BR122020014023B1

BR122020014023B1 - Usos de sedoeptulose

Info

Publication number: BR122020014023B1
Application number: BR122020014023-2A
Authority: BR
Inventors: Arvand Haschemi; Oswald Wagner; Csorsz Nagy; Rodrig Marculescu
Original assignee: C7 Sugar Gmbh
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2022-01-18
Also published as: EP2781218A1; AU2014234229B2; ZA201506564B; US20190069588A1; AU2019202147B2; BR112015023730B1; ES2856850T8; AU2014234229A1; JP6611702B2; AU2019202147A1; JP2016512704A; CN105307659A; US10130117B2; EP3747444A2; BR112015023730A2; WO2014147213A1; NZ711528A; PL2976088T3; US9675099B2; EP3747444A3

Abstract

a presente invenção se refere ao uso de sedoeptulose como um suplemento nutricional/suplemento alimentício.

Description

[0001] A presente invenção se refere ao campo de suplementaçãonutricional.

[0002] Um suplemento nutricional, também conhecido como suplemento alimentar ou suplemento dietético, é uma preparação projetada para complementar a dieta e fornecer nutrientes, como vitaminas, minerais, fibra, ácidos graxos, ou aminoácidos que podem estar faltando ou pode não ser consumidos em quantidades suficientes em uma dieta da pessoa. Alguns países definem suplementos dietéticos como alimentos, enquanto outros são definidos como fármacos ou produtos naturais de saúde.

[0003] Os suplementos que contêm vitaminas ou minerais dietéticos são incluídos como uma categoria de alimento no Codex Alimenta- rius, uma coleção de padrões internacionalmente reconhecidos, códigos de prática, linhas de orientação e outras recomendações alimentos, produção de alimentos e segurança de alimentos. Esses textos são regidos pela Comissão de Codex Alimentarius, uma organização que é patrocinada pela Organização de alimento e Agricultura (FAO) das Nações Unidades e a Organização Mundial da Saúde (WHO).

[0004] Os americanos, em geral, consomem uma quantidadealarmante de açúcar de 1 a 1,5 kg (principalmente como glicose) a cada semana, o que não é surpreendente considerando que açúcares altamente refinados nas formas de sacarose (açúcar de tabela), dextrose (açúcar de milho) e milho xarope com alta frutose estão sendo processados em tantos alimentos como pão, cereal de café da manhã, maionese, pasta de amendoim, ketchup, molho de tomate e várias refeições de micro-ondas e bebidas.

[0005] Uma das maiores desvantagens do açúcar é que o mesmo eleva o nível de insulina, o que inibe a liberação de hormônios do crescimento, o que, por sua vez, causa um baixo sistema imunológico. Um influxo de açúcar na corrente sanguínea atrapalha o equilíbrio de açúcar no sangue do corpo, despertando a liberação de insulina que o corpo usa para manter açúcar no sangue em um nível constante e seguro. A insulina também promove o armazenamento de gordura, de modo que, quando a pessoa ingere doces com alto teor de açúcar, a mesma tem ganho de peso rápido e níveis de triglicerídeo elevados, em que ambos estão ligados à doença cardiovascular. Os carboidratos complexos tendem a ser absorvidos mais lentamente, diminuindo o impacto sobre os níveis de açúcar no sangue.

[0006] Os perigos relacionados à saúde de pessoas criados pelaingestão habitual de açúcar são determinados. Constatou-se que açúcares simples, especialmente glicose, agravaram asma, oscilações de humor, provocam alterações na personalidade, doença mental, distúrbios nervosos alimentares, causam diabetes, aceleram doença do coração, causam cálculos biliares, apressam hipertensão e causam artrite.

[0007] O índice glicêmico ou índice de glicemia (GI) fornece umamedida de como elevar rapidamente níveis de açúcar no sangue (isto é, níveis de glicose no sangue) após comer um tipo particular de alimento. Os efeitos que alimentos diferentes produzidos em níveis de açúcar no sangue variam consideravelmente. O índice glicêmico avalia como muito cada grama de carboidrato disponível (carboidrato total menos fibra) em um alimento que eleva um nível de glicose no sangue da pessoa seguido pelo consumo do alimento, em relação ao consumo de glicose pura. A glicose tem um índice glicêmico de 100. Uma limitação prática do índice glicêmico é que o mesmo não leva em consideração a quantidade de carboidrato consumida de fato. Uma medida relacionada, a carga glicêmica, os fatores na multiplicação do índice glicêmico do alimento em questão pelo teor de carboidrato da porção real.

[0008] Um alimento com baixa GI liberará glicose mais lenta econstantemente, o que conduz às leituras de glicose mais adequadas no sangue após a refeição (após alimentação). Um alimento com alta GI gera uma elevação mais rápida nos níveis de glicose no sangue e é adequada para recuperação de energia após prática de exercício ou para uma pessoa que vivenciou hipoglicemia.

[0009] O efeito glicêmico de alimentos depende de vários fatorescomo o tipo de amido (amilose contra amilopectina), armadilha física das moléculas de amido dentro do alimento, teor de gordura e proteína do alimento e de ácidos orgânicos ou seus sais na refeição — com adição de vinagre, por exemplo, irão reduzir a GI. A presença de gordura ou fibra dietética solúvel pode reduzir a taxa de esvaziamento gástrico, reduzindo, assim, a GI. Em geral, pães granulados e ásperos com quantidades mais altas de fibra têm um valor de GI inferior aos pães brancos. No entanto, a maioria dos pães feitos com 100% de farinha integral ou farinha de trigo integral tem uma GI não um lote total diferente de endosperma apenas (branco) pão. Vários pães marrons são tratados com enzimas para suavizar a crosta, o que torna o amido mais acessível (alta GI).

[0010] Embora a gordura ou proteína que são adicionadas irão reduzir a resposta glicêmica a uma refeição, as diferenças relativas per-manecem. Isto é, com ou sem adições, ainda há uma curva de glicose no sangue mais alta após um pão com alta GI do que após um pão com baixa GI como pão preto. As frutas e vegetais tendem a ter um índice glicêmico baixo. O índice glicêmico pode ser aplicado apenas a alimentos em que o teste se submete a indivíduos que consomem uma quantidade de alimento contendo 50 g de carboidrato disponível. Entretanto, várias frutas e vegetais (não batatas, batatas doces, milho) contêm menos de 50 g de carboidrato disponível por porção típica. As cenouras foram relatadas original e incorretamente como tendo uma alta GI. As bebidas alcóolicas foram relatadas como tendo baixos valores de GI, mas deve-se observar que a cerveja tem uma GI moderada. Os estudos recentes demonstraram que o consumo de uma bebida alcóolica antes de uma refeição reduz a GI da refeição em aproximadamente 15%. O consumo de álcool moderado mais de 12 horas antes de um teste não afeta a GI.

[0011] Várias dietas modernas baseiam-se no índice glicêmico. Noentanto, outras ressaltaram que os alimentos geralmente considerados como não saudáveis podem ter um índice glicêmico baixo, por exemplo, torta de chocolate, sorvete ou frutose pura, ao passo que alimentos como batatas e arroz, comidos em países com baixas taxas de diabetes, têm GIs ao redor de 100.

[0012] É um objetivo da presente invenção fornecer suplementosnutricionais que aperfeiçoam o metabolismo energético do alimento em humanos. É um objetivo adicional fornecer um índice de classificação de alimento alternativo para a GI que leva em consideração o efeito do produto alimentício no metabolismo.

[0013] Portanto, a presente invenção fornece o uso de sedoeptu-lose como um indutor nutricional de consumo de oxigênio celular. A presente invenção também fornece o uso de sedoeptulose, um inibidor nutricional de acidificação extracelular, glicólise e formação de lactato. A presente invenção também fornece o uso de sedoeptulose para reduzir carga glicêmica em produtos alimentícios. A presente invenção também fornece o uso de sedoeptulose como um suplemento nutricional, especialmente para proteger contra uma deficiência de falta de sedoeptulose em indivíduos saudáveis, isto é, fornecer sedoeptulose sem necessidade ou antecedente terapêutico.

[0014] A presente invenção faz uso do fato de que a sedoeptuloselivre é uma fonte de carbono relevante e acessível em humanos. Ademais, a biodisponibilidade de sua forma fosforilada, sedoeptulose-7- fosfato, para funcionar como um reostato para metabolismo de carboidrato de hexose na interface de glicólise e na trajetória de pentose- fosfato, bem como para respiração mitocondrial. A sedoeptulose nutricional parece equilibrar o consumo de glicose celular, a queima de gordura, regulação de redox, inflamação e, por conseguinte, distúrbios relacionados.

[0015] É mostrado com a presente invenção que o valor nutricionaldistinto é fornecido pela adição de sedoeptulose aos produtos alimentícios comparado a todos os carboidratos ora usados, incluindo adoçantes não calóricos e calóricos geralmente usados. Portanto, a presente invenção se refere a equilíbrio de consumo de C6 (acima), evitando, assim obesidade ou diabetes e otimizando e fortalecendo função imune e utilização de energia. Consequentemente, o suplemento "nutricional", de acordo com a presente invenção é usado com o sentido de "fornecer ou aprimorar utilização de nutrientes" pela adição de sedoeptulose a produtos alimentícios e fornecendo, assim. Produtos alimentícios novos e aprimorados com um teor de sedoeptulose (ou fornecendo produtos alimentícios aumentando (adicionalmente) o teor de sedoeptulose). O C7 nutricional suplemento de acordo com a presente invenção, portanto fornece uma estratégia eficaz para regulação de redox fisiológica redox e também para gerenciar perturbações ou distúrbios metabólicos. Consequentemente, a presente invenção significativamente difere do adoçante com caloria reduzida ou uso substituto do açúcar mascavo sugerido nos Documentos No WO 2006/027796 A2 e WO 2006/093848 A2.

[0016] Conforme estabelecido anteriormente, a indústria alimentícia usa atualmente altas quantidades de açúcares com C6 (açúcares com C6 são glicose, frutose e sacarose e maltose (como dímeros respectivos dos mesmos)) como suplementos nutricionais. A maioria dessas hexoses é usada como um adoçante (isto é, não como um suple- mento "nutricional", mas como um intensificador de gosto ou sabor) e são amplamente discutidos por aumentar o risco de doenças cardiovasculares, doença de Alzheimer, síndrome metabólica, obesidade e diabetes. A razão de carboidratos C6 para C7 é distribuída por aplicação em excesso de C6. A adição de C7 (isto é, principalmente, sedo- eptulose, no entanto, a combinação com outros açúcares C7 também é possível, especialmente manoheptulose; além de sedoeptulose isoladamente, C7 pode ser definido como "sedoeptulose com ou sem manoheptulose em uma razão em % de sedo/mano em p/p de pelo menos 10.000:1, de preferência, pelo menos 1.000:1 e especialmente, pelo menos 100:1") irá equilibrar cargas glicêmicas aumentadas. C7 não é tão doce quanto C6 e, portanto, não altera significativamente o gosto de alimentos suplementados. Os carboidratos C7 têm uma função distinta no carboidrato celular e no metabolismo da gordura e, por conseguinte, geram efeito na nutrição bem como aspectos relacionados a cuidados com a cura em vertebrados.

[0017] Consequentemente, a presente invenção fornece o ensinamento de que a adição de C7 a dietas resulta em metabolismo aprimorado e equilibrado em humanos e camundongos. O suplemento nutricional contendo C7, de acordo com a presente invenção, tem o potencial claro de alterar a preferência por produtos alimentícios adoçados por C6 em relação a problemas relacionados a cuidados com a saúde.

[0018] Com a presente invenção obtém-se também um novo parâmetro para eficácia nutricional, a razão de C6/C7 que é fornecida e disponibilizada para dietas-padrão natural e quimicamente projetadas, bem como ingredientes alimentares natural e quimicamente projetados. Com a presente invenção também seria demonstrado que o consumo de C7 gerencia eficiência de energia, gerencia saúde do tecido e inflamação. Ademais, o consumo de C7 induzido e fornecido pela pre sente invenção também gerencia fortalecimento físico, regulação de redox fisiológica e, por conseguinte, também distúrbios relacionados, como diabetes e obesidade.

[0019] Sedoeptulose (número de CAS: 3019-74-7; PubChem:5459879; ChemSpider: 4573620; MeSH: sedoeptulose; ChEBI: CHE- BI:16802) ou D-altro-heptulose é uma cetoheptose — um monossaca- rídeo com sete átomos de carbono e um grupo funcional de cetona. É uma das poucas heptoses encontradas na natureza. A sedoeptulose pode ser produzida mediante extração de fontes naturais ou mediante síntese química. Pode ser purificada em altos graus de pureza (por exemplo, > 60% de pureza, de preferência, > 85% de pureza, mais de preferência, > 90% de pureza, mais de preferência, > 95% de pureza, ainda mais de preferência, > 99% de pureza, especialmente, > 99,9% de pureza).

[0020] A sedoeptulose é um metabólito relativamente desconhecido comparado a sua forma fosforilada, sedoeptulose-7-fosfato (S7P), que é reconhecida como uma molécula intermediária de metabolismo de glicose primária. A existência natural de sedoeptulose foi relatada primeiro em plantas, foi identificada subsequentemente na urina humana, pontos de sangue e, recentemente, dentro de células de camundongo. A S7P é derivada da conversão de catalisada por trans- quetolase- de ribose-5-fosfato (R5P) e xilulose-5-fosfato (X5P). Essa reação ocorre no braço não-oxidativa da trajetória de pentose-fosfato e gera gliceraldeído-3-fosfato (G3P), um intermediário-chave glicolítico, adicionalmente a S7P. G3P e S7P também são produzidos por transaldolase com uso de frutose-6-fosfato (F6P) e eritrose-4-fosfato (E4P) como substratos. Portanto, a S7P é um intermediário crucial na biodis- ponibilidade de PPP e S7P não oxidativa, portanto, contribui para fluxo de carbono celular. Recentemente, os dados a partir de vários grupos indicaram que a sedoeptulose quinase também pode produzir S7P por fosforilação direita de sedoeptulose (Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826). Esta constatação demonstrou a existência inesperada de uma fonte de carbono adicional, sedoeptulose, que participa ativamente do metabolismo de carbono celular (Nagy and Haschemi, Bi- ochem Soc Trans. 2013).

[0021] A sedoeptulose livre pode tanto ser derivada de frutas e vegetais da diet como pode ser preparada enzimaticamente pela desfos- forilação de S7P endogenamente produzida. Até o momento, nenhum carreador de sedoeptulose específico ou fosfatase de S7P específica foi relatado. Outras heptoses bioativas incluem o composto fenólico 7- O-Galoil-sedoeptulose (GS), manoheptulose e glucoheptose. A GS foi relatada como protetora de danos diabéticos do rim aliviando respostas inflamatórias. A manoheptulose (várias patentes pendentes) é um isômero de sedoeptulose e um inibidor de hexoquinase potente geralmente encontrado em avocados. A glucoheptose, embora a natureza química desse composto permaneça não identificada, foi mostrada como adequada para fonte de carboidrato acessível em coelhos. Se- doheptulosana é o anidrato de sedoeptulose e pode servir também como fonte para sedoeptulose livre.

[0022] A sedoeptulose livre pode ser isolada, por exemplo, a partirda planta sedum spectabile e foi relatada anteriormente por conter altar quantidades de carboidratos de heptose.

[0023] Os fosforilatos de sedoeptulose quinase livre de sedoeptu-lose, que permite que as células adicionem diretamente sedoeptulose para metabolismo de carboidrato, semelhante à hexoquinase e glicose. De acordo com a presente invenção, a sedoeptulose é uma fonte de carbono direta que alimenta catabolismo e anabolismo de carboidrato primário, segundo a qual a sedoeptulose quinase (CARKL) constitui seu ponto de entrada. Portanto, a edoeptulose pode surpreendentemente ser comparada à glicose e frutose por causa da existência de todos esses compostos como carboidratos livres e formas fosforiladas. Para entrar no metabolismo, os carboidratos livres são energicamente ativados por um evento de fosforilação inicial. A glicose de fosforilatos de hexoquinase para formar G6P e é um determinante-chave de fluxo de glicose celular. A frutose é fosforilada por cetohexoquinase a fim de formar frutose-1-fosfato (F1P) que deve ser primeiro convertida por aldolase em gliceraldeído e dihidroxiacetona fosfato (DHAP). O DHAP pode entrar diretamente no ciclo de carbono, ao passo que gliceraldeí- do deve ser fosforilado adicionalmente. A formação de S7P a partir de sedoeptulose por sedoeptulose quinase, de uma maneira análoga à formação de G6P a partir de glicose por hexoquinase, permite que a sedoeptulose livre entre prontamente no sistema catabólico. Também foi relatado que uma inibição competitiva de fosforilação F6P ocorre na presença de altas concentrações de S7P. Curiosamente, as frações contendo frutose 1,6-bisfosfatase (FBPase) também foram relatadas como possuindo atividade de sedoeptulose 1,7-bisfosfatase (SBPase).

[0024] Portanto, a presente invenção também é à base de umacoexistência dos shunts de hexose- e heptose-(bis)fosfato. Notavelmente, altos níveis de glicose ou incubação com F2,6bP aumentaram a formação de S1,7bP em fígado de rato aspergido e em citosol de fígado de rato, respectivamente. O glucagon, em contraste com alta glicose, favoreceu a desfosforilação de S1,7bP e, por conseguinte, a formação de S7P. Esses resultados mostram que o metabolismo de sedoeptulose é sensível a controle hormonal.

[0025] O metabolismo de sedoeptulose participa da regulação metabólica; na verdade, a sedoeptulose direciona fluxos metabólicos for-necendo um fornecimento de S7P independentemente da glicose. A expressão de CARKL aumentada (e, portanto, o consumo de sedoep- tulose aumentado) em uma linha celular de macrófago de camundongo resultou em níveis estaduais estáveis de G3P, X5P e R5P reduzi- dos, ao passo que o golpe de CARKL apresentou o efeito reverso. No-tavelmente, os níveis sedoeptulose basais não foram alterados por perturbação de CARKL. Os níveis de S7P não foram alterados por su- perexpressão, mas diminuídos significativamente por perda de CARKL, indicando fosforilação de sedoeptulose como um fator limitan- te de taxa para distribuição de G3P derivada de glicólise. Portanto, a regulagem de disponibilidade de S7P pode ser o mecanismo pelo qual CARKL ou quantidades em excesso de sedoeptulose modulam o metabolismo celular.

[0026] Portanto, a presente invenção se refere ao uso de C7, porexemplo, para equilibrar (super)consumo de C6, obesidade, diabetes, função imune e, geralmente, utilização de energia de vertebrados. O suplemento C7, portanto, também fornece uma estratégia eficaz para gerenciar regulação de redox fisiológica e, por conseguinte, também distúrbios relacionados. Com a presente invenção, acontece que, tanto alta sedoeptulose como alta sedoeptulose quinase resulta em recuperação de sedoeptulose acentuada. Ademais, a expressão de sedoep- tulose quinase tecidual revela que os órgãos metabólicos como fígado ou tecido adiposo tem a capacidade para consumir sedoeptulose. Adicionalmente, o tecido adiposo marrom (queima altas quantidades de lipídeos) expressa significativamente mais (~2,5 x) sedoeptulose qui- nase do que tecido adiposo branco.

[0027] A sedoeptulose (e/ou outras heptoses), administrada a pacientes que têm inflamação ou estão sob risco de serem acometidos por inflamação, minimiza a carga glicêmica e contribui positivamente para impedir, por exemplo, obesidade induzida por dieta e/ou diabetes. Ademais, os dados de animais de sedoeptulose quinase transgênica, como modelo para metabolismo de sedoeptulose acentuado, apresentam que o alto metabolismo de sedoeptulose aumenta a oxidação de lipídeos (indicada por valores de RQ inferiores). Este é um efeito bené- fico de recuperação de sedoeptulose acentuada. Também, o gasto de energia é inferior em animais com alta recuperação de sedoeptulose. Ademais, parece que os camundongos de superexpressão de CARKL são mais insulina sensível do que em animais de controle. Conjuntamente, isso mostra novamente que o metabolismo de sedoeptulose é um meio eficaz para regular o fenótipo metabólico em vertebrados.

[0028] Com a presente invenção, os efeitos específicos e surpreendentes anti-inflamatórios podem ser mostrados a ser causados por alta recuperação de sedoeptulose: A inflamação acentuada desempenha um papel importante no desenvolvimento de doenças, como distúrbios de obesidade relacionados como resistência à insulina. Em uma tela de quinase funcional para reguladores inovadores de ativação de macrófagos, constatou-se que a sedoeptulose quinase reprimiu a secreção de α necrose induzida por tumor de lipopolissacarídeo (LPS). Na mesma tela, a superexpressão de hexoquinase, cetohexo- quinase e fosfofrutoquinase (alto metabolismo de glicose/frutose) têm o efeito oposto. Isso apresentou efeitos opostos de metabolismo de hexose e heptose-carboidrato: heptose inibe inflamação. Ademais, a expressão de CARKL aumentada reprimiu ativação de macrófago induzido por LPS e resultou em formação de superóxido intracelular romba, ao passo que a perda de CARKL (imita metabolismo de sedo- eptulose reduzido) acentuou a resposta inflamatória das células.

[0029] Por outro lado, a presente invenção também se refere àprevenção de todos os déficits de tipo de sedoeptulose, especialmente aqueles que não conduziram a consequências patológicas, isto é, agir contra um déficit de sedoeptulose, de modo que os distúrbios que se devem a esses déficits de sedoeptulose podem ser evitados. A fim de prevenir esses déficits de sedoeptulose, uma composição contendo sedoeptulose pode ser administrada a um indivíduo que está em risco de desenvolver esse déficit de sedoeptulose (ou síndrome de déficit de sedoeptulose) ou um indivíduo saudável sem esse risco, por exemplo, como suplemento nutricional ou em combinação com alimento e/ou bebidas.

[0030] De acordo com uma modalidade preferencial da presenteinvenção, a sedoeptulose é adicionada a um produto alimentício que já contém sedoeptulose e para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício que é aumentado em pelo menos 10%, de preferência, para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício que é aumentado em pelo menos 100%, especialmente, em pelo menos 500%.

[0031] Alternativamente, se a sedoeptulose for adicionada a umproduto alimentício que não contém ainda sedoeptulose, de preferência, um teor de sedoeptulose do produto alimentício é obtido que é de pelo menos 0,001% em p/p, de preferência, pelo menos 0,01% em p/p, com mais preferência, pelo menos 0,1% em p/p, ainda com mais preferência, pelo menos 1% em p/p, especialmente, pelo menos 10% em p/p.

[0032] Se o produto alimentício for um produto alimentício líquido,como uma bebida (por exemplo, um refrigerante), o teor de sedoeptu- lose também poderá ser citado como uma razão em % em p/v. Conse-quentemente, a presente invenção também tem as modalidades prefe-renciais bebidas com um teor de sedoeptulose de pelo menos 0,001% em p/v, de preferência, pelo menos 0,01% em p/v, com mais preferência, pelo menos 0,1% em p/v, ainda com mais preferência, pelo menos 1% em p/v, especialmente, pelo menos 10% em p/v. Uma "razão em peso", conforme citada abaixo, portanto, significa um produto alimentício líquido com % em p/p, bem como o valor de % em p/v.

[0033] Por exemplo, para refrigerantes usuais que não são à basede material de fruta (ou vegetal) natural (sucos), apenas uma adição mínima de sedoeptulose é necessária para aprimorar o teor de sedo- eptulose. Para o propósito da presente invenção, "refrigerantes" são bebidas que contêm tipicamente água (muitas vezes, mas nem sempre, água com gás), usualmente um adoçante e usualmente um agente aromatizante, mas sem suco de fruta (esses são chamados de "sucos de fruta" na presente invenção e uma diferença clara é mantida para o propósito da presente invenção). O adoçante em refrigerantes pode ser açúcar, xarope de milho com alto teor de frutose, suco de fruta, substitutos de açúcar (no caso de bebidas dietéticas) ou alguma combinação desses. Os refrigerantes também podem conter cafeína, corantes, conservantes e outros ingredientes. Uma vez que os refrigerantes (conforme definido de acordo com a presente invenção) não contêm sedoeptulose (isto é, têm um teor de sedoeptulose bem abaixo de 0,001% p/p ou % p/v), uma modalidade preferencial da presente invenção é um refrigerante que tem um teor de sedoeptulose de 0,001% p/p (ou % p/v) ou acima, de preferência pelo menos 0,01% p/p (ou % p/v), com mais preferência pelo menos 0,1% p/p (ou % p/v), ainda com mais preferência pelo menos 1% p/p (ou % p/v), especialmente pelo menos 10% p/p (ou % p/v).

[0034] De acordo com a presente invenção, um produto alimentício pode ser analisado em relação a seu teor em % p/p, % p/v ou con-centração molar de carboidratos C6, especialmente glicose, frutose e sacarose e maltose como respectivos dímeros, e em relação a seu teor em % p/p, % p/v ou concentração molar de carboidratos C7, especialmente sedoeptulose e, opcionalmente, manoeptulose, que estabelecem a razão de carboidratos C6 para carboidratos C7 (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou razão molar) para esse produto alimentício, e em que a sedoeptulose com ou sem manoeptulose é adicionada ao produto alimentício em uma quantidade para diminuir a razão de carboidratos C6 para carboidratos C7 (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou razão molar) em pelo menos 50%, de preferência pelo menos 100%, especialmente pelo menos 200%. De preferência, a razão de peso (isto é o % p/p e/ou o % p/v) no produto alimentício é diminuída para uma razão de peso de C6/C7 resultante de ou abaixo de 2.000%:1%, de preferência para uma razão de peso de C6/C7 resultante de ou abaixo de 100%:1%, com mais preferência para uma razão de peso de C6/C7 resultante de ou abaixo de 10:1, especialmente para uma razão de peso de C6/C7 resultante de ou abaixo de 1%:1%. Alternativamente, a razão de concentrações molares também pode ser diminuída consequentemente, por exemplo, de preferência com uma diminuição para uma razão molar no produto alimentício para uma razão molar de C6/C7 resultante de ou abaixo de 2.000:1, de preferência para uma razão molar de C6/C7 resultante de ou abaixo de 100:1, com mais preferência para uma razão molar de C6/C7 resultante de ou abaixo de 10:1, especialmente para uma razão de C6/C7 resultante de ou abaixo de 1:1 (foi apontado que a razão de % de valores é idêntica à razão dos valores, isto é, 2.000%:1% = 2.000:1).

[0035] Consequentemente, novos produtos alimentícios são fornecidos com a presente invenção através do uso desse método. Por exemplo, uma nova geração de refrigerantes ou sucos de laranja e maçã é fornecida com a presente invenção, a qual tem uma razão molar de C6/C7 resultante de ou abaixo de 2.000:1. Outras modalidades preferenciais de produtos alimentícios de acordo com a presente invenção têm uma razão molar ou de peso de C6/C7 de ou abaixo de 3.000:1, especialmente de ou abaixo de 2.500:1; por exemplo, bebidas que são derivadas de refrigerantes (isto é, essencialmente sem qualquer teor de sedoeptulose) que contêm sucos de fruta, tais como sucos de laranja ou maçã, por exemplo, em uma quantidade de 5 a 50%. Consequentemente, a presente invenção também se refere a um refrigerante com uma razão de carboidratos C6 para carboidratos C7 (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou como razão molar) com um peso ou razão molar C6/C7 de ou abaixo de 3000:1, de preferência de ou abaixo de 2500:1.

[0036] Praticamente qualquer produto alimentício (o termo "produto alimentício" abrange qualquer material passível de ingestão que pode ser usado nutricionalmente por seres humanos, incluindo alimento, bebidas, etc.) pode ser aprimorado de acordo com a presente invenção pela adição de sedoeptulose. Preferencialmente, o produto alimentício é selecionado a partir de um grupo que consiste em um drinque nutricional, uma barra de petisco nutricional, um produto alimentício diet, um produto alimentício de cereal, um drinque suave, um drinque para esportes, drinque energético, adoçante nutricional, açúcar, massa, produto à base de leite, pastas ou produto alimentício funcional incluindo refeições instantâneas.

[0037] De acordo com outro aspecto, a presente invenção tambémse refere aos produtos alimentícios apropriados do modo como são providos na presente invenção. Conforme já mencionado, praticamente qualquer produto alimentício disponível no mercado pode ser aprimorado de acordo com a presente invenção. A presente invenção fornece produtos inovadores que têm um conteúdo de sedoeptulose ou, se o produto disponível já contiver um certo nível de sedoeptulose, tem um conteúdo de sedoeptulose aumentado. Consequentemente, a presente invenção também se refere a um produto alimentício com sedo- eptulose adicionada, em que o conteúdo de sedoeptulose é aumentado em comparação ao produto alimentício sem sedoeptulose adicionada por pelo menos 10% p/p, preferencialmente pelo menos 20% p/p, especialmente pelo menos 30% p/p. Preferencialmente, o conteúdo de sedoeptulose é aumentado em comparação ao produto alimentício sem sedoeptulose adicionada por pelo menos 50% p/p, preferencialmente pelo menos 100% p/p, especialmente pelo menos 200% p/p. Essas Figuras também podem ser - em adição - aplicadas aos produtos alimentícios líquidos, como bebidas, em razões de % p/v (isto é, por exemplo, bebidas nas quais o conteúdo de sedoeptulose é aumentado em comparação ao produto alimentício sem sedoeptulose adicionada por pelo menos 50% p/v, preferencialmente pelo menos 100% p/v, especialmente pelo menos 200% p/v).

[0038] Se o produto alimentício disponível na técnica anterior fororiginalmente isento de sedoeptulose, de acordo com a presente invenção, a sedoeptulose pode ser adicionada para fornecer um conteúdo de sedoeptulose do produto alimentício que é pelo menos de 0,001% p/p ou % p/v, preferencialmente para obter um conteúdo de sedoeptulose do produto alimentício que é de pelo menos 0,01% p/p ou % p/v, mais preferencial de pelo menos 0,1% p/p ou % p/v, com ainda mais preferência de pelo menos 1% p/p ou % p/v, especialmente pelo menos 10% p/p ou % p/v. Certamente, o conteúdo de sedoeptu- lose pode ser ainda muito maior, dependendo da natureza do produto alimentício (doces, etc.).

[0039] Preferencialmente, o produto alimentício, de acordo com apresente invenção, é selecionado a partir de um grupo que consiste em um drinque nutricional, uma barra de petisco nutricional, um produto alimentício diet, um produto alimentício de cereal, um drinque suave, um drinque para esportes, drinque energético, adoçante nutricional, açúcar, massa, produto à base de leite, pastas ou produto alimentício funcional.

[0040] De acordo com outro aspecto, a presente invenção forneceum método para estabelecer para um produto alimentício uma razão de C6-carboidratos para C7-carboidratos (em % p/p, % p/v ou concentração molar) analisando-se o produto alimentício em relação a seu conteúdo de C6-carboidratos, especialmente glicose e frutose, e em relação a seu conteúdo de C7-carboidratos, calcular a razão do conteúdo de C6-carboidratos para o conteúdo de C7-carboidratos (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou razão de concentração molar) para esse produto alimentício, e, preferencialmente, registrar essa razão em um portador de dados ou imprimir a razão em uma base de impressão e combinar o portador de dados ou a base de impressão com o produto alimentício.

[0041] De acordo com uma variante desse aspecto, a presenteinvenção também fornece um método para estabelecer para e ajusta em um produto alimentício uma razão de C6-carboidratos para C7- carboidratos (em % p/p, % p/v ou concentração molar) analisando-se o produto alimentício em relação a its conteúdo de C6-carboidratos, especialmente glicose, frutose e sacarose e maltose como respectivos dímeros, e em relação a seu conteúdo de C7-carboidratos, calcular a razão do conteúdo de C6-carboidratos para o conteúdo de C7- carboidratos (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou razão de concentração molar) para esse produto alimentício; então, adicionar sedoeptulose ao produto alimentício em uma quantidade na qual a razão do conteúdo de C6-carboidratos para o conteúdo de C7-carboidratos (em % p/p: % p/p, % p/v: % p/v ou razão de concentração molar) para esse produto alimentício seja diminuída por pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 50%, especialmente pelo menos 100%; e, preferencialmente, registrar essa razão em um portador de dados ou imprimir a razão em uma base de impressão e combinar o portador de dados ou a base de impressão com o produto alimentício. Conforme já mencionado acima, preferencialmente, o peso ou molecular razão no produto alimentício é diminuída para uma razão de C6/C7 resultante de pelo menos 2000%:1%, preferencialmente para uma razão de C6/C7 resultante de pelo menos 10%:1%, especialmente para uma razão de C6/C7 resultante de pelo menos 1%:1%.

[0042] A presente invenção é adicionalmente descrita nos exemplos a seguir e as Figuras, ainda sem estar restrita aos mesmos.

[0043] Figura 1: (A) amostras agrupadas de cenouras ou folhas de plantas de Sedum Spectabile de crescimento interno em ambiente fechado foram analisadas por cromatografia de gás acoplada à espec- trometria de massa para medir especificamente níveis de glicose relativa (C6) e sedoeptulose (C7). A razão de C6/C7 foi calculada dividindo-se sua respectiva área de pico. (B) Os níveis de sedoeptulose e glicose foram adicionalmente aplicados por GC-MS em soro de indivíduos antes e após retenção de alimento para investigar se C7 derivado de dieta pode entrar na corrente sanguínea do ser humano. O nível de sedoeptulose e glicose de quatro indivíduos em jejum durante a noite (barras vazias) foram comparados aos níveis medidos duas horas após uma refeição (alimentado por diet, barras cinzas) que contém principalmente cenouras (~700g) com algum azeite, sal e pimenta. A alteração em níveis de carboidrato de soro foi expressa como alteração de dobra principal (n=4, +/- S.D.). (C) Concentrações de glicose, frutose e sedoeptulose foram medidas nos extratos de carboidrato de bebidas indicadas. Os valores principais de quadro réplicas técnicas agrupadas foram plotadas para demonstrar concentrações de açúcar extraído. Ademais (D), a razão de C6 / C7 (sedoeptulose) foi estabelecida dividindo-se a soma de moléculas de glicose e frutose (C6) ou peso por respectiva unidade de sedoeptulose (C7) (N.A.= não aplicável).

[0044] Figura 2: (A) Plotagem de níveis de expressão de mRNA dequinase de sedoeptulose normalizada (CARKL) em fígado de camundongo durante um período de 48hrs foi obtida a partir da "Base de dados de Expressão de Gene Circadiano - CIRCA" disponível para o público ("Circadian Gene Expression Database - CIRCA"). O eixo geométrico Y representa expressão de gene normalizada e o eixo geométrico X o tempo em horas. (B e C) níveis de nicotinamida adenina dinu- cleotídeo oxidada e reduzida de células com expressão de CARKL de- sestabilizada foram calculados a partir de dados metabólicos anterior- mente registrados (Haschemi et al., 15 (2012), 813 a 826). A linha RAW264.7 de célula tanto (B) expressa níveis de CARKL altos por su- perexpressão ou (C) níveis de CARKL baixos por expressão de shR- NAmir foram comparados a linha de células de controle individual para ilustrar a regulação de nicotinamida adenima dinucleotídeo mediada por CARKL. Os dados representam a alteração de dobra principal de três experimentos individuais +/- SEM. (D) níveis de mRNA CARKL foram medidos em uma biblioteca de tecido de cDNA de camundongo. Os dados representam expressão de CARKL principal normalizada (para β-actina) relativa a expressão de CARKL de timo em alteração de dobra (todos os tecidos n=3, S.D.).

[0045] Figura 3: (A-E) Adipócitos humanos primários foram obtidospor diferenciação da fração de célula vascular estromal na presença de glicose e frutose (GF, 1,5g/L de cada açúcar; carboidratos totais 3g/L) ou meio suplementado por sedoeptulose, que foi denominado GFS (1g/L de cada açúcar; carboidratos totais 3g/L), durante oito dias. De modo subsequente, níveis de mRNA de (A) CARKL, (B) adiponec- tina e (C) desacoplamento de proteína 1 (UCP-1) foram avaliados por RT-PCR e comparados entre os grupos. (D) Taxas de consumo de oxigênio celular (OCR) e (E) taxas de acidificação extracelular (ECAR) de adipócitos foram registradas na presença de mistura de carboidrato indicada (significa +/- S.D., n=9-11). (F) Níveis de expressão de mRNA de fator de necrose de Tumor alfa (TNFa) e (G) interleucina 6 (IL-6) de adipócitos de murino maduro cultivados durante três dias em meio de cultura celular que contém tanto GF quanto GFS mistura de carboidrato ou (H) expressão de IL-6 em hepatócitos de murino primários, bem como níveis de mRNA (I) TNFa e (J) IL-6 em macrófagos derivados de medula óssea primária, ambos os tipos de célula foram pré-cultivados durante dois dias em meio GF ou GFS, foram comparados entre respectivos grupos. Secreção de citocinas (K) TNFa e (L) IL-6 durante o período de dois dias foi medida por ELISA no sobrenadante de macró- fagos derivados de medula óssea. Secreção induzida por LPS (100ng/mL) de (M) TNFa duas horas após a ativação e (N) IL-6 6hrs após ativação no respectivo meio por macrófagos também foi medida por ELISA. Os dados representam meio +/- S.D., n=3).

[0046] Figura 4: Em um ensaio de quinase in vitro, que empregaformação de ADP como leitura de atividade, a taxa de rotatividade de sedoeptulose em concentração de ATP (150μM) constante foi aprimorada tanto mediante o (A) aumento de concentração de sedoeptulose quanto mediante o (B) aumento da quantidade da quinase de sedoep- tulose de enzima para limitar taxa (CARKL). (C-E) Hepatócitos do tipo murcho (WT) e CARKL de quinase de sedoeptulose que supraexpres- sa camundongo foram pré-cultivados durante dois dias em GFS que contém meio antes basal (C) ECAR e (D) OCR foi registrado dessas células. (E) Hepatócitos de ambas as linhagens genéticas (controles de CARKL e WT) foram cultivados em GF ou GFS que contém meio e, então, pré-privadas (nenhum carboidrato) por uma hora para medir ECAR induzido por glicose após a adição de glicose para alcançar uma concentração final de 1g/L no meio de cultura principal +/- S.D., n=7-11). Como indicadores in vivo de metabólico (F), o quociente respiratório (RQ) e (G) dispêndio de energia (EE, kcal/dia/kgA0.75) por atividade por calorimetria indireta foram determinados e comparados com CARKL para ninhadas do tipo silvestre (WT) durante o dia (8 a.m. a 4 p.m.) e a noite (8 p.m. a 4 a.m.). Os dados representam valores principais, n=3, +/- SD. (H) Teste de tolerância à insulina em camundongo foi realizado em CARKL transgênico fêmeo pré-privado (4h) e controles de ninhada de tipo silvestre por i.p. injeção de 0,75U de peso de corpo de insulina/kg. A glicose do sangue foi medida antes da injeção (controle) e 15, 30, 45 e 60 minutos após a injeção e marcada como valor relativo em % de controle. Os dados representam va- lores principais +/- SD, n=3-4.

[0047] Figura 5: (A) Deposição de lipídio em hepatócitos isoladosde camundongo de supraexpressão tanto de WT quanto CARKL e cultivada no meio de controle (GF) foi visualizada por coloração vermelha de óleo. Micrografias representativas foram averiguadas com um objetivo 20x. (B) A atividade de dehidrogenase de Glucose-6-fosfato foi medida em hepatócitos isolados de camundongo de supraexpressão tanto de WT quanto de CARKL e cultivada em meio de controle (GF) durante dois dias. As setas indicam a relocalização de atividade de G6PD. As micrografias representativas foram averiguadas com um objetivo 10x. (C e D) Osteoclastos de camundongo de supraexpressão de WT ou CARKL foram diferenciados e cultivados durante 7 dias em placas de Ensaio de Corning Osteo em GF ou GFS que contém meio. Sua atividade de reabsorção foi aplicada contando-se todas as vesículas por cavidade que estavam visíveis em magnificação de 20x. Os dados representam os valores principais, n=2-3, +/- SD. (D) Duas imagens representativas das vesículas de absorção maiores reveladas em osteoclastos de WT tanto cultivados em GF quanto GFS que contém meio são mostradas. As micrografias foram adquiridas por magnifica- ção de 40x.

[0048] Figura 6: (A) O sistema imune de camundongo de supraex-pressão de quinase de sedoeptulose (CARKL) e ninhadas de controle foi contestado com uma injeção de lipossacarídeo sub-letal (LPS, 7mg/kg) e um painel de 19 citosinas foi medido 24 horas após a ativação de imune em soro. Os dados representam intensidades fluorescentes de meio relativo (MFI) de citosinas individuais medidas no tipo silvestre (WT=100%) e soro CARKL por perfilador de citosina de camundongo de mapeamento milliplex (n=3, +/- SD). Expressão demRNA de TNFa e de proteína-1 (MCP-1) quimiatraente de monócito de adipócitos maduros de murinho isolados de tecido adiposo branco (B e C) subcutâneo ou (D e E) epididimal de camundongo WT e CARKL. Os dados representam valores principais, n=3, +/- SD. (F) Ocorrência de derrame e genótipo rs465563. Os dados foram comparados por x2 testes de Pearson. **...p<0,01. (G) Duração de sobrevivência isenta de derrame inicial foi avaliada por plotagens Kaplan- Meier. Os homozigotos individuais para o rs465563: [G]-alelo mostram tempos significativamente isentos de evento mais curtos que os portadores do [A]-alelo.

EXEMPLOSMATERIAIS E MÉTODOSCARBOIDRATOS

[0049] Glicose e frutose foram adquiridos junto à Sigma Aldrich.Sedoeptulose foi isolada da planta sedum spectabile ou sedum tele- phium (Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813 a 826) e foi purificada adicionalmente por cromatografia.

AS MEDIÇÕES DE GLICOSE E SEDOEPTULOSE EM CENOURAS E SORO HUMANO

[0050] As cenouras frescas com um certificado orgânico austríacoforam fatiadas em pedaços pequenos e submetidas a congelamento rápido em nitrogênio líquido. O mesmo procedimento foi aplicado às folhas colhidas recentemente das plantas Sedum Spectabile cultivadas internamente. Três amostras de cada tecido foram agrupadas e homo-geneizadas para pó por microesferas de vidro. As frações ricas em carboidrato das amostras foram isoladas por solução de extração de 20% de H2O e 80% de MeOH enriquecida com 13C padrões e processadas por cromatografia de gás padrão acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). A glicose e Sedoeptulose foram identificadas por suas massas individuais e sua quantidade relativa foi derivada da área de pico de cada analito individual normalizado para teor de 13C. A glicose e Sedoeptulose também foram medidas em volumes iguais de soro de um dia para o outro em jejum ou indivíduos alimentados com cenoura. As cenouras foram cozidas no vapor e um pouco de azeite, sal e pimenta foram usados para o sabor. Duas horas antes e duas horas depois após o soro humano de refeição que contém cenoura ter sido preparado em tubos separadores de soro do sangue VACUETTE® Z. As amostras de soro foram processadas conforme descrito anteriormente e também analisadas por GC-MS conforme detalhado acima e em Ruiz-Matute AI et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2011) maio 15 879(17 a 18).

CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE, FRUTOSE E SEDOEPTULOSE EM BEBIDAS

[0051] As bebidas indicadas foram adquiridas de uma mercearialocal e foram todas pré-embaladas. A partir de cada bebia 1mL (para cada uma dentre quatro réplicas técnicas) foi aliquotado e concentrado em vácuo em um SpeedVac. Isso foi seguido por precipitação de MeOH/H2O (80:20) e uma etapa de centrifugação para remover a fração de carboidrato nno sobrenadante do precipitado. Cada sobrena- dante foi novamente liofilizado em um SpeedVac, reidratado em volumes iguais de água e réplicas técnicas foram agrupadas. Para a análise de carboidrato um sistema livre de metal Dionex ICS-3000 DC foi usado com uma coluna CarboPac PA1 (250x4 mm) e uma pré-coluna CarboPac PA1 (ambas da Dionex) em uma taxa de fluxo de 1 mL por minuto. A eluição foi executada de forma isocrática com NaOH a 16 mM pelos primeiros 20 minutos. Então um gradiente linear para NaOH a 100 mM foi aplicado de 20 a 40 minutos seguido de um aumento ao longo de dois minutos para 200 mM e mantido até 47 minutos. A condição inicial com NaOH a 16 mM foi atingida novamente em 49 minutos e mantida até 70 minutos. Os parâmetros da detecção amperomé- trica pulsada são exatamente conforme recomendados na Nota Técnica 21 (Definições Ótimas para Detecção Amperométrica Pulsada de Carboidratos com o uso do Detector Eletroquímico ED40) da Dionex. Os cromatogramas foram avaliados de acordo com os cromatogramas de padrões de glicose, frutose e Sedoeptulose autênticos, cada 100 μM.

CULTURA DE ADIPÓCITO HUMANO

[0052] As células de fração de estroma vascular (SVFs) do tecidoadiposo branco subcutâneo de um paciente sendo submetido a cirurgia abdominal foram isoladas conforme descrito anteriormente (Lin- droos et al, Cell Metab. (2013), Jul 2;18(1):62 a 74.). Brevemente, o tecido adiposo foi digerido com Collagenase II (Worthington) e filtrado. SVFs foram separadas dos adipócitos maduros por centrifugação, seguida pela lise de eritrócitos na fração SVF (Buffer EL, Qiagen). As SVFs purificadas foram cultivadas em DMEM/F12, 10% de FBS (Gib- co, Life Technologies). Assim que as células atingiram confluência, as mesmas foram lavadas com DMEM/F12 sem glicose (Biowest) e o meio foi substituído por DMEM/F12 com uma carga de carboidrato total de 3g/L, contendo 1,5g/L de glicose e frutose ou 1g/L de cada uma dentre glicose, frutose, e Sedoeptulose, respectivamente. Dois dias após a confluência (dia 0), a diferenciação foi induzida adicionando-se 1 μM de dexametasona, 1,74 μM de insulina, 5 μM de troglitazona, 0,5 μM de IBMX, 17 μM de ácido pantotênico e 33 μM de biotina. Após dois dias, IBMX e dexametasona foram omitidas, enquanto insulina e troglitazona foram removidas no dia 4. 50% do foi substituído no dia 6. Dois dias depois, as células foram colhidas para isolamento de RNA (mini kitRNeasy, Qiagen).

CULTURA DO TIPO CEILING DE ADIPÓCITOS DE MURINA MADURA

[0053] O tecido adiposo subcutâneo anterior e posterior e tecidoadiposo branco epidídimo foi isolado do camundongo CARKL transgê- nico e controles da mesma ninhada do tipo silvestre. O tecido adiposo foi digerido conforme descrito acima para a amostra humana. Após a centrifugação, a camada de adipócitos maduros flutuantes foi removida e re-centrifugada em 100 rcf por 10 minutos. 150 μL de adipócitos embalados foram cultivados sob uma lamela flutuante em placas com 6 cavidades, em DMEM/F12, 15% de soro de bezerro (PAA). 24 horas após o isolamento, as cavidades foram lavadas duas vezes com PBS e o meio foi trocado para DMEM/F12 com uma carga de carboidrato total de 3 g/L, que contém 1,5 g/L de glicose e frutose, ou 1 g/L de cada um dentre glicose, frutose e Sedoeptulose, respectivamente. Três dias depois, as células foram colhidas para isolamento de RNA com o uso de TRIreagent (Sigma).

CULTURA DE HEPATÓCITO

[0054] Os hepatócitos foram isolados de camundongos de supe-rexpressão de CARKL e do tipo silvestre macho depois os camundongos foram sacrificados por perfusão de colagenase in situ hepática. Após a perfusão, o fígado foi removido rapidamente, seccionados, e filtrados através de um filtro celular (Fisher Scientific, Inc) em um tubo estéril de 50 mL. Os hepatócitos no filtrado resultante foram purificados a partir das células não parenquimatosas por etapas de centrifugação. Os hepatócitos isolados foram semeados em placas em uma concentração de 0,25 x 10A6/mL em respectivos meios de DMEM que contém 10% de FBS e carboidrato indicado mistura em 3 g/L (glicose e frutose (GF), ou glicose, frutose e Sedoeptulose (GFS)) pelo menos dois dias antes dos experimento serem realizados.

CULTURA DE OSTEOCLASTOS E MACROFAGOS DERIVADOS DE MEDULA ÓSSEA

[0055] Os ossos de camundongo foram isolados dos camundongos de superexpressão de CARKL e do tipo silvestre macho e a medula óssea foi enxaguada com água, lavada e limpa de hemácias por lise, e subsequentemente diferenteciado em DMEM que contém 25 mM de glicose e 20 ng/mL de M-CSF. Após 4 dias, as células para diferen-ciação de osteoclasto foram colhidas e semeadas em placas de ensaio ósteo Corning com meios de diferenciação (veja abaixo), e para ma- crofagos derivados de medula óssea primários (BMDM) o meio foi renovado e suplementado adicionalmente com M-SCF por dois dias. Os BMDM diferenciados foram então semeados em respectivos meios de DMEM que contém 10% de FBS e carboidrato indicado mistura em 3 g/L (glicose e frutose (GF), ou glicose, frutose e Sedoeptulose (GFS)) pelo menos dois dias antes dos experimentos serem realizados.

ENSAIO DE REABSORÇÃO ÓSSEA IN VITRO

[0056] As células precursoras de osteoclasto (células de medulaóssea tratadas com 20 ng/mL de M-CSF por 4 dias) foram plaqueadas em placa com 24 cavidades de Ensaio Ósteo Corning na presença de 10 ng/mL de M-CSF e 100 ng/mL de RANKL em meio alfa-MEM que contém 10% de FBS e 3 g/L de glicose e frutose (GF), ou glicose, fru- tose e Sedoeptulose (GFS). O meio foi renovado a cada terceiro dia. Após 7 dias, as células foram removidas com alvejante e lavadas três vezes com água antes do manchamento de Von Kossa de acordo com protocolos padrão da Corning (revisão técnica) ser realizado para acentuar o contraste entre a superfície de ensaio intacta e poço de reabsorção. Cada cavidade foi fotografada inteiramente por TissueFax com um x20 objetivo e todas os poços de reabsorção visíveis foram contados e analisados cegamente.

TAXAS DE ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR E TAXAS DE CONSUMO DE OXIGÊNIO

[0057] O XF-Analyzer (Seahorse Bio.) foi usado para medir asmudanças no metabolismo celular induzido por diferentes carboidratos. As taxas de acidificação extracelular (ECAR, mpH/min) e taxas de consumo de oxigênio (OCR, pmoles/min) foram gravados em adipóci- tos humanos primários e hepatócitos de murina primários de acordo com as instruções de fabricação. Brevemente, as células foram semeadas em placas de célula de cavalo marinho em uma densidade de 10A4 células por cavidade para adipócitos e 0,5x10A5 células por cavidade para hepatócitos. No dia dos experimentos as células foram lavadas com meios livres de carboidrato e incubadas por uma hora nos meios indicados que contêm misturas de carboidrato em uma concentração de 3 g/L (glicose e frutose (GF), ou glicose, frutose e Sedoeptulose (GFS)). Para medir a ECAR induzida por glicose, as células foram submetidas ao jejum por uma hora em meios livres de carbono antes da glicose (1 g/L) ser adicionada à cavidade por injeção automática. A ECAR induzida por glicose foi normalizada para a respectiva ECAR antes da adição de glicose (basal = 100%). As mudanças induzidas pelas fontes de carboidrato diferentes foram expressas como mudança relativa em % para ilustrar o efeito de cada fonte de carbono.

ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA

[0058] Brevemente, o RNA total foi extraído e transcrito inversocom o uso de kits comerciais (QIAGEN, Applied Biosystems). As PCRs em tempo real quantitativas foram realizadas em um ciclador em tempo real AbiPRISM 7900HT com o uso de supermistura verde SYBR de iTaq com ROX (BioRad) para medir CARKL, adiponectina, UCP-1, TNFa, IL-6, MCP-1, e expressão de beta-actina conforme descrito anteriormente (Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813 a 826). Expressão de gene alvo foi normalizada para expressão de beta-actina. A expressão relativa de gene alvo foi calculada pelo método deltadelta CT.

ENSAIO DE QUINASE DE SEDOEPTULOSE

[0059] O ensaio de ADP Quest (DiscoveRx) foi usado para medirindiretamente a formação de S7P pelo acúmulo de ADP ao longo do tempo de acordo com as instruções de fabricação. A Sedoeptulose quinase recombinante foi produzida anteriormente em E.coli e purifica- da por purificação de afinidade (Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813 a 826).

CALORIMETRIA INDIRETA

[0060] O quociente respiratório (produção de VCO2/consumo deVO2) e gasto de energia (EE, kcal/dia/kgA0,75) por atividade de ca-mundongos foram medido em gaiolas metabólicas (Harvard Appera- tus) por calorimetria indireta. Um camundongo transgênico de CARKL ou uma ninhada do tipo silvestre, foi alojado por gaiola por um dia antes de começar a gravar o quociente respiratório médio e gasto de energia por atividade durante o dia (8am a 4pm) e noite (8pm a 4am).

TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA

[0061] Camundongos fêmea transgênicos de CARKL submetidosa jejum por quatro horas e controles de ninhada do tipo silvestre foram injetados por i.p. com 0,75 U de insulina/kg de peso corporal. A glicose sanguínea foi medida antes da injeção e 15, 30, 45 e 60 minutos após a injeção com o uso de tiras de glicose de único toque (Accu Check, Roche).

MANCHAMENTO OIL RED

[0062] Brevemente, os hepatócitos foram cultivados conforme indicado, antes de o meio ser removido, e as células foram fixadas por 10% de formalina. Após uma lavagem com 60% de isopropanol as cavidades foram incubadas com Solução de Oil Red O (Sigma-Aldrich) e manchadas por 10 minutos, lavadas 4 vezes com água antes de as fotografias serem tiradas em amplificação de x20.

ENSAIO DE ATIVIDADE DE GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGE- NASE

[0063] As células foram cultivadas em lâminas de vidro tratadascom tecido de vaso poliestireno, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e mantidas a -80°C. O procedimento histoquímico enzimático foi à base do método de sal de tetrazólio conforme descrito por Van No- orden e Frederiks. O meio de incubação para a demonstração de atividade de G6PD activity continha 18% de (p/v) álcool polivinílico (peso molecular médio 70.000 a 100.000) em tampão de Tris-Maleato a 0,1 M, pH 7,5, 15 mM de glicose-6-fosfato, 0,8 mM de NADP, 0,4 mM cloreto de magnésio, 0,45 mM de metosulfato de 1-metóxifenazina, 5 mM de azeto de sódio e 5 mM de cloreto de tetranitroazuk tetrazólio. O meio foi recentemente preparado imediatamente antes da incubação. As reações de controle continham adicionalmente 40mM de glicosamina-6- fosfato. As células foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos com mistura contínua por agitador orbital. Após a incubação, as células foram lavadas 3 x 5 minutos em solução salina tampo- nada com fosfato a 60°C, submetidas a secagem, e montadas em gelatina de glicerol, e fotografadas dentro de um dia em ampliação x10. AVALIAÇÃO DA REAÇÃO IMUNOLÓGICA E PERFILAMENTO DE RESPOSTA DE CITOCINA IN VIVO

[0064] Para edotoxemia in vivo de murina subletal, 7 mg/kg deLPS (Sigma Aldrich) foram injetados intraperitonealmente em camundongo transgênico CARKL macho ou ninhadas do tipo silvestre. O soro foi isolado por mini tubos separadores de soro VACUETTE® Z do sangue total. A citocina foi medida por perfilador de citocina de camundongo milliplex map de acordo com as instruções dos fabricantes (Millipore). Todos os experimentos com animais foram executados de acordo com um contrato e protocolo de licença animal ética aprovada pela Universidade Médica de Viena (BMWF-66.009/0140-II/10b/2010). ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO COM POLIMORFISMOS DE NUCLEO- TÍDEO ÚNICO (SNP) DE CARKL COM RISCO DE DERRAME.

[0065] Design do Estudo: 578 pacientes neurologicamente assin-tomáticos do Estudo Inflammation e Carotid Artery - Risk for Atheros-clerosis (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17): 2.203 a 2.209.)), recrutados até 03/2003, foram incluídos na presente análise - critérios de inclusão e exclusão foram publicados anteriormente. Bre-vemente, a doença de artéria carótida assintomática, representando o critério de exclusão primário, foi definido como a ausência de ataques isquêmicos transientes (TIA), amourose fugaz e derrame dentro dos últimos 12 meses ou de sintomas residuais, respectivamente. Além do exame médico exaustivo (incluindo anamnese, condição física e teste sanguíneo), os pacientes foram submetidos a sonografia das artérias carótidas na linha de base e em um acompanhamento 6 a 9 meses após a inclusão no estudo conforme anteriormente descrito (Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17): 2.203 a 2.209.). Incidência de eventos cardiovasculares foi registrada até 01/2006. A análise foi aprovada pelo comitê de éticas local (EC-No. 1933/2012) e foi realizada de acordo com os padrões éticos especificados pela Declaração de Helsinki e suas emendas.

[0066] Definições: A hipertensão arterial foi definida como pressãoarterial de repouso repetitiva acima de 140/90 mm de Hg e presumiu- se estar presente em paciente com medição antihipertensiva. A hiper- lipidemia foi diagnosticada em pacientes com um colesterol de soro total >200 mg/dl ou colesterol de LDL >130 mg/dl e foi considerada estar presente em todos os pacientes que tomam fármacos para redução de lipídio. A diabetes mellitus foi diagnosticada como suporte pelo Comitê Experiente sobre o Diagnóstico e Classificação de Diabetes Mellitus. A doença das artérias periféricas foi classificada com o uso do sistema de classificação de Fontaine, a doença de artéria coronária foi definida de acordo com a classificação pela Sociedade Cardiovascular Canadense (CCS). O infarto do miocárdio amnéstico foi definida de acordo com Alpert. O derrame foi definido por um déficit neurológico que persiste >24 h e foi avaliado de acordo com a escala de derrame de Rankin modificada. A progressão da ateroesclerose de artéria carótida foi definida como um aumento em estenose por pelo menos um grau angiográfico de NASCET.

[0067] Genotipagem: o DNA foi isolado do sangue total anticoagu-lado com EDTA por meio de purificação de ácido nucleico com base em coluna de rotação. A genotipagem foi feita em um termociclador de tempo real rápido ABI TaqMan® 7900HT (Biossistemas aplicados, Rot- kreuz, Switzerland) utilizando-se o 5’- ensaio de nuclase [7]. Esse ensaio inclui a ligação específica de sequência de sondas de DNA rotuladas. Durante a fase de hibridação de cada etapa, as sondas específicas para sequências contêm um fluoróforo em suas extremidades de 5’ que ligam seus respectivos alelos. A fluorescência do fluoróforo é mascarada por um 3'-supressor, até que a 5'-Taq-polimerase separe esses compostos por sua atividade 5'-exonuclease durante a fase de alongamento. Medidas de ponto de fim da intensidade de fluorescência específica de sequência indica a presença do alelo correspondente. No presente estudo, foi analisada a rs465563 em um volume de reação total de 10μL utilizando-se um ensaio de genotipagem TaqMan® SNP (Ensaio ID: C 717358_1_, biossistemas aplicados)comercialmente disponível e TaqMan® Genotype Master Mix (biossis- temas aplicados) de acordo com protocolo padrão suprido pelo fabricante. Os resultados foram interpretados utilizando-se software de detecção de sequência de SDS 2.4 (biossistemas aplicados).

[0068] Análises estatísticas: dados contínuos são apresentadosem relação à sua distribuição como meio e desvio padrão ou faixa média e interquartílica. Dados categóricos são apresentados como contagens e percentuais. A presença de distribuição normal dentro de subgrupos foi avaliada pelos testes Kolmogorov-Smirnov. As variáveis métricas foram comparadas pelos testes de Mann-Whitney U. As conexões entre genótipos e ponto de fim de estudo assim como os ricos relativos foram estimadas por tabelas de contingência e testes de x2 do Pearson. A sobrevivência livre de eventos foi estimada pela análise de Kaplan-Meier, os dados foram comparados em pares pelos testes de Log Rank (Mantel-Cox). Modelos multivariáveis foram calculados por meio de regressão logística binária e avaliadas por plotagens de desenhos de ROC (características de receptor-operador). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a p<0,05, exceto se especificado em contrário. Todos os valores de p- foram interpretados de dois lados, exceto se especificado em contrário. Todos os cálculos estatísticos foram feitos utilizando-se IBM SPSS 20,0 (IBM Corporation, Armonk, USA).

RESULTADOSABSORÇÃO DE SEDOEPTULOSE DERIVADA DE DIETA EM SERES HUMANOS

[0069] Para determinar se o sedoeptulose nutricional é absorvido apartir de dietas por meio de trato digestivo no sangue humano, que é uma etapa crítica para que o sedoeptulose se torne um carboidrato ativo metabólico, níveis de glicose (C6) e sedoeptulose (C7) foram medidos em cenouras e no soro humano. Para determinar a razão C6/C7 de cenouras, o tecido de planta foi homogeneizado, extraídas as pequenas frações de molécula e medidas simultaneamente as quantidades de glicose relativa e sedoeptulose por GC-MS (Figura 1 A). Folhas de sedum spectabile, uma planta suculenta que contém altos níveis de sedoeptulose, foram analisadas em paralelo como controle positivo. As folhas de sedum spectabile que continham glicose e, aproximadamente, o dobro de sedoeptulose, o que resultou na razão C6/C7 de aproximadamente 0,5. Em cenouras orgânicas de qualidade alimentar, quantidades quase iguais de glicose e sedoeptulose foram detectadas e, dessa foram, uma razão C6/C7 de cerca de 1. As bata-tas, ao contrário das cenouras, foram relatadas por não conterem se- doeptulose (Kardon et al., FEBS Lett. (2008) 15 de outubro, 582 (23 e 24)) e espera-se, dessa foram, que processem uma razão C6/C7 mui- to alta (ou mesmo infinita). Em seguida, foi abordado se a sedoeptulo- se derivada de dieta, que se originam das cenouras, atinge o sangue humano através do monitoramento de nível de soro de glicose e sedo- eptulose antes e depois de uma refeição quem contém cenouras no vapor (~700g por adulto masculino) com um pouco de azeite de oliva, sal e pimenta. Duas horas depois da refeição, foi observado um aumento de aproximadamente duas vezes nos níveis de soro de sedoep- tulose em humanos (Figura 1 B). Esse resultado indicou claramente que a sedoeptulose nutricional é absorvida pelo trato digestivo humano e que o mesmo entra no sangue para se tornar disponível como um carboidrato para metabolismo subsequente. Os níveis de glicose no soro já normalizaram dentro de duas horas depois da digestão de alimentos e, dessa foram, sugerem que seres humanos metabolizam a sedoeptulose e a glicose de modo diferente.

[0070] Esses resultados indicam que cenouras, que são consideradas como vegetais saudáveis e constituintes de dietas ao redor do mundo, são uma fonte natural de sedoeptulose para os seres humanos. É interessante mencionar que as cenouras, embora as mesmas contenham carboidratos tal como glicose, são adequadas e bem toleradas por diabéticos e ainda protege pessoas com fatores de risco genético comum para diabete do tipo 2 (Patel CJ et al., Hum Genet. 132 (2013): 495-508).A RAZÃO C6/C7 EM PRODUTOS ALIMENTARES DE SERES HUMANOS NATURAIS E FABRICADOS

[0071] Em seguida, a concentração de glicose, frutose e sedoeptu-lose foi medida em extratos de carboidrato de Coca-Cola®, Red Bull®, sucos de laranja, maça, tomate, e cenoura para estabelecer o índice de C6/C7 para bebidas comuns e, dessa forma, estimar a efetiva exposição humana a sedoeptulose. Refrigerantes e energéticos continham glicose e frutose, mas nenhuma sedoeptulose (Figura 1C). Su- cos de fruta continham quantidades similares de C6 (a soma de glicose e frutose) aos refrigerantes e energéticos (na faixa de 100mM), mas ao contrário do anterior, os mesmos continham sedoeptulose na faixa de 100μM. Em sucos vegetais, os níveis de glicose e frutose foram reduzidos, enquanto foi verificado que as concentrações de sedoeptulo- se foram aumentaram grandemente (na faixa de mM). As razões C6/C7 de bebidas individuais, calculadas como molares- assim como razões de peso, são apresentadas na Figura 1 D. Em dois sucos de fruta, foram verificadas as razões C6/C7 de cerca de 2.000/1. Em sucos de tomate e cenoura, a razão foi de 75/1 e 20/1, respectivamente. Coca-Cola® e Red Bull® não continham quaisquer quantidades detec- táveis de sedoeptulose. Consequentemente, a razão C6/C7 para essas bebidas não poderia ser calculada e, dessa foram, não aplicável (N.A.) a tais produtos alimentícios, se os mesmos não forem suplementados adicionalmente com C7. Essas verificações indicam claramente que produtos alimentícios fabricados carecem de complexidade de carboidrato e, dessa foram, também de sedoeptulose. Considera-velmente, em números absolutos, esses dados indicam que 1 kg de sedoeptulose derivada de dieta é consumido por 9 kg de glicose derivada de dieta uma mistura de carbono natural de suco de cenoura foi escolhida em detrimento de refrigerantes e energéticos - as consequências de privação crônica de sedoeptulose por uma nutrição humana desequilibrada são desconhecidas atualmente.A SEDOEPTULOSE QUINASE OSCILA E É ALTAMENTE EXPRESSADA EM TECIDO METABOLICAMENTE ATIVO.

[0072] Para compreender como a sedoeptulose quinase CARKL e,dessa foram, o metabolismo de sedoeptulose é distribuído e controlado em vários tecidos de mamíferos, diferentes tecidos foram testados para níveis de expressão mRNA. A expressão CARKL, em um banco de dados acessível ao público para perfis de expressão circadianos (CircaDB), foi verificado oscilação no fígado de rato (período 20,0, Figura 2 A) e glândula adrenal (período 24,0, dado não mostrado). Os níveis de Sedoeptulose-7P foram previamente reportados para oscilar em plantas, atingindo o ponto máximo durante a fase regenerativa de fixação de carbono para reconverter moléculas de ribose. O relógio circadiano de mamíferos é, em parte, ajustado pelo estado de redox. As células RAW264.7 de superexpressão CARKL indicou que a alta expressão de sedoeptulose quinase induz a um aumento de 4 vezes de fatores de redox como aumento de nível de nicotinamida reduzida, dinucleótido de adenina (NADH) e também glutationa (GSH) (Figura 2 B e Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826). A deficiência de CARKL e, portanto, também a falta de rotatividade de sedoeptulose mostrou o efeito oposto (Figura 2 C). Esses dados indicam que o metabolismo sedoeptulose está sob o controle de ritmos e atos cardianos simultaneamente como modulador de estados celulares de redox. Para especificar qual tecido consome sedoeptulose nutricional, níveis de mRNA de sedoeptulose quinase (CARKL) foram medidas em uma biblioteca de tecido de cDNA de camundongo (Figura 2 D). A quinase de é a enzima limitante de faixa de metabolismo de sedoeptulose e foi altamente expressada no fígado, rim, no tecido adiposo marrom e branco (BAT e WAT), órgãos digestivos, nas glândulas, nos sistemas reprodutores masculinos assim como o cérebro. Os resultados demonstram que sedoeptulose derivada de dieta pode se tornar uma fonte de carboidrato sistêmico para muitos tecidos, mas especialmente para órgãos metabolicamente ativos, tais como fígado, rim e tecido adiposo.

METABOLISMO DE SEDOEPTULOSE É IMPORTANTE PARA A FUNÇÃO E SAÚDE METABÓLICA DE CÉLULAS

[0073] Para investigar as consequências metabólicas de exposição a sedoeptulose, as células de seres humanos e murídeo no meio de cultura foram expostas a glicose em combinação com frutose (GF) ou a glicose, frutose e sedoeptulose (GFS), enquanto mantém a constante de carga total de carboidrato. A função de adipócitos, hepatócitos e macrófagos foi testada para avaliar a importância de sedoeptulose em complementar cargas de carboidrato nutricional. A sedoeptulose usada nesses experimentos foi isolada das plantas de sedum tele- phium.

[0074] No corpo humano, os adipócitos cumprem a função crucialde armazenar energia em foram de lipídios e são, dessa foram, muito importantes para manter a saúde. Na maioria dos pacientes com obesidade mórbida ou metabolicamente insalubres, os adipócitos não funcionam adequadamente, aumentam o tamanho de suas células para contabilizar as cargas excessivas de lipídios, tornam-se inflamados (meta-inflamação, um baixo grau, mas um tipo crônico de inflamação) e, em última análise contribui para o desenvolvimento de doenças como resistência à insulina ou doenças cardiovasculares. Nos adipócitos de seres humanos, diferenciadas a partir de células precursoras subcutâneas, foi verificado um aumento na expressão de mRNA de sedo- eptulose de CARKL, se foi adicionada sedoeptulose ao meio de cultura (Figura 3 A). Além disso, um aumento na expressão de adiponectina e UCP-1, dois genes marcadores de adipócitos de função relevante, foi observado no GFS comparado às de GF (Figura 3B e 3C). Para testar as mudanças no metabolismo celular, as taxas de consumo de oxigênio celular (OCR) e taxas de acidificação extracelular (ECAR) foram medidas como indicadores para a respiração mitocondrial e fermentação de ácido lácteo, respectivamente. Os adipócitos de seres humanos, diferenciados e cultivados em meio que contém sedoeptulose, mostraram ECAR comparável ao controle de WT, enquanto a taxa de consumo de seu oxigênio celular era aumentada (Figuras 3D e 3E).

[0075] Juntos, esses dados mostram que adipócitos subcutâneos mantêm e aprimoram suas funções (aumento na adiponectina, UCP-1 e consumo de oxigênio) na presença de sedoeptulose comparada a uma situação em que somente glicose e frutose estão presentes como biocombustível.

[0076] Para melhor definir a função positiva de sedoeptulose naprevenção de estados metabolicamente insalubres como inflamação crônica de baixo grau, os perfis de citocina de adipócitos primários de murídeos maduros, hepatócitos primários de murídeos, e ingênuos assim como lipopolissacáridos (LPS) induzidos por macrófagos primários ativados cultivados no meio de GF ou GFS foram medidos. Os adipóci- tos maduros, que são cultivados em meio que contém sedoeptulose, produziram menos TNFa e IL-6 mRNA que adipócitos cultivados com glicose e frutose apenas (Figura 3 F e 3 G). Similarmente a isso, os hepatócitos também produziram menos IL-6, se cultivados com sedo- eptulose (Figura 3 H). Em expressões de mRNA de micrófagos basais primários de TNFa e IL-6, e secreção de citicina foram encontradas bloqueadas pelo meio que contém sedoeptulose (Figura 3 I-L). A ativação de macrófagos induzidos por LPS resultou na secreção fortemente aperfeiçoada de TNF-a e IL-6 nas células cultivadas de GF (Figura 3 M e 3 N). Os macrófagos induzidos por LPScultivados no meio GFS aumentou o IL-6 para níveis comparados com macrófagos trata-dos de GF, mas reduziram suas secreções de TNFa em aproximadamente 40%. Isso mostra que a adição de sedoeptulose à macrófagos, por outro lado, reduz seu estado de inflamatório basal, medido por TNFa e IL-6, mas, por outro lado, retém sua função natural na imunidade, como se vê em IL-6.

[0077] Para concluir, a adição de sedoeptulose ao meio de culturaaumentou significativamente a função de adipócito subcutâneo e reduziu o estado inflamatório de células e, por isso, pode influenciar positivamente a patogênese da obesidade, diabetes tipo II e doenças cardi- ovasculares também resumidas em parte pela síndrome metabólica. SOBREXPRESSÃO DE SEDOEPTULOSE QUINASE CARKL

[0078] Os camundongos transgênicos que sobrexpressam a sedo-eptulose quinase de modo ubíquo no corpo inteiro foram gerados para isolar células primárias geneticamente modificadas que sobrexpres- sam CARKL e para testar o metabolismo de sedoeptulose in vivo. Os camundongos transgênicos de CARKL não mostram nenhum fenótipo óbvio e o peso de sues órgãos não era diferente do peso dos órgãos da mesma ninhada de controle de animais WT (dado não mostrado). Foi levantada a hipótese que o aumento de metabolismo de sedoeptu- lose metabolismo pode ser alcançado através do aumento da concentração do substrato de sedoeptulose, ou através da elevação do nível de sua taxa de enzima limitante de sedoeptulose quinase (CARKL). Para testar isso em um ensaio de quinase in vitro, uma quantidade constante de proteína recombinante CARKL foi incubada com doses crescentes de sedoeptulose. Isso resultou em taxas de aprimoradas de rotatividade de sedoeptulose como medido pela formação ADP (Figura 4A). O mesmo efeito foi observado através do aumento de concentração de proteína CARKL, enquanto a concentração de sedoeptu- lose foi mantida constante (Figura 4B). Esses resultados demonstram que a sobrexpressão CARKL é um modelo válido para investigar os efeitos do aumento de metabolismo de sedoeptulose. Em seguida, os hepatócitos primários, uma vez que o tecido de fígado aparentava me- tabolizar sedoeptulose de modo endógino (Figura 2D), foram isolados para estudar os efeitos de metabolismo de C7- e C6- em níveis de expressão aumentados de CARKL.

[0079] Os hepatócitos foram cultivados em meios com uma C6/C7razão de açúcar 2:1 e metabolicamente avaliados através da comparação de ECAR e OCR conforme os parâmetros metabólicos mais gerais. Os hepatócitos a partir de CARKL que expressam excessivamen- te os camundongos significativamente, aumentaram sua taxa metabólica conforme os níveis de ECAR e OCR aumentados indicaram em comparação às células de controle WT (Figura 4C e 4D). Verificou-se que o sedoeptulose induziu a um metabolismo mais eficiente nessas células. Para testar a relevância do sedoeptulose e da expressão da quinase de sedoeptulose juntas, os hepatócitos isolados dos camundongos de WT e CARKL foram incubados em GF e GFS que contêm o meio de cultivo e seus ECAR induzidos por glicose, foi comparado (após uma hora de privação de carboidrato) como uma medida para controlar glicólise celular. No ECAR induzido por glicose de hepatóci- tos de WT foi reduzido através da administração do sedoeptulose (Figura 4E). Em linha com esses dados, os hepatócitos estimulados por glicose a partir de animais WT cultivados em GF (sem sedoeptulose) encaminharam uma parte maior de glicose para a fermentação de ácido lático, já que as células a partir de CARKL expressam excessivamente os camundongos que pareceu equilibrar o mesmo bolo de glicose de maneira mais eficiente.

[0080] Esses resultados adicionalmente sustentaram os dadosprévios e apontaram claramente que o metabolismo de sedoeptulose aumentado tem efeitos benéficos e distintos nas células, os quais são importantes para a saúde metabólica.

O METABOLISMO DE SEDOEPTULOSE IN VIVO

[0081] Após validar os fenótipos celulares da superexpressão dequinase de sedoeptulose em hepatócitos, o efeito metabólico da modi-ficação de sedoeptulose aumentada para um organismo inteiro foi in-vestigado através da comparação do quociente respiratório (RQ; RQ = consumo de oxigênio de CO2/expirado), assim como do gasto energético por atividade física de controle e de camundongos transgênicos de quinase de sedoeptulose, medidos por calorimetria indireta durante o dia e a noite, conforme os indicadores sistêmicos de metabolismo (Fi- gura 4F e 4G). A quinase de sedoeptulose que expressa excessivamente os animais (CARKL) têm valores de RQ inferiores comparados aos da linhagem do tipo selvagem. Os camundongos CARKL mostraram consumo de oxigênio aumentado e, logo, os valores de RQ inferiores, e, desse modo, espelhados parcialmente nos efeitos do sedoep- tulose nas células. Adicionalmente, os camundongos CARKL também tendem a ter um EE inferior conforme a atividade, se comparado para controlar os camundongos. A sensibilidade a insulina do transgênico CARKL fêmea e dos camundongos WT foram também comparados através de um teste de tolerância a insulina (ITT), para investigar se o metabolismo do sedoeptulose também afeta a sinalização de insulina in vivo. A injeção de insulina (i.p.) baixou o nível de glicose sanguínea nos camundongos que expressam excessivamente a quinase de se- doeptulose mais rápido do que nos controles WT, que indicam que a sensibilidade a insulina foi também aumentada nesses animais através do aumento do metabolismo de sedoeptulose (Figura 4H). Nesse contexto, é importante mencionar que a indução de resistência a insulina em adipósitos adultos por meio de TNFa e de tratamento de hipóxia, resultou na perda de quinase de sedoeptulose (dados gerais de expressão de Gene público disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/query/acc.cgi?acc=GSM1261655).

[0082] Juntos, esses experimentos mostraram que o metabolismode sedoeptulose aumentado não apenas altera o metabolismo in vitro, mas também in vivo. Os valores de RQ inferiores observados nos camundongos CARKL combinados com e pelo EE de tendências inferiores por atividade física e a sensibilidade de insulina aumentada são indicativos para um programa metabólico mais eficiente e sustentável, o qual pode ser induzido através do aumento de metabolismo de se- doeptulose.

A DEPOSIÇÃO DE LIPÍDIO HEPÁTICO É REDUZIDA PELA CARKL

[0083] A deposição de lipídio extensivo nos hepatócitos resulta emdoenças de fígado gorduroso e podem ser acompanhadas por inflamação (isto é, esteato-hepatite não alcoólica (NASH)) que causa fibrose hepática, cirrose, e eventualmente carcinoma hepatocelular. O nível de lipídios de hepatócitos de WT e CARKL que expressam excessivamente os camundongos foi comparado e foi constatado que os hepa- tócitos de camundongos CARKL continham menos gotículas de lipídio do que nos seus controles de WT (Figura 5A).

[0084] Em conclusão, alto teor de gordura do fígado, especialmente em conjunto com a inflamação, que inclui falha de adipósitos que aumenta o risco de muitas doenças que incluem diabetes tipo 2 ou câncer, assim tanto a redução da inflamação quanto o acúmulo de lipídio em hepatócitos através do sedoeptulose poderiam ser especialmente valiosos para a nutrição humana (vide vegetais que contêm altos níveis de C7).CARKL REGULA A ATIVIDADE DE GLICOSE-6-FOSFATO DESI- DROGENASE.

[0085] A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), a taxa que limitaa enzima da haste oxidante do trajeto de fosfato de pentose (PPP) o qual gera corpos C5, isto é, para a síntese de nucleótidos e dos redox equivalentes, foi previamente mostrado para ser inibido diretamente pelo p53 (supressor de tumor) (Jiang et al., Nat Cell Biol. Março de 2011; 13(3):310-6). A mutação no p53, os genes mais frequentemente mutados em tumores humanos, resulta na hiper-ativação de G6PD e na acumulação de lipídio nos hepatócitoepatócitos. A quinase de se- doeptulose é a quinase limitadora de taxa de haste não oxidante do PPP e foi previamente mostrado para reduzir o fluxo PPP oxidante, pelo menos em macrofágos. Realizar um teste para uma possível regulamentação de atividade G6PD nos hepatócitos através do metabolismo de sedoeptulose, foi comparada a atividade da enzima de WT e CARKL que expressam excessivamente células (Figura 5B). Na atividade G6PD de células de controle WT foi observado para ser distribuído de maneira uniforme, já que nas células de camundongos CARKL, a relocalização deG6PD e, desse modo, foi observada uma atividade reduzida no espaço das células. De modo interessante, o mesmo fenó- tipo foi atingido através da incubação das células WT no meio de cultivo de célula com o sedoeptulose (não mostrado). Se a re-localização e/ou a inibição de G6PD através da superexpressão de quinase de sedoeptulose e a incubação de sedoeptulose fossem a causa para a acumulação de lipídio reduzido nos hepatócitos (Figura 4A), que permanece a ser estabelecido. No entanto, esses dados em conjunto com os dados a partir de macrofágos mostra que um nível sedoeptulose elevado pode atuar como uma contramedida para a perda p53 nas células de câncer, pelo menos através da atividade G6PD de regulamentação de modo negativo em alguns casos. Outros exemplos são as células de câncer de mama dependentes de estrogênio que diminuem a expressão CARKL em resposta do fator de crescimento do estrogê- nio (dados repositório GeneChip público disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/; ID: 53372898; GDS3285 /219713_at / SHPK), que por sua vez, novamente, resulta em atividade G6PD e crescrimento de tumor subsequentemente.

[0086] Esses dados também implantam o metabolismo de sedoep-tulose como um alvo apropriado para regular a atividade G6DP e para futuras estratégias anticâncer.

METABOLISMO SEDOEPTULOSE E OSSO METABOLISMO

[0087] O osso é um tecido extremamente dinâmico. O bom equilíbrio da formação óssea e a reabsorção é essencial para a estabilidade mecânica do osso. O desequilíbrio entre a formação óssea e a reabsorção é a causa da osteoporose, uma condição altamente prevalente de densidade óssea reduzida e micro-arquitetura de osso quebrado que resulta na fragilidade óssea e fraturas patológicas. Como os oste- oclatos, as células responsáveis pela reabsorção óssea são derivadas a partir de linhagem de monócito cuja função é altamente impactada pelo metabolismo de sedoeptulose, foi também testado se a função do osteoclato pode ser modulada pela razão de C6/C7.

[0088] As células de medula óssea foram diferenciadas in vitro para os osteoclatos, expondo-se as células a M-CSF em conjunto com RANKL. As células foram cultivadas em placa pré-revestida com uma matriz mineral óssea no fundo da cavidade para fornecer o substrato para a atividade de reabsorção óssea. A análise da reabsorção de substrato é claramente demonstrada que ambas a superexpressão CARKL assim como no aumento no teor C7 no meio de cultivo, reduzida a formação do poço através de osteoclatos (Figura 5C). Curiosamente, os poços de reabsorção maiores foram revelados apenas na ausência do sedoeptulose (Figura 5D).

[0089] Novamente, esses dados sustentam o conceito da presenteinvenção que um uma razão de C6/C7 bem balanceada é crucial para manter a saúde e que o C7 tem o potencial de aliviar as situações fisi- opatológicas, isto é, a osteoporose em humanos.

QUINASE DE SEDOEPTULOSE REGULA A RESPOSTA IMUNE DE ANIMAIS

[0090] São apresentados com os exemplos presentes, os dadosda superexpressão CARKL e seus efeitos no sistema imunológico do camundongo em um modelo de ativação imune aguda e em inflamação de baixo grau do tecido adiposo adulto. Na inflamação aguda nos camundongos CARKL foi extraído através de uma injeção de lipopolis- sacarídeo sub-letal (LPS), a qual resultou em uma resposta de citocina de tipo suprimida comparada com os controles do tipo selvagem (Figura 6A). Um painel de 19 citocinas foi medido em soro de camundongo cWT e CARKL, que foi isolado 24 horas após a injeção LPS (7mg/kg, IP), pelo perfilador de citocina de camundongo. Onze citocinas atingiram o limiar de 50% de alteração principal, a qual foi definida conforme o valor de corte para destacar as citocinas regulamentadas pela supe- rexpressão CARKL in vivo. Os IL-13, MIP1α, RNATES, IL-12 (p70), IL- 2, TNF-α, MCP1, KC, GM-CSF, IL-6, IL-17 e IL-15 foram diminuídas por pelo menos 50% de alteração principal nos camundongos CARKL comparados com os da ninhada do tipo selvagem. As citocinas IL-6, IL-17 e IL-15 mesmo atingido o limiar de 75% de alteração principal. Além da inflamação aguda, os níveis basais de citocina pró- inflamatória em tecido adiposo adulto foram também avaliadas a partir de dois depósitos diferentes (tecido adiposo epididimal e subcutâneo) de camundongo de controle CARKL e WT. De maneira consistente com a redução na inflamação induzida por LPS, os níveis mRNA de TNFa e MCP1, uma adipocitona primária que recruta macrofágos para o tecido adiposo e que pertence as citocinas pró-inflamatórias foram reveladas embotadas pelas superexpressão CARKL (Figura 6B-E).

[0091] Isso indica que um suplemento nutricional que contém se-doeptulose pode atenuar uma inflamação aguda de baixo nível. Logo, alvejando o metabolismo C7 através de sedoeptulose aplicada nutricional e clinicamente aparece como uma medida efetiva para reduzir inflamação desordens.

POLIFORMISMO NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP) NAS 3’-UTR DO GENE CARKL QUE É ASSOCIADO AO RISCO DE AVC.

[0092] 535 pacientes neurologicamente assintomáticos da inflamação e da artéria carótida - Risk for ateroesclerose Study (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulação 111 (17):2203-2209) foram genoti- pados para a substituição rs465563 [A] a [G] na 3'-UTR do gene CARKL. 33 (6,2%) dos pacientes sofreram um acidente vascular cerebral no período de observação. Nesses pacientes, a distribuição de alelos rs465563 foi significativamente diferente comparado às frequên- cias de alelos do resto da população do estudo (x2=12.639, df=2, p=0.002, vide Figura 6F). Em detalhes, os veículos homozigóticos do alelo [G]- sustentaram um risco relativo de 3.93 (95% CI: 1.72 - 9.01) comparado aos indivíduos homozigóticos [A] e 3.10 (95% CI: 1.40 - 6.87) comparado aos indivíduos zigóticos, respectivamente. A independência estatística de informações de genótipo rs465563 foi avaliado pelo modelo de regressão logística que fornece idade, sexo, histórico de infarto do miocárdio e AVC, consumo de nicotina, índice de massa corporal, assim como certas comorbidades (hiperlipidemia, hipertensão, diabetes mellitus) as conforme co-variáveis (modelo: X2=30.476, df=11, p=0.001). Dentro desse modelo, o status do veiculo do genótipo [G];[G] se apresentou como um previsor significativo (razão probabilidade = 5.015, 95% CI: 1.803 - 13.943) quando comparado com pacientes homozigotos para o alelo[A]. Além disso, tem sido avaliado através de figuras de parcelas Kaplan-Meier, se o tempo ini-cial de sobrevida livre de acidente vascular depende do status do veículo rs465563. De fato, os veículos homozigotos do alelo [G] (1518,3 dias, 95% CI: 1419,2 - 1617,4) apresentaram significativamente menor sobrevida livre de eventos do que os indivíduos héterozigotos (1619.1 dias, 95% CI: 1584.8 - 1653.3, p=0.005) e os veículos do genótipo [A];[A] (1788.1 dias, 95% CI: 1755.7 - 1820.4, p=4.9-10-4) (Figura 6G). Os indivíduos homozigotos para o alelo rs465563: [G] mostram tempos mais curtos livre de eventos do que os veículos do alelo [A].

[0093] Os antecedentes mecânicos dessa associação clínica permanecem para ser clarificados. Entretanto, dada a habilidade de CARKL para modular a polarização macrófago e o papel chave do último na formação e progressão das placas ateroscleróticas, parece provável que o polimorfismo rs465563 pode impactar em risco de eventos cerebrovasculares por meio da modulação da polarização macrófaga nas placas ateroscleróticas. Essa noção sustentada pela observação, de acordo com a presente invenção que o 3'-UTR do gene CARKL é principalmente transcrito em macrofágos.

[0094] Em conclusão, essa associação e os dados fornecidos nometabolismo e na função de adipósitos, hepatócitos, e macrofágos em conjunto com a inflamação reduzida e a sensibilidade a insulina acentuada in vitro e in vivo indica fortemente que o sedoeptulose (açúcar C7) é um constituinte crítico para a nutrição humana e uma medicação altamente relevante para tratar, isto é, deficiências C7 e outros estados de doença não saudáveis e metabólicas.

Claims

1. Uso de sedoeptulose, caracterizado pelo fato de que é como um suplemento nutricional/suplemento alimentício para indivíduos saudáveis, em que os usos terapêuticos no corpo humano e animal são excluídos.

2. Uso de sedoeptulose, caracterizado pelo fato de que é como um inibidor nutricional de acidificação extracelular, glicólise e formação de lactato para indivíduos saudáveis, em que os usos terapêuticos no corpo humano e animal são excluídos.

3. Uso de sedoeptulose, caracterizado pelo fato de que é como um indutor nutricional de consumo de oxigênio celular em indivíduos saudáveis, em que os usos terapêuticos no corpo humano e animal são excluídos.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sedoeptulose é adicionada a um produto alimentício, que já contém sedoeptulose e para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício, que é aumentado em pelo menos 10%, de preferência, para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício, que é aumentado em pelo menos 100%, especialmente, pelo menos 500%.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sedoeptulose é adicionada a um produto alimentício, que já não contém sedoeptulose e para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício, que é pelo menos 0,001% em p/p, de preferência, para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício, que é pelo menos 0,01% em p/p, mais preferenn- cialmente pelo menos 0,1% em p/p, ainda com mais preferência pelo menos 1% em p/p, especialmente pelo menos 10% em p/p; ou para produtos alimentícios líquidos para obter um teor de sedoeptulose do produto alimentício que é pelo menos 0,01% em p/v, com mais prefe- rência, pelo menos 0,1% em p/v, ainda com mais preferência pelo menos 1% em p/v, especialmente pelo menos 10% em p/v.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sedoeptulose de um produto alimentício é analisada em relação a seu teor em % em p/p, % em p/v ou concentração molar de carboidratos C6, especialmente, glicose, fruto- se e seus respectivos dímeros, e em relação a seu teor em % em p/p, % em p/v ou concentração molar de carboidratos C7, estabelecendo a razão dos carboidratos C6 para carboidratos C7 (em % em p/p: % em p/p, % em p/v: % em p/v ou como razão molar) para esse produto alimentício, e em que a sedoeptulose é adicionada ao produto alimentício em uma quantidade para diminuir a razão de carboidratos C6 para carboidratos C7 (em % em p/p: % em p/p, % em p/v: % em p/v ou como razão molar) em pelo menos 50%, de preferência em pelo menos 100%, especialmente em pelo menos 200%.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é selecionado do grupo que consiste em uma bebida nutricional, uma barra de lanche nutricional, um produto alimentício dietético, um produto alimentício de cereal, um refrigerante, uma bebida esportiva, bebida energética, adoçante nutricional, doces, massas, produto lácteo, coberturas ou produto alimentício funcional.