CN113980122A - 猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪皮胶原肽‑亚铁螯合物的制备方法及用途。该方法包括如下步骤：将猪皮胶原肽冻干粉溶解，得浓度为0.05～0.5g/mL的猪皮胶原肽溶液；向猪皮胶原肽溶液中加入抗坏血酸，调pH值为4～6，再加入FeCl2·4H2O，在20～50℃下螯合10～60min，加入无水乙醇进行醇沉；其中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.1～0.5:1，猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1～3.5:1。本发明的制备方法制备的猪皮胶原肽‑亚铁螯合物的得率和螯合率均较高，且该猪皮胶原肽‑亚铁螯合物治疗缺铁性贫血效果和促进肠道菌群恢复效果均优于硫酸亚铁。

Description

猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法及用途，具体涉及一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法及其在制备治疗缺铁性贫血和/或调节肠道菌群的药物中的应用、一种胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法以及调节肠道菌群的食品或药物。
背景技术
铁是维持机体正常生理活动所必须的微量元素之一，成人体内约含铁3～5g，其中约2/3为功能性铁，1/3为贮存铁。机体每日摄取的膳食中含铁10～20mg，平均吸收率为10％～20％。尽管机体每日所需铁量较低，但铁对人体至关重要，是血红蛋白、肌红蛋白和多种酶的重要组成成分，广泛参与氧运输、氧化还原反应和能量代谢等。同时，研究表明铁是大多数细菌生长和繁殖的关键元素，膳食低铁和铁过量摄入都会使肠道菌群稳态失调，导致肠道菌群多样性被破坏，扰乱宿主系统代谢，诱发多种疾病如炎症性肠病、癌症的发生和发展。
缺铁性贫血(Iron Deficiency Anemia，IDA)是一种全球性的营养素缺乏症，临床症状有头痛、眼花、耳鸣、心悸、气短等。据统计，全世界由于铁元素缺乏所导致的贫血症约有10亿人，占贫血疾病总发病人数的50％。对其发病机制的研究发现铁元素的摄入不足或机体转铁蛋白的缺失是造成缺铁性贫血的最重要原因。目前，口服补铁制剂是治疗IDA的主要方式。亚铁类补铁剂的主要标志物为硫酸亚铁，但其治疗过程副作用较为严重，因此经常中断治疗，需通过间隔性以及小剂量的方式才能达到一定治疗效果。与硫酸亚铁等无机补铁剂相比，生物活性肽-亚铁螯合物可通过小肠直接吸收，利用率高、安全无消化道刺激且无副作用，是一种理想的补铁剂。CN110731512A公开一种南极磷虾肽铁螯合物，以南极磷虾为原料，酶解出南极磷虾铁螯合肽，再与亚铁鳌合制备南极磷虾肽铁螯合物，作为铁补充剂使用。斯兴开等发表的“带鱼酶解肽亚铁螯合物对贫血大鼠的治疗效果”中公开了带鱼酶解肽亚铁螯合物对大鼠贫血的改善作用，效果优于硫酸亚铁和含铁饲料。并且对于贫血大鼠的肠道细菌及菌量未有较大改变，说明带鱼酶解肽亚铁螯合物不会对肠道菌产生影响，验证了螯合肽的安全性(参见斯兴开，黄赛博，林慧敏，邓尚贵.带鱼酶解肽亚铁螯合物对贫血大鼠的治疗效果.中国食品学报，2017，17(5):18-24)。
猪皮(Pigskin)最早记载于《伤寒论》，药用名称为猪肤。猪皮的化学成份主要有水分、脂肪、矿物质和胶原蛋白，其中胶原蛋白为主要成分，占猪皮干重的98％(参考文献：余东华.猪皮蛋白两步酶解及其产物性质研究[D].华中农业大学,2011.)。现代研究发现，猪皮胶原蛋白在治疗虚劳赢瘦、月经不调、身体虚弱、产前产后血虚、肺结核、咳血、血痰、贫血、血小板、白血球减少症等方面很有疗效。根据中药口服给药的特点，结合大分子蛋白在人体胃肠道消化吸收原理，猪皮胶原蛋白肽应为其补血升白功效的物质基础。
在此基础上，结合缺铁性贫血的发病机理，将亚铁离子与本身具有补血作用的猪皮胶原肽进行螯合，制备有机态的肽-亚铁螯合物作为补血药将具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法。本发明制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物得率和螯合率均较高。
本发明的另一个目的在于提供一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物用于制备治疗缺铁性贫血和/或调节肠道菌群的药物中的应用。经体内药效学实验证实，该猪皮胶原肽-亚铁螯合物对缺铁性贫血的治疗效果优于硫酸亚铁，且其吸收利用率高、胃肠道刺激性小。经肠道菌群多样性测定实验结果表明，与相同Fe含量的硫酸亚铁相比，该猪皮胶原肽-亚铁螯合物促进IDA大鼠肠道菌群恢复效果优于硫酸亚铁，说明该猪皮胶原肽-亚铁螯合物具有调节肠道菌群的作用。
本发明的再一个目的在于提供一种胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法。
本发明的又一个目的在于提供一种胶原肽-氯化亚铁物理混合物用于制备调节肠道菌群的药物中的应用。经肠道菌群多样性测定实验结果表明，与相同Fe含量的硫酸亚铁相比，该胶原肽-氯化亚铁物理混合物促进IDA大鼠肠道菌群恢复效果优于硫酸亚铁，说明该胶原肽-氯化亚铁物理混合物具有调节肠道菌群的作用。
本发明还有一个目的在于提供一种富铁食品或药物，包括上述方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物。
本发明最后一个目的在于提供一种调节肠道菌群的食品或药物，包括上述方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物和/或上述方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物。本发明采用如下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法，包括如下步骤：
将猪皮胶原肽冻干粉溶解，得浓度为0.05～0.5g/mL的猪皮胶原肽溶液；向猪皮胶原肽溶液中加入抗坏血酸，调pH值为4～6，再加入FeCl2·4H2O，在20～50℃下螯合10～60min，加入无水乙醇进行醇沉；
其中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.1～0.5:1，猪皮胶原肽冻干粉中的猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1～3.5:1。
根据本发明所述的制备方法，优选地，所述猪皮胶原肽冻干粉中猪皮胶原肽的分子量为1～3kDa。
根据本发明所述的制备方法，优选地，所述猪皮胶原肽溶液的浓度为0.1～0.3g/mL；抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.2～0.45:1；调pH值为4.5～5.8；猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1.5～3:1；在35～45℃下螯合20～50min。
根据本发明所述的制备方法，优选地，所述猪皮胶原肽冻干粉由包括以下的步骤制备而得：
1)脱脂预处理：
取鲜猪皮，去掉筋膜、削尽皮下脂肪层，切成猪皮丁，加入碱液浸泡1～20h，再用去离子水洗至中性，烘干，粉碎，脱脂，得脱脂猪皮；
2)蛋白酶酶解：
取脱脂猪皮，加水煮沸，再降温至45～65℃，保温，得猪皮液；向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解0.3～3h，再加入菠萝蛋白酶，酶解0.5～5h，煮沸灭酶，得猪皮粗酶解液；猪皮粗酶解液经除渣、离心后，得猪皮酶解液；将猪皮酶解液冷冻干燥，得初猪皮胶原肽冻干粉；
其中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量分别为干猪皮重量的0.1～5％；所述干猪皮为将鲜猪皮于105℃烘干至恒重所得；
3)超滤分段：
将初猪皮胶原肽冻干粉配制成初猪皮胶原肽溶液，超滤，收集分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽溶液，冷冻干燥，得分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉。
根据本发明所述的制备方法，优选地：
步骤1)中，所述碱液为0.1wt％～0.5wt％的NaOH溶液，碱液的用量为猪皮丁重量的2～8倍，加入碱液浸泡时间为5～15h；烘干的温度为70～120℃；采用石油醚脱脂，石油醚的用量为粉碎后猪皮丁重量的1～5倍，脱脂后挥干石油醚；
步骤2)中，加水量为脱脂猪皮重量的4～12倍，煮沸1～25min；降温至50～60℃；碱性蛋白酶的用量为干猪皮重量的0.5～3.5％，酶解0.8～2h；菠萝蛋白酶的用量为干猪皮重量的0.5～3.5％，酶解2.5～4h；离心的参数为1000～7000r/min离心1～5次，每次5～15min。
根据本发明如上所述的制备方法的制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物用于制备治疗缺铁性贫血和/或调节肠道菌群的药物中的应用。
本发明还提供一种胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法，包括如下步骤：取猪皮胶原肽冻干粉和FeCl2·4H2O混合，混合均匀后加去离子溶解，得到胶原肽-氯化亚铁混合物。
本发明还提供一种如上所述的制备方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物用于制备调节肠道菌群的药物中的应用。
本发明再提供一种富铁食品或药物，包括如上所述的制备方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物。
本发明最后提供一种调节肠道菌群的食品或药物，包括如上所述的制备方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物和/或如上所述的制备方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物。
本发明以猪皮胶原肽为肽源，氯化亚铁为铁源，通过优化螯合反应条件，高效制备猪皮胶原肽-亚铁螯合物，该螯合物得率和螯合率均较高。经体内药效学实验证实，该猪皮胶原肽-亚铁螯合物对缺铁性贫血的治疗效果优于无机补铁剂硫酸亚铁，且其吸收利用率高、胃肠道刺激性小。经肠道菌群多样性测定实验结果表明，与相同Fe含量的硫酸亚铁相比，该猪皮胶原肽-亚铁螯合物促进IDA大鼠肠道菌群恢复效果优于硫酸亚铁，说明该猪皮胶原肽-亚铁螯合物具有调节肠道菌群的作用。并且，本发明还发现胶原肽-氯化亚铁物理混合物同样具有调节IDA大鼠肠道菌群的作用。
附图说明
图1为普鲁士蓝染色法观察实验例2各组大鼠肝脏的铁含量及形态学特点图。
图2为HE染色法观察实验例2各组大鼠结肠形态学特点图。
图3为实验例3各组大鼠肠道菌群结构的基于非加权UniFrac的主坐标分析(PCoA)图。
其中，图3中字母含义如下所示：
k:空白组；m:模型组；y:硫酸亚铁组；z:中剂量组；g:高剂量组；w:肽-氯化亚铁物理混合组；d:低剂量组：p:猪皮胶原蛋白组；T:猪皮胶原肽组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中，百分含量“wt％”是指质量百分含量。
<猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法>
本发明的猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法，包括脱脂预处理、蛋白酶酶解、超滤分段和螯合反应四个步骤。下面进行详细描述。
脱脂预处理
取鲜猪皮，去掉筋膜、削尽皮下脂肪层，切成猪皮丁，加入碱液浸泡1～20h，再用去离子水洗至中性，烘干，粉碎，脱脂，得脱脂猪皮。
在本发明中，鲜猪皮可通过市售购得。采用本领域常规方法如用刀具去掉鲜猪皮的筋膜，并削尽皮下脂肪层，这样处理有利于后续步骤将鲜猪皮中的胶原蛋白充分提取出来。也可将上述处理后的鲜猪皮冲洗干净，再进入下一步工序，防止脂肪层的残留。将处理后的鲜猪皮切成猪皮丁，猪皮丁的大小不做具体限定，如切成厚为1cm、长为1cm的正方形猪皮丁，或切成厚为1cm、长为2cm、宽为1cm的长方形猪皮丁。将鲜猪皮切丁后，利于碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解鲜猪皮中的胶原蛋白，进而得到具有多种生理活性的猪皮胶原肽。
在本发明中，碱液为0.1wt％～0.5wt％的NaOH溶液或氢氧化钾溶液，优选为0.2wt％～0.4wt％的NaOH溶液，更优选为0.3wt％的NaOH溶液。碱液的用量为猪皮丁重量的2～8倍，优选为3～6倍，更优选为5倍。加入碱液浸泡猪皮丁5～15h，优选为7～12h，更优选为8h。根据本发明的一个优选的实施方式，采用猪皮丁重量5倍的0.3wt％NaOH溶液作为碱液，浸泡猪皮丁8h。
在本发明中，烘干采用本领域常规的烘干设备，如烘箱。烘干的温度为70～120℃，优选为80～110℃，更优选为90～100℃。采用上述烘干温度能够将猪皮丁充分烘干，且还能少量去除油脂。烘干后的猪皮丁采用本领域常规的粉碎设备粉碎，如高速粉碎机。
在本发明中，粉碎后的猪皮丁采用石油醚脱脂，石油醚的用量为粉碎后猪皮丁重量的1～5倍，优选为1.5～3.5，更优选为2～3倍，如2倍，脱脂后挥干石油醚。采用上述用量的石油醚既能减少石油醚的用量，还能将猪皮丁中的脂肪充分脱除。
蛋白酶酶解
取脱脂猪皮，加水煮沸，再降温至45～65℃，保温，得猪皮液；向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解0.3～3h，再加入菠萝蛋白酶，酶解0.5～5h，煮沸灭酶，得猪皮粗酶解液；猪皮粗酶解液经除渣、离心后，得猪皮酶解液；将猪皮酶解液冷冻干燥，得初猪皮胶原肽冻干粉；其中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量分别为干猪皮重量的0.1～5％。
在本发明中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量以干猪皮的重量为基准计算。干猪皮指的是将鲜猪皮于105℃烘干至恒重所得。
在本发明中，取脱脂猪皮，加水煮沸，所用水可以为纯水、纯净水、蒸馏水或去离子水等，优选为去离子水。加水量为脱脂猪皮重量的4～12倍，优选为5～10倍，更优选为7～10倍，如8倍。加水煮沸1～25min，优选为12～18min，更优选为15～18min，如15min。再将煮沸后的脱脂猪皮降温至50～60℃，优选为52～57℃，更优选为55～57℃，如55℃。
在本发明中，碱性蛋白酶的用量可以为干猪皮重量的0.5～3.5％，优选为1～3％，更优选为1～2.5％。向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解时间可以为0.3～3h；优选地，酶解时间为0.8～2h；更优选地，酶解时间为1～2h。菠萝蛋白酶的用量可以为干猪皮重量的0.5～3.5％，优选为1～3％，更优选为1～2.5％。加入菠萝蛋白酶的酶解时间可以为0.5～5h；优选地，酶解时间为2.5～4h；更优选地，酶解时间为3～4h。本发明采用上述用量的碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶对猪皮中的胶原蛋白进行酶解，进而得到较多的猪皮胶原肽。
在本发明中，对酶解后的猪皮液进行煮沸灭酶，煮沸时间为5～25min，优选为10～20min，更优选为15min。采用上述灭酶方式能充分灭酶活性。
在本发明中，猪皮粗酶解液除渣可以采用本领域常规的工艺，如抽滤除渣、过滤除渣。除渣后的猪皮粗酶解液经离心处理，离心的参数为1000～7000r/min，离心1～5次，每次5～15min；优选地，离心的参数为2000～6000r/min，离心2～4次，每次8～12min；更优选地，离心的参数为5000r/min，离心3次，每次10min。
超滤分段
将初猪皮胶原肽冻干粉配制成初猪皮胶原肽溶液，超滤，收集分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽溶液，冷冻干燥，得分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉。
在本发明中，将初猪皮胶原肽溶液超滤可以采用本领域常规的超滤设备，如超滤膜。根据本发明的一个优选的实施方式，将初猪皮胶原肽溶液经截留分子量为1kDa和3kDa的超滤膜装置进行超滤。
螯合反应
将猪皮胶原肽冻干粉溶解，得浓度为0.05～0.5g/mL的猪皮胶原肽溶液；向猪皮胶原肽溶液中加入抗坏血酸，调pH值为4～6，再加入氯化亚铁(FeCl2·4H2O)，在20～50℃下螯合10～60min，加入无水乙醇进行醇沉。将醇沉产物冷藏静置后收集沉淀，洗涤，烘干，得猪皮胶原肽-亚铁螯合物。抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.1～0.5:1，猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比为1～3.5:1。
在本发明中，将分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉用水溶解，所用水可以为纯水、纯净水、蒸馏水或去离子水等，优选为去离子水。所得猪皮胶原肽溶液的浓度为0.05～0.5g/mL，优选为0.1～0.3g/mL，更优选为0.15～0.25g/mL。若猪皮胶原肽溶液浓度高于上述浓度，其溶解性下降，猪皮胶原肽与亚铁离子分布过于密集，影响其螯合速率，并使螯合率降低。若猪皮胶原肽溶液浓度低于上述浓度时，溶液中的猪皮胶原肽和亚铁离子的的浓度都很低，两者之间由于热运动引起的相互碰撞也少，不利于螯合反应进行。且溶液浓度过低时也会影响醇沉操作，不利于醇沉沉淀的形成，使实验数据产生偏差。
在本发明中，向猪皮胶原肽溶液中加入抗坏血酸，调pH值为4～6，优选为4.5～5.8，更优选为5～5.8。当pH值较低时，由于溶液中氢离子浓度过高，氢离子与亚铁离子争夺供电子基团，使得亚铁离子螯合率降低。而随着pH值的增大，亚铁离子螯合率逐渐上升。但当溶液pH值超过5后，螯合时溶液颜色变深，溶液中氢氧根离子与亚铁离子形成氢氧化物沉淀，不利于螯合反应的进行。因此，猪皮胶原肽与亚铁离子的最佳螯合pH值为5～5.8。调pH值可采用本领域常规的方法，如向猪皮胶原肽溶液中加入酸溶液或碱溶液，只要能将pH值调至上述数值即可。
向调节pH值后的猪皮胶原肽溶液中加入氯化亚铁，在20～50℃下螯合10～60min；优选为35～45℃下螯合20～50min；更优选为40～45℃下螯合30～40min。设定上述鳌合参数，能够保证猪皮胶原肽-亚铁螯合物的螯合率最高。当鳌合温度低于上述温度时，猪皮胶原肽与亚铁离子反应活力不足，导致螯合率和螯合物得率较低。当鳌合温度高于上述温度时，由于螯合反应为放热反应，不利于反应正向进行，同时升高温度也可导致部分螯合物分解或发生其他反应。若螯合时间过短，螯合反应不彻底，导致螯合率较低。又由于螯合反应是一个较快速的反应，不需较长反应时间，时间过长，反而而导致螯合率下降。故选择40～45℃下螯合30～40min为最佳鳌合参数。
在本发明中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.1～0.5:1，优选为0.2～0.45:1，更优选为0.3～0.4:1。猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比可以为1～3.5:1，优选为1.5～3:1，更优选为2～3:1，再优选为2.5～3:1。采用上述用量关系，使制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物得率和螯合率均较高。如果抗坏血酸加入量不足，亚铁离子在螯合过程中被氧化生成沉淀，最终导致螯合率降低；而加入过量抗坏血酸，由于抗坏血酸具有与亚铁离子结合的能力，与猪皮胶原肽竞争螯合亚铁离子，也会导致螯合率的降低。如果猪皮胶原肽与Fe2+的摩尔比较小时，猪皮胶原肽不足，Fe2+不能与猪皮胶原肽形成稳定的环状结构复合物，铁主要以离子形式游离于反应体系中，在反应后续醇沉、无水乙醇洗涤过程中被除去，导致螯合率降低。如果猪皮胶原肽与Fe2+的摩尔比超过3.5:1时，过量猪皮胶原肽未参与螯合反应，造成原料的浪费，且螯合物得率和螯合率均大幅度降低。因此，选择猪皮胶原肽与Fe2+的摩尔比1～3.5:1进行螯合反应。
在本发明中，鳌合后的猪皮胶原肽溶液采用无水乙醇醇沉，优选无水乙醇的用量为鳌合后猪皮胶原肽溶液体积的3～10倍，更优选为6倍。将醇沉后的猪皮胶原肽溶液冷藏静置，冷藏静置时间不做具体限定，只要沉淀充分沉积即可，如冷藏静置1～48h，优选为5～30h，更优选为24h。选择上述冷藏静置时间，既节省了时间，还提高了效率。洗涤冷藏静置后收集的沉淀，洗涤方式可以采用无水乙醇洗涤，无水乙醇用量不做具体限定，只要能将沉淀表面的各种试剂洗净即可。
根据本发明的一个优选的实施方式，猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法包括如下步骤：
1)脱脂预处理：
取鲜猪皮，去掉筋膜、削尽皮下脂肪层，切成1×1cm的猪皮丁，加入碱液浸泡8h，再用去离子水洗至中性，90～100℃烘干，粉碎，加入2倍重量的石油醚脱脂，脱脂后挥干石油醚，得脱脂猪皮；其中，所述碱液为0.3wt％的NaOH溶液，碱液的用量为猪皮丁重量的5倍；
2)蛋白酶酶解：
取脱脂猪皮，加8倍重量的去离子水煮沸15min，再降温至55℃，保温，得猪皮液；向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解1h，再加入菠萝蛋白酶，酶解3h，煮沸15min灭酶，得猪皮粗酶解液；猪皮粗酶解液经抽滤除渣，冷藏12h后，5000r/min离心3次，每次10min，得猪皮酶解液；将猪皮酶解液减压浓缩后，5Pa、-80℃冷冻干燥，得初猪皮胶原肽冻干粉；其中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量分别为干猪皮重量的1％；
3)超滤分段：
将初猪皮胶原肽冻干粉配制成初猪皮胶原肽溶液，采用截留分子量为3kDa和1kDa的超滤膜对初猪皮胶原肽溶液进行超滤，收集分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽溶液，冷冻干燥，得分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉；
4)螯合反应：
将分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉用去离子水溶解，得浓度为0.15g/mL的猪皮胶原肽溶液；加入抗坏血酸，用10wt％盐酸调pH值为5，再加入氯化亚铁，在40℃下螯合40min，用6倍体积的无水乙醇醇沉，冷藏静置24h后收集沉淀，无水乙醇洗涤，烘干，得猪皮胶原肽-亚铁螯合物；其中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.3:1，猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比为3:1。
<猪皮胶原肽-亚铁螯合物用途>
采用上述方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物用于制备治疗缺铁性贫血和/或调节肠道菌群的药物中的应用。本发明将具有补血作用的猪皮胶原肽与亚铁离子进行螯合，使亚铁离子借助肽转运通道吸收，进而提升亚铁离子吸收利用率，增强补血功效。经药效实验证实，本发明制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物吸收利用率高，胃肠道刺激性小，总体治疗缺铁性贫血的效果优于硫酸亚铁。肠道菌群多样性测定实验结果表明，与相同Fe含量的硫酸亚铁相比，本发明猪皮胶原肽-亚铁螯合物促进IDA大鼠肠道菌群恢复效果优于硫酸亚铁，说明该猪皮胶原肽-亚铁螯合物具有调节肠道菌群的作用。
<胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法>
本发明的胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法，包括如下步骤：取猪皮胶原肽冻干粉和FeCl2·4H2O混合，混合均匀后加去离子溶解，得到胶原肽-氯化亚铁混合物。其中，猪皮胶原肽冻干粉中猪皮胶原肽和FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1～3.5:1，优选为1.5～3:1，更优选为2～3:1，再优选为2.5～3:1。去离子水的用量为使得混合物的质量浓度为0.75～3.5mg/mL。
<胶原肽-氯化亚铁物理混合物用途>
采用上述方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物用于制备调节肠道菌群的药物中的应用。肠道菌群多样性测定实验结果表明，与相同Fe含量的硫酸亚铁相比，本发明胶原肽-氯化亚铁物理混合物促进IDA大鼠肠道菌群恢复效果优于硫酸亚铁，说明该胶原肽-氯化亚铁物理混合物具有调节肠道菌群的作用。
<富铁食品或药物>
富铁食品或药物包括上述方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物。
<调节肠道菌群的食品或药物>
调节肠道菌群的食品或药物包括前述方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物和/或前述方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物。
实施例1
1)脱脂预处理：
取鲜猪皮，去掉筋膜、削尽皮下脂肪层，切成1×1cm的猪皮丁，加入碱液浸泡8h，再用去离子水洗至中性，烘箱90～100℃烘干，粉碎，加入2倍重量的石油醚超声脱脂，脱脂后挥干石油醚，得脱脂猪皮；其中，所述碱液为0.3wt％的NaOH溶液，碱液的用量为猪皮丁重量的5倍；超声脱脂为在40℃条件下，50Hz脱脂3次，每次30min。
2)蛋白酶酶解：
取500g脱脂猪皮，加8倍重量的去离子水煮沸15min，再降温至55℃，保温，得猪皮液；向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解1h，再加入菠萝蛋白酶，酶解3h，煮沸15min灭酶，得猪皮粗酶解液；猪皮粗酶解液经抽滤除渣，冷藏12h后，5000r/min离心3次，每次10min，得猪皮酶解液；将猪皮酶解液减压浓缩后，5Pa、-80℃冷冻干燥，得初猪皮胶原肽冻干粉；其中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量分别为干猪皮重量的1％。干猪皮为将鲜猪皮于105℃烘干至恒重所得。
3)超滤分段：
将初猪皮胶原肽冻干粉配制成初猪皮胶原肽溶液，采用截留分子量为3kDa和1kDa的超滤膜对初猪皮胶原肽溶液进行超滤分段，收集分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽溶液，冷冻干燥，得分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉。
4)螯合反应：
将分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉用去离子水溶解，得浓度为0.15g/mL的猪皮胶原肽溶液；加入抗坏血酸，用10wt％盐酸调pH值为5，再加入氯化亚铁(FeCl2·4H2O)，在40℃下螯合40min，用6倍体积的无水乙醇醇沉，慢加快搅，冷藏静置24h后收集沉淀，无水乙醇洗涤，50℃烘干，得猪皮胶原肽-亚铁螯合物；其中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.3:1，猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为3:1。
实施例2～3
除了以下区别，实施例2～3的制备方法与实施例1相同：猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比不同，实施例2～3所用猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比分别为1:1、2:1。
对比例1
除了以下区别，对比例1的制备方法与实施例1相同：猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比不同，对比例1所用猪皮胶原肽与氯化亚铁中Fe2+的摩尔比为4:1。
实验例1
为了对比实施例1～3和对比例1制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物的得率和螯合率，进行如下实验。
1.1、实验试剂
表1试剂基本信息表
Figure BDA0003324951030000151
1.2、实验方法
1.2.1邻非罗啉法测定亚铁离子含量
1.2.1.1测定原理
在弱酸性缓冲溶液条件下，盐酸羟胺将三价铁离子还原为二价铁离子，二价铁离子与邻非罗啉生成稳定的橙红色络合物，在510nm下有选择吸收，其吸光度与铁浓度呈正比。
1.2.1.2溶液配制
1％盐酸羟胺水溶液、0.1％邻菲罗啉水溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)以及硫酸亚铁铵对照品溶液配制(10.50μg/mL)按照文献(林洋，刘再胜，单春乔，等.大豆小肽螯合铁的制备工艺及光谱分析研究[J].大豆科学，2017，36(01):108-115.)进行。
1.2.1.3标准曲线的绘制及测定方法
精密量取硫酸亚铁铵对照品溶液0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL，分别置50mL具塞容量瓶中，各加乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)5.0mL，各加入盐酸羟胺2.5mL，摇匀，再分别加入邻菲罗啉水溶液5.0mL，用水定容至50mL，静置20min后，照紫外-可见分光光度法，以0号管为空白，在510nm波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵坐标，硫酸亚铁铵含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。
供试品测定法：分别精密量取供试品溶液，按照标准曲线的绘制项下自“加乙酸-乙酸钠缓冲液5.0mL”起，依法测定吸光度，从回归方程中计算亚铁离子的含量。
1.2.2螯合率计算方法
螯合率(％)＝M1/M0*100％
螯合物得率(％)＝M2/M3*100％
其中：M0为加入溶液内总亚铁离子含量(mg)
M1为醇沉后肽-亚铁螯合物中的亚铁离子含量(mg)
M2为得到的螯合物质量(mg)
M3为加入螯合体系的肽质量和亚铁盐质量(mg)
1.3、实验结果
如表2所示，实施例1制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物的螯合率为81.77％，螯合物得率为49.53％。实施例1～3的结果均优于对比例1制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物，并可知，按猪皮胶原肽与Fe2+摩尔比3:1加入铁盐是最佳螯合条件。
表2螯合物得率和鳌合率的测定结果
编号 猪皮胶原肽与Fe<sup>2+</sup>摩尔比 螯合物得率％ 螯合率％
实施例1 3:1 53.31 81.54
实施例2 1:1 53.00 61.62
实施例3 2:1 52.24 64.57
对比例1 4:1 48.32 55.05
实验例2
为了验证本发明实施例制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物能够治疗缺铁性贫血，进行如下实验。
2.1、实验动物、仪器与试剂
SD大鼠：SPF级，体质量110～120g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK(鲁)20190003。
低铁饲料和正常饲料：购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，采用公职分析化学工作者协会(AOAC)推荐的低铁饲料配方配制动物饲料：玉米淀粉54％，奶粉40％，豆油5％，食盐1％。
表3试剂盒基本信息表
Figure BDA0003324951030000181
2.2、实验方法
2.2.1主要溶液配制
硫酸亚铁：取硫酸亚铁片溶于去离子水，配制成1.5mg/mL的硫酸亚铁溶液。每片硫酸亚铁片含铁60mg，临床治疗时，成人一日3次，按照动物与人体表面积比折算，大鼠等效剂量以Fe计为16.2mg/kg。
低、中、高剂量螯合物溶液：分别取实施例1制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物溶于去离子水，配制成浓度0.75mg/mL、1.5mg/mL和3mg/mL的低、中、高剂量螯合物溶液(以Fe计)。
胶原肽-氯化亚铁物理混合溶液的配制：按照中剂量螯合物溶液配制Fe和肽含量相等且浓度相同的溶液。取猪皮胶原肽和氯化亚铁混合(固-固混合)均匀后加去离子溶解得到。其中，猪皮胶原肽和氯化亚铁所取量与中剂量螯合物溶液配制Fe和肽含量相等。
猪皮胶原肽溶液的配制：取猪皮胶原肽加去离子水溶解得到，其中，猪皮胶原肽所取量与中剂量螯合物溶液配制肽含量相等。
猪皮胶原蛋白溶液：采用新阿胶(宏济堂阿胶)临床日用量9g计算，按照动物于人体表面积比折算，大鼠等效剂量为0.81g/kg，并按此配制。
2.2.2实验方法
72只SD大鼠适应性饲养7d，温度(24±2)℃，湿度50％±5％，称量体质量。根据体质量将SD大鼠随机分为9组：空白组、模型组、阳性药组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组、螯合物低剂量组、胶原肽-氯化亚铁物理混合组、猪皮胶原肽组和猪皮胶原蛋白组，每组8只。
空白组大鼠第1～5周自由饮食正常饲料，每天灌胃等量的去离子水(10mL/kg)。
模型组大鼠第1～5周自由饮食低铁饲料，从第3周起，每2d对大鼠进行眼框放血1.0～1.5mL，每天灌胃等量的去离子水(10mL/kg)。
阳性药组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组、螯合物低剂量组、胶原肽-氯化亚铁物理混合组、猪皮胶原肽组和猪皮胶原蛋白组大鼠均第1～5周自由饮食低铁饲料，从第3周起，每2d对大鼠进行眼框放血1.0～1.5mL，每天分别灌胃等量的硫酸亚铁溶液、高、中、低剂量螯合物溶液、胶原肽-氯化亚铁物理混合溶液、猪皮胶原肽溶液和猪皮胶原蛋白溶液(10mL/kg)。5周后大鼠生物样本取材前禁食12h，不禁水，各组大鼠用10％水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，部分血液置于血常规管，部分置于抗凝管内，静置30min，3500r·min-1离心10min，取血清分装，-20℃保存待用；迅速将肝脏取出，一部分迅速冻藏于-80℃冰箱，另一部分于4％多聚甲醛溶液中固定；取十二指肠、结肠、空肠上端、回肠，迅速冻藏于-80℃冰箱；其中，结肠、肝脏样本置4％多聚甲醛固定一部分。
全自动血液分析仪测定血常规管中全血红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)和平均血红蛋白浓度(MCHC)。
采用ELISA酶联检测方法检测SD大鼠血清血清总铁结合力(TIBC)、血清铁(SI)、血清铁调素(HEPC)、血清转铁蛋白受体(TRF；CD71)和血清铁蛋白(SF)含量。
大鼠结肠切片和肝脏切片分别采用苏木素伊红(HE)染色和普鲁士蓝(核固红法)染色观察病理状态。
2.3、实验结果，见表4～表8。
实验采用低铁饲料辅以定期放血成功诱导IDA大鼠模型。
表4各组对缺铁性贫血大鼠RBC、HGB和HCT的影响
Figure BDA0003324951030000201
Figure BDA0003324951030000202
注：表4中，上标a、b、c、d、e代表具有显著差异，P<0.05。
表5各组对缺铁性贫血大鼠MCV、MCH和PLT的影响
Figure BDA0003324951030000211
Figure BDA0003324951030000212
注：表5中，上标a、b、c、d、e代表具有显著差异，P<0.05。
表6各组对缺铁性贫血大鼠MCHC和WBC的影响
Figure BDA0003324951030000213
Figure BDA0003324951030000214
注：表6中，上标a、b、c、d、e代表具有显著差异，P<0.05。
表7各组对缺铁性贫血大鼠HPEC、SI和TIBC的影响
Figure BDA0003324951030000221
Figure BDA0003324951030000222
注：表7中，上标a、b、c代表具有显著差异，P<0.05。
表8各组对缺铁性贫血大鼠SF和TFR的影响
Figure BDA0003324951030000223
Figure BDA0003324951030000224
注：表8中，上标a、b、c代表具有显著差异，P<0.05。
由表4～表8可知，不同组别大鼠给药后，13个药效学指标(RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、WBC、PLT、HPEC、SI、TIBC、SF、TFR)中有8个指标(RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、HPEC、SF、TFR)显示，实施例1制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物治疗缺铁贫血效果优于阳性药硫酸亚铁。螯合物低剂量组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组、胶原肽-氯化亚铁物理混合组均优于猪皮胶原肽组和猪皮胶原蛋白组。螯合物低剂量组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组略优于胶原肽-氯化亚铁物理混合组。
如图1所示，大鼠肝脏切片普鲁士蓝染色(核固红法)实验结果证实，猪皮胶原肽-亚铁螯合物吸收率高于硫酸亚铁。如图2所示，大鼠结肠切片HE染色结果显示猪皮胶原肽-亚铁螯合物比硫酸亚铁更有利于肠道绒毛生长，揭示螯合物的胃肠道刺激性小于无机补铁剂硫酸亚铁。图1和图2中，肽-氯化亚铁物理混合组即为胶原肽-氯化亚铁物理混合组。
实验例3
为了验证本发明实施例制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物具有调节肠道菌群的作用，进行如下实验。其中实验动物、仪器与试剂、主要溶液配置参考实验例2。
3.1、实验方法
72只SD大鼠适应性饲养7d，温度(24±2)℃，湿度50％±5％，称量体质量。根据体质量将SD大鼠随机分为9组：空白组、模型组、硫酸亚铁组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组、螯合物低剂量组、胶原肽-氯化亚铁物理混合组、猪皮胶原肽组和猪皮胶原蛋白组，每组8只。
空白组大鼠第1～5周自由饮食正常饲料，每天灌胃等量的去离子水(10mL/kg)。
模型组大鼠第1～5周自由饮食低铁饲料，从第3周起，每2d对大鼠进行眼框放血1.0～1.5mL，每天灌胃等量的去离子水(10mL/kg)。
硫酸亚铁组、螯合物中剂量组、螯合物高剂量组、螯合物低剂量组、胶原肽-氯化亚铁物理混合组、猪皮胶原肽组和猪皮胶原蛋白组大鼠均第1～5周自由饮食低铁饲料，从第3周起，每2d对大鼠进行眼框放血1.0～1.5mL，每天分别灌胃等量的硫酸亚铁溶液、高、中、低剂量螯合物溶液、胶原肽-氯化亚铁物理混合溶液、猪皮胶原肽溶液和猪皮胶原蛋白溶液(10mL/kg)。5周后大鼠生物样本取材前禁食12h，不禁水，采集的大鼠新鲜粪便标本，将粪样置于无菌无酶冻存管，冻藏于-80℃冰箱备用。基于IlluminaMiseq PE300高通量测序技术分析猪皮胶原肽-亚铁螯合物对IDA大鼠肠道菌群多样性的影响。
3.2、实验结果
在门水平下，大鼠肠道菌群组成主要包括厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidota、放线菌门Actinobacteriota、变形菌门Proteobacteria和疣微菌门Verrucomicrobiota，其中厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidota比列最高。厚壁菌门在正常组、螯合物中剂量组、螯合物低剂量组和猪皮胶原肽组所占比例最高，分别为85.45％、84.02％、87.54％和83.67％，均高于其在硫酸亚铁组所占的比例(79.52％)。同时，结果表明厚壁菌门所占比例在螯合物不同剂量组中随着剂量的增加而降低，螯合物高剂量组中厚壁菌门所占比例仅为74.21％。拟杆菌门在硫酸亚铁组和螯合物高剂量组中所占比例最高，分别为18.83％和22.95％，且随着螯合物剂量的增高拟杆菌门所占的比例降低，即所占比例螯合物高剂量组(22.95％)>螯合物中剂量组(13.10％)>螯合物低剂量组(10.46％)。变形菌门在模型组大鼠、猪皮胶原蛋白组大鼠和猪皮胶原肽组大鼠中所占比例最高，分别为6.60％、5.91％和1.79％。说明铁对肠道中的微生物多样性及肠道菌群稳态存在重大影响，缺铁(模型组、猪皮胶原肽组、猪皮胶原蛋白组)和过量摄入铁(螯合物高剂量组)都会导致大鼠肠道菌群紊乱，而适量进行铁剂治疗有利于大鼠肠道菌群恢复稳态。
如图3所示，在Fe含量相同的情况下，有机态补铁剂(螯合物中剂量组)比无机态补铁剂(硫酸亚铁组)更有助于IDA大鼠肠道菌群恢复正常水平(空白组)。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种猪皮胶原肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将猪皮胶原肽冻干粉溶解，得浓度为0.05～0.5g/mL的猪皮胶原肽溶液；向猪皮胶原肽溶液中加入抗坏血酸，调pH值为4～6，再加入FeCl2·4H2O，在20～50℃下螯合10～60min，加入无水乙醇进行醇沉；
其中，抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.1～0.5:1，猪皮胶原肽冻干粉中的猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1～3.5:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猪皮胶原肽冻干粉中猪皮胶原肽的分子量为1～3kDa。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述猪皮胶原肽溶液的浓度为0.1～0.3g/mL；抗坏血酸与FeCl2·4H2O的质量比为0.2～0.45:1；调pH值为4.5～5.8；猪皮胶原肽与FeCl2·4H2O中Fe2+的摩尔比为1.5～3:1；在35～45℃下螯合20～50min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述猪皮胶原肽冻干粉由包括以下的步骤制备而得：
1)脱脂预处理：
取鲜猪皮，去掉筋膜、削尽皮下脂肪层，切成猪皮丁，加入碱液浸泡1～20h，再用去离子水洗至中性，烘干，粉碎，脱脂，得脱脂猪皮；
2)蛋白酶酶解：
取脱脂猪皮，加水煮沸，再降温至45～65℃，保温，得猪皮液；向猪皮液中加碱性蛋白酶，酶解0.3～3h，再加入菠萝蛋白酶，酶解0.5～5h，煮沸灭酶，得猪皮粗酶解液；猪皮粗酶解液经除渣、离心后，得猪皮酶解液；将猪皮酶解液冷冻干燥，得初猪皮胶原肽冻干粉；
其中，碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量分别为干猪皮重量的0.1～5％；所述干猪皮为将鲜猪皮于105℃烘干至恒重所得；
3)超滤分段：
将初猪皮胶原肽冻干粉配制成初猪皮胶原肽溶液，超滤，收集分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽溶液，冷冻干燥，得分子量为1～3kDa的猪皮胶原肽冻干粉。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中，所述碱液为0.1wt％～0.5wt％的NaOH溶液，碱液的用量为猪皮丁重量的2～8倍，加入碱液浸泡时间为5～15h；烘干的温度为70～120℃；采用石油醚脱脂，石油醚的用量为粉碎后猪皮丁重量的1～5倍，脱脂后挥干石油醚；
步骤2)中，加水量为脱脂猪皮重量的4～12倍，煮沸1～25min；降温至50～60℃；碱性蛋白酶的用量为干猪皮重量的0.5～3.5％，酶解0.8～2h；菠萝蛋白酶的用量为干猪皮重量的0.5～3.5％，酶解2.5～4h；离心的参数为1000～7000r/min离心1～5次，每次5～15min。
6.根据权利要求1至5任一项所述的制备方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物用于制备治疗缺铁性贫血和/或调节肠道菌群的药物中的应用。
7.一种胶原肽-氯化亚铁物理混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取猪皮胶原肽冻干粉和FeCl2·4H2O混合，混合均匀后加去离子溶解，得到胶原肽-氯化亚铁混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物用于制备调节肠道菌群的药物中的应用。
9.一种富铁食品或药物，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的制备方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物。
10.一种调节肠道菌群的食品或药物，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的制备方法制备的猪皮胶原肽-亚铁螯合物和/或权利要求7所述的制备方法制备的胶原肽-氯化亚铁物理混合物。
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