CN117126909A - 从动物血液制备血红蛋白肽的方法及制得的血红蛋白肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从动物(例如猪、鳄鱼)血液制备血红蛋白肽的方法。该方法对血球细胞破碎、酶解处理和灭酶处理三个主要环节的工艺条件进行了综合性调整，主要是综合地利用了超声处理。在血球细胞破碎步骤中，用中等功率的超声波处理血球细胞较短时间；在酶解处理步骤中，用相对较低的超声波功率处理较长时间促进酶解反应，以提高酶解的程度；在灭酶处理步骤中，用较高的超声波功率对酶解液处理较短的时间进行灭酶，可以沿用前面两个步骤中使用的超声波设备，简化处理工艺。本发明还提供所获得的血红蛋白肽，其经实验证明功效与抗贫血生物制品促红细胞生成素相当，但由于制备工艺简化而成本较为低廉，有望在食品、营养品或药品中得到使用。

Description

从动物血液制备血红蛋白肽的方法及制得的血红蛋白肽
技术领域
本发明涉及动物制品领域，具体涉及一种从动物血液制备血红蛋白肽的方法，以及通过该方法制得的血红蛋白肽。
背景技术
缺铁性贫血是人体内铁的储存不能满足正常红细胞生成的需要而发生的贫血，是由于铁摄入量不足、吸收量减少、铁利用障碍或丢失过多等造成血红蛋白合成减少所致。贫血患者多见面色苍白、身体乏力、倦怠、食欲差、头晕眼花、耳鸣等症状，严重的还会出现胸闷、心悸、心率加快及精神异常，如烦躁不安、易发脾气、注意力不集中、发育迟缓、智力低下等。缺铁性贫血已成为中国最常见的营养缺乏病之一。中国第四次营养调查结果表明，中国居民缺铁性贫血患病率为20.1％，其中2岁以下婴幼儿、60岁以上老年人和15～50岁育龄妇女的缺铁性贫血患病率分别为31.1％、29.1％和19.9％。
动物血液中的血红蛋白(Hb)是一种复合蛋白，其蛋白质部分称为珠蛋白(Gb)，其辅基是血红素(英文为Heme)。血红素由与亚铁(Fe2+)络合形成，因此血红素又称亚铁卟啉(见以下分子结构式)。一个Hb分子由4个血红素与一个珠蛋白组成。每个珠蛋白有4条多肽链，每条多肽链与一个血红素连接构成Hb的单体或亚单体。这样血红素与珠蛋白通过四键相结合，其中两个键是血红素上的两个丙酸基与珠蛋白结合，另两个是通过铁与珠蛋白中组氨咪唑环的氮形成配位键，当血红素与氧结合时，此配位键中的一个键便被氧取代。血红蛋白分子中的亚铁(Fe2+)在血液氧分压高时，与氧结合形成氧合血红蛋白(HBO2)，在血液氧分压低时，又与氧解离，释放出O2，成为还原血红蛋白，由此实现血液输氧的功能。
当人体内亚铁离子贮存不足，外界铁摄入量又不够时，血红蛋白合成受阻，血红蛋白含量和红细胞数量减少到一定程度就会发生贫血。因此，铁是合成血红蛋白的重要原料。治疗缺铁性贫血一方面要尽可能除去引起缺铁和贫血的原因，另一方面通过食用富含铁的食物或者服用补铁剂，补充足够量的铁以使体内铁的贮存量恢复至正常水平。传统的补铁剂是含铁的化学制剂，主要有硫酸亚铁、富马酸铁、葡萄糖酸亚铁等。这些补铁剂在人体内吸收利用率较低，对胃肠道有不同程度刺激作用，常常使患者食欲不振，且铁离子在血液中浓度过高，可导致体内铁负荷过重产生铁蓄积中毒。
目前医学界公认血红素为防治缺铁性贫血的生物铁源。血红素主要存在于动物的血液和肌肉中，是动物血液中的天然色素。血红素在动物体内与珠蛋白结合成复合蛋白，即(Hb)或(Mb)。在一定条件下，可使与珠蛋白。当血红素与珠蛋白脱离后，亚铁自动氧化成三价铁。因此纯亚铁血红素极难分离得到，从动物血液中提取的血红素产品一般是氯化高铁血红素(简称氯化血红素，英文为Hemin)。氯化血红素是天然的体外纯化形式，是纯天然的生物补铁剂，具有生物利用度高、无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等不良反应等优点。已有试验证实，氯化血红素在小肠内的吸收率高达25％～30％(非氯化血红素约为3％～8％)，这是因为氯化血红素以分子形式吸收，可直接被肠道黏膜摄取。而且，氯化血红素无铁腥味，不刺激胃肠，尤其是婴幼儿、孕妇首选的补血产品。
氯化血红素一般动物血液提取。我国动物养殖业发达，养殖的动物包括禽类动物如鸡、鸭、鹅等，畜类动物如猪、牛、羊等，还包括爬行动物如鳄鱼等。禽畜血液是禽畜养殖业重要副产物，为氯化血红素的生产提供了丰富的原料。尤其是，我国生猪养殖规模非常大，猪血资源极其丰富，是生产氯化血红素最易得的原料。一些特种养殖品种如鳄鱼等，用其血液生产氯化血红素，也是值得开发的保健品。
目前从血液制备氯化血红素的方法多数用到有机物质或者溶剂，例如冰醋酸法、丙酮法、羧甲基纤维素法、选择溶剂法、醇法、表面活性剂法等。这些有机物质或者溶剂多数为非食品级物质，影响其制备的氯化血红素在食品、营养品或药品中的应用。就此而言，用蛋白酶例如碱性蛋白酶处理血液血红蛋白制备氯化血红素是一种优选的方法。事实上，蛋白酶水解血红蛋白将生成包含氯化血红素和蛋白肽的水解产物，在本发明中将称之为血红蛋白肽。但是，从血液制备血红蛋白肽的整个环节涉及血液预处理、血球细胞破碎、酶解处理、灭酶处理和后处理环节，其中血球细胞破碎、酶解处理、灭酶处理是主要环节，目前仍存在血球细胞破碎手段较为单一、酶解处理程度较低，灭酶处理条件不够温和等缺点，血球细胞破碎的效率和酶解处理的程度仍有待提高，灭酶处理的条件仍有待完善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的从动物血液制备氯化血红素或血红蛋白肽的方法中，血球细胞破碎手段较为单一、酶解处理程度较低，灭酶处理条件不够温和等缺点，通过对血球细胞破碎、酶解处理和灭酶处理的工艺条件进行综合性调整，以期提高血球细胞破碎的效率和酶解处理的程度以及完善灭酶处理的条件，获得功效与抗贫血生物制品促红细胞生成素相当、但成本较为低廉的血红蛋白肽，以期用于食品、营养品或药品中。
因此，在第一方面，本发明提供一种从动物血液制备血红蛋白肽的方法，该方法包括以下步骤：
(1)血液预处理：将新鲜血液进行抗凝处理，然后进行离心分离，取包含血球细胞的下层沉淀；
(2)血球细胞破碎：将所得的下层沉淀进行超声处理，超声波功率为500～800W，超声波处理时间为3～5min，然后置于冷冻温度下处理第一时间，再置于解冻温度下处理第二时间，得到血球细胞裂解液；
(3)酶解处理：将血球细胞裂解液进行均浆处理后，加入碱性蛋白酶进行酶解反应，同时进行超声处理，超声波功率为200～300W，反应时间为1～2h，得到酶解液；
(4)灭酶处理：用超声波对酶解液进行灭酶处理，超声波功率为1000～1500W，超声波处理时间为3～5min，得到灭酶液；
(5)后处理：将灭酶液进行离心分离，取上清液进行浓缩，然后将浓缩液进行无菌过滤，得到血红蛋白肽无菌浓缩液。
在步骤(1)血液预处理步骤中，新鲜血液的抗凝处理可以采用本领域常规的血液抗凝方法。例如，可以向血液中添加EDTA-2Na或者柠檬酸钠作为抗凝剂。本发明优选使用柠檬酸钠，其添加量一般占新鲜血液的0.3重量％～0.5重量％。对抗凝血液的离心处理也是常规操作。例如，可以在4℃下以2500～3500rpm的转速离心10-20min。然后弃去上清液，取包含血球细胞的下层沉淀。
在(2)血球细胞破碎步骤中，用功率为500～800W的超声波处理包含血球细胞的下层沉淀3～5min。此超声波功率为中等功率，处理时间较短，处理条件相对温和，使血球细胞壁受到一定程度的损伤，有利于后续的冷冻-解冻过程裂解细胞。冷冻温度一般为-20℃～-30℃，第一时间一般为12～18h，解冻温度一般为2℃～8℃，第二时间一般为5～10h，目的是通过冷冻-解冻过程裂解细胞，使得细胞内容物释放出来，得到包含血红蛋白的血球细胞裂解液。
在(3)酶解处理步骤中，血球细胞裂解液的均浆处理可以用常规的均浆机进行，目的是使血红蛋白分离均匀。碱性蛋白酶的添加量一般占血球细胞裂解液的0.1重量％～0.2重量％，酶解反应的温度为50℃～60℃，pH为8.5～9.5。同时进行超声处理，超声波功率为200～300W，反应时间为1～2h。这是用相对较低的超声波功率处理较长时间促进酶解反应，以提高酶解的程度，使血红蛋白中的血红素与珠蛋白更大程度地分离，提高血红素的得率，并使珠蛋白更大程度地降解为小分子氨基酸，便于后续血红素的分离纯化。
在(4)灭酶处理步骤中，用超声波对酶解液进行灭酶处理，超声波功率为1000～1500W，超声波处理时间为3～5min，得到灭酶液。这是借鉴了巴氏灭菌法(以较高的温度处理较短的时间进行灭菌)，用较高的超声波功率对酶解液处理较短的时间进行灭酶。在此灭酶处理步骤中不用高温灭酶而采用超声波灭酶，主要是可以沿用上述步骤(2)和(3)中使用的超声波设备，不必使用高温处理设备，简化处理工艺。
在(5)后处理步骤中，将灭酶液进行离心分离，取上清液进行浓缩，然后将浓缩液进行无菌过滤，得到血红蛋白肽无菌浓缩液。离心分离、浓缩和无菌过滤都可以采用本领域的常规操作进行。例如，可以在10000～20000rpm的转速下离心10～20min，得上清液，然后可以用孔径200～300D的滤膜对上清液进行浓缩，得浓缩液，然后可以使浓缩液经0.22μm滤芯进行无菌过滤，得到血红蛋白肽无菌浓缩液。该血红蛋白肽无菌浓缩液可以用于制备液态的补铁食品、营养品，或者补铁注射剂。
在(5)后处理步骤中，还可以按需对所得的上清液先进行脱色处理，获得脱色的上清液，然后再进行浓缩和无菌过滤处理。常用的脱色处理方法是用活性炭过滤进行脱色，这是本领域熟知的。例如，可以将向上清液中加入2.0重量％～3.0重量％的活性炭，在温度50℃～60℃、pH 4.0～5.0下进行脱色处理1～1.5h。脱色血红蛋白肽浓缩液可以避免后续制备的铁食品、营养品或药品出现令人不快的红棕色，有利于消费者接受并服用。同时，在该后处理步骤中，还可以对所得的血红蛋白肽无菌浓缩液进行干燥处理，获得干燥血红蛋白肽粉剂。通常，干燥处理通过冷冻干燥进行，这是本领域熟知的。一般地，干燥血红蛋白肽粉剂的水分含量在2重量％以下为佳。干燥血红蛋白肽粉剂可以用于制备粉末或固体的补铁食品、营养品或药品。
本发明的从动物血液制备血红蛋白肽的方法适用于从各种动物的血液制备血红蛋白肽。通常，使用禽畜动物的血液。禽类动物例如鸡、鸭、鹅等，畜类动物例如猪、牛、羊等。从我国禽畜动物的养殖规模和区域来看，优选的动物是猪，因为猪血是量大易得的动物血液。但是，一些特种养殖品种如鳄鱼等，用其血液生产血红蛋白肽，也是值得开发的保健品。
在第二方面，本发明提供通过本发明的从动物血液制备血红蛋白肽的方法得到的血红蛋白肽在制备食品、营养品或药品中的用途。食品、营养品和药品行业有现成的将血红蛋白肽制备食品、营养品或药品的工艺，可以按需应用。本发明的有益效果：
本发明针对现有的从动物血液制备氯化血红素或血红蛋白肽的方法中，血球细胞破碎手段较为单一、酶解处理程度较低，灭酶处理条件不够温和等缺点，对血球细胞破碎、酶解处理和灭酶处理三个主要环节的工艺条件进行了综合性调整，主要是综合地利用了超声处理。首先，在血球细胞破碎步骤中，用中等功率的超声波处理包含血球细胞的下层沉淀较短时间，处理条件相对温和，使血球细胞壁受到一定程度的损伤，有利于后续的冷冻-解冻过程裂解细胞。其次，在酶解处理步骤中，用相对较低的超声波功率处理较长时间促进酶解反应，以提高酶解的程度，使血红蛋白中的血红素与珠蛋白更大程度地分离，提高血红素的得率，并使珠蛋白更大程度地降解为小分子氨基酸，便于后续血红素的分离纯化。再次，在灭酶处理步骤中，用较高的超声波功率对酶解液处理较短的时间进行灭酶，而不用高温灭酶，可以沿用前面两个步骤中使用的超声波设备，不必使用高温处理设备，简化处理工艺。因此，本发明能够提高血球细胞破碎的效率和酶解处理的程度以及完善灭酶处理的条件，所获得的血红蛋白肽经实验证明功效与抗贫血生物制品促红细胞生成素相当，但由于制备工艺简化而成本较为低廉，有望在食品、营养品或药品中得到使用。
附图说明
图1为本发明检测例中各组大鼠外周血红细胞数量测定结果，其中A图显示服用脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血红细胞计数，B图显示服用脱色肽治疗缺铁性贫血大鼠血液红细胞数量，C图显示服用未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠血液红细胞数量，D图显示服用未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠血液红细胞数量；
图2为本发明检测例中各组大鼠外周血血红蛋白含量测定结果，其中A图显示服用脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠血液血红蛋白含量，B图显示服用脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠血液血红蛋白含量，C图显示服用未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠血液血红蛋白含量，D图显示服用未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠血液血红蛋白含量；
图3为本发明检测例中各组大鼠动脉血液中血氧饱和度测定结果，其中A图显示服用脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠动脉血血氧饱和度，B图显示服用脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠动脉血血氧饱和度，C图显示服用未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠动脉血血氧饱和度，D图显示服用未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠动脉血血氧饱和度；
图4为本发明检测例中各组对照大鼠血涂片镜检结果，其中A图显示生理盐水预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，B图显示生理盐水治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片，C图显示EPO预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，D图显示EPO治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片；
图5为本发明检测例中脱色血红蛋白肽预防各组大鼠血涂片镜检结果，其中A图显示正常大鼠外周血涂片，B图显示50mg/kg剂量脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，C图显示100mg/kg剂量脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，D图显示200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片；
图6为本发明检测例中脱色血红蛋白肽治疗各组大鼠血涂片镜检结果，其中A图显示正常大鼠外周血涂片；B图显示50mg/kg剂量脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片；C图显示100mg/kg剂量脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片；D图显示200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片；
图7为本发明检测例中未脱色血红蛋白肽预防各组大鼠血涂片镜检结果，其中A图显示正常大鼠外周血涂片，B图显示50mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，C图显示100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片，D图显示200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠外周血涂片；
图8为本发明检测例中未脱色血红蛋白肽治疗各组大鼠血涂片镜检结果，其中A图显示正常大鼠外周血涂片，B图显示50mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片，C图显示100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片，D图显示200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠外周血涂片；
图9为本发明检测例中各组大鼠体重测定结果，其中A图显示服用脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠体重，B图显示服用脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血体重，C图显示服用未脱色血红蛋白肽预防缺铁性贫血大鼠体重，D图显示服用未脱色血红蛋白肽治疗缺铁性贫血大鼠体重。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、所采用的技术方案及所获得的有益效果更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：从猪血制备血红蛋白肽浓缩液和干粉剂
从屠宰场获得检验合格的新鲜猪血，取100g猪血，加入0.4g柠檬酸钠，搅拌均匀，使柠檬酸钠充分溶于猪血中。然后，将猪血在4℃下以3000rpm的转速离心15min，弃去上清液，取包含血球细胞的下层沉淀。
用功率为600W的超声波处理包含血球细胞的下层沉淀4min。然后，将下层沉淀在-25℃下冷冻18h，再在4℃下解冻8h，得到包含血红蛋白的血球细胞裂解液。
用台式均浆机对血球细胞裂解液进行均浆处理，然后调血球细胞裂解液的pH至9.0，按血球细胞裂解液的重量计加入0.15重量％的碱性蛋白酶，在55℃下进行酶解反应。在酶解过程中，同时以250W的超声波功率对血球细胞裂解液进行超声处理。酶解-超声处理共1.5h，得到酶解液。
以1250W功率的超声波对酶解液进行灭酶处理4min，得到灭酶液。将灭酶液在15000rpm的转速下离心15min，取上清液。用孔径250D的滤膜对上清液进行浓缩，接着使浓缩液经0.22μm滤芯进行无菌过滤，得到猪血血红蛋白肽无菌浓缩液。
将血红蛋白肽无菌浓缩液在冷冻干燥机中干燥至水分含量在2重量％以下，得到猪血血红蛋白肽干粉剂。
实施例2：从猪血制备血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂
按与实施例1相同的方式制备灭酶液，并对灭酶液进行离心获取上清液。
向上清液中加入2.5重量％的活性炭，调上清液的pH为4.5，在温度55℃下进行脱色处理1h，得到脱色的上清液。
然后再按实施例1的相同的方式进行浓缩、过滤灭菌和冷冻干燥，制得猪血血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂。
实施例3：从鳄鱼血制备血红蛋白肽浓缩液和干粉剂
从屠宰场获得检验合格的新鲜鳄鱼血，取100g鳄鱼血，加入0.4g柠檬酸钠，搅拌均匀，使柠檬酸钠充分溶于鳄鱼血中。然后，将鳄鱼血在4℃下以3000rpm的转速离心15min，弃去上清液，取包含血球细胞的下层沉淀。
用功率为800W的超声波处理包含血球细胞的下层沉淀3min。然后，将下层沉淀在-25℃下冷冻18h，再在4℃下解冻8h，得到包含血红蛋白的血球细胞裂解液。
用台式均浆机对血球细胞裂解液进行均浆处理，然后调血球细胞裂解液的pH至9.0，按血球细胞裂解液的重量计加入0.15重量％的碱性蛋白酶，在55℃下进行酶解反应。在酶解过程中，同时以300W的超声波功率对血球细胞裂解液进行超声处理。酶解-超声处理共1h，得到酶解液。
以1500W功率的超声波对酶解液进行灭酶处理3min，得到灭酶液。将灭酶液在15000rpm的转速下离心15min，取上清液。用孔径250D的滤膜对上清液进行浓缩，接着使浓缩液经0.22μm滤芯进行无菌过滤，得到鳄鱼血血红蛋白肽无菌浓缩液。
将血红蛋白肽无菌浓缩液在冷冻干燥机中干燥至水分含量在2重量％以下，得到鳄鱼血血红蛋白肽干粉剂。
实施例4：从鳄鱼血制备血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂
按与实施例3相同的方式制备灭酶液，并对灭酶液进行离心获取上清液。
向上清液中加入3.0重量％的活性炭，调上清液的pH为4.5，在温度50℃下进行脱色处理1h，得到脱色的上清液。
然后再按实施例3的相同的方式进行浓缩、过滤灭菌和冷冻干燥，制得鳄鱼血血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂。
实施例5：从鸡血制备血红蛋白肽浓缩液和干粉剂
从屠宰场获得检验合格的新鲜鸡血，取100g鸡血，加入0.4g柠檬酸钠，搅拌均匀，使柠檬酸钠充分溶于鸡血中。然后，将鸡血在4℃下以3000rpm的转速离心15min，弃去上清液，取包含血球细胞的下层沉淀。
用功率为500W的超声波处理包含血球细胞的下层沉淀5min。然后，将下层沉淀在-25℃下冷冻18h，再在4℃下解冻8h，得到包含血红蛋白的血球细胞裂解液。
用台式均浆机对血球细胞裂解液进行均浆处理，然后调血球细胞裂解液的pH至9.0，按血球细胞裂解液的重量计加入0.15重量％的碱性蛋白酶，在55℃下进行酶解反应。在酶解过程中，同时以200W的超声波功率对血球细胞裂解液进行超声处理。酶解-超声处理共2h，得到酶解液。
以1000W功率的超声波对酶解液进行灭酶处理5min，得到灭酶液。将灭酶液在15000rpm的转速下离心15min，取上清液。用孔径250D的滤膜对上清液进行浓缩，接着使浓缩液经0.22μm滤芯进行无菌过滤，得到鸡血血红蛋白肽无菌浓缩液。
将血红蛋白肽无菌浓缩液在冷冻干燥机中干燥至水分含量在2重量％以下，得到鸡血血红蛋白肽干粉剂。
实施例6：从鸡血制备血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂
按与实施例5相同的方式制备灭酶液，并对灭酶液进行离心获取上清液。
向上清液中加入2.0重量％的活性炭，调上清液的pH为4.5，在温度60℃下进行脱色处理1h，得到脱色的上清液。
然后再按实施例5的相同的方式进行浓缩、过滤灭菌和冷冻干燥，制得鸡血血红蛋白肽脱色浓缩液和脱色干粉剂。
检测例
本检测例采用实施例1制备的未脱色猪血血红蛋白肽干粉剂和实施例2制备的脱色猪血血红蛋白肽干粉剂，并以抗贫血生物制品促红细胞生成素(EPO)作为阳性对照药物，以大鼠血红细胞数量、血红蛋白含量、血氧饱和度(血液中被氧结合的氧合血红蛋白的容量占全部可结合的血红蛋白容量的百分比，是衡量血液携带运送氧气的重要指标)、红细胞形态和体重为指标，验证本发明的血红蛋白肽对贫血的预防和治疗效果。
1.实验材料
实施例1制备的未脱色猪血血红蛋白肽干粉剂(以下简称“未脱色血红蛋白肽”)；
实施例2制备的脱色猪血血红蛋白肽干粉剂(以下简称“脱色血红蛋白肽”)；
促红细胞生成素(EPO)(上海惠诚生物科技有限公司)；
SD大鼠(鼠来宝(武汉)生物科技有限公司)
低铁饲料(铁含量为8.4mg/kg，北京博泰宏达生物技术有限公司)；
基础饲料(斯莱康大小鼠繁殖料，上海斯莱克实验动物有限责任公司)。
2.实验仪器
血细胞分析仪(型号：BC-2800，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；
血气分析仪(EPOC血液分析系统，加拿大艾博科(Epocal)有限公司)；
光学显微镜；
电子天平。
3.实验分组
设阴性对照组、阳性对照组、低剂量血红蛋白肽组、中剂量血红蛋白肽组、高剂量血红蛋白肽组合正常对照组。除正常对照组，每组细分为预防组和治疗组，各血红蛋白肽组还再细分为脱色血红蛋白肽组和未脱色血红蛋白肽组。具体分组如下：
A：阴性对照组(A1生理盐水预防阴性对照；A2：生理盐水治疗阴性对照)；
B：阳性对照组(B1：促红细胞生成素(EPO)预防阳性对照；B2：促红细胞生成素(EPO)治疗阳性对照)；
C：低剂量血红蛋白肽组(C1：低剂量脱色血红蛋白肽预防；C2：低剂量脱色血红蛋白肽治疗；C3：低剂量未脱色血红蛋白肽预防；C4：低剂量未脱色血红蛋白肽治疗)；
D：中剂量血红蛋白肽组：(D1：中剂量脱色血红蛋白肽预防；D2：中剂量脱色血红蛋白肽治疗；D3：中剂量未脱色血红蛋白肽预防；D4：中剂量未脱色血红蛋白肽治疗)；
E：高剂量血红蛋白肽组(E1：高剂量脱色血红蛋白肽预防；E2：高剂量脱色血红蛋白肽治疗；E3：高剂量未脱色血红蛋白肽预防；E4：高剂量未脱色血红蛋白肽治疗)；
F：正常对照组。
4.模型构建
通过低铁饲料和去离子水喂养的方式来构建大鼠缺铁性贫血模型。具体地，将SD大鼠用基础饲料和正常饮水适应性饲养三天后，对造模大鼠(A、B、C、D、E组)改用低铁饲料并辅以去离子水饲养，正常对照组大鼠(F)不变。
5.处理方案
造模大鼠中，所有预防组大鼠(A1、B1、C1、C3、D1、D3、E1、E3)与造模同时开始给予血红蛋白肽，所有治疗组大鼠(A2、B2、C2、C4、D2、D4、E2、E4)在血红蛋白含量普遍低于100g/L后(判定为贫血)开始给予血红蛋白肽，每天给药一次，正常对照大鼠不给药。各处理组(n＝6)给药方案和剂量见表1所示。
表1.各处理组(n＝6)给药方案和剂量
6.检测方法
6.1血常规检查
每周采取剪尾方式收集血液标本，采用2.5％ EDTA-2Na溶液体积比1:9抗凝，用血细胞分析仪测定红细胞数量，用血气分析仪测定血红蛋白含量，完成血常规检测。
6.2血氧饱和度测定
将大鼠腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉后，从腹主动脉采血，采用2.5％EDTA-2Na溶液体积比1:9抗凝，用血气分析仪测定血氧饱和度。
6.3红细胞形态观察
将大鼠腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉后，从腹主动脉采血，采用2.5％EDTA-2Na溶液体积比1:9抗凝，制成血涂片，在光学显微镜下观察细胞形态。
6.4体重变化测定
在实验过程中每周用电子天平对大鼠进行称重，记录整个实验过程中大鼠体重的变化。
7.结果
7.1血常规检查结果
7.1.1红细胞数量测定结果
如图1A所示，脱色预防各组大鼠中，50mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后大鼠红细胞数量在第二周略有下降，之后持续上升，并在第四周恢复至正常范围(≥5.6×1012/L)；100mg/kg剂量给药后红细胞数量持续上升，并在第三周恢复至正常范围；200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后大鼠红细胞数量在第二周略有下降，之后持续上升，并在第三周恢复至正常范围；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数不断下降，并从第二周起一直位于贫血参考线(4.7×1012/L)以下；EPO阳性对照大鼠给药后红细胞数量迅速上升，并在第三周恢复至正常范围；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终平稳在正常范围内，波动不大。
如图1B所示，脱色治疗各组大鼠中，50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠红细胞数均从贫血参考线(4.7×1012/L)以下持续上升，并在第四周恢复至正常范围(≥5.6×1012/L)；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数在实验期间始终位于贫血参考线以下；EPO阳性对照大鼠给药后红细胞数量迅速上升，并在第三周恢复至正常范围；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终平稳在正常范围内，波动不大。
如图1C所示，未脱色预防各组大鼠中，50mg/kg和100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后大鼠红细胞数量呈现波折式上升，并在第四周恢复至正常范围(≥5.6×1012/L)；200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后红细胞数量持续上升，并在第三周恢复至正常范围；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数不断下降，并从第二周起一直位于贫血参考线(4.7×1012/L)以下；EPO阳性对照大鼠给药后，红细胞数量迅速上升，并在第三周恢复至正常范围；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终平稳在正常范围内，波动不大。
如图1D所示，未脱色治疗各组大鼠中，50mg/kg和100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后大鼠红细胞数量均从贫血参考线(4.7×1012/L)以下持续上升，并在第四周恢复至正常范围(≥5.6×1012/L)；200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后大鼠红细胞数量持续上升，并在第三周恢复至正常范围；生理盐水阴性对照大鼠红细胞数不断下降，并从第二周起一直位于贫血参考线以下；EPO阳性对照大鼠给药后红细胞数量迅速上升，并在第三周恢复至正常范围；正常对照大鼠红细胞数在实验期间始终平稳在正常范围内，波动不大。
7.1.2血红蛋白含量测定结果
如图2A所示，脱色预防各组大鼠中，50mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量前三周内持续下降，并在第四周上升至正常范围(≥120g/L)；100mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量持续上升，并在第五周恢复到正常范围；200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量在第一周略有下降后，从第二周开始持续上升到接近正常范围；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白含量不断下降，从第二周开始一直低于贫血参考线(100g/L)；EPO阳性对照大鼠给药后，血红蛋白含量迅速上升，并在第四周恢复至正常范围；正常对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终在正常范围内。
如图2B所示，脱色治疗各组大鼠中，50mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量从贫血参考线(100g/L)以下呈现波折式上升，并在第四周恢复至正常范围(≥120g/L)；100mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量从贫血参考线以下开始上升，在第三周略有下降，之后持续上升至接近正常范围；200mg/kg剂量脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量持续上升至接近正常范围；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终位于贫血参考线以下，并呈现波折式下降；EPO阳性对照大鼠给药后，血红蛋白含量迅速上升，并在第四周恢复至正常范围；正常对照大鼠在实验期间血红蛋白含量始终维持在正常范围内。
如图2C所示，未脱色预防各组大鼠中，50mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量开始上升，第三周有所下降，在第四周恢复至正常范围(≥120g/L)；100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量在第二周有所下降，之后持续上升，并在第五周恢复至正常范围；200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量平稳上升，并在第五周恢复至正常范围；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白含量不断下降，从第二周开始一直低于贫血参考线(100g/L)；EPO阳性对照大鼠给药后，血红蛋白含量迅速上升，并在第四周恢复至正常范围；正常对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终在正常范围内。
如图2D所示，未脱色治疗各组大鼠中，50mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量从贫血参考线(100g/L)以下持续上升，并在第四周恢复至正常范围(≥120g/L)；100mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量从贫血参考线以下持续上升，并在第五周恢复至正常范围；200mg/kg剂量未脱色血红蛋白肽给药后，大鼠血红蛋白含量从贫血参考线以下持续上升，在第四周略有下降后继续上升至正常范围；生理盐水阴性对照大鼠血红蛋白含量实验期间始终位于贫血参考线以下，并呈现波折式下降；EPO阳性对照大鼠给药后血红蛋白含量迅速上升，并在第四周恢复至正常范围；正常对照大鼠在实验期间血红蛋白含量始终维持在正常范围内。
7.1.3小结
在造模过程中，生理盐水对照大鼠的红细胞数量和血红蛋白含量持续下降，EPO对照大鼠的红细胞数量和血红蛋白含量均迅速上升至正常范围。脱色及未脱色血红蛋白肽预防及治疗各剂量组大鼠红细胞数量和血红蛋白含量最终均恢复到正常范围，且显著高于生理盐水阴性对照大鼠，效果与EPO相似。总的来看，未脱色血红蛋白肽的效果要好于脱色血红蛋白肽的效果，预防组的效果要好于治疗组的效果。
7.2血氧饱和度测定结果
由图3可见，实验结束后经大鼠腹腔主动脉采血测得脱色及未脱色血红蛋白肽的预防和治疗大鼠血氧饱和度均高于阴性对照大鼠，与EPO阳性对照及正常饮食对照大鼠持平，说明血红蛋白肽用药后上升的血红蛋白具备正常的携氧能力。
7.3红细胞形态观察结果
由图4至图8可见，各组大鼠腹主动脉采血制得血涂片镜检结果显示，EPO、脱色及未脱色血红蛋白肽预防和治疗各组大鼠红细胞形态正常，阴性生理盐水对照大鼠红细胞中央淡染区有部分扩大。
7.4体重变化测定结果
由图9可见，实验各组大鼠体重均比正常对照组略低，各组间差异不大。
7.5实验总结
本检测例利用低铁饲料和去离子水喂养的方法成功构建了大鼠缺铁性贫血模型，研究了脱色及未脱色血红蛋白肽对缺铁性贫血的预防和治疗作用。各组大鼠的血常规(红细胞数量、血红蛋白含量)、血氧饱和度、红细胞形态和体重变化的检测和观察结果显示，脱色及未脱色血红蛋白肽给药大鼠与生理盐水(阴性对照)大鼠有明显差异，与EPO(阳性对照)给药大鼠相似，说明本发明的血红蛋白肽可以明显提高SD大鼠红细胞数量和血红蛋白含量，对于缺铁性贫血具有预防和治疗作用。
以上应用了具体实施例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液预处理：将新鲜血液进行抗凝处理，然后进行离心分离，取包含血球细胞的下层沉淀；
(2)血球细胞破碎：将所得的下层沉淀进行超声处理，超声波功率为500～800W，超声波处理时间为3～5min，然后置于冷冻温度下处理第一时间，再置于解冻温度下处理第二时间，得到血球细胞裂解液；
(3)酶解处理：将血球细胞裂解液进行均浆处理后，加入碱性蛋白酶进行酶解反应，同时进行超声处理，超声波功率为200～300W，反应时间为1～2h，得到酶解液；
(4)灭酶处理：用超声波对酶解液进行灭酶处理，超声波功率为1000～1500W，超声波处理时间为3～5min，得到灭酶液；
(5)后处理：将灭酶液进行离心分离，取上清液进行浓缩，然后将浓缩液进行无菌过滤，得到血红蛋白肽无菌浓缩液。
2.根据权利要求1所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述冷冻温度为-20℃～-30℃，所述第一时间为12～18h，所述解冻温度为2℃～8℃，所述第二时间为5～10h。
3.根据权利要求1所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述抗凝处理为向所述新鲜血液添加柠檬酸钠，柠檬酸钠添加量占所述新鲜血液的0.3重量％～0.5重量％。
4.根据权利要求1所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的添加量占所述血球细胞裂解液的0.1重量％～0.2重量％，所述酶解反应的温度为50℃～60℃，pH为8.5～9.5。
5.根据权利要求1所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述后处理还包括对所述上清液进行浓缩之前先进行脱色处理，以最终获得脱色血红蛋白肽无菌浓缩液。
6.根据权利要求5所述所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述脱色处理通过活性炭进行。
7.根据权利要求1所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述后处理还包括对所得的血红蛋白肽无菌浓缩液进行干燥处理，获得干燥血红蛋白肽粉剂。
8.根据权利要求7所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述干燥处理通过冷冻干燥进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法，其特征在于，所述动物为猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅或者鳄鱼。
10.通过根据权利要求1-9中任一项所述的从动物血液制备血红蛋白肽的方法得到的血红蛋白肽在制备食品、营养品或药品中的用途。
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