JP2016521289A

JP2016521289A - 関節のケア用組成物

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Publication number: JP2016521289A
Application number: JP2016513350A
Authority: JP
Inventors: スリジェ，サミュエル; コンブレン，ファニー; アンロタン，イヴ
Original assignee: Mars Inc
Current assignee: Mars Inc
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2016-07-21
Also published as: CA2910546C; EP2996704B1; EP2996704A1; US10835566B2; AU2014267299A1; AU2014267299B2; CA2910546A1; RU2657434C2; JP2019163264A; CN105431159A; RU2015153205A; US20160263176A1; HK1222800A1; WO2014184246A1; PL2996704T3; CN105431159B; ES2859873T3

Abstract

本発明は、骨関節炎の予防又は治療に使用するための、緑茶ポリフェノールと共に、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含む組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物において骨関節炎を予防又は治療する方法に関し、この方法は、緑茶ポリフェノールと共に、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含む組成物を、上記哺乳動物に投与するステップを含む。

Description

軟骨の劣化は、関節の炎症を引き起こし得る反復運動、関節の不安定性等のいくつかの理由によって起こり得る。関節炎を患っているヒトのうちの大きな割合が関節リウマチを患っているが、コンパニオンアニマルに発生する関節炎の大部分は骨関節炎である。

現在、骨関節炎の治療法は存在せず、薬理学的治療は症状の緩和に限定されている。最も一般的なものは非ステロイド系抗炎症薬であるが、これらは副作用を伴う。より安全な治療が望まれる。

本発明の第１の態様は、骨関節炎の予防又は治療に使用される、緑茶ポリフェノールと共に、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含有している組成物に関する。骨関節炎の治療は、骨関節炎の症状を改善させることを含む。

本発明は全ての態様について、ヒトを含む任意の哺乳動物に関する。特に本発明は、イヌ、ネコ若しくはウマ科動物（例えばウマ）等のコンパニオンアニマル、又は骨関節炎に罹患しているか若しくは骨関節炎に罹患しやすい任意の他の動物に関する。

本発明の組成物はクルクミノイドを含む。クルクミノイドはクルクミン又はクルクミンの誘導体である。クルクミノイドの化学構造はそれらの官能基において異なる。

クルクミノイドには、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン及び／又はテトラヒドロクルクミンが含まれる。

クルクミノイドは、特に、インドの香辛料であるターメリックの中に存在する天然のポリフェノールである。ターメリックは、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａｌｏｎｇａ）という植物の根から得られる。クルクミノイドはまた、クルクマ属（Ｃｕｒｃｕｍａｇｅｎｕｓ）のショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）植物の他の種の根の中にも発見されている。クルクミノイドには、明らかに土臭く、苦い、コショウのような風味と、マスタードのような香りがある。

ターメリックは特に、６０〜８０％のクルクミン、１５〜３０％のデメトキシクルクミン、及び２〜６％のビスデメトキシクルクミンを含有している。

本発明の組成物中のクルクミノイドは、粉末又は脂質抽出物を含む任意の形態であり得る。

いくつかの実施形態では、クルクミノイドは、リン脂質及び／若しくはセルロース、デンプン、又はそれらの誘導体と混合されて複合体を形成し得る。これは、安定性を補助し得る、及び／又はクルクミノイドの溶解度及び生体利用性を更に高めるために役立ち得る。

クルクミノイドは精油、ピペリン又はブロメラインと混合され得る。クルクミノイドは、ホスファチジルコリン、例えばレシチンと混合され得る。

好ましくは、本発明のクルクミノイドは、最も活性が高いクルクミノイドであるクルクミンである。本発明によるクルクミンには、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン及び／又はテトラヒドロクルクミンが含まれる。

本発明の組成物は、クルクミノイド及び緑茶ポリフェノールを含む。

茶（チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ））、特に緑茶は、ポリフェノール（特にカテキン）を含むフラボノイドの含有量が高い。茶のカテキンとしては、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、没食子酸エピカテキン（ＥＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、カテキン及びガロカテキン（ＧＣ）が挙げられる。

好ましくは、緑茶ポリフェノールはカテキンを含む。好ましくは、カテキンはＥＧＣＧを含む。緑茶抽出物は通常、少なくとも約２５％のポリフェノール、約１２．５％のカテキン、及び約９．３％のＥＧＣＧを含有する。

没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）はエピガロカテキンと没食子酸とのエステルである。ＥＧＣＧは茶の中に最も豊富に存在するカテキンであり、強力な抗酸化剤である。ＥＧＣＧは特に緑茶の中に見られる。ＥＧＣＧは緑茶の主要なポリフェノールであり、抗酸化活性、抗腫瘍活性及び抗変異原活性を示す。

本発明の組成物は、クルクミン、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせを含む。

グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、加水分解コラーゲンの総アミノ酸含有量の５０％を占める。好ましくは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンである。加水分解コラーゲンのアミノ酸組成は以下の表に示すとおりである。

加水分解コラーゲンは、ウシ、魚類、ウマ、ブタ及びウサギ等の動物の骨、皮膚及び結合組織の中に見られるコラーゲン組織の酵素加水分解により得られる。加水分解コラーゲンは十分に消化され、軟骨の中に優先的に蓄積される。

好ましい組成物は、クルクミノイド、緑茶ポリフェノール、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせを含む。好ましくはこの組成物は、クルクミン、緑茶ポリフェノール及び加水分解コラーゲンを含む。

本発明は好ましくは食料品（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ）である。この食料品は、乾燥した、セミモイストタイプの（ｓｅｍｉｍｏｉｓｔ）、又はウェットタイプの（ｗｅｔ）食品製品のような任意の食料品であり得る。特にこの食料品はペットフード製品であり得る。

ペット用食料品は好ましくは、市販されているペットフード製品である。このような製品は好ましくは、ペット動物、特に飼いネコ又は飼いイヌへの給餌用の製品として販売されている。

典型的なペット用食料品は、約２０〜３０％の粗タンパク質及び約１０〜２０％の脂質を含有し、残りは、食物繊維及び灰分を含む炭水化物である。典型的なウェットタイプの又はモイストタイプの製品は、（乾燥重量基準で）約４０％の脂質、５０％のタンパク質を含有し、残りは繊維及び灰分である。本発明の食料品は、乾燥製品（およそ５〜およそ１５％の水分を含む）、セミモイストタイプの製品（およそ１５〜およそ７０％の水分を含む）、又はウェットタイプの製品（およそ７０〜およそ９０％の水分を含む）であり得る。

食料品の残りの構成要素は本発明には不可欠ではなく、典型的な標準的製品が含まれ得る。本発明による食料品の組み合わせられた成分は、特定の対象動物について推奨されるビタミン及びミネラルの全てを提供できる（完全なバランスのとれた食品）。

本発明による食料品は、食餌療法（ｄｉｅｔ）においてペットが摂取する任意の製品を含む。従って本発明は、液体を含む標準的な食品製品、並びにペット用のスナック食品（ｆｏｏｄｓｎａｃｋｓ）（例えばスナックバー（ｓｎａｃｋｂａｒｓ）、ペット用チューインガム、クランチタイプの菓子（ｃｒｕｎｃｈｙｔｒｅａｔ）、シリアルバー、スナック菓子、ビスケット及び甘味製品）、並びにサプリメントを包含する。

食料品は栄養補助食品として提供できる。栄養補助食品は、追加の食料品と共に又は追加の食料品を伴わずに投与できる粉末、ソース、トッピング、ビスケット、キッブル、ハンディタイプのもの（ｐｏｃｋｅｔ）又はタブレットであり得る。栄養補助食品が追加の食品と共に投与される場合は、栄養補助食品は連続して、同時に、又は別個に投与され得る。栄養補助食品は、食料品と混合してよく、食料品に振りかけてよく、又は食料品と別個に供給してよい。あるいは栄養補助食品は、水又は牛乳等の、飲用に提供される液体に添加できる。

食料品は好ましくは調理済みの製品である。これには、食肉又は動物由来の材料（例えば牛肉、鶏肉、七面鳥の肉、子羊の肉、魚、血漿、髄入りの骨等、又はこれらの１つ以上）を組み入れてよい。あるいはこの製品は、タンパク源を提供するために食肉を含まないもの（好ましくは大豆、トウモロコシグルテン又は大豆製品等の食肉代用品を含む）であり得る。食料品は、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテン等の更なるタンパク源を含有し得る。食料品はまた、１種以上の穀物（例えば小麦、トウモロコシ、米、オート麦、大麦等）等のデンプン源を含有してよく、又はデンプンを含まなくてもよい。

本発明の食料品は好ましくは、およそ５％〜およそ１５％の水分を含有している乾燥した製品として製造される。好ましい乾燥食品は、より好ましくは、小さいビスケット様のキッブルとして提供される。

以下の表は本発明による組成物の量と、本発明に従ってイヌに摂取させるイヌ組成物の量とを詳細に示す。

本発明の第１の態様の組成物は、食品「そのもの（ａｓｉｓ）」の重量百分率で約０．００５〜１．１重量％の範囲の量のクルクミノイドとして、クルクミノイドを含み得る。クルクミノイドの量は、０．００５〜１．１％（そのもの）の任意の量とすることができる。クルクミノイドの量は、０．１〜１％（そのもの）の任意の量とすることができる。クルクミノイドの量は、０．１〜０．６％（そのもの）の任意の量とすることができる。クルクミノイドの量は、０．３〜０．６％（そのもの）の任意の量とすることができる。

本発明の第１の態様の組成物は、食品「そのもの」の重量百分率で約０．００５〜０．１５重量％の範囲の量のクルクミノイドとして、クルクミノイドを含み得る。クルクミノイドの量は、０．００５〜０．１５％（そのもの）の任意の量とすることができる（７〜９９ｍｇ／４００ｋｃａｌ）。

治療食（ｄｉｅｔ）が乾燥したものである場合は、「そのもの」の重量は「乾燥物質の重量」と同じである。

好ましくは、組成物中のクルクミノイドの量は、約０．０１〜０．０７％（そのもの）（１４〜４６ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲である。最も好ましくは、クルクミノイドの量は０．０３５％（そのもの）（３６ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

いくつかの実施形態では、組成物中のクルクミノイドは、食品「そのもの」の重量百分率で約０．００５〜０．１５重量％の範囲の量のクルクミンとしてのクルクミンである。クルクミンの量は、０．００５〜０．１５％（そのもの）（７〜９９ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の任意の量とすることができる。好ましくは、クルクミンの量は、約０．０１〜０．０５％（そのもの）（１４〜３２ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲である。最も好ましくは、クルクミンの量は０．０２６％（そのもの）（２７ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

本発明の第１の態様の組成物は、食品「そのもの」の重量百分率で約０．０１〜１．１重量％の範囲の量の緑茶ポリフェノールとして、緑茶ポリフェノールを含み得る。緑茶ポリフェノールの量は、０．０１〜１．１％（そのもの）の任意の量とすることができる。緑茶ポリフェノールの量は、０．１〜１％（そのもの）の任意の量とすることができる。緑茶ポリフェノールの量は、０．１〜０．６％（そのもの）の任意の量とすることができる。緑茶ポリフェノールの量は０．３〜０．６％（そのもの）の任意の量とすることができる。

本発明の第１の態様の組成物は、食品「そのもの」の重量百分率で約０．０１〜０．３重量％の範囲の量の緑茶ポリフェノールとして、緑茶ポリフェノールを含み得る。緑茶ポリフェノールの量は、０．０１〜０．３％（そのもの）（１４〜１９７ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の任意の量とすることができる。好ましくは、緑茶ポリフェノールの量は、約０．０３〜０．１７％（そのもの）（４３〜１１３ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲である。最も好ましくは、緑茶ポリフェノールの量は０．０８５％（そのもの）（８７ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

いくつかの実施形態では、緑茶ポリフェノールは、食品「そのもの」の重量百分率で約０．００５〜０．２重量％（７〜１３１ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲の量のＥＧＣＧとしてのＥＧＣＧである。ＥＧＣＧの量は、０．０１〜０．０６％（そのもの）（１４〜３９ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の任意の量とすることができる。最も好ましくは、ＥＧＣＧの量は０．０３２％（そのもの）（３３ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

本発明の第１の態様の組成物は、食品「そのもの」の重量百分率で約０．５〜１０重量％の範囲の量の組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンで、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせを含み得る。組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの量は、０．５〜１０％（そのもの）（７２０〜６５９１ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の任意の量とすることができる。好ましくは、組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの量は約１．２〜５％（そのもの）（１７３６〜３２９５ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲である。最も好ましくは、組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの量は２．７％（そのもの）（２７８０ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

いくつかの実施形態では、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、食品「そのもの」の重量百分率で約０．５〜５重量％の範囲の量の組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンである加水分解コラーゲンである。加水分解コラーゲンの量は、０．５〜５％（そのもの）（７２０〜３２９５ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の任意の量とすることができる。好ましくは、加水分解コラーゲンの量は約０．７〜３．２％（そのもの）（１０１６〜２１３８ｍｇ／４００ｋｃａｌ）の範囲である。最も好ましくは、加水分解コラーゲンの量は１．７％（そのもの）（１７５０ｍｇ／４００ｋｃａｌ）である。

他の実施形態では、組成物は、約８７ｍｇ／４００ｋｃａｌの緑茶ポリフェノールと共に、並びに約２７５７ｍｇ／４００ｋｃａｌの組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンと共に、約２７ｍｇ／４００ｋｃａｌの量のクルクミン（３５ｍｇ／４００ｋｃａｌのクルクミノイド）を含み得る。ここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンである。好ましくはここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンであり、約１７４７ｍｇ／４００ｋｃａｌの量で組成物中に存在する。

他の実施形態では、組成物は、約１０６ｍｇ／４００ｋｃａｌの緑茶ポリフェノールと共に、並びに約３２９５ｍｇ／４００ｋｃａｌの組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンと共に、約３３ｍｇ／４００ｋｃａｌの量のクルクミン（４３ｍｇ／４００ｋｃａｌのクルクミノイド）を含み得る。ここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンである。好ましくはここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンであり、約２１０８ｍｇ／４００ｋｃａｌの量で組成物中に存在する。

他の実施形態では、組成物は、約５１ｍｇ／４００ｋｃａｌの緑茶ポリフェノールと共に、並びに約１７３６ｍｇ／４００ｋｃａｌの組み合わせたグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンと共に、約１５ｍｇ／４００ｋｃａｌの量のクルクミン（２２ｍｇ／４００ｋｃａｌのクルクミノイド）を含み得る。ここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンである。好ましくはここでは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンであり、約１０１６ｍｇ／４００ｋｃａｌの量で組成物中に存在する。

これらの値は、哺乳動物、特にコンパニオンアニマルへの給餌用の組成物に適用される。

本発明の第２の態様は哺乳動物において骨関節炎を予防又は治療する方法に関する。

骨関節炎（ＯＡ）は、哺乳動物の関節に悪影響を及ぼす変性性の炎症性の症状である。骨関節炎（ＯＡ）はまた、変性性関節炎又は変性性関節疾患としても知られている。骨関節炎は異常症の１つのグループであり、これには、関節軟骨及び軟骨下骨を含む関節の変形が含まれる。

骨関節炎は、異化作用と同化作用の不均衡の結果であり、異化作用が増加し、同化作用が減少して、軟骨細胞の炎症が起こる。軟骨細胞は健康な軟骨の中に見られる唯一の細胞である。軟骨細胞は、主にコラーゲンとプロテオグリカンからなる軟骨基質を産生し、維持する。本発明の組成物は、とりわけ、炎症の軽減、異化作用の減少、及び同化作用の増加を提供することが、インビトロでの炎症によって誘導される軟骨細胞及びインビトロでの健康な軟骨細胞において明らかにされている。従って、本発明の組成物は動物の骨関節炎を予防及び／又は治療する。

本発明は、全ての態様について、ヒトを含む任意の哺乳動物に関する。具体的には、本発明は、イヌ、ネコ若しくはウマ科動物（例えばウマ）等のコンパニオンアニマル、又は骨関節炎に罹患しているか若しくは骨関節炎に罹患しやすい任意の他の動物に関する。

特に、ペット用食料品及びコンパニオンアニマルの健康の分野では、コンパニオンアニマルの健康をサポートするために適している補助食品を含む食料品を提供することが所望される。特に、既に健康であるコンパニオンアニマルの健康を促進する又は維持するために適している治療食を提供することが所望される。

特に、本発明の第２の態様は、特にコンパニオンアニマルにおいて骨関節炎の症状を改善させることを含む、哺乳動物において骨関節炎を予防及び治療するための方法を提供する。上記方法は、緑茶ポリフェノールと共に、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミンを含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。動物には、そのような投与が必要である場合がある。相当の数のイヌがその生涯において骨関節炎に罹患するため、全てのイヌに予防が必要であると考えることができる。

特定の実施形態では、上記方法は、クルクミン、緑茶ポリフェノール、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせを含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。最も好ましくは、グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは加水分解コラーゲンである。

更に、上記方法は好ましくは、骨関節炎に罹患しており骨関節炎の症状を改善させる必要があるか、又は骨関節炎の更なる症状を予防する必要があるか、又は骨関節炎の治療が必要である動物、特にコンパニオンアニマルに適用される。これは例えば、子犬等の幼齢のペット動物、又は老齢のコンパニオンアニマルであり得る。組成物が食料品である場合は、食料品は、コンパニオンアニマルの通常の食餌療法のレジュメ（ｄｉｅｔａｒｙｒｅｇｉｍｅ）に従った食餌療法のレジュメで投与され得る。食料品は、必要とされる予防又は治療のレベルに応じて、コンパニオンアニマルの治療食を１００％又はそれより小さい割合で含み得る。食料品は組成物を簡単に投与できるようにし、それによりコンパニオンアニマルの食物に補充する必要を省くことができる。加えて、食料品は、動物の飼い主が投与することができ、これにより絶えず獣医学的に監視することを回避できる。食料品は、任意の販路でペットフード製品として入手できるか、又は獣医から入手できる。食料品は、本発明の第１の態様に従って上述したものであり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「投与」は、給餌又は任意の他の経口投与方法も含む。他の投与手段は、錠剤、カプセル剤、注射液、坐剤、又は任意の他の適切な手段を含み得る。

本発明の第２の態様の好ましい特徴は、必要な修正を施した上で、第１の態様の好ましい特徴に当てはまる。

本記載は、本発明の第１の態様の組成物を調製するための方法を含む。

食料品は、「ＡＢａｌａｎｃｅｄＤｉｅｔ」（「ＷａｌｔｈａｍＢｏｏｋｏｆＤｏｇａｎｄＣａｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎ」，Ｅｄ．ＡＴＢＥｄｎｅｙ，ＣｈａｐｔｅｒｂｙＡ．Ｒａｉｎｂｉｒｄ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ、５７頁〜７４頁）に記載されているもののような、当該分野で公知の任意の方法に従って生成され得る。

例えば、本明細書中で定義する食料品の製造のためのプロセスは、成分を、緑茶ポリフェノールと共に、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含む組成物と一緒に混合するステップ、並びに食料品、特にペット用食料品を形成するステップを含む。加熱／調理は、混合前、混合中又は混合後に、任意の１種以上の成分に対して行うことができる。

組成物は、食料品に吹付けられ得るか、食料品と混合され得るか、又はマトリックス中の食料品の中に取り込まれ得る。組成物の封入方法は当該分野で公知である。

本発明の重要性は、緑茶ポリフェノール、又はグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせ（随意に、加水分解コラーゲンとして）のいずれかを伴うクルクミノイドの有用な特性である。特に、累積効果を上回る効果が見られる。

３種の成分の組み合わせ（クルクミノイド、緑茶ポリフェノール、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン（任意に加水分解コラーゲンとして））を用いた場合には更なる利点が見られる。

本発明の組成物の化合物の組み合わせは、炎症の軽減、異化作用の減少、及び同化作用の増加の１つ以上に関して相乗効果を提供し得る。

本発明は更に、以下の実施例を参照してここに記載される。以下の実施例は、本発明を説明する目的のためだけに提供され、本発明を限定するとは解釈されない。

化合物の個別のスクリーニング
炎症及び異化プロセスが関節軟骨細胞の作用を模倣するようにインターロイキン‐１βによって誘導されているウシの軟骨細胞の初代培養物に対する、いくつかの化合物の作用を評価するために、実験を行った。

以下の表は、軟骨細胞の３つの代謝経路の化合物の作用を示すための実験を通じて測定した生体マーカーを詳細に示す。

単層中のウシ軟骨細胞の初代培養物
正常なウシ関節軟骨を、１歳〜２歳齢の去勢ウシの中手指節関節から死後すぐに得た。関節軟骨の全長を摘出し、Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）ピペラジン‐Ｎ’‐（２‐エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）１０ｍＭ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（全てベルギーのヴェルヴィエ所在のロンザ社による）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（フェノールレッド及び４．５ｇ／Ｌのグルコースを含む）に浸漬した。３回の洗浄後、軟骨細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼＩＶＳ型（ベルギーのボルネム所在のシグマアルドリッチ社）で３７℃で３０分間、１ｍｇ／ｍｌのプロナーゼＥ（ベルギーのルーヴェン所在のメルク社）で３７℃で１時間、そして０．５ｍｇ／ｍｌのクロストリジウムコラゲナーゼＩＡ（ベルギーのボルネム所在のシグマアルドリッチ社）で３７℃で１６時間〜２０時間の連続する酵素消化により、軟骨から遊離した。その後、酵素により単離した細胞をナイロンメッシュ（７０μｍ）を通して濾過し、３回洗浄し、計数し、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン（全てベルギーのヴェルヴィエ所在のロンザ社による）及び２０μｇ／ｍｌのプロリン（ベルギーのボルネム所在のシグマアルドリッチ社）を補充したＤＭＥＭ（フェノールレッド及び４．５ｇ／Ｌのグルコースを含む）に、０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度になるように充填した。２ｍｌの上述の培養培地／ウェルを添加することにより、細胞を０．５×１０^６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、単層中で５日間培養した。その後、軟骨細胞を単層中で、１％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン及び２０μｇ／ｍｌのプロリンを補充したＤＭＥＭ（フェノールレッドを含まない、１ｇ／Ｌのグルコースのみを含有している）（ベルギーのヴェルヴィエ所在のロンザ社）中でコンフルエンスまで（約２日間）培養した。軟骨細胞の表現型の安定性を確保するために、初代培養物だけを使用した。

細胞がコンフルエンスに到達したら、培養培地を取り除き、いくつかの機能性食品（それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ）を含有している、組換えブタＩＬ‐１β（１０^‐１１Ｍ）（英国のアビングドン所在のＲ＆Ｄシステムズ社）の非存在下又は存在下の新鮮な培養培地（フェノールレッドを含まない、１％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン及び２０μｇ／ｍｌのプロリンを補充した１ｇ／Ｌのグルコースのみを含有しているＤＭＥＭ）で置換した。

化合物（最初は個別に、その後組み合わせて）の抗炎症力を、軟骨細胞の生存性と、ＰＧＥ２及びＮＯの産生を測定することにより試験した。

化合物を、炎症前（予防効果の測定）、炎症と同時に（治療効果の測定）のいずれかで培養培地に添加した。

スクリーニングした化合物のリスト：
１）魚油：１８％のＥＰＡ＋１０％のＤＨＡ（ＤＳＭ社）
２）ＥＰＡ９９％（シグマ社）
３）ＤＨＡ９９％（シグマ社）
４）ＡｌｏｅＶｅｒａ（Ｎａｔｕｒｅｘ社）
５）イラクサ（Ｎｅｔｔｌｅ）の葉の抽出物（Ｎａｔｕｒｅｘ社）
６）Ｒｅｓｖｉｄａ：９９％のレスベラトロール（ＤＳＭ社）
７）緑茶抽出物：２５％のポリフェノール（そのうちの１２．５％はカテキンであり、８％はＥＧＣＧである）（Ｎａｔｕｒｅｘ社）
８）松樹皮抽出物：Ｐｙｃｎｏｇｅｎｏｌ：６５〜７５％のプロシアニジン（Ｂｉｏｌａｎｄｅｓ社）
９）ビタミンＤ３を含むビタミンのプレミックス
１０）ＧＬＭ（ＡｒｏｍａＮＺ）
１１）コラーゲン加水分解物（ＦｏｒｔｉｇｅｌｄｅＧｅｌｉｔａ［３．３ｋＤａ］：加水分解された豚肉コラーゲン）
１２）ＡＳＵ（Ｓｏｃｈｉｍ社）
１３）ウコン粉末：８５％のクルクミノイド（Ｎａｔｕｒｅｘ社）
結果は、使用すべき３種の化合物が、様々なパラメータに対して有意な効果を示したウコン抽出物、加水分解コラーゲン及び緑茶抽出物であることを示した。その後、これらの３種の化合物を反応‐用量について試験した。

用量反応
実施例１の方法論に従った。分子量：０．５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ及び６２．５μｇ／ｍｌに応じて、１０^‐５Ｍに相当する濃度の範囲を包含するために、４種類の異なる濃度を試験した。

結果は、毒性作用を生じることなく最良の作用を生じた濃度が、各化合物について１２．５μｇ／ｍｌであったことを示した。これが、互いに組み合わせた化合物の試験に１２．５μｇ／ｍｌの濃度を使用した理由である。

化合物の特定の組み合わせ及び相乗効果の試験
実施例１の方法に従った。

化合物の補充
細胞がコンフルエンスに到達したら、培養培地を取り除き、いくつかの化合物（それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ）を含有している、組換えブタＩＬ‐１β（１０^‐１１Ｍ）（英国のアビングドン所在のＲ＆Ｄシステムズ社）の非存在下又は存在下の新鮮な培養培地（フェノールレッドを含まない、１％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン及び２０μｇ／ｍｌのプロリンを補充した１ｇ／Ｌのグルコースのみを含有しているＤＭＥＭ）で置換した。

３種の化合物、即ちウコン抽出物（フランスのアヴィニョン所在のＮａｔｕｒｅｘ社）、加水分解コラーゲン（ドイツのエーバーバッハ所在のＧｅｌｉｔａ社）及び緑茶抽出物（フランスのアヴィニョン所在のＮａｔｕｒｅｘ社）を試験した。ウコン抽出物を、テトラヒドロフラン（ベルギーのルーヴェン所在のメルク社）中の１２．５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製し、その後、細胞培養培地中に１０００倍に更に希釈した。加水分解コラーゲン及び緑茶抽出物を、１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で水の中に溶解し、滅菌メッシュ（０．２０μｍ）を通して濾過し、その後、細胞培養培地中に１０００倍に更に希釈した。化合物を、１２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で単独で、又は組み合わせて（１２．５μｇ／ｍｌのウコン抽出物＋１２．５μｇ／ｍｌの加水分解コラーゲン；１２．５μｇ／ｍｌのウコン抽出物＋１２．５μｇ／ｍｌの緑茶抽出物；１２．５μｇ／ｍｌのウコン抽出物＋１２．５μｇ／ｍｌの加水分解コラーゲン＋１２．５μｇ／ｍｌの緑茶抽出物）、組換えブタＩＬ‐１β（１０^‐１１Ｍ）の非存在下又は存在下で、試験した。化合物の作用を対照（ＤＭＥＭのみ、又はＤＭＥＭ＋ＩＬ‐１β）と比較した。

培養の停止
これらの条件下での２４時間の後、各条件の３個のウェルの馴化培地を回収し、‐２０℃で保存した。これらの対応するウェルの細胞を削り取り、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（オランダのフェンロ所在のＱｉａｇｅｎ社）を使用してＲＮＡ抽出を行い、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行し、その後、遺伝子発現を分析するためにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ベルギーのフィルフォルデ所在のロッシュ社）を使用して定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実行した。

これらの条件での４８時間の後、残っているウェル（それぞれの条件について３個）の馴化培地を回収し（乳酸脱水素酵素放出アッセイ）、分析まで‐２０℃で保存した（亜硝酸塩アッセイ及びプロスタグランジンＥ２アッセイ）。細胞を削り取り、４℃で２０秒間の超音波での解離により５００μｌのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液中にホモジナイズして、ＤＮＡ含有量を測定した。

乳酸脱水素酵素放出アッセイ
細胞生存性を、培養上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を定量することによって概算した。上清又は標準液（ウサギの筋肉由来のＬＤＨ）の希釈物の１００μｌの試料を、８００ｍＭの乳酸塩を含有している５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．１％のウシ血清アルブミン）と混合した。その後、５０μｌの比色試薬、１．６ｍｇ／ｍｌのヨードニトロテトラゾリウムクロリド（ベルギーのボルネム所在のシグマアルドリッチ社）、４ｍｇ／ｍｌのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ベルギーのブリュッセル所在のロッシュ・ダイアグノスティック社）、及び０．４ｍｇ／ｍｌのフェナジンメトスルファート（ベルギーのボルネム所在のシグマアルドリッチ社）を添加し、４９２ｎｍでの吸光度を、室温で１０分間のインキュベーション後に読み取った。

ＤＮＡアッセイ
軟骨細胞を、４℃で１５秒間の超音波での解離によって５００μｌのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液中にホモジナイズした。ＤＮＡ含有量を、Ｈｏｅｃｈｓｔの蛍光定量法を使用して細胞抽出物中で測定した。

亜硝酸塩アッセイ
一酸化窒素（ＮＯ）の産生を、Ｇｒｉｅｓｓ反応に基づく分光光度測定法を使用して培養上清中で、その誘導生成物である亜硝酸塩を定量化することによって決定した。簡単に説明すると、１００μｌの上清又は亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_２）標準希釈物を、１００μｌのＧｒｉｅｓｓ試薬（０．５％のスルファニルアミド、０．０５％のナフチルエチレンジアミン二塩酸塩、２．５％のＨ_３ＰＯ_４）と混合した。吸光度を５４０ｎｍで測定した。ＮＯの産生を、１マイクログラムのＤＮＡあたりで表した。

ＰＧＥ２アッセイ
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を、ＤｅｔｅｃｔＸＰＧＥ２ＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ（アメリカのミシガン州所在のＡｒｂｏｒＡｓｓａｙｓ社）を使用して培養上清中で測定した。簡単に説明すると、１００μｌの上清又はＰＧＥ２標準希釈物を、マウスＩｇＧを捕捉するための抗体をコーティングした透明なマイクロタイタープレートに注出した。ＰＧＥ２‐ペルオキシダーゼ結合体（２５μｌ）を、ウェル中の標準物及び上清に添加する。結合反応は、ＰＧＥ２に対するモノクローナル抗体２５μｌの添加により開始される。４℃で一晩のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、１００μｌの基質を添加する。基質は、結合したＰＧＥ２‐ペルオキシダーゼ結合体と反応する。短時間のインキュベーションの後、反応を停止し、発生した色の純度を４５０ｎｍの波長で検出する。ＰＧＥ２の産生を１μｇのＤＮＡあたりで表した。

定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）
それぞれの条件の３つのウェルに由来する細胞由来のＲＮＡをＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（オランダのフェンロ所在のＱｉａｇｅｎ社）を使用して単離した。その後、ＲＮＡを逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）（オランダのルースデン、ウェストバーグ所在）を使用して行った。ＰＣＲ鋳型の供給源は、１本鎖ｃＤＮＡ又は精製されたＤＮＡ標準物のいずれかであった。所望するｃＤＮＡを増幅するために使用したプライマー配列は以下のとおりであった：ウシＨＰＲＴフォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＧ‐３’及び５’‐ＡＧＴＣＴＴＴＡＧＧＣＴＣＧＴＡＧＴＧＣ‐３’；ウシインターロイキン（ＩＬ）‐６フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣ‐３’及び５’‐ＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣ‐３’；ウシシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）２フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＧＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣ‐３’及び５’‐ＡＣＧＴＡＧＴＣＴＴＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＴ‐３’；ウシ誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＡＧＡ‐３’及び５’‐ＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧＧＡ‐３’；ウシアグリカン（ＡＧＧ）フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＴＧＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＧＡＧＣ‐３’及び５’‐ＧＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴ‐３’；ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２）フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣ‐３’及び５’‐ＧＧＧＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＡＴ‐３’；ウシメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）‐３フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＴＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＡＡＴ‐３’及び５’‐ＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ‐３’；トロンボスポンジンモチーフを有するウシＡディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）４フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＣＴＴＴＣＡＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ‐３’及び５’‐ＣＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡ‐３’；ウシＡＤＡＭＴＳ５フォワードプライマー及びリバースプライマー：５’‐ＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＡ‐３’及び５’‐ＣＡＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＡ‐３’。

増幅は、分光蛍光分析用サーマルサイクラ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０、ベルギーのフィルフォルデ所在のロッシュ・ダイアグノスティック社）を用いて行った。ｍＲＮＡレベルを標準化するために、内部対照としてＨＰＲＴ（ハウスキーピング遺伝子）を増幅した。遺伝子発現を、ＩＬ‐６、ＣＯＸ２、ｉＮＯＳ、ＡＧＧ、ＣＯＬ２、ＭＭＰ‐３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５のｃＤＮＡのコピー数と、ＨＰＲＴのｃＤＮＡのコピー数との比を計算することにより正規化した。

結果は、対照と比較した増分の平均百分率として表した。統計学的有意性はｔ検定を使用して評価した。差異はｐ＜０．０５で統計学的に有意であると考えた。以下の表は、化合物を組み合わせて得られた結果、及び観察された相乗効果を詳細に示す。

考察
組み合わせによる結果は、各化合物の相加効果よりも優れていた。それら化合物が、炎症が存在する場合に異化作用を増大させ、同化作用を減少させる関連する異なる代謝経路に対して作用するからであるというのがその説明である。従って、本発明者らの非限定的な仮説は、クルクミンがＩＬ‐１βにより誘導される（コラーゲン及び緑茶によってもまた誘導される）炎症を阻害するというものである。炎症が阻害されると、異化作用が減少し、コラーゲン及び緑茶ポリフェノールは同化作用に対してそれらの正の効果を有し得る。関節症が悪循環である（炎症が異化作用を誘導し、異化作用が炎症を誘導する等）と考えると、異化作用が減少する（同化作用が増加する）と炎症が軽減し、悪循環から回復する。

更に、一般的には、健康な細胞では異化作用と同化作用との間で常にバランスがとられている。本発明者らは、上記組み合わせが（ＩＬ‐１βによる炎症を誘導することなく）健康な細胞の代謝に対して正の効果を有し得ることを観察した。関節症の症例において、又は関節症の以前に、まだ良好な健康状態にある細胞を本発明者らの組み合わせによって保護できるため、これは非常に興味深い。

Claims

骨関節炎の予防及び／又は治療に使用するための、緑茶ポリフェノールと共に、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含む、組成物。
前記予防及び／又は治療は、ヒト、又はネコ、イヌ若しくはウマ等のペットコンパニオンのためのものである、請求項１記載の組成物。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、加水分解コラーゲンである、請求項１又は２記載の組成物。
前記クルクミノイドはクルクミンである、請求項１〜３いずれか１項記載の組成物。
食料品の形態である、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
前記クルクミノイドは、乾燥重量基準で約０．００５％〜１．１％の量で存在する、請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
前記緑茶ポリフェノールは、乾燥重量基準で約０．０１％〜１．１％の量で存在する、請求項１〜６いずれか１項記載の組成物。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、乾燥重量基準で約０．５％〜１０％の量で存在する、請求項１〜７いずれか１項記載の組成物。
前記クルクミノイドはクルクミンであり、乾燥重量基準で約０．００５％〜０．１５％の量で存在する、請求項１〜８いずれか１項記載の組成物。
哺乳動物において骨関節炎を予防又は治療する方法であって、
前記方法は、緑茶ポリフェノールと共に、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせと共にクルクミノイドを含む組成物を、前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
前記哺乳動物は、ヒト、又はネコ、イヌ若しくはウマ等のペットコンパニオンである、請求項１０記載の方法。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、加水分解コラーゲンである、請求項１０又は１１記載の方法。
前記クルクミノイドはクルクミンである、請求項１０〜１２いずれか１項記載の方法。
前記組成物は食料品の形態である、請求項１０〜１３いずれか１項記載の方法。
前記クルクミノイドは、乾燥重量基準で約０．００５％〜１．１％の量で存在する、請求項１０〜１４いずれか１項記載の方法。
前記緑茶ポリフェノールは、乾燥重量基準で約０．０１％〜１．１％の量で存在する、請求項１０〜１５いずれか１項記載の方法。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、乾燥重量基準で約０．５％〜１０％の量で存在する、請求項１０〜１６いずれか１項記載の方法。
前記クルクミノイドはクルクミンであり、乾燥重量基準で約０．００５％〜０．１５％の量で存在する、請求項１０〜１７いずれか１項記載の方法。
クルクミノイド、緑茶ポリフェノール、並びにグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせを含む、組成物。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、加水分解コラーゲンである、請求項１９記載の組成物。
前記クルクミノイドはクルクミンである、請求項１９又は２０記載の組成物。
食料品の形態である、請求項１９〜２１いずれか１項記載の組成物。
前記クルクミノイドは、乾燥重量基準で約０．００５％〜１．１％の量で存在する、請求項１９〜２２いずれか１項記載の組成物。
前記緑茶ポリフェノールは、乾燥重量基準で約０．０１％〜１．１％の量で存在する、請求項１９〜２３いずれか１項記載の組成物。
前記グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの組み合わせは、乾燥重量基準で約０．５％〜１０％の量で存在する、請求項１９〜２４いずれか１項記載の組成物。
前記クルクミノイドはクルクミンであり、乾燥重量基準で約０．００５％〜０．１５％の量で存在する、請求項１９〜２５いずれか１項記載の組成物。
請求項１９〜２６いずれか１項記載の組成物の調製のためのプロセスであって、
成分を混合するステップと、任意に、混合物を合成及び投与に適した形態で提示するステップとを含む、プロセス。
前記組成物は、噴霧、コーティング又はデンプンポケットマトリクス（ｓｔａｒｃｈｐｏｃｋｅｔｍａｔｒｉｘ）の形態で前記混合物に添加される、請求項２７記載のプロセス。
薬剤中で使用するための、請求項１９〜２６いずれか１項記載の組成物。