ES2856850T3

ES2856850T3 - Uso de sedoheptulosa como suplemento nutricional

Info

Publication number: ES2856850T3
Application number: ES14711752T
Authority: ES
Inventors: Arvand Haschemi; Oswald Wagner; Csörsz Nagy; Rodrig Marculescu
Original assignee: Medizinische Universitaet Wien
Current assignee: Medizinische Universitaet Wien
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2034-03-21
Also published as: BR122020014023B1; EP2781218A1; AU2014234229B2; ZA201506564B; US20190069588A1; AU2019202147B2; BR112015023730B1; ES2856850T8; AU2014234229A1; JP6611702B2; AU2019202147A1; JP2016512704A; CN105307659A; US10130117B2; EP3747444A2; BR112015023730A2; WO2014147213A1; NZ711528A; PL2976088T3; US9675099B2

Abstract

Uso de sedoheptulosa como un inductor nutricional del consumo de oxígeno celular, en el que los usos terapéuticos en el cuerpo humano y animal están excluidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de sedoheptulosa como suplemento nutricional

La presente invención se refiere al sector de los suplementos nutricionales.

Un suplemento nutricional, también conocido como suplemento alimenticio o suplemento dietético, es una preparación prevista para suplementar la dieta y proporcionar nutrientes, tales como vitaminas, minerales, fibra, ácidos grasos o aminoácidos que pueden faltar o no ser consumidos en suficientes cantidades en la dieta de una persona. Algunos países definen los suplementos dietéticos como alimentos, mientras que en otros, se definen como fármacos o productos para la salud naturales.

Los suplementos que contienen vitaminas o minerales dietéticos se incluyen como una categoría de alimentos en el Codex Alimentarius, una colección de normas, códigos de práctica, instrucciones y otras recomendaciones internacionalmente conocidos relacionados con los alimentos, la producción de alimentos y la seguridad de los alimentos. Estos textos son clasificados por la Comisión del Codex Alimentarius, una organización patrocinada por la Organización de Alimentos y Agricultura (FAO, Food and Agriculture Organization) de las Naciones Unidas y la Organización Mundial de la Salud (OMS).

El americano promedio consume, de forma asombrosa, de 1 a 1,5 kg de azúcar (principalmente como glucosa) cada semana, que no es sorprendente considerando que los azúcares altamente refinados en las formas de sacarosa (azúcar de mesa), dextrosa (azúcar de maíz), y jarabe de maíz alto el fructosa se han estado procesando en muchos alimentos, tales como pan, cereales para el desayuno, mayonesa, mantequilla de maní, kétchup, salsa para espagueti, y una gran cantidad de alimentos y bebidas de microondas.

Uno de los inconvenientes principales del azúcar es que eleva el nivel de insulina, que inhibe la liberación de las hormonas del crecimiento, que a su vez deprimen el sistema inmunitario. Un influjo de azúcar en la corriente sanguínea altera el equilibrio del azúcar en la sangre del cuerpo, activando la liberación de insulina, que el cuerpo utiliza para mantener el azúcar en la sangre a un nivel constante y seguro. La insulina también promueve el almacenamiento de grasa, de tal forma que cuando se comen dulces altos en azúcar, se crea una forma de ganar peso rápidamente y obtener elevados niveles de triglicéridos, ambos han sido asociados con enfermedad cardiovascular. Los hidratos de carbono complejos tienden a ser absorbidos más lentamente, disminuyendo el impacto de los niveles de azúcar en la sangre.

Los peligros para la salud creados por la ingesta habitual de azúcar son ciertos. Se ha observado que los azúcares simples, especialmente la glucosa, agravan el asma, provocan cambios de humor, provocan cambios en la personalidad, provocan enfermedad mental, fomentan trastornos nerviosos, hacen posible la diabetes, aceleran la enfermedad cardíaca, crean cálculos biliares, aumentan la hipertensión, y la artritis.

El índice glicémico, o índice glucémico, (GI, glycemic index or glycaemic índex) proporciona una medición de la rapidez con la que los niveles de azúcar en sangre (es decir, los niveles de glucosa en la sangre) se elevan después de comer un tipo de alimento particular. Los efectos que diferentes alimentos tienen sobre los niveles de azúcar en la sangre varían considerablemente. El índice glucémico estima cuánto cada gramo del hidrato de carbono disponible (hidrato de carbono total menos fibra) en los alimentos eleva el nivel de glucosa en la sangre de la persona después del consumo del alimento, con relación al consumo de glucosa pura. La glucosa tiene un índice glucémico de 100. Una limitación práctica del índice glucémico es que tiene en cuenta la cantidad de hidratos de carbono realmente consumidos. Una medida relacionada, la carga glucémica, factoriza esto multiplicando el índice glucémico del alimento en cuestión por el contenido de hidratos de carbono de la porción actual.

Un GI bajo liberará la glucosa de forma más lenta y más estable, lo que lleva a lecturas de glucosa en sangre postprandiales más adecuadas (después de comer). Un alimento con un alto GI causa una más rápida elevación de los niveles de glucosa en sangre y es adecuado para la recuperación de energía después del ejercicio o para una persona que experimenta hipoglicemia.

El efecto glucémico de los alimentos depende de un número de factores, tales como el tipo de almidón (amilosa frente a amilopectina), la retención física de las moléculas de almidón dentro del alimento, el contenido de grasas y proteínas del alimento, y los ácidos orgánicos o sus sales en la comida, la adición de vinagre, por ejemplo, reducirá el GI. La presencia de grasa o fibra dietética soluble puede retrasar el grado de vaciado gástrico, de esta forma disminuyendo el GI. En general, los panes de granos gruesos con mayores cantidades de fibra tienen un valor GI inferior que los panes blancos. Sin embargo, la mayor parte de los panes hechos con 100% de trigo entero o harina integral tiene un GI no muy diferente del pan solo con endospermo (blanco). Muchos panes integrales se tratan con enzimas para ablandar la corteza, lo que hace al almidón más accesible (alto GI).

Mientras la adición de grasa o proteína reducirá la respuesta glucémica a una comida, permanecen las diferencias relativas. Es decir, con o sin adiciones, aún existe una curva de glucosa en sangre más alta después de consumir un pan con alto GI que después de consumir un pan con bajo GI, tal como pan integral de centeno. Las frutas y los vegetales tienden a tener un bajo índice glucémico. El índice glucémico puede aplicarse solamente a alimentos en los que la prueba se basa en individuos que consumen una cantidad de alimentos que contienen 50 g de hidrato de carbono disponible. Pero muchas frutas y vegetales (no patatas, patatas dulces, maíz) contienen menos de 50 g de hidrato de carbono disponible por porción típica. En un principio, y de forma incorrecta, se informó de que las zanahorias tenían un alto GI. Se ha informado de que las bebidas alcohólicas tienen bajos valores de GI, pero se debe notar que la cerveza tiene un GI moderado. Los estudios recientes han mostrado que el consumo de bebidas alcohólicas antes de una comida reduce el GI del alimento en aproximadamente el 15%. El consumo moderado de alcohol más de 12 horas antes de la prueba no afecta el GI.

Muchas dietas modernas se basan en el índice glucémico. Sin embargo, otras han resaltado que los alimentos generalmente considerados como no sanos pueden tener un bajo índice glucémico, por ejemplo, pastel de chocolate, helado, o fructuosa pura, mientras los alimentos como las patatas y el arroz, ingeridos en países con bajos grados de diabetes, tiene unos GI de aproximadamente 100.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar suplementos nutricionales que mejoren el metabolismo de la energía de los alimentos en humanos. Es un objetivo adicional proporcionar un índice de clasificación de alimentos alternativo para el GI que tenga en cuenta el efecto del producto alimenticio en el metabolismo. La presente invención se define según las presentes reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer el uso de sedoheptulosa como un inductor nutricional de consumo de oxígeno celular. La presente invención también da a conocer el uso de sedoheptulosa, un inhibidor nutricional de la acidificación extracelular, glicólisis y formación de lactato. La presente invención también da a conocer el uso de sedoheptulosa para reducir la carga glucémica en productos alimenticios.

La presente invención utiliza el hecho de que la sedoheptulosa libre es una fuente de carbono relevante y accesible en humanos. Además, la biodisponibilidad de su forma fosforilada, sedoheptulosa-7-fosfato, parece que funciona como un reóstato para el metabolismo de los hidratos de carbono de hexosa en la interface de la glicólisis y la ruta de la pentosa fosfato así como para la respiración mitocondrial. La sedoheptulosa nutricional parece que equilibra el consumo de glucosa celular, la combustión de las grasas, la regulación redox, la inflamación y, por consiguiente, los trastornos relacionados.

Con la presente invención se muestra que se proporciona el valor nutricional distintivo mediante la adición de sedoheptulosa a productos alimenticios en comparación con todos los hidratos de carbono actualmente utilizados, incluyendo edulcorantes no calóricos y calóricos comúnmente utilizados. La presente invención, por consiguiente, se dirige al equilibrio del (sobre)consumo de C6, por lo tanto previniendo obesidad y diabetes y optimizando y fortaleciendo la función inmunitaria y la utilización de la energía. Por consiguiente, el suplemento “nutricional” según la presente invención se utiliza en el significado de “proporcionar o mejorar la utilización de nutrientes” mediante la adición de sedoheptulosa a productos alimenticios y por lo tanto proporcionando nuevos y mejorados productos alimenticios con un contenido en sedoheptulosa (o mejorando los productos alimenticios (adicionalmente) aumentando el contenido en sedoheptulosa). El suplemento nutricional C7 según la presente invención, por lo tanto, proporciona una estrategia efectiva para gestionar la regulación redox fisiológica y, por lo tanto, también gestionar las alteraciones o trastornos metabólicos relacionados. Por consiguiente, la presente invención significativamente difiere de la utilización del edulcorante reducido en calorías o el sustituto de azúcar moreno sugerido en las Patentes WO 2006/027796 A2 y WO 2006/093848 A2.

Tal como ya se afirmó, la industria de alimentos hoy en día utiliza altas cantidades de azúcares C6 (los azúcares C6 son glucosa, fructosa y sacarosa y maltosa (como sus dímeros respectivos) como suplementos nutricionales. La mayoría de estas hexosas se utilizan como un edulcorante (es decir, no como un suplemento “nutricional”, sino como un sabor o potenciador del sabor) y se explica ampliamente que aumentan el riesgo de enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Alzheimer, síndrome metabólico, obesidad y diabetes. La proporción de los hidratos de carbono C6 con respecto a C7 se desequilibra por la aplicación excesiva de C6. La adición de C7 (es decir, principalmente sedoheptulosa, sin embargo, también combinaciones con otros azúcares C7 son posibles, especialmente manoheptulosa; además la sedoheptulosa sola, C7 puede definirse como “sedoheptulosa con o sin manoheptulosa en una proporción de sedo/mano en % p/p, como mínimo, de 10.000:1, preferentemente, como mínimo, 1.000:1 y especialmente, como mínimo, 100:1”) equilibrará las cargas glucémicas aumentadas. C7 no es tan dulce como C6 y, por lo tanto, no altera significativamente el sabor de los alimentos suplementados. Los hidratos de carbono C7 tienen una función diferente en el metabolismo de los hidratos de carbono y la grasa celular y por lo tanto tienen un impacto en la nutrición así como en los aspectos relacionados con la salud en vertebrados.

Por consiguiente, la presente invención proporciona las enseñanzas de que la adición de C7 a las dietas da como resultado un metabolismo mejorado y equilibrado en humanos y ratones. El suplemento nutricional que contiene C7 según la presente invención tiene un claro potencial para alterar la preferencia por productos edulcorados con C6 con respecto a los aspectos relacionados con el cuidado de la salud.

Con la presente invención también se da a conocer un nuevo parámetro para la eficacia nutricional, la proporción de C6/C7 que se proporciona y está disponible para dietas estándar naturales y químicamente diseñadas así como ingredientes alimenticios naturales y químicamente diseñados. Con la presente invención también se pudo demostrar que el consumo de C7 gestiona la eficiencia energética, gestiona la salud del tejido y la inflamación. Además, el consumo de C7 que induce y proporciona la presente invención también gestiona la resistencia física, la regulación redox fisiológica, y, por lo tanto, también los trastornos relacionados, tales como diabetes y obesidad. La sedoheptulosa (número CAS: 3019-74-7; PubChem: 5459879; ChemSpider: 4573620; MeSH: sedoheptulose; ChEBI: CHEBI:16802) o D-altro-heptulosa es una cetoheptosa, un monosacárido con siete átomos de carbono y un grupo funcional cetona. Es una de las pocas heptosas encontradas en la naturaleza. La sedoheptulosa se puede producir por extracción de fuentes naturales o por síntesis química. Se puede purificar con altos grados de pureza (por ejemplo > 60% de pureza, preferentemente > 85% de pureza, más preferente, > 90% de pureza, más preferente > 95% de pureza, aún más preferente, > 99% de pureza, especialmente > 99,9% de pureza).

La sedoheptulosa es un metabolito relativamente desconocido en comparación con su forma fosforilada, sedoheptulosa-7-fosfato (S7P), que se reconoce como una molécula intermedia del metabolismo de la glucosa primario. Al principio se informó de la existencia natural de la sedoheptulosa en plantas y posteriormente se identificó en orina humana, manchas de sangre y, recientemente, dentro de células de ratón. La S7P se deriva de la conversión catalizada por transcetolasa de ribosa-5-fosfato (R5P) y xilulosa-5-fosfato (X5P). Esta reacción ocurre en la fase no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato y genera gliceraldehído-3-fosfato (G3P), un intermediario glicolítico clave, además de S7P. La G3P y S7P también se producen por transaldolasa utilizando fructosa-6-fosfato (F6P) y eritrosa-4-fosfato (E4P) como sustratos. La S7P, de esta forma, es un intermediario crucial en la PPP no oxidativa y la biodisponibilidad de S7P y, por lo tanto, contribuye al flujo de carbono celular. Recientemente, los datos de varios grupos han indicado que la sedoheptulosa cinasa también puede producir S7P por medio de la fosforilación directa de la sedoheptulosa (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). Este hallazgo demostró la existencia inesperada de una fuente de carbono adicional, sedoheptulosa, que participa activamente en el metabolismo del carbono celular (Nagy y Haschemi, Biochem Soc Trans. 2013).

Una sedoheptulosa libre puede derivarse de frutas y vegetales de la dieta o formarse enzimáticamente por la desfosforilación de la S7P producida endógenamente. De esta forma, hasta la fecha, no se ha informado de un transportador de sedoheptulosa específico o fosfatasa específica de S7P. Otras heptosas bioactivas incluyen el compuesto fenólico 7-O-galoil-sedoheptulosa (GS), manoheptulosa y glucoheptosa. Se informó de la GS como protector en lesión diabética del riñón aliviando las respuestas inflamatorias. La manoheptulosa (varias patentes pendientes) es un isómero de la sedoheptulosa y un potente inhibidor de la hexocinasa comúnmente encontrada en los aguacates. La glucoheptosa, a pesar de que sigue sin identificarse la naturaleza química de este compuesto, ha demostrado que sirve como una fuente de hidrato de carbono accesible en conejos. Sedoheptulosan es el anhídrido de la sedoheptulosa y también podría servir como una fuente de sedoheptulosa libre.

La sedoheptulosa libre puede aislarse, por ejemplo, de la planta sedum spectabile y se ha informado previamente de que contiene altas cantidades de hidratos de carbono heptosa.

La sedoheptulosa cinasa fosforila la sedoheptulosa libre, lo que permite que las células dirijan directamente la sedoheptulosa hacia el metabolismo de los hidratos de carbono, similar a la hexocinasa y la glucosa. Según la presente invención, la sedoheptulosa es una fuente directa de carbono que alimenta el catabolismo y anabolismo primarios de los hidratos de carbono, con lo cual la sedoheptulosa cinasa (CARKL) constituye su punto de entrada. La sedoheptulosa, por consiguiente, de forma sorprendente se compara con la glucosa y la fructosa porque estos compuestos todos existen como hidratos de carbono libres y formas fosforiladas. Para entrar en el metabolismo, los hidratos de carbono libres se activan enérgicamente por un evento de fosforilación inicial. La hexocinasa fosforila la glucosa para formar G6P y es un determinante clave del flujo de glucosa celular. La fructosa se fosforila por la cetohexocinasa para formar fructosa-1-fosfato (F1P), que primero debe convertirse por adolasa a gliceraldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP). A continuación, el D^hAP puede entrar directamente en el ciclo del carbono, mientras el gliceraldehído debe fosforilarse adicionalmente. La formación de S7P a partir de sedoheptulosa por sedoheptulosa cinasa, en una forma análoga a la formación de G6P de glucosa por hexocinasa, permite que la sedoheptulosa libre entre rápidamente en el sistema catabólico. También se informó de que en presencia de altas concentraciones de S7P tiene lugar una inhibición competitiva de la fosforilación de F6P . De forma interesante, también se informa de que las fracciones que contienen fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa) poseen actividad de 1,7-bisfosfatasa (SBPasa).

La presente invención, por consiguiente, también se basa en una coexistencia de las lanzaderas (shunts) de hexosa-(bis)fosfato y heptosa-(bis)fosfato. En particular, los altos niveles de glucosa o la incubación con F2,6bP aumentaron la formación de S1,7bP en hígado de rata perfundido, y en citosol de hígado de rata, respectivamente. El glucagón, en contraste con alta glucosa, favoreció la desfosforilación de S1,7bP y, por lo tanto, la formación de S7P. Estos resultados muestras que el metabolismo de la sedoheptulosa es sensible al control hormonal.

El metabolismo de la sedoheptulosa participa en la regulación metabólica; de hecho, la sedoheptulosa dirige los flujos metabólicos proporcionando un suministro de S7P independientemente de la glucosa. La expresión aumentada de CARKL (y, por lo tanto, el consumo aumentado de sedoheptulosa) en una línea de células macrófagas de ratón resultó en niveles en estado estacionario reducidos de G3P, X5P y R5P, mientras que CARKL con expresión reducida (knockdown) mostró el efecto inverso. En particular, los niveles basales de sedoheptulosa no cambiaron por la perturbación de CARKL. Los niveles de S7P no cambiaron por la sobreexpresión, pero disminuyeron significativamente por la pérdida de CARKL, indicando la fosforilación de sedoheptulosa como un factor limitante del grado por la distribución G3P derivada de la glicólisis. Por consiguiente, la regulación de la disponibilidad de S7P podría ser el mecanismo a través del cual CARKL o las cantidades excesivas de sedoheptulosa modulan el metabolismo celular.

La presente invención, por consiguiente, se dirige al uso de C7, por ejemplo para equilibrar el (sobre)consumo de C6, la función inmunitaria y generalmente, la utilización de la energía de los vertebrados. El suplemento de C7, por lo tanto, también proporciona una estrategia efectiva para gestionar la regulación redox fisiológica y, por lo tanto, también los trastornos relacionados. Con la presente invención, resulta que tanto la alta sedoheptulosa como la alta sedoheptulosa cinasa dan como resultado una producción mejorada de sedoheptulosa. Además, la expresión tisular de la sedoheptulosa cinasa revela que los órganos metabólicos, tales como el hígado o el tejido adiposo, tienen la capacidad de consumir sedoheptulosa. Adicionalmente, el tejido adiposo pardo (que quema altas cantidades de lípidos) expresa significativamente más (~2,5x) sedoheptulosa cinasa que el tejido adiposo blanco.

La sedoheptulosa (y/u otras heptosas), administradas a pacientes con inflamación o que están en riesgo de sufrir inflamación, minimiza la carga glucémica y contribuye positivamente a prevenir, por ejemplo, la obesidad inducida por la dieta y/o diabetes. Además, los datos de animales con sedoheptulosa cinasa transgénica, como modelo del metabolismo de sedoheptulosa aumentado, muestran que el alto metabolismo de la sedoheptulosa aumenta la oxidación lipídica (indicada por valores RQ inferiores). Esto es un efecto beneficioso de la producción mejorada de sedoheptulosa. También el gasto de energía es menor en animales con el metabolismo de la sedoheptulosa. Además, parece que los ratones que sobreexpresan CARKL son más sensibles a la insulina que los animales de control. En su conjunto, esto de nuevo muestra que el metabolismo de la sedoheptulosa es un medio efectivo para regular el fenotipo metabólico en vertebrados.

Con la presente invención, pudo mostrarse que se causan efectos antiinflamatorios específicos y sorprendentes mediante el alto metabolismo de la sedoheptulosa: La inflamación aumentada juega un papel importante en el desarrollo de enfermedades, tales como trastornos relacionados con la obesidad como resistencia a insulina. En un escenario de cinasa funcional para nuevos reguladores de la activación de macrófagos, se encontró que la sedoheptulosa cinasa reprime la secreción del factor a de necrosis de tumor inducido por lipopolisacárido (LPS). En el mismo escenario, la sobreexpresión de hexocinasa, cetohexocinasa y fosfofructocinasa (metabolismo de alta glucosa/fructosa) tuvo el efecto opuesto. Esto mostró los efectos opuestos del metabolismo de los hidratos de carbono hexosa y heptosa: la heptosa inhibe la inflamación. Además, la expresión aumentada de CARKL reprimió la activación de macrófagos inducida por LPS y resultó en una formación de superóxido intracelular mitigada, mientras la pérdida de CARKL (imita el metabolismo de sedoheptulosa reducido) aumentó la respuesta inflamatoria de esas células.

Por otro lado, la presente invención también se refiere a la prevención de todas las clases de déficits de sedoheptulosa, especialmente aquellas que aún no llevan a consecuencias patológicas, es decir, contrarrestar un déficit de sedoheptulosa de tal forma que los trastornos que se deben a tal déficit de sedoheptulosas puedan prevenirse. Con el fin de prevenir tales déficits de sedoheptulosa, una composición que contiene la sedoheptulosa puede administrarse a un ser individual que está en riesgo de desarrollar tal déficit de sedoheptulosa (o síndrome del déficit de sedoheptulosa), o un individuo sano sin tal riesgo, por ejemplo, como suplemento nutricional o en combinación con alimentos y/o bebidas.

Según una realización preferente de la presente invención, la sedoheptulosa se adiciona a un producto alimenticio que ya contiene sedoheptulosa y para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que se aumenta, como mínimo, en el 10 %, preferentemente, para obtener un contenido de sedoheptulosa del producto alimenticio que se aumenta, como mínimo, en el 100 %, especialmente, como mínimo, el 500 %.

Alternativamente, si la sedoheptulosa se adiciona a un producto alimenticio que aún no contiene sedoheptulosa, preferentemente, se obtiene un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, el 0,001 % p/p, preferentemente, como mínimo, el 0,01 % p/p, más preferente, como mínimo, el 0,1% p/p, aún más preferente, como mínimo, el 1 % p/p, especialmente, como mínimo, el 10 % p/p.

Si el producto alimenticio es un producto alimenticio líquido, tal como una bebida (por ejemplo, una bebida refrescante), el contenido en sedoheptulosa también puede ser referido como una proporción en % p/v. Por consiguiente, la presente invención también tiene, como realizaciones preferentes, procedimientos para producir bebidas con un contenido en sedoheptulosa, como mínimo, del 0,001 % p/v, preferentemente, como mínimo, el 0,01 % p/v, más preferente, como mínimo, el 0,1 % p/v, incluso más preferente, como mínimo, el 1 % p/v, especialmente, como mínimo, el 10 % p/v. Una “proporción en peso” como se refiere más adelante, por lo tanto, significa para un producto alimenticio líquido el valor en % p/p así como en % p/v.

Por ejemplo, para bebidas refrescantes habituales que no se basan en material de frutas (o vegetales) naturales (zumos), solamente es necesaria la adición mínima de sedoheptulosa para mejorar el contenido en sedoheptulosa.

Para el propósito de la presente invención “bebidas refrescantes” son bebidas que típicamente contiene agua (por lo general, pero no siempre, agua carbonatada), usualmente un edulcorante y usualmente un agente saborizante, pero sin zumo de fruta (estas son referidas como “zumos de frutas” dentro de la presente invención y se mantiene una clara diferencia para los propósitos de la presente invención). El edulcorante en las bebidas refrescantes puede ser azúcar, jarabe de maíz alto en fructosa, zumo de fruta, sustitutos de azúcar (en el caso de bebidas dietéticas) o alguna combinación de éstos. Las bebidas refrescantes también pueden contener cafeína, colorantes, conservantes y otros ingredientes. Dado que las bebidas refrescantes (como se define en el contexto de la presente invención) no contienen sedoheptulosa (es decir, tienen un contenido en sedoheptulosa por debajo del 0,001 % p/p o % p/v), una realización preferente de la presente invención es una bebida refrescante que tiene un contenido en sedoheptulosa del 0,001 % p/p (o % p/v) o más alto, preferentemente, como mínimo, el 0,01 % p/p (o % p/v), más preferente, como mínimo, el 0,1 % p/p (o % p/v), incluso más preferente, como mínimo, el 1% p/p (o % p/v), especialmente, como mínimo, el 10% p/p (o % p/v).

Según la presente invención, un producto alimenticio puede analizarse con respecto al contenido en % p/p, % p/v o concentración molar de hidratos de carbono C6, especialmente glucosa, fructosa y sacarosa y maltosa como dímeros respectivos, y con respecto a su contenido en % p/p, % p/v o concentración molar de hidratos de carbono C7, especialmente sedoheptulosa y, opcionalmente, manoheptulosa, estableciendo la proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p, % p/v:% p/v o relación molar) para este producto alimenticio, y en el que la sedoheptulosa con o sin manoheptulosa se adiciona al producto alimenticio en una cantidad para reducir la proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p, % p/v:% p/v o relación molar), como mínimo, en el 50 %, preferentemente, como mínimo, en el 100 %, especialmente, como mínimo, en el 200%. Preferentemente, la proporción en peso (es decir, el % p/p y/o el % p/v) en el producto alimenticio se reduce a una relación en peso C6/C7 resultante de 2000 %:1 %, o por debajo de la misma, preferentemente a una relación en peso C6/C7 resultante de 100 %:1 %, o por debajo de la misma, más preferente a una relación en peso C6/C7 resultante de10:1, o por debajo de la misma, especialmente a una relación en peso C6/C7 resultante de 1 %:1 %, o por debajo de la misma. Alternativamente, también la proporción de las concentraciones molares puede reducirse consecuentemente, por ejemplo, de forma preferente, con una reducción a una relación molar en el producto alimenticio a una relación molar C6/C7 resultante de 2000:1 o por debajo de la misma, preferentemente a una relación molar de C6/C7 resultante de 100:1, o por debajo de la misma, más preferente a una relación molar de C6/C7 resultante de 10:1, o por debajo de la misma, especialmente a una relación de C6/C7 resultante de 1:1, o por debajo de la misma (tiene que mencionarse que la relación de los valores en % es idéntica a la relación de los valores, es decir, 2000 %:1 % = 2000:1).

Por consiguiente, con la presente invención se da a conocer un procedimiento para producir productos alimenticios nuevos mediante la utilización de este procedimiento. Por ejemplo, se proporciona una nueva generación de bebidas refrescantes o zumos de naranja y manzana con la presente invención que tienen una relación molar C6/C7 resultante de 2000:1, o por debajo de la misma. Otras realizaciones preferentes de los productos alimenticios producidos según la presente invención tienen un peso o relación molar de C6/C7 de 3000:1, o por debajo de la misma, especialmente de 2500:1, o por debajo de la misma; por ejemplo las bebidas que se derivan de bebidas refrescantes (es decir, esencialmente sin ningún contenido en sedoheptulosa) que contienen zumos de frutas, tales como zumos de naranja o manzana, por ejemplo, en una cantidad del 5 % al 50%. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una bebida refrescante con una proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p, % p/v:% p/v o como una relación molar) con un peso o relación molar de C6/C7 de 3000:1, o por debajo de la misma, preferentemente de 2500:1, o por debajo de la misma.

Virtualmente cualquier producto alimenticio (el término “producto alimenticio” abarca cualquier material que se puede ingerir que puede utilizarse nutricionalmente por los humanos, incluyendo alimentos, bebidas, etc.) puede mejorarse según la presente invención mediante la adición de sedoheptulosa. Preferentemente, el producto alimenticio producido mediante la presente invención se selecciona del grupo que consiste de una bebida nutricional, una barrita de cereales nutricional, un producto alimenticio dietético, un producto alimenticio de cereales, una bebida refrescante, bebida deportiva, bebida energizante, edulcorante nutricional, caramelo, repostería, producto lácteo, productos alimenticios para untar o funcionales incluyendo comidas instantáneas.

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para producir productos alimenticios mejorados que son provistos con la presente invención. Tal como se mencionó anteriormente, virtualmente cualquier producto alimenticio disponible en el mercado puede mejorarse según la presente invención. La presente invención da a conocer procedimientos para producir productos novedosos que tienen un contenido en sedoheptulosa o, si el producto disponible ya contiene un cierto nivel de sedoheptulosa, tienen un contenido en sedoheptulosa aumentado. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un procedimiento para producir un producto alimenticio con sedoheptulosa adicionada, en el que el contenido en sedoheptulosa está aumentado comparado con el producto alimenticio sin sedoheptulosa adicionada, como mínimo, en el 10 % p/p, preferentemente, como mínimo, en el 20 % p/p, especialmente, como mínimo, el 30 % p/p. Preferentemente, el contenido en sedoheptulosa está aumentado comparado con el producto alimenticio sin sedoheptulosa adicionada, como mínimo, en el 50 % p/p, preferentemente, como mínimo, en el 100% p/p, especialmente, como mínimo, el 200% p/p. Estos números también pueden, además, aplicarse a productos alimenticios líquidos, tales como bebidas, en proporciones en % p/v (es decir, por ejemplo, bebidas en las que el contenido en sedoheptulosa está aumentado comparado con el producto alimenticio sin sedoheptulosa adicionada, como mínimo, en el 50 % p/v, preferentemente, como mínimo, en el 100% p/v, especialmente, como mínimo, el 200% p/v).

Si el producto alimenticio disponible de la técnica anterior está originalmente libre de sedoheptulosa, según la presente invención la sedoheptulosa puede adicionarse para proporcionar un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, del 0,001 % p/p o % p/v, preferentemente para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, del 0,01 % p/p o % p/v, más preferente, como mínimo, el 0,1% p/p o % p/v, aún más preferente, como mínimo, el 1% p/p o % p/v, especialmente, como mínimo, el 10% p/p 0 % p/v. Por supuesto, el contenido en sedoheptulosa puede ser aún mayor, dependiendo de la naturaleza del producto alimenticio (caramelos, etc.).

Preferentemente, el producto alimenticio producido según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en una bebida nutricional, una barra de cereales nutricional, un producto alimenticio dietético, un producto alimenticio de cereales, una bebida refrescante, una bebida deportiva, una bebida energética, un edulcorante nutricional, caramelo, pastel, producto lácteo, producto alimenticio para untar o funcional.

Según otro aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para establecer una proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 en un producto alimenticio (en % p/p, % p/v o concentración molar) analizando el producto alimenticio con respecto a su contenido de hidratos de carbono C6, especialmente glucosa y fructosa, y con respecto a su contenido de hidratos de carbono C7, calculando la proporción del contenido de hidratos de carbono C6 con respecto al contenido de hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p,% p/v:% p/v o proporción de concentración molar) para este producto alimenticio, y, preferentemente registrando esta proporción en un portador de datos o imprimiendo la proporción en una base de impresión y combinando el portador de datos o la base de impresión con el producto alimenticio.

Según una variante de este aspecto, la presente invención también da a conocer un procedimiento para establecer y ajustar en un producto alimenticio una proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 (en % p/p,% p/v o concentración molar) mediante el análisis del producto alimenticio con respecto a su contenido de hidratos de carbono C6, especialmente glucosa, fructosa y sacarosa y maltosa como dímeros respectivos, y con respecto a su contenido de hidratos de carbono C7, calculando la proporción del contenido de hidratos de carbono C6 con respecto al contenido de hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p,% p/v:% p/v o proporción de concentración molar) para este producto alimenticio; a continuación, agregando sedoheptulosa al producto alimenticio en una cantidad que la proporción del contenido de hidratos de carbono C6 con respecto al contenido de hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p,% p/v:% p/v o proporción de concentración molar) para este producto alimenticio se reduce, como mínimo, en el 10 %, preferentemente, como mínimo, en el 50 %, especialmente, como mínimo, el 100%; y, preferentemente, registrando esta proporción en un portador de datos o imprimiendo la proporción en una base de impresión y combinando el portador de datos o la base de impresión con el producto alimenticio. Tal como ya se afirmó anteriormente, preferentemente, la proporción en peso o molecular en el producto alimenticio se reduce a una proporción de C6/C7 resultante, como mínimo, de 2000 %:1 %, preferentemente a una proporción de C6/C7 resultante, como mínimo, de 10 %:1 %, especialmente a una proporción de C6/C7 resultante, como mínimo, de 1 %:1 %.

La presente invención se describe de forma adicional en los siguientes ejemplos y figuras, y sin que se limite a los mismos.

Figura 1: (A) Se analizaron muestras agrupadas de zanahorias u hojas de plantas Sedum Spectabile cultivadas en interiores por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para medir específicamente los niveles de glucosa (C6) y sedoheptulosa (C7) relativos. La proporción de C6/C7 se calculó dividiendo su área de pico respectiva. (B) Los niveles de sedoheptulosa y glucosa se evaluaron de forma adicional por GC-MS en el suero de individuos antes y después de la ingesta de alimentos para investigar si C7 derivado de la dieta puede entrar en la corriente sanguínea humana. El nivel de la sedoheptulosa y glucosa de cuatro individuos que ayunaron durante la noche (ayunas) (barras vacías) se comparó con los niveles medidos dos horas después de una comida (alimentación con dieta, barras grises) conteniendo principalmente zanahorias (~700g) con algo de aceite de oliva, sal y pimienta. El cambio en los niveles de hidratos de carbono en el suero se expresó como el cambio múltiplo medio (n=4, /- D.E.). (C) Las concentraciones de glucosa, fructosa y sedoheptulosa se midieron en los extractos de hidratos de carbonos de las bebidas indicadas. Los valores medios de cuatro replicados técnicos agrupados se representaron gráficamente para demostrar las concentraciones de azúcar extraídas. Además (D), la proporción de C6/C7 (sedoheptulosa) se estableció dividiendo la suma de las moléculas de glucosa y fructosa (C6) o el peso por unidad de sedoheptulosa (C7) respectiva (N.A.= no aplicable).

Figura 2: (A) La transferencia de los niveles de expresión normalizados de ARNm de sedoheptulosa cinasa (CARKL) en hígado de ratón durante un período de 48 horas se obtuvo de la “Base de datos de expresión génica circadiana - CIRCA” disponible públicamente. El eje Y representa la expresión génica normalizada y el eje X el tiempo en horas. (B y C) Los niveles del nucleótido de nicotamida adenina reducido y oxidado de células con expresión de CARKL perturbada se calcularon de datos metabolómicos previamente registrados (Haschemi et al., (2012), 813-826). La línea de células RAW264.7 (B) que expresaba altos niveles de CARKL por sobreexpresión o bien (C) bajos niveles de CARKL por la expresión de mirARNsh se compararon con las líneas de células de control individuales para ilustrar la regulación del dinucleótido de nicotinamida adenina mediada por CARKL. Los datos representan el cambio múltiplo medio de tres experimentos individuales /- EEM. (D) Los niveles de ARNm de CARKL se midieron en una biblioteca de tejido de ADNc de ratón. Los datos representan la expresión de CARKL media normalizada (para p-actina) con relación a la expresión de CARKL en timo en cambio múltiplo (todos los tejidos n=3, D.E.).

Figura 3: (A-E) Los adipocitos humanos primarios de obtuvieron por diferenciación de las células de la fracción vascular estromal en presencia de glucosa y fructosa (GF, 1,5 g/l de cada azúcar; total de hidratos de carbono 3 g/l) o medio suplementado con sedoheptulosa, que se denominó GFS (1 g/l de cada azúcar; total de hidratos de carbono 3 g/l), durante ocho días. Posteriormente los niveles de ARNm de (A) CARKL, (B) adiponectina y (C) proteína 1 sin acoplar (UCP-1) se evaluaron por RT-PCR y compararon entre los grupos. (D) Las tasas de consumo de oxígeno celular (OCR, celular oxygen consumption rafes) y (E) tasas de acidificación extracelular (ECAR, extracelular acidification rafes) de adipocitos se registraron en presencia de la mezcla de hidratos de carbono indicada (media /- D.E., n=9-11). (F) Los niveles de expresión del ARNm de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y (G) interleucina 6 (IL-6) de adipocitos murinos maduros cultivados durante tres días en medio de cultivo celular conteniendo mezcla de hidratos de carbono GF o bien GFS, o (H) la expresión de IL-6 en hepatocitos murinos primarios, así como niveles de ARNm de (I) TNFa y (J) IL-6 en macrófagos primarios derivados de la médula espinal, ambos tipos de célula se precultivaron durante dos días en medio GF o GFS, se compararon entre grupos respectivos. La secreción de (K) TNFa y (L) citocinas IL-6 durante el período de dos días se midió por ELISA en el sobrenadante de los macrófagos derivados de la médula espinal La secreción inducida por LPS (100 ng/ml) de (M) TNFa 2 horas después de la activación y (N) IL-6, 6 horas después de la activación en el medio respectivo y los macrófagos también se midieron por ELISA. Los datos representan la media /- D.E., n=3)

Figura 4: En un ensayo de cinasa in vitro, que emplea la formación de ADP como la lectura de la actividad, se aumentó la tasa de metabolización de sedoheptulosa a concentración de ATP constante (150 pMI) (A) aumentando la concentración de sedoheptulosa o bien (B) aumentando la cantidad de la enzima sedoheptulosa cinasa (CARKL) limitante de la tasa. (C-E) Los hepatocitos de ratones de tipo silvestre (WT, wild type) y que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa CARKL se precultivaron durante dos días en medio que contenía GFS antes de registrar la (C) ECAR y (D) OCR basales de estas células. (E) Los hepatocitos de ambos linajes genéticos (controles CARKL y WT) se cultivaron en medio que contenía GF o GFS y, a continuación, se dejaron sin alimentos previamente (sin hidratos de carbono) durante 1 hora para medir la ECAR inducida por glucosa después de la adición de glucosa para alcanzar una concentración final de 1 g/l en el medio de cultivo, media /- D.E., n=7-11). Como indicadores metabólicos in vivo se determinaron (F) el coeficiente respiratorio (RQ) y (G) el gasto energético (EE, kcal/día/kgA0,75) por actividad mediante calorimetría indirecta y se compararon CARKL con respecto a crías de tipo silvestre (WT) durante el día (de las 8 de la mañana a las 4 de la tarde) y la noche (de las 8 de la tarde a las 4 de la mañana). Los datos representan valores medios, n=3, /- D.E. (H) La prueba de tolerancia a insulina en ratones se llevó a cabo en controles transgénicos CARKL hembra previamente sin alimentos (4 h) y crías del tipo silvestre por medio de, por ejemplo, inyección i.p. de 0,75 U insulina/kg de peso corporal. La glucosa en sangre se midió después de la inyección (control) y 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección y se representaron gráficamente como el valor relativo en % del control. Los datos representan los valores medios /- D.E., n=3-4.

Figura 5: (A) La deposición de lípidos en hepatocitos aislados de ratones WT o bien que sobreespresaban CARKL y cultivados en medio de control (GF) se visualizó por tinción con rojo aceite. Se adquirieron micrografías representativas con un objetivo 20x. (B) La actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se midió en hepatocitos aislados de ratones WT o que sobreexpresaban CARKL y cultivados en medio de control (GF) durante dos días. Las flechas indican la relocalización de la actividad de G6PD. Se adquirieron micrografías representativas con un objetivo 10x. (C y D) Se diferenciaron osteoclastos de ratones WT o que sobreexpresaban CARKL y se cultivaron durante 7 días en placas de ensayo Corning Osteo en medio con GF o GFS. Su actividad de resorción se evaluó contando todas las lagunas por pocillo que fueron visibles a una amplificación de 20x. Los datos representan valores medios, n=2-3, /- D.E.. (D) Se muestran dos imágenes representativas de las lagunas de resorción más grandes en el osteoclasto WT cultivado en medio con GF o GFS. Las micrografías se adquirieron por una amplificación de 40x.

Figura 6: (A) El sistema inmunitario de ratones que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa (CARKL) y las crías de control se desafió con una inyección de lipopolisacárido subletal (LPS, 7 mg/kg) y un panel de 19 citocinas se midió 24 horas después de la activación inmunitaria en suero. Los datos representan las intensidades de fluorescencia medias relativas (MFI, mean iluorescence intensities) de citocinas individuales medidas en suero de tipo silvestre (WT=100%) y CARKL por medio del perfilador de citocina de ratón del mapa miliplexado (n=3, /- D.E.). La expresión de ARNm de la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP- 1) y TNFa de adipocitos maduros murinos aislados de tejido adiposo blanco (B y C) subcutáneo o (D y E) epididimal de ratones WS y CARKL. Los datos representan valores medios, n=3, /- D.E.. (F) Incidencia de accidente cerebrovascular y genotipo rs465563. Los datos se compararon por las pruebas de Pearson %2. **...p<0,01. (G) La duración de la supervivencia sin accidente cerebrovascular inicial se evaluó por gráficas Kaplan-Meier. Homocigotos individuales para rs465563: el alelo-[G] muestra tiempos libres de eventos significativamente más cortos que los portadores del alelo-[A].

Ejemplos

Materiales y Procedimientos

Hidratos de carbono

La glucosa y la fructosa se compraron de Sigma Aldrich. La sedoheptulosa se asiló de la planta sedum Spectabile o sedum telephium (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826) y además se purificó por cromatografía.

Mediciones de la glucosa y sedoheptulosa en zanahorias y suero humano

Zanahorias frescas con un “certificado orgánico” austríaco se cortaron en pequeñas piezas y congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El mismo procedimiento se aplicó a las hojas recién recogidas de plantas Sedum Spectabile cultivadas en el interior. Se agruparon tres muestras de cada tejido y homogeneizaron en polvo por medio de perlas de vidrio. Las fracciones ricas en hidratos de carbono de las muestras se aislaron mediante una solución de extracción al 20% de H2O y el 80% de MeOH marcada con patrones 13C y procesada por cromatografía de gases estándar acoplada a espectrometría de masas (GC- MS). La glucosa y la sedoheptulosa se identificaron por sus masas individuales y su cantidad relativa se derivó del área de pico de cada analito individual normalizado para el contenido de 13C. La glucosa y la sedoheptulosa también se midieron en volúmenes iguales de suero de individuos sin alimentos durante la noche o alimentados con zanahorias. Las zanahorias se cocieron al vapor y se utilizó algo de aceite de oliva, sal y pimienta para darles sabor. Dos horas antes y dos horas después de la comida que contenía zanahorias se preparó suero humano en tubos VACUETTE® Z Serum Sep de la sangre. Las muestras de suero se procesaron tal como se describió anteriormente y también se analizaron por GC-MS, tal como se detalló anteriormente y en Ruiz-Matute AI et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2011) 15 de mayo 879(17-18).

Concentración de glucosa, fructosa y sedoheptulosa en bebidas

Las bebidas indicadas se compraron de una tienda de comestibles local y todas estaban preenvasadas. Se extrajo una alícuota de 1 ml de cada bebida (para cada uno de los cuatro replicados) y se concentró al vacío en un SpeedVac. Esto fue seguido por precipitación con MeOH/H2O (80:20) y un paso de centrifugación para aclarar la fracción de los hidratos de carbono en el sobrenadante del precipitado. Cada sobrenadante se liofilizó de nuevo en un SpeedVac, se rehidrató en volúmenes iguales de agua y los replicados técnicos se agruparon. Para el análisis de los hidratos de carbono se utilizó un sistema libre de metal Dionex ICS- 3000 DC con una columna CarboPac PA1 (250x4 mm) y una columna de guardia CarboPac PA1 (ambas de Dionex) a una velocidad de flujo de 1 ml min-1. La elución se llevó a cabo isocráticamente con NaOH 16 mM durante los primeros 20 minutos. A continuación, se aplicó un gradiente lineal hasta NaOH 100 mM de 20 a 40 minutos seguido por un aumento durante 2 minutos hasta 200 mM sostenido hasta los 47 minutos. La condición de partida con NaOH 16 mM se alcanzó de nuevo a los 49 minutos y se mantuvo hasta los 70 minutos. Los parámetros de la detección amperométrica pulsada son exactamente como se recomienda en la Nota Técnica 21 (Parámetros óptimos para la detección amperométrica pulsada de los hidratos de carbono utilizando el detector electromecánico Dionex e D40) de Dionex. Los cromatogramas se evaluaron según los cromatogramas de patrones de glucosa, fructosa y sedoheptulosa auténticas, cada uno de 100 |j.M.

Cultivo de adipocitos Humanos

Se aislaron células de fracción vascular estromal (SVF, stromal vascular fraction) de tejido adiposo blanco subcutáneo de un paciente que experimentó cirugía abdominal, tal como se describió anteriormente (Lindroos et al, Cell Metab. (2013), 2 de julio;18(1):62-74.). En resumen, el tejido adiposo se digirió con colagenasa II (Worthington) y se filtró. Las SVF se separaron de adipocitos maduros por centrifugación, seguido por la lisis de eritrocitos en la fracción SVF (Buffer EL, Qiagen). Las SVF purificados se cultivaron en DMEM/F12, 10% de FBS (Gibco, Life Technologies). Tan pronto como las células alcanzaron la confluencia, se lavaron con DMEM/F12 sin glucosa (Biowest) y el medio se reemplazó con DMEM/F12 con una carga total de hidratos de carbono de 3 g/l, con 1,5 g/l de glucosa y fructosa o 1 g/l de cada una de glucosa, fructosa, y sedoheptulosa, respectivamente. Dos días después de la confluencia (día 0), se indujo la diferenciación por la adición de dexametasona 1 |j.M, insulina 1,74 |j.M, troglitazona 5 |j.M, IBMX 0,5 |j.M, ácido pantoténico 17 |j.M y biotina 33 |xM. Después de dos días, la IBMX y la dexametasona se omitieron, mientras la insulina y la troglitazona se retiraron en el día 4. El 50 % del medio se reemplazó en el día 6. Dos días después, las células se recogieron para aislamiento de ARN (RNeasy mini kit, Qiagen).

Cultivo ceiling de adipocitos murinos maduros

El tejido adiposo subcutáneo anterior y posterior y el tejido adiposo blanco epididimal se aislaron de ratones transgénicos CARKL y de controles de crías de tipo silvestre. El tejido adiposo se digirió como se describió anteriormente para la muestra humana. Después de la centrifugación, la capa de adipocitos maduros flotantes se retiró y recentrifugó a 100 rcf durante 10 minutos. Se cultivaron 150 |j.l de adipocitos empaquetados bajo un cubreobjetos en placas de seis pocillos, en DMEM/F12, 15% de suero de ternero (PAA). Veinticuatro horas después del aislamiento, los pocillos se lavaron dos veces con PBS y el medio se cambió a DMEM/F12 con una carga total de hidratos de carbono de 3 g/l, con 1,5 g/l de glucosa y fructosa, o 1 g/l de cada una de glucosa, fructosa y sedoheptulosa, respectivamente. Tres días después, las células se recogieron para aislamiento del ARN utilizando TRIreagent (Sigma).

Cultivo de hepatocitos

Los hepatocitos se aislaron de ratones macho de tipo silvestre y ratones que sobreexpresaban CARKL después de sacrificar los ratones por perfusión de colagenasa hepática in situ. Después de la perfusión, el hígado se retiró rápidamente, se cortó en pedacitos, y filtró a través de un filtro de células (Fisher Scientific, Inc) en un tubo estéril de 50 ml. Los hepatocitos en el filtrado resultante se purificaron de las células no parenquimales mediante etapas de centrifugación. Los hepatocitos aislados se sembraron en placas a una concentración de 0,25 x 10A6/ml en medio DMEM respectivo que contenía el 10% de FBS y las mezclas de hidratos de carbono indicadas a 3 g/l (glucosa y fructosa (Gf), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)), como mínimo, dos días antes de realizar los experimentos.

Cultivo de macrófagos y osteoclastos derivados de médula espinal

Los huesos de ratón se aislaron de ratones macho de tipo silvestre y ratones que sobreexpresaban CARKL y la médula espinal se enjuagó, lavó y aclaró de glóbulos sanguíneos por lisis y, posteriormente, se diferenció en DMEM que contenía glucosa 25 mM y 20 ng/ml de M-CSF. Después de 4 días, las células para la diferenciación osteoclástica se cosecharon y sembraron en placas de ensayo de Corning Osteo con medio de diferenciación (véase, a continuación), y para macrófagos derivados de médula espinal (BMDM) el medio se renovó y se suplementó adicionalmente con M-SCF durante dos días. A continuación, el BMDM diferenciado se sembró en medio DMEM respectivo que contenía el 10% de FBS y mezclas de hidratos de carbono indicadas a 3 g/l (glucosa y fructosa (GF), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)), como mínimo, dos días antes de realizar los experimentos.

Ensayo de resorción ósea in vitro

Las células precursoras de osteoclastos (células de médula espinal tratadas con 20 ng/ml de M-CSF durante 4 días) se colocaron en un placa de ensayo de 24 pocillos Corning Osteo en la presencia de 10 ng/ml de M-CSF y 100 ng/ml de RANKL en medio alfa-MEM que contenía el 10% de FBS y 3 g/l ya fuese de glucosa y fructosa (Gf), o glucosa, fructosa, y sedoheptulosa (GFS). El medio se renovó cada tercer día. Después de 7 días, las células se retiraron con blanqueador y lavaron tres veces con agua antes de la tinción Von Kossa según los protocolos estándar de Corning (revisión técnica) que se realizó para mejorar el contraste entre la superficie de ensayo intacta y el pozo de resorción. Cada pocillo se fotografió completamente por TissueFax con un objetivo de x20 y todos los pozos de resorción visibles se contaron y analizaron de forma ciega.

Grados de acidificación extracelular y grados de consumo de oxígeno

Se utilizó el analizador XF (Seahorse Bio.) para medir los cambios en el metabolismo celular inducido por diferentes hidratos de carbono. Las tasas de acidificación extracelular (ECAR, mpH/min) y las tasas de consumo de oxígeno (OCR, pmoles/min) se registraron en adipocitos humanos primarios y hepatocitos murinos primarios según las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se sembraron en placas de células Seahorse a una densidad de 10A4 células por pocillo para adipocitos y 0,5x10A5 células por pocillo para hepatocitos. En el día de los experimentos las células se lavaron con medio libre de hidratos de carbono y se incubaron durante una hora en el medio indicado que contenía mezclas de hidratos de carbono a una concentración de 3 g/l (glucosa y fructosa (GF), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)). Para medir la ECAR inducida por la glucosa, las células se dejaron sin alimento durante una hora en medio libre de carbono antes de adicionar la glucosa (1 g/l) al pocillo por inyección automática. La ECAR inducida por la glucosa se normalizó a la ECAR respectiva antes de la adición de la glucosa (basal = 100%). Los cambios inducidos por diferentes fuentes de hidratos de carbono se expresaron como el cambio relativo en % para ilustrar el efecto de cada fuente de carbono.

Análisis de la expresión génica

En resumen, el ARN total se extrajo y transcribió de forma inversa utilizando kits comerciales (QIAGEN, Applied Biosystems). Las PCR en tiempo real cuantitativas se llevaron a cabo en un ciclador en tiempo real AbiPRlSM 7900HT utilizando la Supermezcla Verde iTaq SYBR con ROX (BioRad) para medir la expresión de CARKL, adiponectina, UCP-1, TNFa, IL-6, MCP-1, y beta-actina, tal como se describió anteriormente (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). La expresión del gen diana se normalizó a la expresión de beta-actina. La expresión relativa del gen diana se calculó por el procedimiento CT delta-delta.

Ensayo de sedoheptulosa cinasa

Se utilizó el Ensayo ADP Quest (DiscoveRx) para medir indirectamente la formación de S7P por acumulación de ADP con el transcurso del tiempo, según las instrucciones del fabricante. La sedoheptulosa cinasa recombinante se produjo previamente en E.coli y purificó por purificación por afinidad (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). Calorimetría Indirecta

El coeficiente respiratorio (producción de VCO2 / consumo de VO2) y el gasto energético (EE, energy expenditure, kcal/día/kgA0,75) por actividad de ratones se midió en jaulas metabólicas (Harvard Apperatus) por calorimetría indirecta. Uno de ratones transgénicos CARKL o bien cría de tipo silvestre, se alojó por jaula durante un día antes de iniciar el registro del coeficiente respiratorio medio y el gasto energético por actividad durante el día (de las 8 de la mañana a las 4 de la tarde) y la noche (de las 8 de la tarde a las 4 de la mañana).

Prueba de tolerancia a la insulina

Ratones transgénicos CARKL hembra sin alimentos previamente durante cuatro horas y controles de crías de tipo silvestre se inyectaron i.p. con 0,75 U de insulina / kg del peso corporal. La glucosa en la sangre se midió antes de la inyección y 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección utilizando tiras de glucosa One-Touch (Accu Check, Roche).

Tinción de rojo aceite

En resumen, los hepatocitos de cultivaron tal como se indicó anteriormente, antes de retirar el medio y que las células se fijaran con el 10% de formalina. Después de un lavado con isopropanol al 60%los pocillos se incubaron con solución de rojo aceite O (Sigma-Aldrich) y se tiñeron durante 10 minutos, se lavaron 4 veces con agua antes de tomar las fotografías a una amplificación de x20.

Ensayo de la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

Las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio tratados con cultivo de tejido de envase de poliestireno, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y mantuvieron a -80 °C. El procedimiento histoquímico enzimático se basó en el procedimiento de la sal de tetrazolio, tal como describen Van Noorden y Frederiks. El medio de incubación para la demostración de la actividad de G6PD contenía el 18% (p/v) de alcohol polivinílico (peso molecular promedio 70.000-100.000) en tampón de pH Tris-Maleato 0,1 M, pH 7,5, glucosa-6-fosfato 15 mM, NADP 0,8 mM, cloruro de magnesio 0,4 mM, metosulfato de 1-metoxifenazina 0,45 mM, azida de sodio 5 mM y cloruro de tetranitroazul de tetrazolio 5 mM . El medio se preparó inmediatamente antes de la incubación. Las reacciones de control adicionalmente contenían glucosamina-6-fosfato 40 mM. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos bajo mezclado continuo por medio del agitador orbital. Después de la incubación, las células se lavaron 3 veces durante 5 minutos en solución salina con tampón fosfato a 60 °C, se secaron y se montaron en gelatina de glicerol, y fotografiaron dentro de un día a una amplificación de x10.

Análisis del desafío inmunitario y la respuesta a citocinas in vivo

Para la endotoxemia murina subletal in vivo, se inyectaron 7 mg/kg de LPS (Sigma Aldrich) intraperitonealmente en crías macho transgénicas CARKL o de tipo silvestre. El suero se asiló por medio de tubos VACUETTE® mini Z Serum Sep de sangre entera. Las citocinas se midieron mediante el analizador de citocinas de ratón de mapa miliplexado según las instrucciones del fabricante (Millipore). Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo según el protocolo y contrato con licencia ético en animales aprobado por la Universidad Médica de Viena (BMWF-66.009/0140- II/10b/2010).

Estudio en asociación con polimorfismo de nucleótido único (SNP, single nucleotide polymorphism) de CARKL con riesgo de accidente cerebrovascular

Diseño del estudio: 578 pacientes neurológicamente asintomáticos del Estudio de inflamación y arteria carótida - riesgo de ateroesclerosis (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.)), reclutados hasta 03/2003, se incluyeron en el presente análisis; los criterios de inclusión y exclusión se ha sido publicado previamente. En resumen, la enfermedad de arteria carótida asintomática, que representa el criterio de inclusión primario, se definió como la ausencia de ataques isquémicos temporales (TIA, transient ischemic attacks), amaurosis fugaz y accidente cerebrovascular dentro de los últimos 12 meses o de síntomas residuales, respectivamente. Además del reconocimiento médico exhaustivo (incluyendo anamnesia, estado físico y pruebas sanguíneas), los pacientes se sometieron a sonografía de las arterias carótidas en la línea base y un seguimiento de 6-9 meses después de la inclusión en el estudio, tal como se describió anteriormente (Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.). Se registró la incidencia de eventos cardiovasculares hasta el 01/2006. Este análisis se aprobó por el comité ético local (EC-No. 1933/2012) y se ha llevado a cabo según las normas éticas especificadas por la Declaración de Helsinki y sus enmiendas.

Definiciones: la hipertensión arterial se define como una presión sanguínea en reposo repetitiva por encima de 140/90 mm Hg y se asumió que estaba presente en pacientes con medicamento antihipertensivo. La hiperlipidemia se diagnosticó en pacientes con un colesterol sérico total de >200 mg/dl o colesterol LDL de >130 mg/dl y se consideró que estaba presente en todos los pacientes que tomaban fármacos para reducción de lípidos. La diabetes mellitus se diagnosticó según las suposiciones del Comité experto en el diagnóstico y clasificación de la diabetes mellitus. La enfermedad de arteria periférica se clasifica utilizando el sistema de clasificación de Fontaine, la enfermedad de arteria coronaria se define según la clasificación de la Sociedad cardiovascular canadiense (CCS, Canadian Cardiovascular Society). El infarto al miocardio anamnésico se define según Alpert. El accidente cerebrovascular se define por un déficit neurológico persistente >24 horas y se evaluó según la escala de accidente cerebrovascular Rankin modificada. El avance de la ateroesclerosis de arteria carótida se definió como un aumento en la estenosis, como mínimo, en un grado angiográfico NASCET.

Determinación del genotipo: se asiló el ADN de sangre entera anticoagulada con EDTA por medio de purificación con ácido nucleicos basada en columna giratoria. La determinación del genotipo se hizo en un termociclador rápido en tiempo real ABI TaqMan® 7900HT (Applied Biosystems, Rotkreuz, Suiza) utilizando el ensayo de 5’-nucleasa [7]. Este ensayo incluye la unión específica de la secuencia de sondas de ADN marcadas. Durante la fase de alineación de cada etapa, las sondas específicas de secuencia con un fluoróforo en sus extremos 5’ se unen a su alelo respectivo. La fluorescencia del fluoróforo se enmascara por un extintor 3’, hasta que la 5’-Taq-polimerasa separa estos compuestos por su actividad de 5’-exonucleasa durante la fase de alargamiento. La medición del punto final de la intensidad de la fluorescencia específica de secuencia indica la presencia del alelo correspondiente. En el presente estudio, se analizó rs465563 en un volumen de reacción total de 10 pl utilizando el ensayo de clasificación del genotipo comercialmente disponible TaqMan® SNP (Assay ID: C 717358_1_, Applied Biosystems) y la mezcla maestra para la determinación del genotipo TaqMan® (Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo estándar suministrado por el fabricante. Los resultados se interpretaron utilizando el software de detección de secuencia SDS 2.4 (Applied Biosystems).

Análisis Estadístico: se dan datos continuos con respecto a su distribución como desviación media y estándar o intervalo medio e intercuartílico. Los datos categóricos se presentan como conteos y porcentaje. La presencia de distribución normal dentro de los subgrupos se evaluó mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov. Las variables métricas se compararon por las pruebas U de Mann-Whitney. Las conexiones entre los genotipos y los puntos finales del estudio, así como los riesgos relativos se estimaron por medio de tablas de contingencia y pruebas de Pearson %2. La supervivencia libre de eventos se estimó mediante el análisis Kaplan-Meier, los datos se compararon por pares por las pruebas Log Rank (Mantel-Cox). Los modelos multivariables se calcularon por medio de regresión logística binaria y evaluaron haciendo gráficas ROC (receptor-operador-características). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos a p<0,05, a menos que de indicase algo diferente. Todos los valores p se interpretaron bilaterales a menos que se indicase lo contrario. Todos los cálculos estadísticos se hicieron utilizando IBM SPSS 20.0 (IBM Corporation, Armonk, USA).

Resultados

Absorción de sedoheptulosa derivada de la dieta en humanos

Para determinar si la sedoheptulosa nutricional se absorbe de la dieta a través del tracto digestivo en la sangre humana, que es un paso crítico para que la sedoheptulosa se convierta en un hidrato de carbono activo metabólico, los niveles de glucosa (C6) y sedoheptulosa (C7) se midieron en zanahorias y suero humano. Para determinar proporción de C6/C7 de las zanahorias el tejido de la planta se homogenizó, se extrajeron las fracciones moleculares pequeñas y se midieron simultáneamente las cantidades de glucosa y sedoheptulosa relativas por GC-MS (figura 1A). Las hojas de la Sedum Spectabile, una suculenta planta que contiene altos niveles de sedoheptulosa, se analizaron en paralelo como control positivo. Las hojas de la Sedum Spectabile contenían glucosa y aproximadamente el doble de sedoheptulosa, que resultó en una proporción de C6/C7 de aproximadamente 0,5. En zanahorias orgánicas de grado alimenticio frescas se detectaron casi iguales cantidades de glucosa y sedoheptulosa y, por lo tanto, una proporción de C6/C7 de aproximadamente 1. A diferencia de las zanahorias, se informó que las patatas no contenían sedoheptulosa (Kardon et al., FEBS Lett. (2008) 15 de octubre, 582(23-24)) y por consiguiente se esperaba que tuvieran una alta proporción (o incluso infinita) de C6/C7. A continuación, se prestó a tención a si la sedoheptulosa derivada de la dieta, que se origina de las zanahorias, llega a la sangre humana monitoreando el nivel sérico de la glucosa y la sedoheptulosa antes y después de una comida que contenía principalmente zanahorias al vapor (~700 g por adulto macho) con algo de aceite de oliva, sal y pimienta. Dos horas después del alimento, se observó un aumento de aproximadamente dos veces en los niveles séricos de sedoheptulosa en humanos (figura 1B). Este resultado claramente indicó que la sedoheptulosa nutricional se absorbe por el tracto digestivo humano y que entra en la sangre para hacerse disponible como un hidrato de carbono para el posterior metabolismo. Los niveles de glucosa sérica se normalizaron ya dentro de dos horas después de del consumo de alimentos y, por lo tanto, sugiere que los humanos metabolizan la sedoheptulosa y la glucosa de forma diferente.

Estos resultados indican que las zanahorias, que se consideran como vegetales sanos y constituyentes de dietas alrededor del mundo, son una fuente natural de sedoheptulosa para los humanos. Es interesante mencionar que las zanahorias, a pesar de contener hidratos de carbono, tales como glucosa, son adecuadas y bien toleradas por diabéticos y aún protegen a las personas con factores de riesgo genéticos para diabetes de tipo 2 (Patel CJ et al., Hum Genet. 132 (2013): 495-508).

La proporción de C6/C7 en productos alimenticios para humanos naturales y fabricados

A continuación, la concentración de glucosa, fructosa y sedoheptulosa se midió en extractos de hidratos de carbono de Coca- Cola®, Red Bull®, zumo de naranja, manzana, tomate y zanahoria para establecer el índice C6/C7 de bebidas comunes y, por lo tanto, estimar la exposición real a sedoheptulosa de los humanos. Los refrescos y bebidas energéticas contenían glucosa y fructosa, pero no sedoheptulosa (figura 1C). Los zumos de fruta contenían cantidades similares de C6 (la suma de glucosa y fructosa) a las bebidas refrescantes/energéticas (intervalo de 100 mM), pero a diferencia de las anteriores también contenían sedoheptulosa en el intervalo de 100 pMI. En zumos de vegetales los niveles de glucosa y fructosa se redujeron, mientras las concentraciones de sedoheptulosa se encontraron mayormente aumentadas (intervalo mM). Las proporciones de C6/C7 de las bebidas individuales, calculadas como relaciones molares, así como en peso se dan en la figura 1D. En dos zumos de frutas se encontraron proporciones de C6/C7 de aproximadamente 2000/1. En los zumos de tomate y zanahoria la proporción fue de 75/1 y 20/1, respectivamente; Coca-Cola® y Red Bull® no contenían cantidades detectables de sedoheptulosa. Por lo tanto, las proporciones de C6/C7 de estas bebidas no se pudieron calcular y por lo tanto no son aplicables (N.A.) para tales productos alimenticios si no está adicionalmente suplementados con C7. Estos descubrimientos claramente indican que los productos alimenticios fabricados carecen de la complejidad de los hidratos de carbono y, por lo tanto, también de sedoheptulosa. De forma notable, en números absolutos, estos datos indican que se consume 1 kg de sedoheptulosa derivada de la dieta por 9 kg de glucosa derivada de la dieta si la mezcla de carbono natural del zumo de zanahoria se seleccionara sobre las bebidas refrescantes/energéticas; actualmente se desconocen las consecuencias de la carencia de sedoheptulosa crónica por una nutrición humana desequilibrada.

La sedoheptulosa cinasa oscila y se expresa altamente en tejido metabólicamente activo.

Para entender cómo la sedoheptulosa cinasa CARKL y por lo tanto el metabolismo de la sedoheptulosa se distribuye y controla en varios tejidos de mamífero, se ensayaron los niveles de expresión de ARNm de diferentes tejidos. La expresión de CARKL, en una base de datos públicamente disponible para perfiles de expresión circadiana (CircaDB), se encontró oscilante en hígado de ratón (período 20.0, figura 2A) y la glándula adrenal (período 24.0, datos no mostrados). Anteriormente se informó de que los niveles de sedoheptulosa-7P oscilaban en plantas, llegando a picos durante la fase regenerativa de la fijación del carbono para reconvertirse en fracciones de ribosa. El reloj circadiano de mamífero en parte se determina por el estado redox. Células RAW264.7 que sobreexpresaban CARKL indicaron que la alta expresión de sedoheptulosa cinasa induce un incremento de 4 veces los factores redox como dinucleótido de nicotamida adenina reducido, (NADH) y también el incremento del nivel de glutatión (GSH) (figura 2B y Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). La deficiencia de CARKL y, por consiguiente, también la falta de producción metabólica de sedoheptulosa mostró el efecto opuesto (figura 2C). Estos datos indican que el metabolismo de la sedoheptulosa está bajo el control del ritmo circadiano y actúa simultáneamente como modulador de los estados redox celulares. Con el fin de especificar qué tejido consume sedoheptulosa nutricional, se midieron los niveles de ARNm de sedoheptulosa cinasa (CARKL) en una biblioteca de tejidos de ADNc de ratón (figura 2D). La sedoheptulosa cinasa es la enzima que limita la tasa de metabolismo de la sedoheptulosa y fue altamente expresada en hígado, riñón, tejido adiposo marrón y blanco (BAT, brown adipose tissue y WAT, white adipose tissue), órganos digestivos, en glándulas, en el sistema reproductor del hombre así como en el cerebro. Estos resultados demuestran que la sedoheptulosa derivada de la dieta puede convertirse en una fuente de hidrato de carbono sistémica para muchos tejidos, pero especialmente para órganos metabólicamente activos, tales como hígado, riñón y tejido adiposo.

El metabolismo de la sedoheptulosa es importante para la función y salud metabólica de las células.

Para investigar las consecuencias metabólicas de la exposición a sedoheptulosa, se expusieron células humanas y murinas en el medio de cultivo a glucosa en combinación con fructosa (GF) o bien a glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS), mientras se mantuvo la carga total de hidratos de carbono constante. La función del adipocitos, hepatocitos y macrófagos se ensayó para evaluar la importancia de la sedoheptulosa en complementar cargas de hidrato de carbono nutricional. La sedoheptulosa utilizada en estos experimentos se asiló de plantas sedum telephium.

En el cuerpo humano, los adipocitos cumplen con la función crucial de almacenar energía en forma de lípidos y por lo tanto son células muy importantes para mantener la salud. En pacientes metabólicamente no sanos o en la mayor parte de los pacientes mórbidamente obesos los adipocitos no funcionan de forma adecuada, aumentan su tamaño de célula para representar cargas excesivas de lípidos, se inflaman (metainflamación, un tipo de inflamación de bajo grado pero crónica) y finalmente contribuyen al desarrollo de trastornos como resistencia a insulina o enfermedades cardiovasculares. En los adipocitos humanos, diferenciados de células precursoras subcutáneas, se encontró un aumento en la expresión de ARNm de sedoheptulosa cinasa CARKL si la sedoheptulosa se adicionaba al medio de cultivo (figura 3A). Además, se observó un aumento en la expresión de la adiponectina y UCP-1, dos genes marcadores de adipocitos relevantes funcionales, en células tratadas con GFS en comparación con las de GF (figura 3B y 3C). Para ensayar los cambios en el metabolismo celular, se midieron las tasas de consumo de oxígeno celular (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) como indicadores para respiración mitocondrial y fermentación del ácido láctico, respectivamente. Los adipocitos humanos, diferenciados y cultivados en medio que contenía sedoheptulosa, mostraron una ECAR comparable con controles WS, mientras sus tasas de consumo de oxígeno celular aumentaron (figura 3D y 3E).

Conjuntamente, estos datos muestran que los adipocitos subcutáneos mantienen y mejoran su función (aumento en la adiponectina, UCP-1 y consumo de oxígeno) en la presencia de sedoheptulosa en comparación con una situación en la que solamente está presente glucosa y fructosa como biocombustible.

Para definir mejor el papel beneficioso de la sedoheptulosa en la prevención de estados metabólicamente no saludables, como inflamación de bajo grado crónica, se midieron los perfiles de citocina de adipocitos murinos maduros primarios, hepatocitos murinos primarios, y macrófagos no expuestos así como primarios activados inducidos por lipopolisacárido (LPS) cultivados en medio GF o GFS. Los adipocitos maduros, que se cultivaron en medio que contenía sedoheptulosa, produjeron menos ARNm de TNFa e IL-6 que los adipocitos cultivados con glucosa y fructosa solamente (figura 3F y 3G). De forma similar a esto, los hepatocitos también produjeron menos IL-6 si se cultivaron con sedoheptulosa (figura 3H). En macrófagos primarios la expresión basal de ARNm de TNFa e IL-6, y la secreción de citocinas se encontraron bloqueadas por medio que contenía sedoheptulosa (figura 3I-3L). La activación de macrófagos inducida por LPS resultó en una secreción de TNF-a e IL-6 fuertemente aumentada en células cultivadas en GF (figura 3M y 3N). Los macrófagos inducidos por LPS cultivados en medio GFS aumentaron IL-6 a niveles comparables con macrófagos tratados con GF, pero redujeron su secreción de TNFa en aproximadamente el 40%. Esto muestra que la adición de sedoheptulosa a macrófagos por un lado reduce su estado inflamatorio basal, medido por TNFa e IL-6, pero por el otro retiene su función natural en inmunidad como se ve para IL-6.

Para concluir, la adición de sedoheptulosa al medio de cultivo aumentó significativamente la función del adipocito subcutáneo y redujo el estado inflamatorio de las células y, por lo tanto, podría tener una influencia positiva en la patogénesis de la obesidad, diabetes de tipo II y enfermedades cardiovasculares también resumidas en parte por el síndrome metabólico.

Sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa CARKL

Se generaron ratones transgénicos que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa ubicuamente en el cuerpo entero para aislar células primarias diseñadas por ingeniería genética aisladas que sobreexpresaban CARKL y para probar el metabolismo de la sedoheptulosa in vivo. Los ratones transgénicos CARKL no mostraron ningún fenotipo obvio y el peso de sus órganos no fue diferente del peso de los órganos de animales de control de crías WT (datos no mostrados). Se hipotetizó que el metabolismo aumentado de la sedoheptulosa puede lograrse aumentando la concentración del sustrato de sedoheptulosa, o bien elevando el nivel de su enzima sedoheptulosa cinasa que limita la tasa (CARKL). Para probar esto en un ensayo de cinasa in vitro, se incubó una cantidad constante de proteína CARKL recombinante con dosis crecientes de sedoheptulosa. Esto dio como resultado tasas de producción metabólica de sedoheptulosa aumentadas, medidas por formación de ADP (figura 4A). Se observó el mismo efecto aumentando la concentración de la proteína CARKL, mientras la concentración de la sedoheptulosa se mantuvo constante (figura 4B). Estos resultados demuestran que la sobreexpresión de CARKL es un modelo válido para investigar los efectos del metabolismo de sedoheptulosa aumentado. A continuación, los hepatocitos primarios, dado que el tejido hepático parecía que metabolizaba endógenamente la sedoheptulosa (FIGURA 2D), se aislaron para estudiar los efectos del metabolismo de C7 y C6 a niveles de expresión aumentados de CARKL.

Los hepatocitos se cultivaron en medio con una proporción de azúcar C6/C7 de 2:1 y se evaluaron metabólicamente comparando la ECAR y OCR como parámetros metabólicos más generales. Los hepatocitos de ratones que sobreexpresaban CARKL aumentaron significativamente su tasa metabólica, tal como los niveles de ECAR y oCr aumentados indicaron, si se comparaban con células de control WT (figura 4C y 4D). Pareció que la sedoheptulosa indujo un metabolismo más eficiente en estas células. Para probar la relevancia de la expresión de sedoheptulosa y sedoheptulosa cinasa juntas, los hepatocitos aislados de ratones WT y CARKL se incubaron en medio que contenía GF y GFS y su ECAR inducida por glucosa se comparó (después de 1 hora de privación de hidratos de carbono) como una medida para controlar la glucólisis celular. En hepatocitos de WT la EcAr inducida por glucosa se redujo por la administración de sedoheptulosa (figura 4E). En línea con estos datos, los hepatocitos estimulados con glucosa de animales WT cultivados en GF (sin sedoheptulosa) llevaron una gran parte de la glucosa a la fermentación del ácido láctico, mientras las células de ratones que sobreexpresaban CARKL pareció que equilibraban el mismo bolo de glucosa más eficientemente.

Estos resultados, además, soportaron los datos previos y claramente indicaron que el metabolismo de sedoheptulosa aumentado tiene efectos diferentes y beneficiosos en las células, lo que es importante para la salud metabólica.

Metabolismo de sedoheptulosa in vivo

Después de validar los fenotipos celulares de la sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa en hepatocitos, el efecto metabólico de la producción aumentada de sedoheptulosa para un organismo completo se investigó mediante la comparación del coeficiente respiratorio (RQ, respiratory quotient; RQ = CO2 exhalado/consumo de oxígeno), así como el consumo energético por actividad física de ratones de control y transgénicos con sedoheptulosa cinasa, medidos por calorimetría indirecta durante el día y la noche como indicadores sistémicos del metabolismo (figura 4F y 4G). Los animales que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa (CARKL) tienen valores de RQ inferiores comparados con las crías de tipo silvestre (WT). Los ratones CARKL mostraron un consumo de oxígeno aumentado y, por lo tanto, valores de RQ más bajos, y parcialmente replicaron los efectos de la sedoheptulosa en las células. Además, los ratones CARKL también tienden a tener un EE inferior por actividad si se compara con los ratones de control. La sensibilidad a insulina de ratones hembra transgénicos CARKL y ratones WT también se compararon mediante una prueba de tolerancia a insulina (ITT, insulin tolerance test), para investigar si el metabolismo de la sedoheptulosa también afecta la señalización de la insulina in vivo. La inyección de insulina (i.p.) redujo el nivel de glucosa en sangre en ratones que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa más rápido que los controles WT, indicando que la sensibilidad a insulina también aumentó en estos animales al aumentar el metabolismo de la sedoheptulosa (figura 4H). En este contexto es importante mencionar que la inducción de la resistencia a insulina en adipocitos maduros, por tratamiento con TNFa e hipoxia, resultó en pérdida de sedoheptulosa cinasa (datos generales de expresión génica disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc=GSM1261655).

Conjuntamente, estos experimentos mostraron que el metabolismo de sedoheptulosa aumentado no solamente altera el metabolismo in vitro sino también in vivo. Los valores de RQ más bajos observados en ratones CARKL combinados con la tendencia de un EE inferior por actividad física y la sensibilidad aumentada a insulina son indicativos de un programa metabólico más eficiente y sostenible que puede ser inducido mediante el aumento del metabolismo de la sedoheptulosa.

La deposición lipídica hepática se reduce por CARKL

La extensiva deposición lipídica en hepatocitos resulta en la enfermedad de hígado graso y puede estar acompañada por inflamación (es decir, esteatohepatitis no alcohólica (NASH, non-alcoholic steatohepatitis)) que causa fibrosis hepática, cirrosis, y eventualmente carcinoma hepatocelular. Se comparó el contenido lipídico de los hepatocitos de ratones que sobreexpresaban CARKL y WT y se encontró que los hepatocitos de ratones CARKL contenían menos gotas lipídicas que sus controles WT. (figura 5A).

En conclusión, el alto contenido de grasa en el hígado, especialmente en combinación con inflamación, incluyendo el mal funcionamiento de los adipocitos, aumenta el riesgo de muchas enfermedades incluyendo diabetes de tipo 2 o cáncer, de esta forma tanto la reducción de la inflamación como la acumulación de lípidos en hepatocitos por la sedoheptulosa podría ser especialmente valiosa para la nutrición humana (véanse los vegetales, que contienen altos niveles de C7).

CARKL regula la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), la enzima limitante de la tasa del brazo oxidativo de la ruta de pentosa fosfato (PPP, pentose phosphate pathway) que genera cuerpos C5, es decir, para la síntesis de nucleótidos y equivalentes redox, se mostró anteriormente que se inhibía directamente por p53 (supresor tumoral) (Jiang et al., Nat Cell Biol. (2011) Mar; 13(3):310-6). La mutación en p53, el gen más frecuentemente mutado en tumores humanos, resulta en la hiperactivación de G6PD y la acumulación de lípidos en hepatocitos. La sedoheptulosa cinasa es la cinasa que limita la tasa del brazo no oxidativo de la PPP y se mostró anteriormente que reducía el flujo de la PPP oxidativo, como mínimo, en macrófagos. Para probar una posible regulación de la actividad de G6PD en hepatocitos por el metabolismo de sedoheptulosa, se comparó la actividad enzimática de células WT y de las que sobreexpresaban CARKL (FIGURA 5B). En células de control WT se observó que la actividad de la G6PD estaba distribuida uniformemente, mientras en células de ratones CARKL se observó una relocalización de G6PD y, por lo tanto, una actividad reducida del espacio interior de las células. De forma interesante, se obtuvo el mismo fenotipo incubando células WT en medio de cultivo celular con sedoheptulosa (no mostrado). Si la relocalización y/o la inhibición de G6PD por la sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa y la incubación de sedoheptulosa fueron la causa de la acumulación reducida de lípidos en hepatocitos (figura 4A), queda por establecerse. Sin embargo, estos datos, en combinación con datos de macrófagos muestran que un elevado nivel de sedoheptulosa puede actuar como una contramedida para la pérdida de p53 en células cancerígenas, como mínimo, por la actividad de G6PD negativamente regulada en algunos casos. Otro ejemplo son las células cancerígenas de pecho dependientes de estrógeno que reducen la expresión de CARKL en respuesta al factor de crecimiento del estrógeno (datos del depósito GeneChip públicos disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/; ID: 53372898; GDS3285/219713_at/SHPK), que a su vez podrían resultar en una actividad G6PD aumentada y, posteriormente, el crecimiento del tumor.

Estos datos también implementan el metabolismo de sedoheptulosa como un objetivo adecuado para regular la actividad de G6DP y para estrategias anticancerígenas futuras.

Sedoheptulosa y metabolismo óseo

Es hueso es un tejido extremadamente dinámico. El equilibrio fino de la formación ósea y la resorción es esencial para la estabilidad mecánica del hueso apropiada. El desequilibrio entre la formación ósea y la resorción es la causa de la osteoporosis, una afección altamente prevalente de densidad ósea reducida y microarquitectura ósea alterada que dan como resultado fragilidad ósea y fracturas patológicas. Como los osteoclastos, las células responsables de la resorción ósea se derivan del linaje de monocitos, cuya función está fuertemente impactada por el metabolismo de sedoheptulosa, también se ensayó si la función del osteoclasto puede modularse por la relación C6/C7.

Las células de médula espinal se diferenciaron in vitro a los osteoclastos mediante la exposición de las células a M-CSF en combinación con RANKL. Las células se cultivaron en placas, precubiertas con una matriz mineral ósea en el fondo del pocillo, para proporcionar sustrato a su actividad de resorción ósea. El análisis de la resorción del sustrato claramente demostró que tanto la sobreexpresión de CARKL como el aumento del contenido de C7 en el medio de cultivo, redujeron la formación de lagunas por los osteoclastos (figura 5C). De forma interesante, las lagunas de resorción más grandes se encuentran solamente en la ausencia de sedoheptulosa (figura 5D).

De nuevo, estos datos soportan el concepto de la presente invención de que una proporción C6/C7 bien equilibrada es crucial para mantener la salud y que C7 tiene el potencial de aliviar las situaciones patofisiológicas de la osteoporosis en humanos.

La sedoheptulosa cinasa regula la respuesta inmunitaria de animales

Los datos de la sobreexpresión de CARKL y sus efectos en el sistema inmunitario de ratón en un modelo de activación inmunitaria aguda y en la inflamación de tejido adiposo maduro en bajo grado se presentan con los presentes ejemplos. En ratones CARKL se provocó la inflamación aguda mediante una inyección subletal de lipopolisacárido (LPS), que resultó en una respuesta suprimida de citocina comparada con los controles de tipo silvestre (figura 6A). Se midió un panel de 19 citocinas en suero de ratón WT y CARKL, que se aislaron 24 horas después de la inyección de LPS (7 mg/kg, IP), mediante un perfilador de citocina de ratón. Doce citocinas alcanzaron el umbral del 50% de cambio medio, que se definió como el punto de corte para resaltar las citocinas reguladas por la sobreexpresión de CARKL in vivo. IL-13, MIP1a, RNA^tE^s, IL-12 (p70), IL-2, TNF- a, MCP1, KC, GM-CSF, IL-6, IL-17 y IL-15 se redujeron, como mínimo, en el 50% de cambio medio en ratones CARKL comparados con crías de tipo silvestre. Las citocinas IL-6, IL-17 e IL-15 aún alcanzaron un umbral de 75% de cambio medio. Además de la inflamación aguda, los niveles basales de citocinas proinflamatorias en tejido adiposo murino también se evaluaron de dos depósitos diferentes (tejido adiposo subcutáneo y epididimal) de ratones CARKL y de control WT. De forma coherente con la reducción de la inflamación inducida por LPS, los niveles de ARNm de TNFa y MCP1, una adipocina primaria que recluta macrófagos para el tejido adiposo y que pertenece a las citocinas proinflamatorias, se encontraron atenuados por la sobreexpresión de CARKL (FIGURA 6B-E).

Esto indica que un suplemento nutricional que contiene sedoheptulosa podría amortiguar la inflamación aguda y crónica de bajo grado. Por lo tanto, la activación del metabolismo de C7, por sedoheptulosa nutricional o clínicamente aplicada parece que es una medida efectiva para reducir inflamación y los trastornos asociados.

Un solo polimorfismo de nucleótido (SNP) en 3’-UTR del gen CARKL está asociado con el riesgo de accidente cerebrovascular.

Se clasificaron por genotipo 535 pacientes neurológicamente asintomáticos del Estudio de inflamación y arteria carótida - riesgo para ateroesclerosis (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209) para la sustitución de rs465563 [A] a [G] en 3’-UTR del gen CARKL. Treinta y tres (6,2%) pacientes sufrieron un accidente cerebrovascular dentro del período de observación. En esos pacientes, la distribución de alelos rs465563 fue significativamente diferente en comparación con las frecuencias de alelos del resto de la población del estudio (%2=12,639, df=2, p=0,002, véase figura 6F). En detalle, los portadores de homocigotos del alelo-[G] tienen un riesgo relativo de 3,93 (95% CI: 1,72 - 9,01) comparado con el homocigoto-[A], y 3,10 (95% CI: 1,40 - 6,87) en comparación con los individuos heterocigotos, respectivamente. La independencia estadística de la información del genotipo rs465563 se evaluó por medio de un modelo de regresión logística binaria que proporciona edad, sexo, historial de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular y, consumo de nicotina, índice de masa corporal, así como ciertas comorbilidades (hiperlipidemia, hipertensión, diabetes mellitus) como covariables (modelo: ^=30,476, df=11, p=0,001). Dentro de este modelo, el estado del portador del genotipo [G];[G] se presentó como un pronosticador significativo (relaciones posibles = 5,015, 95% CI: 1.803 - 13.943) cuando se compara con pacientes homocigotos para el alelo-[A]. Además, se ha evaluado por la elaboración de gráficas Kaplan-Meier si el tiempo de supervivencia libre de accidente cerebrovascular inicial depende del estado del portador rs465563. Ciertamente, los portadores homocigotos del alelo-[G] (1518,3 días, 95% CI: 1419,2 - 1617,4) presentaron una supervivencia libre de eventos significativamente más corta que los individuos heterocigotos (1619,1 días, 95% CI: 1584,8 - 1653,3, p=0,005) y los portadores del genotipo-[A];[A] (1788,1 días, 95% CI: 1755,7 - 1820,4, p=4,910-4) (figura 6G). Los individuos homocigotos para el rs465563: alelo-[G] muestran tiempos libres de eventos significativamente más cortos de que los portadores del alelo-[A].

Los antecedentes mecánicos de esta asociación clínica permanecen sin clarificar. Sin embargo, dada la habilidad de la CARKL para modular la polarización de macrófagos y el papel clave de lo anterior en la formación y progresión de las placas ateroescleróticas, parece probable que el polimorfismo rs465563 pueda tener un impacto en el riesgo de eventos cerebrovasculares a través de la modulación de la polarización de macrófagos dentro de las placas ateroescleróticas. Esta noción está soportada por la observación según la presente invención de que 3’- ^uT^rdel gen CARKL principalmente se transcribe en macrófagos.

En conclusión, esta asociación y los datos provistos sobre el metabolismo y la función de los adipocitos, hepatocitos, y macrófagos, en combinación con inflamación reducida y sensibilidad a insulina aumentada in vitro e in vivo fuertemente indica que la sedoheptulosa (azúcar C7) es un constituyente crítico para la nutrición humana y simultáneamente un medicamento altamente relevante para tratar deficiencias en C7 u otros estados de enfermedad metabólicos no saludables.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de sedoheptulosa como un inductor nutricional del consumo de oxígeno celular, en el que los usos terapéuticos en el cuerpo humano y animal están excluidos.

2. Uso de sedoheptulosa como un inhibidor nutricional de la acidificación extracelular, glicólisis y formación de lactato, en el que los usos terapéuticos en el cuerpo humano y animal están excluidos.

3. Uso de sedoheptulosa para reducir la carga glucémica en productos alimenticios, en el que los usos terapéuticos en el cuerpo humano y animal están excluidos.

4. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se añade sedoheptulosa a un producto alimenticio que ya contiene sedoheptulosa y para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que se aumenta, como mínimo, en el 10%, preferentemente para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que se aumenta, como mínimo, en el 100%, especialmente, como mínimo, en el 500%.

5. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se añade sedoheptulosa a un producto alimenticio que no contiene todavía sedoheptulosa y para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, el 0,001 % p/p, preferentemente, para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, el 0,01 % p/p, más preferente, como mínimo, el 0,1 % p/p, incluso más preferente, como mínimo, el 1 % p/p, especialmente, como mínimo, el 10 % p/p; o para productos alimenticios líquidos para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, el 0,01% p/v, más preferente, como mínimo, el 0,1 % p/v, incluso más preferente, como mínimo, el 1 % p/v, especialmente, como mínimo, el 10 % p/v.

6. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sedoheptulosa de un producto alimenticio se analiza con respecto a su contenido en % p/p, % p/v o concentración molar de hidratos de carbono C6, especialmente glucosa, fructosa y sus dímeros respectivos, y con respecto a su contenido en % p/p,% p/v o concentración molar de hidratos de carbono C7, estableciendo la proporción de hidratos de carbono C6 con respecto a hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p,% p/v:% p/v o como relación molar) para este producto alimenticio, y en el que la sedoheptulosa se añade al producto alimenticio en una cantidad para reducir la proporción de hidratos de carbono C6 a hidratos de carbono C7 (en % p/p:% p/p,% p/v:% p/v o como relación molar), como mínimo, en el 50%, preferentemente, como mínimo, en el 100%, especialmente, como mínimo, el 200%.

7. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en una bebida nutricional, una barra de cereales nutricional, un producto alimenticio dietético, un producto alimenticio de cereales, una bebida refrescante, una bebida deportiva, una bebida energética, un edulcorante nutricional, caramelo, repostería, producto lácteo, producto alimenticio para untar o funcional.

8. Procedimiento para producir un producto alimenticio que comprende añadir sedoheptulosa, como mínimo, del 60 % de pureza a un producto alimenticio, en el que el contenido en sedoheptulosa se aumenta en comparación con el producto alimenticio sin sedoheptulosa añadida, como mínimo, en el 10% p/p, preferentemente, como mínimo, el 20% p/p, especialmente, como mínimo, el 30% p/p; o en el que el contenido en sedoheptulosa se aumenta en comparación con el producto alimenticio sin sedoheptulosa añadida, como mínimo, del 60%, como mínimo, en el 50% p/p, preferentemente, como mínimo, el 100% p/p, especialmente, como mínimo, el 200% p/p.

9. Procedimiento para producir un producto alimenticio basado en un producto alimenticio que es originariamente libre de sedoheptulosa, en el que la sedoheptulosa, como mínimo, del 60% de pureza se añade para proporcionar un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, del 0,001 % p/p, preferentemente, para obtener un contenido en sedoheptulosa del producto alimenticio que es, como mínimo, del 0,1 %, más preferente, como mínimo, del 1 %, especialmente, como mínimo, del 10%.

10. Procedimiento, según la reivindicación 8 o 9, en el que el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en una bebida nutricional, una barra de cereales nutricional, un producto alimenticio dietético, un producto alimenticio de cereales, una bebida refrescante, una bebida deportiva, una bebida energética, un edulcorante nutricional, caramelo, repostería, producto lácteo, producto alimenticio para untar o funcional.