CN110904177B - 一种猪血球多肽粉及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪血球多肽粉及其制备方法与应用，通过以下步骤制备而成：猪血预处理得到血球细胞；血球细胞破碎匀浆得到血球裂解液；酶解处理得到酶解液；灭酶后得到产品稀释液；浓缩处理后得到产品浓缩液；产品浓缩液经无菌过滤处理，冷冻干燥，粉碎和包装得到最终成品；其中，血球细胞破碎匀浆中采用超低温冻结，及低温解冻技术，能够最大程度的释放猪血中卟啉铁，使得最终的猪血球多肽粉获得高含量的卟啉铁，猪血肽粉对缺铁性贫血具有预防和治疗作用。

Description

一种猪血球多肽粉及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种猪血利用制备方法，尤其是一种猪血球多肽粉及其制备方法与应用。

背景技术

缺铁性贫血(iron deficiency anemia,IDA)是指体内贮存铁不足，影响血红蛋白合成所引起的一种小细胞低色素性贫血。其最主要的病因为营养不良和慢性消耗性疾病所致。IDA的治疗原则是根治病因和补足贮铁。补足贮铁的治疗性铁剂有无机铁和有机铁两类。无机铁以硫酸亚铁为代表，有机铁则包括右旋糖酐铁、葡萄糖酸亚铁、山梨醇铁、富马酸亚铁、多糖铁复合物和卟啉铁等。其中，卟啉铁作为铁质强化剂，具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒以及胃肠刺激等不良反应等优点。

卟啉铁，又名氯化血红素，其化学性质与血红素类似。氯化血红素为结晶或粉末，透光为黑褐色，折光为钢蓝色，无臭无味，不溶于水及醋酸，微溶于70％～80％乙醇，溶于酸性丙酮，溶于稀氢氧化钠溶液，于氢氧化钠溶液中生成羟高铁血红素。猪血中含有丰富的卟啉铁。现有的猪血球肽普遍采用的提取方法一般包括离心分离、变性、酶解、灭酶、过滤、脱色、调配、杀菌和包装，得到成品。在加酶进行水解之前，血球并未进行破碎处理，导致酶解速度慢、效率低，而且水解不彻底不仅造成原料浪费，另外也降低了产品收率；变性、灭酶及杀菌一般采用高温的方式，会导致产品中活性多肽活力的下降甚至丧失；反复进行pH的调节操作，引入大量无机盐；脱色过程一般采用活性炭粉吸附，在除去色素类物质的同时也会除去部分小分子肽和绝大部分卟啉铁。因此，传统生产工艺生产出来的猪血球肽的卟啉铁损耗大、收率低，而且生产过程中高温处理较多，使得产品在功效上亦得不到有效保证。

目前，临床上对是否发生缺铁性贫血主要依据血液中红细胞数量和血红蛋白含量以及镜检视野中红细胞形态来判定。本发明提供的猪血球多肽粉是否具备预防及改善缺铁性贫血，将通过本发明提供的动物实验来验证，实验过程中对实验动物的血红细胞数量、血红蛋白含量、血氧饱和度、网织红细胞百分比和体重进行监测。验证结果表明，本发明提供的制备方法生产出的猪血球，很大程度上保留了猪血红细胞中的卟啉铁，并含有丰富的源自红细胞水解产生的活性多肽，可以有效改善缺铁性贫血的相关症状。

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质(Hemoglobin,Hb/HGB)。血红蛋白(Hb)由珠蛋白和亚铁血红素结合而成。血液呈现红色就是因为其中含有亚铁血红素的缘故。而亚铁血红素是由卟啉和铁离子合成，具体合成机制是：血浆转铁蛋白是由肝细胞合成的β1-球蛋白，每个转铁蛋白可结合2个铁离子(Fe³⁺)。其功能是将铁离子输送到全身各组织，将其送到贮存处。

血红蛋白分子中的Fe²⁺在氧分压高时，与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO²)；在氧分压低时，又与氧解离，释放出O²，成为还原血红蛋白，由此实现运输氧的功能。血红蛋白中Fe^{2 +}如果被氧化成Fe³⁺，称高铁血红蛋白，则丧失携带O²的能力。当人体内亚铁离子贮存不足，外界铁摄入量又不够时，会导致血红蛋白合成受阻，红细胞的数量和血红蛋白的含量减少到一定程度时会发生贫血。

血氧饱和度(SpO₂)是指在血液中被氧结合的氧合血红蛋白(HbO²)的容量占全部可结合的血红蛋白(Hb)容量的百分比，医学上多采用功能饱和度来反应血液中的氧含量的变化，是衡量血液携带运送氧气的重要指标，如右式所示：

其中，C(HbO2)和C(Hb)为血液中氧合血红蛋白和还原血红蛋白的浓度。健康人体内动脉血的血氧饱和度一般都高于94％，当血氧饱和度低于90％时称为低氧血症，可用来判断血液中血红蛋白是否具有正常的携氧能力。

网织红细胞(Reticulocyte,Rtc)是尚未完全成熟的红细胞，在外周血中的数量可以反映骨髓造血功能，因而对血液病的诊断和治疗有重要意义。网织红细胞含有少量核糖核酸(RNA)，用煌焦油蓝染色时呈网状，故名网织红细胞。正常人外周血中网织红细胞在红细胞中占比很少，成年人和儿童的网织红细胞占比为0.5-1.5％，新生儿的网织红细胞占比为2.0-6.0％，如有增加，表示红细胞增生(如急性溶血，多数溶血性贫血和其他增生性贫血)，如处于贫血却仍不见增生，可能是重度再生障碍性贫血。采用抗贫血治疗后明显上升，表示治疗有效，反之效果欠佳。因此网织红细胞的总数或百分比对贫血的临床诊断及疗效观察非常有价值。

铁离子作为血红蛋白合成不可或缺的一种原料，主要通过外部饮食获取。很多研究人员利用低铁饲料辅助放血的方式成功地建立了大鼠缺铁性贫血模型，证明该造模方式简单快速且有效，所以我们通过低铁饲料和去离子水喂养的方式来构建大鼠缺铁性贫血模型。促红细胞生成素(EPO)能促进骨髓内干细胞加速分化为原始红细胞，促进有核红细胞的有丝分裂，促其加速成熟，促进血红蛋白的合成，以及促进骨髓内网织红细胞和成熟红细胞的释放，大鼠试验中将EPO用来作为阳性对照注射药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型高强猪血球多肽粉的制备方法，其技术方案如下：

(1)猪血预处理：将检验合格的新鲜猪血做抗凝处理，离心分离后，取下层沉淀，得到血球细胞；

(2)血球细胞破碎匀浆：将所述血球细胞置于第一温度下冻结，再于第二温度下解冻，再次经物理破碎匀浆，得到血球裂解液；

(3)酶解处理：碱性蛋白酶加入所述血球裂解液中，添加量为所述血球裂解液质量的0.08-0.12％，pH8.5-9.5，处理1.5-2.5h后得到酶解液；

(4)灭酶：所述酶解液pH调回至5.8-6.2，固液分离得到上清液；所述上清液采用膜过滤后得到产品稀释液；

(5)后处理：将所述产品稀释液进行浓缩处理后得到产品浓缩液，再经无菌过滤，冷冻干燥，粉碎和包装得到猪血球多肽粉产品。

本发明还提供了一种猪血球多肽粉。

本发明还提供了一种猪血球多肽粉在制备预防及改善缺铁性贫血食品、保健品或药品中的应用。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、本发明提供的实施例猪血肽粉中卟啉铁含量(220-240mg/g)显著高于对比例(110-147mg/g)，说明通过本发明提供的制备方法能够获得高含量卟啉铁的猪血球多肽粉。

2、在大鼠实验中，利用低铁饲料和去离子水喂养的方法成功构建了大鼠缺铁性贫血模型，研究了猪血肽粉对缺铁性贫血的药效学作用，各组大鼠的血常规及血氧饱和度检测结果显示，实施例猪血肽给药大鼠相对对比例和生理盐水(阴性对照)大鼠红细胞数和血红蛋白有着明显差异，红细胞数和血红蛋白含量用药后均恢复到正常范围，说明猪血肽粉对缺铁性贫血有治疗作用。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为灌服血肽预防缺铁性贫血的大鼠外周血红细胞计数结果；

图2为灌服血肽治疗缺铁性贫血的大鼠外周血红细胞计数结果；

图3为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠的外周血血红蛋白含量结果；

图4为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠外周血血红蛋白含量结果；

图5为灌服猪血肽粉的预防缺铁性贫血大鼠外周血网织红细胞镜检计数结果；

图6为灌服猪血肽粉的治疗缺铁性贫血大鼠外周血网织红细胞镜检计数结果；

图7为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠血氧饱和度结果；

图8为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠血氧饱和度结果；

图9为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠体重结果；

图10为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠体重结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例一猪血球多肽粉的制备

为获得满足要求的猪血球多肽粉，将新鲜猪血经过预处理、血球细胞破碎匀浆、酶解处理、灭酶、浓缩和成品制备的步骤来实现，具体如下：

(1)猪血预处理：将检验合格的新鲜猪血加入柠檬酸钠做抗凝处理，其中，添加的柠檬酸钠溶液中质量百分比为3％，柠檬酸钠与猪血球的添加质量比例为1:9-12；再于4℃下2500-3500r/min转速离心10-15min后，取下层沉淀，得到血球细胞。

(2)血球细胞破碎匀浆：将血球细胞置于-20℃环境中放置进行冻结，再于4℃环境中使其解冻，得到血球细胞已大量破碎的原料液；将原料液再次物理破碎匀浆，得到血球裂解液；其中冻结的时间不小于12h，解冻的时间不小于4h；物料破碎的方式采用匀浆机进行处理，如PT2500E台式匀浆机。

(3)酶解处理：碱性蛋白酶加入血球裂解液中，添加量为血球裂解液质量的0.08-0.12％，pH8.5-9.5，处理1.5-2.5h后得到酶解液，处理过程维持体系温度为50-60℃。具体的碱性蛋白酶，可以列举如糜碱性蛋白酶、枯草杆菌碱性蛋白酶、面包酵母碱性蛋白酶、灰色链霉菌碱性蛋白酶、直丝链霉菌蛋白酶、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶。

(4)灭酶：所述酶解液pH调回至5.8-6.2，转速>20000r/min，离心10min以上，温度在20-30℃，得到上清液；所述上清液采用膜过滤后得到产品稀释液，过滤过程中控制料液及环境温度为20-30℃；其中膜孔径大于3000D。

(5)后处理：将所述产品稀释液进行浓缩处理后得到产品浓缩液，以采用膜过滤设备进行浓缩，膜孔径为100-300D；再将浓缩液经0.22μm滤芯无菌过滤处理，冷冻干燥，粉碎和包装得到最终猪血球多肽粉成品。

通过上述步骤得到6个实施例1-6样品，其处理过程中的参数分别不同，实施例2-5在酶解处理前，先将血球裂解液置于50-65℃环境下2h，进行变性处理后，再加入碱性蛋白酶进行酶解处理。实施例1-6中，第一温度为不大于-20℃，第二温度为2-8℃；冻结时间为不小于12h，解冻的时间不少于4h。

另外，还通过上述步骤得到3个对比例1-3样品，对比例1、2均采用本发明提供的大致步骤，但是其过程控制不在本发明控制范围内，其中对比例3采用现有的提取方法。采用高效液相色谱法测定浓缩液中卟啉铁含量。

对比例3的猪血肽粉提取方法为：

经抗凝处理(同上)的新鲜猪血经离心分离得到猪血球部分，加一倍水后90℃加热变性1h后加原料指标0.1％的碱性蛋白酶，60℃下酶解2h，过程中维持pH8.0-8.5，结束后将pH调回6.5，煮沸10min灭酶，结束后过滤得到稀释液，浓缩至45-50％浓度后喷雾干燥得到成品粉末。

如表1可见，实施例1-6最终浓缩液中卟啉铁含量为220-240mg/g，对比例1-3最终浓缩液中卟啉铁含量为110-147mg/g左右，实施例最终的浓缩液中卟啉铁含量显著高于对比例，说明通过本发明提供的制备方法能够获得高含量卟啉铁的猪血球多肽粉，减少其提取过程中的损失，为其作为预防和改善缺铁性贫血症的猪血球多肽粉提供可能，通过进一步的实施例二对其在预防和改善缺铁性贫血症的作用和功效来进行验证。

表1猪血球多肽粉的制备

实施例二猪血肽粉的对缺铁性贫血的药效学作用

一)制备缺铁性贫血模型及用药方案

将Sprague-Dwley(SD)大鼠用基础饲料和正常饮水适应性饲养三天后，缺铁性贫血模型大鼠(实验组为A、B、C、D)改用低铁饲料并辅以去离子水饲养，正常对照大鼠(对照组为E)以正常饲料喂养，缺铁性贫血模型大鼠中所有预防组大鼠(A1、B1、C1、D1)于造模同时开始给药，缺铁性贫血模型大鼠中所有治疗组大鼠(A2、B2、C2、D2)在血红蛋白含量低于100g/L后(判定为贫血)开始用药。除促红细胞生成素(EPO)组每两天腹腔注射给药一次外，其余各组每天灌服猪血球多肽粉或生理盐水一次，具体灌服的产品为实施例1-6和对比例3获得的猪血球多肽粉，各组方案和剂量见表2所示，正常对照(n＝6)大鼠不给药。

表2：各组大鼠给药方案和剂量

组别(n＝6)	给药方案	用药剂量和用法
			A1	生理盐水预防阴性对照	/
A2	生理盐水治疗阴性对照	/
			B1	EPO预防阳性对照	100U/kg，每2天1次
B2	EPO治疗阳性对照	100U/kg，每2天1次
			C1	对比例3多肽粉预防	100mg/kg，每天1次
C2	对比例3多肽粉治疗	100mg/kg，每天1次
			D1	实施例1-6多肽粉预防	100mg/kg，每天1次
D2	实施例1-6多肽粉治疗	100mg/kg，每天1次
			E	正常对照	/

二)疗效评价

血常规检查：每周用剪尾方式收集血液标本一次，采用2.5％EDTA-2Na溶液体积比1:9抗凝处理，完成血常规检测，包括血细胞数和血红蛋白含量检测。

血氧饱和度测定：将大鼠腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉后，从腹主动脉采血，采用2.5％EDTA-2Na溶液体积比1:9抗凝，完成血氧饱和度测定。

网织红细胞观察计数：将血常规采得的血液一部分和网织红细胞染色液(煌焦油蓝)1:1体积混合，37℃下放置15-20min，制成血涂片，在显微镜下观察并计数网织红细胞。

体重变化测定：在实验过程中每周用电子天平对大鼠进行称重，记录整个实验过程中大鼠体重的变化。

三)结果

外周血红细胞数结果

请参阅图1、图2，其为各组外周血红细胞数量测定结果，图1为灌服血肽预防缺铁性贫血的大鼠外周血红细胞计数结果；图2为灌服血肽治疗缺铁性贫血的大鼠外周血红细胞计数结果；

图1、图2中的5.6虚线为正常范围(5.6-7.89×10¹²/L)参考下限，4.7虚线为贫血参考线(4.7×10¹²/L)。

图1所示，血肽预防各组大鼠中，实施例1-6和对比例3血肽血肽灌服后，大鼠外周血红细胞数量呈现上升趋势，并在第五和第四周分别达到正常计数范围,实施例1-6血肽组大鼠在第五周继续上升，在实验期间，实施例1-6血肽组大鼠红细胞数明显高于对比例3组大鼠；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数不断下降并从第二周起一直处于4.59-4.67×10¹²/L之间；EPO阳性对照大鼠给药后红细胞数量迅速上升并在第三周达到5.68×10¹²/L；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终在5.68-6.0×10¹²/L。

图2所示，血肽治疗各组大鼠中，实施例1-6和对比例3血肽血肽灌服后，大鼠外周血红细胞数量持续上升，并在第四周达到正常范围，第五周均继续上升，在实验期间，实施例1-6血肽组大鼠红细胞数明显高于对比例3组大鼠；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数一直处于4.42-4.79×10¹²/L之间；EPO阳性对照大鼠灌服后红细胞数量迅速上升并在第三周达到5.92×10¹²/L；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终在5.68-6.0×10¹²/L。

血红蛋白含量测定结果

请参阅图3、图4，图3为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠的外周血血红蛋白含量，图4为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠外周血血红蛋白含量；图中120虚线为正常范围(120-150g/L)，100虚线为贫血参考线(100g/L)。

图3所示，血肽预防各组大鼠中，经血肽灌服后，大鼠血红蛋白含量开始持续上升，实施例1-6和对比例3血肽血肽组大鼠分别在第五周和第四周恢复至正常范围，并且实施例1-6血肽组在第五周继续上升，实验期间实施例1-6血肽组大鼠血红蛋白含量显著高于对比例3组大鼠；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白在实验期间含量不断下降，从第二周开始一直始终处于88.7±3.50-98.2±3.97g/L；EPO阳性对照大鼠注射给药后血红蛋白含量迅速上升并在第四周达到129±5.2g/L；正常对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终在118.2±2.79-124.8±5.46g/L。

图4所示，血肽治疗各组大鼠中，经血肽灌服后，大鼠血红蛋白含量开始持续上升，实施例1-6和对比例3血肽血肽组大鼠分别在第五周和第四周恢复至正常范围，并且实施例1-6血肽组在第五周继续上升，实验期间实施例1-6血肽组大鼠血红蛋白含量显著高于对比例3组大鼠；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白在实验期间含量不断下降，从第二周开始一直始终处于88.7±3.50-98.2±3.97g/L；EPO阳性对照大鼠注射给药后血红蛋白含量迅速上升并在第四周达到129±5.2g/L；正常对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终在118.2±2.79-124.8±5.46g/L。

在实验过程中，生理盐水对照大鼠红细胞和血红蛋白含量持续下降，EPO对照大鼠红细胞和血红蛋白含量均迅速上升至正常范围。血肽预防及治疗各剂量组大鼠红细胞和血红蛋白含量最终均恢复到正常范围，且显著高于生理盐水阴性对照大鼠(P<0.05)。

外周血网织红细胞镜检计数结果

请参阅图5、图6，图5为灌服猪血肽粉的预防缺铁性贫血大鼠外周血网织红细胞镜检计数；图6为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠外周血网织红细胞镜检计数。

SD大鼠外周血网织红细胞计数参考范围为2.25-2.63％，如图5所示，对比例3血肽和实施例1-6血肽预防组大鼠外周血液中网织红细胞在灌服血肽一周后，即第二周各组大鼠外周血网织红细胞数均大幅度上升，然后逐步下降；生理盐水大鼠前三周基本不变，第四周降至0.97±0.17％；如图6所示，灌服一周后各治疗组大鼠均出现较大幅度上升，之后迅速下降；生理盐水大鼠前三周基本不变，第四周降至0.79±0.13％。说明在灌服治疗后，有大量新生红细胞生成，大鼠的贫血状态发生了一定程度的改善。

大鼠血氧饱和度结果

请参阅图7、图8，图7为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠血氧饱和度，图8为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠血氧饱和度。

实验结束后，经大鼠腹腔主动脉采血测得经血肽预防和治疗后大鼠血氧饱和度均高于(>95％)阴性对照大鼠(P<0.05)，和EPO阳性对照及正常饮食对照大鼠持平。说明用药后上升的血红蛋白具备正常的携氧能力。

大鼠体重结果

请参阅图9、图10，图9为灌服猪血肽粉预防缺铁性贫血大鼠体重，图10为灌服猪血肽粉治疗缺铁性贫血大鼠体重。

综上，在试验中利用低铁饲料和去离子水喂养的方法成功构建了大鼠缺铁性贫血模型，研究了猪血肽粉对缺铁性贫血的药效学作用，各组大鼠的血常规及血氧饱和度检测结果显示，实施例1-6猪血肽给药大鼠相对对比例3和生理盐水(阴性对照)大鼠红细胞数和血红蛋白有着明显差异，红细胞数和血红蛋白含量用药后均恢复到正常范围，说明猪血肽粉对缺铁性贫血有治疗作用。

Claims (8)

1.一种猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)猪血预处理：将检验合格的新鲜猪血做抗凝处理，离心分离后，取下层沉淀，得到血球细胞；

(2)血球细胞破碎匀浆：将所述血球细胞置于第一温度下冻结，再于第二温度下解冻，再次经物理破碎匀浆，得到血球裂解液，其中所述第一温度为不大于-20℃，所述第二温度为2-8℃；

(3)酶解处理：先将所述血球裂解液置于50-65℃环境下2h，进行变性处理后，再置于酶解温度调节下适应1-2h后，将碱性蛋白酶加入所述血球裂解液中，添加量为所述血球裂解液质量的0.08-0.12％，pH8.5-9.5，处理1.5-2.5h后得到酶解液；

(4)灭酶：所述酶解液pH调回至5.8-6.2，固液分离得到上清液；所述上清液采用膜过滤后得到产品稀释液；

(5)后处理：将所述产品稀释液进行浓缩处理后得到产品浓缩液，再经无菌过滤，冷冻干燥，粉碎和包装得到猪血球多肽粉产品。

2.根据权利要求1所述的猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，所述第一温度为-30℃以下，所述第二温度为4℃。

3.根据权利要求1-2任一项所述的猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，所述冻结时间为不小于12h，所述解冻的时间不少于4h。

4.根据权利要求1所述的一种猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，所述抗凝处理中，添加的柠檬酸钠溶液中质量百分比为3％，所述柠檬酸钠与猪血球的添加质量比例为1:9。

5.根据权利要求1所述的一种猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，所述酶解处理维持体系温度为50-60℃。

6.根据权利要求1所述的一种猪血球多肽粉的制备方法，其特征在于，所述灭酶过程中的膜截留分子量大于3000D；所述浓缩处理方式为采用膜过滤设备浓度，其膜截留分子量为100-300D。

7.权利要求1-6任一项所述的方法制备的猪血球多肽粉。

8.如权利要求7所述的猪血球多肽粉在制备预防及改善缺铁性贫血食品、保健品或药品中的应用。

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