顺序之外，本文所述的方法可以以逻辑上可能的任何顺序进行。
通过引用并入
在本公开中已经对其它文件(例如，专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网页内容)进行了参考和引用。所有此些文件都通过引用整体并入本文用于所有目的。据称通过引用并入本文但与本文明确阐述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的任何材料或其部分仅以所并入的材料和本公开材料之间不发生冲突的程度并入。在有冲突的情况下，冲突应以支持本公开作为优选公开的方式解决。
等同物
本文公开的代表性实例旨在帮助说明本发明，并且不旨在也不应被解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改及其许多另外的实施例对于本领域技术人员来说将通过本文件的全部内容变得显而易见，包含以下实例和对本文引用的科学和专利文献的参考。以下实例含有可以适于本发明在其各个实施例及其等同物中实践的重要的附加信息、例证和指导。
序列表
<110> 罗赛洛公司
罗契斯特大学
<120> 水解胶原蛋白肽和共生微生物的组合物及其方法
<130> ROUS-003-PCT
<150> US 62/471,582
<151> 2017-03-15
<150> US 62/554,555
<151> 2017-09-05
<160> 12
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tnf正向引物
<400> 1
ctcttctgtc tactgaactt cggg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> Tnf反向引物
<400> 2
gagaagatga tctgagtgtg aggg 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> Il1-β正向引物
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Il1-β反向引物
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Prg4正向引物
<400> 7
agtgctgtcc tgatttcaag ag 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Prg4反向引物
<400> 8
ggtgatttgg gtgagcgttt ggta 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<223> β-肌动蛋白正向引物
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白反向引物
<400> 10
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<223> 319F引物
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<213> 人工序列
<220>
<223> 806R引物
<400> 12
tgaggatgcc ctccgtcgtc 20
Claims (25)
1.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为益生元的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其用于调节受试者中的肠道微生物组。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其用于增加肠道中的微生物多样性。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的用途，其中以所述组合物的干质量计，所述组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的用途，其中所述水解胶原蛋白肽是1型水解胶原蛋白肽hCol1和/或2型水解胶原蛋白肽hCol2。
6.根据权利要求5所述的用途，其中hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述hCol1来源于猪、牛或鱼，和/或所述hCol12来源于猪、牛或鱼。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的用途，其中所述组合物被配制在食品或饲料产品或用于口服施用的食品或饲料成分中。
9.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的用途，其中所述组合物被配制成用于口服施用的膳食补充剂。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的用途，其中每天向受试者施用所述组合物，持续至少7天，优选持续至少14天。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的用途，其中以0.5g和15g之间的日剂量向受试者施用所述组合物。
12.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗受试者中的关节炎症。
13.根据权利要求12所述使用的组合物，其中所述炎症是滑膜炎症。
14.根据权利要求12或13所述使用的组合物，其中以所述组合物的干质量计，所述组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。
15.根据权利要求12到14中任一权利要求所述使用的组合物，其中所述水解胶原蛋白肽是1型水解胶原蛋白肽hCol1和/或2型水解胶原蛋白肽hCol2。
16.根据权利要求15所述的用途的组合物，其中hCol1的平均分子量在约300Da和约7500Da之间，和/或其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
17.根据权利要求15或16所述使用的组合物，其中所述hCol1来源于猪、牛或鱼，和/或所述hCol12来源于猪、牛或鱼。
18.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物，其用于预防或治疗受试者中的骨关节炎，其中所述水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽(hCol2)，其来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
19.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述骨关节炎是创伤后骨关节炎或肥胖诱发的骨关节炎。
20.根据权利要求18或19所述使用的组合物，其中以所述组合物的干质量计，所述组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的水解胶原蛋白肽。
21.根据权利要求18到20中任一权利要求所述使用的组合物，其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
22.一种包括水解胶原蛋白肽的组合物作为软骨保护剂的用途，其中所述水解胶原蛋白肽是2型水解胶原蛋白肽hCol2。
23.根据权利要求22所述的用途，其中以所述组合物的干质量计，所述组合物包括至少90重量％，优选至少95重量％的hCol2。
24.根据权利要求22或23所述的用途，其中所述hCol2的平均分子量在约300Da和约7500Da之间。
25.根据权利要求22到24中任一权利要求所述的用途，其中所述hCol12来源于来自软骨的猪、牛或鱼胶原蛋白。
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